KR20240009157A

KR20240009157A - 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물 및 치료 방법

Info

Publication number: KR20240009157A
Application number: KR1020220086300A
Authority: KR
Inventors: 송하연; 서호성; 안기범; 변의백; 박혜란; 천풍가; 한정무
Original assignee: 한국원자력연구원
Priority date: 2022-07-13
Filing date: 2022-07-13
Publication date: 2024-01-22

Abstract

본 발명은 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물 및 치료 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 TGF-β를 포함하는, 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물; 및 상기 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염증 치료 방법에 관한 것이다.

Description

바이러스 감염증 치료용 약학 조성물 및 치료 방법{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING VIRUS INFECTION AND METHOD FOR TREATING VIRUS INFECTION}

본 발명은 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물 및 치료 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재조합 마우스 TGF-β 단백질을 이용한 바이러스성 폐렴을 포함하는 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.

면역 세포는 사이토카인을 통해 서로 소통한다. 사이토카인은 세포가 혈액에 방출하는 작은 분자로, 면역 세포가 감염 부위로 이동하도록 하여, 손상된 세포를 포식하게 하고, 심지어 혈관벽을 침투할 수 있게 하며; 동시에 사이토카인은 염증을 유발하여, 손상된 생체가 붓고, 발열하며 통증을 일으키게 할 수도 있다.

면역계가 감염, CART　치료, 일부 약물 또는 자체 면역 조절 불균형과 같은 원인으로 인해 극한 정도로 활성화되거나 또는 통제가 되지 않은 경우, 대량의 각종 사이토카인을 방출하여, 많은 수의 염증 촉진 사이토카인의 레벨이 급속히 증가되는데, 이 현상을 사이토카인 폭풍 증후군（cytokine storm syndrome, cytokine release syndrome, CRS）이라 칭한다. 사이토카인 폭풍 증후군은 면역계 과민성 활성화로 인한 전신 염증 반응이다. 임상적으로 자주 보는 사이토카인 폭풍 원인으로는 CART　치료, H5N1, H1N1, SARS, MERS, COVID-19 등이 포함되고, 관련되는 사이토카인에는 주로 TNF-α, IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MCP-1, IL-8, G-CSF, MCP-1 등이 포함된다.

전세계적으로 대유행하고 있는 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)은 폐렴, 패혈증, 급성 호흡부전 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS) 등의 합병증이 심각한 문제가 되고 있으며, 대표적인 원인으로는 사이토카인 폭풍이 제시되고 있다. 정상적인 면역 시스템에서는 바이러스, 예를 들어 코로나　바이러스에 감염되었을 때, 가장 먼저 바이러스의 침입을 표피 세포와 선천 면역세포들이 인식하고, 사이토카인과 케모카인을 생성하여 감염 부위로 다양한 면역세포들을 불러모아, 후천 면역반응을 활성화해 바이러스와 감염된 세포들을 제거한다. 하지만, 면역체계에 혼란이 생겨, 체내 면역반응이 제대로 조절되지 못하고, 사이토카인 폭풍으로 이어질 경우, 폐 염증이 심화되고, 정상세포들의 염증성 세포사멸이 유도되면서, 혈중 사이토카인 농도가 급증함에 따라, 급성 폐 손상 및 ARDS, 다발적 장기손상과 같은 중증이 나타날 수 있다.

한편, 신종 코로나　바이러스　SARS-CoV-2로 인한 신종 코로나　바이러스　폐렴은 인류 건강 및 사회 경제 발전에 막대한 위협이다. 신종 코로나　바이러스　폐렴으로 인한 사망 병례 중 큰 비중을 차지하는 부분은 사이토카인 폭풍에 관련된다. 이에 한국특허 출원 제10-2021-7043443호는 사이토카인 폭풍을 억제하는 약물의 제조에서 프로게스토겐의 응용을 개시하고 있으나, 바이러스　폐렴과 관련한 치료 효과 데이터를 제시하지 못하고 있다.

최근 코로나 바이러스에 의한 감염병이 빈번히 발생하면서 지구촌을 위협하고 있으며, 2003년 사스 코로나바이러스 (SARS-CoV), 및 2019년 코로나 19 (SARS-CoV-2) 감염 사태가 대표적인 경우로, 전체 국가의 코로나바이러스감염에 따른 인명피해 및 경제적 피해가 늘어나고 있는 상황에서, 바이러스 특히 코로나 바이러스 감염증에 대한 치료제의 개발이 시급한 상황이다.

이에 본 발명의 한 측면은 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 측면은 바이러스 감염증의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 견지에 의하면, TGF-β를 포함하는, 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기 본 발명의 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염증 치료 방법.

본 발명에 의하면 재조합 TGF-β을 이용하여 바이러스 감염으로 인해 호흡기로 침윤하는 면역 세포들을 효과적으로 억제할 수 있고, 따라서 폐렴 병변의 악화를 효과적으로 치료할 수 있다. 특히, TGF-β의 비강 투여에 의해 효과적인 항염증 반응을 유도하여 바이러스 감염에 의해 유도되는 폐렴 병변을 제어할 수 있다.

도 1은 예비 실험 결과 재조합 TGF-β 저농도 투여 후 BALF 내 면역세포 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 예비 실험 결과 재조합 TGF-β 저농도 투여 후 BALF 내 사이토카인 및 케모카인 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 재조합 TGF-β 투여의 바이러스 감염성 폐렴 완화 효과를 나타낸 것이다. 도 3 상단 이미지는 각 그룹의 폐 조직을 병리학적으로 분석한(헤마토실린-에오신 염색) 대표 이미지이고, 하단은 염색된 폐 조직 내의 기도(Airway), 혈관(Vascular) 및 폐 실질(Parenchymal) 염증 정도를 수치화하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 재조합 TGF-β 투여의 면역세포 침윤 억제 효과를 나타낸 것이다. 보다 상세하게 도 4A는 기관지 내로 침윤한 호중구(Neutrophils; CD45⁺Ly6G⁺ 세포), 도 4B는 폐포대식세포(Alveolar macrophages; CD45⁺Ly6G^-MHC-II⁺CD64⁺CD24^-CD11c⁺CD11b^low 세포)와 간질대식세포(Interstitial macrophages; CD45⁺Ly6G^-MHC-II⁺CD64⁺CD24^-CD11c^lowCD11b⁺ cells 세포), 도 4C는 수지상세포(CD45⁺Ly6G^-MHC-II⁺CD64^-CD24⁺ 세포)와 호산구(CD45⁺Ly6G^-CD64^-CD24⁺MHC-II^-CD11b⁺ 세포), 도 4D는 B세포(CD45⁺Ly6G^-CD11c^-CD11b^-MHC-II⁺CD24⁺ 세포)와 T세포(CD45⁺Ly6G^-CD11c^-CD11b^-MHC-II^-CD24^- 세포)의 수를 나타낸 것이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 TGF(Transforming growth factor)-β를 이용한 바이러스 감염증 치료에 관한 것으로, 보다 상세하게 본 발명의 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물은 TGF-β를 포함하는 것이다. 이때 TGF-β는 재조합 단백질일 수 있고, 예를 들어 재조합 마우스 TGF-β(rmTGF-β) 단백질일 수 있다.

TGF-β는 상피 세포와 조혈 세포의 성장, 이동, 분화, 사멸 등을 조절하는 다기능성 사이토카인으로 잘 알려져 있으며, 체내 면역반응 조절에서도 중요한 역할을 한다. TGF-β는 조절 T 세포 유도를 촉진하여 체내 항상성 유지에 핵심적인 역할을 하며, 이를 바탕으로 감염, 만성적인 염증 질환에서 효과적인 항염증 반응을 유도할 수 있다. 또한, TGF-β는 세포 표면 부착분자를 억제하여, 면역세포들이 염증 및 감염부위로 침윤하는 것을 억제하기도 한다.

본 발명의 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물이 적용될 수 있는 상기 바이러스는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 및 사스-코로나바이러스-2 (SARS-CoV-2)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 코로나바이러스인 것일 수 있으며, 바람직하게는 사스-코로나바이러스-2 (SARS-CoV-2)인 것이다.

본 발명의 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물이 적용될 수 있는 상기 바이러스 감염증은 바이러스 감염에 의한 가래, 기침, 인후통, 두통, 객혈, 호흡곤란 증상, 상기도 감염, 하기도 감염, 호흡기 감염, 폐렴 및 사이토카인 폭풍 증후군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으며, 바람직하게는 폐렴을 포함하는 것이다. 예를 들어 폐렴을 포함하는 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)일 수 있다.

본 발명의 상기 약학 조성물은 국소 투여용 조성물이 것이 바람직하며, 예를 들어 비강 투여 및/또는 기도 투여(기관내 주사)용 조성물일 수 있다. 경구, 정맥 투여 등과 같은 전신투여 시 전신의 조직으로 많은 양의 TGF-β가 전달될 수 있기 때문에, 전신 부작용 측면에서 위험성이 증가될 수 있다. 예를 들어 바이러스 감염에 의한 폐렴 치료를 위해 전신 투여 시 폐 외에 다른 조직으로도 TGF-β가 전달되기 때문에 폐에서의 염증 완화가 효과가 있더라도 부작용을 수반할 가능성이 높아질 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여 시에는 상기 유효성분 이외에 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 추가로 포함할 수 있다. 주사제의 경우에, 본 발명의 약학적 조성물은 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 또한, 국소 투여 시에 본 발명의 조성물은 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같이 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있으며, 특히 흡입 투여용 제형 또는 주사 투여용으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약앰플 또는 다중 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다. 흡입(inhalation)을 통한 약물 전달은 비침습적(non-invasive) 방법 중 하나로, 특히 폐 질환의 광범위한 치료에 흡입 투여용 제형(예를 들어, 에어로졸)이 유리하게 이용될 수 있다. 이는 폐의 해부학적 구조 및 위치가 즉각적이고 비침습적인 접근을 가능케 하고, 다른 기관에는 영향을 미치지 않으면서 약효의 국소 적용을 받을 수 있기 때문이다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

이와 같은 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물의 제형은 특히 비강 투여 및/또는 기도 투여에 적합한 액체 및/또는 분말 형태로 제조할 수 있으며, 보다 상세하게는 에어로졸(aerosols), 드롭(drops) 또는 통기(insufflation)로 제형화 할 수 있고, 특히 분말제제나 미립구로 제형화 될 수 있다. 비강 드롭으로 투여하기 위한 조성물은 일반적으로 조성물에 포함되는, 예를 들어, 방부제, 점성 조절제, 삼투압 조절제, 완충제, 안정제, 유화제, 또는 향료 등과 같은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다.

예를 들어 본 발명의 조성물은 비강 투여를 위한 것으로서, 에어로졸(aerosols), 드롭(drops) 또는 통기(insufflation)로 제형화 할 수 있고, 특히 분말제제나 미립구로 제형화는 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물을 드롭(drops) 제형으로 투여하는 경우, 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

이와 같은 제형으로 본 발명의 조성물들은 임의의 적합한 형태로　비강 및/또는 기도로 투여될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 용액들은 방울들, 또는 분무의 형태로　비강으로 투여될 수 있고 본 발명의 분말들은 에어로졸화된 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물을 투여하는 바람직한 방법은 분무 장치를 사용하는 것이다. 병, 펌프, 및 작동 장치(actuator)를 포함하는 분무 장치들은 예를 들면, 단일(단위(unit)) 투여량 또는 복수 투여량 시스템들일 수 있고, 이들은 다양한 상업적 출처들로부터 이용가능하다.

또한, 본 발명의 분말 제제들은 바람직하게는 환자에게 에어로졸화 된 제형으로 투여될 수 있으며, 이때 환자의 흡입으로부터의 에너지가 분말을　비강으로 에어로졸화 하기 위해 이용되거나 장치 자체가 압축 공기를 통해서와 같이 에어로졸화 에너지를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 조성물을 이를 위한 각종 제형은 당해 기술 분야의 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 용액들을 제조하는 방법은 물과 같은 적합한 용매에서 구성성분들을 혼합하는 단계를 포함한다. 분말 조성물들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법들을 이용하여 제조될 수 있다.

한편, 본 발명의 상기 약학 조성물은 1 ng/mL 내지 1 mg/mL의 TGF-β를 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 100 ng/mL 내지 100 μg/mL의 TGF-β를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 약학 조성물이 비강 투여용 조성물의 경우 1회 단위 분무 부피는 0.01 내지 0.2 ml, 예를 들면, 0.05 내지 0.1 ml일 수 있다. 예시적인 투여 계획(regimen)은 한쪽 또는 양쪽 콧구멍 모두로의 1회 부문이나, 치료량의 약물을 제공하기 위해서 각 콧구멍으로 최대 약 0.2 ml(즉, 0.1 ml씩 2회의 분무)를 투여하는 것이다. 다만, 약학적 조성물 내 TGF-β 농도에 따라 보다 작은 분무량 또는 보다 큰 약물 투여량으로 투여될 수 있다.

다만, 본 발명의 약학적 조성물의 유효 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 당해 기술 분야의 통상의 전문가에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

나아가, 본 발명의 다른 견지에 의하면 상술한 본 발명의 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염증 치료 방법이 제공된다.

본 발명의 바이러스 감염증 치료 방법이 적용될 수 있는 대상은 인간과 그 외 모든 동물을 의미한다. 즉, 본 발명에 따른 조성물은 인간뿐만 아니라 다른 동물들에게도 적용될 수 있다.

한편, 본 발명의 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물이 투여되는 것이 바람직한 상기 대상은 상기 바이러스에 감염된 환자 중 무증상, 경증(mild) 및 중증도(moderate) 환자이다.

무증상 환자는 바이러스 검사에 대해 양성 반응은 보이지만 일치하는 증상이 없는 경우이며, 경증 환자는 바이러스 감염의 다양한 징후와 증상을 가지고 있지만 호흡 곤란, 기타 흉부 촬영 검사 상 이상 소견이 없는 환자이며, 중등도 환자는 임상적인 평가 또는 영상 검사에서 호흡기 질환 소견이면서 산소포화도가 94% 이하인 환자로 구분될 수 있다.

다만, 산소포화도 94% 미만의 중증(severe) 환자, 및 호흡 부전, 패혈성 쇼크 및/또는 다발성 기관 장애가 발생한 심각(crirical) 환자를 대상으로 하는 경우에는 효과적이지 않을 수 있다.

본 발명의 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물이 투여되는 시점과 관련하여, 상기 투여는 잠복기, 감염 초기 및 감염 중기 중 적어도 한 시점에 수행되는 것이 바람직하다.

감염 초기 및 감염 중기의 구분은 특정한 기간으로 구분되기 보다는 증상의 발현 양상을 바탕으로 구분될 수 있으며, 폐렴 증상이 나타나는 동안의 기간을 포함하는 것으로 의도된다.

초기 증상으로는 감염 후 열, 피로감, 마른 기침, 전신 통증, 목아픔, 두통, 설사 등이 흔하며, 가래가 동반될 수 있다. 그 외 증상은 코막힘, 콧물, 객담(가래), 객혈, 오심, 설사 등이다.

중기 증상으로 감염 약 4일 내지 8일 후 바이러스가 기관지 및/또는 폐에 침투해 폐렴을 일으킬 수 있으며, 객담, 두통, 호흡곤란, 객혈, 오심, 설사 등이 있다. 폐렴 증상은 고열 및 호흡 곤란이 나타나고 마른 기침, 흉통, 흉부 압박감 등이 있다.

*이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. rmTGF-β 투여 농도선정을 위한 예비 실험

바이러스 감염으로 인해 급성 폐렴이 유도된 마우스에 재조합 마우스 TGF-β 단백질(rmTGF-β)을 다양한 농도 및 경로로 투여하였고, 재조합 TGF-β 단백질의 투여가 감염성 폐렴에 의한 병변을 제어할 수 있는지 여부를 탐색하였다.

재조합 마우스 TGF-β 단백질(rmTGF-β)은 R&D system (카달로그 번호: 7666-MB)으로부터 구입하여, 50 μg/mL의 농도로 인산완충생리식염수(Phosphate-buffered saline)에 용해한 후, 20 μL씩 분주하여 -80℃에 보관하였다. 그리고, 투여 직전에 인산완충생리식염수에 아래 표 1에 기재한 각각의 농도가 되도록 희석하여 마우스에 투여하였다.

7주령의 BALB/c 마우스를 25℃, 습도 55%, 12시간의 조명(light/dark) 주기 조건 하에서 1주일간 순화시켰다. 그 후, 트리브로모에탄올(tribromoethanol)을 복강주사 하여 마우스를 마취시킨 후, 30 HAU(hemagglutination)의 농도의 인플루엔자 A 바이러스를 마우스에 비강투여하여 감염시켰다. 마우스 감염 18시간 후에 아래와 같은 농도로 각 그룹의 마우스에 rmTGF-β를 투여하였다.

rmTGF-β 투여 농도 결정을 위한 예비실험 그룹(도 1 및 도 2에 해당)

그룹 1	PBS 비강 투여(비감염 대조군, Uninfected)
그룹 2	감염 후 PBS비강투여(Infection + PBS, IN control 비강투여대조군)
그룹 3	감염 + rmTGF-β 복강투여(Infection + rmTGF-β,IP, 100 ng/mice)
그룹 4	감염 + rmTGF-β 비강투여(Infection + rmTGF-β,IN, 25 ng/mice)

- IP: 복강투여(Intraperitoneal injection)- IN: 비강투여(Intranasal administration)

rmTGF-β 투여 실험 그룹(도 3 및 도 4에 해당)

그룹 1	PBS 비강 투여(비감염 대조군, Uninfected)
그룹 5	감염 후 PBS 기도투여(Infection + PBS; IT control 기도투여 대조군)
그룹 6	감염 + rmTGF-β 복강투여(Infection + rmTGF-β,IP, IP-Mid, 300 ng/mice)
그룹 7	감염 + rmTGF-β 복강투여(Infection + rmTGF-β,IP, IP-High, 1 μg/mice)
그룹 8	감염 + rmTGF-β 정맥투여 (Infection + rmTGF-β, IV, 300 ng/mice)
그룹 9	감염 + rmTGF-β 비강투여 (Infection + rmTGF-β, IN, 200 ng/mice)
그룹 10	감염 + rmTGF-β 기도투여 (Infection + rmTGF-β, IT, 200 ng/mice)

- IT: 기도투여 (Intratracheal administration)

- IV: 정맥투여 (Intravenous injection)

그룹 3: 마우스 당 300 ng의 rmTGF-β를 투여하기 위하여, -80℃에 보관되어 있던rmTGF-β를 1 μg/mL으로 희석한 후, 마우스 당 300 L의 용량을 복강주사 하였다.

그룹 4: 인산완충생리식염수 200 μL에 1 ug의 rmTGF-β가 함유된 용액을 복강주사하였다.

그룹 5: 마우스 당 300 ng의 rmTGF-β를 투여하기 위해, 3 μg/mL의 rmTGF-β를 제조한 후, 100 μL씩 미정맥 주사하여 투여하였다.

그룹 6 및 그룹 7: 마우스 당 200 ng의 rmTGF-β를 투여하기 위하여, rmTGF-β가 4 μg/mL이 되도록 제조한 후, 마우스 당 50 μL씩 비강 혹은 기도투여하였다.

예비 실험 결과, 마우스에 인플루엔자 바이러스 감염 24시간 후에 100 ng의 rmTGF-β를 복강투여(intraperitoneal injection, IP) 혹은 25 ng의 rmTGF-β를 비강투여(intranasal injection, IN)하였을 때, 24시간(1 day) 혹은 72시간(3 day) 후에 면역세포의 침윤억제 효과가 나타나지 않았으며(도 1), 또한, rmTGF-β 투여 후 사이토카인 및 케모카인 변화가 없었다(도 2).

이는 IP 및 IN으로 투여된 약물의 양이 폐로 충분히 전달되지 않았거나, 농도가 부족했을 가능성이 크다고 판단하여, 이후에 진행한 실험에서는 rmTGF-β 투여 농도를 약 3-10배 높게 설정하여 복강 투여 시 최소 농도를 300 ng/mouse, 비강 및 기도 투여 시 농도를 200 ng/mouse로 설정하였고, 폐를 포함한 전신에 약물을 전달할 수 있는 정맥투여도 함께 진행하였다.

2. 실험 방법

(1) 기관지세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 분리 및 면역세포 염색

rmTGF-β 투여 1일 후에, CO₂ 가스를 이용하여 마우스를 안락사한 후, 1.7 mm 카테터를 마우스 기도에 삽입한 후, 0.5 mL의 PBS를 2회 주입하여 BALF를 획득하였다. 분리한 BALF를 400 × g에서 5분간 원심분리하여, BALF 내 세포들을 획득한 후, V450-anti-CD45, BV510-anti-Ly6G, FITC-anti-CD11b, PE-anti-CD11c, PE-Cy7-anti-MHC-II, PE-CF594-CD24, alexa647-anti-CD64, 및 7-aminoactinomycin (7-AAD)를 이용하여 4℃에서 30분간 세포를 염색하였다. 면역세포는 유세포분석기를 이용하여 절대 수(absolute number) 측정법으로 분석하였다.

(2) 폐 조직병리 관찰

　rmTGF-β 투여 6일 후에, CO₂ 가스를 흡입시켜 마우스를 희생하였고, 폐 조직을 분리하였다. 폐 조직을 10% 포르말린을 이용하여 고정한 후, 수세, 탈수, 투명화, 포매과정을 거쳐 파라핀 블록(block)을 제작하였다. 그 후, 조직을 5 μm의 두께로 박절한 후, H&E(hematoxylin & eosin) 염색을 진행하였고, 염색된 조직 절편을 병리슬라이드 스캐너(Motic EasyScan slide scanning system)를 이용하여 데이터화 한 후 폐 조직의 기도염증(airway inflammation), 혈관염증(vascular inflammation) 및 폐 실질염증(parenchymal inflammation)을 관찰하였다.

(3) BALF 내 사이토카인 및 케모카인 분석

　마우스 BALF 내 IL-6, TNF-α, IL-1β, IFN-γ, KC, MCP-1 및 RANTES는 CBA(mouse cytometric bead array) 플렉스 키트(flex kit)를 이용하여 분석하였다. TGF-β와 GM-CSF의 함량은 ELISA kit를 이용하여 분석하였다.

3. rmTGF-β 투여 시 인플루엔자 바이러스 감염에 의한 폐 염증 완화 효과

바이러스 감염 후 폐 조직 내 기도 염증(airway inflammation), 혈관 염증(vascular inflammation) 및 실질 염증(parenchymal inflammation) 점수가 모두 유의적으로 증가하였다.

기도 염증은 rmTGF-β를 비강투여(IN)한 그룹과 기도투여(IT)한 그룹에서 유의적으로 감소하였다. 혈관 염증은 rmTGF-β 복강투여 고농도(IP-H; 1 μg/mice) 그룹과 기도투여(IT) 그룹에서 유의적으로 감소하였다. 폐 실질 염증은 rmTGF-β 복강투여 고농도(IP-H; 1 μg/mice) 그룹, 정맥투여(IV) 그룹, 그리고 기도투여(IT) 그룹에서 유의적으로 감소하였다(도 3).

결과적으로, 기도 투여 그룹에서 기도 염증, 혈관 염증, 폐 실질 염증 수치가 모두 유의적으로 감소한 것으로 확인되었다.

　4. rmTGF-β 투여 시 인플루엔자 바이러스 감염에 의한 염증반응 조절효과

rmTGF-β 투여가 바이러스 감염에 의해 증가하는 염증 반응을 조절하는지 알아보기 위하여, 먼저 BALF 내 면역 세포를 분석하였다. 바이러스 감염 2일차에 호중구(neutrophils), 간질대식세포(Interstitial macrophages), 수지상세포(dendritic cells), 호산구(eosinophils), B세포(B cells), T세포(T cells)가 모두 PBS 그룹에 비하여 증가하였다. 감염 2일차에 가장 많이 증가하는 세포인 호중구는 기도투여(IT) 그룹에서 유의적으로 감소하였다(도 4A).

간질대식세포의 침윤은 정맥투여(IV) 그룹과 기도투여(IT) 그룹에서 유의적으로 감소하였고, 기도투여 그룹에서는 폐포대식세포 또한 감소하는 경향이 나타났다(도 4B).

감염에 의해 증가하는 수지상세포는 복강투여 고농도(IP-H) 그룹, 정맥투여(IV) 그룹, 기도투여(IT) 그룹에서 유의적으로 감소하였고, 호산구는 정맥투여(IV) 그룹과 기도투여(IT) 그룹에서 감소하였다(도 4C).

마지막으로, 감염에 의해 증가하는 B세포의 침윤은 기도투여(IT) 그룹에서 유의적으로 감소하였고, T세포의 침윤도 기도투여 그룹에서 감소하는 경향을 보였지만 유의적인 차이는 나타나지 않았다(도 4D). 　　

실험 결과, 재조합 TGF-β 단백질을 기도투여(IT)했을 때, 폐렴 병변 완화 효과가 가장 효과적이였으며, 이러한 결과는 기도 투여 방식이 약물을 폐로 전달하는데 가장 효율적임을 알 수 있다. 결론적으로, 감염성 폐렴에서 재조합 TGF-β을 기도투여를 포함하는 폐로 전달하는 방식, 예를 들어 코와 입으로 흡입하는 형태나, 비말의 형태로 기도를 통해 폐로 전달되는 방식에 의해 감염으로 인해 호흡기로 침윤하는 면역세포들을 효과적으로 억제할 수 있고, 폐렴 병변이 악화되는 것을 효과적으로 치료할 수 있을 것으로 기재된다.

이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims

TGF-β를 포함하는, 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 바이러스 감염증은 바이러스 감염에 의한 가래, 기침, 인후통, 두통, 객혈, 호흡곤란 증상, 상기도 감염, 하기도 감염, 호흡기 감염, 폐렴 및 사이토카인 폭풍 증후군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 바이러스는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 및 사스-코로나바이러스-2 (SARS-CoV-2)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 코로나바이러스인, 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 비강 또는 기도 투여용 조성물인, 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 용액 또는 분말 제형인, 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 1 ng/mL 내지 1 mg/mL의 TGF-β를 포함하는, 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물.
제4항에 있어서, 비강 투여용 조성물의 경우 1회 단위 분무 부피는 0.01 내지 0.2 ml 인, 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 바이러스 감염증 치료용 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염증 치료 방법.
제8항에 있어서, 상기 대상은 상기 바이러스에 감염된 무증상, 경증(mild) 및 중증도(moderate) 환자인, 바이러스 감염증 치료 방법.
제8항에 있어서, 상기 투여는 잠복기, 감염 초기 및 감염 중기 중 적어도 한 시점에 수행되는, 바이러스 감염증 치료 방법.