KR20240006134A - 마이코박테리움 파라고르도네를 포함하는 면역 증강용 조성물 - Google Patents
마이코박테리움 파라고르도네를 포함하는 면역 증강용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 마이코박테리움 파라고르도네를 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것으로, 일 양상에 따른 마이코박테리움 파라고르도네는 면역세포를 활성화 시켜 사이토카인 분비량을 증가시킴으로써, 비특이적 면역 활성을 높여 면역 증강용 조성물에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
Description
마이코박테리움 파라고르도네를 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다.
면역은 일반적으로 선천성면역(Innate immunity)과 후천성면역(Adaptive immunity)으로 나눌 수 있다. 선천성면역은 병원체 감염을 제1선에서 즉각적으로 방어하는 체계로, 직접적인 침입인자(항원)에 작용하거나 후천성 면역을 유도한다. 후천성 면역은 보다 더 복잡하고 정밀한 체계로 침입인자를 인지하여 제거하거나, 해당 침입인 자에 대한 기억 등의 작용을 하여 선천성면역에 비해 더욱 영구적인 면역 작용을 한다. 선천성면역과 관련된 항원제시세포(Antigen-presenting cells)인 수지상세포 (Dendritic cells, DCs), 대식세포(Macrophages), 자연살해세포(natural killer cells) 등이 직접적인 선천성 면역작용을 하고, 여러 종류의 T세포 활성을 돕는 수용체를 가지고 있으며, 이를통해 사이토카인(cytokines)을 분비한다. 후천성면역은 체내에 침입한 항원에 대한 2차 방어체계로, B림프구, T림프구에 의해 나타나는 특이적 면역반응이다. 항원에 의해 활성화된 T세포의 면역반응은 세포독성 T 세포 반응(Cytotoxic T cell), 도움 T 세포(Helper T cell, Th) 반응 등이 있다. 선천면역에 관계된 수지상세포, 대식세포, 자연살해세포등에서도 외부 침입물질을 인지하여 여러 종류의 사이토카인들을 분비하여 숙주 동물의 면역을 적절하게 변화시켜 주는 반응을 유도하여 면역 방어기작을 적합한 방향으로 나타내기도 한다. 그러나, 때때로 이와 같은 면역반응은 균형이 불균형해지거나 미흡한 면역반응으로 인해 추가적이고 적절한 면역 증강제를 필요로 한다.
본 발명자들은 면역계를 활성화 할 수 있는 미생물을 분리 및 동정하여 이의 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae) 균주, 이의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 마이코박테리움 파라고르도네 균주, 이의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 사료 또는 사료첨가제용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 마이코박테리움 파라고르도네 균주, 이의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 마이코박테리움 파라고르도네 균주, 이의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 프로바이오틱스 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae) 균주, 이의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "용해물"은 상기 마이코박테리움 파라고르도네 내에 포함된 세포 내 생물학적 구성성분, 예를 들어, 세포벽 또는 막, 또는 박테리아 DNA 등의 구성성분, 및 상기 마이코박테리움 파라고르도네가 배양 중 세포 외에 방출한 대사산물이 함유된 배양물과 같은 유용성분의 파쇄물을 포함하는 것을 의미할 수 있다.
상기 미생물의 세포 용해를 달성할 수 있는 방법은 공지의 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 미생물의 세포 용해를 달성할 수 있는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어 세포 개방/파괴는 효소에 의해, 화학적으로 또는 물리적으로 수행될 수 있다. 효소 및 효소 혼합물의 비제한적 예는 프로테이나아제 K와 같은 프로테아제, 리파아제 또는 글리코시다아제이고; 화학물질의 비제한적 예는 이온투과담체, 황산 도데실 나트륨과 같은 세제, 산 또는 염기이고; 물리적 수단의 비제한적 예는 프렌치 프레싱과 같은 고압, 삼투압, 열 또는 추위와 같은 온도이다. 또한, 단백질 분해 효소 이외의 효소, 산, 염기 등의 적절한 조합을 사용하는 방법 또한 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배양액"은 "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 호환적으로 사용될 수 있고, 마이코박테리움 파라고르도네가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 마이코박테리움 파라고르도네를 일정기간 배양하여 얻는 상기 미생물, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 미생물을 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 배양액을 의미할 수 있다. 한편, 상기 배양액 중 균체를 제거한 액체를 "상등액"이라고도 하며, 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나, 배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 상기 "균체"는 본 발명의 미생물 자체를 의미하는 것으로 피부 샘플 등으로부터 분리하여 선별한 미생물 자체 또는 상기 미생물을 배양하여 배양액으로부터 분리한 미생물을 포함한다. 상기 균체는 배양액을 원심분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 중력에 의해 배양액의 하층으로 가라앉으므로 일정 시간동안 가만히 두었다가 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나, 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 명세서에서 용어, "면역"은 체내에 존재하는 자기방어체계로서 인체가 외부로부터 침입해 오는 각종 물질이나 생명체를 자기 자신에 대한 이물질로 인식하여 제거하고 대사시키는 과정을 의미하며, "면역 증강"은 면역 기능을 증진시키는 것을 의미한다. "면역 증강제"는 "항원보강제" 및 "비특이적 면역 증강제"와 호환적으로 사용될 수 있으며, 항원성이 아니며 항원과 사전 또는 동시에 작용할 수 있다. 이들은 항원에 대한 특이적 면역 반응을 비특이적으로 변경 또는 향상시키며, 이는 항원과 함께(예를 들어, 공동-투여) 또는 면역원성을 향상시키거나 면역 반응의 유형을 변경시키기 위해 항원의 투여 전에 미리 주사될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "비특이적 면역"은 "선천성 면역(innate immunity)", "자연면역" 또는 "내재 면역"과 호환적으로 사용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 생균(살아있는 균) 또는 사균(죽어있는 균)일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 균주는 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC 12628BP로 기탁된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 비특이적 면역 활성을 높이는 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 면역 세포의 활성화를 촉진하여 그랜자임 b(granzyme b), 퍼포린(perforin) 및 사이토카인 분비량을 증가시키는 것일 수 있다. 따라서, 면역 세포의 활성화를 촉진하여 그랜자임 b, 퍼포린 및 사이토카인 분비량을 증가시킴에 따라 비특이적 면역 활성을 높이는 것일 수 있다.
상기 면역 세포는 생체 내 면역 기능에 관여하는 모든 세포를 의미할 수 있으며, 일 구체예에 있어서, 수지상세포(Dendritic cells, DCs) 및 자연살해세포(Natural killer cell, NK 세포)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 사이토카인은 신체 방어체계를 제어하고 자극하는 신호 물질로 사용되는 당단백질을 의미할 수 있으며, 일 구체예에 있어서, IFN-β, IFN-γ 및 TNF-a로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 백신 보조제로 사용하기 위한 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 일 양상에 따른 조성물의 투여가 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 발현 증가를 야기할 수 있음을 나타냈다. TNF-α는 백신 반응을 위해 중요한 것으로 알려져 있다. 일 양상에 따른 조성물의 투여가 TNF-α 발현을 증가시키는 것으로 나타났으므로, 상기 조성물은 백신 보조제로 유용할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 일 양상에 따른 조성물은 TNF-α의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 일 양상에 따른 조성물은 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 일 양상은 항원과 조합되어 투여될 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 일 양상에 따른 조성물은 백신접종 직전 또는 직후 환자에게 투여하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 백신 보조제로 사용되는 경우, 일 양상에 따른 조성물은 이들 자체가 환자에게 별도 투여된 항원에 대해 보조제 효과를 제공하기 위해 투여될 것이다. 일 양상에 따른 조성물은 임의의 유용한 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위해 사용될 수 있다. 일 양상에 따른 조성물과 함께 사용하기 위한 예시적인 항원에는 바이러스 표면 단백질과 같은 바이러스 항원; 단백질 및/또는 당류 항원과 같은 박테리아 항원; 진균 항원; 기생충 항원; 및 종양 항원이 포함될 수 있다. 항원은, 예를 들어, 펩타이드 또는 다당류일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 병원성 세균에 대한 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.
상기 병원성 세균은 상기 조성물과는 별도 투여된 항원인 것일 수 있다. 상기 병원성 세균은 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli) 및 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항균"은 (i) 박테리아의 성장을 억제, 감소 또는 방지하거나; (ii) 박테리아가 대상에서 감염을 발생시키는 능력을 억제 또는 감소시키거나; (iii) 박테리아가 환경에서 증식하거나 감염성을 유지하는 능력을 억제 또는 감소시키거나; 또는 (iv) 박테리아에 감염된 세포를 감소시키는 활성을 가짐을 의미할 수 있다.
또 다른 양상은 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae) 균주, 이의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 면역 증강 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae) 균주, 이의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체의 면역 증강에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
상기 균주, 용해물, 배양액 및 면역 증강에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 용어, "대상체", "개체 및 "환자"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 포유동물은 쥣과, 원숭이, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물 및 애완동물을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 생체내에서 수득되거나 시험관내에서 배양된 생물학적 엔티티(entity)의 조직, 세포 및 그들의 자손도 또한 포함된다.
본 명세서에서 용어, "치료제" 또는 "약학 조성물"은, 대상체로의 투여 시에 몇몇 유리한 효과를 부여하는 분자 또는 화합물을 지칭한다. 유리한 효과는 진단적 결정을 가능하게 하는 것; 질병, 증상, 장애 또는 병태의 개선; 질병, 증상, 장애 또는 질환의 발병의 감소 또는 예방; 및 일반적으로 질병, 증상, 장애 또는 병태의 대응을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는" 또는 "완화하는" 또는 "개선하는"은 상호교환가능하게 사용된다. 이들 용어는 치료 이익 및/또는 예방 이익을 포함하나 이들에 한정되지 않는 유리한 또는 요망되는 결과를 수득하는 방법을 지칭한다. 치료 이익은 치료 하의 하나 이상의 질병, 질환 또는 증상의 임의의 치료적으로 유의미한 개선 또는 그에 대한 효과를 의미한다. 예방 이익에 있어서, 조성물은 특정 질병, 질환 또는 증상이 발생할 위험이 있는 대상체에게 또는 질병, 질환 또는 증상이 아직 나타나지 않을지라도, 질병의 하나 이상의 생리학적 증상을 보고하는 대상체에게 투여될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 유리한 또는 요망되는 결과를 야기하기에 충분한 작용제의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 치료되는 대상체 및 병태, 대상체의 체중 및 연령, 병태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 상기 용어는 본원에 기술된 영상화 방법 중 임의의 것에 의한 검출을 위한 이미지를 제공할 용량에 적용된다. 특정 용량은 선택된 특정 작용제, 뒤따르는 투여 요법, 그것이 다른 화합물과 병용하여 투여되는지 여부, 투여 시기, 영상화되는 조직 및 그것을 운반하는 신체 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.
상기 약학 조성물은 임상투여시 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(Nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
상기 약학 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(Carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(Ascorbic acid) 또는 글루타치온(Glutathione)과 같은 항산화제(Antioxidants), 킬레이트화제(Chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(Stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물의 유효용량은 0.01 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.
상기 마이코박테리움 파라고르도네의 투여양은 환자의 면역계가 효과적인 면역 반응을 일으킬 수 있도록, 환자에서 방어적인 면역 반응을 유발하는데 충분한 양일 수 있다. 본 명세서의 특정 구현예에서, 상기 마이코박테리움 파라고르도네는 103 내지 1011개, 104 내지 1010개, 106 내지 1010개, 또는 106 내지 109개일 수 있다. 다른 예로, 용량은 현탁제 또는 건조 조제물로서 제공되는 마이코박테리움 파라고르도네 0.01 mg 내지 10 mg 또는 0.1 mg 내지 1 mg일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 용량은 1 X 103 내지 1 X 1011 cfu/ml, 1 X 104 내지 1 X 1010 cfu/ml, 1 X 106 내지 1 X 1010 cfu/ml, 또는 1 X 106 내지 1 X 109 cfu/ml 일 수 있다.
다른 양상은 마이코박테리움 파라고르도네 균주, 이의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 사료 또는 사료첨가제용 조성물을 제공한다.
상기 균주, 용해물, 배양액 및 면역 증강에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분으로, 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 사료는 당업계의 공지된 다양한 형태의 사료로 제조가능하며, 구체적으로는 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다. 사육 대상은 상기 사료를 섭취할 수 있는 생명체라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "사료 첨가제"는 면역력 향상, 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 포함한다. 본 출원의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨, 벤토나이트 (bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
상기 사료 조성물 내 조성물의 함량은 적용 개체의 종류 및 연령, 적용 형태, 목적하는 효과 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대 0.01 내지 20 중량%, 0.01 내지 15 중량%, 0.01 내지 10 중량%, 0.01 내지 5 중량%, 0.01 내지 1 중량%, 1 내지 20 중량%, 1 내지 15 중량%, 1 내지 10 중량%, 1 내지 5 중량%, 5 내지 20 중량%, 5 내지 15 중량%, 5 내지 10 중량%, 10 내지 20 중량%, 10 내지 15 중량%, 또는 15 내지 20 중량 %로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 사료 조성물은 투여를 위해서 추가로 구연산, 푸마르산, 아디프산, 젖산 등의 유기산; 인산칼륨, 인산나트륨, 중합 인산염 등의 인산염; 폴리페놀, 카테친, 토코페롤, 비타민 C, 녹차 추출물, 키토산, 탄니산 등의 천연 항산화제 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항인플루엔자제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다.
또한, 상기 사료 조성물은 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항산화제, 항진균제, 항균제 등과 같은 각종 보조제 및 분쇄 또는 파쇄된 밀, 보리, 옥수수 등의 식물성 단백질 사료, 혈분, 육분, 생선분 등의 동물성 단백질 사료, 동물성 지방 및 식물성 지방 같은 주성분 이외에도 영양 보충제, 성장 촉진제, 소화 흡수 촉진제, 질병 예방제와 함께 사용될 수 있다.
상기 사료 조성물을 사료 첨가물로 사용할 경우, 상기 사료 조성물을 그대로 첨가하거나 다른성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 사료 조성물의 투여 형태는 비독성 제약상 허용 가능한 담체와 조합하여 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 상기 담체는 비자연적으로 발생한(non-naturally occurring) 물질 또는 자연적으로 발생한 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예로, 상기 담체는 상기 균주가 자연적으로 접촉하지 않는 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 식용 담체는 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체형 담체의 경우에는 정제, 산제, 토로키제 등의 투여 형태일 수 있으며 액체형 담체의 경우에는 시럽제, 액체 현탁액제, 에멀젼제, 용액제 등의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여제는 보존제, 윤화제, 용액 촉진제, 안정화제를 함유할 수 있으며 다른 염증 질환 개선제 및 바이러스 예방상 유용한 물질을 함유할 수도 있다.
상기 사료 조성물은 사료에 건조 중량 기준으로 1 ㎏ 당 약 10 내지 500 g, 또는 10 내지 100 g의 양으로 혼합될 수 있고, 완전히 혼합한 후 매쉬로 공급하거나, 추가 가공 공정을 통하여 팰렛화, 팽창화, 압출 공정을 거칠 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 양상은 마이코박테리움 파라고르도네 균주, 이의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품용 조성물을 제공한다.
상기 균주, 용해물, 배양액 및 면역 증강에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 식품은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강 식품(health food) 및 식품 첨가제(food additive)등의 모든 형태를 포함하며, 상기 유형의 식품은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
상기 조성물은 성장촉진, 면역촉진, 항균을 목적으로 식품에 첨가될 수 있다. 식품은 식품학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 비자연적으로 발생한(non-naturally occurring) 물질 또는 자연적으로 발생한 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 조성물을 포함하는 원료 조성물 중 0.0001 내지 1 중량%, 또는 0.001 내지 0.1 중량%의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 다이사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 추가 성분의 비율은 본 출원의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.04 중량부, 구체적으로는 0.02 내지 0.03 중량부 일 수 있다.
상기 외에 상기 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 상기 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 그밖에 본 출원의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 과육의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 출원의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 10 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 이들 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
또 다른 양상은 마이코박테리움 파라고르도네 균주, 이의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 프로바이오틱스 조성물을 제공한다.
상기 균주, 용해물, 배양액 및 면역 증강에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 용어, "프로바이오틱스"는 체내에 들어가서 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 락토바실러스 등의 유산균을 이용하여 만들어진 발효유 제품으로 섭취되어 왔으나 최근에는 락토바실러스 이외에 비피도박테리움, 엔티로코커스와 같은 일부 균주 등을 포함한 발효유, 과립, 분말 등의 형태로 판매되고 있다. 상기 균주 역시 발효유, 과립, 분말 등의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 프로바이오틱스 조성물은 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 동결보호제일 수 있고, 상기 첨가제 첨가 이후 동결 건조할 수 있다. 이때, 상기 동결 건조된 조성물 내 균주는 생균 상태일 수 있다.
일 양상에 따른 마이코박테리움 파라고르도네는 면역세포를 활성화 시켜 사이토카인 분비량을 증가시킴으로써, 비특이적 면역 활성을 높여 면역 증강용 조성물에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 Mpg 접종 후 DC 및 NK세포 상호작용을 통해 유도된 훈련된 면역을 나타낸 개략도이다.
도 2a는 일 구체예에 따른 Mpg 접종 후 IFN-γ 또는 TNF-α를 생산하는 NK세포의 집단을 유세포 분석을 통해 분석한 결과이고; 및 도 2b는 유세포 분석 결과 IFN-γ 또는 TNF-α 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 일 구체예에 따른 Mpg 접종 후 병원체로 재자극 한 경우 IFN-γ 생성량을 나타낸 그래프이고; 및 도 3b는 TNF-α의 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 SCID 마우스로 수행된 이종 면역 실험에 대한 일정을 도식화한 그림이고; 및 도 4b는 일 구체예에 따른 Mpg 접종 후 병원체가 제거된 것을 나타낸 그래프이다.
도 5a는 일 구체예에 따른 Mpg 접종 후 8주 뒤의 IFN-γ 또는 TNF-α를 생산하는 NK세포의 집단을 유세포 분석을 통해 분석한 결과이고; 도 5b는 유세포 분석 결과 IFN-γ 또는 TNF-α 생성량을 나타낸 그래프이며; 도 5c는 Mpg 접종 후 8주 뒤 병원체로 재자극 한 경우 IFN-γ 생성량을 나타낸 그래프이고; 및 도 5d는 TNF-α의 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 일 구체예에 따른 Mpg 접종 후 IFN-β 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 7a는 일 구체예에 따른 Mpg 접종 후 p-IRF3 및 IRF3에 대한 면역블롯 결과를 나타낸 것이고; 도 7b는 p-IRE1α, IRE1α 및 XBP1에 대한 면역블롯 결과를 나타낸 것이며; 도 7c는 p-TBK1 및 TBK1에 대한 면역블롯 결과를 나타낸 것이고; 및 도 7d는 KIRA6 처리 후, 일 구체예에 따른 Mpg 접종하여 IFN-β 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 8a는 일 구체예에 따른 Mpg의 세포내 c-di-GMP 농도를 HPLC로 분석한 결과 그래프이고; 도 8b는 일 구체예에 따른 Mpg를 SFZ와 배양하여 세포내 c-di-GMP 농도를 ELISA로 분석한 결과 그래프이며; 도 8c는 SFZ의 세포독성을 나타낸 그래프이고; 및 도 8d는 일 구체예에 따른 Mpg를 SFZ와 배양하여 IFN-β 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 9는 H151로 전처리된 DC를 일 구체예에 따른 Mpg를 접종시킨 후 IFN-β 생성량을 나타낸 그래프 및 H151의 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 10a는 일 구체예에 따른 Mpg 접종 후, p-IRE1α, IRE1α, cGAS 및 XBP1에 대한 면역블롯 결과를 나타낸 것이고; 도 10b는 p-TBK1, TBK1 및 LC3B에 대한 면역블롯 결과를 나타낸 것이며; 및 도 10c는 p-IRF3 및 IRF3에 대한 면역블롯 결과를 나타낸 것이다.
도 11a는 BMDC 및 NK세포 공동 배양 시스템의 일정을 도식화한 그림이고; 도 11b는 IFN-γ- 또는 TNF-α-생산 NK세포를 유세포 분석을 통해 분석한 결과 그래프이며; 도 11c는 병원체로 재자극한 후, IFN-γ 생성량을 나타낸 그래프이고; 및 도 11d는 병원체로 재자극한 후, TNF-α 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 12a는 BMDC를 IFNAR KO(C57BL/6) 또는 WT(C57BL/6) 마우스에서 분리하고 WT 마우스의 NK세포와 공동 배양한 후, NK 세포를 유세포 분석을 통해 IFN-γ 또는 TNF-α의 발현을 나타낸 그래프이고; 도 12b는 병원체로 재자극한 후, IFN-γ 생성량을 나타낸 그래프이고; 및 도 12c는 병원체로 재자극한 후, TNF-α 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 13a는 NK 세포를 일 구체예에 따른 Mpg 접종 마우스에서 분리하고 병원체에 감염된 BMDM과 공동 배양한 후, 세포 자살에 의한 세포 사멸을 7AAD 염색 후 유세포 분석을 통해 분석한 결과이고; 도 13b는 유세포 분석 결과 그래프이며; 및 도 13c는 분리된 NK세포에서 granzyme B 및 perforin 1의 mRNA 수준을 qRT-PCT을 통해 확인한 결과 그래프이다.
도 14a는 일 구체예에 따른 Mpg로 자극된 NK세포의 적응 전달 일정을 도식화한 그림이고; 및 도 14b는 일 구체예에 따른 Mpg로 자극된 NK세포에 의해 병원체가 제거된 것을 나타낸 그래프이다.
도 15a는 DC에 일 구체예에 따른 Mpg를 접종시키고, IFN-β 수준을 ELISA를 통해 검출한 결과 그래프이고; 도 15b는 일 구체예에 따른 Mpg로 접종된 PBMC 중 CD3-/CD56+ NK 세포를 게이팅하고, IFN-γ- 또는 TNF-α-생산 NK 세포를 유세포 분석을 통해 분석한 결과이며; 도 15c는 유세포 분석 결과 그래프이고; 및 도 15d는 병원체로 재자극 한 후 IFN-β 및 TNF-a 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 16a는 CFSE 표지된 MDM을 병원체로 감염시키고 일 구체예에 따른 Mpg 접종 PBMC에서 분리된 NK세포와 공동 배양하여, 세포자살에 의한 세포사멸을 7AAD 염색 후 유세포 분석을 통해 분석한 결과이고; 도 16b는 유세포 결과 그래프이며; 및 도 16c는 일 구체예에 따른 Mpg 접종 PBMC에서 분리된 NK세포에서 granzyme B 및 perforin 1의 mRNA 수준은 qRT-PCR을 통해 확인한 결과 그래프이다.
도 2a는 일 구체예에 따른 Mpg 접종 후 IFN-γ 또는 TNF-α를 생산하는 NK세포의 집단을 유세포 분석을 통해 분석한 결과이고; 및 도 2b는 유세포 분석 결과 IFN-γ 또는 TNF-α 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 일 구체예에 따른 Mpg 접종 후 병원체로 재자극 한 경우 IFN-γ 생성량을 나타낸 그래프이고; 및 도 3b는 TNF-α의 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 SCID 마우스로 수행된 이종 면역 실험에 대한 일정을 도식화한 그림이고; 및 도 4b는 일 구체예에 따른 Mpg 접종 후 병원체가 제거된 것을 나타낸 그래프이다.
도 5a는 일 구체예에 따른 Mpg 접종 후 8주 뒤의 IFN-γ 또는 TNF-α를 생산하는 NK세포의 집단을 유세포 분석을 통해 분석한 결과이고; 도 5b는 유세포 분석 결과 IFN-γ 또는 TNF-α 생성량을 나타낸 그래프이며; 도 5c는 Mpg 접종 후 8주 뒤 병원체로 재자극 한 경우 IFN-γ 생성량을 나타낸 그래프이고; 및 도 5d는 TNF-α의 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 일 구체예에 따른 Mpg 접종 후 IFN-β 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 7a는 일 구체예에 따른 Mpg 접종 후 p-IRF3 및 IRF3에 대한 면역블롯 결과를 나타낸 것이고; 도 7b는 p-IRE1α, IRE1α 및 XBP1에 대한 면역블롯 결과를 나타낸 것이며; 도 7c는 p-TBK1 및 TBK1에 대한 면역블롯 결과를 나타낸 것이고; 및 도 7d는 KIRA6 처리 후, 일 구체예에 따른 Mpg 접종하여 IFN-β 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 8a는 일 구체예에 따른 Mpg의 세포내 c-di-GMP 농도를 HPLC로 분석한 결과 그래프이고; 도 8b는 일 구체예에 따른 Mpg를 SFZ와 배양하여 세포내 c-di-GMP 농도를 ELISA로 분석한 결과 그래프이며; 도 8c는 SFZ의 세포독성을 나타낸 그래프이고; 및 도 8d는 일 구체예에 따른 Mpg를 SFZ와 배양하여 IFN-β 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 9는 H151로 전처리된 DC를 일 구체예에 따른 Mpg를 접종시킨 후 IFN-β 생성량을 나타낸 그래프 및 H151의 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 10a는 일 구체예에 따른 Mpg 접종 후, p-IRE1α, IRE1α, cGAS 및 XBP1에 대한 면역블롯 결과를 나타낸 것이고; 도 10b는 p-TBK1, TBK1 및 LC3B에 대한 면역블롯 결과를 나타낸 것이며; 및 도 10c는 p-IRF3 및 IRF3에 대한 면역블롯 결과를 나타낸 것이다.
도 11a는 BMDC 및 NK세포 공동 배양 시스템의 일정을 도식화한 그림이고; 도 11b는 IFN-γ- 또는 TNF-α-생산 NK세포를 유세포 분석을 통해 분석한 결과 그래프이며; 도 11c는 병원체로 재자극한 후, IFN-γ 생성량을 나타낸 그래프이고; 및 도 11d는 병원체로 재자극한 후, TNF-α 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 12a는 BMDC를 IFNAR KO(C57BL/6) 또는 WT(C57BL/6) 마우스에서 분리하고 WT 마우스의 NK세포와 공동 배양한 후, NK 세포를 유세포 분석을 통해 IFN-γ 또는 TNF-α의 발현을 나타낸 그래프이고; 도 12b는 병원체로 재자극한 후, IFN-γ 생성량을 나타낸 그래프이고; 및 도 12c는 병원체로 재자극한 후, TNF-α 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 13a는 NK 세포를 일 구체예에 따른 Mpg 접종 마우스에서 분리하고 병원체에 감염된 BMDM과 공동 배양한 후, 세포 자살에 의한 세포 사멸을 7AAD 염색 후 유세포 분석을 통해 분석한 결과이고; 도 13b는 유세포 분석 결과 그래프이며; 및 도 13c는 분리된 NK세포에서 granzyme B 및 perforin 1의 mRNA 수준을 qRT-PCT을 통해 확인한 결과 그래프이다.
도 14a는 일 구체예에 따른 Mpg로 자극된 NK세포의 적응 전달 일정을 도식화한 그림이고; 및 도 14b는 일 구체예에 따른 Mpg로 자극된 NK세포에 의해 병원체가 제거된 것을 나타낸 그래프이다.
도 15a는 DC에 일 구체예에 따른 Mpg를 접종시키고, IFN-β 수준을 ELISA를 통해 검출한 결과 그래프이고; 도 15b는 일 구체예에 따른 Mpg로 접종된 PBMC 중 CD3-/CD56+ NK 세포를 게이팅하고, IFN-γ- 또는 TNF-α-생산 NK 세포를 유세포 분석을 통해 분석한 결과이며; 도 15c는 유세포 분석 결과 그래프이고; 및 도 15d는 병원체로 재자극 한 후 IFN-β 및 TNF-a 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 16a는 CFSE 표지된 MDM을 병원체로 감염시키고 일 구체예에 따른 Mpg 접종 PBMC에서 분리된 NK세포와 공동 배양하여, 세포자살에 의한 세포사멸을 7AAD 염색 후 유세포 분석을 통해 분석한 결과이고; 도 16b는 유세포 결과 그래프이며; 및 도 16c는 일 구체예에 따른 Mpg 접종 PBMC에서 분리된 NK세포에서 granzyme B 및 perforin 1의 mRNA 수준은 qRT-PCR을 통해 확인한 결과 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<준비예>
균주의 준비 및 실험방법
1. 균주의 준비
사용한 마이코박테리아 균주는 다음과 같다: Mycobacterium bovis BCG Tokyo strain (BCG), Mpg JCM 18565T (Mpg)(수탁번호 KCTC 12628BP), M. tuberculosis H37Ra ATCC 25177, Mycobacterium gordonae ATCC 14470T, Mycobacterium marinum JCM 17638T, Mycobacterium smegmatis NCTC 8159T 및 Mycobacterium anyangense QIA-38T. 모든 균주는 냉동 보관된 상태에서 배양하였고(70℃에서 보관), 37℃ 또는 30℃ (Mpg의 경우) 7H9 배지 (10% ADC 포함) 또는 7H10 한천 고체배지(10% OADC 포함)에서 계대배양하였다. C. albicans, Staphylococcus aureus 및 Escherichia coli 는 30℃ LB 배지 또는 한천 고체배지에서 유지하였다. 실험에 사용하기 전에 모든 균주는 0.05% Tween 80이 포함된 PBS에 현탁하고 30게이지 바늘에 통과시켰다. 열처리 균주는 14 lb/in2 압력으로 121℃에서 15분 동안 멸균에 의해 불활성화시켰다.
2
. In vivo
실험 모델
훈련된 면역 시험을 위해 7주령 암컷 BALB/c 마우스를 코아텍(서울, 대한민국)에서 구입하여 8주령에 실험에 사용하였다. 모든 마우스는 BCG, Mpg 또는 HK-Mpg의 피하 주사 전에 마취시켰으며(1Х106 colony-forming units가 포함된120 μl의 PBS), 박테리아는 2주 간격으로 2회 주사하였다. 최종 백신 접종 후 2주째에 또는 8주째에 마우스를 CO2에 의한 질식으로 안락사시켰다. 보호 효과 시험을 위해 5주령 암컷 CB17-Prkdcscid/NCrKoat (SCID) 마우스(~25g)를 구입하여 8주령까지 사육하였다. 최종 백신 접종 후 2주째에 마우스를 마취시키고 치사량의 C. albicans (1.0x107 CFUs가 포함된 100 l 의 PBS) 생균체를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 7일 후, 1차 세포 분리 또는 CFU 분석을 위해 장기(간 및 신장)를 수집하였다. 6주령 IFNAR 녹아웃(KO) C57BL/6 마우스 및 C57BL/6 마우스를 오리엔트바이오(성남, 대한민국)에서 구입하였다.
3. 세포 배양 및 감염
마우스 수지상세포주 DC2.4를 10% 태아 소혈청(FBS)와 1% 페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep)이 함유된 완전한 RPMI 1640 배지에서 37℃ 및 5% CO2환경에서 유지시켰다. 골수 유래 수지상세포(BMDCs) 및 골수 유래 대식세포(BMDMs)은 8주령 Balb/c, C57BL/6 및 IFNAR KO C57BL/6 마우스의 대퇴골 및 경골에서 분리된 골수에서 생성되었다. 골수세포를 6일 동안 분화시켜 BMDC를 생성하였으며, 마우스 IL-4가 함유된 IMDM(20 ng/ml; PeproTech), 재조합 마우스 GM-CSF(20 ng/ml; PeproTech), 젠타마이신(50 μm/ml; Gibco Invitrogen), L-글루타민(2 nM; Gibco Invitrogen), β-머캅토에탄올(50 nM; Gibco Invitrogen), 10% FBS 및 1% Pen-Strep을 사용하였다. BMDM의 경우, M-CSF (20 ng/ml; PeproTech)가 함유된 완전한 RPMI 배지를 사용하였다. 세포주는 Pen-Strep-free 배지에서 마이코박테리아 균주(감염 다중도(MOI) 10)로 감염시켜 4시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 후 감염된 세포를 PBS로 세척하였고 세포외 마이코박테리아를 제거하기 위해 20 μg/ml 아미카신이 함유된 새로운 배양배지에 배양하였다. NK세포 분리를 위해 비장을 제거 및 처리하여 비장세포 현탁액을 생성하였다. NK세포는 NK세포 분리 키트(Miltenyi Biotec, #130-115-818)의 면역자기 비드를 사용하여 비장세포에서 분리하였다. NK세포는 완전한 RPMI 배지에서 배양하였다.
4.
Ex vivo
재자극 및 사이토카인 어세이
인간 또는 마우스 NK세포를 100 μl의 RPMI 1640 배지(10% FBS 포함, 항생제 없음)가 포함된 96웰 플레이트에서 배양하고 멸균된 C. albicans, S. aureus, E. coli 또는 M. tuberculosis H37Ra (5x106 세포/웰)를 100 μl의 배지에 첨가하였다. 24시간 또는 72시간 후 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA) 키트(Invitrogen)를 사용하여 IFN-γ 및 TNF-α의 농도를 측정하기위해 상청액을 회수하였다. 감염된 DC2.4 세포(1x106 세포/웰) 또는 BMDCs (1x106 세포/웰)는 12웰 또는 6웰 플레이트에서 배양하였으며 마우스 또는 인간 IFN-β, IFN-γ 및 TNF-α ELISA 키트(Invitrogen)를 사용하여 상청액을 분석하였다.
5. NK세포 적응주입/전달(adoptive transfer)
NK세포를 NK세포 분리 키트를 사용하여 백신 접종된 마우스로부터 분리하여 3x106세포(150 μl의 PBS)를 25게이지 바늘로 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하였다. 24시간 후 NK세포가 이식된 마우스에 치사량의 C. albicans (1x107 CFUs/마우스)를 정맥 주사하여 접종하고, 접종 5일 후에 CFU 분석을 위해 신장 및 간을 회수하였다.
6. 비장세포의 분리
마우스에서 장기(비장, 간 및 신장)를 적출하여 RPMI 1640 배지를 추가하면서 5ml 주사기 플런저로 70-μm mesh strainer에 통과시켜 균질화하였다. 샘플은 1500rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 세포 펠렛을 4ml의 적혈구(RBC) 용해 완충액(Sigma-Aldrich, #R7757)에 재현탁한 후 실온에서 3분 동안 인큐베이션시켰다. 그리고 6ml의 RPMI 1640 배지(10% FBS 포함)를 첨가하였고, 세포를 70-μm mesh strainer에 통과시켜 여과하였다. 회수한 세포를 원심분리하여 그 펠렛을 배양배지에 재현탁시켰다.
7. 공동배양 시스템
BMDC 감염 후, NK세포를 상청액을 제거하지 않은 감염된 BMDC에 첨가하였다. BMDCs/NK세포의 공동배양 비율은 1:2이며, 세포는 37℃ 및 5% CO2.에서 48시간 동안 배양하였다.
8. 세포독성 분석
CFSE/7AAD 분석을 위해, 기본적인 세포독성 키트(Immunochemistry Technologies, #970)를 사용하였다. BMDM을 10분 동안 CFSE로 염색하고 1시간 동안 C. albicans, S. aureus 또는 E. coli를 감염시켰다. NK세포를 CFSE로 표지한 감염된 BMDM과 5:1의 비율로 24시간 동안 공동 배양하였다. 감염된 BMDM의 세포사멸은 7AAD 염색 10분 후에 유세포 분석을 통해 분석하였다. NK세포는 백신 접종된 마우스에서 분리하였으며 마우스를 희생시키기 전 다른 마우스를 48시간 동안 치사량의 C. albicans 생균체로 감염시킨 후 1차 세포 분리를 위해 간과 신장을 적출하였다. NK세포는 감염된 간 또는 신장 세포와 5:1의 비율로 공동 배양하였다. 48시간 후, 세포를 PBS로 세척하고 CFU 분석을 위해 회수하였다. 동일한 실험 세트에서 CytoTox96® Reagent (Promega)를 사용하여 젖산 탈수소효소(LDH) 세포독성 분석을 수행하였다. MTT 분석을 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 MTT 분석 키트(Abcam, #ab211091)를 사용하였다. 분석을 위해 감염된 숙주세포의 상청액을 회수하였다.
9. 인간 1차 세포 분화 및 분리
말초혈액 단핵구(PBMC)를 질량 원심분리를 이용하여 혈액으로부터 분리하였다. 혈액을 PBS(1:1)로 희석하여 Ficoll-Paque (GE Healthcare, #GE17144002) 표면 위에 고르게 넣어준 후 20분 동안 400g에서 느린 가속으로 원심분리하였다. 혈장 혈청의 최상층은 따로 보관되었으며 펠렛화된 적혈구를 방해하지 않고 PBMC를 확보하였다. 확보한 PBMC를 PBS로 세척하고 500 U/ml 재조합 인간IL-2 (PeproTech) 및 공여자의 20% 헐장 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBMC를 4시간 동안 Pen-Strep-free 배지에서 마이코박테리아 균주(MOI 10)로 감염시킨 후 PBS로 세척하였다. FACS Aria cell sorter (BD Aria III)를 사용하여 인간 NK세포를 분류하였다. CD3-/CD56+ 세포를 95% 이상의 순도로 분류하였고 mRNA 추출 및 재자극 실험을 위해 수집하였다.
10. 유세포 분석
비장세포 또는 NK세포를 분리하여 96웰의 둥근 바닥 플레이트에 배양(3-5x106 세포/웰) 하였다. 유세포 분석을 위해 세포를 실온에서 10분 동안 Fc 수용체 차단을 위해 완충액(10% FBS 및 10mM EDTA가 함유된 PBS)에서 항-CD16/32(BioLegend, #101301) 와 함께 인큐베이션하였고, 얼음에서 30분 동안 표면 마커-특이적 항체(1:500)로 염색하였다.
세포내 사이토카인 염색을 위해 세포를 고정 완충액(1% 파라포름알데히드가 포함된 PBS)을 이용하여 20분 동안 실온에서 고정시킨 후 완충액으로 세척하였다. 그 다음으로 투과 완충액(0.1% Triton X-100이 포함된 완충액)을 실온에서 30분 동안 첨가하였고, 세포를 PBS로 세척하였다. 투과 과정 후, 세포내 사이토카인-특이적 항체(1:200)를 투과 완충액에 첨가하였고 얼음에서 40분 동안 인큐베이션하였다.
11. 면역블롯팅
DC2.4세포를 회수하여 단백질분해효소 억제제 및 인산염 억제제(Hoffmann-La Roche Inc., Swiss, #04693132001 및 #04906837001)가 포함된 RIPA 완충액(CST, #9806)을 사용하여 얼음 위에서 30분 동안 용해시켰다. 브래드포드 단백질 정량법(Bio-Rad, #5000201)을 사용하여 단백질 정량을 수행하였고 단백질을 10분 간 끓는 물에서 변성시켰다. 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하여 NC 멤브레인으로 이동시켰다. 멤브레인은 5% 탈지 우유 또는 BSA로 블로킹한 후 4℃에서 밤새 1차 항체와 인큐베이션하였다. 다음과 같은 1차 항체(1:1000)를 사용하였다: 항-토끼 IRF3 (Cell Signaling Technology, #4302), 항-토끼 p-IRF3 (Cell Signaling Technology, #29047), 항-토끼 IRE1α (Cell Signaling Technology, #3294), 항-토끼 p-IRE1α (Abcam, #ab124945), 항-토끼 XBP-1s (Cell Signaling Technology, #12782), 항-토끼 TBK-1 (Cell Signaling Technology, # 3504S), 항-토끼 p-TBK1 (Cell Signaling Technology, #5483S) 및 항-마우스 GAPDH (Thermo, #MA5-15738-D680). 3-4회 세척한 후, 멤브레인을 HRP-접합된 2차 항체(1:20000)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 멤브레인을 ECL 용액에 적셔 Amersham Imager 600 imagers (GE Healthcare)를 사용하여 시각화하였다.
12
. In vitro
억제제 처리
DC 2.4세포를 6웰 배양 플레이트에 배양하여(1x106/웰), 0.2 μM, 1 μM 또는 5 μM KIRA6 (Sigma-Aldrich, #532281001)을 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 6시간의 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고 BCG, Mpg 또는 HK-Mpg (MOI 10)를 4시간 동안 감염시켰다.
인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고 10% FBS, 10 μM 아미카신 및 0.2 μM, 1 μM 또는 5 μM KIRA6이 함유된 새로운 배지로 세척하였다. 24시간 후, 총 mRNA를 추출하기위해 세포를 TRIzol (Sigma-Aldrich)을 사용하여 용해시켰다. 마이코박테리아 감염 전 DC2.4세포를 3시간 동안 H151 (InvivoGen, #inh-h151)로 전처리하고 2시간 동안 RU521 (InvivoGen, #inh-ru521)과 함께 인큐베이션하였다. DC2.4세포를 2% FBS 및 1% Pen-Strep이 함유된 새로운 RPMI 배지에서 H151 또는 RU521과 함께 인큐베이션하고, 마이코박테리아 감염 전 PBS로 세척하였다.
13. CFU 계수 분석
간 및 신장을 마우스로부터 수득하여 균질화하고 70-μm mesh strainer를 통해 여과하고 PBS로 연속적으로 희석하였다. 균질화된 장기는 37℃에서 LB 한천 플레이트에 플레이팅한 후 콜로니 수를 계수하였다.
14. RNA 추출 및 정량적 실시간 PCR
제공된 지침에 따라 TRIzol (Invitrogen)을 사용하여 DC2.4 또는 인간 NK세포로부터 총 mRNA를 추출하였다. SYBR green qPCR Master Mix(Bioneer, #K6403)를 이용한 정량적 역전사-PCR(qRT-PCR)에 총 RNA 샘플당 총 100~300ng을 사용하였다. 각 실험에서 상대적 발현 수준을 β-액틴 (마우스) or GAPDH (인간) 발현으로 정규화하여 계산하였다.
15. 게놈 분석
GGDEF 도메인 함유 단백질의 유전자좌 태그는 Genious Prime을 통해 확인하였다. Pfam을 적용하여 각 단백질의 GGDEF 도메인을 확인하고 각 단백질 서열에서 GGDEF 도메인의 유전자좌를 확인하였다. 각 GGDEF 도메인을 포함하는 단백질의 기능을 Chunlab을 통해 확인하였다.
16. 공초점 현미경 이미징
DC2.4세포를 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정시킨 후 DAPI (Vector Laboratories, US, Vectashield)가 포함된 마운팅 용액을 사용하여 마운팅하였다. 공초점 현미경(Olympus, FV3000)을 사용하여 이미지를 확보하였다.
17. 윤리 선언문
모든 동물 실험은 기관 권장 사항에 따라 수행되었다. 절차는 서울대학교 실험동물자원연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC, 승인 번호 SNU-181008-2-1 및 SNU-190926-7-2)의 승인을 받았다. 사람 혈액은 건강한 기증자의 동의를 얻어 채취하였으며 사람 혈액을 이용한 모든 실험은 서울대학교 기관심의위원회(IRB, 승인번호 1907-021-1045)의 승인을 받았다.
18. 통계적 분석
모든 실험 데이터는 GraphPad Prism 5(GraphPad, CA, USA)를 이용하여 분석하였으며, 모든 실험은 2개 이상의 독립적인 반복실험으로 수행하였다. 모든 결과를 one- 또는 two-way ANOVA와 Tukey의 다중비교검정으로 비교하여 여러 실험군을 비교하였고, Student's t 검정을 적용하여 두 실험군을 비교하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)를 나타내며 통계적 유의성은 다음과 같이 별표로 표시하였다: *P < 0.05, **P < 0.01, 및 ***P < 0.001 (ns, not significant).
실험예 1. 마이코박테리움 파라고르도네의 NK 세포에 의한 비특이적 면역 반응 유도 효과 확인
실험예 1-1. IFN-
및 TNF-
발현 확인
Mpg 생균체에 의한 이종 면역의 유도 가능성을 평가하기 위해, Mpg 생균체, BCG 또는 HK-Mpg(열처리된 Mpg)를 마우스에 2주 간격으로 2회 피하주사하였다. IFN-γ는 주로 NK세포와 T세포에 의해 생성되기 때문에, 선천성 면역계에 기초한 IFN-γ 수준 증가의 주요 원인을 조사하기 위해 알려진 활성 마커(IFN-γ 및 TNF-α) 및 NK세포의 비특이적 면역 반응에 대하여 평가하였다.
그 결과, Mpg 생균체 그룹은 BCG 및 HK-Mpg 그룹과 비교하여 증가된 IFN-γ 및 TNF-α 발현 수준을 보여주었고(도 2a 및 2b), 동일한 실험 세트에서 열처리된 연관성이 없는 병원체인 C. albicans, S. aureus, E. coli 및 M. tuberculosis H37R로 생체외에서 세포를 재자극하였을 때, Mpg 생균체 그룹에서 분리된 NK세포에서 강력한 IFN-γ 및 TNF-α가 생성되는 것을 관찰하였다(도 3a 및 3b). 이러한 결과는 Mpg 생균체가 NK세포에서 이종 면역 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다.
실험예 1-2. 비특이적 면역 확인
상기 관찰된 효과가 생체내에서 선천성 면역세포 기반 이종 또는 비특이적 보호 효과로 이어질 수 있는지 여부를 추가로 확인하기 위하여 T 및 B세포가 결핍된 SCID 마우스를 사용하였다. BCG 또는 Mpg 생균체를 마우스에 백신 접종 후 치사량의 C. albicans 생균을 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하였다. 감염 후 7일째에 그룹 간 간과 신장에서의 C. albicans의 CFU를 비교하였다(도 4a).
그 결과, Mpg 생균체 그룹은 다른 모든 그룹보다 현저히 낮은 진균 부담을 보여 적응 면역 체계와 무관한 선천성 면역 세포 매개 비특이적 보호 효과가 유도되었음을 나타낸다(도 4b).
실험예 1-3. 장기 면역 기억 능력 확인
또한, Mpg 생균체가 NK세포의 장기 면역 기억 능력을 유도하는지 여부를 명확히 하기 위해 마지막 백신 접종 후 최대 8주까지의 비특이적 면역 반응을 분석하였다.
그 결과, 상기 관찰된 결과와 일관되게 NK세포에서 강화된 IFN-γ 및 TNF-α의 발현 수준이 유지되었으며(도 5a), Mpg 생균체 백신 접종 그룹에서 NK세포 집단의 변화없이 재자극 후에도 상응하는 분비 수준이 증가하였다(도 5b, 5c 및 5d).
종합적으로, 상기와 같은 결과는 Mpg 생균체 백신 접종이 NK세포의 선천성 면역 기억 능력에 기초하여 이종 또는 비특이적 보호 효과를 유도함을 시사한다.
실험예 2. Mpg생균체가 DC에서 IRE1α/XBP1 기전을 통해 ER 스트레스 반응을 유도하여 증가된 IFN-β 반응을 유발함을 확인
실험예 2-1. IFN-β 생성 확인
I형 IFN, IL-12 및 IL-15와 같은 DC 유래 사이토카인은 NK세포의 활성화를 강화시킨다. 따라서, DC의 Mpg생균체 감염이 NK세포와 관련된 사이토카인의 강화된 생산을 유도하는지 여부를 DC2.4세포를 24시간 동안 MOI 10에서 생균 또는 HK-Mpg, M. gordonae, M. marium, BCG 또는 M. smegmatis로 감염시켜 확인하였다.
그 결과, Mpg 생균체가 다른 마이코박테리아 균주와 비교하여 DC2.4세포에서 IFN-β의 강력한 생성이 유도되는 것을 확인하였으며(도 6), 이는 Mpg 생균체에 감염된 DC에 의해 기억 유사 NK세포가 생성된다는 것을 의미한다.
실험예 2-2. 전사 인자 확인
또한, Mpg 생균체 감염 24시간 후에 I형 IFN 유전자 발현을 유도하는 필수 전사 인자인 IRF3의 증가된 인산화 수준을 확인하였다(도 7a). 미생물 감염에서 I형 IFN 반응은 잘못 접힌 단백질의 축적으로 인해 ER에서 붕괴된 항상성을 회복하기 위해 발생하는 ER 스트레스 반응과 관련이 있다. 따라서 Mpg 생균체 감염에 대한 반응으로 I형 IFN 유도와 세포내 ER 스트레스 센서 사이의 연관관계를 조사하였다. 그 결과 실제로 Mpg 생균체가 IRE1α 인산화를 유도하여 XBP1 mRNA 스플라이싱을 통해 XBP1 단백질을 생성하는 것을 확인하였으며, 반면 BCG나 HK-Mpg는 IRE1α/XBP1 신호 전달 경로를 활성화시키지 않는 것을 확인하였다(도 7b).
또한, IRE1α 매개 UPR(unfolded protein response)이 TBK1-IRF3활성을 통해 I형 IFN 반응을 활성화하기 때문에, 이 부분에 대해서도 확인해보았다. 그 결과, 인산화된 TBK1의 수준이 향상되어 IRF3의 인산화도 활성화시켰다. ER 스트레스 반응의 다운스트림에서 LC3B-II의 유도를 발견하였는데, 이는 Mpg 생균체에 감염된 DC에서 세포 항상성에 대한 강화된 자가포식 활성을 시사한다. 그러나 BCG 또는 HK-Mpg로 감염된 DC가 ER 스트레스를 유발하지 않을 때 LC3B-II에서의 변화는 없었다(도 7c).
다음으로, Mpg생균체에 의해 유도된 IFN-β 생성 증가에서 IRE1α의 현저한 역할을 조사하기 위해 IRE1α의 키나제 억제제인 KIRA6을 사용하여 IRE1α 억제하여 마우스(BALB/c)로부터 유래한 BMDC에 처리하였다. 그 결과, IFN-β 생성 수준의 감소는 용량 의존적으로 Mpg생균체로 감염된 DC2.4세포에서만 관찰되었으며(도 7d), 이는 Mpg-감염된 DC에서 발견되는 강화된 유형 I IFN 반응이 IRE1α/XBP1s 의존적 방식으로 유도된다는 것을 의미한다.
실험예 3. C-di-GMP는 Vita-PAMP로서 STING 의존성 I형 IFN 생산에 관여함을 확인
실험예 3-1. c-di-GMP 수준 확인
유형 I IFN 반응은 미생물의 살아있는 상태를 인식하는 일종의 형태인지수용체(pattern recognition receptors, PRR)에 의해 생존 가능한 박테리아의 인식을 통해 유도되며, 인식된 리간드는 vita-PAMP(pathogen-associated molecular patterns)라고 하며, 이는 차례로 숙주의 선천성 면역 반응을 유도하는 뚜렷한 신호 전달의 연쇄반응으로 이어질 수 있다. Mpg 생균체가 DC에서 IFN-β를 유도할 수 있기 때문에 Mpg가 독특한 vita-PAMP를 생성할 수 있다고 가정하였다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 통해 vita-PAMP로서 Mpg생균체의 박테리아 cyclic dinucleotides(CDN)의 가능성을 조사하였다.
그 결과, Mpg 생균체의 c-di-GMP(Cyclic diguanosine monophosphate) 수준이 동일한 수의 마이코박테리아에서 BCG 또는 HK-Mpg보다 높은 것을 확인하였다(도 8a).
다음으로, c-di-GMP가 Mpg생균체에 감염된 DC에서 I형 IFN 반응의 유발제로서 역할을 하는지 여부를 조사하기 위해 c-di-GMP 생합성 및 바이오막 생성을 방해하는 것으로 알려진 설파티아졸(SFZ)을 성장률이나 생존력에 영향을 미치지 않는 농도로 첨가하여 마이코박테리아 균주와 함께 배양하였다(도 8b).
그 결과, SFZ 처리된 Mpg생균체가 감염에 사용되었을 때 숙주 세포 독성이 없는 DC2.4 세포에서 IFN-β 분비가 유의하게 감소되었음을 확인하였다(도 8c 및 8d).
실험예 3-2. STING 의존성 IFN 생성 확인
C-di-GMP가 ER 스트레스 반응과 연관된 선천성 면역 센서인 STING(stimulator of interferon genes)에 직접 결합한다는 것은 잘 알려져 있다. STING의 길항제인 H-151 처리를 통해 Mpg생균체로 유도된 I형 IFN 반응의 STING 의존성을 추가로 평가하였다. 그 결과, IFN-β 생산은 Mpg생균체에 감염된 DC2.4 세포에서만 용량 의존적으로 H-151 처리에 의해 감소하였으며, 이는 Mpg생균체가 STING 의존성 I형 IFN 생산을 유도함을 나타낸다(도 9). 결과적으로, 이러한 데이터는 Mpg 생균체가 감염된 DC에서 vita-PAMP로서 c-di-GMP의 STING 감지를 통해 I형 IFN 반응을 유도할 수 있음을 시사한다.
실험예 3-3. ER 스트레스 반응 유도 확인
DC에서 Mpg 생균체에 의해 생성된 c-di-GMP에 유도된 I형 INF 생성과 ER 스트레스 반응 사이의 연관성을 추가로 확인하기 위해 Mpg에 의해 생성된 c-di-GMP를 제거하기 위해 SFZ 처리 유무와 관계없이 ER 스트레스 반응의 유도를 비교하였다. 그 결과, Mpg 생균체의 SFZ 전처리에 의해 p-IRE1α 및 XBP1 발현 수준이 감소하는 것을 확인하였다(도 10a). SFZ 처리에 의해 유도된 감소된 ER 스트레스 반응은 또한 TBK1 및 IRF3의 감소된 활성화로 이어졌으며, LC3B-II 수준은 SFZ 처리 후에 감소하였다(도 10b 및 10c).
이러한 결과는 c-di-GMP가 Mpg 생균체의 vita-PAMP이며 ER 스트레스 매개 유형 I IFN 반응을 STING-의존적 방식으로 유도함을 종합적으로 시사한다.
실험예 4. Mpg생균체 감염에 의해 유도된 DC 유래 IFN-β에 의한 NK세포 훈련 확인
실험예 4-1. DC와 NK세포 사이의 상호작용 확인
DC와 NK세포 사이의 상호작용은 DC 유래 유형 I IFN을 통해 NK세포의 세포독성을 강화시키는 선천성 면역 활성에서 중심 역할을 한다. BMDC-NK세포 공동 배양 시스템을 통해 Mpg생균체 감염에 반응하여 NK세포를 활성화하는 DC의 직접적인 역할을 다음과 같이 확인하였다.
마우스(BALB/c)에서 분리된 BMDC를 분화시켜 24시간 동안 BCG, Mpg생균체 또는 HK-Mpg로 감염시켰다. 다음으로, 48시간 동안 감염된 BMDC와 함께 다른 마우스(BALB/c)에서 분리된 NK세포를 공동 배양하였다(도 11a).
그 결과, NK세포에서 IFN-γ 및 TNF-α의 발현 수준은 이들 세포가 Mpg생균체-감염 BMDC와 공동 배양될 때 향상되었으며(도 11b), 이는 Mpg생균체가 DC 매개 NK세포 활성화를 유도할 수 있음을 시사한다. 또한, NK세포를 Mpg생균체에 감염된 BMDC와 공동 배양시켰을 때 관련 없는 병원체로 재자극한 후 NK세포의 비특이적 면역 반응이 증가하는 것을 확인하였다(도 11c 및 11d). 이러한 결과는 Mpg생균체에 감염된 DC와 공동 배양된 NK세포가 NK세포 활성화를 유도할 수 있을 뿐만 아니라 관련 없는 병원체에 의한 재자극에 대한 반응으로 사이토카인을 효과적으로 생성할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 이러한 결과는 Mpg생균체에 감염된 DC에 의해 확립된 분비된 사이토카인 환경이 사이토카인에 의해 유도된 기억 유사 NK세포 분화로 이어질 수 있으며, 관련 없는 병원체로 재자극하여 활성화될 수 있는 세포를 생성할 수 있음을 시사한다.
실험예 4-2. DC에 의해 생성된 IFN-β와 NK세포의 관련성 확인
DC에 의해 생성된 IFN-β가 Mpg생균체 감염에 대한 반응으로 사이토카인 유도 기억 유사 NK세포 생성과 관련이 있음을 추가로 입증하기 위해 IFNAR1 KO 마우스의 BMDC를 사용하여 손상된 IFN-β 신호가 NK세포에 미치는 영향을 평가하였다. 야생형(C57BL/6) 및 IFNAR1 KO 마우스 유래 BMDC를 BCG, Mpg 또는 HK-Mpg로 감염시켜 다른 마우스((C57BL/6)로부터 분리된 NK세포와 공동 배양하였다.
그 결과, BMDC에서 결함이 있는 IFN-β 신호전달은 NK세포에서 IFN-γ 및 TNF-α의 발현 수준을 감소시키는 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 IFN-β가 BCG 또는 HK-Mpg가 아닌 Mpg생균체에 의한 NK세포 활성화에 기여함을 시사한다(도 12a).
또한, NK세포가 관련 없는 병원체로 생체외에서 재자극된 후 WT 또는 IFNAR1 KO 마우스의 감염된 BMDC와 공동 배양된 NK 세포에서 IFN-γ 및 TNF-α 생성을 평가하였다.
그 결과, NK세포는 특히 C. albicans 재자극 후 IFNAR1 KO 마우스로부터의 Mpg생균체-감염 BMDC와 공동 배양할 때 IFN-γ 및 TNF-α의 생성 감소를 나타내었다(도 12b 및 12c).
종합적으로, 상기와 같은 결과는 DC 유래 유형 I IFN이 Mpg생균체 감염에 대한 반응으로 성공적인 NK세포 활성화를 유도한다는 것을 나타낸다.
실험예 5. Mpg 생균체를 백신 접종한 마우스의 NK세포의 감염된 세포에 대한 강화된 세포독성확인
실험예 5-1. NK 세포 매개 비특이적 면역 효과 확인
Mpg생균체 백신 접종의 비특이적 보호 효과가 NK 세포 매개 세포독성에 의해 강화되는지 여부를 추가로 평가하기 위해, Mpg생균체에 의해 감염된 1차 세포에 유도된 NK세포의 강화된 세포독성을 다음과 같이 평가하였다.
BMDM을 C. albicans, S. aureus 또는 E. coli 생균으로 감염시켰고, 백신 접종된 마우스로부터 NK세포를 분리하였다. 분리된 NK세포와 감염된 BMDM을 48시간 동안 5:1의 비율로 공동 배양하였다.
그 결과, Mpg생균체 백신 접종 그룹이 특히 C. albicans 및 S. aureus에 감염된 BMDM에 대해 높은 NK세포의 세포 독성을 나타냈으며, 이는 Mpg생균체로 자극된 NK세포가 주로 강화된 세포 용해 활성을 통해 병원체에 대한 보호 효과를 매개할 수 있음을 나타낸다(도 13a 및 13b). 또한, granzyme B 및 perforin 1의 발현 수준은 BCG 백신 접종 마우스의 발현 수준과 비교하여 일관되게 Mpg 백신 접종 마우스의 NK세포에서 높게 상승하는 것을 확인하였다(도 13c). 전반적으로, Mpg 백신을 접종한 마우스의 NK세포는 세포용해 단백질 생산의 유도를 통해 감염된 대식세포에 대해 강화된 세포독성을 발휘하는 것을 확인하였다.
실험예 5-2. NK 세포 매개 비특이적 병원체 제거 효과 확인
다음으로, 생체 내에서 Mpg생균체 백신 접종 마우스의 NK 세포의 세포 독성을 추가로 검증하기 위해 NK세포 적응 전달을 통해 Mpg생균체로 자극된 NK세포의 보호 효과를 다음과 같이 평가하였다.
NK세포를 PBS 또는 Mpg 생균체로 처리된 마우스로부터 분리하였고 NK세포 전달 24시간 후에 치사량의 C. albicans로 감염된 다른 마우스로 전달하였다. 5일 후, 간과 신장을 회수하였고 병원체 제거율을 평가하기 위해 CFU 분석을 수행하였다(도 14a).
그 결과, Mpg 생균체 접종 마우스의 NK세포를 전달하였을 때, 이들 조직에서의 균 부담이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다(도 14b). 이러한 결과는 Mpg 백신 접종이 감염된 세포에 대한 NK세포의 세포독성 활성의 강화를 통해 비특이적 보호 효과를 유발할 수 있다는 것을 추가로 뒷받침한다.
실험예 6. Mpg생균체의 인간 NK세포에서 훈련된 면역 유도 확인
실험예 6-1. 사이토카인 발현 확인
다음으로, Mpg생균체가 인간 NK세포에서 훈련된 면역을 유발할 수 있는지 여부를 평가하였다. 따라서 인간 NK세포에 대한 훈련 효과를 평가하기 위해 Mpg생균체로 자극된 PBMC의 기능적 조사를 수행하였다.
먼저, Mpg생균체가 감염된 인간 DC에서 증가된 IFN-β를 유도하여 시험관 내 인간 NK세포 훈련에 대한 증거를 제공하는지 여부를 평가하였다.
그 결과, 상기 결과와 일관되게, Mpg 생균체에 감염된 인간 단핵구 유래 수지상세포(moDCs)는 24시간 이내에 c-di-GMP의 존재에 의존하여 상당한 IFN-β를 생성하였다(도 15a). 감염 48시간 후, 총 NK세포 집단의 변화없이 Mpg-감염 PBMC 중에서 IFN-γ- 또는 TNF-α-발현 NK세포가 증가하였다(도 15b 및 15c). 또한, Mpg생균체에 감염된 그룹은 24시간 동안 관련 없는 병원체에 노출되었을 때 사이토카인 분비가 증가하는 것을 나타내어, 비특이적 면역 반응이 크게 향상되었음을 나타내었다(도 15d).
실험예 6-2. 비특이적 세포독성 확인
그 다음, 감염 후 인간 NK세포의 세포용해력을 평가하기 위해, 분류된 NK세포를 CFSE로 표지된 인간 단핵구 유래 대식세포(MDM)와 공동 배양하고 C. albicans, S. aureus 또는 E. coli 생균을 5:1의 비율로 24시간 동안 감염시켰다.
그 결과, 감염된 MDM의 CFSE+/7AAD+ 집단은 BCG 자극 NK세포와의 공동 배양과 비교하여 Mpg 생균체 자극 NK세포와의 공동 배양했을 때 증가하는 것을 확인하였다(도 16a 및 16b). Perforin 1 및 granzyme B mRNA 발현의 상향 조절은 감염된 PBMC로부터 분리된 NK세포에서도 관찰되었으며(도 16c), 이는 Mpg 생균체 감염이 인간 NK세포에서 강화된 세포독성을 유도할 수 있음을 나타낸다.
종합적으로, 상기 결과는 Mpg 생균체가 강화된 비특이적 세포독성 활성을 갖는 세포로 인간 NK세포의 분화를 유도함을 시사한다.
Claims (13)
- 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae) 균주, 이의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 생균 또는 사균인 것인, 면역 증강용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 수탁번호 KCTC 12628BP로 기탁된 것인, 면역 증강용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 비특이적 면역 활성을 높이는 것인, 면역 증강용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 면역 세포의 활성화를 촉진하여 그랜자임 b(granzyme b), 퍼포린(perforin) 및 사이토카인 분비량을 증가시키는 것인, 면역 증강용 약학 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 면역 세포는 수지상세포(Dendritic cells, DCs) 및 자연살해세포(Natural killer cell, NK 세포)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 면역 증강용 약학 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 사이토카인은 IFN-β, IFN-γ 및 TNF-a로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 면역 증강용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 백신 보조제로 사용하기 위한, 면역 증강용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 병원성 세균에 대한 항균 활성을 갖는 것인, 면역 증강용 약학 조성물.
- 청구항 9에 있어서, 상기 병원성 세균은 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli) 및 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 면역 증강용 약학 조성물.
- 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae) 균주, 이의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 사료 또는 사료첨가제용 조성물.
- 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae) 균주, 이의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품용 조성물.
- 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae) 균주, 이의 용해물 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 프로바이오틱스 조성물.
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