KR20240004937A - Bma031 항원 결합 폴리펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 α/β T 세포 수용체(TCR)/분화 3 클러스터(CD3) 복합체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 항원 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 숙주 세포, 및 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물, 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 약제에 사용하기 위한, 특히 증식성 질환의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 항원 결합 폴리펩타이드, 핵산, 벡터, 숙주 세포 또는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항원 결합 폴리펩타이드의 결합을 개선 또는 유지시키고/시키거나 이의 안정성을 개선시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포를 검출하거나, 결정하거나 또는 농축시키는 방법에 관한 것이다.

Description

BMA031 항원 결합 폴리펩타이드
본 발명은 α/β T 세포 수용체(TCR)/분화 3 클러스터(CD3) 복합체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 항원 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 숙주 세포, 및 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물, 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 약제에 사용하기 위한, 특히 증식성 질환의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 항원 결합 폴리펩타이드, 핵산, 벡터, 숙주 세포 또는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항원 결합 폴리펩타이드의 결합을 개선 또는 유지시키고/시키거나 이의 안정성을 개선시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포를 검출하거나, 결정하거나 또는 농축시키는 방법에 관한 것이다.
두 가지 유형의 T 림프구는 두 가지 유형의 각각의 TCR, 즉 α/β TCR 또는 γ/δ TCR의 발현에 따라 구별될 수 있다. α/β TCR은 대부분의 인간 T 림프구(약 >80%)에서 발현되는 반면, γ/δ TCR은 말초 림프 기관 및 혈액은 물론 대부분의 상피 조직의 인간 T 세포에서 <20% 정도로 발현된다. α/β TCR은 주요 조직적합성 복합체(MHC; 문헌[Borst et al.; Human Immunology, 29, 175-188, 1990])의 분자에 결합된 외래 항원을 인식한다. 쥐 항체 BMA031은 인간 α/β TCR/CD3 복합체에 대해 지시된다(문헌[Borst et al., 1990]). α/β TCR에 특이성을 갖는 인간화 항체는 쥐 단클론 항체 BMA031을 기반으로 생산되었다; 문헌[Shearman et al., The Journal of Immunology; vol. 147, 4366-4373, no: 12; 1991], 또는 EP 0403156A1. 그러나 EUCIV3과 같은 BMA031의 인간화 버전은 쥐 BMA031에 비해 더 낮은 결합을 나타내었다; 문헌[Shearman et al., 1991]. 추가 인간화 BMA031 변이체가 또한 선행 기술에서 개시되었으며 세포-매개 세포용해를 유도하는 것으로 나타났다(문헌[Shearman et al .; 1990]). 따라서 인간화 BMA031 분자는 질병 및 장애, 예를 들어 증식성 질환의 면역요법을 개선하는 데 상당한 의학적 잠재력을 제공할 수 있다. 그러나 지금까지 인간화 BMA031 변이체는 낮은 결합 및/또는 불충분한 안정성으로 어려움을 겪었다.
따라서, 당해 분야에서는 유효하게 결합하고 유리한 안정성을 갖는 인간화 BMA031 변이체가 필요하다.
본 발명은 BMA031로부터 유래되고 α/β TCR/CD3 복합체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드를 제공한다. 항원 결합 폴리펩타이드는 본원에 제공된 치환을 포함한다. 특히, 항원 결합 폴리펩타이드는
(i) 하기의 중쇄 위치 중 하나 이상: 30, 31, 53 및 54; 및/또는
(ii) 하기의 경쇄 위치 중 하나 이상: 31 및 56
에서 양으로 하전된 아미노산에 의한 본 발명의 치환(들)을 포함하며, 여기서 위치는 카밧(Kabat) 넘버링에 따른다. 추가로, 본원에 제공된 항원 결합 폴리펩타이드는 Kabat 넘버링에 따른 90번 위치(예를 들어 90번 위치의 히스티딘(H)의)에서 티로신(Y)에 의한 본 발명의 치환을 포함한다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 특히 문헌[Brinkmann et al.; MABS2017, Vol. 9, No. 2, 182-212]에 기재된 바와 같은 항체 조작 방법을 사용함으로써 다양한 상이한 항체 포맷에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 특히 당해 분야에 비해 하기와 같은 이점을 제공한다: 본원에 제공된 치환을 포함하지 않는 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 (i) α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 세포에 대한 증가된 결합; 및/또는 (ii) 증가된 안정성, 특히 열 안정성. 더욱 또한, 본원에 제공된 치환의 조합이 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 세포에 대한 결합을 향상시키는 상승작용 효과를 제공한다는 것이 예기치 않게 입증되었다. 더욱이, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 본 발명의 치환을 포함하지 않는 항원 결합 폴리펩타이드에 비해 모집된 T 세포의 효과기 기능을 개선시킨다, 예를 들어 개선된 의학적 효과를 갖는다. 예를 들어, 항원 결합 폴리펩타이드가 이중특이성 분자이고 특히 TCR(예를 들어, TCER® 분자)을 포함하는 경우, 효과기 분자를 포함하는 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 본 발명의 치환을 포함하지 않는 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여, 모집된 T 세포의 효과기 기능의 효능을 증가시킬 수 있다, 예를 들어 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서, 항원 결합 폴리펩타이드에서 본원에 제공된 치환은 항원 결합 폴리펩타이드의 의학적 특성을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 첫 번째 양태는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드에 관한 것으로, 여기서
(1) VH는
(a) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1),
(b) YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(서열번호 53)의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2,
여기서
X1은 A 또는 N이고;
X2 는 E 또는 Q이고; 및/또는
X3은 Q 또는 K이다
(c) HCDR3, 및
(d) 중쇄 프레임워크 영역(HFR) 1-4
를 포함하고;
(2) VL은
(a) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1),
(b) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2,
(c) LCDR3, 및
(d) 경쇄 프레임워크 영역(LFR) 1-4
를 포함하고, 여기서
(i) 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 및/또는
(ii) 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 및/또는
(iii) Kabat 넘버링에 따른 HFR1의 30번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 및/또는
(iv) Kabat 넘버링에 따른 HFR3의 90번 위치는 티로신(Y) 잔기로 치환되고,
여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 α/β T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 두 번째 양태는 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산, 또는 상기 핵산을 포함하는 핵산 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 세 번째 양태는 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드, 또는 본 발명의 두 번째 양태의 핵산 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 네 번째 양태는 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드, 본 발명의 두 번째 양태의 핵산 또는 벡터, 또는 본 발명의 세 번째 양태의 숙주 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다섯 번째 양태는 약제에 사용하기 위한 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드, 본 발명의 두 번째 양태의 핵산 또는 벡터, 또는 본 발명의 세 번째 양태의 숙주 세포, 또는 네 번째 양태의 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 여섯 번째 양태는 증식성 질환, 바람직하게는 암의 진단, 예방, 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드, 본 발명의 두 번째 양태의 핵산 또는 벡터, 또는 본 발명의 세 번째 양태의 숙주 세포, 또는 네 번째 양태의 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일곱 번째 양태는 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드의 결합을 개선 또는 유지시키고/시키거나 이의 안정성을 개선시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 여덟 번째 양태는 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포를 검출하거나, 결정하거나 또는 농축시키는 방법에 관한 것이다.
추가 양태는, 특히 항원 결합 폴리펩타이드의 제조 방법 및/또는 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 키트에 관한 것이며, 또한 본원에서 하기에 기재된다.
하기에서, 본 명세서에 포함된 도면의 내용을 기재한다. 이러한 맥락에서, 상기 및/또는 하기의 본 발명의 상세한 설명을 참조한다.
도 1: 파지 디스플레이 선택 후 선택된 scFv 클론의 결합 및 특이성 스크리닝. 유세포 결합 분석을 Jurkat, 클론 E6-1 세포주(y-축) 및 J.RT3T3.5 세포(x-축)로 수행하였다. ScFv BMA031(V36)(빈 삼각형)은 참조로 사용되었으며 항-CD3 항체(빈 원)는 표적 결합에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. 표적 양성 세포의 개선된 염색을 갖는 선택된 클론(색칠 된 원)에 대해 추가 분석이 진행되었다. 점선은, scFv가 없지만 검출 항체를 포함하는 각 세포주의 배경 염색을 나타낸다.
도 2: 파지 디스플레이 후 선택된 Fab 변이체의 결합. 정제된 Fab를 10 ㎍/㎖ 내지 10 ng/㎖ 범위의 농도로 일련의 적정으로서 Jurkat, 클론 E6-1 세포주에 적용하고 항-His 태그 항체를 통해 염색을 검출하였다. 곡선 아래 결합(AUC)을 중간 형광 강도(MFI) 및 로그 농도로부터 계산하였다. 점선은 예시적인 모 항체 TPP-1374의 결합 AUC를 나타낸다.
도 3: 파지 디스플레이 후 선택된 Fab 변이체의 결합 및 특이성 스크리닝. 정제된 Fab를 Jurkat, 클론 E6-1 세포주 및 J.RT3T3.5 세포에 1 ㎍/㎖의 농도로 적용하고 항-His 태그 항체를 통해 염색을 검출하였다. 점선은 어떠한 Fab도 존재하지 않는 배경 신호를 나타낸다.
도 4: 설계된 Fab 변이체의 결합 및 특이성 스크리닝. 정제된 Fab를 Jurkat, 클론 E6-1 세포주 및 J.RT3T3.5 세포에 1 ㎍/㎖의 농도로 적용하고 항-His 태그 항체를 통해 염색을 검출하였다. 점선은 어떠한 Fab도 존재하지 않는 배경 신호를 나타낸다.
도 5: 설계된 Fab 변이체의 곡선 아래 결합 면적 및 용융 온도. 정제된 Fab를 Jurkat, 클론 E6-1 세포주에 10 ㎍/㎖ 내지 10 ng/㎖ 범위 농도의 일련의 적정으로 적용하고 결합 AUC를 생성된 결합 곡선(왼쪽 Y-축)을 기반으로 계산하였다. 용융 온도(Tm)는 nanoDSF 측정(오른쪽 Y-축)을 통해 계산되었다. 상부 패널은 돌연변이된 CDR만을 갖는 변이체를 나타내고, 하부 패널은 중쇄 프레임워크 돌연변이 H90Y를 갖는 변이체를 추가로 포함한다. 화살표는 중쇄 프레임워크 영역 3(HFR3) 돌연변이 H90Y가 있거나 없는 변이체의 관계를 나타낸다. *: VH_Y53R_VL_VL_wt(TPP-1378)에 대한 융점이 결정되지 않았다. 굵은 점선은 VH_wt_VL_wt(TPP-1374, 예시적인 모 항체)의 Tm을 나타낸다. 점선은 VH_wt_VL_wt(TPP-1374)의 결합 AUC를 나타낸다.
도 6: 설계된 Fab 변이체의 표적 세포 결합. 정제된 Fab를 Jurkat, 클론 E6-1 세포주에 10 ㎍/㎖ 내지 10 ng/㎖ 범위 농도의 일련의 적정으로 적용하고 항-His 태그 항체를 통해 염색을 검출하였다.
도 7: TCER® 포맷과 관련하여 변형된 BMA031 분자의 효능. 정제된 T 세포 결합 수용체(TCER®) 분자의 효능을 락테이트 데하이드로게나제(LDH) 방출 분석에서 평가하였다. 세포 표면에 다양한 수준의 표적 펩타이드 HLA(pHLA)를 나타내는 종양 세포주(Hs695T, U2OS)뿐만 아니라, 표적 펩타이드-인간 백혈구 항원(pHLA)-음성 종양 세포주(T98G)를 상승하는 농도의 TCER® 분자의 존재 하에서 건강한 HLA-A*02-양성 공여자 HBC-1005(E:T = 10:1)로부터 유래된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 대한 표적으로 사용하였다. TCER®-유도된 세포용해를 방출된 LDH를 측정하여 48시간 후에 정량화하였다. 용량-반응 곡선의 EC50 값을 비-선형 4-점 곡선 피팅을 활용하여 계산하였다.
도 8: TCER® 포맷과 관련하여 변형된 BMA031 분자의 효능. 정제된 TCER® 분자의 효능을 LDH 방출 분석에서 평가하였다. 세포 표면에 다양한 수준의 표적 pHLA를 나타내는 종양 세포주(Hs695T, U2OS)뿐만 아니라, 표적 pHLA-음성 종양 세포주(T98G)를 상승하는 농도의 TCER® 분자의 존재 하에서 건강한 HLA-A*02 양성 공여자 HBC-1039(E:T = 10:1)로부터 유래된 PBMC에 대한 표적으로 사용하였다. TCER®-유도된 세포용해를 방출된 LDH를 측정하여 48시간 후에 정량화하였다. 용량-반응 곡선의 EC50 값을 비-선형 4-점 곡선 피팅을 활용하여 계산하였다.
본 발명을 아래에 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않는다는 점을 이해해야 하는데, 이들은 다양할 수 있기 때문이다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 목적으로 사용된 것이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 전체에 걸쳐 여러 문서가 인용된다. 상기에서든 하기에서든, 본원에 인용된 각 문서(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조사의 사양, 지침 등 포함)는 그 전체가 참고로 포함된다. 본 문서의 어떠한 내용도 본 발명이 이전 발명으로 인해 그러한 개시에 앞서는 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 문서에 인용된 일부 문헌은 "참고로 포함된다"라는 특징이 있다. 그러한 통합된 참고문헌의 정의 또는 교시와 본 명세서에 인용된 정의 또는 교시가 상충되는 경우, 본 명세서의 텍스트가 우선한다.
하기에서, 본 발명의 요소가 설명될 것이다. 이들 요소는 특정 실시양태와 함께 나열되어 있지만, 추가적인 실시양태를 생성하기 위해 임의의 방식으로, 임의의 수로 조합될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 다양하게 기재된 실시예 및 바람직한 실시양태는 본 발명을 명시적으로 기재한 실시양태로만 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이 설명은 명시적으로 설명된 실시양태를 임의의 수의 개시된 및/또는 바람직한 요소와 조합되는 실시양태를 지원하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 출원에 기재된 모든 요소의 임의의 순열 및 조합은 문맥상 달리 나타내지 않는 한 본 출원의 설명에 개시된 것으로 간주되어야 한다.
본 발명을 실시하기 위해, 달리 명시되지 않는 한, 해당 분야의 문헌에 설명되어 있는 화학, 생화학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법이 사용된다(예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989] 참조).
하기에서, 본 명세서에서 빈번히 사용되는 용어에 대한 정의를 제공한다. 이들 용어는 각각의 사용 사례에서 명세서의 나머지 부분에서 각각 정의된 의미와 바람직한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 내용이 달리 명시하지 않는 한 복수형을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 "항원 결합 폴리펩타이드"라는 용어는 적어도 하나의 항원, 특히 상기 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드 또는 결합 단백질을 의미한다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 가변 도메인의 일부인 상보성 결정 영역(CDR) 1 내지 CDR3을 포함한다.
바람직하게, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 동일하거나 상이한 폴리펩타이드 쇄에 포함될 수 있는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. VH 및 VL은 하기에 정의된 항체 또는 이의 단편의 상보성 결정 영역(CDR) 및 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 하기에 정의된 VH 및 VL을 포함하며, 여기서 VH의 특정 위치 및/또는 VL의 특정 위치는 해당 위치에서 양으로 하전된 아미노산을 갖지 않는 항원 결합 폴리펩타이드 또는 그의 단편과 비교하여 양으로 하전된 아미노산을 갖는다. 즉, 상기 특정 아미노산 위치는 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드에서 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다. 바람직하게는, 항원 결합 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 단편은 양으로 하전되지 않은 아미노산 중 적어도 하나의 아미노산이 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 CDR을 포함한다. 중쇄 FR1의 30번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 또한, 항원 결합 폴리펩타이드의 Kabat 넘버링에 따른 중쇄 FR3의 90번 위치가 티로신으로 치환된다.
항원 결합 폴리펩타이드는 본 발명의 맥락에서 항원에 특이적으로 결합하는 파라토프(또는 "항원 결합 부위"라고도 함)를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 항원 결합 폴리펩타이드의 예는 특히 항체 또는 이의 단편 또는 단쇄 항체이다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 단편은 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 세포 또는 α/β TCR/CD3 복합체에 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 단편은 시노몰구스 α/β TCR/CD3 복합체에 특이적으로 결합하지 않는다. 추가 양태에서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 γ/δ T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 세포에 특이적으로 결합하지 않는다. 추가 양태에서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 CD3의 세포외 도메인에 결합한다.
특정한 추가 양태에서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 단편은 인간 α/β TCR/CD3 복합체에 특이적으로 결합한다. 즉, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 단편은 인간 이외의 다른 종의 α/β TCR/CD3 복합체에 특이적으로 결합하지 않는다.
항원 결합 폴리펩타이드는 첨부된 청구범위 및 이하 본원에 정의된 바와 같은 CDR 서열을 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 적어도 하나의 아미노산은 하기 본원에 정의된 바와 같은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되는 것이 바람직하다. 항원 결합 폴리펩타이드의 CDR에서 4개 이하의 아미노산 위치가 양으로 하전된 아미노산으로 치환되는 것이 바람직하다. 바람직하게, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 적어도 BMA031의 항체 서열 또는 하기 본원에 정의된 BMA031(V36)의 항체 서열로부터 유래된 VH 및 VL 가변 도메인을 포함하며, 이는 참조 항체, 모 항원 결합 폴리펩타이드 또는 모 항체로 지정되고 하기에서 추가로 정의될 것이다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 α/β TCR/CD3 복합체를 표적화하는 항체에 기초한 공통 서열을 포함하는 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 본원에 제공된 본 발명의 치환을 포함한다. 이러한 항체의 예시적인 서열은 본원에서 하기에 개시되어 있다. 첨부된 실시예에 나타낸 바와 같이, 양으로 하전된 아미노산을 갖는 특정 치환 및/또는 모 항원 결합 폴리펩타이드, 예를 들어 BMA031(V36)의 가변 도메인 내 HFR3의 90번 위치에서의 치환의 도입은 본원에 제공된 치환을 포함하지 않는 모 항원 결합 폴리펩타이드에 비해 본원에서 입증된 유리한 효과, 예를 들어 증가된 결합 및/또는 증가된 안정성을 제공하였다. 특정 추가 양태에서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 또한 본원에 제공된 치환을 포함하지 않는 항원 결합 폴리펩타이드에 비해 결합을 본질적으로 유지하거나 유지하면서 증가된 안정성을 가질 수 있다. 특정한 추가 양태에서, 본원에 제공된 항원 결합 폴리펩타이드는 또한 본원에 제공된 치환을 포함하지 않는 항원 결합 폴리펩타이드에 비해 항원 결합 폴리펩타이드의 안정성을 본질적으로 유지하거나 유지하면서 증가된 결합을 가질 수 있다. "본질적으로 결합을 유지하는"이라는 맥락에서 용어 "본질적으로"는 결합(예를 들어, "결합 AUC 증가%로 표현됨)이 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하는 경우, 실질적으로 변경되지 않음, 즉 약 25%, 바람직하게는 약 15%, 더욱 바람직하게는 약 10%, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 5% 감소보다 더 크게 변경되지 않음을 의미한다. "본질적으로 안정성을 유지하는"과 관련하여 용어 "본질적으로"는 안정성이 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 실질적으로 변경되지 않음, 즉 약 25%, 더욱 바람직하게는 약 15%, 더욱 바람직하게는 약 10%, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 5% 감소보다 더 크게 변경되지 않음을 의미한다.
"가변 도메인"이라는 용어는 본 발명의 맥락에서 당업자에게 공지된 서열 상동성에 기초하여 정의되는 면역글로불린의 영역을 의미한다. 전형적으로, 2개의 가변 도메인이 항원 결합 부위를 형성한다. 이러한 도메인의 비소진적 예는 항체 경쇄(VL)에 포함된 가변 경쇄 도메인, 항체 중쇄(VH)에 포함된 가변 중쇄 도메인, TCR 분자의 알파 쇄(Vα)에 포함된 알파 가변 도메인 또는 TCR의 베타 쇄(Vβ)에 포함된 베타 가변 도메인이다.
"상보성 결정 영역"(CDR)이라는 용어는 본 발명의 맥락에서 면역글로불린의 가변 도메인, 예를 들어 VH, VL, Vα 및 Vβ에서 발견되는 인접하지 않은 항원 결합 부위를 의미한다. CDR은 하기에 문헌에 기재되었으며: Lefranc et al. (2003) Developmental and Comparative Immunology 27:55; Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-66I6 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest", 1991; Chothia et al., J. Mol. Biol. I96:90I-917, 1987; 및 Contact 주석(Contact 주석에 대해, MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)); AbM 주석에 대해, Abhinandan and Martin, Mol. Immunol. (2008), 45(14):3832-9; IMGT(Lefranc MP. Unique database numbering system for immunogenetic analysis; Immunol. Today (1997) 18:509, 여기서 정의는 서로 비교할 때 아미노산 잔기의 중복 또는 하위 집합을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 접목된 항체 또는 이의 변이체 또는 단편의 CDR을 지칭하는 정의의 적용은 본원에 정의되고 사용되는 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 상기 인용된 참고문헌 각각에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산 잔기는 비교를 위해 하기 표 1에 예시적으로 제시되어 있다.
[표 1]
항체 BMA031(V36)의 다양한 주석에 따른 CDR 넘버링
1잔기 넘버링은 상기 문헌[Kabat et al.]의 명명법을 따른다.
2잔기 넘버링은 상기 문헌[Chothia et al.]의 명명법을 따른다.
3잔기 넘버링은 상기 AbM, 문헌[Abhinandan and Martin]에 따른다.
4잔기 넘버링은 상기 Contact 넘버링, 문헌[MacCallum et al.]에 따른다.
"HCDR1", HCDR2" 및 "HCDR3"은 본 발명의 맥락에서 항원 결합 폴리펩타이드, 예를 들어 항체 또는 이의 기능적 단편의 중쇄 가변 도메인의 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 CDR을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "LCDR1", "LCDR2" 및 "LCDR3"이라는 용어는 각각 항원 결합 폴리펩타이드, 예를 들어 항체 또는 단편의 경쇄 가변 도메인 내의 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 CDR을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"이라는 용어는 각각 항원 결합 폴리펩타이드, 예를 들어 항체 또는 이의 기능적 단편의 쇄의 가변 영역 중 하나의 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 CDR을 의미한다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 각각의 위치에 양으로 하전된 잔기를 갖지 않는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여, 예를 들어 CDR에서 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다. CDR 내의 아미노산 위치, 및 유사하게 VH 또는 VL 내의 아미노산 위치는 상기에서 설명한 Kabat, Chothia, AbM 또는 Contact 주석에 따라, 특히 Kabat 넘버링에 따라 지정된다.
"프레임워크 영역"(FR)이라는 용어는 본 발명의 맥락에서 항원 결합 폴리펩타이드, 예를 들어 항체 또는 이의 단편의 가변 도메인 내의 CDR 영역 외부의 모든 아미노산 잔기를 의미한다. 프레임워크 영역은 일반적으로 약 100-120개 아미노산 길이의 불연속적인 아미노산 서열이지만 CDR 외부의 아미노산만을 참조하도록 의도된다. 본원에 사용된 바와 같이, "프레임워크 영역"이라는 용어는 CDR에 의해 분리된 프레임워크의 각 도메인을 의미하도록 의도된다. FR1 내지 FR4는 가변 도메인의 첫 번째 N-말단 아미노산 서열인 프레임워크 영역 1에 이어서 각각 CDR1, 2 및 3이 산재되어 있는 FR2, FR3 및 FR4를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 프레임워크 영역, 예를 들어 중쇄 프레임워크 영역 3(HFR3)에 치환(들)을 포함한다.
"폴리펩타이드"라는 용어는 본 발명의 맥락에서 펩타이드 결합에 의해 함께 결합된 아미노산의 단일 선형 쇄를 지칭하며, 전형적으로 적어도 약 50 개, 적어도 약 60 개, 적어도 약 70개, 약 80 개, 적어도 약 90 개, 또는 적어도 약 100 개 아미노산을 포함한다. 또한, 항원 결합 폴리펩타이드가 본 발명의 치환을 포함하고 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 세포에 특이적으로 결합하는 한, 본원에 제공된 항원 결합 폴리펩타이드는 지시된 범위보다 더 짧은 길이를 갖는다는 것이 고려된다. 폴리펩타이드는 하나 이상의 쇄로 구성된 단백질의 한 쇄일 수 있으며, 단백질이 하나의 쇄로 구성된 경우 단백질 자체일 수도 있다.
"단백질"이라는 용어는 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄를 포함할 수 있는 기능적 단위를 의미한다. 단백질이 2개 이상의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 경우, 이들은 서로 비공유적으로 및/또는 공유적으로 결합될 수 있다.
"항원-결합 부위"라는 용어는 본 발명의 맥락에서 관심 표적 항원, 특히 표적 항원의 에피토프에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합하는 역할을 하는 적어도 하나의 결합 부위를 의미한다. "항원 결합 부위"라는 용어는 본 발명의 맥락에서 "파라토프"라는 용어와 상호교환적으로 사용되며, 항원에 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드의 부분을 지칭한다. 예시적인 결합 부위에는 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인과 같은 항체 가변 도메인, 알파 또는 베타 가변 도메인 또는 감마 또는 델타 가변 도메인과 같은 TCR 가변 도메인이 포함된다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 항원 결합 폴리펩타이드는 다중(예를 들어, 2개, 3개, 4개 이상) 결합 부위를 포함한다.
본 발명의 맥락에서 "항원" 또는 "표적 항원"은 적어도 하나의 항원 결합 부위에 의해 결합될 수 있는 분자, 또는 분자 또는 복합체의 일부를 의미하며, 여기서 상기 하나의 항원 결합 부위는 예를 들어, 본 발명의 항체, TCR 및/또는 항원 결합 폴리펩타이드에 포함된다.
"에피토프"라는 용어는 항원의 기능적 에피토프를 의미한다. 기능적 에피토프는 항원 결합 폴리펩타이드의 파라토프와 항원 사이의 비-공유 상호작용에 기여하는 잔기, 전형적으로 아미노산 또는 폴리사카라이드를 포함한다. 비-공유 상호작용은 각각 정전기력, 반데르발스력, 수소결합, 및 소수성 상호작용을 포함한다. 기능적 에피토프는 항원 결합 폴리펩타이드의 구조적 에피토프를 구성하는 잔기의 하위 그룹이다. 구조적 에피토프는 항원 결합 폴리펩타이드에 의해 커버되는 모든 잔기, 즉 항원 결합 폴리펩타이드의 발자국을 포함한다. 일반적으로 항체에 의해 결합된 항원의 기능적 에피토프는 4 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 유사하게, 제시된 MHC인 펩타이드의 기능적 에피토프는 전형적으로 4 내지 8개의 아미노산을 포함한다. 두 항체 사이의 경쟁은 항체의 구조적 에피토프가 동일하거나 중복되는 경우 발생한다.
"α/β TCR/CD3 복합체"라는 용어는 T 세포의 표면에 존재하는 T 세포 수용체 복합체를 지칭한다. 대부분의 T 세포는 MHC에 의해 제시된 항원성 펩타이드의 복합 표면에 전형적으로 결합하는 다이설파이드 결합된 α 및 β 쇄로 구성된 α/β TCR을 발현한다. TCR은 그 자체로는 신호를 전달하지 않지만, T 세포 공동 수용체로 지정되고 세포내 신호 전달 모티프를 포함하는 단백질 복합체인 CD3와 구성적으로 연관되어 있다(문헌[Birnbaum et al.; PNAS vol. 11, no. 49; 17576-17581, 2014]). α/β TCR은 집합적으로 α/β TCR/CD3 복합체를 형성하는 CD3εγ, CD3εδ 및 CD3ζζ 이량체를 포함하는 보존된 다중-서브유닛 신호전달 기구에 비공유적으로 결합된다. α/β TCR/CD3 복합체는 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드에 의해 특이적으로 결합되는 에피토프를 포함한다. BMA031 항체(문헌[Shearman et al., 1991]) 또는 본원에 제공된 항원 결합 폴리펩타이드의 표적 에피토프의 특정 아미노산 서열은 공지되어 있지 않다. 그러나, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 BMA031 또는 BMA031(V36)과 동일하거나 유사한 기능적 에피토프에 결합하여 서로 경쟁한다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 에피토프 특이성은 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 세포, 바람직하게는 T 세포에의 결합에 대해, 특히 T 세포 표면상에 존재하는 α/β TCR/CD3 복합체에의 결합에 대해 "참조 항체"와 경쟁하는 능력을 특징으로 한다. 따라서, 본원에 제공된 항원 결합 폴리펩타이드는 T 세포에의 결합에 대해, 특히 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포에의 결합에 대해, 더욱 바람직하게는 T 세포 표면상에 존재하는 α/β TCR/CD3 복합체에의 결합에 대해, α/β TCR/CD3 복합체에 특이적으로 결합하는 참조 항체와 경쟁할 수 있다. T 세포는 바람직하게는 T 림프구, 더욱 바람직하게는 Jurkat 세포, 예를 들어 클론 E6-1 세포이다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 상기에서 언급한 참조 항체, 즉 BMA031 또는 BMA031(V36)의 서열을 기반으로 개발되었다는 점에 유의한다. 참조 항체와 항원 결합 폴리펩타이드 사이의 경쟁은 공지된 분석 방법에 의해 시험될 수 있다. 예를 들어, 본원에 첨부된 실시예에 기재된 결합 분석이 사용될 수 있다. 구체적으로, 참조 항체와 항원 결합 폴리펩타이드 사이의 경쟁을 하기에 추가로 개시된 바와 같은 유세포 분석법, 예를 들어 FACS에 의해 시험할 수 있으며, 여기서 α/β TCR/CD3-양성 세포에 대한 참조 항체의 결합은 항원 결합 폴리펩타이드의 존재 하에서 결정되고 참조 항체 단독의 결합과 비교된다. α/β TCR/CD3-양성 세포의 예는 T 세포, 바람직하게는 Jurkat 세포이다. 경쟁 분석에서, Fc 부분을 포함하는 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드를 사용하는 것이 바람직하며, 예를 들어 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 항체의 요소를 포함한다. 예를 들어, 참조 항체는 마우스 IgG1로부터 유래된 불변 도메인을 나타낼 수 있는 반면, 항원 결합 폴리펩타이드는 인간 IgG1로부터 유래된 불변 도메인을 나타낼 수 있다. 이러한 실험에서 참조 항체는 이전에 결정된 결합의 약 EC50의 농도로 사용되며 α/β TCR/CD3-양성 세포에 대한 동몰 농도의 항원 결합 폴리펩타이드의 존재 또는 부재 하에 배양된다. 이어서 참조 항체의 결합은 두 번째 염색 단계에서 마우스 특이적 2차 시약, 예를 들어 염소 F(ab')2 항-마우스 IgG1(Fc)-RPE(Dianova, SBA -1072-09)를 사용하여 결정될 수 있다. 참조 항체와 항원 결합 폴리펩타이드의 경쟁은 참조 항체 단독의 결합과 비교하여 항원 결합 폴리펩타이드의 존재 하에서 참조 항체의 감소된 결합으로 표시된다. 바람직하게, 참조 항체는 α/β TCR/CD3 복합체, 특히 α/β TCR/CD3-양성 세포에 대한 항원 결합 폴리펩타이드의 결합을 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 30%까지 감소시킨다.
경쟁 분석의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 "참조 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 의해 정의되며, 바람직하게는 IgG1 불변 도메인 및 Cκ 경쇄를 추가로 포함한다. 바람직하게, 참조 항체는 인간 IgG1 불변 도메인을 포함한다. 더욱 바람직하게, 참조 항체는 서열번호 61에 따른 힌지-CH2-CH3 영역을 포함한다. 바람직하게, 참조 항체는 서열번호 1에 따른 VH 및 서열번호 2에 따른 VL, 더욱 바람직하게는 서열번호 60에 따른 중쇄(HC) 및 서열번호 6에 따른 경쇄(LC)로 이루어지는 BMA031(V36)을 포함한다. 참조 항체는 본원의 상기 및 하기에 정의된 본 발명의 치환을 포함하지 않는다. 특히, 참조 항체는 양으로 하전된 아미노산 치환(들)을 포함하지 않는다. 바람직하게, 참조 항체는 양으로 하전된 아미노산 치환(들) 및/또는 중쇄의 90번 위치에서 티로신에 의한 치환을 포함하지 않는다.
"모 항원 결합 폴리펩타이드"는 일반적으로, 예를 들어 Tm, EC50 또는 결합 AUC의 증가%와 같은 특성을 평가할 때 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드와 비교되는 항원 결합 폴리펩타이드를 의미한다. "모 항원 결합 폴리펩타이드"는 본원에서 상기 및 하기에 정의된 바와 같은 본 발명의 치환을 포함하지 않는다. 특히, 모 항원 결합 폴리펩타이드는 양으로 하전된 아미노산 치환(들)을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 모 항원 결합 폴리펩타이드는 양으로 하전된 아미노산(들) 및/또는 중쇄의 90번 위치에서 티로신에 의한 치환을 포함하지 않는다. 본 발명의 치환의 효과는 바람직하게는 2개의 유사한 분자, 즉 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 본 발명의 치환만이 상이한 분자들 사이에서 비교되어야 한다. 따라서 "모 항원 결합 폴리펩타이드"는 특정 양태에서 서열번호 1에 따른 VH(BMA031 V36) 및 서열번호 2에 따른 VL(VL BMA031 V36)을 포함하고 달리 항원 결합 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 갖는 분자를 지칭할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 모 항원 결합 폴리펩타이드는 항체, 예를 들어 BMA031(V36)의 아미노산 서열을 갖거나 그의 기능적 단편, 예를 들어 Fab이며, 본 발명의 맥락에서 "모 항체"로서 지칭된다.
"모 항체"는 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같은 치환을 포함하지 않는다. 이러한 "모 항체"의 일례는 BMA031 또는 BMA031의 추가의 인간화 변이체, 예를 들어 본원에서 하기에 개시된 바와 같은 BMA031(V36), 또는 바람직하게는 이의 단편이다. 모 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 의해 정의되며, 바람직하게 모 항체는 서열번호 1에 따른 VH(BMA031 V36) 및 서열번호 2에 따른 VL(VL BMA031 V36)을 포함한다. 모 항체라는 용어는 또한 하기에 정의된 실시양태 및 실시예에서, 예를 들어 결합의 결정(예를 들어, EC50 또는 결합 AUC에서 증가%), 또는 용융 온도(Tm)의 결정에 비교 분자의 맥락으로 사용된다.
바람직한 실시양태에서, 모 항원 결합 폴리펩타이드는 본원에 정의된 BMA031(V36)의 VH 및 VL 도메인을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시양태에서, 실시예 섹션의 경우와 같이, 본원에서 하기에 추가로 기재된 기능적 특징, 예를 들어 "결합 AUC의 증가%", "결합 EC50" 및/또는 "Tm"은, 항원 결합 폴리펩타이드와 모 항원 결합 폴리펩타이드가 모두 동일한 포맷, 예를 들어 실시예 1에 기재된 바와 같은 Fab 단편인 경우 결정된다.
본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드와 모 항원 결합 폴리펩타이드의 비교를, 유사한, 바람직하게는 동일한 실험 조건 하에서, 바람직하게는 나란히 수행하며, 더욱 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드와 모 항원 결합 폴리펩타이드는 동일한 분석의 일부이다. 가장 바람직하게, 본원에 기재된 항원 결합 폴리펩타이드의 기능적 특성은 모 항원 결합 폴리펩타이드와, 둘 다 Fab 또는 Fab 단편으로 존재할 때 비교된다.
"T 세포 수용체"(TCR)라는 용어는 본 발명의 맥락에서 신호전달 매개에 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 연관된 면역글로불린 슈퍼패밀리의 이종이량체 세포 표면 단백질을 의미한다. TCR은 α/β 및 γ/δ 형태로 존재하며, 이들은 구조적으로 유사하지만 해부학적 위치가 상당히 다르며 기능도 상이한 것으로 추정된다. 고유 이종이량체 αβ TCR 및 γδ TCR 세포외 부분은 각각 2개의 폴리펩타이드를 포함하며, 이들은 각각 막-근위 불변 도메인과 막-원위 가변 도메인을 갖는다. 불변 도메인과 가변 도메인은 각각 쇄 내 다이설파이드 결합을 포함한다. 가변 도메인은 항체의 상보성 결정 영역(CDR)과 유사한 고도로 다형성인 루프를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 "TCR"이라는 용어는 또한 이의 단편뿐만 아니라 단쇄 TCR 및 이의 단편, 특히 단일 도메인 TCR의 가변 알파 및 베타 도메인, 및 키메라, 인간화, 이중특이성 또는 다중특이성 TCR을 의미한다. TCR 유전자 치료법의 사용은 다수의 현행 장애를 극복한다. 이를 통해 피험자(환자) 자신의 T-세포에 원하는 특이성을 부여하고 짧은 시간 내에 충분한 수의 T 세포를 생성시켜, 고갈을 피할 수 있다. TCR은 강력한 T-세포(예를 들어, 중심 기억 T 세포 또는 줄기 세포 특성을 지닌 T-세포)로 형질도입될 것이며, 전달 시 이는 더 양호한 지속성, 보존 및 기능을 보장할 수 있다. TCR-조작된 T-세포는 화학 요법이나 방사선 조사에 의해 림프구 감소증이 발생한 암 환자에게 주입되어 효율적인 생착이 허용되지만, 면역 억제는 억제된다.
"TCR의 단편"이라는 용어는 본 발명의 맥락에서 전장 또는 야생형 TCR의 일부, 특히 이러한 TCR의 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 의미한다. TCR 단편의 예에는 α, β, δ 또는 γ 쇄의 단편, 예를 들어 Vα - Ca 또는 Vβ - Cβ 또는 이의 일부가 포함된다. 이들 단편은 또한 상응하는 힌지 영역 또는 단쇄 가변 도메인, 예를 들어 Vα, Vβ, Vδ, Vγ, 단쇄 Vα/Vβ 단편 또는 TCR 단편으로부터 형성된 이중특이성 및 다중특이성 TCR을 또한 추가로 포함할 수 있다. TCR의 단편은 자연 발생 전장 또는 야생형 TCR과 비교하여 동일한 기능을 발휘한다, 즉 단편은 표적 항원, 특히 항원성 펩타이드 또는 주요 조직적합성 복합체 I 또는 II(MHC I 또는 MHC II)와 복합체를 이루는 표적 펩타이드에 선택적으로 및/또는 특이적으로 결합한다.
"단쇄 TCR(scTCR)"은 본 발명의 맥락에서 TCR의 가변 도메인, 예를 들어 Vα 및 Vβ 또는 Vδ 및 Vγ가 하나의 폴리펩타이드 쇄상에 위치하는 단백질 또는 항원 결합 폴리펩타이드를 의미한다. 전형적으로, 가변 도메인은 링커에 의해 분리되며, 여기서 상기 링커는 전형적으로 10 내지 30개, 예를 들어 10 내지 25개의 아미노산을 포함한다.
"야생형 알파-베타 이종이량체 TCR"이라는 용어는 본 발명의 맥락에서 알파 쇄 및 베타 쇄를 갖는 TCR을 의미한다. 각 알파 쇄는 가변, 결합 및 불변 영역을 포함하며, 베타 쇄는 또한 일반적으로 가변 영역과 결합 영역 사이에 짧은 다양성 영역을 포함하지만 이 다양성 영역은 결합 영역의 일부로 간주되는 경우가 많다. TCR 알파 및 베타 쇄의 불변 또는 C 영역은 각각 TRAC 및 TRBC로서 지칭된다(문헌[Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10]). 본원에서 알파 가변 도메인 및 베타 가변 도메인으로 지칭되는 각각의 가변 영역은 프레임워크 서열에 삽입된 3개의 CDR을 포함하며, 그 중 하나는 CDR3으로 명명된 고가변 영역이다. 알파 가변 도메인 CDR은 본원에서 CDRa1, CDRa2, CDRa3으로 지칭되고, 베타 가변 도메인 CDR은 본원에서 CDRb1, CDRb2, CDRb3으로 지칭된다. 여러 유형의 알파 쇄 가변(V알파) 영역 및 여러 유형의 베타 쇄 가변(V베타) 영역이 존재하며 이들은 프레임워크, CDR1 및 CDR2 서열, 및 부분적으로 정의된 CDR3 서열에 의해 구별된다. V알파 유형은 IMGT 명명법에서 고유한 TRAV 번호로 표시되고, V베타 유형은 IMGT 명명법에서 고유한 TRBV 번호로 표시된다(문헌[Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(1): 42-54]; 문헌[Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 83-96]; 문헌[LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press]). 면역글로불린 항체 및 TCR 유전자에 대한 보다 많은 정보에 대해서, 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템®(문헌[Lefranc M-P et al., Nucleic Acids Res. 2015 Jan; 43 (Database issue):D413-22])을 참조하시오. 따라서, 통상적인 TCR 항원 결합 부위는 일반적으로 각각의 알파 및 베타 쇄 가변 영역으로부터의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR을 포함하며, 여기서 CDR1 및 CDR3 서열은 HLA 단백질에 결합된 펩타이드 항원의 인식 및 결합과 관련이 있고, CDR2 서열은 HLA 단백질의 인식 및 결합과 관련이 있다.
"면역글로불린"으로도 지칭되는 "항체"라는 용어는 본 발명의 맥락에서 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결되고 각각의 중쇄가 다이설파이드 결합에 의해 경쇄에 연결된 2개의 중쇄를 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드를 지칭한다. 경쇄에는 람다(λ) 및 카파(κ), 두 가지 유형이 존재한다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 5가지 주요 중쇄 부류(또는 아이소타입)가 존재한다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 각 쇄는 별개의 서열 도메인을 함유한다. 경쇄는 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)이라는 2개의 도메인 또는 영역을 포함한다. 중쇄는 4개의 도메인, 즉 가변 도메인(VH) 및 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3, 집합적으로 CH로 지칭됨)을 포함한다. 경쇄(VL) 및 중쇄(VH)의 가변 영역은 항원에 대한 결합 인식 및 특이성을 결정한다. 경쇄(CL) 및 중쇄(CH)의 불변 영역 도메인은 항체 쇄 결합, 분비, 태반을 통한 이동성, 보체 결합 및 Fc 수용체(FcR)에 대한 결합과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. Fv 단편은 면역글로불린의 Fab 단편의 N-말단 부분이며 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 가변 부분으로 이루어진다. 항체의 특이성은 항체 결합 부위 또는 파라토프와 항원 결정기 사이의 구조적 상보성에 있다. 항체 결합 부위는 주로 고가변 또는 상보성 결정 영역(CDR)의 잔기로 구성된다. 때로는 비-고가변 또는 FR의 잔기가 전체 도메인 구조에 영향을 미치므로 항원 결합 부위에도 영향을 미친다. CDR은 고유 면역글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화도 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열을 의미한다. 항체 또는 면역글로불린의 예는 IgM, IgD, IgG, IgA 또는 IgE이다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 CDR은 항체, 이중특이성 항체 또는 다중특이성 항체에 접목될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 항체, TCR 또는 항원 결합 폴리펩타이드의 CDR의 아미노산 서열을 알면, 당업자는 프레임워크 영역, 예를 들어 항체 프레임워크 영역 또는 TCR 프레임워크 영역을 결정할 수 있다. 그러나 CDR이 표시되지 않는 경우, 당업자는 먼저 항체에 대한 IMGT 정의에 기초하여 CDR 아미노산 서열을 결정한 다음 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 결정할 수 있다.
항원 결합 폴리펩타이드는 본원에 제공된 치환을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 "항체"라는 용어는 또한 항체 및 이의 단편뿐만 아니라 단일 도메인 항체 및 이의 단편, 다중특이성 항체 및 이의 단편, 특히 단일 도메인 항체의 가변 중쇄, 키메라, 인간화, 이중특이성 또는 다중특이성 항체를 지칭한다. "항체의 단편"은 온전한 항체의 일부, 특히 항체의 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 포함한다. 본원에 제공된 항체의 단편은 본원에 제공된 치환(들)을 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, 다이아바디, 항체 단편으로부터 형성된 이중특이성 및 다중특이성 항체가 포함된다. 항체의 단편은 또한 중쇄 가변 영역(VHH)과 같은 단일 도메인 항체일 수도 있다. 바람직하게, "항체의 단편"은 온전한 항체의 일부를 포함하고, 특히 본원에서 하기에 정의된 바와 같이 각각의 CDR 위치에서 양으로 하전된 아미노산을 포함하는 적어도 가변 도메인 CDR을 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다. 항원 결합 폴리펩타이드 또는 항체의 단편은 이들이 유래된 항원 결합 폴리펩타이드 또는 항체(예를 들어 항원 결합 폴리펩타이드 또는 항체의 일부)와 비교하여 본질적으로 동일하거나 동일한 기능을 발휘한다, 즉 항체의 단편은 이의 표적에 특이적으로 결합한다. 본원에서 제공된 항원 결합 폴리펩타이드의 단편 또는 항원 결합 폴리펩타이드에 포함된 항체의 단편(예를 들어, 하기에 정의된 기능적 변이체)은 모 항원 결합 폴리펩타이드 또는 모 항체와 비교하여 개선되거나 증가된 결합 및/또는 Tm을 갖는다. 본원에 정의된 단편은 본원에서 하기에 정의되고 모 항체와 비교된 바와 같이 적어도 2배의 개선된 결합 또는 감소된 결합 EC50 및/또는 적어도 1℃의 개선된 Tm 또는 적어도 1℃의 델타 Tm을 초래하는 것이 특히 바람직하다.
"인간 프레임워크 영역"이라는 용어는 본 발명의 맥락에서 자연 발생 인간 항체 또는 인간 TCR과 같은 자연 발생 항원 결합 폴리펩타이드의 프레임워크 영역에 실질적으로 일치하거나(약 85% 이상, 특히 90%, 95%, 97%, 99%) 일치하는(100%) 프레임워크 영역을 의미한다.
"인간화 항체"라는 용어는, 완전히 또는 부분적으로 비-인간 기원이고 인간에서 면역 반응을 피하거나 최소화하기 위해 특정 아미노산, 특히 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역에서 특정 아미노산을 대체하도록 변형된 항체를 의미한다. 인간화 항체의 불변 도메인은 주로 인간 중쇄 및 경쇄 도메인이다. 항체 서열의 인간화 방법은 당업계에 공지되어 있다; (문헌[Almagro & Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633]). 통상적으로 사용되는 방법 중 하나는 공여자 항체, 일반적으로 마우스 항체의 CDR 서열을 다양한 특이성을 갖는 인간 항체의 프레임워크 스캐폴드에 접목하는 것을 포함하는 CDR 접목(grafting) 또는 항체 재성형(reshaping)이다. CDR 접목은 CDR 접목된 비-인간 항체의 결합 특이성 및 친화도, 및 따라서 생물학적 활성을 감소시킬 수 있으므로, 모 항체의 결합 특이성 및 친화성을 유지하기 위해 역 돌연변이를 CDR 이식된 항체의 선택된 위치에 도입시킬 수 있다. CDR의 일부 아미노산 잔기는 전형적으로 변경되지 않지만, 특정 경우에는 글리코실화 부위, 탈아미드화 부위, 이성체화 부위 또는 원하지 않는 시스테인 잔기를 제거하기 위해 개별 CDR 아미노산 잔기를 변경하는 것이 바람직할 수 있다. N-결합된 글리코실화는 트라이펩타이드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr의 아스파라긴 잔기에 올리고사카라이드 쇄를 부착시킴으로써 발생하며, 여기서 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. N-글리코실화 부위의 제거는 특히 보존적 치환을 통해 Asn 또는 Ser/Th 잔기를 다른 잔기로 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다. 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 탈아미드화는 pH 및 표면 노출과 같은 요인에 따라 발생할 수 있다. 아스파라긴 잔기는 특히, 주로 서열 Asn-Gly에 존재할 때 탈아미드화에 민감하고, Asn-Ser과 같은 다른 다이펩타이드 서열에서는 이보다 정도가 덜 하다. 이러한 탈아미드화 부위, 특히 Asn-Gly가 CDR 서열에 존재하는 경우, 일반적으로 관련 잔기 중 하나를 제거하기 위해 보존적 치환에 의해 상기 부위를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 관련 잔기 중 하나를 제거하기 위한 CDR 서열의 치환이 또한 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
"Fab"라는 용어는 본 발명의 맥락에서 약 50,000 달톤의 분자량과 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 의미하며, 여기서 IgG를 프로테아제, 예를 들어 파파인으로 처리하여 획득된 단편 중에서, 중쇄의 N-말단 측의 대략 절반 및 전체 경쇄가 다이설파이드 결합을 통해 함께 결합된다.
본 발명의 맥락에서 "이중특이성 분자"라는 용어는 2개의 상이한 항원에 대해 적어도 2개의 결합가 및 결합 특이성을 갖고, 따라서 2개의 항원 결합 부위를 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드를 의미한다. "결합가"라는 용어는 항원 결합 폴리펩타이드의 결합 부위의 수를 의미하며, 예를 들어 2가 항원 결합 폴리펩타이드는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항원 결합 폴리펩타이드에 관한 것이다. 결합가라는 용어는 동일하거나 상이한 표적에 결합할 수 있는 결합 부위의 수를 나타낸다. 2가 항원 결합 폴리펩타이드는 단일특이성, 즉 하나의 표적에 결합할 수 있거나, 이중특이성, 즉 2개의 상이한 표적에 결합할 수 있다. 표적은 각각의 에피토프, 표적 펩타이드, 유사한 펩타이드 또는 α/β TCR/CD3 복합체와 같은 비-표적 펩타이드를 포함하는 항원일 수 있다.
본 발명의 맥락에서 "이중특이성"이라는 용어에 대해, 항원 결합 부위의 적어도 하나의 특이성은 항체로부터 유래되는 것이 바람직하고, 보다 특히 적어도 하나의 항원-결합 부위는 본원에 개시된 바와 같은 항체 유래 CDR을 포함하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 "이중특이성"은 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같은 CDR, 바람직하게는 항체 유래 CDR을 포함하는 적어도 하나의 항원 결합 부위, 및 적어도 하나의 추가(제2) 항원 결합 부위를 겸비하는 항원 결합 폴리펩타이드를 의미하며, 여기서 상기 적어도 하나의 추가 항원 결합 부위는 항체로부터 유래될 수 있고 따라서 항체 CDR을 포함하거나, 또는 TCR로부터 유래될 수 있으며, 따라서 TCR CDR을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 추가(제2) 항원 결합 부위는 TCR로부터 유래되고, 따라서 TCR CDR을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 "포맷"이라는 용어는 상기 항원 결합 폴리펩타이드 및 이의 공간적 구성에 존재하는 특정 수 및 유형의 도메인을 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드를 의미한다. 이중특이성 포맷과 같은 다양한 포맷이 당해 분야에 기재되어 있다. 이러한 포맷에는 다이아바디, 교차-이중-가변-도메인(CODV) 및/또는 이중 가변 도메인(DVD) 폴리펩타이드의 비제한적인 예가 포함된다. 항원 결합 폴리펩타이드는 청구범위에 정의된 위치에 본 발명의 아미노산 잔기를 포함하는 다이아바디, 교차-이중-가변-도메인(CODV) 및/또는 이중 가변 도메인(DVD) 폴리펩타이드 일 수 있다.
"다이아바디(Db)"라는 용어는 항체와 관련하여, 본 발명의 맥락에서, 전형적으로 동일하거나 상이한 항체로부터의 VH 및 VL 도메인을 각각 포함하는 2개의 쇄로 구성된 2가 분자를 의미한다. 2개의 쇄는 일반적으로 VHA-VLB 및 VHB-VLA(2개의 상이한 특이성을 나타내는 A 및 B) 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA 배열을 갖는다.
본 발명의 맥락에서, 본원에서 "다이아바디(Db)" 또는 "다이아바디 포맷"은 각각 링커(LDb1 및 LDb2)에 의해 연결된 2개의 가변 도메인을 포함하는 2개의 폴리펩타이드 쇄로 구성된 2가 분자를 의미하며, 여기서 도메인 중 2개는 본 발명의 맥락에서 정의된 제1 및 제2 도메인(V1 및 V2)이고 나머지 두 도메인은 TCR 유래 또는 항체 유래 가변 도메인(VA, VB)일 수 있다. V1 및 V2 도메인은 2개의 상이한 폴리펩타이드에 위치하고 VA 및 VB 도메인은 2개의 상이한 폴리펩타이드에 위치하며 도메인들은 머리에서 꼬리 배향으로 이량체화된다. 따라서 배향은 V1-LDb1-VA 및 VB-LDb2-V2, V2-LDb1-VA 및 VB-LDb2-V1, V1-LDb1-VB 및 VA-LDb2-V2 또는 V2-LDb1-VB 및 VA-LDb2-V1일 수 있다. 도메인이 머리에서 꼬리로 이량체화를 허용하기 위해서, 링커, 즉 LDb1 및 LDb1는 동일하거나 상이할 수 있으며 짧은 링커이다. 짧은 링커는 전형적으로 2 내지 12, 3 내지 13, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 아미노산 길이, 예를 들어 4, 5개(문헌[Brinkmann U. and Kontermann R.E., MAbs. 2017 Feb-Mar; 9(2): 182-212]) 또는 8개 아미노산 길이인 링커이다.
"이중-가변-도메인 면역글로불린(DVD-Ig™)" 포맷은 문헌[Wu C. et al., Nat Biotechnol. 2007 Nov; 25(11):1290-7]에 의해 2007년에 처음으로 기재되었다. 이러한 포맷에서, 제2 단클론 항체(B)의 표적-결합 가변 도메인은 전형적으로 통상적인 항체(A)(도메인 VLA 및 VHA 포함)에 융합되며, 따라서 여기서 통상적인 항체(A)의 경쇄는 추가적인 경쇄 가변 도메인(VLB)을 포함하고, 통상적인 항체의 중쇄(A)는 추가적인 중쇄 가변 도메인(VHB)을 포함한다. 따라서 당해 분야에 기재된 DVD-Ig™은 전형적으로 2개의 폴리펩타이드 쇄, 즉 VHB-L-VHA-CH1-CH2-CH3을 포함하는 하나의 중쇄 및 VLB-L-VLA-CL을 포함하는 하나의 경쇄로 구성된다. 따라서 도메인 쌍 VLA/VHA 및 VLB/VHB는 나란히 쌍을 이루고 있다.
본 발명의 맥락에서, "이중-가변-도메인 Ig 포맷"은, 각각 링커(L1, L3)에 의해 연결된 2개의 가변 도메인을 포함하는 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 의미하며, 여기서 도메인 중 2개는 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같은 제1 및 제2 도메인(V1 및 V2)이고 다른 두 도메인은 항체 유래 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(VHA 및 VHB)이다. 본 발명의 맥락에서 DVD-Ig 포맷에서, 폴리펩타이드 쇄는 예를 들어 V1-L1-VHA-L2-CH1-CH2-CH3 및 V2-L3-VLA-L4-CL 또는 V2-L1-VHA-L2-CH1-CH2-CH3 및 V1-L3-VLA-L4-CL 구성을 갖는다. 연결 링커 L1 및 L3은 바람직하게는 5 내지 20개 아미노산 잔기 길이, 예를 들어 5 내지 15개 아미노산 잔기이고/이거나, 연결 링커 L2 및 L4는 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.
항체의 문맥에서 당해 분야에 공지된 "교차 이중-가변 도메인-Ig-유사 단백질"은 2개의 VH 및 2개의 VL 도메인이, VHA-VHB 및 VLB-VLA 순서 또는 VHB-VHA 및 VLA-VLB 순서 중 어느 하나(N-에서 C-말단으로)로 배열된 가변적인 VH-VL 도메인의 교차 짝짓기를 허용하는 방식으로 연결되는 포맷을 기재한다.
본 발명의 맥락에서, "교차 이중-가변 도메인-Ig-유사 단백질"은 링커(L1, L2, L3 및 L4)에 의해 연결된 2개의 가변 도메인을 각각 포함하는 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 단백질을 의미하며, 여기서 도메인 중 2개는 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같은 제1 및 제2 도메인(V1 및 V2)이고, 나머지 2개의 도메인은 항체 유래 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(VHA, VHB)이다. 본 발명의 맥락에서 CDVD-Ig 포맷에서 폴리펩타이드 쇄는 예를 들어 V1-L1-VHA-L2-CH1-CH2-CH3 및 VLA-L3-V2-L4-CL, V2-L1-VHA-L2-CH1-CH2-CH3 및 VLA-L3-V1-L4-CL, VHA-L1-V1-L2-CH1-CH2-CH3 및 V2-L3-VLA-LDVD3-CL 또는 VHA-L1-V2-L2-CH1-CH2-CH3 및 V1-L3-VLA-L4-CL 구성을 갖는다. 이 CDVD 포맷에서 링커(L1 내지 L4)는 전형적으로 상이한 길이를 갖는다. 예를 들어, L1은 3 내지 12개의 아미노산 잔기 길이이고, L2는 3 내지 14개의 아미노산 잔기 길이이고, L3은 1 내지 8개의 아미노산 잔기 길이이고, L4는 1 내지 3개의 아미노산 잔기 길이이거나, 또는 L1은 5 내지 10개의 아미노산 잔기 길이이고, L2는 5 내지 8개의 아미노산 잔기 길이이고, L3은 1 내지 5개의 아미노산 잔기 길이이고, L4는 1 내지 2개의 아미노산 잔기이거나, 또는 L1은 7개 아미노산 잔기 길이이고, L2는 5개 아미노산 잔기 길이이고, L3은 1개 아미노산 잔기 길이이고, L4는 2개 아미노산 잔기 길이이다.
"공유 결합된" 또는 "공유 결합"이라는 용어는 본 발명의 맥락에서 예를 들어 다이설파이드 가교 또는 다이설파이드 결합 또는 펩타이드 연결 또는 링커 또는 링커 서열, 예를 들어 폴리펩타이드 링커를 통한 공유 연결을 지칭한다.
"링커" 또는 "펩타이드 링커"라는 용어는 본 발명의 맥락에서 "복합체의 2개 부분 또는 모이어티, 예를 들어 2개의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 입체적으로 분리하는 아미노산 서열을 의미한다. 전형적으로, 이러한 링커는 1개 내지 20개의 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다. 펩타이드 링커는 함께 연결된 두 부분 사이에 유연성을 제공한다. 유연성은 일반적으로 아미노산이 작은 경우 증가한다. 따라서, 유연한 펩타이드 링커는 증가된 함량의 작은 아미노산, 특히 글리신 및/또는 알라닌, 및/또는 세린, 트레오닌, 아스파라긴 및 글루타민과 같은 친수성 아미노산을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 두 도메인 사이에 삽입된 펩타이드 링커, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 잔기는 예를 들어 단쇄 작제물에서 또는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 가변 도메인 사이에 도메인에 대한 충분한 이동성을 제공하고, 올바른 폴딩을 허용하여 항원 결합 부위를 형성하게 한다. 이중특이성 항원 결합 폴리펩타이드의 경우, 링커는 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 교차 짝짓기에서(CODV 포맷 또는 일부 다이아바디 포맷에서) 또는 나란한 짝짓기 배열(예를 들어, DVD 포맷)에서 항원 결합 부위 및 추가 항원 결합 부위를 형성할 수 있게 한다. 본 발명의 맥락에서 링커는 L1, L2, L3, L4 등으로 약칭된다.
본 발명의 맥락에서 "이량체화 도메인"(또한 각각 D1 또는 D2로 약칭됨)이라는 용어는 바람직하게는 제1 폴리펩타이드 쇄와 제2 폴리펩타이드 쇄의 이종이량체화를 매개하지만 2개의 제1 또는 2개의 제2 폴리펩타이드 쇄의 동종이량체화는 매개하지 않는 이종이량체화 도메인을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 한 쌍의 이량체화 도메인(예를 들어 D1 및 D2)은 면역글로불린 불변 도메인, 예를 들어 항체-유래 CL 및 CH1, 또는 CL-Fc 및 CH1-Fc, 또는 TCR-유래 Cα 및 Cβ, 또는 한 쌍의 CH3 도메인 또는 한 쌍의 Fc 도메인을 포함하며, 여기서 CH3 및 Fc 도메인은 바람직하게는 구멍에 손잡이 돌연변이와 같은 이종이량체화를 강제하는 도입된 돌연변이를 포함한다. 특히 이량체화 도메인은 본원에서 하기에 정의된 바와 같은 Fc 도메인에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 "Fc 도메인"이라는 용어는 본원에서 하기에 추가로 정의된 고유 Fc 도메인 및 Fc 도메인 변이체 및 서열을 포함한다. Fc 변이체 및 고유 Fc 분자와 관련하여, "Fc 도메인"이라는 용어는 전체 항체로부터 절단되거나 다른 수단에 의해 생성된 단량체 또는 다량체 형태의 분자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "고유 Fc"라는 용어는, 단량체 형태이든 다량체 형태이든 간에, 항체의 절단으로부터 생성되거나 다른 수단에 의해 생성된, 비-항원-결합 단편의 서열을 포함하는 분자를 의미하며, 힌지 영역을 함유할 수 있다. 고유 Fc의 본래의 면역글로불린 공급원은 특히 인간 기원이고 임의의 면역글로불린, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2, 가장 바람직하게는 IgG1일 수 있다. 고유 Fc 분자는 공유(즉, 다이설파이드 결합) 및 비-공유 결합에 의해 이량체 또는 다량체 형태로 연결될 수 있는 단량체성 폴리펩타이드로 구성된다. 고유 Fc 분자의 단량체 서브유닛 사이의 분자간 다이설파이드 결합의 수는 부류(예를 들어, IgG, IgA 및 IgE) 또는 하위부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 및 IgG2)에 따라 1 내지 4의 범위이다. 고유 Fc의 일례는 IgG의 파파인 절단으로 인한 다이설파이드-결합된 이량체이다. "고유 Fc"라는 용어는 단량체, 이량체 및 다량체 형태를 총칭한다. Fc 도메인은 "RF" 및/또는 "구멍에 손잡이" 돌연변이, 바람직하게는 "구멍에 손잡이"를 포함하거나 추가로 포함하는 것이 바람직하다. "RF 돌연변이"는 전형적으로 문헌[Jendeberg, L. et al., 1997, J. Immunological Meth., 201: 25-34]에 기재된 바와 같이 Fc 도메인의 CH3 도메인에서 아미노산 HY의 RF로의 아미노산 치환, 예를 들어 CH3 도메인에서의 아미노산 치환 H435R 및 Y436F를 의미하며 이는 단백질 A에 대한 결합을 폐지하므로 정제 목적에 유리한 것으로 기재되어 있다. 이중특이성 항원 결합 폴리펩타이드가 2개의 FC-도메인을 포함하는 경우, RF 돌연변이는 하나 또는 둘 다, 바람직하게는 하나의 Fc-도메인에 존재한다. "구멍에 손잡이" 또는 소위 "구멍에 손잡이" 기술은 이종다량체 형성을 촉진하기 위해 CH3-CH3 접점에서 아미노산 치환 T366S, L368A 및 Y407V(구멍) 및 T366W(손잡이) 모두를 의미한다. 이러한 구멍에 손잡이 돌연변이는 추가적인 시스테인 아미노산 치환 Y349C 및 S354C를 도입함으로써 더욱 안정화될 수 있다. 안정화 시스테인 아미노산 치환과 함께 "구멍에 손잡이" 기술은 본원에 참고로 포함된 미국특허 5 731 168 및 미국특허 8 216 805에 기재되어 있다.
"아미노산"이라는 용어는 본 발명의 문맥에서 치환되거나 비치환된 아미노기, 치환되거나 비치환된 카르복시기, 및 하나 이상의 측쇄 또는 기, 또는 이들 기 중 임의의 것의 유사체를 포함하는 임의의 단량체 단위를 의미한다. 예시적인 측쇄는 예를 들어, 티올, 셀레노, 설포닐, 알킬, 아릴, 아실, 케토, 아지도, 하이드록실, 하이드라진, 시아노, 할로, 하이드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로사이클릭, 에논, 이민, 알데하이드, 에스테르, 티오산, 하이드록실아민, 또는 이들 기의 임의의 조합을 포함한다. 다른 전형적인 아미노산에는 광활성화 가능한 가교결합제를 포함하는 아미노산, 금속 결합 아미노산, 스핀-표지된 아미노산, 형광 아미노산, 금속-함유 아미노산, 신규 작용기를 갖는 아미노산, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 광케이지 및/또는 광이성질화성 아미노산, 방사성 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화된 아미노산, 기타 탄수화물 변형된 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중 원자 치환된 아미노산, 화학적 절단성 및/또는 광절단성 아미노산, 탄소-결합된 당-함유 아미노산, 산화환원-활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산, 및 하나 이상의 독성 모이어티를 포함하는 아미노산을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, "아미노산"이라는 용어는 하기 20개의 천연 또는 유전적으로 암호화된 알파-아미노산을 포함한다: 알라닌(Ala 또는 A), 아르기닌(Arg 또는 R), 아스파라긴(Asn 또는 N), 아스파르트산(Asp 또는 D), 시스테인(Cys 또는 C), 글루타민(Gln 또는 Q), 글루탐산(Glu 또는 E), 글리신(Gly 또는 G), 히스티딘(His 또는 H), 이소류신(Ile 또는 I), 류신(Leu 또는 L), 리신(Lys 또는 K), 메티오닌(Met 또는 M), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 프롤린(Pro 또는 P), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 트립토판(Trp 또는 W), 티로신(Tyr 또는 Y), 및 발린(Val 또는 V). "X" 잔기가 한정되지 않은 경우에, 이는 "임의의 아미노산"으로 해석되어야 한다. 이들 20개 천연 아미노산의 구조는 예를 들어 문헌[Stryer et al., Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company (2002)]에 도시되어 있다. 추가적인 아미노산, 예를 들어 셀레노시스테인 및 피롤리신이 또한 유전적으로 암호화될 수 있다(문헌[Stadtman (1996) "Selenocysteine," Annu Rev Biochem. 65:83-100] 및 문헌[Ibba et al. (2002) "Genetic code: introducing pyrrolysine," Curr Biol. 12(13):R464-R466]). "아미노산"이라는 용어는 또한 비천연 아미노산, 변형된 아미노산(예를 들어, 변형된 측쇄 및/또는 주쇄를 갖는), 및 아미노산 유사체를 포함한다(예를 들어, 하기의 문헌을 참조하시오: Zhang et al. (2004) "Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887; Anderson et al. (2004) "An expanded genetic code with a functional quadruplet codon" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571; Ikeda et al. (2003) "Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo," Protein Eng. Des. Sel. 16(9):699-706; Chin et al. (2003) "An Expanded Eukaryotic Genetic Code," Science 301(5635):964-967; James et al. (2001) "Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues," Protein Eng. Des. Sel. 14(12):983-991; Kohrer et al. (2001) "Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25):14310-14315; Bacher et al. (2001) "Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue," J. Bacteriol. 183(18):5414-5425, Hamano-Takaku et al. (2000) "A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine," J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328, 및 Budisa et al. (2001) "Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl) alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids," Protein Sci. 10(7):1281-1292). 아미노산은 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질로 합쳐질 수 있다.
아미노산은 극성 아미노산과 비극성 아미노산으로 추가로 분류될 수 있다. 극성은 음으로 및 양으로 하전된 단부가 있는 전기 쌍극자 모멘트를 갖는 분자 또는 그의 화학기로 이어지는 전하의 분리로서 정의된다. 극성 분자는 쌍극자-쌍극자 분자간 힘과 수소 결합을 통해 상호작용한다. 극성은 표면 장력, 용해도, 융점과 비점을 포함한 다양한 물리적 특성의 기초가 된다. 극성 아미노산은 트립토판을 제외하고 수소 공여체 및/또는 수용체 원자를 갖는 아미노산을 포함한다. 실제로, 트립토판은 그의 수소 공여 원자에도 불구하고 구조 도메인의 비극성 코어에 참여하기 때문에 IMGT '비극성' 부류로 분류되었다. 극성 아미노산 그룹에는 5개의 하전된 아미노산(R, H, K, D, E)과 5개의 하전되지 않은 아미노산(N, Q, S, T, Y)이 포함된다. 비극성 아미노산 그룹에는 (A, C, G, I, L, M, F, P, W, V) 아미노산과 같은 하전되지 않은 아미노산이 포함된다. 극성 아미노산은 친수성(Q, N) 또는 중성(S, T, Y)이며, 대개는 단백질의 외부에 있고 수소 결합에 빈번히 관여한다. 비극성 아미노산은 단백질 내부에서 측쇄를 함께 묶는 경향이 있으며 반 데르 발스 상호작용에 빈번히 관여한다.
"양으로 하전된 아미노산"이라는 용어는 본 발명의 맥락에서 아미노산의 측쇄가 양전하를 운반하는 아미노산을 의미한다. 예를 들어 pH 7에서는 리신(K), 아르기닌(R)이 양으로 하전된다. 따라서 양으로 하전된 아미노산은 바람직하게는 R 또는 K이다. H는 또한 특정 조건 하에서 pH 7에서 하전될 수 있다. "음으로 하전된"이란 용어는 아미노산의 측쇄가 음전하를 운반하는 아미노산을 의미한다. 예를 들어 pH 7에서는 아스파르트산(D) 및 글루탐산(E)이 음으로 하전된다. 전하는 아미노산, 펩타이드 또는 단백질이 포함된 용액의 pH 및 온도에 따라 달라질 수 있음에 유의한다. 특히, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드가 약제로서 적용되는 경우, 인체의 pH 및 온도가 중요하다. 따라서, "양으로 하전된 아미노산"이라는 용어는 피험자의 순환 및 세포외 공간, 특히 항원 결합 폴리펩타이드가 투여되는 피험자의 종양 조직에서 발견되는 조건 하에서 양전하를 운반하는 아미노산을 의미한다. 바람직하게 피험자는 인간이다. 이 경우 아미노산은 예를 들어 인체의 pH 및 온도에서 양으로 하전된다. 특정 양태에서, 양으로 하전된 아미노산은 아르기닌(R), 히스티딘(H) 및 리신(K)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 바람직하게는 양으로 하전된 아미노산은 R 또는 K이다. 본 발명의 맥락에서, 본원에서 하기에 정의된 바와 같은 CDR, VH 또는 VL의 각 위치의 적어도 하나의 아미노산, 및 양으로 하전되지 않은 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다. 예를 들어, 하나의 위치가 세린(S)을 운반하고, 따라서 이는 양으로 하전되지 않은 아미노를 갖는 위치이며 양으로 하전된 아미노산, 예를 들어 R로 치환된다. 따라서 잔기 S는 양으로 하전되지 않은 아미노산을 구성한다. 양으로 하전되지 않은 아미노산을 갖는 하기 본원에 정의된 특정 CDR 또는 특정 VH 또는 VL의 잔기는 비하전되거나 하전되지 않은 아미노산을 갖거나 음으로 하전된 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이러한 맥락에서, Q가 HCDR2의 특정 위치에서 자연적으로 발생하는 경우, 이는 본 발명의 맥락에서 바람직하게는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되지 않는 것이 바람직하다.
"치환된"이라는 용어는 모 항원 결합 폴리펩타이드의 아미노산이, 대체되는 아미노산과 상이한 또 다른 아미노산으로 대체되는 것을 의미한다.
"펩타이드"라는 용어는 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산의 짧은 중합체를 의미한다. 이는 단백질과 동일한 화학적(펩타이드) 결합을 갖고 있지만 일반적으로 길이가 더 짧다. 가장 짧은 펩타이드는 단일 펩타이드 결합으로 연결된 2개의 아미노산으로 구성된 다이펩타이드이다. 또한 트라이펩타이드, 테트라펩타이드, 펜타펩타이드 등이 있을 수 있다. 전형적으로, 펩타이드의 길이는 최대 8, 10, 12, 15, 18 또는 20개 아미노산이다. 펩타이드는 사이클릭 펩타이드이거나 화학적으로 변형되지 않는 한, 아미노 단부와 카르복실 단부를 갖는다.
본 발명의 맥락에서 "아미노산 서열 일치성"이라는 용어는 서열 일치성의 백분율을 의미하며 비교 창을 통해 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교함으로써 결정되고, 여기서 비교 창의 서열 부분은 상기 두 서열의 최적의 정렬을 위해 참조 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않는다)과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 끊김)을 포함할 수 있다. 백분율은, 두 서열 모두에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 존재하여 합치된 위치의 수를 생성시키는 위치의 수를 결정하고, 합치된 위치의 수를 비교 창의 총 위치 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 일치성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
"일치하는"이라는 용어는 2개 이상의 폴리펩타이드 또는 핵산 서열과 관련하여 동일한, 즉 동일한 서열의 아미노산 또는 핵산을 포함하는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 의미한다. 서열은 비교 창 또는 하기의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정되는 바와 같이 지정된 영역에 걸쳐 최대의 상응성을 위해 비교 및 정렬될 때 동일한 아미노산 잔기의 명시된 백분율(예를 들어, 명시된 영역에 걸쳐 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 일치성)을 갖는 경우 서로 "실질적으로 일치한다". 이러한 정의는 또한 시험 서열의 보완을 의미한다. 따라서, "적어도 80%의 서열 일치성"이라는 용어는 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열 비교와 관련하여 명세서 전반에 걸쳐 사용된다. 이 표현은 각각의 참조 폴리펩타이드 또는 각각의 참조 폴리뉴클레오타이드에 대해 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 일치성을 의미한다.
본 발명의 맥락에서 "서열 비교"라는 용어는 하나의 서열이 비교되는 시험 서열에 대한 참조 서열로서 작용하는 과정을 의미한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우 하위 서열 좌표를 지정하고 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 디폴트 프로그램 매개변수가 일반적으로 사용되거나 대체 매개변수를 지정할 수 있다. 이어서 서열 비교 알고리즘이 프로그램 매개변수를 기반으로 참조 서열에 대한 시험 서열의 서열 일치성 또는 유사성 백분율을 계산한다. 2개의 서열을 비교하고 서열 일치성 백분율을 계산할 비교 참조 서열이 지정되지 않은 경우, 달리 구체적으로 표시되지 않는 한, 서열 일치성은 비교 대상인 두 서열 중 더 긴 서열을 기준으로 계산된다. 참조 서열이 표시되면, 달리 구체적으로 표시되지 않는 한, 서열 일치성은 서열번호로 표시된 참조 서열의 전체 길이를 기초로 결정된다.
비교를 위한 서열 정렬 방법은 당해 분야에 주지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어, Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘(문헌[Adv. Appl. Math. 2:482, 1970])에 의해, Needleman 및 Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘(문헌[J. Mol. Biol. 48:443, 1970])에 의해, Pearson 및 Lipman의 유사성 방법에 대한 검색(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988])에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행(예를 들어, the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 육안 검사(예를 들어 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)])을 참조하시오)에 의해 수행될 수 있다. 서열 일치성 및 서열 유사성 .5의 결정에 적합한 알고리즘은 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘으로, 이들은 각각 문헌[Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977], 및 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 입수가 가능하다. 이 알고리즘은 먼저 조회 서열에서 길이 W의 짧은 단어를 식별하여 높은 점수의 서열 쌍(HSP)을 식별하는 작업을 포함하며, 이는 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 일부 양의 임계값 점수 T와 일치하거나 이를 충족시킨다. T는 이웃 단어 점수 임계값(상기 문헌[Altschul et al.] 참조)으로서 지칭된다. 이러한 초기 이웃 단어 적중은 이를 포함하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 시작하기 위한 시드 역할을 한다. 단어 적중은 누적 정렬 점수가 증가할 수 있는 한 각 서열을 따라 양방향으로 확장된다. 누적 점수는 뉴클레오타이드 서열의 경우 매개변수 M(일치하는 잔기 쌍에 대한 보상 점수, 항상 >0) 및 N(일치하지 않는 잔기에 대한 벌점 점수, 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우 점수 행렬을 사용하여 누적 점수를 계산한다. 다음과 같은 경우 각 방향의 단어 적중 확장이 중단된다: 누적 정렬 점수가 최대 달성 값에서 수량 X만큼 떨어지거나; 누적 점수가 하나 이상의 음으로 채점된 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하가 되거나; 또는 어느 한 서열의 끝에 도달할 때. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 민감도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열용)은 디폴트로서 11의 단어 길이(W), 기대값(E) 10, M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어 길이, 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 점수 행렬(문헌[Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989]을 참조하시오), 50의 정렬(B), 10의 기대값(E), M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘이 제공하는 유사성의 또 다른 척도는 최소 합계 확률(P(N))이며, 이는 아미노산 서열 간의 일치가 우연히 발생할 확률을 나타낸다. 예를 들어, 시험 아미노산과 기준 아미노산의 비교에서 최소 확률 합계가 약 0.2 미만, 전형적으로 약 0.01 미만, 보다 전형적으로 약 0.001 미만인 경우 해당 아미노산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다. 아미노산이 화학적으로 관련된 아미노산으로 치환되는 반-보존적, 특히 보존적 아미노산 치환이 바람직하다. 전형적인 치환은 지방족 아미노산, 지방족 하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산, 산성 잔기를 갖는 아미노산, 아미드 유도체, 염기성 잔기를 갖는 아미노산, 또는 방향족 잔기를 갖는 아미노산 중에서 발생한다. 전형적인 반-보존적 및 보존적 치환은 하기 표 2에 표시되어 있다.
[표 2]
각각 아미노산 및 보존적 및 반-보존적 치환
A, F, H, I, L, M, P, V, W 또는 Y에서 C로의 변화는 새로운 시스테인이 유리 티올로 남아 있는 경우 반-보존적이다. 또한, 당업자는 입체적으로 요구되는 위치의 글리신이 치환되어서는 안 되며 알파-나선 또는 베타-시트 구조를 갖는 단백질 부분에 P가 도입되어서는 안 된다는 것을 이해할 것다.
본 발명의 맥락에서 사용된 "기능적 변이체" 또는 "변이체"라는 용어는 주어진 항원 결합 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드와 실질적인 또는 상당한 서열 일치성 또는 유사성을 갖는 항원 결합 폴리펩타이드 또는 본 발명의 폴리펩타이드를 의미하며, 여기서 상기 기능적 변이체는 주어진 항원 결합 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 유지한다. 본 발명의 맥락에서, 본 발명의 치환, 특히 본원의 상기 및 하기에 정의된 바와 같은 90번 위치에 각각의 양으로 하전된 아미노산 및/또는 Y를 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드 또는 참조 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합(예를 들어, 결합 EC50)을 개선 또는 증가시키고/시키거나, Tm을 개선 또는 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 기능적 변이체는 비교되는 항원 결합 폴리펩타이드와 각각 동일하거나 개선 또는 증가된 결합(예를 들어 결합 EC50) 또는 Tm을 갖는 것으로 구상된다. 더욱이, 이는 FR 또는 VH 또는 VL과 같은 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 부분, 영역 또는 단편에 대해서도 구상된다. 본원에 제공된 기능적 변이체, 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 FR, VH, VL 또는 항원 결합 폴리펩타이드는 주어진 항원 결합 폴리펩타이드, 예를 들어 항원 결합 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 98%, 98%, 98%, 98%, 98%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능적 단편은 본 발명의 치환을 포함한다. 바람직하게, 기능적 단편은 본 발명의 치환을 포함하지 않는 모 항원 결합 폴리펩타이드 또는 이의 단편과 비교하여 개선되거나 증가된 결합(예를 들어 EC50 결합) 및/또는 Tm을 갖는다.
"기능적 변이체"는 예를 들어 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환을 갖는 본 발명의 각각의 항원 결합 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 기능적 변이체는 적어도 하나의 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 본 발명의 각각의 항원 결합 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이 경우, 비-보존적 아미노산 치환은 기능적 변이체의 생물학적 활성을 방해하거나 억제하지 않는 것이 바람직하다. 바람직하게, 비-보존적 아미노산 치환은 기능적 변이체의 생물학적 활성을 향상시켜, 기능적 변이체의 생물학적 활성이 각각의 항원 결합 폴리펩타이드 또는 이의 단편과 비교하여 증가되도록 한다.
"안정성"이라는 용어는 단백질, 폴리펩타이드 또는 항원 결합 폴리펩타이드의 열 안정성을 의미한다. 단백질 또는 폴리펩타이드는 전형적으로 매개 변수 "용융 온도(Tm)"에 의해 기재되는 내열성 또는 열 안정성을 특징으로 한다. 기능적이고 올바르게 폴딩된 단백질을 제공하기 위해서는 온도가 중요한 요소이다. 따라서 단백질의 안정성은 적용되는 다양한 온도 조건에 따라 달라진다. 단백질의 원래 온도 이상에서는 열 에너지가 해당 단백질의 분해 및 변성을 초래할 것이다. 단백질이 고온에서 돌이킬 수 없는 변화에 저항하는 경우 열안정성 또는 열적으로 안정하다고 기재된다. 상기에서 언급한 바와 같이, 열 안정성은 기술어 용융 온도 Tm에 의해 정의된다.
"용융 온도(Tm)"라는 용어는 본 발명의 맥락에서 "열 안정성", 즉 폴딩된 상태의 단백질 농도가 용해된 단백질의 농도와 동일한 온도를 의미한다(문헌[Miotto et al., Insights on protein thermal stability: a graph representation of molecular interactions; bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/354266; June 22, 2018]). 특히, Tm은 하기 실시예에서 입증된 바와 같이 단백질의 50%가 분해되는 온도이다. 폴리펩타이드나 단백질이 Tm에 도달하면 자유 에너지 변화 ΔG는 0과 같다. 이 시점에서 폴리펩타이드나 단백질 분자는 무정형 상태로 사라지고 단백질 쇄는 스스로 다시 폴딩될 수 없다. 일반적인 경험 법칙은 Tm의 증가가 최대 안정성 델타 G(T*)의 자유 에너지 증가와 연관되어 있다는 것이다. Tm은 온도의 함수로서 단백질의 분해 및 폴딩을 추적하기 위한 분광 기술인 원형 이색성(CD)을 사용하거나 시차 주사 열량계(DSC), 시차 주사 형광 측정법(DSF) 또는 생화학적 분석을 통해 측정될 수 있다. 일반적으로 Tm 값이 높은 단백질이나 폴리펩타이드는 Tm 값이 낮은 단백질이나 폴리펩타이드보다 더 안정적이다. 열 안정성의 증가는 항원 결합 폴리펩타이드의 변성 감소로 이어지며, 이에 따라 예를 들어 상기 폴리펩타이드의 저장 조건이 개선된다. 예시적인 방법인 나노 시차 주사 형광 측정법(nano-DSF)은 pH 7.4에서 PBS(인산염 완충 식염수) 완충액을 사용하여 Tm을 측정하기 위해 본원의 하기 첨부된 실시예에 개시되어 있다. 바람직하게, Tm은 DSF에 의해 결정되고, 더욱 바람직하게는 nanoDSF에 의해 결정된다. 특히, Tm은 1℃/분의 가열 램프 속도로 PBS pH 7.4에서 DSF에 의해 결정되며, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드의 농도는 50 ㎍/㎖이다. 절대 용융 온도를 직접 얻을 수 있다. 다양한 분석물질의 델타 Tm 값을 계산할 수 있다. 서로 비교되는 값은 동일한 실험 실행에 포함되는 것이 바람직하다.
"결합"이라는 용어는 본 발명의 맥락에서 "결합 친화도" 또는 "곡선 아래 결합 면적(AUC)" 또는 "결합 EC50 값"을 의미하며, 이에 대해서는 하기에서 상세히 정의한다. 특히, "결합"은 상기 정의된 바와 같은 α/β TCR/CD3 복합체에 대한 항원 결합 폴리펩타이드의 결합, 또는 바람직하게는 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 세포, 또는 보다 바람직하게는 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포에 대한 항원 결합 폴리펩타이드의 결합을 의미한다. 항원 결합 폴리펩타이드의 결합은 예를 들어 FACS에 의해 하기 실시예에 추가로 개시된 바와 같은 유세포 분석법에 의해 결정될 수 있으며, 여기서 α/β TCR/CD3-양성 세포에 대한 항원 결합 폴리펩타이드의 결합은 예를 들어 모 항원 결합 폴리펩타이드, 특히 본 발명의 치환을 포함하지 않는 항원 결합 폴리펩타이드, 예를 들어 BMA031(V36)과의 비교로 결정된다. 바람직하게, α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 세포에 대한 항원 결합 폴리펩타이드의 결합은 α/β TCR/CD3-양성 Jurkat 세포(예를 들어 클론 E6-1 세포), 및 α/β TCR/CD3 음성 Jurkat 세포를 사용하는 유세포 분석 결합 분석에 의해 결정된다. 특히, 항원 결합 폴리펩타이드의 결합은 항원 결합 폴리펩타이드의 반 로그 단계에서 다양한 농도, 예를 들어 10 ㎍/㎖ 내지 10 ng/㎖를 시험함으로써 결정된다. 추가의 특정 양태에서, 세포에 대한 결합 및 세척 단계는 PBS, 2 mM 에틸렌다이아민테트라 아세트산(EDTA), 5% 소 태아 혈청(FCS)을 포함하는 완충액에서 수행된다. 추가의 특정 양태에서, 항원 음성 세포(예를 들어 CFSE CellTrace로 표지됨)를 항원 양성 세포와 1:1 비로 혼합한다. 추가의 특정 양태에서, 상기 농도의 항원 결합 폴리펩타이드(예를 들어 100 ㎕/웰)를 세포 혼합물(예를 들어 100,000개 세포/웰)과 함께 상기 완충액 내 얼음 상에서 예를 들어 15분 동안 배양하고, 세포를 세척하여 결합되지 않은 항원 결합 폴리펩타이드를 제거한다. 바람직하게는, 생/사 세포에 대한 분류/염색을 수행한다. 항원 결합 폴리펩타이드에 결합된 세포의 염색을 유세포 분석기(예를 들어, Intellicyt iQue Screener(Sartorius AG) 또는 CytoFLEX (Beckmann Coulter, 2089495-01))에서 결정할 수 있으며 MFI(중간 형광 강도) 값을 비교할 수 있다.
본 발명의 맥락에서 "결합 친화도" 또는 "친화도"는 예를 들어 최대 유효 농도의 절반(EC50) 또는 평형 해리 상수(KD)로 표현될 수 있다.
"EC 50 " 또는 "EC50"으로도 약칭되는 "최대 유효 농도의 절반"은 본 발명의 맥락에서 "결합 EC50" 또는 "기능적 EC50"을 지칭하며, 이는 사용되는 용어가 무엇이든 출원 전반에 걸쳐 각각 표시된다.
본 발명의 맥락에서 "결합 EC50"이라는 용어는 표적, 예를 들어 α/β TCR/CD3 복합체의 절반이 결합된 상태로 존재하는 리간드, 예를 들어 항원 결합 폴리펩타이드 또는 단백질의 농도로서 기재될 수 있다. 결합 EC50은 표적 세포, 바람직하게는 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포에 대한 항원 결합 폴리펩타이드의 결합, 즉 표적에 대한 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 결합을 측정하기 위한 매개변수이다. 결합 EC50 값은 표적 농도에 따라 달라진다. EC50과 친화도는 반비례한다, 즉 EC50 값이 낮을수록 분자의 결합 친화도가 높아진다. 일반적으로 낮은 결합 EC50 값이 바람직하다. 결합 EC50 값은 예를 들어 유세포 분석기(예를 들어, Intellicyt iQue Screener(Sartorius AG) 또는 CytoFLEX(Beckmann Coulter, 2089495-01))를 사용하여 하기 실시예에 기재된 유세포 분석 결합 분석에 의해 결정된다. 전형적으로 측정은 하기의 조건에서 수행된다: 표지된 세포(예를 들어, CFSE CellTrace로 표지된 표적 항원 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하지 않는 세포)를 항원 양성 세포와 1:1 비로 혼합한다. 추가의 특정 양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드(예를 들어, 100 ㎕/웰의 농도)를 세포 혼합물(예를 들어, 100,000개의 세포/웰)과 함께 예를 들어, 상기 완충액 내의 얼음 위에서 15분 동안 배양하고, 세포를 세척하여 결합되지 않은 항원 결합 폴리펩타이드를 제거한다. 염색을 유세포 분석기에서 측정할 수 있으며 다양한 샘플의 MFI 값을 비교할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 MFI의 EC50 값을, 본 발명의 아미노산 치환을 포함하지 않는 모 항체 BMA031(V36)(또한 모 항체 TPP-1374로도 지정됨)의 MFI의 EC50 값에 대한 x배 감소로서 계산하고 제시한다. 예를 들어, TPP-1389는 31.8의 EC50 감소 배수를 나타내며, 이는 EC50이 모 항체 TPP-1374에 대해 동일한 방법으로 결정된 EC50과 비교하여 31.8배 감소하였음을 의미한다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 결합 EC50 값은 바람직하게는 모 항원 결합 폴리펩타이드, 예를 들어 본 발명의 치환을 포함하지 않는(예를 들어 양으로 하전된 아미노산에 의한 치환을 포함하지 않는, 및/또는 90번 위치에 티로신을 포함하지 않는) 항원 결합 폴리펩타이드의 결합 EC50 값보다 낮다. 본원에서 하기에 사용된 바와 같이, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 x배 감소는 본 발명의 치환을 포함하지 않는(예를 들어, 양으로 하전된 아미노산으로의 치환을 포함하지 않는, 및/또는 90번 위치에 티로신을 포함하지 않는) 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교된다. 바람직하게, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 x배 감소는 서열번호 1에 따른 VH 및 서열번호 2에 따른 VL을 포함하는 모 항체 BMA031(V36)과 비교된다.
본 발명의 맥락에서 "기능적 EC50"이라는 용어는 물질의 최대 유효 농도의 절반을 의미하며, 따라서 특정 노출 시간 후 기준선과 최대값 사이의 중간 반응을 유도하는 상기 물질의 농도의 척도이다. 이는 일반적으로 약물의 효능을 측정하는 데 사용된다. 따라서 등급화된 용량 반응 곡선의 EC50은 최대 효과의 50%가 관찰되는 물질의 농도를 나타낸다. 양자 용량 반응 곡선의 EC50은 지정된 노출 기간 후에 모집단의 50%가 반응을 나타내는 화합물의 농도를 나타낸다. 일례에서, "기능적 EC50 값"은 특정 노출 시간 후 기준선과 최대값 사이의 중간 반응을 유도하는 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 농도를 의미한다. EC50 값은 예를 들어 본원의 실시예 3에 기재된 바와 같이, 예를 들어 IFN-감마 방출 분석 또는 LDH 방출 분석을 사용하여 다양한 공지된 방법에 의해 실험적으로 평가될 수 있다.
"곡선 아래 면적(AUC)"이라는 용어는 본 발명의 맥락에서 "곡선 아래 결합 면적(결합 AUC)"을 지칭하며고, 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
상기 제시된 바와 같이, 결합은 또한 AUC 또는 결합 AUC로서 표현될 수 있으며, 이는 항원 결합 폴리펩타이드의 로그 농도 및 MFI에 기초하여 계산된다. 계산된 EC50 또는 AUC는 항원 결합 폴리펩타이드, 예를 들어 항체의 그의 표적, 예를 들어 항원에 대한, 및 이와 역의 결합 강도를 의미하고, 따라서 증가된 AUC 값은 항원 결합 폴리펩타이드의 그의 표적에 대한, 및 이와 역의 증가된 또는 개선된 결합, 예를 들어 α/β TCR/CD3 복합체, 또는 바람직하게는 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 세포, 또는 보다 바람직하게는 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포에 대한 증가되거나 개선된 결합을 가리킨다. 바람직하게, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 AUC는 "결합 AUC 증가%" 또는 "AUC 증가%로 표시되며, 이는 증가된 AUC%를 의미한다. "결합 AUC의 증가%" 또는 "AUC의 증가%"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 항원 결합 폴리펩타이드의 결합 AUC는 특히 본 발명의 치환을 포함하지 않는(예를 들어 양으로 하전된 아미노산으로의 치환을 포함하지 않는, 및/또는 90번 위치에 티로신을 포함하지 않는) 모 항원 결합 폴리펩타이드의 결합 AUC와 비교된다. 본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 "결합 AUC의 증가%" 또는 "AUC 증가%"는 특히 본 발명의 치환을 포함하지 않는(예를 들어 양으로 하전된 아미노산으로의 치환을 포함하지 않는, 및/또는 90번 위치에 티로신을 포함하지 않는) 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교된다. 바람직하게, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 "결합 AUC 증가%" 또는 "AUC 증가%"는 또한, 동일한 조건(및 바람직하게는 동일한 실험 실시) 하에서, 및 ACU 증가%가 0으로 설정된, 하기 실시예에서 TPP-1374로 또한 지정된 모 항체 BMA031(V36)과 비교된다. 예를 들어, 항원 결합 폴리펩타이드 TPP-1375는 AUC의 87% 증가를 나타내며(실시예 섹션에서 표 5 참조), 이는 비교에 사용된 모 항체 TPP-1374와 비교하여 87%의 결합 AUC 증가를 가리킨다.
"상승작용적 또는 상승작용"이라는 용어는 본 발명의 맥락에서 항원 결합 폴리펩타이드의 가변 도메인(들)의 CDR 또는 FR에서 하나 이상의 상이한 돌연변이로 인해 발생하는 상승작용 효과를 지칭한다. 상승작용 효과는 각 단일 돌연변이만으로 인한 효과의 단순한 합보다 큰 비선형 누적 효과이다. 예를 들어, 중쇄 31번 위치에 R을 운반하는 항원 결합 폴리펩타이드 TPP-1360의 AUC 증가%는 144%이고, 90번 위치에 Y를 운반하는 항원 결합 폴리펩타이드 TPP-1387의 경우 14%이다(본원에 개시된 실시예의 표 6 참조). 놀랍게도 실시예에서 나타난 바와 같이, 항원 결합 폴리펩타이드는 상승작용 효과를 제공한다. 예를 들어, TPP-1388에 나타낸 바와 같이, 중쇄의 31번 위치에서 R에 의한 치환 및 90번 위치에서 Y에 의한 치환을 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드는 AUC의 273% 증가를 나타내며, 이는 AUC의 증가%에 관한 상승작용을 예시한다; 예를 들어 표 5 또는 6을 참조하시오.
"해리 상수(K D )"("mol/L"로 측정, 때로는 "M"으로 약칭함)라는 용어는 결합 부분(예를 들어, 항원 결합 폴리펩타이드 또는 이의 단편)과 표적 분자(예를 들어, 항원 또는 이의 에피토프) 사이의 특정 상호작용의 해리 평형 상수, koff/kon의 비를 의미한다. KD와 친화도는 반비례한다. KD 값은 항원 결합 폴리펩타이드의 농도와 관련되며, KD 값이 낮을수록 항원 결합 폴리펩타이드의 친화도는 더 높아진다. 친화도, 즉 KD 값은 표면 플라스몬 공명(SPR) 기반 분석(예를 들어, BIAcore 분석) 또는 생물층 간섭계(BLI), 효소-결합 면역흡수 분석(ELISA), 및 경쟁 분석(예를 들어, 방사성 면역 분석(RIA))을 사용하여 결합 및 해리 속도를 측정하는 것과 같은 다양한 공지된 방법에 의해 실험적으로 평가될 수 있다. 저-친화도 항원 결합 폴리펩타이드는 일반적으로 항원과 천천히 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원에 더 빠르게 결합하고 결합된 상태를 유지하는 경향이 있다. KD는 전형적으로 BLI 또는 SPR에 의해 30℃에서 측정된다.
전형적으로, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드가 제2 결합 부위를 포함하고, 주어진 항원에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부위가 친화도 성숙 TCR 또는 이의 단편을 포함하거나, 항원 결합 폴리펩타이드가 이중특이성 포맷의 가용성 분자 또는 이의 단편, 예를 들어 TCER® 분자 또는 이의 단편인 경우, TCR 또는 이의 기능적 단편, 특히 Vα 또는 Vβ의 KD는 9x10-8 내지 5x10-13 M, 9x10-9 내지 1x10-12 M, 8x10-9 내지 5x10-12 M, 7x10-9 내지 1x10-11 M, 6x10-9 내지 2x10-11 M, 5x10-9 내지 5x10-11 M, 4x10-9 내지 8x10-11 M, 3x10-9 내지 1x10-10 M의 범위이다. 본원에서 "TCER®" 분자 또는 "TCER®"로 지칭되는 이중특이성 포맷의 분자는 전형적으로 T 세포 상의 표면 분자에 특이적으로 결합하는 제1 폴리펩타이드 쇄에 포함된 제1 항원 결합 부위, 및 MHC-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩타이드 쇄에 포함된 제2 항원 결합 부위를 포함한다.
전형적으로, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드가 제2 결합 부위를 포함하고, 주어진 항원에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부위가 TCR 또는 이의 단편을 포함하는 경우, TCR 또는 이의 단편은 3x10-5 내지 1x10-7 s-1, 2x10-5 내지 5x10-7 s-1, 1x10-5 내지 1x10-6 s-1 또는 5x10-6 내지 1x10-6 s-1 범위의 Kd를 갖는다.
"TCER ® 분자"라고도 지칭되는 "TCER ® "이라는 용어는 본 발명의 맥락에서 T 세포의 표면 분자에 특이적으로 결합하는 하나의 특이성과 MHC-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 하나의 특이성을 포함하는 이중특이성 분자를 의미한다. 따라서, "TCER®"은 본원에 정의된 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 포함하는 가용성 항원 결합 폴리펩타이드인 이중특이성 TCR이며, 여기서 제1 항원 결합 부위는 α/β TCR/CD3 복합체에 특이적으로 결합하는 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같은 항원 결합 폴리펩타이드의 VH 및 VL 도메인, 및 MHC-펩타이드 복합체, 예를 들어 종양-관련 펩타이드-MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 TCR의 α 가변 도메인(Vα) 및 β 가변 도메인(Vβ)에 의해 형성된 추가 또는 제2 항원 결합 부위를 포함한다.
"특이적으로 결합하는"이라는 용어는 표적이 특이적 및 비-특이적 결합 부위를 포함하는 경우 항원 결합 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 예를 들어 항체 또는 이의 단편 또는 TCR 또는 이의 단편이 그의 표적의 특이적 결합 부위에 결합하는 것을 의미한다. 그러나, 때로는 밀접하게 관련된 단백질에 대한 폴리펩타이드의 결합이 불가피한 경우, 표적에 대한 실제 결합은 특이적일 수 있지만 항원 결합 폴리펩타이드는 의도된 표적 결합과 관련하여 비특이적인 것으로 간주된다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 유사한 항원보다 표적에 더 강하게 결합하거나 결합이 증대된 경우 특이적으로 결합하는 것으로 간주된다. 항원 결합 폴리펩타이드가 항체인 경우, 항체가 그의 표적에 특이적으로 결합하는 것이 바람직하다.
본 발명의 맥락에서 "세포 표면 단백질"이라는 용어는 보다 복잡한 유기체의 세포막 층에 포매되거나 그 층에 걸쳐 있는 단백질을 지칭한다. 이 단백질은 세포가 다른 세포를 포함하여 주변 환경과 상호 작용하는 방식에 필수적이다. 세포 표면 단백질의 예로는 항체, TCR 또는 TCR 쇄와 같은 항원 수용체; MHC 분자 또는 β-마이크로글로불린과 같은 항원 제시 분자; CD4, CD8 또는 CD19와 같은 공동-수용체 분자, CD3-γ, -δ 및 -ε 쇄, CD79a 및 CD79b와 같은 항원 수용체 보조 분자; CD28, CD80 또는 CD86과 같은 공동-자극 또는 억제 분자; 자연 살해 세포상의 수용체; 백혈구상의 수용체, ICAM과 같은 면역글로불린-유사 세포 부착 분자; NCAM, CD2; IL-1 수용체 또는 콜로니 자극 인자 1 수용체와 같은 사이토카인 수용체; 성장 인자 수용체; 수용체 티로신 키나제 또는 포스파타제, 중합체성 면역글로불린 수용체(PIGR) 또는 Fc 수용체와 같은 Ig 결합 수용체가 있다. 추가 예는 CD3, CD4, CD25, CTLA4, GITR, NK1.1, SLAMF1, SLAMF6, TGFβ, Vα24, Jα18, IL-12R, IFNγR, CXCR3, IL-4R, IL33R, CCR4, IL-17RB, CRTH2; IL-23R, CCR6, IL-1R, CD161; CCR7 hi, CD44, CD62Lhi, TCR, CD3, IL-7R (CD127), IL-15R로 이루어지는 군으로부터 선택된 표면 마커 분자이다.
"MHC"라는 용어는 본 발명의 맥락에서 "주요 조직적합성 복합체"라는 용어의 약어를 의미한다. MHC는 세포 표면 단백질 세트, 즉 척추동물의 변경된 자연 또는 외래 단백질에 대한 획득 면역을 확립하는 데 필수적인 역할을 하는 세포 표면 수용체로, 이는 결국 조직 내 조직적합성을 결정한다. MHC 분자의 주요 기능은 변경된 단백질이나 병원체에서 유래된 항원에 결합하여 적절한 T 세포가 인식할 수 있도록 이를 세포 표면상에 표시하는 것이다. 인간 MHC는 HLA(인간 백혈구 항원) 복합체 또는 HLA라고도 한다. MHC 유전자 패밀리는 부류 I, 부류 II 및 부류 III의 세 가지 하위 그룹으로 나뉜다. 펩타이드와 MHC 부류 I의 복합체는 적절한 TCR을 갖는 CD8 양성 T 세포에 의해 인식되는 반면, 펩타이드와 MHC 부류 II 분자의 복합체는 적절한 TCR을 갖는 CD4 양성 헬퍼 T 세포에 의해 인식된다. CD8- 및 CD4-의존적인 반응 유형 모두 항종양 효과에 공동으로 및 상승작용적으로 기여하므로, 종양-관련 항원 및 상응하는 TCR의 식별 및 특성화는 백신 및 세포 요법과 같은 암 면역요법의 개발에 중요하다.
"MHC-I"이라는 용어는 본 발명의 맥락에서 MHC 부류 I 분자 또는 MHC-I를 의미한다. MHC I 분자는 MHC I 중쇄라고도 하는 알파 쇄와 베타 2 마이크로글로불린 분자를 구성하는 베타 쇄로 이루어진다. 알파 쇄는 3개의 알파 도메인, 즉 알파1 도메인, 알파2 도메인 및 알파3 도메인을 포함한다. 알파1 및 알파2 도메인은 주로 펩타이드 리간드 MHC(pMHC) 복합체를 생성하는 펩타이드 포켓을 형성하는 데 기여한다. MHC-I는 전형적으로 세포질 항원 단백질에서 유래하고 유비퀴틴화 후 프로테아솜에 의해 분해된 후 항원 처리(TAP)와 관련된 특정 운반체를 통해 세포질에서 소포체(ER)로 운반되는 펩타이드에 결합한다. MCH I는 전형적으로 길이가 8-12개 아미노산인 펩타이드에 결합한다.
"MHC-II"라는 용어는 본 발명의 맥락에서 MHC 부류 II 분자 또는 MHC-II를 의미한다. MHC-II 분자는 알파 및 베타 쇄로 이루어지며, 여기서 알파 쇄는 2개의 알파 도메인, 알파1 도메인, 알파2 도메인을 포함하고, 베타 쇄는 2개의 베타 도메인, 베타 도메인1과 베타 도메인2를 포함한다. MHC II는 전형적으로 불변 쇄라고 지칭되는 단백질과 복합체로 ER에서 폴딩되고 이어서 불변 쇄가 카텝신 프로테아제에 의해 절단되는 후기 엔도솜 구획으로 운반되며, 짧은 단편은 부류 II 관련 불변 쇄 펩타이드(CLIP)라고 지칭되는 MHC II의 펩타이드 결합 홈에 결합된 채로 남아 있는다. 이어서 이러한 자리표시자 펩타이드는 통상적으로 세포내이입 구획에서 이용 가능한 단백질분해적으로 분해된 단백질로부터 유래된 더 높은 친화도 펩타이드와 교환된다. MHC-II는 전형적으로 10-30개 아미노산 길이의 펩타이드 또는 13-25개 아미노산 길이의 펩타이드에 결합한다.
"HLA"라는 용어는 본 발명의 맥락에서 아미노산 서열이 인간마다 상이한 인간 MHC 분자를 의미한다.
본 발명의 맥락에서 "핵산"이라는 용어는 단일 또는 이중 가닥 올리고- 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 염기 또는 둘 다의 중합체를 의미한다. 뉴클레오타이드 단량체는 핵염기, 5탄당(예를 들어, 비제한적으로, 리보스 또는 2'-데옥시리보스) 및 1 내지 3개의 인산염 그룹으로 구성된다. 전형적으로, 핵산은 개별 뉴클레오타이드 단량체 사이의 포스포다이에스테르 결합을 통해 형성된다. 본 발명의 맥락에서, 핵산이라는 용어에는 비제한적으로, 리보핵산(RNA) 및 데옥시리보핵산(DNA) 분자가 포함되지만, 다른 연결을 포함하는 핵산의 합성 형태(예를 들어 문헌[Nielsen et al., Science 254:1497-1500, 1991]에 기재된 바와 같은 펩타이드 핵산)도 포함된다. 전형적으로 핵산은 단일 또는 이중 가닥 분자이며 자연 발생 뉴클레오타이드로 구성된다. 핵산의 단일 가닥의 묘사는 또한 (적어도 부분적으로) 상보적 가닥의 서열을 정의한다. 핵산은 단일 또는 이중 가닥일 수 있거나 이중 및 단일 가닥 서열 모두의 부분을 함유할 수 있다. 예시된 이중-가닥 핵산 분자는 3' 또는 5' 돌출부를 가질 수 있으므로 전체 길이에 걸쳐 완전히 이중 가닥일 필요는 없거나 이것으로 가정되지 않는다. 핵산은 생물학적, 생화학적 또는 화학적 합성 방법이나 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 비제한적으로 RNA의 증폭 및 역전사 방법에 의해 수득될 수 있다. 핵산이라는 용어는 염색체 또는 염색체 분절, 벡터(예를 들어, 발현 벡터), 발현 카세트, 네이키드 DNA 또는 RNA 중합체, 프라이머, 탐침, cDNA, 게놈 DNA, 재조합 DNA, cRNA, mRNA, tRNA, 미세RNA(miRNA) 또는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 포함한다. 핵산은 예를 들어 단일 가닥, 이중 가닥 또는 삼중 가닥일 수 있으며 특정 길이로 제한되지 않는다. 달리 표시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 명시적으로 표시된 임의의 서열에 더하여 상보적 서열을 포함하거나 암호화한다.
본 발명의 맥락에서 "벡터"라는 용어는 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드(들) 및 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 혼합물을 의미하며, 이 중에 포함된 단백질 및/또는 핵산은 세포내로 도입되거나 도입할 수 있다. 벡터의 예에는 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 또는 인공 염색체가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 벡터는 예를 들어 외래 또는 이종 DNA와 같은 관심 유전자 산물을 숙주 세포에 도입하는 데 사용된다. 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 자율 복제를 촉진하는 "레플리콘" 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있다. 외래 DNA는 이종 DNA로 정의되며, 이는 숙주 세포에서 자연적으로 발견되지 않는 DNA로, 예를 들어 벡터 분자를 복제하거나 선택 가능 또는 스크리닝 가능한 마커를 암호화하거나 트랜스유전자를 암호화한다. 일단 숙주 세포에 들어가면 벡터는 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 또는 동시에 복제될 수 있으며, 벡터 및 그의 삽입된 DNA의 여러 사본이 생성될 수 있다. 또한, 벡터는 삽입된 DNA의 mRNA 분자 내로의 전사를 허용하거나 삽입된 DNA가 여러 개의 RNA 사본으로 복제되도록 하는 필수 요소를 함유할 수도 있다. 벡터는 관심 유전자의 발현을 조절하는 "발현 조절 서열"을 추가로 포함할 수 있다. 전형적으로, 발현 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 사일런서, 절연체 또는 억제인자와 같은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드이다. 하나 이상의 관심 유전자 산물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에서, 발현은 하나 이상의 발현 조절 서열에 의해 함께 또는 별도로 조절될 수 있다. 보다 구체적으로, 벡터에 포함된 각 폴리뉴클레오타이드는 별도의 발현 조절 서열에 의해 조절되거나, 벡터에 포함된 모든 폴리뉴클레오타이드는 단일 발현 조절 서열에 의해 조절될 수 있다. 단일 발현 조절 서열에 의해 조절되는 단일 벡터에 포함된 폴리뉴클레오타이드는 개방 판독 프레임을 형성할 수 있다. 일부 발현 벡터는, 발현된 mRNA의 반감기를 증가시키고/시키거나 mRNA를 단백질 분자로 번역하게 하는 삽입된 DNA에 인접한 서열 요소를 추가로 포함한다. 따라서 삽입된 DNA에 의해 암호화된 많은 mRNA 및 폴리펩타이드 분자가 빠르게 합성될 수 있다. 이러한 벡터는 피험자에게 투여 시 상기 폴리펩타이드의 발현을 유발하거나 지시하기 위한 조절 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 종결자 등을 포함할 수 있다. 동물세포용 발현 벡터에 사용되는 프로모터 및 인핸서의 예로는 SV40의 초기 프로모터 및 인핸서(문헌[Mizukami T. et al. 1987]), 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터 및 인핸서(문헌[Kuwana Y et al. 1987]), 면역글로불린 H 쇄의 프로모터(문헌[Mason JO et al. 1985]) 및 인핸서(문헌[Gillies SD et al. 1983]) 등이 포함된다. 동물 세포용의 임의의 발현 벡터는, 인간 항체 C 영역을 암호화하는 유전자가 삽입되어 발현될 수 있는 한, 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예는 pAGE107(문헌[Miyaji H et al. 1990]), pAGE103(문헌[Mizukami T et al. 1987]), pHSG274(문헌[Brady G et al. 1984]), pKCR(문헌[O'Hare K et al. 1981]), pSG1 베타 d2-4-([Miyaji H et al. 1990]) 등을 포함한다. 플라스미드의 다른 예에는 복제 기원을 포함하는 복제 플라스미드, 또는 통합 플라스미드, 예를 들어 pUC, pcDNA, pBR이 포함된다.
"형질전환"이라는 용어는 세포막을 통해 세포에 의해 핵산(DNA 또는 RNA)과 같은 유전 물질의 흡수를 수반하는 숙주 세포 내로의 유전자 전달의 자연 발생 과정을 의미하며, 따라서 숙주 세포는 도입된 유전자 또는 서열을 발현하여 원하는 유전자 산물, 전형적으로 숙주 세포에 도입되는 유전자 또는 서열에 의해 암호화되는 단백질 또는 효소를 생성할 것이다. 자연적 형질전환 및 인공적 또는 유도 형질전환으로서 공지된 두 가지 유형의 형질전환이 존재한다. 인공적 또는 유도 형질전환은 전형적으로 "형질감염"으로 지칭된다.
"형질감염"이라는 용어는 숙주 세포가 외래 유전 물질을 수용할 수 있게 숙주 세포의 세포막에 구멍을 생성시키는 것을 수반하는 유전자 전달 방식을 의미한다. 형질감염은 곤충이나 포유동물 세포와 같은 진핵 세포의 형질전환을 의미한다. 화학적 매개 형질감염은 예를 들어 인산칼슘, 양이온성 중합체 또는 리포솜의 사용을 포함한다. 비-화학적 매개 형질감염 방법은 전형적으로 일렉트로포레이션, 소노포레이션, 임페일펙션(impalefection), 광학적 형질감염 또는 유체 역학 전달이다. 입자 기반 형질감염은 나노입자를 사용하여 핵산을 숙주 세포로 전달하는 유전자 총 기법을 사용하거나 또는 자기 감염(magnetofection)이라는 다른 방법에 의한다. 뉴클레오펙션(nucleofection)과 열 충격의 사용은 성공적인 형질감염을 위한 또 다른 진화된 방법이다. 형질감염 방법을 통해 외래 핵산을 수용하는 숙주 세포는 "형질감염"되었다.
본 발명의 맥락에서 "형질도입"이라는 용어는 바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해 DNA 또는 RNA와 같은 외래 핵산이 세포 내로 전달되는 것을 의미한다. 바이러스나 바이러스 벡터에 의해 외래 핵산(DNA 또는 RNA)을 수용하고 발현하는 숙주 세포는 "형질도입"되었다.
"약학 조성물" 또는 "치료 조성물"이라는 용어는 본 발명의 맥락에서 피험자에게 적절하게 투여될 때 원하는 치료 효과를 유도할 수 있는 화합물 또는 조성물을 의미한다.
"약학적으로" 또는 "약학적으로 허용되는"은 포유동물, 특히 인간에게 적절하게 투여될 때 유해한 반응, 알러지 반응 또는 기타 원치 않는 반응을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 의미한다. 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 임의의 유형의 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제형 보조제를 의미한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 본 발명의 맥락에서 "약학적으로 허용되는 희석제" 또는 "약학적으로 허용되는 비히클"로도 지칭될 수 있으며, 생리학적으로 적합한 용매, 증량제, 안정화제, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함할 수 있다.
"치료제"라는 용어는 본 발명의 맥락에서 치료 효과를 갖는 작용제를 의미한다.
하기에서 본 발명의 다양한 양태를 더욱 상세하게 정의한다. 이렇게 정의된 각 양태는 달리 명시되지 않는 한 다른 양태(들)와 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
상기에 표시된 바와 같이, VH 및 VL에서 CDR 및 FR의 위치는 Chothia, Kabat, AbM 또는 Contact와 같은 상기에서 정의된 주석 중 임의의 것에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 첫 번째 양태는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드에 관한 것이며, 여기서 CDR 및 FR은 Chothia에 따라 명시되고,
(1) VH는
(a) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1),
(b) 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2,
(c) HCDR3, 및
(d) 중쇄 프레임워크 영역(HFR) 1-4
를 포함하고;
(2) VL은
(a) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1),
(b) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2,
(c) LCDR3, 및
(d) 경쇄 프레임워크 영역(HFR) 1-4
를 포함하고;
여기서
(i) 양으로 하전되지 않은 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 및/또는
(ii) 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 및/또는
(iii) HFR3에서 Chothia 넘버링에 따른 90번 위치는 티로신(Y) 잔기로 치환되고,
여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 α/β T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체에 특이적으로 결합한다.
상기 양태의 추가의 특정 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는
(i) 하기의 중쇄 위치 중 하나 이상: 30, 31, 53 및 54; 및/또는
(ii) 하기의 경쇄 위치 중 하나 이상: 31 및 56
에서 양으로 하전된 아미노산을 포함하며, 여기서 위치는 Chothia 넘버링에 따른다.
상기 양태의 추가의 특정 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는
(a) 중쇄의 하기 위치에서 양으로 하전된 아미노산이
(i) 30번 위치에서 R, K 또는 H이고;
(ii) 31번 위치에서 R, K 또는 H이고;
(iii) 53번 위치에서 R, K 또는 H이고; 및/또는
(iv) 54번 위치에서 R 또는 K이고; 및/또는
(b) 경쇄의 하기 위치에서 양으로 하전된 아미노산이
(i) 31번 위치에서 R 또는 K이고; 및/또는
(ii) 56번 위치에서 R 또는 K이고,
여기서 위치는 Chothia 넘버링에 따른다.
대안적으로, 첫 번째 양태는 또한 하기와 같이 Kabat 주석에 기반하여 명시될 수 있다:
중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드로서, 여기서
(1) VH는
(a) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1),
(b) YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(서열번호 53)의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2,
여기서
X1은 A 또는 N이고;
X2 는 E 또는 Q이고; 및/또는
X3은 Q 또는 K이다
(c) HCDR3, 및
(d) 중쇄 프레임워크 영역(HFR) 1-4
를 포함하고;
(2) VL은
(a) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1),
(b) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2,
(c) LCDR3, 및
(d) 경쇄 프레임워크 영역(LFR) 1-4
를 포함하고, 여기서
(i) 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 및/또는
(ii) 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 및/또는
(iii) Kabat 넘버링에 따른 HFR1의 30번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 및/또는
(iv) Kabat 넘버링에 따른 HFR3의 90번 위치는 티로신(Y) 잔기로 치환되고,
여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 α/β T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체에 특이적으로 결합한다.
특히, 본 발명의 실시양태를 설명함에 있어서, 가변 경쇄 및 가변 중쇄 내의 아미노산의 위치는 별도의 언급이 없는 한 Kabat 넘버링에 따라 표시된다.
본 발명의 맥락에서 HFR3의 90번 위치에서 Y로의 돌연변이는 (i) 내지 (iv)에 명시된 치환 중 어느 것도 포함하지 않는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 α/β TCR/CD3 복합체에 대한 항원 결합 폴리펩타이드의 결합의 증가 및/또는 열안정성의 증가(예를 들어 Tm℃ 또는 델타 Tm℃)로 이어지며, 이러한 양의 효과는 상기 (i) 내지 (iii)에 명시된 치환 중 1개, 2개 또는 전부와 조합되는 경우 더욱 현저함이 관찰되었다. 증가된 결합은 본원에서 예를 들어 "x-배" 감소로 지칭되는 결합 EC50의 감소로서 기재된다. 대안적으로, 결합의 증가는 또한 본원에서 "AUC 결합의 증가%"로서 기재된다. Tm의 차이는 본원에서 상기에 정의된 바와 같이 "델타 Tm℃"로 기재된다.
따라서, 항원 결합 폴리펩타이드의 하나의 실시양태에서, HFR3의 90번 위치는 Y로 치환되고, 추가로 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다.
본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드의 하나의 실시양태에서, HFR1의 30번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다. 하나의 실시양태에서 HFR3의 90번 위치는 Y로 치환된다.
하나의 실시양태에서, HFR1의 30번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, HFR3의 90번 위치는 Y로 치환된다.
항원 결합 폴리펩타이드의 하나의 실시양태에서, HFR3의 90번 위치는 Y로 치환되고, HFR1의 30번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 및 추가로 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다.
항원 결합 폴리펩타이드의 하나의 실시양태에서, HFR1의 30번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 추가로 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다.
하나의 실시태양에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 54에 따른 LCDR1(여기서 양으로 하전되지 않은 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다); 및/또는 서열번호 55에 따른 LCDR2(여기서 양으로 하전되지 않은 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다)를 포함한다.
항원 결합 폴리펩타이드의 하나의 실시양태에서, HFR1의 30번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 추가로 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다.
항원 결합 폴리펩타이드의 하나의 실시양태에서, HFR3의 90번 위치는 Y로 치환되고, 추가로 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다.
항원 결합 폴리펩타이드의 하나의 실시양태에서, HFR1의 30번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; HFR3의 90번 위치는 Y로 치환되며, 추가로 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다.
항원 결합 폴리펩타이드의 하나의 실시양태에서, (iv) HFR3의 90번 위치는 Y로 치환되고, (i) 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, (ii) 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다.
항원 결합 폴리펩타이드의 하나의 실시양태에서, (iv) HFR3의 90번 위치는 Y로 치환되고, (iii) HFR1의 30번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, (i) 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, (ii) 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 적어도 하나의 아미노산은 본원에서 상기 및 하기에 정의된 바와 같이 HCDR1 및/또는 HCDR2 및/또는 LCDR1 및/또는 LCDR2 위치에서 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, CDR 중 4개 이하의 위치가 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게는 CDR 중 3개 이하의 위치가 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다.
하나의 실시양태에서, HCDR1 및/또는 HCDR2 및/또는 LCDR1 및/또는 LCDR2 위치에서 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 항원 결합 폴리펩타이드의 적어도 하나의 아미노산은 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하의 아미노산이다. 하기의 실시양태에서, 양으로 하전된 아미노산이 서열번호 52의 HCDR1, 서열번호 53의 HCDR2, 서열번호 54의 LCDR1, 서열번호 55의 LCDR2, 서열번호 56의 HCDR3 또는 서열번호 57의 LCDR3에 특정 위치에 존재하는 경우, 상기 아미노산은 본 발명의 맥락에서 상이한 양으로 하전된 아미노산으로 치환되지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 첫 번째 양태의 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52에 따른 HCDR1을 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SYVMH를 포함하는 서열번호 52의 경우, S는 H, K 또는 R로 치환된다. 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SYVMH를 포함하는 서열번호 52의 경우, Y는 H, K 또는 R로 치환된다. 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SYVMH를 포함하는 서열번호 52의 경우, V는 H, K 또는 R로 치환된다. 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SYVMH를 포함하는 서열번호 52의 경우, M은 H, K 또는 R로 치환된다.
본 발명의 첫 번째 양태의 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 53에 따른 HCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 특히, 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 두 번째 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 특히, 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 세 번째 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 특히, 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 3개의 Y가 모두 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다.
하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 I가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단 N이 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 두 번째 N-이 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N이 둘 다 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 P가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 V가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 T가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 F가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 G가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다.
본 발명의 첫 번째 양태의 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 53에 따른 HCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 두 번째 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 세 번째 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 3개의 Y가 모두 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 I가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단 N이 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 두 번째 N이 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N이 둘 다 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 P가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 V가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 T가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 F가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 G가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다.
본 발명의 첫 번째 양태의 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 53에 따른 HCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 두 번째 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 특히, 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 세 번째 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 3개의 Y가 모두 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 I가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단 N이 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 두 번째 N이 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N이 둘 다 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 P가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 V가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 T가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 F가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 G가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다.
본 발명의 첫 번째 양태의 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 53에 따른 HCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 특히 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 두 번째 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 특히, 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 세 번째 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 특히, 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 3개의 Y가 모두 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 I가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단 N이 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 두 번째 N이 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N이 둘 다 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 P가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 V가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 T가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 F가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 A이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 G가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다.
하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 두 번째 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 세 번째 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 3개의 Y가 모두 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 I가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단 N이 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 두 번째 N이 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N이 둘 다 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 P가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 V가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 T가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 F가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 Q가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다.
하나의 실시양태에서 HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 두 번째 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 세 번째 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 3개의 Y가 모두 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 I가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단 N이 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 두 번째 N이 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N이 둘 다 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 P가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 V가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 T가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 F가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 G가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다.
하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 두 번째 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 세 번째 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 3개의 Y가 모두 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 I가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단 N이 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 두 번째 N이 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N이 둘 다 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 P가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 V가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 T가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 F가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 Q이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 G가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다.
하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 두 번째 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 세 번째 Y가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 3개의 Y가 모두 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 I가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단 N이 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N-말단으로부터 두 번째 N이 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 N이 둘 다 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 P가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 V가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 T가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 Q이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 F가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다. 하나의 실시양태에서, HCDR2는 아미노산 서열 YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(여기서 X1은 N이고; X2는 E이고, X3은 K이다)를 포함하는 서열번호 53을 포함하고, 이는 G가 H, K 또는 R로 치환됨을 의미한다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52에 따른 HCDR1(여기서 양으로 하전되지 않은 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다) 및 상기에 제시된 바와 같은 HCDR2를 포함하고, 중쇄 프레임워크 영역(HFR) 1-4(여기서 HFR의 30번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다)를 추가로 포함한다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52에 따른 HCDR1(여기서 양으로 하전되지 않은 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다) 및 상기에 제시된 바와 같은 HCDR2를 포함하고, HCDR3 및 HFR 1-4를 추가로 포함한다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52에 따른 HCDR1(여기서 양으로 하전되지 않은 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다) 및 상기에 제시된 바와 같은 HCDR2를 포함하고, HCDR3 및 HFR 1-4(여기서 바람직하게 90번 위치는 Y로 치환된다)를 추가로 포함한다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52에 따른 HCDR1(여기서 양으로 하전되지 않은 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다) 및 상기에 제시된 바와 같은 HCDR2를 포함하고, HCDR3 및 HFR 1-4(여기서 HFR1의 30번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다)를 추가로 포함한다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52에 따른 HCDR1(여기서 양으로 하전되지 않은 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다) 및 상기에 제시된 바와 같은 HCDR2를 포함하고, HCDR3 및 HFR 1-4(여기서 HFR1의 30번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고 HFR3의 90번 위치는 Y로 치환된다)를 추가로 포함한다. 상기 HFR1-4 서열은 또한 상기 변형 중 어느 것도 포함하지 않는 FR과 비교하여 치환, 결실 또는 삽입과 같은 하나 이상의 추가 변형을 또한 포함할 수 있다. 그러나, FR1-4 서열이 특정 위치, 예를 들어 버니어 대역, VH/VL 쇄-간 계면 또는 CDR 표준 부류를 결정하는 위치에서 변형되지 않는 것이 바람직하다. 바람직하게, HFR3은 90번 위치에 Y 잔기를 포함한다. 본원에서 하기에, 발명의 맥락에서 변형되지 않아야 하는 FR 중의 추가의 위치를 제공한다. 또한 특정 위치는 사용된 주석에 관계없이 FR에 포함되고 CDR에는 포함되지 않는 것이 바람직하다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 54(SATSSVSYMH)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1)을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다. 특히, 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단 S는 H, K 또는 R로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 두 번째 S는 H, K 또는 R로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 세 번째 S는 H, K 또는 R로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 네 번째 S는 H, K 또는 R로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 4개의 S는 모두 H, K 또는 R로 치환된다. 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, A는 H, K 또는 R로 치환된다. 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, T는 H, K 또는 R로 치환된다. 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, V는 H, K 또는 R로 치환된다. 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, Y는 H, K 또는 R로 치환된다. 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, M은 H, K 또는 R로 치환된다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 55(DTSKLAS)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR2)를 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 55의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, T는 H, K 또는 R로 치환된다. 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, S는 H, K 또는 R로 치환된다. 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 H, K 또는 R로 치환된다. 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, A는 H, K 또는 R로 치환된다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 54(SATSSVSYMH)의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1을 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되며; 서열번호 55(DTSKLAS)의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 55의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다.
특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단 S는 R, K 또는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 R로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 두 번째 S는 R, K 또는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 R로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 세 번째 S는 R, K 또는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 R로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 네 번째 S는 R, K 또는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 R로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, 4개의 S는 모두 R, K 또는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 R로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단 S는 K로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 R, K 또는 H로 치환된다. 특히 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 두 번째 S는 K로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 R, K 또는 H로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 세 번째 S는 K로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 R, K 또는 H로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 네 번째 S는 K로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 R, K 또는 H로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, 4개의 S는 모두 K로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 R, K 또는 H로 치환된다.
특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단 S는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 R로 치환된다. 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 두 번째 S는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 R로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 세 번째 S는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 R로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 네 번째 S는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 R로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, 4개의 S는 모두 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 R로 치환된다.
특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단 S는 R, K 또는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 K로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 두 번째 S는 R, K 또는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 K로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 세 번째 S는 R, K 또는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 K로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 네 번째 S는 R, K 또는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 K로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 4개의 S는 모두 R, K 또는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 K로 치환된다.
특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단 S는 K로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 K로 치환된다. 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 두 번째 S는 K로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 K로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 세 번째 S는 K로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 K로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 네 번째 S는 K로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 K로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, 4개의 S는 모두 K로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 K로 치환된다.
특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단 S는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 K로 치환된다. 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 두 번째 S는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 K로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 세 번째 S는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 K로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 네 번째 S는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 K로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, 4개의 S는 모두 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 K로 치환된다.
특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단 S는 R, K 또는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 H로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 두 번째 S는 R, K 또는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 H로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 세 번째 S는 R, K 또는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 H로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 네 번째 S는 R, K 또는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 H로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 4개의 S는 모두 R, K 또는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 H로 치환된다.
특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단 S는 K로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 H로 치환된다. 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 두 번째 S는 K로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 H로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 세 번째 S는 K로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 H로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 네 번째 S는 K로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 H로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, 4개의 S는 모두 K로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 H로 치환된다.
특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단 S는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 H로 치환된다. 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 두 번째 S는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 H로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 세 번째 S는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 H로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, N-말단으로부터 네 번째 S는 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 H로 치환된다. 특히, 하나의 실시양태에서 아미노산 서열 SATSSVSYMH를 포함하는 서열번호 54의 경우에, 4개의 S는 모두 H로 치환되고, 아미노산 서열 DTSKLAS를 포함하는 서열번호 55의 경우에, L은 H로 치환된다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 상기에 제시된 바와 같은 서열번호 54(SATSSVSYMH)의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1(여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다)을 포함하고/하거나; 서열번호 55(DTSKLAS)의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2(여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 55의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다)을 포함하고; HFR1의 30번 위치에 양으로 하전된 아미노산을 추가로 포함한다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 HFR3을 추가로 포함한다. HFR3이 90번 위치에 Y를 포함하는 것이 특히 바람직하다.
또 다른 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 상기에 정의된 바와 같은HCDR1 및/또는 HCDR2 및/또는 상기에서 정의된 바와 같은 LCDR2를 포함하는 VH 및 VL을 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 HFR3을 추가로 포함한다. HFR3이 90번 위치에 Y를 포함하는 것이 특히 바람직하다. 항원 결합 폴리펩타이드가 HFR1을 추가로 포함하고 여기서 HFR1의 30번 위치가 양으로 하전된 아미노산으로 치환되는 것이 또한 바람직하다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 54에 따른 LCDR1(여기서 양으로 하전되지 않은 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 하전된 아미노산으로 치환된다) 및 상기에 제시된 바와 같은 LCDR2를 포함하고, 경쇄 CDR 3(LCDR3) 및 경쇄 프레임워크 영역(LFR) 1-4를 추가로 포함한다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 54에 따른 LCDR1(여기서 양으로 하전되지 않은 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 하전된 아미노산으로 치환된다) 및 상기에 제시된 바와 같은 LCDR2를 포함하고, 중쇄 CDR 3(HCDR3) 및 중쇄 프레임워크 영역(HFR) 1-4를 추가로 포함한다. 상기 LFR1-4 서열은 또한 상기 변형 중 어느 것도 포함하지 않는 FR과 비교하여 치환, 결실 또는 삽입과 같은 하나 이상의 추가 변형을 또한 포함할 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 상기 추가의 변형의 경우에, 변형된 FR 서열은 본 발명의 치환, 예를 들어 VH에서 FR3의 90번 위치에 티로신, 및/또는 VH에서 30번 위치에 양으로 하전된 아미노산을 여전히 포함한다. FR1-4 서열이 특정 위치, 예를 들어 버니어 대역, VH/VL 쇄-간 계면 또는 CDR 표준 부류를 결정하는 위치에서 변형되지 않는 것이 추가로 바람직하다. 본원에서 하기에, 발명의 맥락에서 변형되지 않아야 하는 FR 중의 추가의 위치를 제공한다. 또한 특정 위치는 사용된 주석에 관계없이 FR에 포함되고 CDR에는 포함되지 않는 것이 바람직하다.
바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 α/β TCR/CD3 복합체에 특이적으로 결합하고, 바람직하게 α/β TCR/CD3 복합체는 T 세포상에, 더욱 바람직하게는 T 림프구상에 존재한다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포에의 결합에 대해 참조 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1에 따른 VH 아미노산 서열 및 서열번호 2에 따른 VL 아미노산 서열을 포함하는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1에 따른 VH 및 서열번호 2에 따른 VL을 포함하는 항체를 갖는 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포에의 결합에 대해 참조 항체와 경쟁한다. 바람직한 실시양태에서 참조 항체는 불변 도메인, 바람직하게는 인간 IgG1 불변 도메인 및 인간 카파 경쇄 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 60에 따른 중쇄(HC) 아미노산 서열 및 서열번호 6에 따른 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함하는 항체를 갖는 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포에의 결합에 대해 참조 항체와 경쟁한다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 60에 따른 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 6에 따른 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체를 갖는 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포에의 결합에 대해 참조 항체와 경쟁한다.
본 발명의 첫 번째 양태의 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 HCDR 및/또는 LCDR에 포함된 양으로 하전된 아미노산(들)은 중쇄의 31, 53 및/또는 54번 위치(들) 및/또는 경쇄의 31 및/또는 56번 위치(들)에 존재한다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 HCDR에 포함된 양으로 하전된 아미노산은 중쇄의 31번 위치에 있다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 HCDR에 포함된 양으로 하전된 아미노산은 중쇄의 31 및 53번 위치에 있다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 HCDR에 포함된 양으로 하전된 아미노산은 중쇄의 31 및 54번 위치에 있다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 HCDR에 포함된 양으로 하전된 아미노산은 중쇄의 31, 53 및 54번 위치에 있다. 또한, 이들 실시양태 중 어느 하나의 항원 결합 폴리펩타이드는 HFR3의 90번 위치에 Y를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR에 포함된 양으로 하전된 아미노산은 경쇄의 31번 위치에 있다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR에 포함된 양으로 하전된 아미노산은 경쇄의 56번 위치에 있다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR에 포함된 양으로 하전된 아미노산은 경쇄의 31 및 56번 위치에 있다. 또한, 이들 실시양태 중 어느 하나의 항원 결합 폴리펩타이드는 HFR3의 90번 위치에 Y를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄의 31번 위치 및 경쇄의 31 및/또는 56번 위치에 양으로 하전된 아미노산을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄의 53번 위치 및 경쇄의 31 및/또는 56번 위치에 양으로 하전된 아미노산을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄의 54번 위치 및 경쇄의 31 및/또는 56번 위치에 양으로 하전된 아미노산을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄의 31 및 53번 위치 및 경쇄의 31 및/또는 56번 위치에 양으로 하전된 아미노산을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄의 31 및 54번 위치 및 경쇄의 31 및/또는 56번 위치에 양으로 하전된 아미노산을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄의 53 및 54번 위치 및 경쇄의 31 및/또는 56번 위치에 양으로 하전된 아미노산을 포함한다. 이들 실시양태 중 어느 하나의 항원 결합 폴리펩타이드는 VH의 FR3의 90번 위치에 Y를 추가로 포함할 수 있고/있거나 VH의 30번 위치에 양으로 하전된 아미노산을 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 30번 위치에 있는 항원 결합 폴리펩타이드 중쇄의 양으로 하전된 아미노산은 R, K 또는 H이다. 바람직하게는, 30번 위치에 있는 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄에 있는 양으로 하전된 아미노산은 R 또는 K이다. 훨씬 더 바람직하게, 30번 위치에 있는 항원 결합 폴리펩타이드 중쇄의 양으로 하전된 아미노산은 R이다. 하나의 실시양태에서, 30번 위치에 있는 항원 결합 폴리펩타이드 중쇄의 양으로 하전된 아미노산은 R 또는 K이고 HFR3의 90번 위치의 경우는 Y이다.
본 발명의 첫 번째 양태의 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 중쇄의 31번 위치의 양으로 하전된 아미노산은 R, K 또는 H이다. 보다 바람직하게는, 31번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산은 R 또는 K이다. 훨씬 더 바람직하게, 31번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산은 R이다. 훨씬 더 바람직하게는, 31번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산은 R 또는 K이고 90번 위치의 경우는 Y이거나, 또는 31번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산은 R이고 HFR3의 90번 위치의 경우는 Y이다.
하나의 실시양태에서 53번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산은 R, K 또는 H이다. 바람직하게, 53번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산은 K, R 또는 H이고 중쇄의 90번 위치의 경우는 Y이다. 바람직하게 53번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산은 R 또는 K이다. 보다 바람직하게, 53번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산은 R이다. 53번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산이 R이고 HFR3의 90번 위치의 경우 Y인 것이 특히 바람직하다. 53번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산이 R 또는 K이고 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 30번 위치에 세린이 있는 것이 더욱 바람직하다. 53번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산이 R이고 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 30번 위치에 세린이 있는 것이 특히 바람직하다.
하나의 실시양태에서 54번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산은 R, K 또는 H이다. 바람직하게, 54번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산은 K이다. 54번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산이 K이고, 90번 위치에 Y가 있거나, 또는 54번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산이 R이고 HFR3의 90번 위치의 경우 Y인 것이 특히 바람직하다.
하나의 실시양태에서 31번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 경쇄의 양으로 하전된 아미노산은 R 또는 K이다. 바람직하게, 31번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산은 R이다. 31번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 경쇄의 양으로 하전된 아미노산이 R이고, HFR3의 90번 위치에 Y가 있거나, 또는 31번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 경쇄의 양으로 하전된 아미노산이 K이고 HFR3의 90번 위치의 경우 Y인 것이 특히 바람직하다.
하나의 실시양태에서 56번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 경쇄의 양으로 하전된 아미노산은 R 또는 K이다. 바람직하게, 56번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 경쇄의 양으로 하전된 아미노산은 R이다. 56번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 경쇄의 양으로 하전된 아미노산이 R이고, 90번 위치의 경우 Y이거나, 또는 56번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 경쇄의 양으로 하전된 아미노산이 K이고 HFR3의 90번 위치의 경우 Y인 것이 특히 바람직하다.
하기의 양으로 하전된 아미노산 조합이 중쇄에 바람직하다: R31 및 R53; R31 및 K53; R31 및 H53; R31 및 R54; R31 및 K54; K31 및 R53; K31 및 K53; K31 및 H53; K31 및 R54; K31 및 K54; H31 및 R53; H31 및 K51; H31 및 H51; H31 및 R54; H31 및 K54; R31, R53 및 R54; R31, R53 및 K54; R31, K53 및 R54; R31, K53 및 K54; R31, H53 및 R54; R31, H53 및 K54; K31, R53 및 R54; K31, R53 및 K54; K31, K53 및 R54; K31, K53 및 K54; K31, H53 및 R54; K31, H53 및 K54; H31, R53 및 R54; H31, R53 및 K54; H31, K53 및 R54; H31, K53 및 K54; H31, H53 및 R54; H31, H53 및 K54; R53 및 R54; R53 및 K54; K53 및 R54; K53 및 K54; H53 및 R54; 및 H53 및 K54. 이들 실시양태 중 어느 하나의 항원 결합 폴리펩타이드는 VH에서 FR3의 90번 위치에 Y, 및/또는 VH에서 30번 위치에 양으로 하전된 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 53번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산이 R인 것이 훨씬 더 바람직하다. 53번 위치의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 양으로 하전된 아미노산이 R이고, 항원 결합 폴리펩타이드가 VH에서 FR3의 90번 위치에 Y를 포함하는 것이 훨씬 더 바람직하다.
하기 양으로 하전된 아미노산 조합이 경쇄에 바람직하다: R31 및 R56; R31 및 K56; K31 및 R56; 및 K31 및 K56.
하기 양으로 하전된 아미노산 조합이 HFR3의 90번 위치의 치환과 함께 경쇄에 특히 바람직하다:
R31 및 R56; 및 90번 위치는 Y이다;
R31 및 K56; 및 90번 위치는 Y이다;
K31 및 R56; 및 90번 위치는 Y이다;
K31 및 K56 및 90번 위치는 Y이다.
중쇄 및 경쇄에서 하기 양으로 하전된 아미노산 조합이 특히 바람직하다: 중쇄 31R 및 경쇄 56R; 중쇄 54K 및 경쇄 56R; 중쇄 54K 및 경쇄 31R; 중쇄 53R 및 경쇄 56R; 중쇄 53R 및 경쇄 31R 및 56R; 및 중쇄 31R, 경쇄 31R 및 경쇄 56R.
중쇄 및 경쇄에서 하기 양으로 하전된 아미노산 조합이 특히 바람직하다: 중쇄의 90번 위치에 치환의 존재 또는 부재 하에: 중쇄 31R 및 경쇄 56R 및 중쇄 90번 위치는 Y이다; 중쇄 54K 및 경쇄 56R 및 중쇄 90번 위치 Y; 중쇄 54K 및 경쇄 31R 및 56R, 및 중쇄 90번 위치 Y; 중쇄 53R 및 경쇄 56R; 중쇄 53R 및 경쇄 56R 및 중쇄 90번 위치 Y.
본 발명의 맥락에서 항원 결합 폴리펩타이드에서 양으로 하전된 아미노산에 의한 치환(예를 들어 상기에 정의된 바와 같은 HCDR1 및/또는 HCDR2 및/또는 LCDR1 및/또는 LCDR2의 각 위치 및/또는 HFR1의 30번 위치에서)은 α/β TCR/CD3 복합체에 대한 증가된 결합을 제공하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 치환 중 어느 것도 포함하지 않는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 EC50의 저하가 제공된다. 결합 EC50의 저하는 결합 EC50의 "x배" 감소 또는 "AUC 결합의 증가%"로 기재된다.
본 발명의 맥락에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 α/β T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체에 특이적으로 결합하고; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 결합을 가지며, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30배의 결합 EC50의 감소를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 EC50이 적어도 2배 감소된다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이와 비교하여 결합 EC50의 적어도 2배 감소를 나타낸다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이와 비교하여 결합 EC50의 적어도 2배 감소를 나타낸다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 90번 위치에 Y 잔기를 포함하는 HFR3을 포함하고 모 항원 결합 폴리펩타이와 비교하여 결합 EC50의 적어도 2배 감소를 나타낸다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 90번 위치에 Y를 포함하는 HFR3을 포함하며; 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이와 비교하여 결합 EC50의 적어도 2배 감소를 나타낸다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 90번 위치에 Y를 포함하는 HFR3을 포함하며; 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이와 비교하여 결합 EC50의 적어도 2배 감소를 나타낸다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이와 비교하여 결합 EC50의 적어도 2배 감소를 나타낸다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 양으로 하전되지 않은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 90번 위치에 Y를 포함하는 HFR3을 포함하며; 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이와 비교하여 결합 EC50의 적어도 2배 감소를 나타낸다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄의 30번 위치에 양으로 하전된 아미노산을 포함하고 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 EC50의 2배 감소를 나타낸다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 30번 위치의 양으로 하전된 아미노산은 R, K 또는 H이고, 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드, 바람직하게는 모 항체와 비교하여 EC50의 적어도 2배 감소를 나타낸다. 훨씬 더 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 30번 위치의 양으로 하전된 아미노산은 R 또는 K이고, 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 EC50의 적어도 2배 감소를 나타낸다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에 하기의 돌연변이 중 하나를 포함하고: 위치 30R 위치 30K 위치 31R 위치 31K 위치 53R, 위치 54R; 위치 54K, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 EC50의 적어도 2배 감소를 나타낸다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에 하기의 돌연변이 중 하나를 포함하고: 위치 31R; 위치 31K; 위치 53R, 위치 54K, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 EC50의 적어도 4배 감소를 나타낸다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에 하기의 돌연변이 중 하나를 포함하고: 위치 31R; 위치 53R, 위치 54K, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 EC50의 적어도 5배 감소를 나타낸다. 보다 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 54K 위치에서 중쇄 중에 하나의 돌연변이를 포함하고, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 EC50의 적어도 8배 감소를 나타낸다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 56R 또는 56K 위치에서 경쇄에 돌연변이를 포함하고, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 EC50의 적어도 4배 감소를 나타낸다. 보다 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 56R 위치에서 경쇄 중에 돌연변이를 포함하고, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 EC50의 적어도 8배 감소를 나타낸다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에 90Y 위치에서 돌연변이를 포함하고, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 EC50의 적어도 3배 감소를 나타낸다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에 하기의 바람직한 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90Y; 및 위치 54R 및 위치 90Y, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 EC50의 적어도 4배 감소를 나타낸다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에 하기의 바람직한 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90Y, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 EC50의 적어도 5배 감소를 나타낸다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에 하기의 바람직한 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90Y, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 EC50의 적어도 7배 감소를 나타낸다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에 위치 31R 및 위치 90Y에서 돌연변이를 포함하고; 모 항원 결합 폴리펩타이드, 바람직하게는 모 항체와 비교하여 결합 EC50의 적어도 8배 감소를 나타낸다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 경쇄에 위치 56R에서 돌연변이를 포함하고, 위치 90Y에 돌연변이를 추가로 포함하고, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 EC50의 적어도 13배 감소를 나타낸다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 및 중쇄에서 위치 53R 및 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 EC50의 적어도 15배 감소를 나타낸다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 및 중쇄에서 위치 54K 및 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 EC50의 적어도 20배 감소를 나타낸다. 훨씬 더 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 EC50의 적어도 30배 감소를 나타낸다.
발명자들은 놀랍게도 첨부된 실시예에서 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 결합 AUC가 모 항원 결합 폴리펩타이드의 결합 AUC, 바람직하게는 모 항체의 결합 AUC와 비교하여 증가된다는 것을 입증하였으며, 이는 결합 AUC 증가%로 기재된다. 따라서, 본원에서 제공되는 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 결합 AUC를 가지며, 바람직하게 항원 결합 폴리펩타이드는 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가; 결합 AUC의 적어도 약 15% 증가; 결합 AUC의 적어도 약 50% 증가; 결합 AUC의 적어도 약 140% 증가; 결합 AUC의 적어도 약 200% 증가; 결합 AUC의 적어도 약 250% 증가; 결합 AUC의 적어도 약 400% 증가; 결합 AUC의 적어도 약 500% 증가; 결합 AUC의 적어도 약 600% 증가; 결합 AUC의 적어도 약 700% 증가; 또는 결합 AUC의 적어도 약 800% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가, 즉 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 세포에 대해 증가된 결합을 갖는다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 15% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 HFR3의 90번 위치에 Y를 포함하고 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, HFR3의 90번 위치에 Y를 포함하며, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, HFR3의 90번 위치에 Y를 포함하며, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하고, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; HFR3의 90번 위치에 Y를 포함하고, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에 하기의 치환 중 하나를 포함하고: 위치 30R, 위치 30K; 위치 31R 위치 31K; 위치 53R, 위치 54R; 위치 54K, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 15% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에 하기의 돌연변이 중 하나를 포함하고: 위치 30R, 위치 30K; 위치 31R 위치 31K; 위치 53R, 위치 54R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 50% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄에서 HFR1의 30번 위치에 양으로 하전된 아미노산을 추가로 포함하고, AUC의 적어도 80% 증가를 나타낸다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드의 HFR1의 30번 위치의 양으로 하전된 아미노산은 R, K 또는 H이고, 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 AUC의 적어도 80% 증가를 나타낸다. 훨씬 더 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드의 HFR1의 30번 위치의 양으로 하전된 아미노산은 R 또는 K이고, 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 AUC의 적어도 80% 증가를 나타낸다.
하나의 실시양태에서 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게 중쇄에서 하기의 돌연변이 중 하나를 포함하고: 위치 30R, 위치 30K; 위치 31R 위치 31K; 위치 53R, 위치 54K, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 100% 증가를 갖는다. 항원 결합 폴리펩타이드가 중쇄에서 위치 31R에 치환을 갖고 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 140% 증가를 갖는 것이 특히 바람직하다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게 경쇄에서 위치 56R에 돌연변이를 포함하고, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 15%의 증가; 결합 AUC의 적어도 약 20%의 증가; 적어도 약 50%의 증가; 적어도 약 100%의 증가; 또는 결합 AUC의 적어도 약 200%의 증가를 갖는다. 보다 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게 경쇄에서 위치 56R에 돌연변이를 포함하고, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 200% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게 중쇄에서 위치 90Y에 돌연변이를 포함하고, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10%의 증가를 갖는다. 보다 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게 중쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90Y; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 200% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게 중쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90Y; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 250% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게 중쇄에서 위치 54K 및 위치 90Y에 아미노산 조합을 포함하고; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 300% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게 경쇄에서 위치 56R에 돌연변이를 포함하고, 중쇄에서 위치 90Y에 돌연변이를 추가로 포함하고, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가; 결합 AUC의 적어도 약 50% 증가, 결합 AUC의 약 100% 증가; 또는 결합 AUC의 약 200% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 및 중쇄에서 위치 54K 및 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 200% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R 또는 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 250% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R 또는 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 300% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R 또는 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 400% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 500% 증가; 결합 AUC의 적어도 약 600% 증가; 결합 AUC의 적어도 약 700% 증가; 또는 결합 AUC의 적어도 약 800% 증가를 갖는다. 항원 결합 폴리펩타이드가 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 500% 증가를 갖는 것이 특히 바람직하다.
발명자는 놀랍게도 첨부된 실시예에서 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 Tm이 델타 Tm(℃) 또는 절대 온도 값(℃)으로 기재된 모 항원 결합 폴리펩타이드의 Tm과 비교하여 증가한다는 것을 입증하였다. 따라서, 본원에 제공된 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드에 비해 증가된 Tm을 갖는다. 바람직하게 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 1℃의 델타 Tm; 적어도 2℃의 델타 Tm, 적어도 3℃의 델타 Tm, 적어도 3.5℃의 델타 Tm 또는 적어도 4℃의 델타 Tm을 갖는다.
본원에서 제공되는 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여, 바람직하게는 모 항체와 비교하여 증가된 Tm을 가지며, 적어도 72.5℃의 Tm을 갖거나, 적어도 72.8℃의 Tm을 갖거나, 적어도 73.8℃의 Tm을 갖거나, 적어도 74.8℃의 Tm을 갖거나, 또는 적어도 75.3℃의 Tm을 갖는다. 보다 바람직하게 항원 결합 폴리펩타이드는 적어도 73.0℃의 Tm, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 73.5℃을 갖거나, 적어도 74℃의 Tm을 갖거나, 적어도 75℃의 Tm을 갖거나, 또는 적어도 76℃의 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항체 BMA031(V36)과 관련하여 본원에 기재된 바와 같은 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 같은 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 1℃의 델타 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 항원 결합 폴리펩타이드는 본 발명의 치환을 포함하지 않는 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 1℃의 델타 Tm 또는 적어도 72.8℃의 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 1℃의 델타 Tm을 갖거나 적어도 72.8℃의 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 1℃의 델타 Tm을 갖거나 적어도 72.8℃의 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 90번 위치에 Y 잔기를 포함하는 HFR3을 포함하고, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 2℃, 바람직하게는 적어도 2.5℃, 더욱 바람직하게는 적어도 3℃의 델타 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 90번 위치에 Y를 포함하는 HFR3을 포함하며, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 1℃의 델타 Tm을 갖거나 적어도 72.8℃의 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 90번 위치에 Y를 포함하는 HFR3을 포함하며, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 1℃의 델타 Tm을 갖거나 적어도 72.8℃의 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 1℃의 델타 Tm을 갖거나 적어도 72.8℃의 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 90번 위치에 Y를 포함하는 HFR3을 포함하며, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 1℃의 델타 Tm을 갖거나 적어도 72.8℃의 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 위치 90Y에 돌연변이를 포함하고 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 1.0℃의 델타 Tm을 갖는다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 하기 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90Y; 및 위치 54R 및 위치 90Y, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 1.0℃의 델타 Tm을 갖는다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄에서 하기 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90Y; 및 위치 54R 및 위치 90Y, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 2.0℃의 델타 Tm을 갖는다. 훨씬 더 바람직하게는, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 하기 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90Y; 및 위치 54R 및 위치 90Y, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.0℃의 델타 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 다음 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 및 위치 53R 및 위치 90Y; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.5℃의 델타 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 위치 53R 및 위치 90Y에 돌연변이를 포함하고; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 4.0℃의 델타 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 경쇄에서 위치 56R에 돌연변이를 포함하고, 위치 90Y에 돌연변이를 추가로 포함하며, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.0℃의 델타 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 및 중쇄에서 위치 54K 및 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 2.0℃의 델타 Tm을 갖는다.
바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 및 중쇄에서 위치 53R 및 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.5℃의 델타 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 위치 90Y에 돌연변이를 포함하고, 적어도 73.0℃의 Tm을 갖거나, 적어도 74℃의 Tm을 갖거나, 적어도 75℃의 Tm을 갖거나, 또는 적어도 76℃의 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 하기의 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90Y; 및 위치 54R 및 위치 90Y, 적어도 73.46℃의 Tm을 갖는다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 하기의 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90Y; 및 위치 54R 및 위치 90Y, 적어도 74.46℃의 Tm을 갖는다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 하기의 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90Y; 및 위치 54R 및 위치 90Y, 적어도 75.46℃의 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄에서 하기의 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90Y; 및 위치 54R 및 위치 90Y, 적어도 75.5℃의 Tm을 갖는다. 훨씬 더 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄에서 하기의 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90Y; 및 위치 54R 및 위치 90Y, 적어도 75.9℃의 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 하기의 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 및 위치 53R 및 위치 90Y; 적어도 76.0℃의 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 위치 53R 및 위치 90Y에 돌연변이를 포함하고; 적어도 76.5℃의 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 경쇄에서 위치 56R에 돌연변이를 포함하고, 중쇄에서 위치 90Y에 돌연변이를 추가로 포함하고, 적어도 72.0℃의 Tm, 적어도 73.0℃의 Tm, 적어도 74.0℃의 Tm, 적어도 75.0℃의 Tm; 또는 적어도 76.0℃의 Tm을 갖는다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 적어도 75.0℃의 Tm을 갖는다. 훨씬 더 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 적어도 75.5℃의 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 위치 31R, 위치 90Y 및 위치 56R; 위치 53R, 위치 90Y 및 위치 56R; 및 위치 54K, 및 위치 90Y 및 위치 56R, 적어도 74.0℃의 Tm을 갖는다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 위치 31R, 위치 90Y 및 위치 56R; 위치 53R, 위치 90Y 및 위치 56R; 위치 54K, 및 위치 90Y 및 위치 56R, 적어도 75.0℃의 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R 및 위치 90Y, 및 경쇄에서 위치 56R, 적어도 76.0℃의 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 결합 AUC의 10% 증가를 가지며, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 1℃의 델타 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 항원 결합 폴리펩타이드는 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가를 가지며, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 1℃의 델타 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가를 가지며, 적어도 1℃의 델타 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가를 가지며, 적어도 1℃의 델타 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 HFR3의 90번 위치에 Y를 포함하고, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, HFR3의 90번 위치에 Y를 포함하며, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가를 가지며, 적어도 1℃의 델타 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, HFR3의 90번 위치에 Y를 포함하며, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가를 갖고, 적어도 1℃의 델타 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가를 가지며, 적어도 1℃의 델타 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하며, 여기서 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, HFR3의 90번 위치에 Y를 포함하며, 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가를 가지며, 적어도 1℃의 델타 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 위치 90Y에 돌연변이를 포함하고 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 결합 AUC의 적어도 약 10% 증가를 가지며, 적어도 1.0℃의 델타 Tm을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 하기 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90Y; 및 위치 54R 및 위치 90Y, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 1.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 200% 증가를 갖는다.
바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄에서 하기 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90서; 및 위치 54R 및 위치 90Y, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 2.0℃의 델타 Tm을 가지며, 결합 AUC의 적어도 약 200% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 하기 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90Y, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 240% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 위치 54K 및 위치 90Y에 돌연변이를 포함하고; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 300% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 하기 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 및 위치 53R 및 위치 90Y; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.5℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 200% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 하기 아미노산 조합 중 하나를 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 및 위치 53R 및 위치 90Y; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.5℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 250% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 위치 53R 및 위치 90Y에서 돌연변이를 포함하고; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 4.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 200% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 중쇄에서 위치 53R 및 위치 90Y에서 돌연변이를 포함하고; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 4.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 250% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 경쇄에서 위치 56R에서 돌연변이를 포함하고 위치 90Y에서 돌연변이를 추가로 포함하며, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 150% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 바람직하게는 경쇄에서 위치 56R에서 돌연변이를 포함하고 위치 90Y에서 돌연변이를 추가로 포함하며, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 200% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R 및 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 및 경쇄에서 위치 54K 및 위치 90Y 및 중쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 2.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 200% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R 및 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 및 중쇄에서 위치 54K 및 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 2.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 300% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 및 중쇄에서 위치 54K 및 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 2.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 400% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 및 경쇄에서 위치 54K 및 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 2.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 500% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 및 중쇄에서 위치 54K 및 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 2.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 600% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 및 중쇄에서 위치 54K 및 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 2.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 700% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 및 중쇄에서 위치 54K 및 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 2.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 800% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 200% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 300% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 400% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 500% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 600% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 700% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.0℃의 델타 Tm을 갖고, 결합 AUC의 적어도 약 800% 증가를 갖는다.
놀랍게도 양으로 하전되지 않은 아미노산을 운반하는 위치의, 양으로 하전된 아미노산에 의한 특정 치환이 향상된 결합(예를 들어, 결합 AUC(도 5, 상단 패널))을 제공한다는 것이 입증될 수 있었다. 놀랍게도 위치 90Y는 Tm의 상당한 증가로 이어지는 것으로 나타났다(도 5, 하단 패널). 90번 위치의 아미노산 Y를, 90번 위치에서 Y에 의한 치환이 모든 시험된 분자에 대해 Tm의 증가로 이어지므로 개선된 Tm을 위한 구성 블록으로 볼 수 있다(도 5, 하단 패널 참조). 더욱이, 발명자는 놀랍게도 90번 위치에 Y를 갖는 분자가, 하나 이상의 위치의 양으로 하전된 아미노산에 의한 치환과 함께, Tm의 증가에 더하여 결합(예를 들어, 결합 AUC)의 상당한 증가/개선을 유도한다는 것, 즉 이들 치환이 상승작용 효과로 이어진다는 것을 발견하였다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄에 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y에서; 위치 54R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90Y, 바람직하게 상기 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3℃의 델타 Tm을 가지며 결합 AUC의 적어도 약 200% 증가를 갖는다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄에 하기의 아미노산 조합을 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 바람직하게 상기 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3℃의 델타 Tm을 가지며 결합 AUC의 적어도 약 270% 증가를 갖는다. 훨씬 더 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄에 하기의 아미노산 조합을 포함하고: 위치 54K 및 위치 90Y, 상기 항원 결합 폴리펩타이드는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3℃의 델타 Tm을 갖고 결합 AUC의 적어도 약 240% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: VH에서 위치 31R, 위치 90Y 및 VL에서 위치 56R; VH에서 위치 53R, 위치 90Y 및 VL에서 위치 56R; 및 VH에서 위치 54K, 위치 90Y 및 VL에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 2.50℃의 델타 Tm을 가지며 결합 AUC의 적어도 약 245% 증가를 갖는다. 더욱 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: VH에서 위치 31R, 위치 90Y 및 VL에서 위치 56R; VH에서 위치 53R, 위치 90Y 및 VL에서 위치 56R; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.50℃의 델타 Tm을 가지며 결합 AUC의 적어도 약 400% 증가를 갖는다. 항원 결합 폴리펩타이드가 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하는 것이 특히 바람직하다: VH에서 위치 53R, 90Y 및 VL에서 위치 56R; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 3.50℃의 델타 Tm을 가지며 결합 AUC의 적어도 약 800% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 위치 54R 및 위치 90Y; 및 위치 54K 및 위치 90Y, 바람직하게는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 75℃의 Tm을 갖고 결합 AUC의 적어도 약 200% 증가를 갖는다. 바람직하게는, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄에서 하기의 아미노산 조합을 포함하고: 위치 31R 및 위치 90Y; 위치 53R 및 위치 90Y; 바람직하게는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 76℃의 Tm을 갖고 결합 AUC의 적어도 약 270% 증가를 갖는다. 훨씬 더 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄에서 하기의 아미노산 조합을 포함하고: 위치 54K 및 위치 90Y, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 75℃의 Tm을 갖고 결합 AUC의 적어도 약 240% 증가를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함한다: 중쇄에서 VH 중의 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 및 중쇄에서 위치 54K, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R, 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 75℃의 Tm을 갖고 결합 AUC의 적어도 약 245% 증가를 갖는다. 더욱 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 및 경쇄에 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 31R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 경쇄에서 위치 56R; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 76℃의 Tm을 가지며 결합 AUC의 적어도 약 400% 증가를 갖는다. 항원 결합 폴리펩타이드가 중쇄 및 경쇄에서 하기의 바람직한 아미노산 조합을 포함하고: 중쇄에서 위치 53R, 위치 90Y 및 중쇄에서 위치 56R; 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 76℃의 Tm을 가지며 결합 AUC에서 적어도 약 800% 증가를 갖는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 첫 번째 양태의 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 항체 또는 이의 단편이다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 이중특이성 항체 또는 이의 단편이다. 더욱 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 TCR 또는 이의 단편을 추가로 포함하는 이중특이성 항체이다.
본 발명의 첫 번째 양태의 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 이전에 기재된 바와 같은 제1 결합 부위를 형성하는 VH 및 VL을 포함하고, 제2 결합 부위를 추가로 포함한다. 바람직하게, 상기 제2 결합 부위는 세포 표면 단백질에 특이적으로 결합한다. 바람직한 세포 표면 단백질은 당단백질, MHC 부류 I 단백질, MHC 부류 II 단백질; β-마이크로글로불린, IgA, IgD, IgE , IgG, IgM, TCR과 같은 면역글로불린, CD4 또는 CD8과 같은 보조 수용체 분자로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 세포 표면 단백질은 암세포의 표면 단백질이다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드의 제2 결합 부위는 MHC-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합한다. 더욱 바람직하게 MHC 분자는 펩타이드와 복합체를 이루는 MHC I 분자이고, 바람직하게는 MHC I 분자는 펩타이드와 복합체를 이루는 인간 백혈구 항원(HLA) 분자이다. 훨씬 더 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드의 제2 결합 부위는 암세포의 HLA 펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하며, 바람직하게 HLA는 HLA-A*02이다.
하나의 실시양태에서 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드의 제2 항원 결합 부위는 예를 들어 항체, TCR, 스캐폴드 단백질, 또는 항체 모방체, 예를 들어 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin), 노틴(knottin), 안티칼린(anticalin), 피노머(fynomer) 또는 애피바디(affibody)이거나, 이에 포함되거나, 또는 이에 의해 형성된다. 바람직하게, 제2 항원 결합 부위는 TCR 또는 이의 단편에 포함된다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 제2 항원 결합 부위는 적어도 TCR의 α(Vα) 및/또는 β(Vβ) 쇄의 가변 영역; 또는 TCR의 γ(Vγ) 및/또는 δ(Vδ) 쇄 또는 추가 항체의 VL 및/또는 VH를 포함한다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드의 제2 결합 부위는 적어도 TCR 의 Vα 및/또는 Vβ 또는 Vγ 및/또는 Vδ를 포함한다. 제2 항원 결합 부위의 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ는 2개의 별도의 폴리펩타이드 쇄 상에 있을 수 있다. 제2 항원 결합 부위의 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ는 동일한 폴리펩타이드 쇄 상에 있을 수 있다. 바람직하게, 제2 항원 결합 부위의 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ는 2개의 별도의 폴리펩타이드 쇄 상에 있다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 불변 도메인을 추가로 포함한다.
본 발명의 맥락에서, Vα 및 Vβ 또는 (Vγ 및 Vδ)는 바람직하게는 종양 관련 항원(TAA)/MHC 복합체에 결합한다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드에 포함될 수 있는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ는 예를 들어 하기에 상세히 기재되어 있으며, 이들의 내용은 각각 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다: WO2018172533, WO2018033291, WO2017158103, WO2018104438, WO2018104478, WO2019002444, WO2017158116, 미국특허 제 10800845 호, 미국특허 제 10537624 호, 미국특허 제 10538573 호, 미국특허 제 10537624 호, 미국특허 제 10590194 호, 미국특허 제 10800832 호, 및 미국특허 제 10527623 호.
상응하게, 하나의 실시양태에서, Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ는 WO2018172533, WO2018033291, WO2017158103, WO2018104438, WO2018104478, WO2019002444, WO2017158116 미국특허 제 10800845 호, 미국특허 제 10537624 호, 미국특허 제 10538573 호, 미국특허 제 10537624 호, 미국특허 제 10590194 호, 미국특허 제 10800832 호, 및 미국특허 제 10527623 호에 개시된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 인용된 선행 기술에 기재된 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ는 TAA 펩타이드에 결합하며, 이는 인용된 것과 동일한 특허 출원에 개시되어 있다. 이들의 내용은 각각 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다.
하나의 양태에서, 본원에 기재된 방법 및 실시양태와 함께 사용될 수 있는 종양 관련 항원(TAA) 펩타이드는 예를 들어 하기에 기재된 TAA 펩타이드를 포함한다: 미국 특허공보 20160187351, 미국 특허공보 20170165335, 미국 특허공보 20170035807, 미국 특허공보 20160280759, 미국 특허공보 20160287687, 미국 특허공보 20160346371, 미국 특허공보 20160368965, 미국 특허공보 20170022251, 미국 특허공보 20170002055, 미국 특허공보 20170029486, 미국 특허공보 20170037089, 미국 특허공보 20170136108, 미국 특허공보 20170101473, 미국 특허공보 20170096461, 미국 특허공보 20170165337, 미국 특허공보 20170189505, 미국 특허공보 20170173132, 미국 특허공보 20170296640, 미국 특허공보 20170253633, 미국 특허공보 20170260249, 미국 특허공보 20180051080, 미국 특허공보 20180164315, 미국 특허공보 20180291082, 미국 특허공보 20180291083, 미국 특허공보 20190255110, 미국특허 9,717,774, 미국특허 9,895,415, 미국 특허공보 20190247433, 미국 특허공보 20190292520, 미국 특허공보 20200085930, 미국특허 10,336,809, 미국특허 10,131,703, 미국특허 10,081,664, 미국특허 10,081,664, 미국특허 10,093,715, 10,583,573, 및 US20200085930, 이들 특허공보, 서열, 및 이들 중에 기재된 서열 목록 각각의 내용은 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 맥락에서, 추가 항체의 VL 및/또는 VH는 바람직하게는 종양 표면에 존재하는 단백질에 결합한다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 VH 및 VL은 항체의 것이다. 하나의 실시양태에서, 제1 항원 결합 부위는 2개의 별도의 폴리펩타이드 쇄상의 VH 및 VL을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 제1 항원 결합 부위는 동일한 폴리펩타이드 쇄상의 VH 및 VL을 포함한다. 바람직하게, 제1 항원 결합 부위에 포함된 VH 및 VL은 항원 결합 폴리펩타이드가 단쇄 폴리펩타이드가 아닌 한 2개의 별도의 폴리펩타이드 쇄상에 존재한다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 52(HCDR1)에 있다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 52(HCDR1) 및 서열번호 53(HCDR1 및 HCDR2)에 있다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 52 및 서열번호 3(HCDR1 및 LCDR1)에 있다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 52 및 서열번호 55(HCDR1 및 LCDR2)에 있다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 52 및 서열번호 3 및 서열번호 55(HCDR1, LCDR1 및 LCDR2)에 있다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 52 및 서열번호 53 및 서열번호 54(HCDR1, HCDR2 및 LCDR1)에 있다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 52 및 서열번호 53 및 서열번호 55(HCDR1, HCDR2 및 LCDR2)에 있다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 52 및 서열번호 53 및 서열번호 54 및 서열번호 55(HCDR1, HCDR2, LCDR1 및 LCDR2)에 있다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 53 및 서열번호 54(HCDR2 및 LCDR1)에 있다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 53 및 서열번호 55(HCDR2 및 LCDR2)에 있다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 53 및 서열번호 54 및 서열번호 55(HCDR2 및 LCDR1 및 LCDR2)에 있다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 54에 있다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 54 및 서열번호 53(LCDR1 및 HCDR2)에 있다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 54 및 서열번호 55(LCDR1 및 LCDR2)에 있다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 55(LCDR2)에 있다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 55(LCDR2), 서열번호 53(HCDR2) 또는 서열번호 52(HCDR1)에 있다. 보다 바람직하게, 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 52(HCDR1) 및 서열번호 55(LCDR2)에 있다. 항원 결합 폴리펩타이드의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산이 서열번호 53(HCDR2) 및 서열번호 55(LCDR2)에 있는 것이 특히 바람직하다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 항원 결합 폴리펩타이드의 HFR1의 30번 위치에 세린(S) 또는 아스파라긴(N)을 포함한다. 항원 결합 폴리펩타이드 중쇄의 53번 위치에 있는 양으로 하전된 아미노산이 R 또는 K이고, 세린이 항원 결합 폴리펩타이드의 HFR1의 30번 위치에 있는 것이 추가로 바람직하다. 또한, 항원 결합 폴리펩타이드 중쇄의 53번 위치에 있는 양으로 하전된 아미노산이 R이고 세린이 항원 결합 폴리펩타이드의 HFR1의 30번 위치에 있는 것이 또한 바람직하다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 항원 결합 폴리펩타이드의 HFR1의 30번 위치에 세린(S) 또는 아스파라긴(N)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 HFR1의 30번 위치에 있는 트레오닌(T)은 아스파라긴(N) 또는 세린(S)으로 치환된다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 HFR1의 31번 위치에 있는 S는 아스파라긴(N)으로 치환된다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 56번 위치의 발린(V)은 이소류신(I)으로 치환된다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 100a번 위치에 있는 글루탐산(E)은 아스파르트산(D)으로 치환된다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 30번 위치에 있는 트레오닌(T)은 아스파라긴(N) 또는 세린(S)으로 치환된다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 31번 위치의 S는 아스파라긴(N)으로 치환된다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 56번 위치의 발린(V)은 이소류신(I)으로 치환된다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 100a번 위치의 글루탐산(E)은 아스파르트산(D)으로 치환된다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 경쇄의 31번 위치의 S는 N으로 치환된다. 하나의 실시양태에서, 경쇄의 93번 위치의 S는 N으로 치환된다. 하나의 실시양태에서, 경쇄의 31번 및 93번 위치의 S는 모두 N으로 치환된다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 30번 위치의 T는 N 또는 S로 치환되고, 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 31번 위치의 S는 N으로 치환되고, 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 56번 위치의 V는 I로 치환되고, 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 100a번 위치의 E는 D로 치환되고, 항원 결합 폴리펩타이드의 경쇄의 31번 위치의 S는 N으로 치환된다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 30번 위치의 T는 N 또는 S로 치환되고, 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 31번 위치의 S는 N으로 치환되고, 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 56번 위치의 V는 I로 치환되고, 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 100a번 위치의 E는 D로치환되고, 항원 결합 폴리펩타이드의 경쇄의 93번 위치의 S는 N으로 치환된다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 30번 위치의 T는 N 또는 S로 치환되고, 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 31번 위치의 S는 N으로 치환되고, 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 56번 위치의 V는 I로 치환되고, 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄의 100a번 위치의 E는 D로 치환되고, 항원 결합 폴리펩타이드의 경쇄의 31번 및 93번 위치의 S는 N으로 치환된다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 CDR3(HCDR3)에 추가의 변형을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 변형은 E 또는 D와 같은 음으로 하전된 아미노산에 의한 치환이다. 바람직하게는 HCDR3의 100번 위치의 아미노산이 치환된다. 100a번 위치가 E 또는 D로 치환되는 것이 특히 바람직하다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 경쇄 CDR3(LCDR3)에 추가 변형을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 변형은 R, H, K, D, E, N, Q, S, T, Y로 이루어지는 군으로부터 선택된 극성 아미노산에 의한 치환이다. 바람직하게는, LCDR3의 93번 위치의 아미노산이 치환된다. 93번 위치가 N 또는 S인 것이 특히 바람직하다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 HCDR3 및 LCDR3에 추가의 변형을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 HCDR3에서 음으로 하전된 아미노산에 의한 치환 및 LCDR3에서 극성 아미노산에 의한 치환을 포함한다. 바람직하게는, HCDR3의 100a번 위치가 음으로 하전된 아미노산으로 치환되고, LCDR3의 93번 위치가 극성 아미노산으로 치환된다. 훨씬 더 바람직하게는, HCDR3의 100a번 위치가 E로 치환되고, LCDR3의 93번 위치가 극성 아미노산 S로 치환되며; HCDR3의 100a번 위치가 E로 치환되고, LCDR3의 93번 위치가 극성 아미노산 N으로 치환되며; HCDR3의 100a번 위치가 D로 치환되고, LCDR3의 93번 위치가 극성 아미노산 S로 치환되며; HCDR3의 100a번 위치가 D로 치환되고, LCDR3의 93번 위치가 극성 아미노산 N으로 치환된다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 HCDR3은 서열 GSYYDYX1GFVY(서열번호 56)를 가지며, 여기서 X1은 D 또는 E이다. 바람직하게, X1은 E(GSYYDYEGFVY 서열번호 64)이다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSX1X2X3LT(서열번호 57)를 가지며, 여기서 X1은 S 또는 N이고, X2는 Q, D, H, S, Y, A 및 N으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산이고; X3은 P 또는 A이다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSSX2X3LT(서열번호 65)을 갖는다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSX1NX3LT(서열번호66)를 가지며, 여기서 X2는 N이다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSX1X2PLT(서열번호 67)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSSQPLT(서열번호 68)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSSDPLT(서열번호 69)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSSHPLT(서열번호 70)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSSSPLT(서열번호 71)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSSYPLT(서열번호 72)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSSAPLT(서열번호 73)를 갖는다. 특히 바람직한 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSSNPLT(서열번호 74)를 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSSQALT(서열번호 75)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSSDALT(서열번호 76)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSSHALT(서열번호 77)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSSSALT(서열번호 78)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSSYALT(서열번호 79)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSSAALT(서열번호 80)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSSNALT(서열번호 81)를 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSNQPLT(서열번호 82)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWNSDPLT(서열번호 83)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWNSHPLT(서열번호 84)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWNSSPLT(서열번호 85)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWNSYPLT(서열번호 86)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWNSAPLT(서열번호 87)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWNSNPLT(서열번호 88)를 갖는다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSNQALT(서열번호 89)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWNSDALT(서열번호 90)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWNSHALT(서열번호 91)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWNSSALT(서열번호 92)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWNSYALT(서열번호 93)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWNSAALT(서열번호 94)를 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWNSNALT(서열번호 95)를 갖는다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드의 LCDR3은 서열 QQWSX1NPLT(서열번호 96)를 가지며, 여기서 X1은 S 또는 N이다. 훨씬 더 바람직하게, X1은 S이다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1(BMA031 V36_VH), 서열번호 97(GL1_BM_VH28_HV), 서열번호 98(GL1_BM_VH31_HV), 서열번호 99(HEBE1_H10_HV), 서열번호 100(HEBE1_H66_HV), 및 서열번호 101(HEBE1_H71_HV)에 제시된 VH에 포함된 바와 같은 HFR1, HFR2 및 HFR3을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 바람직하게, HFR1, HFR2 및 HFR3은 서열번호 1(BMA031 V36_VH)에 제시된 VH에 포함된다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 바람직한 실시양태에서, HFR1의 30번 위치 및/또는 HFR3의 90번 위치가 치환되며, 이 치환은, 프레임워크 영역의 나머지 아미노산이 상기에 제시된 바와 같은 HFR1, HFR2 및 HFR2를 포함하거나 또는 이들로 이루어지더라도 유지된다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 2(BMA031 V36_VL) 또는 서열번호 102(GL1BMVK43_VL)에 제시된 VL에 포함된 바와 같은 LFR1, LFR2 및 LFR3을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 바람직하게 LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4는 서열번호 2(BMA031 V36_VL)에 제시된 VL에 포함된다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1(BMA031 V36_VH), 서열번호 97(GL1_BM_VH28_HV), 서열번호 98(GL1_BM_VH31_HV), 서열번호 99(HEBE1_H10_HV), 서열번호 100(HEBE1_H66_HV), 및 서열번호 101(HEBE1_H71_HV)에 제시된 VH에 포함된 바와 같은 HFR1, HFR2 및 HFR3을 포함하거나 또는 이들로 이루어지고, 서열번호 2(BMA031 V36_VL)에 제시된 VL에 포함된 바와 같은 LFR1, LFR2 및 LFR3을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1(BMA031 V36_VH), 서열번호 97(GL1_BM_VH28_HV), 서열번호 98(GL1_BM_VH31_HV), 서열번호 99(HEBE1_H10_HV), 서열번호 100(HEBE1_H66_HV), 및 서열번호 101(HEBE1_H71_HV)에 제시된 VH에 포함된 바와 같은 HFR1, HFR2 및 HFR3을 포함하거나 또는 이들로 이루어지고, 서열번호 102(GL1BMVK43_VL)에 제시된 VL에 포함된 바와 같은 LFR1, LFR2 및 LFR3을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1(BMA031 V36_VH)에 제시된 VH에 포함된 바와 같은 HFR1, HFR2 및 HFR3을 포함하고, 서열번호 2(BMA031 V36_VL)에 제시된 VL에 포함된 바와 같은 LFR1, LFR2 및 LFR3을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 바람직한 실시양태에서, HFR1의 30번 위치 및/또는 90번 위치가 치환되며, 이 치환은, 프레임워크 영역의 나머지 아미노산이 상기에 제시된 바와 같은 HFR1, HFR2 및 HFR2를 포함하거나 또는 이들로 이루어지더라도 유지된다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1(BMA031 V36_VH)에 제시된 VH에 포함된 바와 같은 HFR4; 또는 서열번호 2(BMA031 V36_VL)에 제시된 VL에 포함된 바와 같은 LFR4를 추가로 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 바람직한 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1(BMA031 V36_VH)에 제시된 VH에 포함된 바와 같은 HFR1, HFR2, HFR3 및 HFR4를 포함하거나 또는 이들로 이루어지고, 서열번호 2(BMA031 V36_VL)에 제시된 VL에 포함된 바와 같은 LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 바람직한 실시양태에서, HFR1의 30번 위치 및/또는 90번 위치가 치환되며, 이 치환은, 프레임워크 영역의 나머지 아미노산이 상기에 제시된 바와 같은 HFR1, HFR2 및 HFR2를 포함하거나 또는 이들로 이루어지더라도 유지된다.
하기에 보다 상세히 기재된 바와 같은 추가의 실시양태에서 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 본원에서 상기에 정의된 바와 같은 중쇄 프레임워크 영역(HFR) 및/또는 경쇄 프레임워크 영역(LFR) 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 상기에 정의된 바와 같이 특정한 정도의 서열 일치성을 갖는 HFR 또는 LFR을 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드는 또한 유사하거나 또는 보다 높은 기능적 특성, 예를 들어 증가되거나 개선된 결합 EC50 또는 Tm을 발휘할 수 있다. 특히, HFR 또는 LFR의 기능적 변이체를 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드는 본원에 상기에 정의된 바와 같이 적어도 2배의 개선되거나 증가된 결합 EC50을 갖고/갖거나 적어도 1℃의 개선되거나 증가된 Tm 또는 적어도 1℃의 델타 Tm을 갖는다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 103에 제시된 바와 같은 HFR1 또는 서열번호 103에 제시된 바와 같은 HFR1과 적어도 약 60% 서열 일치성을 갖는 인간 HFR1 서열, 서열번호 104에 제시된 바와 같은 HFR2 또는 서열번호 104와 적어도 약 75% 서열 일치성을 갖는 인간 HFR2 서열, 서열번호 105에 제시된 바와 같은 HFR3 또는 서열번호 105와 적어도 약 55% 서열 일치성을 갖는 인간 HFR3 서열 및 서열번호 106에 제시된 바와 같은 HFR4 또는 서열번호 106과 적어도 90% 서열 일치성을 갖는 인간 HFR4 서열을 포함한다. 이들 각각의 경우에 상기에 개략된 HFR에서 바람직한 아미노산 치환이 특히 30번 및/또는 90번 위치에서 유지된다. 예를 들어 서열번호 1(BMA031 V36_VH)의 HFR1은 서열번호 100(HEBE1_H66_HV)의 HFR1에 63.33%의 서열 일치성을 갖거나, 또는 서열번호 1(BMA031 V36_VH)의 HFR2는 서열번호 99(HEBE1_H10_HV)의 HFR2에 78.6%의 서열 일치성을 갖는다. 따라서, 본원에서 상기 및 하기에 제공된 바와 같은 프레임워크 영역은 본원에 제공된 항원 결합 펩타이드에 포함되는 것으로 구상된다.
바람직한 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 103 내지 서열번호 106에 따르는 HFR1, HFR2, HFR3, 및 HFR4 또는 각각의 경우에 각각 서열번호 103 내지 서열번호 106과 적어도 90% 서열을 갖는 인간 HFR1, HFR2, HFR3, 및 HFR4 서열을 포함한다. 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄에 90Y를 포함하며, 본원에서 상기 및 하기에 제공된 항원 결합 폴리펩타이드의 프레임워크 영역은 정의된 서열 일치성의 HFR을 포함하고 중쇄에 90Y를 추가로 포함한다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 107에 제시된 바와 같은 LFR1 또는 서열번호 107과 적어도 약 50% 서열 일치성을 갖는 인간 LFR1 서열, 서열번호 108에 제시된 바와 같은 LFR2 또는 서열번호 108과 적어도 약 80% 서열 일치성을 갖는 인간 LFR2 서열, 서열번호 109에 제시된 바와 같은 LFR3 또는 서열번호 109와 적어도 약 80% 서열 일치성을 갖는 인간 LFR3 서열 및 서열번호 110에 제시된 바와 같은 LFR4 또는 서열번호 110과 적어도 약 80% 서열 일치성을 갖는 인간 LFR4 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 107 내지 서열번호 110에 따르는 LFR1, LFR2, LFR3, 및 LFR4 또는 각각의 경우에 각각 서열번호 107 내지 서열번호 110과 적어도 90% 서열을 갖는 인간 LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4 서열을 포함한다.
서열번호 103 내지 110에 따라 각각 표시된 아미노산 서열과 적어도 50, 60, 70, 80, 90 또는 95% 서열 일치성을 갖는 HFR1-4 및 LFR1-4 서열은 특정 위치, 예를 들어 버니어 대역, VH/VL 쇄-간 계면에 기여하는 위치, 또는 CDR 표준 부류를 결정하는 위치에서 변형되지 않는 것이 바람직하다. 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄에 Y90을 포함하고, 본원의 상기 및 하기에 제공된 프레임워크 영역을 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄에 90Y를 포함한다. 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄의 30번 위치에 양으로 하전된 아미노산을 포함하고, 본원의 상기 및 하기에 제공된 프레임워크 영역을 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄의 30번 위치에 양으로 하전된 아미노산을 포함한다. 하기 실시양태 모두에서, 본 발명의 첫 번째 양태의 (i)에 따른 HCDR의 서열 및 (ii)에 따른 LCDR의 서열이 유지된다.
특정 양태에서, VL에서 변형되지 않는 위치는 6번 위치, 23번 위치, 38번 위치, 44번 위치, 59번 위치, 61번 위치, 62번 위치, 64번 위치, 66번 위치, 82번 위치, 86번 위치, 87번 위치, 88번 위치, 98번 위치, 99번 위치, 및/또는 101번 위치이다.
특정 양태에서, VH에서 변형되지 않는 위치는 6번 위치, 14번 위치, 22번 위치, 36번 위치, 37번 위치, 39번 위치, 45번 위치, 46번 위치, 69번 위치, 71번 위치, 78번 위치, 86번 위치, 91번 위치, 92번 위치, 103번 위치, 104번 위치 및 106번 위치이다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VH 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VH 도메인은 아미노산 14P, 46E, 86D, 104G 및 106G를 포함하며 본 발명의 치환(들), 특히 본 발명의 첫 번째 양태의 (i)에 명시된 바와 같은 HCDR1, 및/또는 HCDR2 및/또는 (iii) 및/또는 (iv)에 명시된 바와 같은 치환을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 바람직하게 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 2와 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VL 도메인은 아미노산 59P, 61R, 62F, 82D, 99G, 및 101G를 포함하며 본 발명의 치환(들), 특히 본 발명의 첫 번째 양태의 (ii)에 명시된 바와 같은 LCDR1 및/또는 LCDR2를 포함한다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VH 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VH 도메인은 아미노산 14P, 46E, 86D, 104G 및 106G를 포함하며 본 발명의 치환(들), 특히 본 발명의 첫 번째 양태의 (i)에 명시된 바와 같은 HCDR1, 및/또는 HCDR2 및/또는 (iii) 및/또는 (iv)에 명시된 바와 같은 치환을 포함하며; 서열번호 2에 따른 VL 도메인 또는 서열번호 2와 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VL 도메인은 아미노산 59P, 61R, 62F, 82D, 99G, 및 101G를 포함하며 본 발명의 치환(들), 특히 본 발명의 첫 번째 양태의 (ii)에 명시된 바와 같은 LCDR1 및/또는 LCDR2를 포함한다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VH 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VH 도메인은 아미노산 6Q 및 36W를 포함하며, 본 발명의 치환(들), 특히 본 발명의 첫 번째 양태의 (i)에 명시된 바와 같은 HCDR1, 및/또는 HCDR2 및/또는 (iii) 및/또는 (iv)에 명시된 바와 같은 치환을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 바람직하게 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 2와 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VL 도메인은 아미노산 6Q 및 86Y를 포함하며 본 발명의 치환(들), 특히 본 발명의 첫 번째 양태의 (ii)에 명시된 바와 같은 LCDR1 및/또는 LCDR2를 포함한다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VH 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VH 도메인은 아미노산 6Q 및 36W를 포함하며 본 발명의 치환(들), 특히 본 발명의 첫 번째 양태의 (i)에 명시된 바와 같은 HCDR1, 및/또는 HCDR2 및/또는 (iii) 및/또는 (iv)에 명시된 바와 같은 치환을 포함하며; 서열번호 2와 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VL 도메인은 아미노산 6Q 및 86Y를 포함하며 본 발명의 치환(들), 특히 본 발명의 첫 번째 양태의 (ii)에 명시된 바와 같은 LCDR1 및/또는 LCDR2를 포함한다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VH 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VH 도메인은 아미노산 22C, 37V, 39Q, 45L, 69L, 71S, 78A, 91Y, 92C 및 103W를 포함하며 본 발명의 치환(들), 특히 본 발명의 첫 번째 양태의 (i)에 명시된 바와 같은 HCDR1, 및/또는 HCDR2 및/또는 (iii) 및/또는 (iv)에 명시된 바와 같은 치환을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 바람직하게 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 2와 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VL 도메인은 아미노산 C23, 38Q, 44P, 64G, 66G, 87Y, 88C 및 98F를 포함하며 본 발명의 치환(들), 특히 본 발명의 첫 번째 양태의 (ii)에 명시된 바와 같은 LCDR1 및/또는 LCDR2를 포함한다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VH 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VH 도메인은 아미노산 22C, 37V, 39Q, 45L, 69L, 71S, 78A, 91Y, 92C 및 103W를 포함하며 본 발명의 치환(들), 특히 본 발명의 첫 번째 양태의 (i)에 명시된 바와 같은 HCDR1, 및/또는 HCDR2 및/또는 (iii) 및/또는 (iv)에 명시된 바와 같은 치환을 포함하며; 서열번호 2와 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VL 도메인은 아미노산 C23, 38Q, 44P, 64G, 66G, 87Y, 88C 및 98F를 포함하며 본 발명의 치환(들), 특히 본 발명의 첫 번째 양태의 (ii)에 명시된 바와 같은 LCDR1 및/또는 LCDR2를 포함한다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VH 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VH 도메인은 아미노산 6Q, 14P, 22C, 36W, 37V, 39Q, 45L, 46E, 69L, 71S, 78A, 86D, 91Y, 92C, 103W, 104G, 및 106G를 포함하며 본 발명의 치환(들), 특히 본 발명의 첫 번째 양태의 (i)에 명시된 바와 같은 HCDR1, 및/또는 HCDR2 및/또는 (iii) 및/또는 (iv)에 명시된 바와 같은 치환을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 바람직하게 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 2와 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VL 도메인은 아미노산 6Q, 23C, 38Q, 44P, 59P, 61R, 62F, 64G, 66G, 82D, 86Y, 88C, 98F, 99G, 및 101G를 포함하며 본 발명의 치환(들), 특히 본 발명의 첫 번째 양태의 (ii)에 명시된 바와 같은 LCDR1 및/또는 LCDR2를 포함한다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VH 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VH 도메인은 아미노산 6Q, 14P, 22C, 36W, 37V, 39Q, 45L, 46E, 69L, 71S, 78A, 86D, 91Y, 92C, 103W, 104G, 및 106G를 포함하며 본 발명의 치환(들), 특히 본 발명의 첫 번째 양태의 (i)에 명시된 바와 같은 HCDR1, 및/또는 HCDR2 및/또는 (iii) 및/또는 (iv)에 명시된 바와 같은 치환을 포함하며; 서열번호 2와 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 VL 도메인은 아미노산 6Q, 23C, 38Q, 44P, 59P, 61R, 62F, 64G, 66G, 82D, 86Y, 88C, 98F, 99G, 및 101G를 포함하며 본 발명의 치환(들), 특히 본 발명의 첫 번째 양태의 (ii)에 명시된 바와 같은 LCDR1 및/또는 LCDR2를 포함한다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 7(VH H90Y); 서열번호 9(VH_T30N_S31R), 서열번호 10(VH_T30S_S31R_Y53R_E100aD), 서열번호 11(VH S31R), 서열번호 12(VH_T30S_Y53R), 서열번호 14(VH N54K H90Y), 서열번호 15(VH_T30N_S31N_Y53R), 서열번호 16(VH_T30N_S31R_V56I), 서열번호 17(VH_S31R_N54K_E100aD), 서열번호 19(VH_T30R), 서열번호 20(VH T30K); 서열번호 21(VH S31K); 서열번호 22(VH_Y53R), 서열번호 23(VH_Y53K), 서열번호 24(VH_N54R), 서열번호 25(VH N54K), 서열번호 29(VH_Y53H), 서열번호 30(VH_S31H), 서열번호 31(VH S31R H90Y), 서열번호 32(VH Y53R H90Y), 서열번호 33(VH N54R H90Y), 및 서열번호 34(VH_E61Q_H90Y)로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH 또는 각각 서열번호 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29, 30, 31, 32, 33, 및 34로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 이의 VH 변이체를 포함하고, 여기서 VH 변이체는 서열번호 1에 따른 서열을 갖는 VH와 비교하여 각각의 본 발명의 치환(들)을 유지하고 바람직하게는 각각 서열번호 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29, 30, 31, 32, 33, 및 34에 따른 서열의 HCDR1 내지 3을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이 "각각의 치환(들)을 유지한다"는 본원에 제공된 바와 같은 본 발명의 치환(들)을 유지함을 의미한다. 따라서, 특정 양태에서, 주어진 서열번호에 제공된 %로 일치하는 항원 결합 폴리펩타이드는 예를 들어 (i) 하기 중쇄의 위치: 30, 31, 53, 및 54 중 하나 이상에; 및/또는 (ii) 하기 경쇄의 위치: 31 및 56 중 하나 이상에, 및/또는 중쇄의 90번 위치에 본 발명의 치환(들)을 유지한다. 바람직한 양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29, 30, 31, 32, 33, 및 34로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 특정 양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 11(VH S31R), 또는 서열번호 22(VH_Y53R)의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 추가의 바람직한 양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 또한 상기에 제공된 VH의 기능적 단편일 수 있으며, 여기서 기능적 단편은 본 발명의 치환(들)을 포함한다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 8(VL S31R S56R), 서열번호 13(VL S31N S56R S93N), 서열번호 18(VL S56R), 서열번호 26(VL_S31R), 서열번호 27(VL_S31K), 및 서열번호 28(VL_S56K)로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL 또는 각각 서열번호 8, 13, 18, 26, 27, 및 28로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 이의 VL 변이체를 포함하고, 여기서 VL 변이체는 서열번호 2에 따른 서열을 갖는 VL과 비교하여 각각의 본 발명의 치환(들)을 유지하고 바람직하게는 각각 서열번호 8, 13, 18, 26, 27, 및 28에 따른 상기 서열의 LCDR1 내지 3을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이 "각각의 치환(들)을 유지한다"는 본원에 제공된 바와 같은 본 발명의 치환(들)을 유지함을 의미한다. 따라서, 특정 양태에서, 주어진 서열번호에 제공된 %로 일치하는 항원 결합 폴리펩타이드는 예를 들어 (i) 하기 중쇄의 위치: 30, 31, 53, 및 54 중 하나 이상에; 및/또는 (ii) 하기 경쇄의 위치: 31 및 56 중 하나 이상에, 및/또는 중쇄의 90번 위치에 본 발명의 치환(들)을 유지한다. 바람직한 양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 8, 13, 18, 26, 27, 및 28로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 추가의 바람직한 양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 또한 상기에 제공된 VL의 기능적 단편일 수 있으며, 여기서 기능적 단편은 본 발명의 치환(들)을 포함한다.
하기에서, 본원에 제공된 VH 및 VL의 특정 조합을 제시한다. 본원에서 상기 제공된 VH 및 VL이 각각 조합될 수 있는 것으로 이해된다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함한다:
서열번호 7 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 2, 서열번호 10 및 서열번호 2, 서열번호 11 및 서열번호 2, 서열번호 12 및 서열번호 2, 서열번호 11 및 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 2, 서열번호 15 및 서열번호 2, 서열번호 16 및 서열번호 2, 서열번호 17 및 서열번호 2, 서열번호 1 및 서열번호 18, 서열번호 11 및 서열번호 18, 서열번호 11 및 서열번호 8, 서열번호 12 및 서열번호 18, 서열번호 12 및 서열번호 8, 서열번호 14 및 서열번호 18, 서열번호 14 및 서열번호 8, 서열번호 19 및 서열번호 2, 서열번호 20 및 서열번호 2, 서열번호 21 및 서열번호 2, 서열번호 22 및 서열번호 2, 서열번호 23 및 서열번호 2, 서열번호 24 및 서열번호 2, 서열번호 25 및 서열번호 2, 서열번호 1 및 서열번호 26, 서열번호 1 및 서열번호 27, 서열번호 1 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 2, 서열번호 30 및 서열번호 2, 서열번호 7 및 서열번호 2, 서열번호 31 및 서열번호 2, 서열번호 31 및 서열번호 18, 서열번호 32 및 서열번호 2, 서열번호 33 및 서열번호 2, 서열번호 32 및 서열번호 18, 서열번호 7 및 서열번호 18.
추가의 바람직한 양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 또한 상기에 제공된 VL 및 VH의 기능적 단편일 수 있으며, 여기서 기능적 단편(들)은 본 발명의 치환(들)을 포함한다.
바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 11 및 서열번호 2, 서열번호 22 및 서열번호 2, 서열번호 14 및 서열번호 2, 서열번호 31 및 서열번호 2, 서열번호 32 및 서열번호 2, 서열번호 32 및 서열번호 18(VH_Y53R_H90Y 및 VL_S56R); 서열번호 14 및 서열번호 18(VH_N54K_H90Y 및 VL_S56R) 서열번호 31 및 서열번호 18(VH_S31R_H90Y 및 VL_S56R); 또는 서열번호 7 및 서열번호 2(VH_H90Y 및 BMA031 (V36)_VL)에 따른 VH 및 VL을 포함한다.
보다 바람직하게, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 11 및 서열번호 2, 서열번호 22 및 서열번호 2, 서열번호 32 및 서열번호 2; 서열번호 14 및 서열번호 2, 또는 서열번호 31 및 서열번호 2에 따른 VH 및 VL을 포함한다.
상기 및 하기에 개시한 바와 같이, 본 발명은 바람직하게는 항원 결합 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 여기서 VH는 서열번호 32(VH Y53R H90Y)의 아미노산 서열 또는 서열번호 32의 아미노산 서열에 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 이의 VH 변이체를 포함하며, 여기서 VH 변이체는 서열번호 1에 따른 서열을 갖는 VH와 비교하여 각각의 치환(Y53 및 H90Y 또는 상응하는 아미노산 치환)을 유지하고, 여기서 VL은 α/β TCR/CD3 복합체(본원에 정의된 바와 같은)에의 항체 결합의 VL을 포함하며, 특히 VL은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 바람직한 양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 또한 상기 정의된 VH 및 VL의 기능적 단편일 수 있으며, 여기서 기능적 단편은 본 발명의 치환(들)을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 추가 변형, 예를 들어 CDR의 동일한 범주의 아미노산 내의 아미노산(들)의 추가 치환(들)을 포함한다. 추가 변형은 극성의 하전되지 않은 아미노산의, 다른 극성의 하전되지 않은 아미노산으로의 치환; 음으로 하전된 아미노산의, 다른 음으로 하전된 아미노산으로의 치환; 및/또는 소수성 아미노산의, 다른 소수성 아미노산으로의 치환일 수 있다. 추가 변형은 또한 극성의 하전되지 않은 아미노산의, 다른 극성의 하전되지 않은 아미노산으로의 치환; 음으로 하전된 아미노산의, 다른 음으로 하전된 아미노산으로의 치환; 및 소수성 아미노산의, 다른 소수성 아미노산으로의 치환일 수 있다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 31번 위치 및 경쇄의 56번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 중쇄의 31번 위치는 R로 치환되고 경쇄의 56번 위치는 R로 치환된다.
하나의 실시양태에서 서열번호 1에 따른 중쇄의 31번 위치 및 경쇄의 56번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고 중쇄의 90번 위치는 Y이고, 바람직하게 중쇄의 31번 위치는 R로 치환되고, 경쇄의 56번 위치는 R로 치환되고, 중쇄의 90번 위치는 Y이다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 31번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고 중쇄의 90번 위치는 Y이고, 바람직하게 중쇄의 31번 위치는 R로 치환되고, 중쇄의 90번 위치는 Y이다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 53번 위치 및 경쇄의 56번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 중쇄의 53번 위치는 R로 치환되고, 경쇄의 56번 위치는 R로 치환된다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 53번 위치 및 경쇄의 56번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고 중쇄의 90번 위치는 Y이고, 바람직하게 중쇄의 53번 위치는 R로 치환되고, 중쇄의 90번 위치는 Y이고, 경쇄의 56번 위치는 R로 치환된다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 54번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고 중쇄의 90번 위치는 Y이고, 바람직하게 중쇄의 54번 위치는 R로 치환되고, 중쇄의 90번 위치는 Y이다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 90번 위치는 Y이고, 경쇄의 56번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 중쇄의 90번 위치는 Y이고, 경쇄의 56번 위치는 R로 치환된다.
하나의 실시양태에서 경쇄의 56번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 경쇄의 56번 위치는 R로 치환된다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 54번 위치 및 경쇄의 56번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고 중쇄의 90번 위치는 소수성 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 중쇄의 54번 위치는 K로 치환되고, 경쇄의 56번 위치는 R로 치환되고, 중쇄의 90번 위치는 Y로 치환된다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 54번 위치 및 경쇄의 31번 및 56번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 중쇄의 90번 위치는 소수성 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 중쇄의 54번 위치는 K로 치환되고, 경쇄의 31번 및 56번 위치는 R로 치환되고, 중쇄의 90번 위치는 Y로 치환된다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 31번 및 53번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 중쇄의 31번 및 53번 위치는 R로 치환된다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 53번 위치 및 경쇄의 31번 및 56번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 중쇄의 53번 위치는 R로 치환되고, 경쇄의 31번 및 56번 위치는 R로 치환된다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 31번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 중쇄의 31번 위치는 R로 치환된다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 31번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 중쇄의 31번 위치는 K로 치환된다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 30번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 중쇄의 30번 위치는 K로 치환된다.
하나의 실시양태에서 경쇄의 56번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 경쇄의 56번 위치는 R로 치환된다.
하나의 실시양태에서 경쇄의 56번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 경쇄의 56번 위치는 K로 치환된다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 54번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 중쇄의 54번 위치는 K로 치환된다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 54번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 중쇄의 90번 위치는 소수성 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 중쇄의 54번 위치는 K로 치환되고, 중쇄의 90번 위치는 Y로 치환된다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 31번 및 54번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 중쇄의 31번 위치는 R로 치환되고 중쇄의 54번 위치는 K로 치환된다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 53번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 중쇄의 53번 위치는 R로 치환된다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 53번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고 90번 위치는 Y이고, 바람직하게 중쇄의 53번 위치는 R로 치환되고, 90번 위치는 Y이다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 31번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 중쇄의 31번 위치는 R로 치환된다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 31번 위치 및 경쇄의 31번 및 56번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 중쇄의 31번 위치는 R로 치환되고, 경쇄의 31번 및 56번 위치는 R로 치환된다.
하나의 실시양태에서 중쇄의 53번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 중쇄의 53번 위치는 R로 치환된다.
하나의 실시양태에서 경쇄의 31번 및 56번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 중쇄의 90번 위치는 소수성 아미노산으로 치환되고, 바람직하게 경쇄의 31번 및 56번 위치는 R로 치환되고, 중쇄의 90번 위치는 Y로 치환된다.
하나의 실시양태에서, VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ는 공유적으로 또는 비공유적으로 함께 연결된다. 바람직하게는, VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ는 다이설파이드 결합에 의해 공유적으로 연결된다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 추가 항원 결합 부위를 추가로 포함한다. 예를 들어, 항원 결합 폴리펩타이드가 제1 및 제2 결합 부위를 포함하고 추가의 결합 부위를 추가로 포함하는 경우, 항원 결합 폴리펩타이드는 삼중특이성 분자 또는 3가 등일 수 있다. 하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 막관통 영역을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 임의로 세포질 신호전달 영역을 포함하는 막관통 영역을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 진단제를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 예를 들어 화학요법제, 비-화학요법제, 항-종양제 및/또는 방사선, 바람직하게는 화학요법제와 같은 암 치료에 널리 사용되는 다양한 약물 및 치료와 동시에, 이전에 또는 이후에 투여될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 이러한 치료제는 세포독성제 또는 방사성 동위원소와 같은 성장 억제제일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 이중특이성 포맷, 특히 이중특이성 TCER® 분자에서 사용될 수 있다. 놀랍게도 HCDR1 및/또는 HCDR2 및/또는 LCDR1 및/또는 LCDR2의 각 위치에서 적어도 하나의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 상기 정의된 바와 같은 제1 결합 부위를 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 이중특이성 분자 및 예를 들어 TCR 또는 이의 단편을 포함하는 제2 결합 부위를 추가로 포함하는 것은 이중특이성 포맷에서 향상된 효과기 기능을 나타내는 것이 입증되었다. 하기 본원의 실시예에서 입증된 바와 같이, 상기 본원에 정의된 바와 같은 제1 및 제2 결합 부위를 포함하는 이러한 이중특이성 분자는 종양 세포의 T 세포 매개 사멸에 있어서 증가된 효능을 나타낸다(하기 기재된 실시예 3 참조). 따라서, 놀랍게도 상기 본 발명의 첫 번째 양태에 따라 기재된 항원 결합 폴리펩타이드는 또한 기능적이며 이중특이성 포맷에서 개선을 보인다는 것이 밝혀졌다. 또한 놀랍게도 상기 기재된 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 항원 결합 폴리펩타이드는 펩타이드-HLA 양성 종양 세포의 T 세포 매개 종양 사멸에서 증가된 효능을 발휘하고 추가로 펩타이드-HLA 음성 종양에 대한 세포독성은, TCER® 포맷에서 BMA031(V36)의 VH를 포함하는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 이중특이성 TCER® 스캐폴드에서 거의 검출할 수 없음이 밝혀졌다. 상기 이중특이성 TCER® 분자의 효능은 방출된 LDH 및 EC50 값(상기 본원에서 정의된 기능적 EC50)을 측정하여 평가된다. 예를 들어, Hs695T 세포 및 U2OS 세포에 대한 항원 결합 폴리펩타이드의 기능적 EC50은 TCER® 포맷의 BMA031(V36)의 VH 및 VL을 포함하는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 감소된다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 제1 및 제2 항원 결합 부위를 형성하는 제1 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하며, 여기서 제1 폴리펩타이드 쇄는 하기 식으로 나타내는 구조를 갖고:
[화학식 I]
V1-L1-V2-L2-D1
여기서
V1은 제1 가변 도메인이고;
V2는 제2 가변 도메인이고;
L1 및 L2는 링커이고; L2는 존재하거나 존재하지 않고;
D1은 이량체화 도메인이고 존재하거나 존재하지 않으며;
제2 폴리펩타이드 쇄는 하기 식으로 나타내는 구조를 갖는다:
[화학식 II]
V3-L3-V4-L4-D2
여기서
V3은 제3 가변 도메인이고;
V4는 제4 가변 도메인이고;
L3 및 L4는 링커이고; L4는 존재하거나 존재하지 않고;
D2는 이량체화 도메인이고 존재하거나 존재하지 않으며;
여기서, D1 및 D2는 서로 특이적으로 결합하고, 여기서
V1, V2, V3, V4 중 하나는 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같은 VH이고,
V1, V2, V3, V4 중 하나는 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같은 VL이고,
V1, V2, V3, V4 중 하나는 TCR의 Vα 또는 Vγ이고,
V1, V2, V3, V4 중 하나는 상기 TCR의 Vβ 도는 Vδ이다.
하나의 실시양태에서, VH 및 VL은 제1 결합 부위를 형성하고 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ는 제2 결합 부위를 형성한다.
하나의 실시양태에서, V1 또는 V2는 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같은 VL이고, V3 또는 V4는 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같은 VH이고, V3 또는 V4는 Vα 또는 Vγ이고 V1 또는 V2는 TCR의 Vβ 또는 Vδ이다.
하나의 실시양태에서, V1 또는 V2는 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같은 VH이고, V3 또는 V4는 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같은 VL이고, V3 또는 V4는 Vβ 또는 Vδ이고 V1 또는 V2는 TCR의 Vα 또는 Vγ이다.
하나의 실시양태에서 V1 또는 V2는 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같은 VL이고, V3 또는 V4는 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같은 VH이고, V3 또는 V4는 Vβ 또는 Vδ이고 V1 또는 V2는 TCR의 Vα 또는 Vγ이다. 하나의 실시양태에서 V1 또는 V2는 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같은 VH이고, V3 또는 V4는 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같은 VL이고, V3 또는 V4는 Vα 또는 Vγ이고 V1 또는 V2는 TCR의 Vβ 또는 Vδ이다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 하기와 같은 V1 내지 V4를 포함하고: V1은 VH이고, V2는 Vβ 또는 Vδ이고, V3은 Vα 또는 Vγ이고, V4는 VL이다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 하기와 같은 V1 내지 V4를 포함하고: V1은 Vβ 또는 Vδ이고; V2는 VH이고; V3은 VL이고; V4는 Vα 또는 Vγ이다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 하기와 같은 V1 내지 V4를 포함하고: V1은 Vβ 또는 Vδ이고, V2는 V L이고, V3은 VH이고, 및 V4 는 Vα 또는 Vγ이다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 하기와 같은 V1 내지 V4를 포함하고: V1은 V L이고, V2는 Vβ 또는 Vδ이고, V3은 Vα 또는 Vγ이고, V4는 VH이다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 하기와 같은 V1 내지 V4를 포함하고: V1은 VH이고, V2는 Vβ 또는 Vδ이고, V3은 VL이고, 및 V4 는 Vα 또는 Vγ이다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 하기와 같은 V1 내지 V4를 포함하고: V1은 Vβ 또는 Vδ이고, V2는 VH이고; V3은 Vα 또는 Vγ이고, V4는 VL이다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 하기와 같은 V1 내지 V4를 포함하고: V1은 VL이고, V2는 Vβ 또는 Vδ이고; V3은 VH이고, V4는 Vα 또는 Vγ이다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 하기와 같은 V1 내지 V4를 포함하고: V1은 Vβ 또는 Vδ이고, V2는 VL이고; V3은 Vα 또는 Vγ이고, 및 V4는 VH이다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 하기와 같은 V1 내지 V4를 포함하고: V1은 VH이고, V2는 VL이고, V3은 Vα 또는 Vγ이고; V4는 Vβ 또는 Vδ이다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 하기와 같은 V1 내지 V4를 포함하고: V1은 VL이고; V2는 VH이고; V3은 Vα 또는 Vγ이고; V4는 Vβ 또는 Vδ이다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 하기와 같은 V1 내지 V4를 포함하고: V1은 VH이고, V2는 VL이고; V3은 Vβ 또는 Vδ이고; 및 V4는 Vα 또는 Vγ이다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드는 하기와 같은 V1 내지 V4를 포함하고: V1은 VL이고, V2는 VH이고; V3은 Vβ 또는 Vδ이고; V4는 Vα 또는 Vγ이다.
화학식 I 및 II와 관련하여, VH 및 VL은 상이한 폴리펩타이드 쇄상에 위치하고 Vα 또는 Vγ 및 Vβ 또는 Vδ는 상이한 폴리펩타이드 쇄상에 위치하며 이량체화 도메인 D1 및 D2는 이종이량체화 도메인이 바람직하다. 항원 결합 폴리펩타이드에서 V1은 VH이고 , V2는 Vβ이고, V3은 Vα이고, V4는 VL인 것이 특히 바람직하다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드의 D1 및 D2는 Fc 도메인, 바람직하게는 Fc 도메인의 쌍이고, 바람직하게는 상이하고 이종이량체화를 강제하는 돌연변이, 바람직하게는 "구멍에 손잡이(knob-into-hole)" 돌연변이를 포함한다.
L1, L2, L3, L4는 존재하는 경우, 2-25, 2-20, 또는 3-18개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커, 예를 들어 L1, L2, L3, L4는 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5개 이하 아미노산 길이의 펩타이드일 수 있다. 다른 실시양태에서, 링커, 예를 들어 L1, L2, L3, L4는 5-25, 5-15, 4-11, 10-20, 또는 20-30개 아미노산 길이일 수 있다.
하나의 실시양태에서 L1 및/또는 L3은 5-15개 아미노산, 바람직하게는 5-10개 아미노산, 더욱 바람직하게는 8개 아미노산의 길이를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, L2 및 L4는 존재하지 않고, L1 및 L3은 존재하며 길이는 5-10개, 바람직하게는 8개 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 상기 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 항원 결합 폴리펩타이드는 본원에 위에 정의된 바와 같은 임의의 포맷, 예를 들어 이중특이성 포맷 또는 COVD 포맷으로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 폴리펩타이드는 이중특이성 분자이다. 훨씬 더 바람직하게는, 항원 결합 폴리펩타이드는 이중특이성 TCER® 분자이다.
하나의 실시양태에서, V1은 VH 또는 VL이고 V2는 VH 또는 VL로서 각각 제1 결합 부위를 형성하고, 상기에서 상세히 정의된 바와 같고 상기 정의된 바와 같은 각각의 위치에 적어도 하나의 양으로 하전된 아미노산을 갖는 항원 결합 폴리펩타이드에 포함된 바와 같은 VH 및 VL을 포함한다.
하나의 실시양태에서 본원에 개시된 이중특이성 분자는 본원에 기재된 바와 같은 TCER® 포맷을 포함하고, 본원에 상기 기재된 바와 같이 기능적 EC50으로서 계산된, 바람직하게는 1000 pM 미만, 900 pM 미만; 800 pM 미만; 700 pM 미만; 600 pM 미만, 및 특히 500 pM 미만의 기능적 EC50을 갖는 증가된 세포독성을 나타낸다. 바람직하게는, 이중특이성 분자는 본원의 상기 및 하기에 정의된 바와 같은 이중특이성 TCER® 분자이고 1000 pM 미만, 900 pM 미만; 800 pM 미만; 700 pM 미만, 600 pM 미만, 및 특히 500 pM 미만의 기능적 EC50을 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 이중특이성 항원 결합 폴리펩타이드를 지칭하고 제1 및 제2 항원 결합 부위를 형성하는 제1 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 폴리펩타이드 쇄는 상기 정의된 바와 같은 화학식 I 및 II로 나타내는 구조를 갖고, 여기서 제1 폴리펩타이드 쇄는 α/β TCR/CD3 복합체에 특이적으로 결합하는 제1 결합 부위를 포함하고, 제1 가변 도메인(V1) 및 제2 가변 도메인(V2)을 포함하며, 여기서 제1 가변 도메인은 본원에서 상기에 정의된 바와 같은 중쇄 가변 도메인(VH)이고 제2 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인(VL)이며; 여기서 제2 폴리펩타이드 쇄는 제3 가변 도메인(V3) 및 제4 가변 도메인(V4)을 포함하는 제2 항원 결합 부위를 포함하고, 제3 가변 도메인은 가변 알파 도메인(Vα) 및 가변 베타 도메인(Vβ)을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 제1 항원 결합 부위를 형성하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서 VH 및 VL은 본 발명의 맥락에서 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 양으로 하전된 아미노산을 갖는 HCDR 및 LCDR을 포함하고, 제2 결합 부위를 형성하는 Vα 및 Vβ를 포함하며, 여기서 Vα 및 Vβ는 TCR의 VαCDR1-3 및 VβCDR1-3을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 본원에서 상기 정의된 바와 같은 VH HFR1-4 및 VL LFR1-4에 제1 항원 결합 부위를 형성하는 VH 및 VL, 및 제2 결합 부위를 형성하는 Vα 및 Vβ에 Vα의 FR1-4 및 Vβ의 FR1-4를 추가로 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 제1 항원 결합 부위를 형성하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서 VH 및 VL은 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 양으로 하전된 아미노산 및 VH의 90번 위치에 티로신을 갖는 HCDR 및 LCDR을 포함하고 제2 결합 부위를 형성하는 Vα 및 Vβ를 포함하며, 여기서 Vα 및 Vβ는 TCR의 VαCDR1-3 및 VβCDR1-3을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 상기 정의된 바와 같은 VH HFR1-4 및 VL LFR1-4에 제1 항원 결합 부위를 형성하는 VH 및 VL, 및 제2 결합 부위를 형성하는 Vα 및 Vβ에 Vα의 FR1-4 및 Vβ의 FR1-4를 추가로 포함한다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 C-말단에 링커(L2) 및 이량체화 도메인(D1) 또는 이의 일부를 추가로 포함하는 화학식 I의 제1 폴리펩타이드 쇄, 및/또는 C-말단에 링커(L4) 및 이량체화 도메인(D2) 또는 이의 일부를 추가로 포함하는 화학식 II의 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하며, 여기서 D1과 D2는 서로 특이적으로 결합한다. 이량체화 도메인은 본원의 상기 '정의' 섹션에서 정의된다. 바람직하게, 링커 L1 및 L3은 10-25개 아미노산 또는 5-10개 아미노산, 더욱 바람직하게는 8개 아미노산의 길이를 갖는다. 하나의 실시양태에서, 화학식 I의 제1 폴리펩타이드 쇄는 그의 C-말단에 링커(L2) 및 Fc1 도메인 또는 이의 일부를 추가로 포함하고/하거나 화학식 II의 제2 폴리펩타이드 쇄는 그의 C-말단에 링커(L4) 및 Fc2 도메인 또는 이의 일부를 포함한다. Fc-도메인은 본원에서 상기 '정의' 섹션에 정의된 바와 같으며, 서로 특이적으로 결합한다. Fc1 및 Fc2는 상이하고 서로 특이적으로 결합하며, 이들의 서열은 예를 들어 본원에 하기에 표시된 바와 같다.
하나의 실시양태에서, Fc-도메인은 인간 IgG Fc 도메인이고, 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2, 더욱 바람직하게는 IgG1로부터 유래된다. 특히, 이중특이성 항원 결합 폴리펩타이드가 2개의 Fc 도메인, 즉 본원에서 상기에 기재된 TCER® 포맷(예를 들어 Fc1 및 Fc2)을 포함하는 경우, 2개의 Fc 도메인은 동일한 면역글로불린 아이소타입 또는 아이소타입 하위부류의 것이거나 상이한 면역글로불린 아이소타입 또는 아이소타입 하위부류, 바람직하게는 동일한 것일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서 Fc1 및 Fc2는 IgG1 하위부류, IgG2 하위부류, IgG3 하위부류, 또는 IgG4 하위부류의 것, 바람직하게는 IgG1 하위부류, 또는 IgG2 하위부류, 보다 바람직하게는 IgG1 하위부류의 것이다.
일부 실시양태에서, Fc 도메인은 "RF" 및/또는 "구멍에 손잡이" 돌연변이, 바람직하게는 "구멍에 손잡이"를 포함하거나 추가로 포함한다. Fc1이 서열번호 124(구멍)를 포함하거나 이로 이루어지고, Fc2가 서열번호 125(손잡이)를 포함하거나 이로 이루어지는 것이 바람직하다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 39를 포함하거나 이로 이루어지는 화학식 I V1-L1-V2-L2-D1을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 35를 포함하거나 이로 이루어지는 화학식 I II V3-L3-V4-L4-D2를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 39를 포함하거나 이로 이루어지는 화학식 I V1-L1-V2-L2-D1을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 38을 포함하거나 이로 이루어지는 화학식 I II V3-L3-V4-L4-D2를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 39를 포함하거나 이로 이루어지는 화학식 I V1-L1-V2-L2-D1을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄; 및 서열번호 36을 포함하거나 이로 이루어지는 화학식 I II V3-L3-V4-L4-D2를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 모 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 39를 포함하거나 이로 이루어지는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함할 수 있고; 서열번호 37을 포함하거나 이로 이루어지는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 두 번째 양태는 추가로 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 핵산 세트, 또는 상기 핵산 또는 핵산 세트를 포함하는 핵산 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드가 2개 이상의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 경우, 하나의 핵산 세트가 사용될 수 있다. 대안적으로, 2개 이상의 폴리펩타이드 쇄는 하나의 폴리시스트론 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있거나 초기 단일 폴리펩타이드가 2개 이상의 폴리펩타이드 쇄로 분리되도록 하는 절단 부위를 포함하는 단일 폴리펩타이드로서 암호화될 수 있다.
하나의 실시양태에서 단리된 핵산은 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 하나의 실시양태에서, 핵산 벡터는 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 상기 핵산을 포함한다. 전형적으로, 상기 핵산은 플라스미드, 코스미드, 에피솜, 인공 염색체, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 임의의 적합한 벡터에 포함될 수 있는 DNA 또는 RNA 분자이다.
본 발명의 세 번째 양태는 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드, 또는 본 발명의 두 번째 양태의 핵산 또는 핵산 세트 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 전형적으로, 이러한 숙주 세포는 본 발명의 두 번째 양태에 따른 핵산 및/또는 벡터로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된다. 형질전환 또는 형질도입 과정에 의해 DNA 또는 RNA로 이루어지는 외래 핵산 또는 벡터를 수용하고 후속적으로 발현하는 숙주 세포는 "형질전환"되었거나 또는 "형질도입"되었다.
하나의 실시양태에서, 세포는 US20190216852에 기재된 방법을 사용하여 형질도입될 수 있으며, 이 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 세 번째 양태에 따른 핵산 또는 핵산 세트는 적합한 발현 시스템에서 본 발명의 재조합 항원 결합 폴리펩타이드를 생산하는데 사용될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 숙주 세포는 전술한 바와 같은 핵산 또는 벡터를 포함한다. 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 세포(예를 들어 인간 세포), 효모, 식물, 동물, 진균 또는 조류일 수 있거나 원핵 세포, 예를 들어 세균 또는 원생동물일 수 있다. TCR 또는 재조합 TCR을 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드 또는 이중특이성 항원 결합 폴리펩타이드와 같은 항원 결합 폴리펩타이드를 생산할 목적으로, 숙주 세포는 바람직하게는 림프구와 같은 포유동물 세포, 바람직하게는 T 림프구 또는 T 림프구 전구세포이다. 바람직한 숙주 세포의 예는 CD4 또는 CD8 양성 T 세포이다. 재조합 발현을 위한 바람직한 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 스크리닝 분석에 적합한 숙주 세포는 효모 세포일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 항원 결합 폴리펩타이드, 또는 본 발명의 핵산 또는 핵산 세트, 또는 벡터를 포함하며, 여기서 상기 숙주 세포는 바람직하게는 림프구, 예를 들어 T 림프구 또는 T 림프구 전구 세포, 바람직하게는 CD4 또는 CD8 양성 T 세포이다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드의 발현을 목적으로, 발현 벡터는 항체 중쇄 또는 알파 쇄와 같은 제1 항원 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 및 알파 경쇄 또는 베타 쇄와 같은 제2 항원 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자가 별도의 벡터에 존재하는 유형이거나, 또는 2개의 유전자가 모두 동일한 벡터상에 존재하는 유형(탠덤 유형)의 것일 수 있다.
본 발명의 네 번째 양태는 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드, 본 발명의 두 번째 양태의 핵산 또는 핵산 세트 또는 벡터, 또는 본 발명의 세 번째 양태의 숙주 세포 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 안정화제 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 약학 조성물은 치료 유효량의 항원 결합 폴리펩타이드, 본 발명의 핵산 또는 핵산 세트 또는 벡터 또는 숙주 세포를 포함한다. 하나의 실시양태에서 본 발명의 네 번째 양태의 약학 조성물은 치료 유효량의 활성 성분, 바람직하게는 본 발명의 첫 번째 양태의 항원-결합 폴리펩타이드, 본 발명의 두 번째 양태의 핵산 또는 벡터, 또는 본 발명의 세 번째 양태의 숙주 세포를, 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기에 적합한 양의 담체 및/또는 부형제와 함께, 바람직하게는 정제된 형태로 함유한다. 추가 실시양태에서, 약학 조성물은 항원 결합 폴리펩타이드, 또는 항원 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 벡터, 또는 항원 결합 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포 및 약학적으로 활성인 조성물을 포함한다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다. 정맥내 투여의 경우, 담체는 수성 담체인 것이 바람직하다. 하나의 실시양태에서 이러한 수성 담체는 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드와 조합될 때 개선된 특성, 예를 들어 개선된 용해도, 효능 및/또는 개선된 면역요법을 부여할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 약학 조성물은 선택된 투여 방식에 따라 적절하게 투여되도록 선택된 약학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 제형 중에, 비제한적으로 보조제 및/또는 추가 활성 성분과 같은 치료제 또는 약리학적 활성 물질을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서 약학 조성물은 용액, 현탁액, 유화액, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방성 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 제조하기 위해, 약학적으로 허용되는 담체는 고체 또는 액체일 수 있으며, 바람직하게는 액체이다. 액체 형태 조성물에는 용액, 현탁액 및 유화액, 예를 들어 물, 식염수 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 용액 또는 물/프로필렌 글리콜 용액이 포함된다. 비경구 주사(예를 들어, 정맥내, 동맥내, 골내 주입, 근육내, 피하, 복강내, 피내 및 척수강내 주사)의 경우, 액체 제제는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 수용액과 같은 용액으로 제형화될 수 있다. 식염수는 약학 조성물이 정맥내로 투여되는 경우 바람직한 담체이다.
하나의 실시양태에서, 약학 조성물은 단위 투여형이다. 이러한 형태에서, 조성물은 적절한 양의 활성 성분을 함유하는 단위 용량으로 세분될 수 있다. 단위 투여형은 패키징된 조성물(패키지는 개별 양의 조성물을 함유한다), 예를 들어 패키징된 정제, 캡슐, 및 바이알 또는 앰풀 중의 분말일 수 있다. 또한, 단위 투여형은 캡슐, 주사 바이알, 정제, 카셰제 또는 로젠지 자체일 수 있거나, 이들 중 임의의 것의 적합한 수를 패키징한 형태일 수 있다. 원하는 경우, 약학 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.
약학 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 요법은 당연히 치료할 상태, 질병의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별, 원하는 치료 기간 등에 따라 달라진다. 이 약학 조성물은 이를 환자에게 투여하기 원하는 방법에 따라 임의의 적합한 형태일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 네 번째 양태의 약학 조성물은 주사될 수 있는 제형에 대해 약학적으로 허용되는 비히클을 함유한다. 이는 특히 등장성의 멸균 식염수 용액(일나트륨 또는 이나트륨 포스페이트, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등 또는 이러한 염의 혼합물) 또는 건조, 특히 동결 건조된 조성물일 수 있으며, 이는 첨가 시 경우에 따라, 멸균수 또는 생리식염수를 사용하여 주사 용액을 구성한다.
약학 조성물을 제조하기 위해, 유효량의 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드를 약학적으로 허용되는 담체 또는 수성 매질에 용해하거나 분산시킬 수 있다.
주사용으로 적합한 약학적 형태에는 멸균 수용액 또는 분산액; 참기름, 땅콩기름 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 모든 경우에 상기 형태는 멸균되어야 하며 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 하며 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 통상적인 보관 및 사용 조건에서 이러한 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드를, 약학적으로 허용되는 염을 사용하여 중성 또는 염 형태의 약학 조성물로 제형화할 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요에 따라 상기에서 열거한 다양한 기타 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼합한 후 여과 멸균하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질과 상기에 열거된 것 중 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균 활성 성분을 혼합하여 제조된다. 멸균 주사용 용액 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 앞서 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성시키는 진공-건조 및 동결-건조 기법이다.
본 발명의 다섯 번째 양태는 약제에 사용하기 위한 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드, 본 발명의 두 번째 양태의 핵산 또는 벡터, 또는 본 발명의 세 번째 양태의 숙주 세포 또는 네 번째 양태의 약학 조성물에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 상기 항원 결합 폴리펩타이드, 상기 핵산 또는 벡터, 상기 숙주 세포 또는 상기 약학 조성물은 약제에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 여섯 번째 양태는 증식성 질환, 바람직하게는 암, 또는 종양 또는 종양성 질환 및/또는 장애의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드, 본 발명의 두 번째 양태의 핵산 또는 벡터, 또는 본 발명의 세 번째 양태의 숙주 세포, 또는 본 발명의 네 번째 양태의 약학 조성물에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 상기 항원 결합 폴리펩타이드, 상기 핵산 또는 벡터, 상기 숙주 세포 또는 상기 약학 조성물은 증식성 질환의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는, 진단, 예방 및/또는 치료될 증식성 질환은 암이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드, 본 발명의 두 번째 양태의 핵산 또는 벡터, 또는 본 발명의 세 번째 양태의 숙주 세포, 또는 본 발명의 네 번째 양태의 약학 조성물은 종양 성장을 억제하거나 암을 치료하기 위한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 암에 걸린 환자에게 본원에 기재된 항원 결합 단백질을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, MHC 단백질과의 복합체로 본원에 기재되거나 본원에 참고로 포함된 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드를 제시하는, 상기 환자의 치료 방법을 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 암에 걸린 환자에게 본원에 기재된 항원 결합 단백질을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, MHC 단백질과의 복합체로 본원에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드를 제시하는, 상기 환자에서 면역 반응을 이끌어내는 방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 일곱 번째 양태는 항원 결합 폴리펩타이드의 안정성 및/또는 결합을 개선시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 본원에서 제공된 치환을 항원 결합 폴리펩타이드에 도입한다. 특히, 이 방법은 양으로 하전된 아미노산을 HCDR 및/또는 LCDR에 도입하는 단계 및/또는 Kabat 넘버링에 따른 중쇄의 90번 위치에 티로신을 도입하는 단계를 포함한다. 특히, 방법은
(i) 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산을 양으로 하전된 아미노산으로 치환하고; 및/또는
(ii) 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산을 양으로 하전된 아미노산으로 치환하고; 및/또는
(iii) Kabat 넘버링에 따른 HFR1의 30번 위치를 양으로 하전된 아미노산으로 치환하고; 및/또는
(iv) Kabat 넘버링에 따른 HFR3의 90번 위치를 티로신(Y)으로 치환함
을 포함하며, 여기서
(1) α/β T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체에 대한 항원 결합 폴리펩타이드의 결합이 모 항원 결합 폴리펩타이드에 비해 증가되거나;
(2) α/β T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체에 대한 항원 결합 폴리펩타이드의 결합이 유지되거나 증가되고 항원 결합 폴리펩타이드의 안정성이 모 항원 결합 폴리펩타이드에 비해 증가되거나; 또는
(3) 항원 결합 폴리펩타이드의 안정성이 모 항원 결합 폴리펩타이드에 비해 증가된다.
특히, 항원 결합 폴리펩타이드의 위치(들)는 첨부된 실시예에 도시된 바와 같을 뿐만 아니라 상기 및 하기에 제공되는 바와 같이 치환된다. 바람직하게, 방법은 중쇄의
(i) 30번 위치,
(ii) 31번 위치,
(iii) 53번 위치
(iv) 54번 위치; 및/또는
경쇄의
(i) 31번 위치; 및/또는
(ii) 56번 위치
에서 양으로 하전된 아미노산에 의한 치환을 포함한다.
특히, 이 방법은 중쇄의 90번 위치에서 히스티딘을 티로신으로 치환하는 것을 포함한다. 중쇄의 90번 위치의 히스티딘이 티로신으로 치환되는 것은 본원에서 상기 및 하기에 제공된 바와 같이 중쇄 및/또는 경쇄에서의 추가 치환과 조합될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 방법은 본 발명의 치환을 포함하지 않는 모 항원 결합 폴리펩타이드, 예를 들어 서열번호 1(BMA031(V36) VH) 및 서열번호 2(BMA031(V36) VL)와 비교하여, 바람직하게는 본원의 상기 및 하기에 기재된 결합을 평가함으로써 측정된, 증가된 결합을 갖는 항원 결합 폴리펩타이드를 제공한다. 항원 결합 폴리펩타이드와 관련하여 상기에 개시된 효과를 또한 본원에 제공된 방법에도 적용한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 일곱 번째 양태에 따른 방법은 예를 들어 서열번호 1(BMA031(V36) VH) 및 서열번호 2(BMA031(V36) VL)에 따른 VH/VL을 포함하는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 Tm을 갖는 항원 결합 폴리펩타이드로 이어진다. 바람직하게는, 항원 결합 폴리펩타이드의 Tm은 예를 들어 서열번호 1(BMA031(V36) VH) 및 서열번호 2(BMA031(V36) VL)에 따른 VH/VL을 포함하는 모 항원 결합 폴리펩타이드, 바람직하게는 모 항체와 비교하여 적어도 1℃ - 3℃까지 증가된다. 실시예에서 예기치 않게 입증된 바와 같이, 90번 위치에서 티로신에 의한 히스티딘의 치환은 90번 위치에서 티로신에 의한 치환을 포함하지 않는 모 항원 결합 폴리펩타이드, 예를 들어 서열번호 1(BMA031(V36) VH) 및 서열번호 2(BMA031(V36) VL)에 따른 VH/VL을 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 안정성을 증가시켰다. 특히, 90번 위치에서 티로신에 의한 히스티딘의 치환은, 상기 90번 위치에서 티로신에 의한 히스티딘의 치환을 포함하지 않는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 안정성을 적어도 약 1℃, 바람직하게는 적어도 약 2℃, 더욱 바람직하게는 적어도 약 2.5℃, 또는 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 3℃까지 증가시킨다.
하나의 실시양태에서, 방법은 예를 들어 서열번호 1(BMA031(V36) VH) 및 서열번호 2(BMA031(V36) VL)에 따른 VH/VL을 포함하는 모 항원 결합 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 결합; 및 예를 들어 서열번호 1(BMA031(V36) VH) 및 서열번호 2(BMA031(V36) VL)에 따른 VH/VL을 포함하는 모 항원 결합 폴리펩타이드, 바람직하게는 모 항체와 비교하여 증가된 Tm을 제공하는 항원 결합 폴리펩타이드의 생성으로 이어진다.
하나의 실시양태에서, 방법은 중쇄 30, 31, 53 및 54번 위치 중 적어도 하나가 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 항원 결합 폴리펩타이드를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 방법은 경쇄 31, 56 및 93번 위치 중 적어도 하나가 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 항원 결합 폴리펩타이드를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 방법은 중쇄 30, 31, 53 및 54번 위치 중 적어도 하나가 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고 경쇄 31 및 56번 위치 중 적어도 하나가 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 항원 결합 폴리펩타이드를 포함한다.
하나의 실시양태에서 이러한 치환(들)은 치환을 포함하지 않는 모 항원 결합 폴리펩타이드에 비해 항원 결합 폴리펩타이드의 안정성 및/또는 결합을 증가시킨다.
본 발명의 여덟 번째 양태는 세포, 예를 들어 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포를 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 세포의 검출, 결정 및/또는 농축 방법에 관한 것다. 방법은 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포를 농축시킴, 예를 들어 항원 결합 폴리펩타이드에 결합된 T 세포를 농축시킴을 추가로 포함할 수 있다. α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포의 검출 또는 결정 방법은 상기 세포에 결합된 항원 결합 폴리펩타이드의 검출 및/또는 결정을 추가로 포함할 수 있다. 방법은 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드에 결합된 세포를 정제하는 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 세포, 예를 들어 α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포를 검출, 결정 및/또는 농축시키는데 있어서 본원에 제공된 항원 결합 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
추가 양태는 T 세포를 활성화하는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 T 세포를 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드와 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명의 추가 양태는 본 발명의 첫 번째 양태의 항원 결합 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서 항원 결합 폴리펩타이드의 제조 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a. 적합한 숙주 세포를 제공하고,
b. 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 항원 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 유전자 작제물을 제공하고,
c. 상기 유전자 작제물을 상기 본 발명의 세 번째 양태에 따른 적합한 숙주 세포에 도입하고,
d. 상기 유전자 작제물을 상기 적합한 숙주 세포에 의해 발현시키고,
e. 임의로, 항원 결합 폴리펩타이드를 단리한다.
유전자 작제물은 바람직하게는 본 발명의 두 번째 양태에 따른 핵산 또는 벡터이다. 하나의 실시양태에서, 방법은 적합한 숙주 세포로부터 항원 결합 폴리펩타이드를 단리 및 정제하고, 임의로 T 세포에서 항원 결합 폴리펩타이드를 재구성하는 것을 추가로 포함한다. 하나의 실시양태에서, 유전자 작제물은 상기 암호화 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 포함하는 발현 작제물이다. 유전자 작제물은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 형질전환, 형질도입 또는 형질감염을 사용하여 숙주 세포 내로 도입된다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드는 임의의 화학적, 생물학적, 유전적 또는 효소적 기법과 같은 당업계에 공지된 임의의 기법에 의해 단독으로 또는 조합하여 생성될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 추가의 양태는 이전 청구항 중 어느 한 항의 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 키트에 관한 것이다.
상기에 따라, 본 발명은 바람직하게는 하기의 항목에 관한 것이다:
1. 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드에 관한 것으로, 여기서
(1) VH는
(a) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1),
(b) YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(서열번호 53)의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2,
여기서
X1은 A 또는 N이고;
X2 는 E 또는 Q이고; 및/또는
X3은 Q 또는 K이다
(c) HCDR3, 및
(d) 중쇄 프레임워크 영역(HFR) 1-4
를 포함하고;
(2) VL은
(a) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1),
(b) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2,
(c) LCDR3, 및
(d) 경쇄 프레임워크 영역(LFR) 1-4
를 포함하고, 여기서
(i) 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 및/또는
(ii) 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 및/또는
(iii) Kabat 넘버링에 따른 HFR1의 30번 위치는 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 및/또는
(iv) Kabat 넘버링에 따른 HFR3의 90번 위치는 티로신(Y) 잔기로 치환되고,
여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 α/β T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체에 특이적으로 결합한다.
2. 1항에 있어서,
양으로 하전된 아미노산이
(i) 하기 중쇄의 위치 중 하나 이상: 31, 53 및 54; 및/또는
(ii) 하기 경쇄의 위치 중 하나 이상: 31 및 56
에 있고, 여기서 위치가 Kabat 넘버링에 따르는
항원 결합 폴리펩타이드.
3. 1항 또는 2항에 있어서,
(a) 중쇄의 하기 위치에서 양으로 하전된 아미노산이
(i) 30번 위치에서 R, K 또는 H이고;
(ii) 31번 위치에서 R, K 또는 H이고;
(iii) 53번 위치에서 R, K 또는 H이고; 및/또는
(iv) 54번 위치에서 R 또는 K이고; 및/또는
(b) 경쇄의 하기 위치에서 양으로 하전된 아미노산이
(i) 31번 위치에서 R 또는 K이고; 및/또는
(ii) 56번 위치에서 R 또는 K인
항원 결합 폴리펩타이드.
4. 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서,
VH 및 VL이 제1 결합 부위를 형성하고, 항원 결합 폴리펩타이드가 바람직하게는 세포 표면 단백질, 바람직하게는 암세포의 세포 표면 단백질에 특이적으로 결합하는, 보다 바람직하게는 주요 조직적합성(MHC) 펩타이드 복합체, 바람직하게는 MHC I에 특이적으로 결합하는, 바람직하게는 인간 백혈구 항원(HLA) 펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는, 및 가장 바람직하게는 암세포의 인간 백혈구 항원(HLA) 펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 항원 결합 폴리펩타이드.
5. 4항에 있어서,
제2 항원 결합 부위가 적어도 하기의 가변 영역을 포함하는, 항원 결합 폴리펩타이드:
(i) TCR의 α(Vα) 및/또는 β(Vβ) 쇄; 또는
(ii) TCR의 γ(Vγ) 및/또는 δ(Vδ) 쇄, 또는
(iii) 1항에 정의된 바와 같은 VL과 상이한 경쇄 및/또는 1항에 정의된 바와 같은 VH와 상이한 중쇄.
6. 5항에 있어서,
제2 항원 결합 부위가 2개의 별도의 폴리펩타이드 쇄 또는 동일한 폴리펩타이드 쇄 상의 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ를 포함하는, 항원 결합 폴리펩타이드.
7.1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서,
VL 및 VH가 항체의 VL 및 VH인, 항원 결합 폴리펩타이드.
8. 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 항원 결합 부위가 2개의 별도의 폴리펩타이드 쇄 또는 동일한 폴리펩타이드 쇄 상의 VH 및 VL을 포함하는, 항원 결합 폴리펩타이드.
9. 1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서,
양으로 하전된 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 아미노산이:
(1) 서열번호 52;
(2) 서열번호 52 및 서열번호 53;
(3) 서열번호 52 및 서열번호 54;
(4) 서열번호 52 및 서열번호55;
(5) 서열번호 52 및 서열번호 54 및 서열번호 55;
(6) 서열번호 52 및 서열번호 53 및 서열번호 54;
(7) 서열번호 52 및 서열번호 53 및 서열번호 55;
(8) 서열번호 52 및 서열번호 53 및 서열번호 54 및 서열번호 55;
(9) 서열번호 53;
(10) 서열번호 53 및 서열번호 54;
(11) 서열번호 53 및 서열번호 55;
(12) 서열번호 53 및 서열번호 54 및 서열번호 55;
(13) 서열번호 54(LCDR1);
(14) 서열번호 54 및 서열번호 55; 또는
(15) 서열번호 55
에 있는, 항원 결합 폴리펩타이드.
10. 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서,
양으로 하전된 아미노산이 아르기닌(R), 히스티딘(H) 및 리신(K)으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 양으로 하전된 아미노산이 R 또는 K인, 항원 결합 폴리펩타이드.
11. 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서,
중쇄의 30번 위치에 세린(S) 또는 아스파라긴(N)을 포함하고, 위치가 Kabat 넘버링에 따르는, 항원 결합 폴리펩타이드.
12. 1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서,
항원 결합 폴리펩타이드가 하기에서 하기의 추가의 변형을 포함하고
(i) 중쇄 CDR3(HCDR3), 바람직하게는 100a번 위치에서 음으로 하전된 아미노산, 보다 바람직하게는 글루타메이트(E)에 의한 치환; 및/또는
(ii) 경쇄 CDR3(LCDR3), 바람직하게는 93번 위치에서 극성 아미노산, 보다 바람직하게는 아스파라긴(N)에 의한 치환,
여기서 위치가 Kabat 넘버링에 따르는, 항원 결합 폴리펩타이드.
13. 12항에 있어서,
(i) HCDR3이 서열 GSYYDYX1GFVY(서열번호 56)를 가지며, 여기서 X1은 D 또는 E, 바람직하게는 E이고; 및/또는
(ii) LCDR3이 서열 QQWSX1X2X3LT(서열번호 57)를 가지며, 여기서 X1은 S 또는 N이고; X2는 Q, D, H, S, Y, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산이고; X3은 P 또는 A이고; 바람직하게 LCDR3이 서열 QQWSX1NPLT(서열번호 96)를 가지며, 여기서 X1은 S 또는 N, 바람직하게는 S인, 항원 결합 폴리펩타이드.
14. 1항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서,
하기를 포함하는, 항원 결합 폴리펩타이드:
(i) 서열번호 1(BMA031 V36_VH), 서열번호 97(GL1_BM_VH28_HV), 서열번호 98(GL1_BM_VH31_HV), 서열번호 99(HEBE1_H10_HV), 서열번호 100(HEBE1_H66_HV), 및 서열번호 101(HEBE1_H71_HV)에 제시된 VH에 포함된 바와 같은, HFR1, HFR2 및 HFR3, 바람직하게는 여기서 HFR1, HFR2 및 HFR3이 서열번호 1(BMA031 V36_VH)에 제시된 VH에 포함되고; 및/또는
(ii) 서열번호 2(BMA031 V36_VL) 또는 서열번호 102(GL1BMVK43_VL)에 제시된 VL에 포함된 바와 같은 LFR1, LFR2 및 LFR3, 바람직하게는 여기서 LFR1, LFR2 및 LFR3이 서열번호 2(BMA031 V36_VL)에 제시된 VL에 포함되고; 임의로 여기서 항원 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1(BMA031 V36_VH)에 제시된 VH에 포함된 바와 같은 HFR4; 또는 서열번호 2(BMA031 V36_VL)에 제시된 VL에 포함된 바와 같은 LFR4를 추가로 포함한다.
15. 1항 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서,
하기를 포함하는, 항원 결합 폴리펩타이드:
(i) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 HFR1 또는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 HFR1과 적어도 약 60%의 서열 일치성을 갖는 인간 HFR1 서열, 임의로 Kabat 주석에 따른 30번 위치에 치환을 포함한다;
(ii) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 HFR2 또는 서열번호 1과 적어도 약 75%의 서열 일치성을 갖는 인간 HFR2 서열; 및
(iii) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 HFR3 또는 서열번호 1과 적어도 약 55%의 서열 일치성을 갖는 인간 HFR3 서열, 임의로 Kabat 주석에 따른 90번 위치에 치환을 포함한다.
16. 1항 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서,
VL 도메인이 하기를 포함하는, 항원 결합 폴리펩타이드:
(i) 서열번호 2에 제시된 바와 같은 LFR1 또는 서열번호 2와 적어도 약 50% 서열 일치성을 갖는 인간 LFR1 서열;
(ii) 서열번호 2에 제시된 바와 같은 LFR2 또는 서열번호 2와 적어도 약 80% 서열 일치성을 갖는 인간 LFR2 서열; 및
(iii) 서열번호 2에 제시된 바와 같은 LFR3 또는 서열번호 2와 적어도 약 80% 서열 일치성을 갖는 인간 LFR3 서열.
17. 1항 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 HFR4 또는 서열번호 1과 적어도 약 90% 서열 일치성을 갖는 인간 HFR4 서열; 및/또는
(ii) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 LFR4 또는 서열번호 1과 적어도 약 90% 서열 일치성을 갖는 인간 LFR4 서열
을 추가로 포함하는, 항원 결합 폴리펩타이드.
18. 1항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서,
VH가 서열번호 7(VH H90Y); 서열번호 9(VH_T30N_S31R), 서열번호 10(VH_T30S_S31R_Y53R_E100aD), 서열번호 11(VH S31R), 서열번호 12(VH_T30S_Y53R), 서열번호 14(VH N54K H90Y), 서열번호 15(VH_T30N_S31N_Y53R), 서열번호 16(VH_T30N_S31R_V56I), 서열번호 17(VH_S31R_N54K_E100aD), 서열번호 19(VH_T30R), 서열번호 20(VH T30K); 서열번호 21(VH S31K); 서열번호 22(VH_Y53R), 서열번호 23(VH_Y53K), 서열번호 24(VH_N54R), 서열번호 25(VH N54K), 서열번호 29(VH_Y53H), 서열번호 30(VH_S31H), 서열번호 31(VH S31R H90Y), 서열번호 32(VH Y53R H90Y), 서열번호 33(VH N54R H90Y), 및 서열번호 34(VH_E61Q_H90Y)로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 각각 서열번호 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29, 30, 31, 32, 33, 및 34로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 이의 VH 변이체를 포함하고, 여기서 VH 변이체가 서열번호 1에 따른 서열을 갖는 VH와 비교하여 각각의 치환(들)을 유지하는, 항원 결합 폴리펩타이드.
19. 1항 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서,
VL이 서열번호 8(VL S31R S56R), 서열번호 13(VL S31N S56R S93N), 서열번호 18(VL S56R), 서열번호 26(VL_S31R), 서열번호 27(VL_S31K), 및 서열번호 28(VL_S56K)로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 각각 서열번호 8, 13, 18, 26, 27, 및 28로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 이의 VL 변이체를 포함하고, 여기서 VL 변이체가 서열번호 2에 따른 서열을 갖는 VL과 비교하여 각각의 치환(들)을 유지하는, 항원 결합 폴리펩타이드.
20. 1항 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서,
VH 및 VL이 서열번호 7 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 2, 서열번호 10 및 서열번호 2, 서열번호 11 및 서열번호 2, 서열번호 12 및 서열번호 2, 서열번호 11 및 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 2, 서열번호 15 및 서열번호 2, 서열번호 16 및 서열번호 2, 서열번호 17 및 서열번호 2, 서열번호 1 및 서열번호 18, 서열번호 11 및 서열번호 18, 서열번호 11 및 서열번호 8, 서열번호 12 및 서열번호 18, 서열번호 12 및 서열번호 8, 서열번호 14 및 서열번호 18, 서열번호 14 및 서열번호 8, 서열번호 19 및 서열번호 2, 서열번호 20 및 서열번호 2, 서열번호 21 및 서열번호 2, 서열번호 22 및 서열번호 2, 서열번호 23 및 서열번호 2, 서열번호 24 및 서열번호 2, 서열번호 25 및 서열번호 2, 서열번호 1 및 서열번호 26, 서열번호 1 및 서열번호 27, 서열번호 1 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 2, 서열번호: 30 및 서열번호 2, 서열번호 7 및 서열번호 2, 서열번호 31 및 서열번호 2, 서열번호 31 및 서열번호 18, 서열번호 32 및 서열번호 2, 서열번호 33 및 서열번호 2, 서열번호 32 및 서열번호 18, 및 서열번호 7 및 서열번호 18로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 항원 결합 폴리펩타이드.
21. 1항 내지 20항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 중쇄의 30번 위치에서 트레오닌(T)이 아스파라긴(N) 또는 세린(S)으로 치환되고;
b) 중쇄의 31번 위치에서 S가 아스파라긴(N)으로 치환되고;
c) 중쇄의 56번 위치에서 발린(V)이 이소류신(I)으로 치환되고;
d) 중쇄의 100a번 위치에서 글루탐산(E)이 아스파르트산(D)으로 치환되고; 및/또는
e) 경쇄의 31번 위치 및/또는 93번 위치에서 S가 아스파라긴(N)으로 치환된, 항원 결합 폴리펩타이드.
22. 1항 내지 21항 중 어느 한 항에 있어서,
VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ가 공유적으로 또는 비공유적으로 함께 연결된, 항원 결합 폴리펩타이드.
23. 1항 내지 22항 중 어느 한 항에 있어서,
하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 항원 결합 폴리펩타이드:
(i) 추가의 항원 결합 부위;
(ii) 임의로 세포질 신호전달 영역을 포함하는 막관통 영역;
(iii) 진단제; 및/또는
(iv) 치료제.
24. 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 및 제2 항원 결합 부위를 형성하는 제1 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하며, 여기서 제1 폴리펩타이드 쇄가 하기 식으로 나타내는 구조를 갖고:
화학식 I
V1-L1-V2-L2-D1
여기서
V1은 제1 가변 도메인이고;
V2는 제2 가변 도메인이고;
L1 및 L2는 링커이고; L2는 존재하거나 존재하지 않고;
D1은 이량체화 도메인이고 존재하거나 존재하지 않으며;
제2 폴리펩타이드 쇄가 하기 식으로 나타내는 구조를 갖는
항원 결합 폴리펩타이드:
화학식 II
V3-L3-V4-L4-D2
여기서
V3은 제3 가변 도메인이고;
V4는 제4 가변 도메인이고;
L3 및 L4는 링커이고; L4는 존재하거나 존재하지 않고;
D2는 이량체화 도메인이고 존재하거나 존재하지 않으며;
여기서, D1 및 D2는 서로 특이적으로 결합하고, 여기서
V1 또는 V2는 1항의 VH이고 V3 또는 V4는 1항의 VL이고,
V3 또는 V4는 5항의 Vα 또는 Vγ이고 V1 또는 V2는 Vβ 또는 Vδ이거나;
또는
V1 또는 V2는 1항의 VL이고, V3 또는 V4는 1항의 VH이고,
V3 또는 V4는 5항의 Vα 또는 Vγ이고 V1 또는 V2는 Vβ 또는 Vδ이거나;
또는
V1 또는 V2는 1항의 VH이고 V3 또는 V4는 1항의 VL이고,
V3 또는 V4는 5항의 Vβ 또는 Vδ이고 V1 또는 V2는 Vα 또는 Vγ이거나;
또는
V1 또는 V2는 1항의 VL이고, V3 또는 V4는 1항의 VH이고,
V3 또는 V4는 5항의 Vβ 또는 Vδ이고 V1 또는 V2는 Vα 또는 Vγ이다.
25. 24항에 있어서,
(1) V1은 VH이고,
V2는 Vβ 또는 Vδ이고,
V3은 Vα 또는 Vγ이고,
V4는 VL 이고;
(2) V1은 Vβ 또는 Vδ이고,
V2는 VH이고,
V3은 VL이고,
V4는 Vα 또는 Vγ이고,
(3) V1은 Vβ 또는 Vδ이고,
V2는 VL이고,
V3은 VH이고,
V4는 Vα 또는 Vγ이고,
(4) V1은 VL이고,
V2는 Vβ 또는 Vδ이고,
V3은 Vα 또는 Vγ이고,
V4는 VH 이고;
(5) V1은 VH이고,
V2는 Vβ 또는 Vδ이고,
V3은 VL이고,
V4는 Vα 또는 Vγ이고,
(6) V1은 Vβ 또는 Vδ이고,
V2는 VH이고,
V3은 Vα 또는 Vγ이고,
V4는 VL 이고;
(7) V1은 VL이고,
V2는 Vβ 또는 Vδ이고,
V3은 VH이고,
V4는 Vα 또는 Vγ이고,
(8) V1은 Vβ 또는 Vδ이고,
V2는 VL이고,
V3은 Vα 또는 Vγ이고,
V4는 VH이고;
(9) V1은 VH이고,
V2는 VL이고,
V3은 Vα 또는 Vγ이고,
V4는 Vβ 또는 Vδ이고,
(10) V1은 VL이고,
V2는 VH이고,
V3은 Vα 또는 Vγ이고,
V4는 Vβ 또는 Vδ이고,
(11) V1은 VH이고,
V2는 VL이고,
V3은 Vβ 또는 Vδ이고,
V4는 Vα 또는 Vγ이고,
(12) V1은 VL이고,
V2는 VH이고,
V3은 Vβ 또는 Vδ이고,
V4는 Vα 또는 Vγ인,
항원 결합 폴리펩타이드.
26. 24항 또는 25항에 있어서,
(i) D1 및 D2가 Fc 도메인이고;
(ii) L1이 1-30개의 아미노산 길이를 갖고; 및/또는
(iii) L가, 존재하는 경우, 1-30개의 아미노산 길이를 갖고; 및/또는
(iv) L3이 1-30개의 아미노산 길이를 갖고; 및/또는
(v) L4가 존재하고 1-30개의 아미노산 길이를 갖는,
항원 결합 폴리펩타이드.
27. 24항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 서열번호 39에 따른 제1 폴리펩타이드 쇄를 갖고, 서열번호 38에 따른 제2 폴리펩타이드 쇄를 갖거나; 또는
(ii) 서열번호 39에 따른 제1 폴리펩타이드 쇄를 갖고, 서열번호 35에 따른 제2 폴리펩타이드 쇄를 갖는
항원 결합 폴리펩타이드.
28. 1항 내지 26항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 핵산 세트, 또는 상기 핵산 또는 핵산 세트를 포함하는 핵산 벡터.
29. 1항 내지 27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 폴리펩타이드, 또는 28항에 따른 핵산 또는 핵산 세트 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포로서, 여기서
(i) 림프구, 바람직하게는 T 림프구 또는 T 림프구 전구세포, 예를 들어 CD4 또는 CD8 양성 T 세포; 또는
(ii) 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 효모 세포와 같은 재조합 발현용 세포
인, 재조합 숙주 세포.
30. 1항 내지 27항 중 어느 한 항에 따른 항원 폴리펩타이드, 28항에 따른 핵산 또는 핵산 세트 또는 벡터, 또는 29항에 따른 숙주 세포, 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 안정화제(stabilizer) 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
31. 1항 내지 27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 폴리펩타이드의 제조 방법으로서,
(i) 적합한 숙주 세포를 제공하고,
(ii) 1항 내지 22항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 유전자 작제물을 제공하고,
(iii) 상기 유전자 작제물을 상기 적합한 숙주 세포에 도입하고,
(iv) 상기 유전자 작제물을 상기 적합한 숙주 세포에 의해 발현시킴
을 포함하는, 방법
32. 31항에 있어서,
적합한 숙주 세포로부터 항원 결합 폴리펩타이드를 단리 및 정제하고, 임의로, T 세포에서 항원 결합 폴리펩타이드를 재구성하는 것을 추가로 포함하는 방법.
33. 약제에 사용하기 위한, 1항 내지 27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 폴리펩타이드, 28항에 따른 핵산 또는 핵산 세트 또는 벡터, 29항에 따른 숙주 세포, 또는 30항에 따른 약학 조성물.
34. 증식성 질환, 바람직하게는 암의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 1항 내지 27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 폴리펩타이드, 28항에 따른 핵산 또는 핵산 세트 또는 벡터, 29항에 따른 숙주 세포, 또는 30항에 따른 약학 조성물.
35. 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드의 결합을 개선 또는 유지시키고/시키거나 이의 안정성을 개선시키는 방법으로서, 여기서
(1) VH가
(a) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1),
(b) YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(서열번호 53)의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2,
여기서
X1은 A 또는 N이고;
X2 는 E 또는 Q이고; 및/또는
X3은 Q 또는 K이다
(c) HCDR3, 및
(d) 중쇄 프레임워크 영역(HFR) 1-4
를 포함하고;
(2) VL이
(a) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1),
(b) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2,
(c) LCDR3, 및
(d) 경쇄 프레임워크 영역(LFR) 1-4
를 포함하고, 여기서
(i) 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산이 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 및/또는
(ii) 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산이 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 및/또는
(iii) Kabat 넘버링에 따른 HFR1의 30번 위치가 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 및/또는
(iv) Kabat 넘버링에 따른 HFR3의 90번 위치가 티로신(Y) 잔기로 치환되고,
여기서
(1) α/β T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체에 대한 항원 결합 폴리펩타이드의 결합이 모 항원 결합 폴리펩타이드에 비해 증가되거나;
(2) α/β T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체에 대한 항원 결합 폴리펩타이드의 결합이 유지되거나 증가되고 항원 결합 폴리펩타이드의 안정성이 모 항원 결합 폴리펩타이드에 비해 증가되거나; 또는
(3) 항원 결합 폴리펩타이드의 안정성이 모 항원 결합 폴리펩타이드에 비해 증가되는
방법.
36. 35항에 있어서,
(i) 하기 중쇄 위치 31, 53 및 54번 중 적어도 하나가 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고; 및/또는
(ii) 하기 경쇄 위치 31 및 56 중 적어도 하나가 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 위치가 Kabat 넘버링에 따르는
방법.
37. 35항에 있어서,
치환(들)이 중쇄의 30, 31, 53 및/또는 54번 위치에서 양으로 하전된 아미노산에 의한 치환, 경쇄에서 31 및/또는 56번 위치에서 양으로 하전된 아미노산에 의한 치환, 및/또는 중쇄에서 90번 위치에서 티로신(Y)의 치환을 포함하지 않는 모 항원 결합 폴리펩타이드에 비해 항원 결합 폴리펩타이드의 안정성 및/또는 결합을 증가시키는 방법.
38. 1항 내지 37항 중 어느 한 항에 있어서,
Kabat 넘버링에 따른 HFR3의 90번 위치에서 티로신(Y) 잔기에 의한 치환이 모 항원 결합 폴리펩타이드에 비해 안정성을 증가시키는 방법.
39. α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포를 1항 내지 27항 중 어느 하나에 따른 항원 결합 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계를 포함하는, α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포의 검출, 결정 또는 농축 방법.
40. 1항 내지 27항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 키트.
"약"이라는 용어는 본 발명의 맥락에서 및 특정의 인용된 수치를 참조하여 사용될 때 값을 지칭하며, 상기 값은 인용된 값으로부터 5% 이하, 4.5%, 4.0%, 3.5%, 3.0%, 2.5%, 2.0%, 1.5%, 1.0%, 또는 0.5% 이하까지 변할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, "약 100"이라는 표현은 95와 105 및 그 사이의 모든 값(예를 들어 95.0, 95.5, 96.0, 96.5, 97.0, 97.5, 98.0, 98.5, 99.0, 99.5, 100.5, 101.0, 101.5, 102.0, 102.5, 103.0, 103.5, 104.0, 104.5 및 105.0)을 포함한다.
본 출원 전반에 걸쳐, "및/또는"이라는 용어는 그것이 연결하는 하나 이상의 경우가 발생할 수 있다는 것을 포괄하는 것으로 해석되는 문법적 접속사이다. 예를 들어, "이러한 고유 서열 단백질은 표준 재조합 및/또는 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다"라는 표현은 고유 서열 단백질이 표준 재조합 및 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있거나 고유 서열 단백질이 표준 재조합 방법 또는 천연 서열을 사용하여 제조될 수 있음을 나타낸다. 단백질은 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
또한, 본 출원 전체에 걸쳐, "포함하는"이라는 용어는 구체적으로 언급된 모든 특징뿐만 아니라 임의적, 추가적, 불특정 특징을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 사용된 "포함하는"이라는 용어의 사용은 또한 구체적으로 언급된 특징 이외의 특징이 존재하지 않는(즉, "로 이루어지는") 실시양태를 개시한다.
또한 단수형 표현은 복수형을 배제하지 않는다. 특정 수단이 서로 다른 종속항에 인용되어 있다는 단순한 사실만으로는 이러한 수단의 조합이 유리하게 사용될 수 없음을 의미하지 않는다.
하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 첨부된 청구범위에 의해 표시된 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1
증가된 안정성 및/또는 증가된 결합 친화도를 갖는 항원 결합 폴리펩타이드를 제공하기 위해, 항체 BMA031(V36)(TPP-1374, Fab 단편)의 가변 쇄를 scFv(서열번호 44)로 전환시키고 상응하는 DNA를 합성하였다. CDR의 돌연변이를 변성 프라이머를 사용하여 중첩 연장 PCR에 의해 가변 중쇄의 28 내지 31, 33, 50, 52, 53, 54, 56, 58 및 96 내지 100b번 위치 및/또는 가변 경쇄의 27, 29, 49, 50, 53, 55, 56, 91 내지 94 및 96번 위치에 도입시켰다. 생성된 DNA 스트링을 pHAL을 기반으로 하는 파지미드 벡터에 결찰시키고 본질적으로 문헌[Unkauf et al. 2018]에 기재된 바와 같이 scFv-함유 파지 생성을 위해 에스케리키아 콜라이(E.coli) TG1에 형질전환시켰다. 생성된 파지 입자를 본질적으로 문헌[Wenzel et al. 2020]에 기재된 바와 같이, 먼저 α/β TCR/CD3 음성 Jurkat T 세포(J.RT3T3.5)에 의한 음성 선택 단계에 이어서, 2회의 선택 라운드에 걸쳐 α/β TCR/CD3 양성 Jurkat T 세포(Jurkat, 클론 E6-1)에 의한 양성 선택을 포함한 선택 전략에 사용하였다. α/β TCR/CD3 음성 Jurkat T 세포 J.RT3T3.5는 방사선 조사를 통해 Jurkat 세포로부터 유래되며, 다른 표면 단백질의 발현은 구별할 수 없는 수준으로 유지되는 반면 그의 α/β TCR/CD3 복합체의 제시가 상실된다(문헌[Weiss and Stobo 1984]). TCR 베타 쇄가 전달되고 또한 결과적으로 TCR/CD3 복합체가 표면에서 발현되면, J.RT3T3.5 세포주는 그의 기능성을 회복한다(문헌[Ohashi et al . 1985]). 따라서, 이 세포주는 α/β TCR/CD3 복합체 결합제의 음성 선택을 위한 좋은 도구로 간주되었다. 가용성 scFv 분자의 유세포 분석을 위해 최종 클론을 이 콜라이 XL1에 형질도입시켰다. 모든 클론을, Jurkat 세포주 둘 다에의 결합에 대해 분석하였으며 특이성이 유지된(Jurkat, 클론 E6-1에는 결합하지만 J.RT3T3.5에는 결합하지 않음, 도 1) 11개의 독특한 결합-개선된 클론(서열번호 45 내지 55)을 결합 특성의 추가적인 조사뿐만 아니라 안정성 평가를 위해 Fab 포맷(본원에서는 또한 Fab 단편으로서 지칭됨)으로 전환시켰다. Fab 단편은 다이설파이드 가교를 통해 연결된 각각의 VL-CL 및 VH-CH1을 포함하였다. CH1의 아미노산 서열은 서열번호 3에 나타낸다. CL의 아미노산 서열은 서열번호 4에 나타낸다. 모 항원 결합 폴리펩타이드의 예시적인 Fab 단편(TPP1374 - BMA031(V36)의 Fab 단편)은 서열번호 5 및 6에 나타낸다. Fab 포맷에서 하기 시험된 항원 결합 폴리펩타이드는 또한 서열번호 5 및 6에 나타낸 CL 및 CH1을 포함하였다. 또한, 추가적인 His-태그를 Fab 단편의 정제 및 검출을 위해 CH1의 C-말단에 추가시켰다. 즉, 시험된 치환을 예시적인 모 항체에 도입시켰다. 삽입된 CDR 돌연변이(Kabat에 따른 VH의 30번 위치 포함) 외에도, 계획되지 않은 프레임워크 돌연변이, 즉 중쇄 프레임워크 3(HFR3)의 H90Y가 또한 scFv-파지 라이브러리로부터 선택되었다. 아미노산 잔기의 넘버링은 달리 명시하지 않는 한 Kabat 넘버링을 따른다. 선택된 가변 도메인을 본질적으로 문헌[Jger et al. 2013]에 기재된 바와 같이, pCSE 기반 Fab 발현 벡터에 셔플링 및 클로닝하고 일시적 가용성 단백질 발현(TPP-1357 내지 TPP-1373)을 위해 HEK293 세포에 형질감염시켰으며, 항상 예시적인 모 항체(TPP-1374)가 동반되었다. 단백질을 본질적으로 문헌[Siegemund et al. 2014]에 기재된 바와 같이, 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피를 통해 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다.
결합 특성을 상술한 α/β TCR/CD3-양성(및 γ/δ 음성) 및 -음성 Jurkat 세포주를 사용하고 일련의 정제된 Fab 단편의 적정(농도 10 ㎍/㎖에서 10 ng/㎖까지 반 로그 단계로)을 적용하여 유세포 분석 결합 분석을 통해 조사하였다. 간략하게, 모든 세포분석 단계를 FACS 완충액(PBS, 2 mM EDTA, 5% FCS)에서 수행하였다. 항원 음성 J.RT3T3.5 세포를 매뉴얼에 따라 CFSE CellTrace(ThermoFisher, C34554)로 표지하고 항원 양성 Jurkat, 클론 E6-1 세포와 1:1 비로 혼합하였다. 그 후, 세포를 300 rcf에서 원심분리를 통해 FACS 완충액으로 1회 세척하였다. 일련의 관심 항체 Fab의 희석액(100 ㎕/웰 및 상기에 표시된 농도)을 FACS 완충액 중에서 얼음상에서 15분 동안 세포 혼합물(100,000개 세포/웰)과 함께 배양하였다. 결합되지 않은 항체를, FACS 완충액을 사용한 1회 세척 단계로 세척하였다. 결합을 검출하기 위해, 항-HIS-태그 Alexa647-표지된 항체(Biolegend, 652513)를 FACS 완충액 중에서 얼음(암실에서)에서 15분 동안 1:2000 희석(50 ㎕/웰)으로 사용하였다. 결합되지 않은 2차 염색 항체를 300rcf에서 원심분리를 통해 FACS 완충액을 사용한 3회 세척 단계로 제거하였다. 세척 후, 세포를 생/사 염색을 위해 1x 프로피디움요오다이드(Roth, CN74.1)(40 ㎕/웰)를 함유하는 FACS 완충액에 재현탁하였다. 마지막으로, 세포의 염색을 유세포 분석기(Intellicyt iQue Screener(Sartorius AG) 또는 CytoFLEX (Beckmann Coulter, 2089495-01))에서 측정하고 MFI(중심 형광 강도) 값을 비교하였다. 항원 양성(CFSE CellTrace 음성 염색)인 살아있는 세포(프로피디움요오다이드 음성 염색)에 대해, MFI 및 로그 농도 값을 사용하여 곡선 아래 결합 면적(결합 AUC)을 계산하였다. 선택된 모든 변이체는 예시적인 모 항체 TPP-1374에 비해 증가된 결합 AUC 값을 나타낸다(도 2). 동시에 TCR/CD3 음성 Jurkat 세포에 대해 동일한 분석을 수행하여 표적 특이성을 다루었다. 모든 Fab 단편은 결합을 나타내지 않았다(도 3).
Fab 단편의 안정성을, Prometheus NT.48 시스템을 사용하여 nanoDSF로 조사하고, 단백질의 50%가 분해될 때 Fab 단편의 융점을 계산하였다(표 3). 모든 측정을, 50 ㎍/㎖의 Fab 농도 및 1℃/분의 가열 램프 속도로 PBS pH7.4에서 수행하였다. 용융 온도의 평가를 PR.StabilityAnalysis(v. PR.StabilityAnalysis_x64_1.1.0.11077)을 통해 수행하였다. 델타 Tm 값은 한 실험 내에서 실행된 변이체에 대해서만 계산되었다. 71.8℃에서 모 BMA031(V36) Fab 단편은 이미 높은 안정성을 나타냈으며 TPP-1366을 제외하고 다른 모든 단백질은 70℃의 용융 온도 이상에서 안정성을 유지할 수 있었다. 다양한 치환은 BMA031(V36) Fab 단편에 비해 안정성을 더욱 개선시켰다; 표 3 참조. 놀랍게도, 중쇄의 돌연변이 H90Y(Kabat 넘버링에 따름)는 75℃를 훨씬 초과하는 이동으로 온도 안정성에서 엄청난 증가를 제공하였다(표 3 참조).
[표 3]
성숙 Fab 분자의 용융 온도. 정제된 Fab 단편의 용융 온도는 nanoDSF에 의해 다루어졌다. TPP-1374가 참조 분자로 제공되었다.
실시예 2
실시예 1에서 선택된 치환의 조합을 예시적인 모 항체(TPP-1374)에 도입하였다. 중쇄 및 경쇄의 CDR 1 및 2 내의 여러 위치가 양으로 하전된 아미노산(염기성 아미노산)으로 치환되었다. 첫 번째 실험에서는 쇄당 단지 하나의 염기성 아미노산만 적용하였다. 또한, 프레임워크 돌연변이 H90Y를 선택된 변이체에 도입하였다. Fab 단편 TPP-1360, TPP-1363, TPP-1372, TPP-1374 내지 TPP-1384 및 TPP-1387 내지 TPP-1393을 생성시키고, 정제하고, 결합 AUC 및 용융 온도에 대해 실시예 1에 설명된 바와 같이 분석하였다. 또한, MFI를 비선형 4점 곡선 피팅으로 피팅하여 결합 EC50을 조사하였다; 도 6을 참조하시오. 중쇄의 30번 위치의 염기성 아미노산(예를 들어, R 또는 K)에 의한 치환으로, 참조 BMA031(V36) Fab(TPP-1374)와 비교하여 표적 보유 Jurkat, 클론 E6-1 세포에 대한 결합 EC50이 개선되었다(표 4, 표 7, 도 5). 아르기닌 또는 리신과 함께 중쇄의 31번 위치의 세린 치환은 모 BMA031(V36) Fab와 비교하여 시험된 모든 변이체에서 결합 EC50을 개선시켰다(표 4, 표 6, 표 4, 도 5). 중쇄의 54번 위치에서 교환된 아스파라긴 잔기를 갖는 시험된 모든 변이체는 BMA031(V36) Fab에 비해 개선된 결합 특성을 나타내었다(표 4, 표 6, 표 7, 도 5).
중쇄의 53번 위치에서의 아르기닌 치환에 의한 티로신의 대체는 BMA031(V36) Fab에 비해 결합 AUC를 개선시켰다(표 4 및 6).
경쇄에서, 56번 위치에서 양전하에 의한 대체는 결합을 강화시켰다(표 4, 표 7, 도 5).
경쇄의 31번 위치에서 양전하에 의한 세린의 대체는 결합을 감소시키는 동시에 안정성을 증가시켰다(표 4, 도 5).
뜻밖에도, 중쇄에 H90Y를 도입하면 용융 온도가 최소 75℃까지 3℃ 이상 증가하였다(단, VH_N54K_H90Y_VL_S56R(TPP-1372)은 용융 온도를 2.8℃까지 증가시켰다). 예시적인 Fab 단편 VH_H90Y VL_S31R_S56R 및 VH_N54K_H90Y_VL_S31R_S56R은 용융 온도를 심지어 4℃ 이상 증가시켰다(표 4와 표 5, 표 6, 도 5를 비교하시오).
또한, H90Y와 중쇄의 31, 53 및 54번 위치의 아르기닌 치환과의 조합(TPP-1388, TPP-1390 및 TPP-1391)은 결합 AUC에 관한 상승작용 효과를 생성시킨다. AUC 결합에 있어서 이러한 상승작용 효과는 또한 경쇄의 56번 위치의 아르기닌과 분자 VH_S31R 및 VH_Y53R과의 추가 조합(TPP-1389 및 TPP-1392)에 대해서도 발견되었으며, 그 결과 가장 높은 결합 AUC 값이 발생하였다(표 6, 도 5). 이러한 단일 돌연변이 조합의 결합에 대한 엄청난 효과는 개선된 결합 곡선 및 EC50 값으로도 설명될 수 있다(표 7, 도 6).
Fab 단편의 특이성은 실시예 1에서와 같이 J.RT3T3.5 세포의 유세포 분석에 의해 다시 다루어졌다. 조사된 단백질 중 어느 것도 이 TCR/CD3 음성 세포주에 대해 어떠한 교차 반응성도 나타내지 않았지만, 표적 세포주에 대한 결합이 모든 변이체에 존재하였다(도 4).
[표 4]
성숙 Fab 분자(CDR 돌연변이만)의 특징. α/β TCR/CD3 양성 Jurkat 세포(클론 E6-1)에 대한 정제된 Fab 단편의 결합을 10 ㎍/㎖ 내지 10 ng/㎖ 범위의 일련의 적정에서 조사하였다. 곡선 아래 면적을 MFI 값 및 상응하는 로그 농도에 대해 계산하였다. VH_wt_VL_wt(TPP-1374)와 비교된 결합 AUC의 증가 % 및 용융 온도의 차이를 나타낸다.
[표 5]
성숙 Fab 분자(중쇄 프레임워크 돌연변이 H90Y를 포함한 변이체)의 특징. α/β TCR/CD3 양성 Jurkat 세포(클론 E6-1)에 대한 정제된 Fab 단편의 결합을 10 ㎍/㎖ 내지 10 ng/㎖ 범위의 일련의 적정에서 조사하였다. 곡선 아래 면적을 MFI 값 및 상응하는 로그 농도에 대해 계산하였다. VH_wt_VL_wt(TPP-1374)와 비교된 결합 AUC의 증가 % 및 용융 온도의 차이를 나타낸다.
[표 6]
성숙 Fab 분자(특정 돌연변이의 직접 비교)의 특징. α/β TCR/CD3 양성 Jurkat 세포(클론 E6-1)에 대한 정제된 Fab 단편의 결합을 10 ㎍/㎖ 내지 10 ng/㎖ 범위의 일련의 적정에서 조사하였다. 곡선 아래 면적을 MFI 값 및 상응하는 로그 농도에 대해 계산하였다. VH_wt_VL_wt(TPP-1374)와 비교된 결합 AUC의 증가 % 및 용융 온도의 차이를 나타낸다.
[표 7]
성숙 Fab 분자의 결합 EC50. α/β TCR/CD3 양성 Jurkat 세포(클론 E6-1)에 대한 정제된 Fab 단편의 결합을 10 ㎍/㎖ 내지 10 ng/㎖ 범위의 일련의 적정에서 조사하였다. 중간 형광 강도(MFI)의 EC50을 계산하고 VH_wt_VL_wt(TPP-1374)와 비교된 감소 배수를 나타낸다.
실시예 3: 선택된 TCER 변이체(TPP-226(PPB-1156), TPP-894(PPB-1155), TPP-879(PPB-1152))
변형된 BMA031 분자의 관찰된 이로운 효과가 이중특이성 항원 결합 폴리펩타이드의 특성도 개선하는지 여부를 조사하기 위해, 본원에서 제공된 변형된 BMA031 분자를 포함하는 TCER® 분자를 구성하였다. 따라서, BMA031(V36) 및 V알파 및 V베타의 최적화된 변이체로부터 유래된 VH 및 VL을 암호화하는 DNA 서열뿐만 아니라 링커를 암호화하는 서열을 유전자 합성을 통하여 획득하였다. 재조합 단백질의 발현을 위한 벡터를 HCMV 유래 프로모터 요소인 pUC19 유도체에 의해 조절되는 모노-시스트론으로서 설계하였다. 플라스미드 DNA를 표준 배양 방법에 따라 이 콜라이에서 증폭시킨 후 시판되는 키트(Macherey & Nagel)를 사용하여 정제하였다. 정제된 플라스미드 DNA를 CHO 세포의 일시적 형질감염에 사용하였다. 형질감염된 CHO-세포를 32℃ 내지 37℃에서 10 내지 11일 동안 배양하였다. 순화된 세포 상등액을 Sartoclear Dynamics® Lab Filter Aid(Sartorius)를 사용하여 여과(0.22 ㎛)에 의해 제거하였다. 이중특이성 분자를, 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피를 인-라인으로 수행하도록 장착된 Akta Pure 25 L FPLC 시스템(GE Lifesciences)을 사용하여 정제하였다. 친화성 크로마토그래피를 표준 친화성 크로마토그래피 프로토콜에 따라 단백질 L 컬럼(GE Lifesciences)에서 수행하였다. 고순도 단량체 단백질을 수득하기 위해 표준 프로토콜에 따라 Superdex 200 pg 16/600 컬럼(GE Lifesciences)을 사용하여 친화성 컬럼으로부터 용출(pH 2.8)한 직후 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 단백질 농도를 예측된 단백질 서열에 따라 계산된 흡광 계수를 사용하여 NanoDrop 시스템(Thermo Scientific)에서 결정하였다. 필요한 경우 Vivaspin 장치(Sartorius)를 사용하여 농도를 조절하였다. 마지막으로, 정제된 분자를 2-8℃의 온도에서 약 1 ㎎/㎖의 농도로 인산염 완충 식염수에 보관하였다. 정제된 이중특이성 분자의 품질을 Vanquish uHPLC 시스템 내에서 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM 인산나트륨 pH 6.8에서 실행되는 MabPac SEC-1 컬럼(5 ㎛, 4x300 ㎜)에서 HPLC-SEC에 의해 조절하였다. 개선된 BMA031 변이체의 효능을 LDH 방출 분석에서 평가하였다. 따라서 세포 표면에 다양한 수준의 표적 pHLA를 나타내는 종양 세포주 뿐만 아니라 표적 pHLA-음성 종양 세포주를, 상승하는 농도의 TCER 분자의 존재 하에서 건강한 HLA-A*02 양성 공여자(E:T = 10: 1)로부터 유래한 PBMC에 대한 표적으로서 사용하였다. TCER-유도된 세포용해를, 방출된 LDH의 측정에 의해 48시간 후에 정량화하였다. 용량-반응 곡선의 EC50 값을 비선형 4점 곡선 피팅을 사용하여 계산하였다. 2명의 독립적인 공여자의 PBMC를 사용한 2개의 독립적인 분석의 결과를 각각 도 7 및 도 8에 나타낸다. 각각의 비선형 곡선 핏의 계산된 EC50 값이 표 8에 요약되어 있다. 이러한 결과는 TCER® 스캐폴드 내에서 변형된 BMA031 분자(TPP-879, TPP-894)의 사용이, BMA031(V36)의 서열번호 1에 따른 VH 및 서열번호 2에 따른 VL을 포함하는 TPP-226과 비교하여 표적 pHLA 양성 종양 세포주의 T 세포 매개된 사멸의 효능을 증가시킨다는 것을 입증한다. 이들 결과는 또한 최적화된 모집 도메인에 의해 유도된 표적 pHLA-음성 종양 세포주 T98G에 대한 T 세포 매개된 세포독성의 증가가 없거나 단지 미미하게 증가함을 나타낸다.
[표 8]
TCER 분자에 의해 유도된 T 세포 매개된 세포독성의 EC50 값 요약
예시적인 참고문헌을 본원에 제공하며, 이들 참고문헌은 내용 전체가 본원에 포함된다.
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Figure pct00019
SEQUENCE LISTING <110> Immatics Biotechnologies GmbH <120> BMA031 antigen binding polypeptides <130> 1017-43 PCT <140> PCT/EP2022/062018 <141> 2022-05-04 <150> EP 21172352.3 <151> 2021-05-05 <150> US 63/184,698 <151> 2021-05-05 <160> 112 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable heavy chain of BMA031 (V36) <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 Chothia <400> 62 Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 1 5 <210> 63 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 Chothia <400> 63 Asn Pro Tyr Asn Asp Val 1 5 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 Kabat <400> 64 Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val Tyr 1 5 10 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 Kabat <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is an amino acid selected from the group consisting of Q, D, H, S, Y, A and N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is P or A <400> 65 Gln Gln Trp Ser Ser Xaa Xaa Leu Thr 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 Kabat <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is P or A <400> 66 Gln Gln Trp Ser Xaa Asn Xaa Leu Thr 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 Kabat <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is an amino acid selected from the group consisting of Q, D, H, S, Y, A and N <400> 67 Gln Gln Trp Ser Xaa Xaa Pro Leu Thr 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 68 Gln Gln Trp Ser Ser Gln Pro Leu Thr 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 69 Gln Gln Trp Ser Ser Asp Pro Leu Thr 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 70 Gln Gln Trp Ser Ser His Pro Leu Thr 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 71 Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 72 Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 73 Gln Gln Trp Ser Ser Ala Pro Leu Thr 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 74 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 75 Gln Gln Trp Ser Ser Gln Ala Leu Thr 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 76 Gln Gln Trp Ser Ser Asp Ala Leu Thr 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 77 Gln Gln Trp Ser Ser His Ala Leu Thr 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 78 Gln Gln Trp Ser Ser Ser Ala Leu Thr 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 79 Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Ala Leu Thr 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 80 Gln Gln Trp Ser Ser Ala Ala Leu Thr 1 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 81 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Ala Leu Thr 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 82 Gln Gln Trp Ser Asn Gln Pro Leu Thr 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 83 Gln Gln Trp Asn Ser Asp Pro Leu Thr 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 84 Gln Gln Trp Asn Ser His Pro Leu Thr 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QQWNSSPLT <400> 85 Gln Gln Trp Asn Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 86 Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 87 Gln Gln Trp Asn Ser Ala Pro Leu Thr 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 88 Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 89 Gln Gln Trp Ser Asn Gln Ala Leu Thr 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 90 Gln Gln Trp Asn Ser Asp Ala Leu Thr 1 5 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 91 Gln Gln Trp Asn Ser His Ala Leu Thr 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 92 Gln Gln Trp Asn Ser Ser Ala Leu Thr 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 93 Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Ala Leu Thr 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 94 Gln Gln Trp Asn Ser Ala Ala Leu Thr 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 95 Gln Gln Trp Asn Ser Asn Ala Leu Thr 1 5 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is S or N <400> 96 Gln Gln Trp Ser Xaa Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 97 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GL1_BM_VH28_HV <400> 97 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 98 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GL1_BM_VH31_HV <400> 98 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 99 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HEBE1_H10_HV <400> 99 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 100 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HEBE1_H66_HV <400> 100 Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 101 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HEBE1_H71_HV <400> 101 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 102 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GL1BMVK43_VL <400> 102 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 103 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HFR1 <400> 103 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr 20 25 30 <210> 104 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HFR2 <400> 104 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 105 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HFR3 <400> 105 Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 106 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HFR4 <400> 106 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 107 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LFR1 <400> 107 Gln Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 108 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LFR2 <400> 108 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 109 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LFR3 <400> 109 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 110 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LFR4 <400> 110 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 111 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc hole mutant <400> 111 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80 Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro 225 <210> 112 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc knob mutant <400> 112 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80 Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro 225

Claims (15)

  1. 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드로서,
    (1) VH가
    (a) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1),
    (b) YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(서열번호 53)의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2
    [이때,
    X1은 A 또는 N이고/이거나;
    X2 는 E 또는 Q이고/이거나;
    X3은 Q 또는 K이다],
    (c) HCDR3, 및
    (d) 중쇄 프레임워크 영역(HFR) 1 내지 4
    를 포함하고;
    (2) VL이
    (a) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1),
    (b) 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2,
    (c) LCDR3, 및
    (d) 경쇄 프레임워크 영역(LFR) 1 내지 4
    를 포함하고,
    (i) 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산이 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고/되거나;
    (ii) 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산이 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고/되거나;
    (iii) 카밧(Kabat) 넘버링에 따른 HFR1의 30번 위치가 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고/되거나;
    (iv) 카밧 넘버링에 따른 HFR3의 90번 위치가 티로신(Y) 잔기로 치환되고,
    항원 결합 폴리펩타이드가 α/β T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체에 특이적으로 결합하는,
    항원 결합 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    양으로 하전된 아미노산이
    (i) 중쇄의 31, 53 및 54번 위치 중 하나 이상; 및/또는
    (ii) 경쇄의 31 및 56번 위치 중 하나 이상
    에 있고, 상기 위치가 카밧 넘버링에 따르는,
    항원 결합 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) 중쇄에서 양으로 하전된 아미노산이
    (i) 30번 위치에서 R, K 또는 H이고/이거나;
    (ii) 31번 위치에서 R, K 또는 H이고/이거나;
    (iii) 53번 위치에서 R, K 또는 H이고/이거나;
    (iv) 54번 위치에서 R 또는 K이고/이거나;
    (b) 경쇄에서 양으로 하전된 아미노산이
    (i) 31번 위치에서 R 또는 K이고/이거나;
    (ii) 56번 위치에서 R 또는 K인,
    항원 결합 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    VH 및 VL이 제1 결합 부위를 형성하고, 항원 결합 폴리펩타이드가 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 항원 결합 폴리펩타이드.
  5. 제4항에 있어서,
    제2 항원 결합 부위가 적어도 하기 가변 영역을 포함하는, 항원 결합 폴리펩타이드:
    (i) TCR의 α(Vα) 및/또는 β(Vβ) 쇄;
    (ii) TCR의 γ(Vγ) 및/또는 δ(Vδ) 쇄; 또는
    (iii) 제1항에 정의된 VL과 상이한 경쇄 및/또는 제1항에 정의된 VH와 상이한 중쇄.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    양으로 하전된 아미노산이 아르기닌(R), 히스티딘(H) 및 리신(K)으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 양으로 하전된 아미노산이 R 또는 K인, 항원 결합 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 중쇄의 30번 위치에서 트레오닌(T)이 아스파라긴(N) 또는 세린(S)으로 치환되고/되거나;
    (ii) 중쇄의 31번 위치에서 S가 N으로 치환되고/되거나;
    (iii) 중쇄의 56번 위치에서 발린(V)이 이소류신(I)으로 치환되고/되거나;
    (iv) 중쇄의 100a번 위치에서 글루탐산(E)이 아스파르트산(D)으로 치환되고/되거나;
    (v) 경쇄의 31번 위치 및/또는 93번 위치에서 S가 N으로 치환된,
    항원 결합 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 핵산 세트, 또는 상기 핵산을 포함하는 핵산 벡터.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 폴리펩타이드, 또는 제8항에 따른 핵산 또는 핵산 세트 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포로서,
    (i) 림프구, 바람직하게는 T 림프구 또는 T 림프구 전구세포(progenitor cell), 예를 들어 CD4 또는 CD8 양성 T 세포; 또는
    (ii) 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 효모 세포와 같은 재조합 발현용 세포인
    재조합 숙주 세포.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항원 폴리펩타이드, 제8항에 따른 핵산 또는 핵산 세트 또는 벡터, 또는 제9항에 따른 숙주 세포; 및
    약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 안정화제 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 폴리펩타이드의 제조 방법으로서,
    (i) 적합한 숙주 세포를 제공하는 단계;
    (ii) 항원을 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 유전자 작제물을 제공하는 단계;
    (iii) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 결합시키는 단계;
    (iv) 상기 유전자 작제물을 상기 적합한 숙주 세포에 도입하는 단계; 및
    (v) 상기 유전자 작제물을 상기 적합한 숙주 세포에 의해 발현시키는 단계
    를 포함하는 방법
  12. 의학 분야에 사용하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 폴리펩타이드, 제8항에 따른 핵산 또는 핵산 세트 또는 벡터, 제9항에 따른 숙주 세포, 또는 제10항에 따른 약학 조성물.
  13. 증식성 질환, 바람직하게는 암의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 폴리펩타이드, 제8항에 따른 핵산 또는 벡터, 제9항에 따른 숙주 세포, 또는 제10항에 따른 약학 조성물.
  14. 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드의 결합을 개선 또는 유지시키고/시키거나 이의 안정성을 개선시키는 방법으로서,
    (1) VH가
    (a) 서열번호 52(SYVMH)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1),
    (b) YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(서열번호 53)의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2
    [이때,
    X1은 A 또는 N이고/이거나;
    X2 는 E 또는 Q이고/이거나;
    X3은 Q 또는 K이다],
    (c) HCDR3, 및
    (d) 중쇄 프레임워크 영역(HFR) 1 내지 4
    를 포함하고;
    (2) VL이
    (a) 서열번호 54(SATSSVSYMH)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1),
    (b) 서열번호 55(DTSKLAS)의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2,
    (c) LCDR3, 및
    (d) 경쇄 프레임워크 영역(LFR) 1 내지 4
    를 포함하고,
    (i) 양으로 하전되지 않은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2의 적어도 하나의 아미노산이 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고/되거나;
    (ii) 양으로 하전되지 않은 서열번호 54의 아미노산을 포함하는 LCDR1의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2의 적어도 하나의 아미노산이 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고/되거나;
    (iii) 카밧 넘버링에 따른 HFR1의 30번 위치가 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고/되거나;
    (iv) 카밧 넘버링에 따른 HFR3의 90번 위치가 티로신(Y) 잔기로 치환되고,
    (1) α/β T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체에 대한 항원 결합 폴리펩타이드의 결합이 모 항원 결합 폴리펩타이드에 비해 증가되거나;
    (2) α/β T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체에 대한 항원 결합 폴리펩타이드의 결합이 유지되거나 증가되고, 항원 결합 폴리펩타이드의 안정성이 모 항원 결합 폴리펩타이드에 비해 증가되거나;
    (3) 항원 결합 폴리펩타이드의 안정성이 모 항원 결합 폴리펩타이드에 비해 증가되는,
    방법.
  15. α/β TCR/CD3 복합체를 발현하는 T 세포를 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 세포를 검출하거나, 결정하거나, 농축시키는 방법.
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