CN117255805A - Bma031抗原结合多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及特异性结合α/βT细胞受体(TCR)/分化簇3(CD3)复合物的抗原结合多肽。本发明进一步提供了一种包含编码所述抗原结合多肽的序列的核酸或一种包含所述核酸的载体。本发明进一步涉及包含所述抗原结合多肽的重组宿主细胞，以及包含所述抗原结合多肽、所述核酸、所述载体和/或所述宿主细胞的药物组合物。本发明进一步涉及所述抗原结合多肽、所述核酸、所述载体、所述宿主细胞或所述药物组合物，用于医学，特别是用于诊断、预防和/或治疗增殖性疾病。本发明还涉及一种用于改善或维持所述抗原结合多肽的结合和/或改善所述抗原结合多肽的稳定性的方法。本发明还涉及一种用于检测、确定或富集表达所述α/βTCR/CD3复合物的T细胞的方法。
Description
本发明涉及特异性结合α/βT细胞受体(TCR)/分化簇3(CD3)复合物的抗原结合多肽。本发明进一步提供了一种包含编码所述抗原结合多肽的序列的核酸或一种包含所述核酸的载体。本发明进一步涉及包含所述抗原结合多肽的重组宿主细胞；包含所述抗原结合多肽、所述核酸、所述载体和/或所述宿主细胞的药物组合物。本发明进一步涉及所述抗原结合多肽、所述核酸、所述载体、所述宿主细胞或所述药物组合物，用于医学，特别是用于诊断、预防和/或治疗增殖性疾病。本发明还涉及一种用于改善或维持所述抗原结合多肽的结合和/或改善所述抗原结合多肽的稳定性的方法。本发明还涉及一种用于检测、确定或富集表达所述α/βTCR/CD3复合物的T细胞的方法。
两种类型的T淋巴细胞可以基于以下两种类型的相应TCR的表达来区分：α/βTCR或γ/δTCR。α/βTCR在大多数人T淋巴细胞(约>80％)上表达，而γ/δTCR以<20％的程度在外周淋巴器官和血液中以及在大多数上皮组织中的人T细胞上表达。α/βTCR识别与主要组织相容性复合物分子(MHC；Borst等人；Human Immunology,29,175-188,1990)结合的外来抗原。鼠抗体BMA031针对人α/βTCR/CD3复合物(Borst等人,1990)。对α/βTCR具有特异性的人源化抗体基于鼠单克隆抗体BMA031产生；Shearman等人,The Journal of Immunology；第147卷,4366-4373,第12期；1991，或EP 0403156A1。然而，与鼠BMA031相比，人源化形式的BMA031(诸如EUCIV3)显示出较低的结合；Shearman等人,1991。现有技术中还披露了其他人源化BMA031变体，并且显示诱导细胞介导的细胞溶解(Shearman等人；1990)。因此，人源化BMA031分子可以提供相当大的医学潜力来改善疾病和障碍(例如，增殖性疾病)的免疫疗法。然而，迄今为止，人源化BMA031变体存在低的结合力和/或差的稳定性。
因此，本领域需要有效结合并且具有良好稳定性的人源化BMA031变体。
本发明提供了抗原结合多肽，所述抗原结合多肽衍生自BMA031并且特异性结合α/βTCR/CD3复合物。所述抗原结合多肽包含本文提供的取代。特别地，所述抗原结合多肽包含一个或多个被带正电荷的氨基酸的本发明取代
(i)在所述重链的以下位置中的一个或多个处：30、31、53和54；和/或
(ii)在所述轻链的以下位置中的一个或多个处：31和56，并且其中所述位置是根据Kabat编号的。此外，本文提供的抗原结合多肽包含根据Kabat编号的位置90处(例如，位置90处组氨酸(H))被酪氨酸(Y)的本发明取代。本发明的抗原结合多肽适用于通过利用抗体工程化方法以各种不同的抗体形式使用，所述抗体工程化方法诸如尤其是Brinkmann等人；MABS2017,第9卷,第2期,182-212中描述的。与现有技术相比，与不包含本文提供的取代的抗原结合多肽相比，本发明的抗原结合多肽尤其提供了以下优点：(i)增加的与表达α/βTCR/CD3复合物的细胞的结合；和/或(ii)增加的稳定性，特别是热稳定性。此外，出乎意料地证明，本文提供的取代的组合提供了协同效应，导致改善的与表达α/βTCR/CD3复合物的细胞的结合。此外，与不包含本发明取代的抗原结合多肽相比，本发明的抗原结合肽改善了募集的T细胞的效应功能，例如改善了医疗效果。与不包含本发明取代的抗原结合多肽相比，包含效应分子的本发明抗原结合多肽(例如，如果抗原结合多肽是双特异性分子并且尤其包含TCR(例如，分子))可以导致增加募集的T细胞的效应功能的效力，例如杀死肿瘤细胞。因此，所述抗原结合多肽中的本文提供的取代可以导致抗原结合多肽的医学特性的改善。
本发明的第一方面涉及一种抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中
(1)所述VH包含
(a)重链互补决定区1(HCDR1)，所述重链互补决定区1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，
(b)HCDR2，所述HCDR2包含YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(SEQ ID NO:53)的氨基酸序列，其中
X1是A或N；
X2是E或Q；和/或
X3是Q或K
(c)HCDR3，以及
(d)重链框架区(HFR)1-4；
(2)所述VL包含
(a)轻链互补决定区1(LCDR1)，所述轻链互补决定区1包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，
(b)LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，
(c)LCDR3，以及
(d)轻链框架区(LFR)1-4；
其中
(i)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和/或
(ii)包含SEQ ID NO:54的氨基酸的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和/或
(iii)根据Kabat编号的HFR1中的位置30被带正电荷的氨基酸取代，和/或
(iv)根据Kabat编号的HFR3中的位置90被酪氨酸(Y)残基取代，
并且其中所述抗原结合多肽特异性结合α/βT细胞受体(TCR)/CD3复合物。
本发明的第二方面涉及一种包含编码本发明第一方面的抗原结合多肽的序列的分离的核酸，或包含所述核酸的核酸载体。
本发明的第三方面涉及一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含本发明第一方面的抗原结合多肽或本发明第二方面的核酸或载体。
本发明的第四方面涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第一方面的抗原结合多肽、本发明第二方面的核酸或载体或本发明第三方面的宿主细胞以及药学上可接受的载体。
本发明的第五方面涉及本发明第一方面的抗原结合多肽、本发明第二方面的核酸或载体或本发明第三方面的宿主细胞或本发明第四方面的药物组合物，用于医学。
本发明的第六方面涉及本发明第一方面的抗原结合多肽、本发明第二方面的核酸或载体或本发明第三方面的宿主细胞或本发明第四方面的药物组合物，用于诊断、预防和/或治疗增殖性疾病，优选癌症。
本发明的第七方面涉及一种用于改善或维持本发明第一方面的抗原结合多肽的结合和/或改善抗原结合多肽的稳定性的方法。
本发明的第八方面涉及一种用于检测、确定或富集表达所述α/βTCR/CD3复合物的T细胞的方法。
其他方面尤其涉及产生抗原结合多肽的方法和/或包含抗原结合多肽的试剂盒，并且也描述在下文中。
附图说明
在下文中，描述了本说明书中包括的附图的内容。在此上下文中，参考上文和/或下文的本发明详细描述。
图1：噬菌体展示选择后所选scFv克隆的结合和特异性筛选。用Jurkat克隆E6-1细胞系(y轴)和J.RT3T3.5细胞(x轴)进行流式细胞术结合分析。ScFv BMA031(V36)(空心三角形)用作参考，并且抗CD3抗体(空心圆)用作靶标结合的阳性对照。将具有改善的靶阳性细胞染色的所选克隆(实心圆)进行进一步分析。虚线表示没有scFv但包含检测抗体的相应细胞系的背景染色。
图2：噬菌体展示后所选Fab变体的结合。将纯化Fab作为浓度范围为10μg/ml至10ng/ml的滴定系列应用于Jurkat克隆E6-1细胞系，并且通过抗His标签抗体检测染色。由中值荧光强度(MFI)和对数浓度计算曲线下结合(AUC)。虚线表示示例性亲本抗体TPP-1374的结合AUC。
图3：噬菌体展示后所选Fab变体的结合和特异性筛选。将纯化Fab以1μg/ml的浓度应用于Jurkat克隆E6-1细胞系和J.RT3T3.5细胞，并且通过抗His标签抗体检测染色。虚线表示不存在任何Fab的背景信号。
图4：所设计的Fab变体的结合和特异性筛选。将纯化Fab以1μg/ml的浓度应用于Jurkat克隆E6-1细胞系和J.RT3T3.5细胞，并且通过抗His标签抗体检测染色。虚线表示不存在任何Fab的背景信号。
图5：所设计的Fab变体的曲线下结合面积和熔解温度。将纯化Fab以浓度范围为10μg/ml至10ng/ml的滴定系列应用于Jurkat克隆E6-1细胞系，并且基于所得结合曲线计算结合AUC(左Y轴)。熔解温度(Tm)由纳米DSF测量值(右Y轴)计算。上图仅表示具有突变CDR的变体，下图进一步包括携带重链框架突变H90Y的变体。箭头指示有和没有重链框架区3(HFR3)突变H90Y的变体的关系。*：VH_Y53R_VL_VL_wt(TPP-1378)的熔点未确定。粗虚线表示VH_wt_VL_wt(TPP-1374，示例性亲本抗体)的Tm。虚线表示VH_wt_VL_wt(TPP-1374)的结合AUC。
图6：所设计的Fab变体的靶细胞结合。将纯化Fab以浓度范围为10μg/ml至10ng/ml的滴定系列应用于Jurkat克隆E6-1细胞系，并且通过抗His标签抗体检测染色。
图7：在形式的上下文中经修饰的BMA031分子的效力。在乳酸脱氢酶(LDH)释放测定中评估纯化T细胞接合受体/>分子的效力。在渐增浓度的/>分子的存在下将在其细胞表面上呈递不同水平的靶肽HLA(pHLA)的肿瘤细胞系(Hs695T，U2OS)以及靶肽人白细胞抗原(pHLA)阴性的肿瘤细胞系(T98G)用作衍生自健康HLA-A*02阳性供体HBC-1005的外周血单个核细胞(PBMC)的靶标(E:T＝10:1)。在48小时后通过测量释放的LDH进行/>诱导的细胞溶解的定量。使用非线性4点曲线拟合来计算剂量-反应曲线的EC50值。
图8：在形式的上下文中经修饰的BMA031分子的效力。在LDH释放测定中评估纯化/>分子的效力。在渐增浓度的/>分子的存在下将在其细胞表面上呈递不同水平的靶pHLA的肿瘤细胞系(Hs695T，U2OS)以及靶pHLA阴性的肿瘤细胞系(T98G)用作衍生自健康HLA-A*02阳性供体HBC-1039的PBMC的靶标(E:T＝10:1)。在48小时后通过测量释放的LDH进行/>诱导的细胞溶解的定量。使用非线性4点曲线拟合来计算剂量-反应曲线的EC50值。
在下文详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以改变。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由随附权利要求限定。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
贯穿本说明书的正文引用了若干文献。将本文无论在上文还是在下文引用的每个文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指导等)都通过引用以其整体特此并入。本文的任何内容都不应解释为承认本发明因在先发明而无权早于这样的披露内容。本文引用的一些文件表征为“通过引用并入”。在此类并入的参考文献的定义或传授内容与本说明书中列举的定义或传授内容之间发生冲突的情况下，本说明书的文本优先。
在下文中，将描述本发明的要素。这些要素是用具体实施方案来列出，然而，应理解，它们可以按任何方式和以任何数量组合以产生另外的实施方案。差异性描述的实施例和优选实施方案不应当解释为将本发明限制于仅明确描述的实施方案。本说明书应当被理解为支持并且涵盖组合明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或优选要素的实施方案。此外，除非上下文另有指示，否则应当考虑本申请的说明书公开本申请中所有所描述要素的任何排列和组合。
为了实施本发明，除非另有指示，否则采用在本领域的文献中有解释的化学、生物化学和重组DNA技术的常规方法(参见例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,J.Sambrook等人编辑,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor1989)。
在下文中，提供了本说明书中经常使用的术语的一些定义。这些术语在其使用的每种情况下在本说明书的其余部分将具有分别定义的含义和优选的含义。
如在本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外明确规定。
术语“抗原结合多肽”在本发明的上下文中是指能够特异性结合至少一种抗原，特别是所述抗原的表位的多肽或结合蛋白。本发明的抗原结合多肽包含互补决定区(CDR)1至CDR3，其为可变结构域的一部分。
优选地，本发明的抗原结合多肽包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域和轻链可变结构域可以包含在相同或不同的多肽链上。VH和VL包含如下所定义的抗体或其片段的互补决定区(CDR)和框架区(FR)。优选地，所述抗原结合多肽包含如下文所定义的VH和VL，其中与在相应位置没有带正电荷的氨基酸的抗原结合多肽或其片段相比，VH中的特定位置和/或VL中的特异位置具有带正电荷的氨基酸。换言之，在本发明的抗原结合多肽中，所述特定氨基酸位置被带正电荷的氨基酸取代。优选地，所述抗原结合多肽或其功能片段包含CDR，其中不带正电荷的氨基酸中的至少一个氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。重链的FR1的位置30可以被带正电荷的氨基酸取代。此外，根据Kabat编号，在抗原结合多肽中，重链的FR3的位置90被酪氨酸取代。
抗原结合多肽在本发明的上下文中是指包含特异性结合抗原的互补位(可替代地称为“抗原结合位点”)的多肽。抗原结合多肽的例子尤其是抗体或其片段或单链抗体。本发明的抗原结合多肽或其功能片段特异性结合表达α/βTCR/CD3复合物的细胞或α/βTCR/CD3复合物。在某些方面，本发明的抗原结合多肽或其功能片段不特异性结合食蟹猴α/βTCR/CD3复合物。在进一步的方面，本发明的抗原结合多肽不特异性结合表达γ/δT细胞受体(TCR)的细胞。在进一步的方面，本发明的抗原结合多肽结合CD3的胞外结构域。
在进一步的方面，本发明的抗原结合多肽或其功能片段特异性结合人α/βTCR/CD3复合物。换言之，本发明的抗原结合多肽或其功能片段不特异性结合除人以外任何其他物种的α/βTCR/CD3复合物。
优选的是，所述抗原结合多肽包含如所附权利要求和下文所定义的CDR序列，其中至少一个不带正电荷的氨基酸被如下文所定义的带正电荷的氨基酸取代。优选的是，在抗原结合多肽的CDR中，不超过四个氨基酸位置被带正电荷的氨基酸取代。优选地，本发明的抗原结合多肽至少包含VH和VL可变结构域，所述VH和VL可变结构域衍生自BMA031的抗体序列或BMA031(V36)的抗体序列，如下文所定义，它们被指定为参考抗体、亲本抗原结合多肽或亲本抗体，并且将在下文中进一步定义。本发明的抗原结合多肽包含VH和VL结构域，所述VH和VL结构域包含基于靶向α/βTCR/CD3复合物的抗体的共有序列，并且包含本文提供的本发明取代。下文公开了此类抗体的示例性序列。如所附实施例中所示，在亲本抗原结合多肽(例如，BMA031(V36))的可变结构域中引入用带正电荷的氨基酸的特定取代和/或在HFR3中位置90处的取代提供了本文证明的有利效果，例如与不包含本文提供的取代的亲本抗原结合多肽相比增加的结合和/或增加的稳定性。在某些进一步的方面，与不包含本文提供的取代的抗原结合多肽相比，本发明的抗原结合多肽还可以具有增加的稳定性，同时基本上维持或维持结合。在某些进一步的方面，与不包含本文提供的取代的抗原结合多肽相比，本文提供的抗原结合多肽还可以具有增加的结合，同时基本上维持或维持抗原结合多肽的稳定性。术语“基本上”在“基本上维持……结合”的上下文中意指结合(例如，以“结合AUC提高％”表达)没有实质性改变，即如果与亲本抗原结合多肽相比，改变不超过约25％、优选约15％、更优选约10％并且甚至更优选约5％的减少。术语“基本上”在“基本上维持……稳定性”的上下文中意指稳定性没有实质性改变，即与亲本抗原结合多肽相比，改变不超过约25％、更优选约15％、更优选约10％并且甚至更优选约5％的减少。
术语“可变结构域”在本发明的上下文中是指免疫球蛋白的区域，所述区域是基于如本领域技术人员已知的序列同源性定义的。典型地，两个可变结构域形成抗原结合位点。此类结构域的非穷尽性例子是抗体轻链(VL)中包含的可变轻链结构域、抗体重链(VH)中包含的可变重链结构域、TCR分子(Vα)的α链中包含的α可变结构域、或TCR(Vβ)的β链中包含的β可变结构域。
术语“互补决定区”(CDR)在本发明的上下文中是指在免疫球蛋白的可变结构域内发现的非相连抗原结合位点，例如在VH、VL、Vα和Vβ中。CDR已由以下描述：Lefranc等人(2003)Developmental and Comparative Immunology 27:55；Kabat等人,J.Biol.Chem.252:6609-66I6(1977)；Kabat等人,U.S.Dept.of Health and HumanServices,“Sequences of proteins of immunological interest”,1991；Chothia等人,J.Mol.Biol.I96:90I-917,1987；和Contact注释(关于Contact注释，MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；关于AbM注释，Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.(2008),45(14):3832-9.；IMGT(Lefranc MP.Unique database numbering system forimmunogenetic analysis；Immunol.Today(1997)18:509)，其中当相互比较时，所述定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体或移植的抗体或其变体或片段的CDR旨在处于如本文所定义和使用的术语的范围内。包括如通过每个以上引用的参考文献所定义的CDR的氨基酸残基在下表1中示例性列出作为比较。
1残基编号遵循Kabat等人(同上)的命名法
2残基编号遵循Chothia等人(同上)的命名法
3残基编号根据AbM、Abhinandan和Martin(同上)；
4残基根据Contact编号，MacCallum等人，同上。
表1：根据抗体BMA031(V36)的不同注释的CDR编号。
术语“HCDR1”、“HCDR2”和“HCDR3”在本发明的上下文中是指抗原结合多肽(例如，抗体或其功能片段)的重链可变结构域中的第一、第二和第三CDR。如本文所用，术语“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”分别是指抗原结合多肽(例如，抗体或其片段)的轻链可变结构域中的第一、第二和第三CDR。如本文所用，术语“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”分别是指抗原结合多肽(例如，抗体或其功能片段)任一链的可变区的第一、第二和第三CDR。与在相应位置具有不带正电荷的残基的亲本抗原结合多肽相比，本发明的抗原结合多肽被带正电荷的氨基酸取代，例如在CDR中。在CDR内的氨基酸位置以及类似地在VH或VL内的氨基酸位置是根据如上所述的Kabat、Chothia、AbM或Contact注释，特别是根据Kabat编号来指定的。
术语“框架区”(FR)在本发明的上下文中是指抗原结合多肽(例如，抗体或其片段)的可变结构域内的CDR区外的所有氨基酸残基。框架区通常是长度在约100-120个氨基酸之间的不连续氨基酸序列，但旨在仅指CDR外的那些氨基酸。如本文所用，术语“框架区”旨在意指由CDR分隔的框架的每个结构域。FR1至FR4是指框架区1，其为可变结构域的第一个N末端氨基酸序列，其次是分别穿插CDR1、2和3的FR2、FR3和FR4。在一些实施方案中，本发明的抗原结合多肽包含框架区中例如重链框架区3(HFR3)中的一个或多个取代。
术语“多肽”在本发明的上下文中是指通过肽键结合在一起的氨基酸的单线性链，并且典型地包含至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90或至少约100个氨基酸。本文还设想，本文提供的抗原结合多肽的长度低于所指示的范围，只要所述抗原结合多肽包含本发明的取代并且特异性结合表达α/βTCR/CD3复合物的细胞即可。多肽可以是由多于一条链构成的蛋白质的一条链，或者如果蛋白质由一条链构成，则它可以是所述蛋白质本身。
术语“蛋白质”指可包含一条或多条多肽链的功能单元。如果蛋白质包含两条或更多条多肽链，则它们可以彼此非共价和/或共价结合。
术语“抗原结合位点”在本发明的上下文中是指至少一个结合位点，其负责特异性和/或选择性结合目的靶抗原，特别是靶抗原的表位。术语“抗原结合位点”在本发明的上下文中可与术语“互补位”互换使用，并且是指抗原结合多肽的与抗原结合的部分。示例性结合位点包含抗体可变结构域，诸如重链可变结构域或轻链可变结构域；TCR可变结构域，诸如α或β可变结构域；或γ或δ可变结构域。在特定方面，本文所述的抗原结合多肽包含多个(例如，两个、三个、四个或更多个)结合位点。
术语“抗原”或“靶抗原”在本发明的上下文中是指能够被至少一个抗原结合位点结合的分子或分子或复合物的一部分，其中所述一个抗原连接位点例如包含在抗体、TCR和/或本发明的抗原结合多肽中。
术语“表位”在本发明的上下文中是指抗原的功能表位。功能表位包含残基，典型地是氨基酸或多糖，其有助于抗原结合多肽的互补位与抗原之间的非共价相互作用。非共价相互作用分别包括静电力、范德华力、氢键和疏水相互作用。功能表位是构成抗原结合多肽的结构表位的残基的子组。结构表位包含被抗原结合多肽覆盖的所有残基，即抗原结合多肽的足迹。典型地，被抗体结合的抗原的功能表位包含4至10个氨基酸。类似地，MHC呈递的肽的功能表位典型地包含4至8个氨基酸。如果抗体的结构表位相同或重叠，则两种抗体之间会发生竞争。
术语“α/βTCR/CD3复合物”在本发明的上下文中是指如存在于T细胞表面上的T细胞受体复合物。大多数T细胞表达α/βTCR，其由二硫键结合的α和β链构成，典型地结合由MHC呈递的抗原肽的复合表面。TCR本身不发出信号，但与CD3组成性缔合，CD3是一种被指定为T细胞共受体的蛋白质复合物并且含有胞内信号传导基序(Birnbaum等人；PNAS第11卷,第49期；17576-17581,2014)。α/βTCR非共价偶联到这个保守的多亚单位信号传导器，其包含CD3εγ、CD3εδ和CD3ζζ二聚体，它们集体形成α/βTCR/CD3复合物。α/βTCR/CD3复合物包含被本发明抗原结合多肽特异性结合的表位。BMA031抗体(Shearman等人,1991)或本文提供的抗原结合多肽的靶表位的具体氨基酸序列是未知的。然而，本发明的抗原结合多肽与BMA031或BMA031(V36)结合相同或相似的功能表位，并且因此相互竞争。因此，本发明抗原结合多肽的表位特异性的特征在于它们的与“参考抗体”竞争结合表达α/βTCR/CD3复合物的细胞，优选T细胞，特别是结合存在于T细胞表面上的α/βTCR/CD3复合物的能力。因此，本文提供的抗原结合多肽可以与特异性结合α/βTCR/CD3复合物的参考抗体、优选BMA031或甚至更优选BMA031(V36)竞争结合T细胞，特别是结合表达α/βTCR/CD3复合物的T细胞，更优选结合存在于T细胞表面上的α/βTCR/CD3复合物。T细胞优选是T淋巴细胞，更优选Jurkat细胞，例如克隆E6-1细胞。注意，本发明的抗原结合多肽是基于上面提及的参考抗体(即，BMA031或BMA031(V36))的序列开发的。参考抗体与抗原结合多肽之间的竞争可以通过已知的测定方法进行测试。例如，可以使用如本文所附实施例中所述的结合测定。具体地，参考抗体与抗原结合多肽之间的竞争可以通过如下文进一步公开的流式细胞仪测定(例如，FACS)来测试，其中参考抗体与α/βTCR/CD3阳性细胞的结合是在存在抗原结合多肽的情况下确定的，并且与单独的参考抗体的结合进行比较。α/βTCR/CD3阳性细胞的例子是T细胞，优选Jurkat细胞。在竞争测定中，优选使用包含Fc部分的本发明抗原结合多肽，例如本发明的抗原结合多肽包含抗体的元件。例如，参考抗体可以展现出衍生自小鼠IgG1的恒定结构域，而抗原结合多肽可以展现出衍生自人IgG1的恒定结构域。在此类实验中，以近似于之前确定的结合EC50的浓度使用参考抗体，在α/βTCR/CD3阳性细胞上存在或不存在等摩尔浓度的抗原结合多肽的情况下孵育。然后可以在第二染色步骤中使用小鼠特异性第二试剂，例如山羊F(ab’)2抗小鼠IgG1(Fc)-RPE(Dianova，SBA-1072-09)来确定参考抗体的结合。与单独参考抗体的结合相比，参考抗体与抗原结合多肽的竞争通过在抗原结合多肽的存在下参考抗体的结合减少来指示。优选地，参考抗体使抗原结合多肽与α/βTCR/CD3复合物、特别是α/βTCR/CD3阳性细胞的结合减少至少10％、更优选至少20％、更优选至少30％。
如本文在竞争测定中使用的“参考抗体”由其重链和轻链可变结构域定义，并且优选进一步包含IgG1恒定结构域和Cκ轻链。优选地，参考抗体包含人IgG1恒定结构域。更优选地，参考抗体包含根据SEQ ID NO:61的铰链-CH2-CH3区。优选地，参考抗体包含根据SEQ IDNO:1的VH和根据SEQ ID NO:2的VL，更优选地，BMA031(V36)由根据SEQ ID NO:60的重链(HC)和根据SEQ ID NO:6的轻链(LC)组成。参考抗体不包含如上文和下文中定义的本发明取代。特别地，参考抗体不包含带正电荷的氨基酸的取代。优选地，参考抗体不包含一个或多个带正电荷的氨基酸的取代和/或在重链位置90处的酪氨酸取代。
“亲本抗原结合多肽”通常是指例如当评估如Tm、EC50或结合AUC提高％的特性时与本发明抗原结合多肽比较的抗原结合多肽。“亲本抗原结合多肽”不包含如上文和下文中定义的本发明取代。特别地，亲本抗原结合多肽不包含带正电荷的氨基酸的取代。优选地，亲本抗原结合多肽不包含一个或多个带正电荷的氨基酸和/或在重链位置90处的酪氨酸取代。本发明取代的效果应优选在两种相似分子(即，仅在根据本发明第一方面的本发明取代上不同的分子)之间进行比较。因此，“亲本抗原结合多肽”可以在某些方面是指这样的分子，所述分子包含根据SEQ ID NO:1的VH(BMA031 V36)和根据SEQ ID NO:2的VL(VL BMA031V36)并且另外具有抗原结合多肽的氨基酸序列。在优选的实施方案中，亲本抗原结合多肽具有抗体(例如，BMA031(V36))的氨基酸序列，或是其功能片段，例如Fab，并且在本发明的上下文中称为“亲本抗体”。
“亲本抗体”不包含如在本发明上下文中定义的取代。这种“亲本抗体”的例子是BMA031或BMA031的进一步人源化变体，例如，如下文公开的BMA031(V36)，或优选其片段。亲本抗体由其重链和轻链可变结构域定义，优选地，亲本抗体包含根据SEQ ID NO:1的VH(BMA031 V36)和根据SEQ ID NO:2的VL(VL BMA031 V36)。术语亲本抗体也用于以下定义的实施方案和实施例中的比较分子的上下文中，例如，结合(例如，EC50或结合AUC提高％)的确定或熔解温度(Tm)的确定。
在优选的实施方案中，亲本抗原结合多肽包含如本文所定义的BMA031(V36)的VH和VL结构域或由其组成。
在优选的实施方案中，与实施例部分中的情况一样，当抗原结合多肽和亲本抗原结合多肽都是相同的形式(例如，如实施例1中所述的Fab片段)时，确定功能特征，诸如下文进一步描述的“结合AUC的增加％”、“结合EC50”和/或“Tm”。
本发明抗原结合多肽和亲本抗原结合多肽的比较是在相似的、优选相同的实验条件下进行的，优选平行进行，更优选地，本发明抗体结合多肽和亲本抗原结合多肽是同一测定的一部分。最优选地，当本文所述抗原结合多肽和亲本抗原结合多肽都以Fab或Fab片段的形式存在时，将本文所述抗原结合多肽的功能特性与亲本抗原结合多肽进行比较。
术语“T细胞受体”(TCR)在本发明的上下文中是指免疫球蛋白超家族的异二聚体细胞表面蛋白，其与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白缔合。TCR以α/β和γ/δ的形式存在，它们在结构上相似但具有截然不同的解剖位置并且也可能具有不同的功能。天然异二聚体αβTCR和γδTCR的胞外部分各自含有两个多肽，其中每个具有膜近端恒定结构域和膜远端可变结构域。恒定结构域和可变结构域各自包含链内二硫键。可变结构域含有类似于抗体互补决定区(CDR)的高度多态性环。术语“TCR”在本发明的上下文中也指其片段，以及单链TCR及其片段，特别是单结构域TCR的可变α和β结构域，以及嵌合、人源化、双特异性或多特异性TCR。TCR基因疗法的使用克服了许多目前的障碍。它允许为受试者(患者)自身的T细胞赋予所希望的特异性，并且在短时间段内产生足够数量的T细胞，从而避免其耗竭。TCR将被转导到有效力的T细胞(例如，中央记忆T细胞或具有干细胞特征的T细胞)中，这可以确保在转移时更好的持续性、保存性和功能。经TCR工程化的T细胞将被输注到癌症患者中，所述患者因化疗或辐照而致使淋巴细胞减少，从而允许高效的植入，但抑制免疫抑制。
术语“TCR的片段”在本发明的上下文中是指全长或野生型TCR的一部分，特别是这种TCR的抗原结合位点或可变区。TCR片段的例子包括α、β、δ或γ链的片段，诸如Vα-Ca或Vβ-Cβ或其一部分。这些片段还可以进一步包含相应的铰链区或单链可变结构域，诸如Vα、Vβ、Vδ、Vγ、单链Vα/Vβ片段或由TCR片段形成的双特异性和多特异性TCR。与天然存在的全长或野生型TCR相比，TCR的片段发挥相同的功能，即，片段选择性地和/或特异性结合其靶抗原，特别是抗原肽或与主要组织相容性复合物I或II(MHC I或MHC II)复合的靶肽。
术语“单链TCR(scTCR)”在本发明的上下文中是指蛋白质或抗原结合多肽，其中TCR的可变结构域，诸如Vα和Vβ或Vδ和Vγ位于一条多肽链上。典型地，可变结构域被接头隔开，其中所述接头典型地包含10至30个，诸如10至25个氨基酸。
术语“野生型α-β异二聚体TCR”在本发明的上下文中是指具有α链和β链的TCR。每条α链包含可变区、连接区和恒定区，并且β链通常在可变区与连接区之间也含有短的多样区，但此多样区通常被认为是连接区的一部分。TCRα链和β链的恒定区或C区分别称为TRAC和TRBC(Lefranc,(2001),Curr Protoc Immunol Appendix 1:Appendix 10)。每个可变区，本文称为α可变结构域和β可变结构域，包含嵌入框架序列中的三个CDR，其中一个是名为CDR3的高变区。α可变结构域CDR在本文中称为CDRa1、CDRa2、CDRa3，并且β可变结构域CDR在本文中称为CDRb1、CDRb2、CDRb3。存在几种类型的α链可变(Vα)区和几种类型的β链可变(Vβ)区，其区别在于它们的框架、CDR1和CDR2序列以及部分定义的CDR3序列。Vα类型在IMGT命名法中由唯一的TRAV编号指代，Vβ类型在IMGT命名法中由唯一的TRBV编号指代(Folch和Lefranc,(2000),Exp Clin Immunogenet 17(1):42-54；Scaviner和Lefranc,(2000),ExpClin Immunogenet 17(2):83-96；LeFranc和LeFranc,(2001),“T cell ReceptorFactsbook”,Academic Press)。有关免疫球蛋白抗体和TCR基因的更多信息，参见international ImMunoGeneTics informationLefranc M-P等人(Nucleic AcidsRes.2015年1月；43(数据库辑):D413-22)。因此，常规的TCR抗原结合位点通常包括六个CDR，包括来自α和β链可变区中每一个的CDR集，其中CDR1和CDR3序列与结合HLA蛋白的肽抗原的识别和结合有关，并且CDR2序列与HLA蛋白的识别和结合有关。
术语“抗体”，也称为“免疫球蛋白”，在本发明的上下文中是指包含两条通过二硫键相互连接的重链的抗原结合多肽，并且每条重链通过二硫键与轻链连接。有两种类型的轻链，即lambda(λ)和kappa(κ)。有五种主要的重链类别(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，它们决定了抗体分子的功能活性。每条链含有不同的序列结构域。轻链包含两个结构域或区：可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域：一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区结构域赋予了重要的生物学特性，诸如抗体链缔合、分泌、跨胎盘移动性、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N末端部分，并且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点或互补位与抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变或互补决定区(CDR)的残基构成。偶尔，来自非高变或FR的残基会影响整个结构域结构，并且因此影响抗原结合位点。CDR是指氨基酸序列，它们共同定义了天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性。抗体或免疫球蛋白的例子是IgM、IgD、IgG、IgA或IgE。本发明抗原结合多肽的CDR可以移植到抗体、双特异性抗体或多特异性抗体中。已知例如本发明的抗体、TCR或抗原结合多肽的CDR的氨基酸序列，本领域技术人员可以确定框架区，诸如抗体框架区或TCR框架区。然而，在未指示CDR的情况下，本领域技术人员可以首先基于抗体的IMGT定义确定CDR氨基酸序列，并且然后确定框架区的氨基酸序列。
抗原结合多肽可以包含抗体或其片段，所述抗体或其片段包含本文提供的取代。术语“抗体”在本发明的上下文中还指抗体及其片段，以及单结构域抗体及其片段和多特异性抗体及其片段，特别是单结构域抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体的可变重链。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，特别是抗体的抗原结合位点或可变区。本文提供的抗体的片段包含本文提供的一个或多个取代。抗体片段的例子包括Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、双抗体、由抗体片段形成的双特异性和多特异性抗体。抗体片段也可以是单结构域抗体，诸如重链可变区(VHH)。优选地，“抗体片段”包含完整抗体的一部分，特别是包含抗原结合位点，所述抗原结合位点至少包含可变结构域CDR，所述可变结构域CDR包含在如下文所定义的相应CDR位置处的带正电荷的氨基酸。抗原结合多肽或抗体的片段与衍生它们的抗原结合多肽或抗体(例如，抗原结合多肽或抗体的一部分)相比发挥基本上相同或相同的功能，即，抗体片段特异性结合其靶标。与亲本抗原结合多肽或亲本抗体相比，本文提供的抗原结合多肽的片段或包含在抗原结合多肽中的抗体的片段，诸如下文所定义的功能变体，具有改善或增加的结合和/或Tm。特别优选的是，如下文所定义的并且与亲本抗体相比，如本文所定义的片段导致至少2倍的结合改善或结合EC50降低和/或导致至少1℃的Tm改善或至少1℃的ΔTm。
术语“人框架区”在本发明的上下文中是指与天然存在的抗原结合多肽(诸如天然存在的人抗体或人TCR)的框架区基本相同(约85％，或更特别地90％、95％、97％、99％)或相同(100％)的框架区。
术语“人源化抗体”在本发明的上下文中是指这样的抗体，所述抗体完全或部分地是非人起源的并且已被修饰为替代某些氨基酸，特别是在重链和轻链的框架区中，以便避免或最小化在人体中的免疫反应。人源化抗体的恒定结构域主要是人重链和轻链结构域。用于人源化抗体序列的方法是本领域已知的(Almagro&Fransson(2008)Front Biosci.13:1619-1633)。一种常用的方法是CDR植入或抗体重塑，其涉及将供体抗体(通常是小鼠抗体)的CDR序列植入到具有不同特异性的人抗体的框架支架中。由于CDR植入可能降低CDR植入的非人抗体的结合特异性和亲和力，从而降低其生物学活性，因此可以在CDR植入的抗体的所选位置处引入回复突变，以便保留亲本抗体的结合特异性和亲和力。作为CDR的一部分的氨基酸残基典型地将不会改变，但是在某些情况下可能期望改变单独CDR氨基酸残基，例如以去除糖基化位点、脱酰胺位点、异构化位点、或不希望的半胱氨酸残基。N连接的糖基化通过将寡糖链附接至三肽序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr中的天冬酰胺残基而发生，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。N糖基化位点的去除可以通过以下方式来实现：将Asn或Ser/Thr残基突变为不同的残基，特别是通过保守取代的方式。天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺可以根据诸如pH和表面暴露的因素而发生。天冬酰胺残基特别易发生脱酰胺，主要是当存在于Asn-Gly序列中时发生，而在其他二肽序列诸如Asn-Ser中以较小程度发生。当在CDR序列中存在这种脱酰胺位点、特别是Asn-Gly时，因此可能希望去除所述位点，典型地通过保守取代以去除所涉及残基中的一个。CDR序列中的取代以去除所涉及的残基之一也旨在被本发明所涵盖。
术语“Fab”在本发明的上下文中是指具有约50,000道尔顿的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中在通过用蛋白酶例如木瓜蛋白酶处理IgG而获得的片段中，重链的N末端侧的约一半和整个轻链通过二硫键结合在一起。
术语“双特异性分子”在本发明的上下文中是指具有至少两价和对两种不同抗原的结合特异性的抗原结合多肽，并且因此包含两个抗原结合位点。术语“价”是指抗原结合多肽的结合位点的数量，例如，二价抗原结合多肽涉及具有两个抗原结合位点的抗原结合多肽。术语价是指结合位点的数量，所述结合位点可以与相同或不同的靶标结合。二价抗原结合多肽可以是单特异性的，即可以与一种靶标结合；或者是双特异性的，即可以与两种不同靶标结合。靶标可以是抗原(包括它们相应的表位)、靶肽、脱靶肽诸如类似肽或α/βTCR/CD3复合物。
对于本发明上下文中的术语“双特异性”，优选的是，抗原结合位点的至少一种特异性衍生自抗体，更特别地，至少一个抗原结合位点包含如本文公开的抗体衍生的CDR。因此，在本发明的上下文中，“双特异性”是指抗原结合多肽，所述抗原结合多肽结合至少一个抗原结合位点，其包含如本发明上下文中定义的CDR，优选抗体衍生的CDR；以及至少一个其他(第二)抗原结合位点，其中所述至少一个其他抗原结合位点可以衍生自抗体并且因此包含抗体CDR，或者可以衍生自TCR并且因此包含TCR CDR。在优选的实施方案中，所述其他(第二)抗原结合位点衍生自TCR并且因此包含TCR CDR。
术语“形式”在本发明的上下文中是指包含特定数量和类型的结构域的抗原结合多肽，所述结构域存在于所述抗原结合多肽及其空间组织中。本领域描述了许多不同的形式，诸如双特异性形式。此类形式包括双抗体、交叉双可变结构域(CODV)和/或双可变结构域(DVD)多肽的非限制性例子。抗原结合多肽可以是双抗体、交叉双可变结构域(CODV)和/或双可变结构域(DVD)多肽，其在权利要求中定义的位置处包含本发明氨基酸残基。
术语“双抗体(Db)”在抗体的上下文中以及在本发明的上下文中典型地是指由两条链构成的二价分子，每条链包含VH和VL结构域，所述VH和VL结构域来自相同或不同的抗体。这两条链典型地具有构型VHA-VLB和VHB-VLA(A和B表示两种不同的特异性)或VLA-VHB和VLB-VHA。
在本发明的上下文中，本文中的“双抗体(Db)”或“双抗体形式”是指由两条多肽链构成的二价分子，每条多肽链包含通过接头(LDb1和LDb2)连接的两个可变结构域，其中两个结构域是如本发明上下文中定义的第一结构域和第二结构域(V1和V2)并且其他两个结构域可以是TCR衍生的或抗体衍生的可变结构域(VA、VB)。V1和V2结构域位于两条不同的多肽上，并且VA和VB结构域位于两条不同的肽上，并且结构域从头到尾方向上二聚。因此，方向可以是V1-LDb1-VA和VB-LDb2-V2、V2-LDb1-VA和VB-LDb2-V1、V1-LDb1-VB和VA-LDb2-V2或V2-LDb1-VB和VA-LDb2-V1。为了允许结构域头对尾二聚化接头，即，LDb1和LDb1可以相同或不同并且是短接头。短接头是长度典型地在2至12个、3至13个之间，诸如3、4、5、6、7、8、9个氨基酸的(例如，4、5个)接头(Brinkmann U.和Kontermann R.E.,MAbs.2017年2月-3月；9(2):182-212)或是长度为8个氨基酸长的接头。
“双可变结构域免疫球蛋白(DVD-IgTM)”形式最初由Wu C.等人(NatBiotechnol.2007年11月；25(11):1290-7)于2007年描述。在这种形式中，第二单克隆抗体(B)的靶结合可变结构域典型地与常规抗体(A)(包含结构域VLA和VHA)融合，其中常规抗体(A)的轻链因此包含另外的轻链可变结构域(VLB)，并且常规抗体(A)的重链包含另外的重链可变结构域(VHB)。因此，如本领域所述的DVD-IgTM典型地由两条多肽链构成，一条重链包含VHB-L-VHA-CH1-CH2-CH3，并且另一条轻链包含VLB-L-VLA-CL。结构域对VLA/VHA和VLB/VHB因此是平行配对的。
在本发明的上下文中，“双可变结构域Ig形式”是指包含两条多肽链的多肽，每条多肽链包含通过接头(L1、L3)连接的两个可变结构域，其中所述结构域中的两个是如本发明上下文中定义的第一结构域和第二结构域(V1和V2)，并且其他两个结构域是抗体衍生的重链和轻链可变结构域(VHA和VHB)。在本发明的上下文中的DVD-Ig形式中，多肽链具有例如组织V1-L1-VHA-L2-CH1-CH2-CH3和V2-L3-VLA-L4-CL或V2-L1-VHA-L2-CH1-CH2-CH3和V1-L3-VLA-L4-CL。连接接头L1和L3的长度优选为5至20个之间的氨基酸残基，诸如5至15个氨基酸残基，和/或连接接头L2和L4可以存在或不存在。
在抗体的上下文中，本领域已知的“交叉双可变结构域Ig样蛋白”描述了一种形式，其中两个VH结构域和两个VL结构域以允许可变VH-VL结构域交叉配对的方式连接，所述可变VH-VL结构域以(从N末端到C末端)VHA-VHB和VLB-VLA的顺序或以VHB-VHA和VLA-VLB的顺序排列。
在本发明的上下文中，“交叉双可变结构域Ig样蛋白”是指包含两条多肽链的蛋白质，每条多肽链包含通过接头(L1、L2、L3和L4)连接的两个可变结构域，其中所述结构域中的两个是如本发明上下文中定义的第一结构域和第二结构域(V1和V2)，并且其他两个结构域是抗体衍生的重链和轻链可变结构域(VHA、VHB)。在本发明的上下文中的CDVD-Ig形式中，多肽链具有例如组织V1-L1-VHA-L2-CH1-CH2-CH3和VLA-L3-V2-L4-CL、V2-L1-VHA-L2-CH1-CH2-CH3和VLA-L3-V1-L4-CL、VHA-L1-V1-L2-CH1-CH2-CH3和V2-L3-VLA-LDVD3-CL或VHA-L1-V2-L2-CH1-CH2-CH3和V1-L3-VLA-L4-CL。在此CDVD形式中，接头(L1至L4)典型地具有不同的长度。例如，L1的长度为3至12个氨基酸残基，L2的长度为3至14个氨基酸残基，L3的长度为1至8个氨基酸残基，并且L4的长度为1至3个氨基酸残基，或L1的长度为5至10个氨基酸残基，L2的长度为5至8个氨基酸残基，L3的长度为1至5个氨基酸残基，并且L4的长度为1至2个氨基酸残基，或L1的长度为7个氨基酸残基，L2的长度为5个氨基酸残基，L3的长度为1个氨基酸残基，并且L4的长度为2个氨基酸残基。
术语“共价连接的”或“共价连接”在本发明的上下文中例如是指二硫桥或二硫键或肽连接或经由接头或接头序列(诸如多肽接头)的共价连接。
术语“接头”或“肽接头”在本发明的上下文中是指“在空间上分开复合物的两个部分(part)或部分(moiety)(例如，两个肽、多肽或蛋白质)的氨基酸序列。典型地，这种接头包含1与20个之间的氨基酸或由其组成。肽接头在连接到一起的两个部分之间提供柔性。如果氨基酸小，则柔性通常增加。因此，柔性肽接头包含增加含量的小氨基酸，特别是甘氨酸和/或丙氨酸，和/或亲水性氨基酸，诸如丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。在本发明的上下文中，插入两个结构域之间的肽接头，例如一个或多个氨基酸残基，为结构域提供足够的移动性，例如在单链构建体中，或在轻链和重链可变结构域的可变结构域之间，并且允许正确折叠以形成抗原结合位点。在双特异性抗原结合多肽的情况下，接头允许以交叉配对(以CODV形式或一些双抗体形式)或以本发明抗原结合多肽的平行配对构型(例如，以DVD形式)形成抗原结合位点和其他抗原结合位点。在本发明的上下文中，接头被缩写为L1、L2、L3、L4等。
在本发明的上下文中，术语“二聚化结构域”(也分别缩写为D1或D2)优选是指介导第一多肽链与第二多肽链的异二聚化而非两个第一多肽链或两个第二多肽链的同源二聚化的异二聚化结构域。在优选的实施方案中，一对二聚化结构域(例如，D1和D2)包含免疫球蛋白恒定结构域，诸如抗体衍生的CL和CH1、或CL-Fc和CH1-Fc、或TCR衍生的Cα和Cβ、或一对CH3结构域或一对Fc结构域，其中CH3和Fc结构域优选包含强制异二聚化的引入突变，诸如杵臼突变。特别地，二聚化结构域涉及如下文所定义的Fc结构域。
如在本发明上下文中使用的术语“Fc结构域”包括天然Fc结构域和Fc结构域变体和序列，如下文进一步定义的。在Fc变体和天然Fc分子的上下文中，术语“Fc结构域”包括呈单体或多聚体形式的分子，无论是从完整抗体消化而来还是通过其他手段产生。
如本文所用，术语“天然Fc”是指包含由抗体消化产生或通过其他手段产生的非抗原结合片段的序列的分子(所述分子呈单体或多聚体形式)，并且可以含有铰链区。天然Fc的原始免疫球蛋白来源特别是人起源的并且可以是任何免疫球蛋白、优选IgG1或IgG2、最优选IgG1。天然Fc分子由单体多肽构成，所述单体多肽可以通过共价(即，二硫键)和非共价缔合而连接成二聚体或多聚体形式。天然Fc分子的单体亚基之间的分子间二硫键的数量范围为从1至4，这取决于类别(例如，IgG、IgA和IgE)或子类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2)。天然Fc的一个例子是由木瓜蛋白酶消化IgG产生的二硫键键合的二聚体。术语“天然Fc”是单体、二聚体和多聚体形式通用的。优选的是，Fc结构域包含或进一步包含“RF”和/或“杵臼”突变，优选“杵臼”。“RF突变”典型地是指在Fc结构域的CH3结构域中氨基酸HY变成RF的氨基酸取代，诸如在CH3结构域中的氨基酸取代H435R和Y436F，如Jendeberg,L.等人(1997,J.Immunological Meth.,201:25-34)所述，并且被描述为有利于纯化目的，因为它消除了与蛋白A的结合。在双特异性抗原结合多肽包含两个FC结构域的情况下，RF突变可以在一个或两个Fc结构域中，优选在一个Fc结构域中。“杵臼”或也称为“杵臼”技术是指均在CH3-CH3界面中的氨基酸取代T366S、L368A和Y407V(臼)与T366W(杵)，以促进异多聚体的形成。可以通过引入另外的半胱氨酸氨基酸取代Y349C和S354C来进一步稳定这些杵臼突变。专利US 5 731168和US 8 216 805中已经描述了“杵臼”技术以及稳定半胱氨酸氨基酸取代，将所述专利通过引用并入本文。
术语“氨基酸”在本发明的上下文中是指包含经取代或未经取代的氨基、经取代或未经取代的羧基、以及一个或多个侧链或基团、或这些基团中任何一个的类似物的任何单体单元。示例性侧链包括，例如，硫醇、硒代基、磺酰基、烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤基、酰肼、烯基、炔基、醚、硼酸酯、硼酸酯、磷酸基、膦酰基、磷化氢、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺或这些基团的任何组合。其他代表性氨基酸包括但不限于包含可光活化交联剂的氨基酸、金属结合氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、含金属氨基酸、具有新型官能团的氨基酸、与其他分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼化和/或可光异构化的氨基酸、放射性氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸、其他碳水化合物修饰的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、可化学切割和/或光可切割的氨基酸、含碳连接糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸、以及包含一个或多个毒性部分的氨基酸。如本文所用，术语“氨基酸”包括以下二十种天然或遗传编码的α-氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)、和缬氨酸(Val或V)。在“X”残基未定义的情况下，它们被解释为“任何氨基酸”这二十种天然氨基酸的结构示出在例如Stryer等人,Biochemistry,第5版,Freeman and Company(2002)中。另外的氨基酸，诸如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸，也可以是经遗传编码的(Stadtman(1996)“Selenocysteine,”Annu Rev Biochem.65:83-100和Ibba等人(2002)“Genetic code:introducing pyrrolysine,”Curr Biol.12(13):R464-R466)。术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸、经修饰的氨基酸(例如，具有经修饰的侧链和/或主链)和氨基酸类似物(参见例如，Zhang等人(2004)“Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells,”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(24):8882-8887；Anderson等人(2004)“An expandedgenetic code with a functional quadruplet codon”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(20):7566-7571；Ikeda等人(2003)“Synthesis of a novel histidine analogue andits efficient incorporation into a protein in vivo,”Protein Eng.Des.Sel.16(9):699-706；Chin等人(2003)“An Expanded Eukaryotic Genetic Code,”Science 301(5635):964-967；James等人(2001)“Kinetic characterization of ribonuclease Smutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues,”ProteinEng.Des.Sel.14(12):983-991；Kohrer等人(2001)“Import of amber and ochresuppressor tRNAs into mammalian cells:Ageneral approach to site-specificinsertion of amino acid analogues into proteins,”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(25):14310-14315；Bacher等人(2001)“Selection and Characterization ofEscherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic TryptophanAnalogue,”J.Bacteriol.183(18):5414-5425,Hamano-Takaku等人(2000)“A MutantEscherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino AcidAzatyrosine More Efficiently than Tyrosine,”J.Biol.Chem.275(51):40324-40328；和Budisa等人(2001)“Proteins with{beta}-(thienopyrrolyl)alanines asalternative chromophores and pharmaceutically active amino acids,”ProteinSci.10(7):1281-1292)。氨基酸可以合并成肽、多肽或蛋白质。
氨基酸可以进一步分类为极性氨基酸和非极性氨基酸。极性被定义为电荷分离，导致分子或其化学基团具有电偶极矩，其具有带负电荷的端和带正电荷的端。极性分子通过偶极-偶极分子间力和氢键相互作用。极性是许多物理特性的基础，所述物理特性包括表面张力、溶解度、熔点和沸点。极性氨基酸包括具有氢供体和/或受体原子的氨基酸，色氨酸除外。确实，尽管色氨酸的氢供体原子，但它被归类到IMGT的“非极性”类，因为它参与结构域的非极性核心。极性氨基酸组包括五种带电荷的(R、H、K、D、E)和五种不带电荷的(N、Q、S、T、Y)氨基酸。非极性氨基酸组包括不带电荷的氨基酸，诸如(A、C、G、I、L、M、F、P、W、V)氨基酸。极性氨基酸是亲水性的(Q、N)或中性的(S、T、Y)，通常位于蛋白质的外部，并且经常以氢键接合。非极性氨基酸倾向于将其侧链一起簇集在蛋白质内部，并且经常以范德华相互作用接合。
术语“带正电荷的氨基酸”在本发明的上下文中是指其中氨基酸的侧链携带正电荷的氨基酸。例如，在pH 7时，赖氨酸(K)、精氨酸(R)带正电荷。因此，带正电荷的氨基酸优选为R或K。在某些条件下，H也可以在pH 7下带正电荷。术语“带负电荷的”是指其中氨基酸的侧链携带负电荷的氨基酸。例如，在pH 7时，天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)带负电荷。注意，电荷可以取决于含有氨基酸、肽或蛋白质的溶液的pH以及还有温度。特别地，如果将本发明的抗原结合多肽作为药剂应用，则人体的pH和温度是相关的。因此，术语“带正电荷的氨基酸”是指在受试者、特别是施用抗原结合多肽的受试者的肿瘤组织的循环和胞外空间中发现的条件下携带正电荷的氨基酸。优选地，受试者是人。在这种情况下，例如在人体的pH和温度下，氨基酸携带正电荷。在特定方面，带正电荷的氨基酸选自精氨酸(R)、组氨酸(H)和赖氨酸(K)，优选地其中所述带正电荷的氨基酸为R或K。在本发明的上下文中，如下文所定义的CDR或者VH或VL中相应位置的且至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。例如，一个位置携带丝氨酸(S)，并且因此是具有不带正电荷的氨基的位置，并且被带正电荷的氨基酸(例如，R)取代。因此，残基S构成不带正电荷的氨基酸。具有不带正电荷的氨基酸的如下文所定义的某个CDR或某个VH或VL的残基可以具有未带电荷或不带电荷的氨基酸或具有带负电荷的氨基酸残基。在此上下文中，优选的是，如果Q天然存在于HCDR2中的某个位置，则在本发明的上下文中，它优选不被带正电荷的氨基酸取代。
如本说明书中通篇使用的术语“经取代的”是指亲本抗原结合多肽中的氨基酸被与被替代氨基酸不同的另一种氨基酸替代。
术语“肽”在本发明的上下文中是指通过肽键连接的氨基酸的短聚合物。它与蛋白质具有相同的化学键(肽键)，但通常长度较短。最短的肽是由通过单肽键连接的两个氨基酸组成的二肽。也可以有三肽、四肽、五肽等。典型地，肽具有高达8、10、12、15、18或20个氨基酸的长度。肽具有氨基端和羧基端，除非它是环状肽或经化学修饰的。
术语“氨基酸序列同一性”在本发明的上下文中是指序列同一性百分比，并且通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定，其中与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，所述序列在比较窗口中的部分可以包含添加或缺失(即，空位)用于两个序列的最佳比对。百分比是通过以下方式来计算的：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数，以得到匹配位置数；用匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。
术语“相同”在两个或更多个多肽或核酸序列的上下文中是指相同的两个或更多个序列或子序列，即，包含相同的氨基酸或核酸序列。如果当在比较窗口或指定区域中进行比较和对齐以获得最大对应时序列具有如使用以下序列比较算法之一或通过手动对齐和目视检查测量的特定百分比的相同氨基酸残基(例如，在特定区域上至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性)，则所述序列彼此“基本相同”。这些定义也指测试序列的互补体。因此，术语“至少80％序列同一性”在整个说明书中关于多肽和多核苷酸序列比较使用。此表达优选是指与相应的参考多肽或相应的参考多核苷酸具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
术语“序列比较”在本发明的上下文中是指这样的过程，其中一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，如有必要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。通常可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。序列比较算法随后基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性或相似性百分比。在比较两个序列并且在与待计算序列同一性百分比的序列相比未指定参考序列的情况下，如果没有具体指示，则参考待比较的两个序列中较长者的一个来计算序列同一性。如果指示了参考序列，则序列同一性基于由其SEQ ID号指示的参考序列的全长(如果没有另外具体指示的话)来确定。
用于比较的序列比对方法是本领域中熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2:482,1970)、通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.48:443,1970)、通过Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988)、通过这些算法的计算机化实现(例如，Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,GeneticsComputer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)、或通过手动比对和目视检查(参见例如，Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(1995增补))来进行。适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等人(Nuc.Acids Res.25:3389-402,1977)和Altschul等人(J.Mol.Biol.215:403-10,1990)中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。这种算法涉及首先通过鉴定询问序列中长度“W”的短字码来鉴定高评分序列对(HSP)，所述短字码在与数据库序列中相同长度的字码比对时，匹配或符合一定的正值阈值得分T。T被称为相邻字码得分阈值(Altschul等人，同上)。这些初始相邻字码命中充当开始搜索的种子，以发现含有所述种子的较长HSP。沿每个序列在两个方向上延长字命中，只要可以增加累积比对得分即可。对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖赏得分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。在累积比对得分从其最大达成值下降数量“X”时，在累积得分由于一个或多个负评分残基比对的积累而变为零或更低时，或在到达任一序列的末端时，停止每一方向上的字码命中延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4、以及两条链的比较作为默认设置。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下作为默认设置：字长(W)为3和期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915,1989)，比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。
由BLAST算法提供的另一个相似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试氨基酸与参考氨基酸的比较中的最小总和概率小于约0.2、典型地小于约0.01并且最典型地小于约0.001，则氨基酸被认为与参考序列相似。半保守氨基酸并且尤其是保守氨基酸取代是优选的，其中氨基酸被化学相关的氨基酸取代。典型的取代是在脂族氨基酸中，在具有脂族羟基侧链的氨基酸中，在具有酸性残基的氨基酸中，在酰胺衍生物中，在具有碱性残基的氨基酸中，或在具有芳族残基的氨基酸中。典型的半保守和保守取代指示在下表2中。
| 氨基酸 | 保守取代 | 半保守取代 |
| A | G；S；T N；V；C | |
| C | A；V；L | M；I；F；G |
| D | E；N；Q | A；S；T；K；R；H |
| E | D；Q；N | A；S；T；K；R； |
| F | W；Y；L；M；H | I；V；A |
| G | A | S；N；T；D；E；N；Q |
| H | Y；F；K；R | L；M；A |
| I | V；L；M；A | F；Y；W；G |
| K | R；H | D；E；N；Q；S；T；A |
| L | M；I；V；A | F；Y；W；H；C |
| M | L；I；V；A | F；Y；W；C； |
| N | Q | D；E；S；T；A；G；K；R |
| P | V；I | L；A；M；W；Y；S；T；C；F |
| Q | N | D；E；A；S；T；L；M；K；R |
| R | K；H | N；Q；S；T；D；E；A |
| S | A；T；G；N | D；E；R；K |
| T | A；S；G；N；V D；E；R；K；I | |
| V | A；L；I M；T；C；N | |
| W | F；Y；H | L；M；I；V；C |
| Y | F；W；H | L；M；I；V；C |
表2：氨基酸和相应的保守和半保守取代。
如果新的半胱氨酸保持为游离硫醇，则从A、F、H、I、L、M、P、V、W或Y到C的变化是半保守的。此外，技术人员应理解，在有空间要求的位置处的甘氨酸不应被取代，并且P不应被引入具有α-螺旋结构或β-折叠结构的蛋白质部分中。
如在本发明的上下文中使用的术语“功能变体”或“变体”是指与给定抗原结合多肽或多肽具有实质或显著的序列同一性或相似性的抗原结合多肽或多肽，其中所述功能变体保留了给定抗原结合多肽或多肽的生物活性。在本发明的上下文中，与亲本抗原结合多肽或参考抗原结合多肽相比，包含本发明取代(特别是如上文和下文中定义的相应的带正电荷的氨基酸和/或位置90处的Y)的抗原结合多肽导致改善或增加的结合(例如，结合EC50)和/或改善或增加的Tm。因此，设想了本发明抗原结合多肽的功能变体与它们所比较的抗原结合肽具有相同的或改善和增加的(分别)结合(例如，结合EC50)或Tm。此外，这也被设想用于本发明抗原结合多肽的部分、区域或片段，诸如FR或VH或VL。如本文所定义的例如FR、VH、VL或抗原结合多肽的本文提供的功能变体可以具有与给定抗原结合多肽(例如，抗原结合多肽)的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，功能片段包含本发明的取代。优选地，与不包含本发明取代的亲本抗原结合多肽或其片段相比，功能片段具有改善或增加的结合(例如，结合EC50)和/或Tm。
如本文所定义的“功能变体”可以例如包含具有至少一个保守氨基酸取代的本发明相应抗原结合多肽的氨基酸序列。可替代地或另外，功能变体可以包含具有至少一个非保守氨基酸取代的本发明相应抗原结合多肽的氨基酸序列。在这种情况下，优选的是，非保守氨基酸取代不干扰或抑制功能变体的生物活性。优选地，非保守氨基酸取代增强功能变体的生物活性，使得与相应的抗原结合多肽或其片段相比，功能变体的生物活性增加。
术语“稳定性”在本发明的上下文中指蛋白质、多肽或抗原结合多肽的热稳定性。蛋白质或多肽典型地通过尤其是耐热性或热稳定性(由参数“熔解温度(Tm)”描述)来表征。温度因素是为了提供功能性的和正确折叠的蛋白质。因此，在施加的不同温度条件下，蛋白质的稳定性不同。高于蛋白质的自然温度，热能将导致所述蛋白质的解折叠和变性。如果蛋白质在高温下抵抗不可逆的变化，则将其描述为热稳定的(thermostable)或热稳定的(thermally stable)。如上所提及，热稳定性由描述符熔解温度Tm定义。
术语“熔解温度(Tm)”在本发明的上下文中是指“热稳定性”，即处于折叠状态的蛋白质的浓度等于未折叠蛋白质的浓度的温度(Miotto等人,Insights on protein thermalstability:a graph representation of molecular interactions；bioRxiv preprintdoi:https://doi.org/10.1101/354266；2018年6月22日)。特别地，Tm是50％蛋白质解折叠的温度，如下文实施例中所展示。如果多肽或蛋白质达到其Tm，则自由能变化ΔG等于零。此时，多肽或蛋白质分子消失为无定形状态，并且蛋白质链不能自我再折叠。一般经验法则是Tm的增加与最大稳定性的自由能的增加ΔG(T*)相关。Tm可以通过使用圆二色谱(CD)(一种跟踪蛋白质的解折叠和折叠随温度变化的光谱技术)或通过差示扫描量热法(DSC)、差示扫描荧光法(DSF)或生物化学测定来测量。通常，具有高Tm值的蛋白质或多肽比那些具有较低Tm值的蛋白质或多肽更稳定。热稳定性的增加导致抗原结合多肽的变性减少，并且因此导致，例如，所述多肽的储存条件改善。作为示例性方法的纳米差示扫描荧光法(纳米DSF)在下文所附实施例中公开用于使用pH 7.4的PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液来确定Tm。优选地，Tm通过DSF，更优选通过纳米DSF来确定。特别地，Tm通过DSF在PBS pH 7.4中以1℃/min的加热升温速率进行确定，其中抗原结合多肽的浓度为50μg/ml。可以直接获得绝对熔解温度。可以计算不同分析物的ΔTm值。优选的是，相互比较的值包含在相同的实验运行中。
术语“结合”在本发明的上下文中是指如下面进一步详细定义的“结合亲和力”或“曲线下结合面积(AUC)”或“结合EC50值”。特别地，“结合”是指抗原结合多肽与如上定义的α/βTCR/CD3复合物的结合，或优选地是指抗原结合多肽与表达α/βTCR/CD3复合物的细胞或更优选表达α/βTCR/CD3复合物的T细胞的结合。抗原结合多肽的结合可以通过如本文下面实施例中进一步公开的流式细胞仪测定来确定，例如通过FACS，其中确定抗原结合多肽与α/βTCR/CD3阳性细胞的结合，例如与亲本抗原结合多肽、特别是不包含本发明取代的抗原结合多肽(例如，BMA031(V36))相比来确定。优选地，抗原结合多肽与表达α/βTCR/CD3复合物的细胞的结合通过流式细胞术结合分析使用α/βTCR/CD3阳性Jurkat细胞(例如，克隆E6-1细胞)和α/βTCR/CD3阴性Jurkat细胞来确定。特别地，抗原结合多肽的结合是通过测试不同浓度(例如，在抗原结合多肽的半对数步骤中从10μg/ml至10ng/ml)来确定的。在进一步的特定方面，在包含PBS、2mM乙二胺四乙酸(EDTA)、5％胎牛血清(FCS)的缓冲液中进行与细胞的结合和洗涤步骤。在进一步的特定方面，将抗原阴性细胞(例如，用CFSE CellTrace标记的)与抗原阳性细胞以1:1的比率混合。在进一步的特定方面，将抗原结合多肽的浓度(例如，100μl/孔)与细胞混合物(例如，100.000个细胞/孔)在冰上在所述缓冲液中孵育例如15min，并且洗涤细胞以去除未结合的抗原结合多肽。优选地，进行活细胞/死细胞的分选/染色。与抗原结合多肽结合的细胞的染色可以在流式细胞仪(例如，Intellicyt iQueScreener(Sartorius AG)或CytoFLEX(Beckmann Coulter，2089495-01))中确定，并且可以比较MFI(中值荧光强度)值。
在本发明的上下文中的“结合亲和力”或“亲和力”可以例如以半数最大有效浓度(EC50)或平衡解离常数(KD)来表达。
“半数最大有效浓度”(也缩写为“EC50 ”或“EC50”)在本发明的上下文中是指“结合 EC50”或者“功能EC50”，并且无论使用哪个术语，其都在整个申请中被分别指示。
在本发明的上下文中，术语“结合EC50”可以描述为配体(例如，抗原结合多肽或蛋白质)的浓度，在此浓度下一半靶标(例如，α/βTCR/CD3复合物)以结合状态存在。结合EC50是用于测量抗原结合多肽与靶细胞，优选表达α/βTCR/CD3复合物的T细胞的结合(即，本发明抗原结合多肽与其靶标的结合)的参数。结合EC50值取决于靶标浓度。EC50和亲和力呈负相关，这意味着EC50值越低，分子的结合亲和力就越高。通常优选低结合EC50值。结合EC50值例如通过如在下文实施例中描述的流式细胞术结合分析使用流式细胞仪(例如，Intellicyt iQue Screener(Sartorius AG)或CytoFLEX(Beckmann Coulter，2089495-01)来确定。典型地，在以下条件下进行测量：将标记的细胞(例如，不表达靶抗原α/βTCR/CD3复合物的细胞，用CFSE CellTrace标记)与抗原阳性细胞以1:1的比率混合。在进一步的特定方面，将抗原结合多肽(例如，100μl/孔的浓度)与细胞混合物(例如，100.000个细胞/孔)在冰上在所述缓冲液中孵育例如15min，并且洗涤细胞以去除未结合的抗原结合多肽。可以在流式细胞仪中确定染色，并且可以比较不同样品的MFI值。优选地，计算本发明抗原结合多肽的MFI的EC50值，并且将其表示为相比于不包含本发明氨基酸取代的亲本抗体BMA031(V36)(也指定为TPP-1374)的MFI的EC50值，x倍降低。例如，TPP-1389显示出EC50降低31.8倍，这意味着与通过相同方法针对亲本抗体TPP-1374确定的EC50相比，EC50降低31.8倍。因此，本发明抗原结合多肽的结合EC50值优选低于亲本抗原结合多肽，例如不包含本发明取代(例如，不包含用带正电荷的氨基酸的取代和/或不包含在位置90处的酪氨酸)的抗原结合肽的结合EC50值。如下文所用，本发明抗原结合多肽的x倍降低是与不包含本发明取代(例如，不包含用带正电荷的氨基酸的取代和/或不包含在位置90处的酪氨酸)的亲本抗原结合多肽进行比较的。优选地，本发明抗原结合多肽的x倍降低是与包含根据SEQ ID NO:1的VH和根据SEQ ID NO:2的VL的亲本抗体BMA031(V36)进行比较的。
术语“功能EC50”在本发明的上下文中是指物质的半数最大有效浓度，并且因此是在指定暴露时间后引起在基线与最大值之间中间的反应的所述物质浓度的度量。它通常用作药物效力的量度。因此，剂量-量反应曲线(graded dose response curve)的EC50表示观察到其最大效应的50％的物质浓度。剂量-质反应曲线(quantal dose response curve)的EC50表示在特定的暴露持续时间后，50％的群体展现出反应的化合物浓度。在一个例子中，“功能EC50值“是指本发明抗原结合多肽的浓度，其在指定暴露时间后诱导在基线与最大值之间中间的反应。EC50值可以通过各种已知的方法使用例如IFN-γ释放测定或LDH释放测定(如例如本文实施例3中所述)进行实验评估。
术语“曲线下面积(AUC)”在本发明的上下文中是指“曲线下结合面积(结合AUC)”并且在本文中可互换使用。
如上所阐述，结合也可以表示为AUC或结合AUC，这是基于抗原结合多肽的对数浓度和MFI计算。计算的EC50或AUC表示抗原结合多肽(例如，抗体)与其靶标(例如，抗原)的结合强度，并且反之亦然，并且因此，AUC值的增加表明抗原结合多肽与其靶标(例如，与α/βTCR/CD3复合物、或优选表达α/βTCR/CD3复合物的细胞、或更优选表达α/βTCR/CD3复合物的T细胞)的结合的增加或改善或反之亦然。优选地，本发明抗原结合多肽的AUC以“结合AUC提高％”或“AUC提高％”指示，这意指“增加的AUC％”。术语“结合AUC提高％”或“AUC提高％”在本文中可互换使用。将抗原结合多肽的结合AUC与亲本抗原结合多肽、特别是不包含本发明取代(例如，不包含用带正电荷的氨基酸的取代和/或不包含在位置90处的酪氨酸)的结合AUC进行比较。如本文所用，将本发明抗原结合多肽的“结合AUC提高％”或“增加的AUC％”与亲本抗原结合多肽、特别是不包含本发明取代(例如，不包含用带正电荷的氨基酸的取代和/或不包含在位置90处的酪氨酸)进行比较。优选地，将本发明抗原结合多肽的“结合AUC提高％”或“增加的AUC％”与亲本抗体BMA031(V36)(在以下实施例中也指定为TPP-1374)(并且将其设置为0％的AUC增加)在相同的条件下(并且优选在相同的实验运行中)进行比较。例如，抗原结合多肽TPP-1375显示出87％的AUC增加(参见实施例部分中的表5)，这表明与用于比较的亲本抗体TPP-1374相比，87％的结合AUC增加。
术语“协同或协同作用”在本发明的上下文中是指由于抗原结合多肽的一个或多个可变结构域的CDR或FR中的多于一个不同突变而发生的协同效应。协同效应是一种非线性累积效应，其大于由单独的每个单一突变单独引起的效应的简单总和。例如，在重链位置31处携带R的抗原结合多肽TPP-1360的AUC提高％是144％，并且对于在位置90处携带Y的抗原结合多肽TPP-1387的AUC提高％是14％(参见本文公开的实施例的表6)。如在实施例中出人意料地显示的，抗原结合多肽提供协同效应。例如，如TPP-1388中所示，包含在重链位置31处被R的取代并且位置90处被Y的取代的抗原结合多肽显示出273％的AUC提高，举例说明了关于AUC提高％的协同效应；例如参见表5或表6。
术语“解离常数(KD)”(以“mol/L”测量，有时缩写为“M”)在本发明的上下文中是指结合部分(例如，抗原结合多肽或其片段)与靶分子(例如，抗原或其表位)之间的特定相互作用的解离平衡常数，即koff/kon比率。KD与亲和力呈负相关。KD值与抗原结合多肽的浓度有关，并且KD值越低，抗原结合多肽的亲和力越高。亲和力，即KD值，可以通过各种已知的方法进行实验评估，诸如用基于表面等离子体共振(SPR)的测定(诸如BIAcore测定)或生物膜干涉术(BLI)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和竞争测定(例如，放射免疫测定(RIA))测量缔合速率和解离速率。低亲和力抗原结合多肽通常缓慢地结合抗原并且倾向于易于解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于保持结合。KD典型地在30℃下通过BLI或SPR测量。
典型地，如果本发明抗原结合多肽包含第二结合位点，并且特异性结合给定抗原的第二结合位点包含亲和成熟的TCR或其片段，或者抗原结合多肽是呈双特异性形式的可溶性分子或其片段，诸如分子或其片段，则TCR或其功能片段、特别是Vα或Vβ的KD在9x10-8至5x10-13M、9x10-9至1x10-12M、8x10-9至5x10-12M、7x10-9至1x10-11M、6x10-9至2x10-11M、5x10-9至5x10-11M、4x10-9至8x10-11M、3x10-9至1x10-10M的范围内。本文中称为/>分子或/>的双特异性形式的分子典型地包含第一抗原结合位点和第二抗原结合位点，第一抗原结合位点包含在特异性结合T细胞表面分子的第一多肽链中，第二抗原结合位点包含在特异性结合MHC-肽复合物的第二多肽链中。
典型地，如果本发明抗原结合多肽包含第二结合位点，并且特异性结合给定抗原的第二结合位点包含TCR或其片段，则TCR或片段的Kd在3x10-5至1x10-7s-1、2x10-5至5x10-7s-1、1x10-5至1x10-6s-1或5x10-6至1x10-6s-1的范围内。
术语也称为/> 分子”，在本发明的上下文中是指双特异性分子，其包含一种特异性结合T细胞表面分子的特异性和一种特异性结合MHC-肽复合物的特异性。因此，/>是双特异性TCR，所述双特异性TCR是可溶性抗原结合多肽，所述可溶性抗原结合多肽包含如本文所定义的第一抗原结合位点和第二抗原结合位点，其中第一抗原结合位点包含如在本发明的上下文中定义的抗原结合多肽的特异性结合a/βTCR/CD3复合物的VH和VL结构域以及由特异性结合MHC-肽复合物(例如，肿瘤相关肽MHC复合物)的TCR的α可变结构域(Vα)和β可变结构域(Vβ)形成的其他或第二抗原结合位点。
术语“特异性结合”在本发明的上下文中是指当靶标包含特异性结合位点和非特异性结合位点时，抗原结合多肽或其片段(例如，抗体或其片段或者TCR或其片段)与其靶标的特异性结合位点的结合。然而，有时多肽与密切相关的蛋白质的结合是不可避免的，那么与靶标的实际结合可能是特异性的，但抗原结合多肽被认为在预期靶标结合方面是非特异性的。如果本发明抗原结合多肽与其靶标的结合比与一种或多种类似抗原的结合更强或增强，则认为本发明抗原结合多肽特异性结合。优选的是，如果抗原结合多肽是抗体，则该抗体特异性结合其靶标。
术语“细胞表面蛋白”在本发明的上下文中是指嵌入或跨越更复杂生物体的细胞膜的层的蛋白质。这些蛋白质是细胞与其周围环境(包括其他细胞)相互作用的组成部分。细胞表面蛋白的例子是抗原受体，诸如抗体或TCR或TCR链；抗原呈递分子，诸如MHC分子或β-微球蛋白；共受体分子，诸如CD4、CD8或CD19；抗原受体辅助分子，诸如CD3-γ、-δ和-ε链，CD79a和CD79b；共刺激或抑制分子，诸如CD28、CD80或CD86；自然杀伤细胞上的受体；白细胞上的受体，免疫球蛋白样细胞粘附分子，诸如ICAM；NCAM、CD2；细胞因子受体，诸如IL-1受体或集落刺激因子1受体；生长因子受体；受体酪氨酸激酶或磷酸酶，Ig结合受体，诸如聚合免疫球蛋白受体(PIGR)或Fc受体。其他例子是选自以下的表面标记分子：CD3、CD4、CD25、CTLA4、GITR、NK1.1、SLAMF1、SLAMF6、TGFβ、Vα24、Jα18、IL-12R、IFNγR、CXCR3、IL-4R、IL33R、CCR4、IL-17RB、CRTH2；IL-23R、CCR6、IL-1R、CD161；CCR7 hi、CD44、CD62Lhi、TCR、CD3、IL-7R(CD127)、IL-15R。
术语“MHC”在本发明的上下文中是指术语“主要组织相容性复合物”的缩写。MHC是一组细胞表面蛋白，即细胞表面受体，所述细胞表面受体在脊椎动物中建立针对改变的天然蛋白或外来蛋白的获得性免疫方面具有重要作用，这进而决定组织内的组织相容性。MHC分子的主要功能是结合衍生自改变的蛋白质或病原体的抗原并且将它们展示在细胞表面上，以便被适当的T细胞识别。人MHC也称为HLA(人白细胞抗原)复合物或HLA。MHC基因家族分为三个亚群：I类、II类和III类。肽和MHC I类的复合物被携带适当TCR的CD8阳性T细胞识别，而肽和MHC II类分子的复合物则被携带适当TCR的CD4阳性辅助T细胞识别。由于CD8和CD4依赖性的两种类型的反应共同且协同地促进抗肿瘤效果，因此肿瘤相关抗原和相应TCR的鉴定和表征在癌症免疫疗法(诸如疫苗和细胞疗法)的发展中是重要的。
术语“MHC-I”在本发明的上下文中是指MHC I类分子或MHC-I。MHC I分子由α链(也称为MHC I重链)和β链组成，β链构成β2微球蛋白分子。α链包括三个α结构域，即α1结构域、α2结构域和α3结构域。α1和α2结构域主要有助于形成肽口袋以产生肽配体MHC(pMHC)复合物。MHC-I典型地结合衍生自胞质抗原蛋白的肽，并且所述肽在泛素化后被蛋白酶体降解并且随后通过与抗原处理相关的特定转运蛋白(TAP)从胞质溶胶转运到内质网(ER)。MCH I典型地结合长度为8-12个氨基酸的肽。
术语“MHC-II”在本发明的上下文中是指MHC II类分子或MHC-II。MHC-II分子由α链和β链组成，其中α链包含两个α结构域：α1结构域、α2结构域，并且β链包含两个β结构域：β结构域1和β结构域2。MHC II典型地在ER中与称为恒定链(invariant chain)的蛋白质复合折叠，并且然后被转运到晚期内体隔室，在晚期内体隔室中恒定链被组织蛋白酶切割，并且短片段保持与MHC II的肽结合沟结合，称为II类相关恒定链肽(CLIP)。然后，这种占位肽通常与更高亲和力的肽交换，后者衍生自在内吞隔室中可得的通过蛋白水解降解的蛋白质。MHC-II典型地结合长度为10-30个氨基酸的肽或长度为13-25个氨基酸的肽。
术语“HLA”在本发明的上下文中是指不同人类之间在氨基酸序列上不同的人MHC分子。
术语“核酸”在本发明的上下文中是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基或两者的单链或双链寡聚物或聚合物。核苷酸单体由一个核碱基、一个五碳糖(诸如但不限于核糖或2'-脱氧核糖)和一至三个磷酸基团构成。典型地，核酸是通过单独核苷酸单体之间的磷酸二酯键形成的。在本发明的上下文中，术语核酸包括但不限于核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)分子，而且还包括包含其他连接的核酸的合成形式(例如，如Nielsen等人(Science 254:1497-1500,1991)中所述的肽核酸)。典型地，核酸是单链或双链分子并且由天然存在的核苷酸构成。核酸单链的描述也(至少部分)定义了互补链的序列。核酸可以是单链或双链的，或者可以含有双链序列和单链序列二者的部分。举例说明的双链核酸分子可以具有3'或5'的单链突出端，并且因此不需要或假设在其整个长度上完全是双链的。核酸可以通过生物、生物化学或化学合成方法或本领域已知的任何方法(包括但不限于RNA的扩增和逆转录方法)来获得。术语核酸包括染色体或染色体片段、载体(例如，表达载体)、表达盒、裸DNA或RNA聚合物、引物、探针、cDNA、基因组DNA、重组DNA、cRNA、mRNA、tRNA、微RNA(miRNA)或小干扰RNA(siRNA)。核酸可以是例如单链、双链或三链，并且不限于任何特定长度。除非另有指示，特定核酸序列除了明确指示的任何序列之外还包含或编码互补序列。
术语“载体”在本发明的上下文中是指编码目的蛋白的多核苷酸或包含一种或多种多肽和编码目的蛋白的多核苷酸的混合物，其能够被引入或能够将其中包含的蛋白质和/或核酸引入细胞中。载体的例子包括但不限于质粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。使用载体将目的基因产物(诸如例如，外来或异源DNA)引入宿主细胞中。载体可以含有促进载体在宿主细胞中的自主复制的“复制子”多核苷酸序列。外来DNA被定义为异源DNA，所述异源DNA是并非在宿主细胞中天然发现的DNA，所述异源DNA例如复制载体分子，编码选择标记或筛选标记，或编码转基因。一旦进入宿主细胞，载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA同时复制，并且可以产生几个拷贝的载体及其插入的DNA。另外，载体还可以含有必需元件，所述必需元件允许将插入的DNA转录成mRNA分子或者以其他方式导致插入的DNA复制到多个拷贝的RNA中。载体可以进一步涵盖调节目的基因的表达的“表达控制序列”。典型地，表达控制序列是多肽或多核苷酸，诸如启动子、增强子、沉默子、绝缘子或阻遏物。在包含编码一种或多种目的基因产物的多于一种多核苷酸的载体中，可以通过一种或多种表达控制序列一起或单独控制表达。更具体地，载体上包含的每种多核苷酸可以通过单独表达控制序列来控制，或者载体上包含的所有多核苷酸可以通过单一表达控制序列来控制。通过单一表达控制序列控制的单一载体上包含的多核苷酸可以形成开放阅读框。一些表达载体另外含有与插入的DNA相邻的序列元件，所述序列元件增加所表达的mRNA的半衰期和/或允许将mRNA翻译成蛋白质分子。因此可以快速地合成由插入的DNA编码的许多mRNA和多肽分子。此类载体可以包含调节元件(诸如启动子、增强子、终止子等)以在施用至受试者时引起或指导所述多肽的表达。在用于动物细胞的表达载体中使用的启动子和增强子的例子包括SV40的早期启动子和增强子(Mizukami T.等人1987)、Moloney小鼠白血病病毒的LTR启动子和增强子(Kuwana Y等人1987)、免疫球蛋白H链的启动子(Mason JO等人1985)和增强子(Gillies SD等人1983)等。可以使用任何用于动物细胞的表达载体，只要可以插入和表达编码人抗体C区的基因即可。合适载体的例子包括pAGE107(Miyaji H等人1990)、pAGE103(Mizukami T等人1987)、pHSG274(Brady G等人1984)、pKCR(O'Hare K等人1981)、pSG1βd2-4-(Miyaji H等人1990)等。质粒的其他例子包括包含复制起点的复制质粒，或整合质粒，例如pUC、pcDNA、pBR。
术语“转化”在本发明的上下文中是指天然发生的基因转移到宿主细胞中的过程，所述过程涉及细胞通过细胞膜吸收遗传物质，诸如核酸(DNA或RNA)，使得宿主细胞将表达引入的基因或序列以产生所希望的基因产物，典型地是由引入宿主细胞中的基因或序列编码的蛋白质或酶。存在两种类型的转化，称为天然转化和人工或诱导转化。人工或诱导的转化典型地被称为“转染”。
术语“转染”在本发明的上下文中是指一种基因转移模式，其涉及在宿主细胞的细胞膜上产生孔，从而使宿主细胞能够接收外来遗传物质。转染是指真核细胞(诸如昆虫或哺乳动物细胞)的转化。化学介导的转染涉及使用例如磷酸钙或阳离子聚合物或脂质体。非化学介导的转染方法典型地是电穿孔、声致穿孔、穿刺感染(impalefection)、光学转染、或流体动力学递送(hydro dynamic delivery)。基于颗粒的转染使用基因枪技术，其中使用纳米颗粒将核酸转移到宿主细胞中，或通过另一种称为磁转染的方法。核转染和使用热休克是用于成功转染的其他演化方法。通过转染方法接收外来核酸的宿主细胞已被“转染”。
术语“转导”在本发明的上下文中是指通过病毒或病毒载体将外来核酸(诸如DNA或RNA)转移到细胞中。通过病毒或病毒载体接收并且表达外来核酸(DNA或RNA)的宿主细胞已被“转导”。
术语“药物组合物”或“治疗性组合物”在本发明的上下文中是指当适当施用于受试者时能够诱导所希望的治疗效果的化合物或组合物。
术语“药学上”或“药学上可接受的”在本发明的上下文中是指当施用于哺乳动物、尤其是人(视情况而定)时不导致不良反应、过敏反应或其他不利反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或配制助剂。
术语“药学上可接受的载体”在本发明的上下文中也可以称为“药学上可接受的稀 释剂”或“药学上可接受的媒介物”并且可能包括溶剂、增量剂、稳定剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂以及生理上相容的类似物。
术语“治疗剂”在本发明的上下文中是指具有治疗效果的药剂。
在以下中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确指示相反含义，否则如此定义的每个方面都可以与其他任何一个或多个方面组合。特别地，指示为优选或有利的任何特征都可以与指示为优选或有利的其他任何一个或多个特征组合。
如上所指示，在VH和VL中CDR和FR的位置可以通过任何上述定义的注释诸如Chothia、Kabat、AbM或Contact来确定。
本发明的第一方面涉及一种抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中CDR和FR根据Chothia来指定，
(1)所述VH包含
(a)重链互补决定区1(HCDR1)，所述重链互补决定区1包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，
(b)HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，
(c)HCDR3，以及
(d)重链框架区(HFR)1-4；
(2)所述VL包含
(a)轻链互补决定区1(LCDR1)，所述轻链互补决定区1包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，
(b)LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，
(c)LCDR3，以及
(d)轻链框架区(LFR)1-4；
其中
(i)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和/或
(ii)包含SEQ ID NO:54的氨基酸的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和/或
(iii)HFR3中根据Chothia编号的位置90被酪氨酸(Y)残基取代，
并且其中所述抗原结合多肽特异性结合α/βT细胞受体(TCR)/CD3复合物。
在该方面的进一步的具体实施方案中，所述抗原结合多肽包含带正电荷的氨基酸：
(i)在所述重链的以下位置中的一个或多个处：30、31、53和54；和/或
(ii)在所述轻链的以下位置中的一个或多个处：31和56，
并且其中所述位置是根据Chothia编号的。
在该方面的进一步的具体实施方案中，所述抗原结合多肽包含：
(a)所述重链中的带正电荷的氨基酸：
(i)位置30处为R、K或H；
(ii)位置31处为R、K或H；
(iii)位置53处为R、K或H；和/或
(iv)位置54处为R或K；和/或
(b)所述轻链中的带正电荷的氨基酸
(i)位置31处为R或K；和/或
(ii)位置56处为R或K，其中所述位置是根据Chothia编号的。
可替代地，第一方面也可以如下基于Kabat注释来指定：
一种抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中
(1)所述VH包含
(a)重链互补决定区1(HCDR1)，所述重链互补决定区1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，
(b)HCDR2，所述HCDR2包含YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(SEQ ID NO:53)的氨基酸序列，其中
X1是A或N；
X2是E或Q；和/或
X3是Q或K
(c)HCDR3，以及
(d)重链框架区(HFR)1-4；
(2)所述VL包含
(a)轻链互补决定区1(LCDR1)，所述轻链互补决定区1包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，
(b)LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，
(c)LCDR3，以及
(d)轻链框架区(LFR)1-4；
其中
(i)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和/或
(ii)包含SEQ ID NO:54的氨基酸的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和/或
(iii)根据Kabat编号的HFR1中的位置30被带正电荷的氨基酸取代，和/或
(iv)根据Kabat编号的HFR3中的位置90被酪氨酸(Y)残基取代，
并且其中所述抗原结合多肽特异性结合α/βT细胞受体(TCR)/CD3复合物。
特别地并且当解释本发明的以下实施方案时，可变轻链和可变重链内的氨基酸的位置根据Kabat编号指示，除非另有指示。
在本发明的上下文中观察到，与不包含(i)至(iv)中指定的任一取代的亲本抗原结合多肽相比，HFR3中位置90处突变为Y导致抗原结合多肽与α/βTCR/CD3复合物的结合增加和/或热稳定性增加(例如，Tm℃或ΔTm℃)，并且如果与上述(i)至(iii)中指定的一个、两个或全部取代组合，则这些积极作用更加明显。结合增加被描述为结合EC50的降低，这在本文中被称为例如“x倍”降低。可替代地，结合的增加在本文中也被描述为“结合AUC提高％”。Tm的差异以如上文所定义的“ΔTm℃”来描述。
因此，在抗原结合多肽的一个实施方案中，HFR3中位置90被Y取代，并且此外，包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ IDNO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。
在本发明第一方面的抗原结合多肽的一个实施方案中，HFR1中的位置30被带正电荷的氨基酸取代。在一个实施方案中，HFR3中的位置90被Y取代。
在一个实施方案中，HFR1中的位置30被带正电荷的氨基酸取代，并且HFR3中的位置90被Y取代。
在抗原结合多肽的一个实施方案中，HFR3中位置90被Y取代，HFR1中位置30被带正电荷的氨基酸取代；并且此外，包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。
在抗原结合多肽的一个实施方案中，HFR1中位置30被带正电荷的氨基酸取代，并且此外，包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含根据SEQ ID NO:54的LCDR1，其中至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和/或根据SEQ ID NO:55的LCDR2，其中至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。
在抗原结合多肽的一个实施方案中，HFR1中位置30被带正电荷的氨基酸取代，并且此外，包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。
在抗原结合多肽的一个实施方案中，HFR3中位置90被Y取代，并且此外，包含SEQID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。
在抗原结合多肽的一个实施方案中，HFR1中位置30被带正电荷的氨基酸取代；HFR3的位置90被Y取代，并且此外，包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。
在抗原结合多肽的一个实施方案中，(iv)HFR3的位置90被Y取代，并且(i)包含SEQID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且(ii)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。
在抗原结合多肽的一个实施方案中，(iv)HFR3的位置90被Y取代，并且(iii)HFR1的位置30被带正电荷的氨基酸取代，并且(i)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且(ii)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽的至少一个氨基酸在如上文和下文中定义的HCDR1和/或HCDR2和/或LCDR1和/或LCDR2位置中被带正电荷的氨基酸取代，CDR中不超过四个位置被带正电荷的氨基酸取代，优选CDR中不超过三个位置被带正电荷的氨基酸取代。
在一个实施方案中，HCDR1和/或HCDR2和/或LCDR1和/或LCDR2中被带正电荷的氨基酸取代的抗原结合多肽的至少一个氨基酸不多于2个、不多于3个、不多于4个氨基酸。在以下实施方案中，优选的是，如果SEQ ID NO:52的HCDR1、SEQ ID NO:53的HCDR2、SEQ IDNO:54的LCDR1、SEQ ID NO:55的LCDR2、SEQ ID NO:56的HCDR3或SEQ ID NO:57的LCDR3中某个位置处存在带正电荷的氨基酸，则在本发明的上下文中，所述氨基酸不被不同的带正电荷的氨基酸取代。
在本发明第一方面的一个实施方案中，抗原结合多肽包含根据SEQ ID NO:52的HCDR1，其中至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SYVMH的SEQ ID NO:52的情况下，S被H、K或R取代。在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SYVMH的SEQ ID NO:52的情况下，Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SYVMH的SEQ ID NO:52的情况下，V被H、K或R取代。在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SYVMH的SEQ ID NO:52的情况下，M被H、K或R取代。
在本发明第一方面的一个实施方案中，抗原结合多肽包含根据SEQ ID NO:53的HCDR2，其中至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。特别地，在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是Q，意指N末端Y被H、K或R取代。特别地，在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是Q，意指从N末端第二个Y被H、K或R取代。特别地，在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是Q，意指从N末端第三个Y被H、K或R取代。特别地，在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是Q，意指所有三个Y被H、K或R取代。
在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ IDNO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是Q，意指I被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是Q，意指N末端N被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是Q，意指从N末端第二个N被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是Q，意指两个N都被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是Q，意指P被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是Q，意指V被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是Q，意指T被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是Q，意指F被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是Q，意指G被H、K或R取代。
在本发明第一方面的一个实施方案中，抗原结合多肽包含根据SEQ ID NO:53的HCDR2，其中至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。特别地，在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是K，意指N末端Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是K，意指从N末端第二个Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是K，意指从N末端第三个YH、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是K，意指所有三个Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是K，意指I被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是K，意指N末端N被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是K，意指从N末端第二个N被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是K，意指两个N都被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是K，意指P被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是K，意指V被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ IDNO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是K，意指T被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是K，意指F被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQID NO:53，其中X1是A；X2是E并且X3是K，意指G被H、K或R取代。
在本发明第一方面的一个实施方案中，抗原结合多肽包含根据SEQ ID NO:53的HCDR2，其中至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。特别地，在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是Q，意指N末端Y被H、K或R取代。特别地，在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是Q，意指从N末端第二个Y被H、K或R取代。特别地，在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是Q，意指从N末端第三个Y被H、K或R取代。特别地，在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是Q，意指所有三个Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ IDNO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是Q，意指I被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是Q，意指N末端N被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是Q，意指从N末端第二个N被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是Q，意指两个N都被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是Q，意指P被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是Q，意指V被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是Q，意指T被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是Q，意指F被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是Q，意指G被H、K或R取代。
在本发明第一方面的一个实施方案中，抗原结合多肽包含根据SEQ ID NO:53的HCDR2，其中至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。特别地，在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是K，意指N末端Y被H、K或R取代。特别地，在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是K，意指从N末端第二个Y被H、K或R取代。特别地，在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是K，意指从N末端第三个YH、K或R取代。特别地，在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是K，意指所有三个Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ IDNO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是K，意指I被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是K，意指N末端N被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是K，意指从N末端第二个N被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是K，意指两个N都被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是K，意指P被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是K，意指V被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是K，意指T被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是K，意指F被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是A；X2是Q并且X3是K，意指G被H、K或R取代。
在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ IDNO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是Q，意指N末端Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是Q，意指从N末端第二个Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是Q，意指从N末端第三个Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是Q，意指所有三个Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是Q，意指I被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是Q，意指N末端N被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是Q，意指从N末端第二个N被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是Q，意指两个N都被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是Q，意指P被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是Q，意指V被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是Q，意指T被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是Q，意指F被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是Q，意指G被H、K或R取代。
在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ IDNO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是Q，意指N末端Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是Q，意指从N末端第二个Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是Q，意指从N末端第三个YH、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是Q，意指所有三个Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是Q，意指I被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是Q，意指N末端N被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是Q，意指从N末端第二个N被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是Q，意指两个N都被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是Q，意指P被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是Q，意指V被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是Q，意指T被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是Q，意指F被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是Q，意指G被H、K或R取代。
在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ IDNO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是K，意指N末端Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是K，意指从N末端第二个Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是K，意指从N末端第三个Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是K，意指所有三个Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是K，意指I被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X是Q并且X3是K，意指N末端N被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是K，意指从N末端第二个N被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是K，意指两个N都被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是K，意指P被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是K，意指V被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是K，意指T被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是Q，意指F被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是Q并且X3是K，意指G被H、K或R取代。
在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ IDNO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是K，意指N末端Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是K，意指从N末端第二个Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是K，意指从N末端第三个Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是K，意指所有三个Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是K，意指I被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是K，意指N末端N被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是K，意指从N末端第二个N被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是K，意指两个N都被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是K，意指P被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是K，意指V被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是K，意指T被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是Q，意指F被H、K或R取代。在一个实施方案中，HCDR2包含含有氨基酸序列YINPYNDVTKYX1X2KFX3G的SEQ ID NO:53，其中X1是N；X2是E并且X3是K，意指G被H、K或R取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含根据SEQ ID NO:52的HCDR1，其中至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和如上列出的HCDR2，并且进一步包含重链框架区(HFR)1-4，其中HFR中的位置30被带正电荷的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含根据SEQ ID NO:52的HCDR1，其中至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和如上列出的HCDR2，并且进一步包含HCDR3和HFR1-4。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含根据SEQ ID NO:52的HCDR1，其中至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和如上列出的HCDR2，并且进一步包含HCDR3和HFR1-4，其中优选地，位置90被Y取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含根据SEQ ID NO:52的HCDR1，其中至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和如上列出的HCDR2，并且进一步包含HCDR3和HFR1-4，其中HFR1的位置30被带正电荷的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含根据SEQ ID NO:52的HCDR1，其中至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和如上列出的HCDR2，并且进一步包含HCDR3和HFR1-4，其中HFR1的位置30被带正电荷的氨基酸取代并且HFR3中的位置90被Y取代。与不包含其他修饰(诸如取代、缺失或插入)中的任一个的FR序列相比，所述HFR1-4序列还可以包含一个或多个所述修饰。然而，优选的是，FR1-4序列在某些位置不被修饰，诸如在韦尼耶区(Vernier zone)、VH/VL链间界面中的那些位置或在确定CDR典范类的位置。优选地，HFR3包含在位置90处的Y残基。在下文中，提供了FR中的其他位置，所述位置在本发明的上下文中优选不应被修饰。还优选的是，无论使用何种注释，某些位置都包含在FR中而不包含在CDR中。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含可变轻链(VL)，所述可变轻链包含含有SEQID NO:54(SATSSVSYMH)的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，其中SEQ ID NO:54的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，N末端S被H、K或R取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第二个S被H、K或R取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第三个S被H、K或R取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第四个S被H、K或R取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端所有四个S被H、K或R取代。在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，A被H、K或R取代。在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，T被H、K或R取代。在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，V可以被H、K或R取代。在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，Y被H、K或R取代。在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ IDNO:54的情况下，M被H、K或R取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含可变轻链(VL)，所述可变轻链包含含有SEQID NO:55(DTSKLAS)的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，其中SEQ ID NO:55的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，T被H、K或R取代。在一个实施方案中，在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，S被H、K或R取代。在一个实施方案中，在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被H、K或R取代。在一个实施方案中，在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，A被H、K或R取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:54(SATSSVSYMH)的氨基酸序列的LCDR1，其中SEQ ID NO:54的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；并且包含含有SEQ ID NO:55(DTSKLAS)的氨基酸序列的LCDR2，其中SEQ ID NO:55的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。
特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，N末端S被R、K或H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被R取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第二个S被R、K或H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被R取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第三个S被R、K或H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被R取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ IDNO:54的情况下，从N末端第四个S被R、K或H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ IDNO:55的情况下，L被R取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，所有四个S被R、K或H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQID NO:55的情况下，L被R取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，N末端S被K取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被R、K或H取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第二个S被K取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被R、K或H取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第三个S被K取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被R、K或H取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第四个S被K取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被R、K或H取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，所有四个S被K取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被R、K或H取代。
特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，N末端S被H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被R取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第二个S被H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ IDNO:55的情况下，L可以被R取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第三个S被H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被R取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ IDNO:54的情况下，从N末端第四个S被H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被R取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQID NO:54的情况下，所有四个S被H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被R取代。
特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，N末端S被R、K或H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被K取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第二个S被R、K或H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被K取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第三个S被R、K或H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被K取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ IDNO:54的情况下，从N末端第四个S被R、K或H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ IDNO:55的情况下，L被K取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端所有四个S被R、K或H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被K取代。
特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，N末端S被K取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被K取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第二个S被K取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被K取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第三个S被K取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被K取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第四个S被K取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被K取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，所有四个S被K取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被K取代。
特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，N末端S被H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被K取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第二个S被H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被K取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第三个S被H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被K取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ IDNO:54的情况下，从N末端第四个S被H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被K取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQID NO:54的情况下，所有四个S被H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被K取代。
特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，N末端S被R、K或H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被H取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第二个S被R、K或H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被H取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第三个S被R、K或H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被H取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ IDNO:54的情况下，从N末端第四个S被R、K或H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ IDNO:55的情况下，L被H取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，所有四个S被R、K或H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQID NO:55的情况下，L被H取代。
特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，N末端S被K取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被H取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第二个S被K取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被H取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第三个S被K取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被H取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ IDNO:54的情况下，从N末端第四个S被K取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被H取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQID NO:54的情况下，所有四个S被K取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L可以被H取代。
特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，N末端S被H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被H取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第二个S被H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被H取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第三个S被H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被H取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，从N末端第四个S被H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被H取代。特别地，在一个实施方案中，在包含氨基酸序列SATSSVSYMH的SEQ ID NO:54的情况下，所有四个S被H取代，并且在包含氨基酸序列DTSKLAS的SEQ ID NO:55的情况下，L被H取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:54(SATSSVSYMH)的氨基酸序列的LCDR1，其中SEQ ID NO:54的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和/或包含含有SEQ ID NO:55(DTSKLAS)的氨基酸序列的LCDR2，其中SEQ ID NO:55的至少一个不带正电荷的氨基酸被如上列出的带正电荷的氨基酸取代；并且在HFR1的位置30处进一步包含带正电荷的氨基酸。优选地，抗原结合多肽进一步包含HFR3。特别优选的是，HFR3包含在位置90处的Y。
在另一个实施方案中，抗原结合多肽包含VH和VL，其包含如上定义的HCDR1和/或HCDR2和/或如上定义的LCDR2，其中包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；并且其中包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代。优选地，抗原结合多肽进一步包含HFR3。特别优选的是，HFR3包含在位置90处的Y。还优选的是，抗原结合多肽进一步包含HFR1，其中HFR1的位置30被带正电荷的氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含根据SEQ ID NO:54的LCDR1，其中至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和如上列出的LCDR2，并且进一步包含轻链CDR 3(LCDR3)和轻链框架区(LFR)1-4。在一个实施方案中，抗原结合多肽包含根据SEQ IDNO:54的LCDR1，其中至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和如上列出的LCDR2，并且进一步包含重链CDR 3(LCDR3)和重链框架区(LFR)1-4。与不包含其他修饰(诸如其他取代、缺失或插入)中的任一个的FR序列相比，所述LFR1-4序列还可以包含一个或多个所述修饰。然而，在一些实施方案中，在所述其他修饰的情况下，经修饰的FR序列仍然包含本发明取代，例如在VH中FR3的位置90处的酪氨酸和/或在VH中位置30处的带正电荷的氨基酸。进一步优选的是，FR1-4序列在某些位置不被修饰，诸如在韦尼耶区、VH/VL链间界面中的那些位置或在确定CDR典范类的位置。在下文中，提供了FR中的其他位置，所述位置在本发明的上下文中优选不应被修饰。还优选的是，无论使用何种注释，某些位置都包含在FR中而不包含在CDR中。
优选地，抗原结合多肽具体结合α/βTCR/CD3复合物，优选地α/βTCR/CD3复合物存在于T细胞上、更优选存在于T淋巴细胞上。本发明的抗原结合多肽与参考抗体竞争结合表达α/βTCR/CD3复合物的T细胞。在某些实施方案中，抗原结合多肽结合与包含根据SEQ IDNO:1的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:2的VL氨基酸序列的参考抗体相同的表位。在某些实施方案中，抗原结合多肽与参考抗体竞争结合表达α/βTCR/CD3复合物的T细胞，其中抗体包含根据SEQ ID NO:1的VH和根据SEQ ID NO:2的VL。在优选的实施方案中，参考抗体包含恒定结构域，优选人IgG1恒定结构域，和人κ轻链区。在某些实施方案中，抗原结合多肽与参考抗体结合表达α/βTCR/CD3复合物的T细胞，其中抗体包含根据SEQ ID NO:60的重链(HC)氨基酸序列和根据SEQ ID NO:6的轻链(LC)氨基酸序列。优选地，抗原结合多肽与参考抗体结合表达α/βTCR/CD3复合物的细胞，其中抗体包含根据SEQ ID NO:60的重链氨基酸序列和根据SEQ ID NO:6的轻链氨基酸序列。
在本发明第一方面的一个实施方案中，抗原结合多肽的HCDR和/或LCDR中包含的一个或多个带正电荷的氨基酸在重链的位置31、53和/或54处和/或轻链的位置31和/或56处。
在一个实施方案中，抗原结合多肽的HCDR中包含的带正电荷的氨基酸在重链的位置31处。在一个实施方案中，抗原结合多肽的HCDR中包含的带正电荷的氨基酸在重链的位置31和53处。在一个实施方案中，抗原结合多肽的HCDR中包含的带正电荷的氨基酸在重链的位置31和54处。在一个实施方案中，抗原结合多肽的HCDR中包含的带正电荷的氨基酸在重链的位置31、53和54处。另外，这些实施方案中的任何一个的抗原结合多肽可以进一步包含在HFR3中的位置90处的Y。
在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR中包含的带正电荷的氨基酸在轻链的位置31处。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR中包含的带正电荷的氨基酸在轻链的位置56处。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR中包含的带正电荷的氨基酸在轻链的位置31和56处。另外，这些实施方案中的任何一个的抗原结合多肽可以进一步包含在HFR3中的位置90处的Y。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链的位置31处以及在轻链的位置31和/或56处包含带正电荷的氨基酸。在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链的位置53处以及在轻链的位置31和/或56处包含带正电荷的氨基酸。在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链的位置54处以及在轻链的位置31和/或56处包含带正电荷的氨基酸。在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链的位置31和53处以及在轻链的位置31和/或56处包含带正电荷的氨基酸。在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链的位置31和54处以及在轻链的位置31和/或56处包含带正电荷的氨基酸。在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链的位置53和54处以及在轻链的位置31和/或56处包含带正电荷的氨基酸。这些实施方案中的任何一个的抗原结合多肽可以进一步在VH中的FR3中的位置90处包含Y和/或在VH中的位置30处包含带正电荷的氨基酸。
在一个实施方案中，抗原结合多肽的重链中位置30处的带正电荷的氨基酸是R、K或H。优选地，抗原结合多肽的重链中位置30处的带正电荷的氨基酸是R或K。甚至更优选地，抗原结合多肽的重链中位置30处的带正电荷的氨基酸是R。在一个实施方案中，抗原结合多肽的重链的HFR1中位置30处的带正电荷的氨基酸是R或K并且在HFR3的位置90处是Y。
在本发明第一方面的一个实施方案中，抗原结合多肽的重链的位置31处的带正电荷的氨基酸是R、K或H。更优选地，抗原结合多肽的重链的位置31处的带正电荷的氨基酸是R或K。甚至更优选地，抗原结合多肽的重链的位置31处的带正电荷的氨基酸是R。甚至更优选地，抗原结合多肽的重链的位置31处的带正电荷的氨基酸是R或K并且在位置90处是Y，或抗原结合多肽的重链的位置31处的带正电荷的氨基酸是R并且在HFR3的位置90处是Y。
在一个实施方案中，抗原结合多肽的重链的位置53处的带正电荷的氨基酸是R、K或H。优选地，抗原结合多肽的重链的位置53处的带正电荷的氨基酸是K、R或H并且在重链的位置90处是Y。优选地，抗原结合多肽的重链的位置53处的带正电荷的氨基酸是R或K。更优选地，抗原结合多肽的重链的位置53处的带正电荷的氨基酸是R。特别优选的是，抗原结合多肽的重链的位置53处的带正电荷的氨基酸是R并且在HFR3的位置90处是Y。进一步优选的是，抗原结合多肽的重链的位置53处的带正电荷的氨基酸是R或K并且在抗原结合多肽的重链的位置30处是丝氨酸。特别优选的是，抗原结合多肽的重链的位置53处的带正电荷的氨基酸是R并且在抗原结合多肽的重链的位置30处是丝氨酸。
在一个实施方案中，抗原结合多肽的重链的位置54的带正电荷的氨基酸是R或K。优选地，抗原结合多肽的重链的位置54的带正电荷的氨基酸是K。特别优选的是，抗原结合多肽的重链的位置54的带正电荷的氨基酸是K并且在位置90处是Y，或抗原结合多肽的重链的位置54的带正电荷的氨基酸是R并且在HFR3的位置90处是Y。
在一个实施方案中，抗原结合多肽的轻链的位置31的带正电荷的氨基酸是R或K。优选地，抗原结合多肽的重链的位置31处的带正电荷的氨基酸是R。特别优选的是，抗原结合多肽的轻链的位置31的带正电荷的氨基酸是R并且在HFR3的位置90处是Y，或抗原结合多肽的轻链的位置31的带正电荷的氨基酸是K并且在HFR3的位置90处是Y。
在一个实施方案中，抗原结合多肽的轻链中位置56处的带正电荷的氨基酸是R或K。优选地，抗原结合多肽的轻链中位置56处的带正电荷的氨基酸是R。特别优选的是，抗原结合多肽的轻链中位置56处的带正电荷的氨基酸是R并且在位置90处是Y，或抗原结合多肽的轻链中位置56处的带正电荷的氨基酸是K并且在HFR3的位置90处是Y。
在重链中优选以下带正电荷的氨基酸的组合：R31和R53；R31和K53；R31和H53；R31和R54；R31和K54；K31和R53；K31和K53；K31和H53；K31和R54；K31和K54；H31和R53；H31和K51；H31和H51；H31和R54；H31和K54；R31、R53和R54；R31、R53和K54；R31、K53和R54；R31、K53和K54；R31、H53和R54；R31、H53和K54；K31、R53和R54；K31、R53和K54；K31、K53和R54；K31、K53和K54；K31、H53和R54；K31、H53和K54；H31、R53和R54；H31、R53和K54；H31、K53和R54；H31、K53和K54；H31、H53和R54；H31、H53和K54；R53和R54；R53和K54；K53和R54；K53和K54；H53和R54；以及H53和K54。这些实施方案中的任何一个的抗原结合多肽可以进一步在VH中的FR3中的位置90处包含Y和/或在VH中的位置30处包含带正电荷的氨基酸。甚至更优选的是，抗原结合多肽的重链的位置53处的带正电荷的氨基酸是R。甚至更优选的是，抗原结合多肽的重链的位置53处的带正电荷的氨基酸是R，并且抗原结合多肽在VH的FR3中的位置90处包含Y。
在轻链中优选以下带正电荷的氨基酸的组合：R31和R56；R31和K56；K31和R56；以及K31和K56。
特别优选的是在轻链中的以下带正电荷的氨基酸的组合，连同在HFR3中的位置90处的取代：
R31和R56；以及位置90是Y；
R31和K56；以及位置90是Y；
K31和R56；以及位置90是Y；
K31和K56；以及位置90是Y。
在重链中和在轻链中的以下带正电荷的氨基酸的组合是特别优选的：重链31R和轻链56R；重链54K和轻链56R；重链54K和轻链31R；重链53R和轻链56R；重链53R和轻链31R和56R；以及重链31R、轻链31R和轻链56R。
特别优选的是在重链中和在轻链中的以下带正电荷的氨基酸的组合，并且在重链中位置90处有或没有取代：重链31R和轻链56R，以及重链位置90是Y；重链54K和轻链56R，以及重链位置90Y；重链54K和轻链31R和56R，以及重链位置90Y；重链53R和轻链56R；重链53R和轻链56R以及重链位置90Y。
在本发明的上下文中观察到，抗原结合多肽中被带正电荷的氨基酸的取代(例如，在HCDR1和/或HCDR2和/或LCDR1和/或LCDR2中的相应位置处和/或在如上定义的HFR1的位置30处)提供了增加的与α/βTCR/CD3复合物的结合。因此，与不包含任何本发明取代的亲本抗原结合多肽相比，提供了结合EC50的降低。结合EC50的降低以结合EC50的“x倍”降低或以“结合AUC提高％”来描述。
在本发明的上下文中，抗原结合多肽特异性结合α/βT细胞受体(TCR)/CD3复合物；并且与亲本抗原结合多肽相比具有增加的结合，其中与亲本抗原结合多肽相比，抗原结合多肽具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30倍的结合EC50降低。
在一个实施方案中，与亲本抗原结合多肽相比，抗原结合多肽具有至少2倍的结合EC50降低。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR2，其中含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且其中与亲本抗原结合多肽相比，抗原结合多肽显示出至少2倍的结合EC50降低。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:55的LCDR2，其中含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且其中与亲本抗原结合多肽相比，抗原结合多肽显示出至少2倍的结合EC50增加。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含在位置90处包含Y残基的HFR3，并且与亲本抗原结合多肽相比，显示出至少2倍的EC50降低。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR2，其中含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；并且包含在位置90处包含Y的HFR3；并且其中与亲本抗原结合多肽相比，抗原结合多肽显示出至少2倍的结合EC50增加。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:55的LCDR2，其中含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且包含在位置90处包含Y的HFR3；并且其中与亲本抗原结合多肽相比，抗原结合多肽显示出至少2倍的结合EC50增加。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含：含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR2，其中含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；以及含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2，其中含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且其中与亲本抗原结合多肽相比，抗原结合多肽显示出至少2倍的结合EC50增加。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含：含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR2，其中含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；以及含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:55的LCDR2，其中含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；并且包含在位置90处包含Y的HFR3；并且其中与亲本抗原结合多肽相比，抗原结合多肽显示出至少2倍的结合EC50增加。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链的位置30处包含带正电荷的氨基酸并且与亲本抗原结合多肽相比，显示出2倍的EC50降低。优选地，抗原结合多肽的重链的位置30处的带正电荷的氨基酸是R、K或H，并且与亲本抗原结合多肽、优选亲本抗体相比，抗原结合多肽显示出至少2倍的EC50降低。甚至更优选地，抗原结合多肽的重链的位置30处的带正电荷的氨基酸是R或K，并且与亲本抗原结合多肽相比，抗原结合多肽显示出至少2倍的EC50降低。
在一个实施方案中，本发明第一方面的抗原结合多肽优选在重链中包含以下突变之一：位置30R、位置30K、位置31R、位置31K、位置53R、位置54R、位置54K，并且与亲本抗原结合多肽相比，显示出至少2倍的结合EC50降低。在一个实施方案中，本发明第一方面的抗原结合多肽优选在重链中包含以下突变之一：位置31R、位置31K、位置53R、位置54K，并且与亲本抗原结合多肽相比，显示出至少4倍的结合EC50降低。
在一个实施方案中，本发明第一方面的抗原结合多肽优选在重链中包含以下突变之一：位置31R、位置53R、位置54K，并且与亲本抗原结合多肽相比，显示出至少5倍的结合EC50降低。更优选地，抗原结合多肽在重链的位置54K处包含一个突变，并且与亲本抗原结合多肽相比，显示出至少8倍的结合EC50降低。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在轻链的位置56R或56K处包含突变，并且与亲本抗原结合多肽相比，显示出至少4倍的结合EC50降低。更优选地，抗原结合多肽优选在轻链的位置56R处包含突变，并且与亲本抗原结合多肽相比，显示出至少8倍的结合EC50降低。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选包含在重链的位置90Y处的突变，并且与亲本抗原结合多肽相比，显示出至少3倍的结合EC50降低。在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在重链中包含以下优选氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y；以及位置54R和位置90Y，并且与亲本抗原结合多肽相比，显示出至少4倍的结合EC50降低。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在重链中包含以下优选氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y；并且与亲本抗原结合多肽相比，显示出至少5倍的结合EC50降低。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在重链中包含以下优选氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y；并且与亲本抗原结合多肽相比，显示出至少7倍的结合EC50降低。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在重链的位置31R和位置90Y处包含突变；并且与亲本抗原结合多肽、优选亲本抗体相比，显示出至少8倍的结合EC50降低。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在轻链的位置56R处包含突变并且进一步在位置90Y处包含突变，并且与亲本抗原结合多肽相比，显示出至少13倍的结合EC50降低。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；以及在重链中位置53R和位置90Y以及在轻链中位置56R，并且与亲本抗原结合多肽相比，显示出至少15倍的结合EC50降低。优选地，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；以及在重链中位置54K和位置90Y以及在轻链中位置56R，并且与亲本抗原结合多肽相比，显示出至少20倍的结合EC50降低。甚至更优选地，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R，并且与亲本抗原结合多肽相比，显示出至少30倍的结合EC50降低。
诸位发明人在所附实施例中出人意料地证明，本发明抗原结合多肽的结合AUC与亲本抗原结合多肽的结合AUC、优选亲本抗体的结合AUC相比增加，其以结合AUC提高％来描述。因此，与亲本抗原结合多肽相比，本文提供的抗原结合多肽具有增加的结合AUC，优选地抗原结合多肽具有至少约10％的结合AUC提高；具有至少约15％的结合AUC提高；至少约50％的结合AUC提高；至少约140％的结合AUC提高；至少约200％的结合AUC提高；至少约250％的结合AUC提高；至少约400％的结合AUC提高；至少约500％的结合AUC提高；至少约600％的结合AUC提高；至少约700％的结合AUC提高；或至少约800％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，与亲本抗原结合多肽相比，本发明抗原结合多肽具有至少约10％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，本发明第一方面的抗原结合多肽具有至少约10％的结合AUC提高，即与亲本抗原结合多肽相比，与表达α/βTCR/CD3复合物的细胞的结合增加。在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR2，其中含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且其中与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽具有至少约15％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:55的LCDR2，其中含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且其中与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽具有至少约10％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在HFR3中位置90处包含Y并且与亲本抗原结合多肽相比具有至少约10％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR2，其中含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；并且在HFR3中位置90处包含Y，并且与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽具有至少约10％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2，其中含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且在HFR3中位置90处包含Y，并且其中与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽具有至少约10％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含：含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR2，其中含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；以及含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2，其中包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且其中与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽具有至少约10％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含：含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR2，其中含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；以及含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:55的LCDR2，其中含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；并且在HFR3中位置90处包含Y，并且其中与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽具有至少约10％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，本发明第一方面的抗原结合多肽优选在重链中包含以下取代之一：位置30R、位置30K；位置31R、位置31K；位置53R、位置54R；位置54K，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少约15％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，本发明第一方面的抗原结合多肽优选在重链中包含以下突变之一：位置30R、位置30K；位置31R、位置31K；位置53R、位置54K，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少约50％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链中HFR1的位置30处进一步包含带正电荷的氨基酸，并且显示出至少80％的AUC提高。优选地，抗原结合多肽的HFR1中位置30处的带正电荷的氨基酸是R、K或H，并且与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽显示出至少80％的AUC提高。甚至更优选地，抗原结合多肽的HFR1中位置30处的带正电荷的氨基酸是R或K，并且与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽显示出至少80％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，本发明第一方面的抗原结合多肽优选在重链中包含以下突变之一：位置30R、位置30K；位置31R、位置31K；位置53R、位置54K，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少100％的结合AUC提高。特别优选的是，抗原结合多肽在重链中位置31R处具有取代，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有约140％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在轻链中位置56R处包含突变，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少约15％或更多的结合AUC提高；至少约20％的结合AUC提高；至少约50％的提高；至少约100％；或至少约200％的结合AUC提高。更优选地，抗原结合多肽优选在轻链中位置56R处包含突变，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少约200％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选包含在重链的位置90Y处的突变，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少约10％的结合AUC提高。在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在重链中包含以下优选氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y；并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少约200％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在重链中包含以下优选氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y；并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少约250％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选包含在重链中位置54K和位置90Y的氨基酸组合；并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少约300％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选包含在轻链中位置56R处的突变并且进一步包含在重链的位置90Y处的突变，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少约10％的结合AUC提高；至少约50％的结合AUC提高；约100％的结合AUC提高；或约200％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；以及在重链中位置54K和位置90Y以及在轻链中位置56R，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少约200％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R或在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少约250％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R或在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少约300％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R或在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少约400％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少约500％的结合AUC提高；至少约600％的结合AUC提高；至少约700％的结合AUC提高；或至少约800％的结合AUC提高。特别优选的是，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R，与亲本抗原结合多肽相比，具有至少约500％的结合AUC提高。
诸位发明人在所附实施例中出人意料地证明，本发明抗原结合多肽的Tm与亲本抗原结合多肽的Tm相比增加，其以按℃计的ΔTm或按℃计的绝对温度值来描述。因此，与亲本抗原结合多肽相比，本文提供的抗原结合多肽具有增加的Tm。优选地，与亲本抗原结合多肽相比，抗原结合多肽具有至少1℃的ΔTm、至少2℃的ΔTm、至少3℃的ΔTm、至少3,5℃的ΔTm或至少4℃的ΔTm。
本文提供的抗原结合多肽与亲本抗原结合多肽相比、优选与亲本抗体相比具有增加的Tm，并且具有至少72.5℃的Tm，具有至少72.8℃的Tm，具有至少73.8℃的Tm，具有至少74.8℃的Tm或具有至少75.3℃的Tm。更优选地，抗原结合多肽具有至少73.0℃、甚至更优选至少73.5℃的Tm，具有至少74℃的Tm，具有至少75℃的Tm或具有至少76℃的Tm。
在一个实施方案中，与亲本抗原结合多肽，诸如包含如本文在亲本抗体BMA031(V36)的上下文中所述的VH和VL氨基酸序列的亲本抗原结合多肽相比，本发明抗原结合多肽具有至少1℃的ΔTm。
在一个实施方案中，本文提供的抗原结合多肽具有与不包含本发明取代的抗原结合多肽相比至少1℃的ΔTm或至少72.8℃的Tm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR2，其中含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且其中所述抗原结合多肽具有与亲本抗原结合多肽相比至少1℃的ΔTm或具有至少72.8℃的Tm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:55的LCDR2，其中含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且其中所述抗原结合多肽具有与亲本抗原结合多肽相比至少1℃的ΔTm或具有至少72.8℃的Tm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含在位置90处包含Y残基的HFR3，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少2℃、优选至少2.5℃、更优选至少3℃的ΔTm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR2，其中含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；并且包含在位置90处包含Y的HFR3；并且其中所述抗原结合多肽具有与亲本抗原结合多肽相比至少1℃的ΔTm或具有至少72.8℃的Tm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:55的LCDR2，其中含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且包含在位置90处包含Y的HFR3；并且其中所述抗原结合多肽具有与亲本抗原结合多肽相比至少1℃的ΔTm或具有至少72.8℃的Tm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含：含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR2，其中含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；以及含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2，其中含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且其中所述抗原结合多肽具有与亲本抗原结合多肽相比至少1℃的ΔTm或具有至少72.8℃的Tm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含：含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR2，其中含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；以及含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:55的LCDR2，其中含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；并且包含在位置90处包含Y的HFR3；并且其中所述抗原结合多肽具有与亲本抗原结合多肽相比至少1℃的ΔTm或具有至少72.8℃的Tm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选包含在重链的位置90Y处的突变，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少1.0℃的ΔTm。在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在重链中包含以下氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y；以及位置54R和位置90Y，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少1.0℃的ΔTm。优选地，抗原结合多肽在重链中包含以下氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y；以及位置54R和位置90Y，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少2.0℃的ΔTm。甚至更优选地，抗原结合多肽优选在重链中包含以下氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y；以及位置54R和位置90Y，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.0℃的ΔTm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在重链中包含以下氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；以及位置53R和位置90Y；并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.5℃的ΔTm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在重链中位置53R和位置90Y处包含突变；并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少4.0℃的ΔTm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选包含在轻链中位置56R处的突变并且进一步包含在位置90Y处的突变，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.0℃的ΔTm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；以及在重链中位置54K和位置90Y以及在轻链中位置56R，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少2.0℃的ΔTm。
优选地，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；以及在重链中位置53R和位置90Y以及在轻链中位置56R，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.5℃的ΔTm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选包含在重链的位置90Y处的突变，并且具有至少73.0℃的Tm，具有至少74℃的Tm，具有至少75℃的Tm，或具有至少76℃的Tm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在重链中包含以下氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y；以及位置54R和位置90Y，并且具有至少73.46℃的Tm。在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在重链中包含以下氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y；以及位置54R和位置90Y，并且具有至少74.46℃的Tm。在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在重链中包含以下氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y；以及位置54R和位置90Y，并且具有至少75.46℃的Tm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链中包含以下氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y；以及位置54R和位置90Y，并且具有至少75.5℃的Tm。甚至更优选地，抗原结合多肽在重链中包含以下氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y；以及位置54R和位置90Y，并且具有至少75.9℃的Tm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在重链中包含以下氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；以及位置53R和位置90Y；并且具有至少76.0℃的Tm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选包含在重链中位置53R和位置90Y处的突变；并且具有至少76.5℃的Tm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选包含在轻链中位置56R处的突变并且进一步包含在重链的位置90Y处的突变，并且具有至少72.0℃的Tm、至少73.0℃的Tm、至少74.0℃的Tm、至少75.0℃的Tm、或至少76.0℃的Tm。优选地，抗原结合多肽具有至少75.0℃的Tm。甚至更优选地，抗原结合多肽具有至少75.5℃的Tm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：位置31R、位置90Y和位置56R；位置53R、位置90Y和位置56R；以及位置54K和位置90Y和位置56R，并且具有至少74,0℃的Tm。优选地，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：位置31R、位置90Y和位置56R；位置53R、位置90Y和位置56R；以及位置54K和位置90Y和位置56R，并且具有至少75.0℃的Tm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；以及在重链中位置53R和位置90Y以及在轻链中位置56R，并且具有至少76.0℃的Tm。
在一个实施方案中，本发明抗原结合多肽具有10％的结合AUC提高，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少1℃的ΔTm。
在一个实施方案中，本文提供的抗原结合多肽具有至少约10％的结合AUC提高，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少1℃的ΔTm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR2，其中含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且其中与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽具有至少约10％的结合AUC提高并且具有至少1℃的ΔTm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:55的LCDR2，其中含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且其中与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽具有至少约10％的结合AUC提高并且具有至少1℃的ΔTm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在HFR3中位置90处包含Y并且与亲本抗原结合多肽相比具有至少约10％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR2，其中含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；并且在HFR3中位置90处包含Y，并且与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽具有至少约10％的结合AUC提高并且具有至少1℃的ΔTm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:55的LCDR2，其中含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代并且在HFR3中位置90处包含Y；并且其中与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽具有至少约10％的结合AUC提高并且具有至少1℃的ΔTm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含：含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR2，其中含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；以及含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2，其中含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且其中与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽具有至少约10％的结合AUC提高并且具有至少1℃的ΔTm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含：含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR2，其中含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；以及含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1和/或含有氨基酸序列SEQ ID NO:55的LCDR2，其中含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；并且在HFR3中位置90处包含Y，并且其中与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽具有至少约10％的结合AUC提高并且具有至少1℃的ΔTm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选包含在重链的位置90Y处的突变，与亲本抗原结合多肽相比，具有至少约10％的结合AUC提高并且具有至少1℃的ΔTm。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在重链中包含以下优选氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y；以及位置54R和位置90Y，与亲本抗原结合多肽相比，具有至少1.0℃的ΔTm并且具有至少约200％的结合AUC提高。
优选地，抗原结合多肽在重链中包含以下氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y；以及位置54R和位置90Y，与亲本抗原结合多肽相比，具有至少2.0℃的ΔTm并且具有至少约200％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链中包含以下氨基优选氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y；与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.0℃的ΔTm并且具有至少约240％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选包含在重链中位置54K和位置90Y处的突变；与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.0℃的ΔTm并且具有至少约300％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在重链中包含以下氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；以及位置53R和位置90Y；与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.5℃的ΔTm并且具有至少约200％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选在重链中包含以下氨基酸组合之一：位置31R和位置90Y；以及位置53R和位置90Y；与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.5℃的ΔTm并且具有至少约250％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选包含在重链中位置53R和位置90Y处的突变；与亲本抗原结合多肽相比，具有至少4.0℃的ΔTm并且具有至少约200％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选包含在重链中位置53R和位置90Y处的突变；与亲本抗原结合多肽相比，具有至少4.0℃的ΔTm并且具有至少约250％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选包含在轻链中位置56R处的突变并且进一步包含在位置90Y处的突变，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.0℃的ΔTm并且具有至少约150％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽优选包含在轻链中位置56R处的突变并且进一步包含在位置90Y处的突变，并且显示具有至少3.0℃的ΔTm并且具有至少约200％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；以及在轻链中位置54K和位置90Y以及在重链中位置56R，与亲本抗原结合多肽相比，具有至少2.0℃的ΔTm并且具有至少约200％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；以及在重链中位置54K和位置90Y以及在轻链中位置56R，与亲本抗原结合多肽相比，具有至少2.0℃的ΔTm并且具有至少约300％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；以及在重链中位置54K和位置90Y以及在轻链中位置56R，与亲本抗原结合多肽相比，具有至少2.0℃的ΔTm并且具有至少约400％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；以及在重链中位置54K和位置90Y以及在轻链中位置56R，与亲本抗原结合多肽相比，具有至少2.0℃的ΔTm并且具有至少约500％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；以及在重链中位置54K和位置90Y以及在轻链中位置56R，与亲本抗原结合多肽相比，具有至少2.0℃的ΔTm并且具有至少约600％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；以及在重链中位置54K和位置90Y以及在轻链中位置56R，与亲本抗原结合多肽相比，具有至少2.0℃的ΔTm并且具有至少约700％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；以及在重链中位置54K和位置90Y以及在轻链中位置56R，与亲本抗原结合多肽相比，具有至少2.0℃的ΔTm并且具有至少约800％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.0℃的ΔTm并且具有至少约200％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.0℃的ΔTm并且具有至少约300％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.0℃的ΔTm并且具有至少约400％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.0℃的ΔTm并且具有至少约500％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.0℃的ΔTm并且具有至少约600％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.0℃的ΔTm并且具有至少约700％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.0℃的ΔTm并且具有至少约800％的结合AUC提高。
可能出人意料地显示，用带正电荷的氨基酸对携带非带正电荷的氨基酸的位置的某些取代提供了改善的结合(例如，结合AUC(图5，上图))。出人意料地，发现位置90Y导致Tm显著增加(图5，下图)。位置90处的氨基酸Y可以被视为用于改善Tm的构建块，因为位置90处被Y取代导致所有测试分子的Tm增加(参见图5，下图)。此外，诸位发明人出人意料地发现，携带在位置90处的Y连同一个或多个位置被带正电荷的氨基酸的取代的分子，除了Tm的增加之外，还导致结合(例如，结合AUC)的显著增加/改善，即，这些取代导致协同效应。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链中包含以下优选氨基酸组合：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；位置54R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y，并且优选地，与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽具有至少3℃度的ΔTm并且具有至少约200％的结合AUC提高。优选地，抗原结合多肽在重链中包含以下氨基酸组合：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；并且优选地，与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽具有至少3℃度的ΔTm并且具有至少约270％的结合AUC提高。甚至更优选地，抗原结合多肽在重链中包含以下氨基酸组合：位置54K和位置90Y，并且与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽具有至少3℃度的ΔTm并且具有至少约240％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在VH中位置31R、位置90Y以及在VL中位置56R；在VH中位置53R、位置90Y以及在VL中位置56R；以及在VH中位置54K、位置90Y以及在VL中位置56R，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少2.50℃的ΔTm并且具有至少约245％的结合AUC提高。更优选地，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在VH中位置31R、位置90Y以及在VH中位置56R；在VH中位置53R、位置90Y以及在VH中位置56R；并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.50℃的ΔTm并且具有至少约400％的结合AUC提高。特别优选的是，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在VH中位置53R、位置90Y以及在VH中位置56R；并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少3.50℃的ΔTm并且具有至少约800％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链中包含以下优选氨基酸组合：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；位置54R和位置90Y；以及位置54K和位置90Y，并且优选地，与亲本抗原结合多肽相比，具有至少75℃的Tm并且具有至少约200％的结合AUC提高。优选地，抗原结合多肽在重链中包含以下氨基酸组合：位置31R和位置90Y；位置53R和位置90Y；并且优选地，与亲本抗原结合多肽相比，具有至少76℃的Tm并且具有至少约270％的结合AUC提高。甚至更优选地，抗原结合多肽在重链中包含以下氨基酸组合：位置54K和位置90Y，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少75℃的Tm并且具有至少约240％的结合AUC提高。
在一个实施方案中，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中的VH中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；以及在重链中位置54K、位置90Y以及在轻链中位置56R，并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少75℃的Tm并且具有至少约245％的结合AUC提高。更优选地，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置31R、位置90Y以及在轻链中位置56R；在重链中位置53R、位置90Y以及在轻链中位置56R；并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少76℃的Tm并且具有至少约400％的结合AUC提高。特别优选的是，抗原结合多肽在重链和轻链中包含以下优选氨基酸组合：在重链中位置53R、位置90Y以及在重链中位置56R；并且与亲本抗原结合多肽相比，具有至少76℃的Tm并且具有至少约800％的结合AUC提高。
在本发明第一方面的一个实施方案中，抗原结合多肽是抗体或其片段。优选地，抗原结合多肽是双特异性抗体或其片段。更优选地，抗原结合多肽是进一步包含TCR或其片段的双特异性抗体。
在本发明第一方面的一个实施方案中，抗原结合多肽包含形成如先前所述的第一结合位点的VH和VL，并且进一步包含第二结合位点。优选地，所述第二结合位点特异性结合细胞表面蛋白。优选的细胞表面蛋白选自糖蛋白、MHC I类蛋白、MHC II类蛋白；β-微球蛋白；免疫球蛋白诸如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM；TCR；共受体分子，诸如CD4或CD8。在优选的实施方案中，细胞表面蛋白是癌细胞的表面蛋白。优选地，抗原结合多肽的第二结合位点特异性结合MHC-肽复合物。更优选地，所述MHC分子是与肽复合的MHC I分子，其中优选地，MHC I分子是与多肽复合的人白细胞抗原(HLA)分子。甚至更优选地，抗原结合多肽的第二结合位点特异性结合癌细胞的MHC肽复合物，优选地其中所述HLA是HLA-A*02。
在一个实施方案中，本发明第一方面的抗原结合多肽的第二抗原结合位点例如包含在抗体、TCR、支架蛋白或拟抗体中或由其形成，所述拟抗体诸如设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、扭结蛋白(knottin)、抗运载蛋白(anticalin)、fynomer或亲和体(affibody)。优选地，第二抗原结合位点包含在TCR或其片段中。
在一个实施方案中，抗原结合多肽的第二抗原结合位点至少包含TCR的α(Vα)和/或β(Vβ)链的可变区；或TCR的γ(Vγ)和/或δ(Vδ)链或另一种抗体的VL和/或VH。优选地，抗原结合多肽的第二结合位点至少包含TCR的Vα和/或Vβ或Vγ和/或Vδ。第二抗原结合位点的Vα和Vβ或Vγ和Vδ可以在两条单独的多肽链上。第二抗原结合位点的Vα和Vβ或Vγ和Vδ可以在同一条多肽链上。优选地，第二抗原结合位点的Vα和Vβ或Vγ和Vδ在两条单独的多肽链上。优选地，抗原结合多肽进一步包含恒定结构域。
在本发明的上下文中，Vα和Vβ或(Vγ或Vδ)优选结合肿瘤相关抗原(TAA)/MHC复合物。可包含在本发明抗原结合多肽中的Vα和Vβ或Vγ或Vδ详细描述在例如WO 2018172533、WO 2018033291、WO 2017158103、WO 2018104438、WO 2018104478、WO 2019002444、WO2017158116、美国专利号10800845、美国专利号10537624、美国专利号10538573、美国专利号10537624、美国专利号10590194、美国专利号10800832和美国专利号10527623中，将所述专利的内容均通过引用以其整体特此并入。
因此，在一个实施方案中，Vα和Vβ或Vγ和Vδ包含WO 2018172533、WO 2018033291、WO 2017158103、WO 2018104438、WO 2018104478、WO 2019002444、WO 2017158116美国专利号10800845、美国专利号10537624、美国专利号10538573、美国专利号10537624、美国专利号10590194、美国专利号10800832和美国专利号10527623中披露的氨基酸序列或由其组成，并且在引用的现有技术中描述的Vα和Vβ或Vγ和Vδ结合在引用的相同专利申请中披露的TAA肽。将其内容均通过引用整体以其整体特此并入。
在一方面，能够用于本文所述方法和实施方案的肿瘤相关抗原(TAA)肽包括，例如，美国公开案20160187351、美国公开案20170165335、美国公开案20170035807、美国公开案20160280759、美国公开案20160287687、美国公开案20160346371、美国公开案20160368965、美国公开案20170022251、美国公开案20170002055、美国公开案20170029486、美国公开案20170037089、美国公开案20170136108、美国公开案20170101473、美国公开案20170096461、美国公开案20170165337、美国公开案20170189505、美国公开案20170173132、美国公开案20170296640、美国公开案20170253633、美国公开案20170260249、美国公开案20180051080、美国公开号20180164315、美国公开案20180291082、美国公开案20180291083、美国公开案20190255110、美国专利9,717,774、美国专利9,895,415、美国公开案20190247433、美国公开案20190292520、美国公开案20200085930、美国专利10,336,809、美国专利10,131,703、美国专利10,081,664、美国专利10,081,664、美国专利10,093,715、10,583,573和US20200085930中所述的那些TAA肽，将这些公开案、序列和其中描述的序列表中每一个的内容通过引用以其整体并入本文。
在本发明的上下文中，另一种抗体的VL和/或VH优选结合肿瘤表面上存在的蛋白质。
在一个实施方案中，抗原结合多肽的VH和VL是抗体的。在一个实施方案中，第一抗原结合位点包含两条单独多肽链上的VH和VL。在一个实施方案中，第一抗原结合位点包含同一条多肽链上的VH和VL。优选地，除非抗原结合多肽是单链多肽，否则第一抗原结合位点中包含的VH和VL在两条单独多肽链上。
在一个实施方案中，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQ ID NO:52(HCDR1)中。在一个实施方案中，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQ ID NO:52(HCDR1)和SEQ ID NO:53(HCDR1和HCDR2)中。在一个实施方案中，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:3(HCDR1和LCDR1)中。在一个实施方案中，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:55(HCDR1和LCDR2)中。在一个实施方案中，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQ ID NO:52和SEQID NO:3和SEQ ID NO:55(HCDR1、LCDR1和LCDR2)中。在一个实施方案中，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54(HCDR1、HCDR2和LCDR1)中。在一个实施方案中，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:55(HCDR1、HCDR2和LCDR2)中。在一个实施方案中，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55(HCDR1、HCDR2、LCDR1和LCDR2)中。在一个实施方案中，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54(HCDR2和LCDR1)中。在一个实施方案中，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:55(HCDR2和LCDR2)中。在一个实施方案中，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55(HCDR2和LCDR1和LCDR2)中。在一个实施方案中，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQ ID NO:54中。在一个实施方案中，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQID NO:54和SEQ ID NO:53(LCDR1和HCDR2)中。在一个实施方案中，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55(LCDR1和LCDR2)中。在一个实施方案中，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQ IDNO:55(LCDR2)中。优选地，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQ ID NO:55(LCDR2)、SEQ ID NO:53(HCDR2)或SEQ ID NO:52(HCDR1)中。更优选地，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQ ID NO:52(HCDR1)和SEQ IDNO:55(LCDR2)中。特别优选的是，抗原结合多肽的至少一个被带正电荷的氨基酸取代的氨基酸在SEQ ID NO:53(HCDR2)和SEQ ID NO:55(LCDR2)中。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含在抗原结合多肽的HFR1中的位置30处的丝氨酸(S)或天冬酰胺(N)。进一步优选的是，抗原结合多肽的重链的位置53处的带正电荷的氨基酸是R或K并且在抗原结合多肽的HFR1的位置30处是丝氨酸。还进一步优选的是，抗原结合多肽的重链的位置53处的带正电荷的氨基酸是R，并且丝氨酸在抗原结合多肽的HFR1的位置30处。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含在抗原结合多肽的HFR1中的位置30处的丝氨酸(S)或天冬酰胺(N)。
在一个实施方案中，抗原结合多肽的HFR1中位置30处的苏氨酸(T)被天冬酰胺(N)或丝氨酸(S)取代。在一个实施方案中，抗原结合多肽的HFR1中位置31处的S被天冬酰胺(N)取代。在一个实施方案中，抗原结合多肽重链中位置56处的缬氨酸(V)被异亮氨酸(I)取代。在一个实施方案中，抗原结合多肽重链中位置100a处的谷氨酸(E)被天冬氨酸(D)取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽重链中位置30处的苏氨酸(T)被天冬酰胺(N)或丝氨酸(S)取代。在一个实施方案中，抗原结合多肽重链中位置31处的S被天冬酰胺(N)取代。在一个实施方案中，抗原结合多肽重链中位置56处的缬氨酸(V)被异亮氨酸(I)取代。在一个实施方案中，抗原结合多肽重链中位置100a处的谷氨酸(E)被天冬氨酸(D)取代。在一个实施方案中，抗原结合多肽轻链中位置31处的S被N取代。在一个实施方案中，轻链中位置93处的S被N取代。在一个实施方案中，轻链中位置31和位置93处的S均被N取代。在一个实施方案中，抗原结合多肽重链中位置30处的T被N或S取代，抗原结合多肽重链中位置31处的S被N取代，抗原结合多肽重链中位置56处的V被I取代，抗原结合多肽重链中位置100a处的E被D取代，并且抗原结合多肽轻链中位置31处的S被N取代。在一个实施方案中，抗原结合多肽重链中位置30处的T被N或S取代，抗原结合多肽重链中位置31处的S被N取代，抗原结合多肽重链中位置56处的V被I取代，抗原结合多肽重链中位置100a处的E被D取代，并且抗原结合多肽轻链中位置93处的S被N取代。在一个实施方案中，抗原结合多肽重链中位置30处的T被N或S取代，抗原结合多肽重链中位置31处的S被N取代，抗原结合多肽重链中位置56处的V被I取代，抗原结合多肽重链中位置100a处的E被D取代，并且抗原结合多肽轻链中位置31和93处的S被N取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含重链CDR3(HCDR3)中的其他修饰。在一个实施方案中，所述修饰是被带负电荷的氨基酸诸如E或D的取代。优选地，HCDR3的位置100处的氨基酸被取代。特别优选的是，位置100a被E或D取代。在一个实施方案中，抗原结合多肽包含在轻链CDR3(LCDR3)中的其他修饰。在一个实施方案中，所述修饰是用选自R、H、K、D、E、N、Q、S、T、Y的极性氨基酸的取代。优选地，LCDR3的氨基酸位置93被取代。特别优选的是，位置93是N或S。在一个实施方案中，抗原结合多肽包含在重链HCDR3和LCDR3中的其他修饰。在一个实施方案中，抗原结合多肽包含在HCDR3中被带负电荷的氨基酸的取代和在LCDR3中被极性氨基酸的取代。优选地，HCDR3中的位置100a被带负电荷的氨基酸取代，并且LCDR3的位置93被极性氨基酸取代。甚至更优选地，HCDR3中的位置100a被E取代，并且LCDR3中的位置93被极性氨基酸S取代；HCDR3中的位置100a被E取代，并且LCDR3中的位置93被极性氨基酸N取代；HCDR3中的位置100a被D取代，并且LCDR3中的位置93被极性氨基酸S取代；HCDR3中的位置100a被D取代，并且LCDR3中的位置93被极性氨基酸N取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽的HCDR3具有序列GSYYDYX1GFVY(SEQ ID NO:56)，其中X1是D或E。优选地，X1是E(GSYYDYEGFVY SEQ ID NO:64)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSX1X2X3LT(SEQ ID NO:57)，其中X1是S或N，X2是选自Q、D、H、S、Y、A和N的氨基酸；并且X3是P或A。优选地，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSSX2X3LT(SEQID NO:65)。优选地，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSX1NX3LT(SEQ ID NO:66)，其中X2是N。优选地，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSX1X2PLT(SEQ ID NO:67)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSSQPLT(SEQ ID NO:68)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSSDPLT(SEQ ID NO:69)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSSHPLT(SEQ ID NO:70)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSSSPLT(SEQ ID NO:71)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSSYPLT(SEQ ID NO:72)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSSAPLT(SEQ ID NO:73)。在特别优选的实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSSNPLT(SEQ ID NO:74)。
在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSSQALT(SEQ ID NO:75)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSSDALT(SEQ ID NO:76)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSSHALT(SEQ ID NO:77)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSSSALT(SEQ ID NO:78)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSSYALT(SEQ ID NO:79)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSSAALT(SEQ ID NO:80)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSSNALT(SEQ ID NO:81)。
在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSNQPLT(SEQ ID NO:82)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWNSDPLT(SEQ ID NO:83)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWNSHPLT(SEQ ID NO:84)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWNSSPLT(SEQ ID NO:85)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWNSYPLT(SEQ ID NO:86)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWNSAPLT(SEQ ID NO:87)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWNSNPLT(SEQ ID NO:88)。
在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSNQALT(SEQ ID NO:89)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWNSDALT(SEQ ID NO:90)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWNSHALT(SEQ ID NO:91)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWNSSALT(SEQ ID NO:92)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWNSYALT(SEQ ID NO:93)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWNSAALT(SEQ ID NO:94)。在一个实施方案中，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWNSNALT(SEQ ID NO:95)。
优选地，抗原结合多肽的LCDR3具有序列QQWSX1NPLT(SEQ ID NO:96)，其中X1是S或N。甚至更优选地，X1是S。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如包含在SEQ ID NO:1(BMA031 V36_VH)、SEQ ID NO:97(GL1_BM_VH28_HV)、SEQ ID NO:98(GL1_BM_VH31_HV)、SEQ ID NO:99(HEBE1_H10_HV)、SEQ ID NO:100(HEBE1_H66_HV)、and SEQ ID NO:101(HEBE1_H71_HV)中列出的VH中的HFR1、HFR2和HFR3或由其组成。优选地，HFR1、HFR2和HFR3包含在SEQ ID NO:1(BMA031V36_VH)中列出的VH中。在本发明抗原结合多肽的优选实施方案中，其中HFR1中的位置30和/或HFR3中的位置90被取代，尽管框架区的剩余氨基酸包含如上所列出的HFR1、HFR2和HFR2或由其组成，但这种取代得以保持。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如包含在SEQ ID NO:2(BMA031 V36_VL)或SEQ ID NO:102(GL1BMVK43_VL)中列出的VL中的LFR1、LFR2和LFR3或由其组成。优选地，LFR1、LFR2、LFR3和LFR4包含在SEQ ID NO:2(BMA031 V36_VL)中列出的VH中。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如包含在SEQ ID NO:1(BMA031 V36_VH)、SEQ ID NO:97(GL1_BM_VH28_HV)、SEQ ID NO:98(GL1_BM_VH31_HV)、SEQ ID NO:99(HEBE1_H10_HV)、SEQ ID NO:100(HEBE1_H66_HV)和SEQ ID NO:101(HEBE1_H71_HV)中列出的VH中的HFR1、HFR2和HFR3或由其组成，并且包含如包含在SEQ ID NO:2(BMA031 V36_VL)中列出的VL中的LFR1、LFR2和LFR3或由其组成。在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如包含在SEQ ID NO:1(BMA031 V36_VH)、SEQ ID NO:97(GL1_BM_VH28_HV)、SEQ ID NO:98(GL1_BM_VH31_HV)、SEQ ID NO:99(HEBE1_H10_HV)、SEQ ID NO:100(HEBE1_H66_HV)和SEQ ID NO:101(HEBE1_H71_HV)中列出的VH中的HFR1、HFR2和HFR3或由其组成，并且包含如包含在SEQID NO:102(GL1BMVK43_VL)中列出的VL中的LFR1、LFR2和LFR3或由其组成。优选地，抗原结合多肽包含如包含在SEQ ID NO:1(BMA031 V36_VH)中列出的VH中的HFR1、HFR2和HFR3，并且包含如包含在SEQ ID NO:2(BMA031 V36_VL)中列出的VL中的LFR1、LFR2和LFR3或由其组成。在本发明抗原结合多肽的优选实施方案中，其中HFR1中的位置30和/或位置90被取代，尽管框架区的剩余氨基酸包含如上所列出的HFR1、HFR2和HFR2或由其组成，但这种取代得以保持。
在一个实施方案中，抗原结合多肽进一步包含如包含在SEQ ID NO:1(BMA031V36_VH)中列出的VH的HFR4；或如包含在SEQ ID NO:2(BMA031 V36_VL)中列出的VL中的LFR4或由其组成。在优选的实施方案中，抗原结合多肽包含如包含在SEQ ID NO:1(BMA031 V36_VH)中列出的VH中的HFR1、HFR2、HFR3和HFR4或由其组成，并且包含如包含在SEQ ID NO:2(BMA031 V36_VL)中列出的VL中的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4或由其组成。在本发明抗原结合多肽的优选实施方案中，其中HFR1中的位置30和/或位置90被取代，尽管框架区的剩余氨基酸包含如上所列出的HFR1、HFR2和HFR2或由其组成，但这种取代得以保持。
在如以下更详细描述的进一步实施方案中，本发明抗原结合多肽包含如上文所定义的重链框架区(HFR)和/或轻链框架区(LFR)或其功能变体。如上所定义，包含具有一定程度序列同一性的HFR或LFR序列的抗原结合多肽也可以发挥相似或更高的功能特性，诸如增加或改善的结合EC50或Tm。特别地，包含HFR或LFR的功能变体的抗原结合多肽具有改善或增加的至少2倍的结合EC50和/或具有改善或增加的至少1℃的Tm或至少1℃的ΔTm，如上文所定义。在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如SEQ ID NO:103中列出的HFR1或与如SEQ IDNO:103中列出的HFR1具有至少约60％序列同一性的人HFR1序列、如SEQ ID NO:104中列出的HFR2或与SEQ ID NO:104具有至少约75％序列同一性的人HFR2序列、如SEQ ID NO:105中列出的HFR3或与SEQ ID NO:105具有至少约55％序列同一性的人HFR3序列和如SEQ ID NO:106中列出的HFR4序列或与SEQ ID NO:106具有至少90％序列同一性的人HFR4序列。在这些情况的每一种中，维持上面概述的HFR中的优选氨基酸取代，特别是在位置30和/或90。例如，SEQ ID NO:1(BMA031 V36_VH)的HFR1与SEQ ID NO:100(HEBE1_H66_HV)的HFR1具有63.33％的序列同一性，或SEQ ID NO:1(BMA031 V36_VH)的HFR2与SEQ ID NO:99(HEBE1_H10_HV)的HFR2具有78.6％的序列同一性。因此，如上文和下文中提供的框架区被设想包含在本文所提供的抗原结合多肽中。
在优选的实施方案中，抗原结合多肽包含根据SEQ ID NO:103至SEQ ID NO:106的HFR1、HFR2、HFR3和HFR4或在每种情况下分别与SEQ ID NO:103至SEQ ID NO:106具有至少90％序列的人HFR1、HFR2、HFR3和HFR4序列。在其中抗原结合多肽包含在重链中的90Y的实施方案中，抗原结合多肽的上文和下文提供的框架区包含所定义序列同一性的HFR，并且进一步包含在重链中的90Y。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如SEQ ID NO:107中列出的LFR1或与SEQID NO:107具有至少约50％序列同一性的人LFR1序列、如SEQ ID NO:108中列出的LFR2或与SEQ ID NO:108具有至少约80％序列同一性的人LFR2序列、如SEQ ID NO:109中列出的LFR3序列或与SEQ ID NO:109具有至少约80％序列同一性的人LFR3序列、和如SEQ ID NO:110中列出的LFR4序列或与SEQ ID NO:110具有至少约80％序列同一性的人LFR4序列。在优选的实施方案中，抗原结合多肽包含根据SEQ ID NO:107至SEQ ID NO:110的LFR1、LFR2、LFR 3和LFR4或在每种情况下分别与SEQ ID NO:107至SEQ ID NO:110具有至少90％序列的人LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列。
优选的是，与分别指示的根据SEQ ID NO:103至110的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％序列同一性的HFR1-4和LFR1-4序列在某些位置(例如，韦尼耶区的位置、有助于VH/VL链间界面的位置或确定CDR典范类的位置)不被修饰。在其中抗原结合多肽包含在重链中的Y90的实施方案中，包含上文和下文提供的框架区的抗原结合多肽包含在重链中的90Y。在其中抗原结合多肽包含在重链中位置30处的带正电荷的氨基酸的实施方案中，包含上文和下文提供的框架区的抗原结合多肽包含在重链中位置30处的带正电荷的氨基酸。在以下所有实施方案中，维持根据本发明第一方面的(i)的HCDR的序列和根据(ii)的LCDR的序列。
在特定方面，VL中未被修饰的位置是位置6、位置23、位置38、位置44、位置59、位置61、位置62、位置64、位置66、位置82、位置86、位置87、位置88、位置98、位置99和/或位置101。
在特定方面，VH中未被修饰的位置是位置6、位置14、位置22、位置36、位置37、位置39、位置45、位置46、位置69、位置71、位置78、位置86、位置91、位置92、位置103、位置104和位置106。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的VH结构域，并且其中具有至少80％序列同一性的VH结构域包含氨基酸14P、46E、86D、104G和106G并且包含一个或多个本发明取代，特别是如本发明第一方面的(i)中指定的HCDR1和/或HCDR2和/或如(iii)和/或(iv)中指定的取代。
在一个实施方案中，优选地，抗原结合多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的VL结构域，并且其中与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的VL结构域包含氨基酸59P、61R、62F、82D、99G和101G并且包含一个或多个本发明取代，特别是如本发明第一方面(ii)中指定的LCDR1和/或LCDR2。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的VH结构域，并且其中具有至少80％序列同一性的VH结构域包含氨基酸14P、46E、86D、104G和106G并且包含一个或多个本发明取代，特别是如本发明第一方面的(i)中指定的HCDR1和/或HCDR2和/或如(iii)和/或(iv)中指定的取代；以及根据SEQ ID NO:2的VL结构域或与SEQ ID NO:2具有至少约80％序列同一性的序列，并且其中具有至少80％序列同一性的VL结构域包含氨基酸59P、61R、62F、82D、8 99G和101G并且包含一个或多个本发明取代，特别是如本发明第一方面的(ii)中指定的LCDR1和/或LCDR2。
在一个实施方案中，优选地，抗原结合多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的VH结构域，并且其中具有至少80％序列同一性的VH结构域包含氨基酸：6Q和36W，并且包含一个或多个本发明取代，特别是如本发明第一方面的(i)中指定的HCDR1和/或HCDR2和/或如(iii)和/或(iv)中指定的取代。
在一个实施方案中，优选地，抗原结合多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的VL结构域，并且其中具有至少80％序列同一性的VL结构域包含氨基酸6Q和86Y，并且抗原结合多肽包含一个或多个本发明取代，特别是如本发明第一方面的(ii)中指定的LCDR1和/或LCDR2。
在一个实施方案中，优选地，抗原结合多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的VH结构域，并且其中具有至少80％序列同一性的VH结构域包含氨基酸6Q和36W，并且抗原结合多肽包含一个或多个本发明取代，特别是如本发明第一方面的(i)中指定的HCDR1和/或HCDR2和/或如(iii)和/或(iv)中指定的取代；与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的VL结构域，并且其中具有至少80％序列同一性的VL结构域包含氨基酸6Q和86Y，并且抗原结合多肽包含一个或多个本发明取代，特别是如本发明第一方面的(ii)中指定的LCDR1和/或LCDR2。
在一个实施方案中，优选地，抗原结合多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的VH结构域，并且其中具有至少80％序列同一性的VH结构域包含氨基酸：22C、37V、39Q、45L、69L、71S、78A、91Y、92C和103W，并且抗原结合多肽包含一个或多个本发明取代，特别是如本发明第一方面的(i)中指定的HCDR1和/或HCDR2和/或如(iii)和/或(iv)中指定的取代。
在一个实施方案中，优选地，抗原结合多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的VL结构域，并且其中具有至少80％序列同一性的VL结构域包含氨基酸：C23、38Q、44P、64G、66G、87Y、88C和98F，并且抗原结合多肽包含一个或多个本发明取代，特别是如本发明第一方面的(ii)中指定的LCDR1和/或LCDR2。
在一个实施方案中，优选地，抗原结合多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的VH结构域，并且其中具有至少80％序列同一性的VH结构域包含氨基酸：22C、37V、39Q、45L、69L、71S、78A、91Y、92C和103W，并且抗原结合多肽包含一个或多个本发明取代，特别是如本发明第一方面的(i)中指定的HCDR1和/或HCDR2和/或如(iii)和/或(iv)中指定的取代；以及与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的VL结构域，并且其中具有至少80％序列同一性的VL结构域包含氨基酸：23C、38Q、44P、64G、66G、87Y、88C和98F，并且抗原结合多肽包含一个或多个本发明取代，特别是如本发明第一方面的(ii)中指定的LCDR1和/或LCDR2。
在一个实施方案中，优选地，抗原结合多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的VH结构域，并且其中具有至少80％序列同一性的VH结构域包含氨基酸：6Q、14P、22C、36W、37V、39Q、45L、46E、69L、71S、78A、86D、91Y、92C、103W、104G和106G，并且抗原结合多肽包含一个或多个本发明取代，特别是如本发明第一方面的(i)中指定的HCDR1和/或HCDR2和/或如(iii)和/或(iv)中指定的取代。
在一个实施方案中，优选地，抗原结合多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的VL结构域，并且其中具有至少80％序列同一性的VL结构域包含氨基酸：6Q、23C、38Q、44P、59P、61R、62F、64G、66G、82D、86Y、88C、98F、99G和101G，并且抗原结合多肽包含一个或多个本发明取代，特别是如本发明第一方面的(ii)中指定的LCDR1和/或LCDR2。
在一个实施方案中，优选地，抗原结合多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的VH结构域，并且其中具有至少80％序列同一性的VH结构域包含氨基酸：6Q、14P、22C、36W、37V、39Q、45L、46E、69L、71S、78A、86D、91Y、92C、103W、104G和106G，并且抗原结合多肽包含一个或多个本发明取代，特别是如本发明第一方面的(i)中指定的HCDR1和/或HCDR2和/或如(iii)和/或(iv)中指定的取代；以及与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的VL结构域，并且其中具有至少80％序列同一性的VL结构域包含氨基酸：6Q、23C、38Q、44P、59P、61R、62F、64G、66G、82D、86Y、88C、98F、99G和101G，并且抗原结合多肽包含一个或多个本发明取代，特别是如本发明第一方面的(ii)中指定的LCDR1和/或LCDR2。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有选自SEQ ID NO:7(VH H90Y)；SEQ IDNO:9(VH_T30N_S31R)、SEQ ID NO:10(VH_T30S_S31R_Y53R_E100aD)、SEQ ID NO:11(VHS31R)、SEQ ID NO:12(VH_T30S_Y53R)、SEQ ID NO:14(VH N54K H90Y)、SEQ ID NO:15(VH_T30N_S31N_Y53R)、SEQ ID NO:16(VH_T30N_S31R_V56I)、SEQ ID NO:17(VH_S31R_N54K_E100aD)、SEQ ID NO:19(VH_T30R)、SEQ ID NO:20(VH T30K)；SEQ ID NO:21(VH S31K)；SEQID NO:22(VH_Y53R)、SEQ ID NO:23(VH_Y53K)、SEQ ID NO:24(VH_N54R)、SEQ ID NO:25(VHN54K)、SEQ ID NO:29(VH_Y53H)、SEQ ID NO:30(VH_S31H)、SEQ ID NO:31(VH S31R H90Y)、SEQ ID NO:32(VH Y53R H90Y)、SEQ ID NO:33(VH N54R H90Y)和SEQ ID NO:34(VH_E61Q_H90Y)的氨基酸序列的VH或包含与分别选自SEQ ID NO:7、9、10、11、12、14、15、16、17、19、20、21、22、23、24、25、29、30、31、32、33和34的氨基酸序列至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列的其VH变体，其中与具有根据SEQ ID NO:1的序列的VH相比，VH变体保留相应的一个或多个本发明取代，并且优选分别包含根据SEQ ID NO:7、9、10、11、12、14、15、16、17、19、20、21、22、23、24、25、29、30、31、32、33和34的序列的HCDR1至3。如本文所用，“保留相应的一个或多个取代”意指维持如本文所提供的一个或多个本发明取代。因此，在特定方面，与给定SEQ ID NO具有提供的％的同一性的抗原结合多肽保留一个或多个本发明取代，例如(i)在重链的以下一个或多个位置：30、31、53和54；和/或(ii)在轻链的以下一个或多个位置：31和56，和/或在重链的位置90。在优选方面，抗原结合多肽包含含有选自SEQ IDNO:7、9、10、11、12、14、15、16、17、19、20、21、22、23、24、25、29、30、31、32、33和34的氨基酸序列的VH。在特定方面，抗原结合多肽包含含有SEQ ID NO:11(VH S31R)、或SEQ ID NO:22(VH_Y53R)的氨基酸序列的VH。在进一步优选的方面，抗原结合多肽也可以是上面提供的VH的功能片段，其中所述功能片段包含一个或多个本发明取代。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有选自SEQ ID NO:8(VL S31R S56R)、SEQ ID NO:13(VL S31N S56R S93N)、SEQ ID NO:18(VL S56R)、SEQ ID NO:26(VL_S31R)SEQ ID NO:27(VL_S31K)和SEQ ID NO:28(VL_S56K)的氨基酸序列的VL或包含与分别选自SEQ ID NO:8、13、18、26、27和28的氨基酸序列至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列的其VL变体，其中与具有根据SEQ ID NO:2的序列的VL相比，所述VL变体保留相应的一个或多个取代，并且优选包含分别根据SEQ ID NO:8、13、18、26、27和28的所述序列的LCDR1至3。如本文所用，“保留相应的一个或多个取代”意指维持如本文所提供的一个或多个本发明取代。因此，在特定方面，与给定SEQ ID NO具有提供的％的同一性的抗原结合多肽保留一个或多个本发明取代，例如(i)在重链的以下一个或多个位置：30、31、53和54；和/或(ii)在轻链的以下一个或多个位置：31和56，和/或在重链的位置90。在优选方面，抗原结合多肽包含含有选自SEQ ID NO:8、13、18、26、27和28的氨基酸序列的VL。在进一步优选的方面，抗原结合多肽也可以是上面提供的VL的功能片段，其中所述功能片段包含一个或多个本发明取代。
在以下中，阐述了本文提供的VH和VL的特定组合。在本文中应当理解，可以分别组合上面提供的VH和VL。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含VH和VL，所述VH和VL包含选自以下的序列：
SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10和SEQID NO:2、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11和SEQID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:12和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:8、SEQID NO:19和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:2、SEQID NO:22和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:2、SEQID NO:25和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:27、SEQID NO:1和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:2、SEQID NO:7和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:18、SEQID NO:32和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:18。
在进一步优选的方面，抗原结合多肽也可以是上面提供的VL和VH的一个或多个功能片段，其中所述一个或多个功能片段包含一个或多个本发明取代。
优选地，抗原结合多肽包含根据SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:18(VH_Y53R_H90Y和VL_S56R)；SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:18(VH_N54K_H90Y和VL_S56R)、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:18(VH_S31R_H90Y和VL_S56R)；或SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:2(VH_H90Y和BMA031(V36)_VL)的VH和VL。
更优选地，抗原结合多肽包含根据以下的VH和VL：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:2。
如上文和下文中公开的，本发明优选涉及the抗原结合多肽，其中VH包含SEQ IDNO:32(VH Y53R H90Y)的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列的其VH变体，其中与具有根据SEQ ID NO:1的序列的VH相比，VH变体保留相应的取代(Y53和H90Y或相应的氨基酸取代)，并且其中VL包含结合α/βTCR/CD3复合物(如本文所定义)的抗体VL，特别地其中VL包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在进一步优选的方面，抗原结合多肽也可以是上面定义的VH和VL的功能片段，其中所述功能片段包含一个或多个本发明取代。在一个实施方案中，抗原结合多肽包含其他修饰，例如在CDR中相同类别氨基酸中的一个或多个氨基酸的其他取代。其他修饰可以是极性不带电荷的氨基酸被另一个极性不带电荷的氨基酸的取代；带负电荷的氨基酸被另一个带负电荷的氨基酸的取代；和/或疏水性氨基酸被另一个疏水性氨基酸的取代。其他修饰也可以是极性不带电荷的氨基酸被另一个极性不带电荷的氨基酸的取代；带负电荷的氨基酸被另一个带负电荷的氨基酸的取代；和疏水性氨基酸被另一个疏水性氨基酸的取代。
在一个实施方案中，重链中的位置31和轻链中的位置56被带正电荷的氨基酸取代，优选地其中重链中的位置31被R取代，并且轻链中的位置56被R取代。
在一个实施方案中，根据SEQ ID NO:1的重链中的位置31和轻链中的位置56被带正电荷的氨基酸取代，并且重链中的位置90是Y，优选地重链中的位置31被R取代，并且轻链中的位置56被R取代，并且重链中的位置90是Y。
在一个实施方案中，重链中的位置31被带正电荷的氨基酸取代，并且重链中的位置90是Y，优选地重链中的位置31被R取代，并且重链中的位置90是Y。
在一个实施方案中，重链中的位置53和轻链中的位置56被带正电荷的氨基酸取代，优选地重链中的位置53被R取代，并且轻链中的位置56被R取代。
在一个实施方案中，重链中的位置53和轻链中的位置56被带正电荷的氨基酸取代，并且重链中的位置90是Y，优选地重链中的位置53被R取代，重链中的位置90是Y，并且轻链中的位置56被R取代。
在一个实施方案中，重链中的位置54被带正电荷的氨基酸取代，并且重链中的位置90是Y，优选地重链中的位置54被R取代，并且重链中的位置90是Y。
在一个实施方案中，重链中的位置90是Y并且轻链中的位置56被带正电荷的氨基酸取代，优选地重链中的位置90是Y并且轻链中的位置56被R取代。
在一个实施方案中，轻链中的位置56被带正电荷的氨基酸取代，优选地轻链中的位置56被R取代。
在一个实施方案中，重链中的位置54和轻链中的位置56被带正电荷的氨基酸取代，并且其中重链中的位置90被疏水性氨基酸取代，优选地重链中的位置54被K取代，轻链中的位置56被R取代，并且重链中的位置90被Y取代。
在一个实施方案中，重链中的位置54和轻链中的位置31和56被带正电荷的氨基酸取代，并且其中重链中的位置90被疏水性氨基酸取代，优选地重链中的位置54被K取代，轻链中的位置31和56被R取代，并且重链中的位置90被Y取代。
在一个实施方案中，重链中的位置31和53被带正电荷的氨基酸取代，优选地重链中的位置31和53被R取代。
在一个实施方案中，重链中的位置53和轻链中的位置31和56被带正电荷的氨基酸取代，优选地其中重链中的位置53被R取代，轻链中的位置31和56被R取代。
在一个实施方案中，重链中的位置31被带正电荷的氨基酸取代，优选地重链中的位置31被R取代。
在一个实施方案中，重链中的位置31被带正电荷的氨基酸取代，优选地重链中的位置31被K取代。
在一个实施方案中，重链中的位置30被带正电荷的氨基酸取代，优选地重链中的位置30被K取代。
在一个实施方案中，轻链中的位置56被带正电荷的氨基酸取代，优选地轻链中的位置56被R取代。
在一个实施方案中，轻链中的位置56被带正电荷的氨基酸取代，优选地轻链中的位置56被K取代。
在一个实施方案中，重链中的位置54被带正电荷的氨基酸取代，优选地重链中的位置54被K取代。
在一个实施方案中，重链中的位置54被带正电荷的氨基酸取代，并且重链中的位置90被疏水性氨基酸取代，优选地重链中的位置54被K取代并且重链中的位置90被Y取代。
在一个实施方案中，重链中的位置31和54被带正电荷的氨基酸取代，优选地其中重链中的位置31被R取代并且重链中的位置54被K取代。
在一个实施方案中，重链中的位置53被带正电荷的氨基酸取代，优选地其中重链中的位置53被R取代。
在一个实施方案中，重链中的位置53被带正电荷的氨基酸取代，并且位置90是Y，优选地其中重链中的位置53被R取代，并且位置90是Y。
在一个实施方案中，重链中的位置31被带正电荷的氨基酸取代，优选地重链中的位置31被R取代。
在一个实施方案中，重链中的位置31和轻链中的位置31和56被带正电荷的氨基酸取代，优选地其中重链中的位置31被R取代，并且轻链中的位置31和56被R取代。
在一个实施方案中，重链中的位置53被带正电荷的氨基酸取代，优选地其中重链中的位置53被R取代。
在一个实施方案中，轻链中的位置31和56被带正电荷的氨基酸取代，并且其中重链中的位置90被疏水性氨基酸取代，优选地其中轻链中的位置31和56被R取代，并且重链中的位置90被Y取代。
在一个实施方案中，VH和VL或Vα和Vβ共价或非共价连接在一起。优选地，VH和VL或Vα和Vβ通过二硫键共价连接。
在一个实施方案中，抗原结合多肽进一步包含一个或多个进一步的抗原结合位点。例如，如果抗原结合多肽包含第一结合位点和第二结合位点并且进一步包含进一步的结合位点，则抗原结合多肽可以是三特异性分子或三价等。在一个实施方案中，抗原结合多肽可以进一步包含跨膜区。在一个实施方案中，抗原结合多肽可以进一步包含跨膜区，所述跨膜区任选地包含胞质信号传导区。在一个实施方案中，抗原结合多肽可以进一步包含诊断剂。在一个实施方案中，抗原结合多肽可以进一步包含治疗剂。在一个实施方案中，本发明抗原结合多肽可以与广泛用于癌症治疗的各种药物和治疗(例如像化疗剂、非化疗剂、抗肿瘤剂和/或放射，优选化疗剂)同时、之前或之后施用。在一个实施方案中，这种治疗剂可以是生长抑制剂，诸如细胞毒性剂或放射性同位素。
在一个实施方案中，本发明抗原结合多肽可以以双特异性形式、特别是以双特异性分子使用。出人意料地显示，包含含有在HCDR1和/或HCDR2和/或LCDR1和/或LCDR2中的相应位置处被至少一个带正电荷的氨基酸取代的如上定义的第一结合位点的抗原结合多肽并且进一步包含含有例如TCR或其片段的第二结合位点的双特异性分子以双特异性形式显示出改善的效应子功能。如下文实施例中所证明的，包含如上文所定义的第一结合位点和第二结合位点的此类双特异性分子在T细胞介导的肿瘤细胞杀伤中显示出增强的效力(参见下面描述的实施例3)。因此，出人意料地显示，根据以上本发明第一方面所述的抗原结合多肽也是功能性的并且以双特异性形式显示出改善。还出人意料地显示，如上所述的根据本发明第一方面的抗原结合多肽在T细胞介导的肽HLA阳性肿瘤细胞的肿瘤杀伤中发挥增加的效力，并且另外，与包含/>形式的BMA031(V36)的VH的亲本抗原结合多肽相比，在双特异性/>支架中几乎没有检测到针对肽HLA阴性肿瘤细胞系的细胞毒性。所述双特异性/>分子的效力通过测量释放的LDH和EC50值(如上所定义的功能EC50)来评估。例如，与包含/>形式的BMA031(V36)的VH和VL的亲本抗原结合多肽相比，抗原结合多肽的针对Hs695T细胞和U2OS细胞的功能EC50降低。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含形成第一抗原结合位点和第二抗原结合位点的第一多肽链和第二多肽链，其中第一多肽链具有由下式表示的结构：
V1-L1-V2-L2-D1[I]
其中
V1是第一可变结构域；
V2是第二可变结构域；
L1和L2是接头；L2存在或不存在；
D1是二聚化结构域并且存在或不存在；
并且其中所述第二多肽链具有由下式表示的结构：
V3-L3-V4-L4-D2[II]
其中
V3是第三可变结构域；
V4是第四可变结构域；
L3和L4是接头；L4存在或不存在；并且
D2是二聚化结构域并且存在或不存在；
其中D1和D2彼此特异性结合，并且其中
V1、V2、V3、V4中之一是如在本发明的上下文中定义的VH，
V1、V2、V3、V4中之一是如在本发明的上下文中定义的VL，并且
V1、V2、V3、V4中之一是TCR的Vα或Vγ，并且
V1、V2、V3、V4中之一是所述TCR的Vβ或Vδ。
在一个实施方案中，VH和VL形成第一结合位点，并且Vα和Vβ或Vγ和Vδ形成第二结合位点。
在一个实施方案中，V1或V2是如在本发明的上下文中定义的VL，并且V3或V4是如在本发明的上下文中定义的VH，并且V3或V4是Vα或Vγ，并且V1或V2是TCR的Vβ或Vδ。
在一个实施方案中，V1或V2是如在本发明的上下文中定义的VH，并且V3或V4是如在本发明的上下文中定义的VL，并且V3或V4是Vβ或Vδ，并且V1或V2是TCR的Vα或Vγ。
在一个实施方案中，V1或V2是如在本发明的上下文中定义的VL，并且V3或V4是如在本发明的上下文中定义的VH，并且V3或V4是Vβ或Vδ，并且V1或V2是TCR的Vα或Vγ。在一个实施方案中，V1或V2是如在本发明的上下文中定义的VH，并且V3或V4是如在本发明的上下文中定义的VL，并且V3或V4是Vα或Vγ，并且V1或V2是TCR的Vβ或Vδ。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如下V1至V4：V1是VH，V2是Vβ或Vδ，V3是Vα或Vγ，并且V4是VL。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如下V1至V4：V1是Vβ或Vδ；V2是VH；V3是VL；并且V4是Vα或Vγ。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如下V1至V4：V1是Vβ或Vδ，V2是VL，V3是VH，并且V4是Vα或Vγ。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如下V1至V4：V1是VL，V2是Vβ或Vδ，V3是Vα或Vγ，并且V4是VH。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如下V1至V4：V1是VH，V2是Vβ或Vδ，V3是VL，并且V4是Vα或Vγ。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如下V1至V4：V1是Vβ或Vδ，V2是VH；V3是Vα或Vγ，并且V4是VL。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如下V1至V4：V1是VL，V2是Vβ或Vδ；V3是VH，并且V4是Vα或Vγ。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如下V1至V4：V1是Vβ或Vδ，V2是VL；V3是Vα或Vγ，并且V4是VH。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如下V1至V4：V1是VH，V2是VL，并且V3是Vα或Vγ；V4是Vβ或Vδ。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如下V1至V4：V1是VL；V2是VH；V3是Vα或Vγ；并且V4是Vβ或Vδ。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如下V1至V4：V1是VH；V2是VL；V3是Vβ或Vδ；并且V4是Vα或Vγ。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含如下V1至V4：V1是VL；V2是VH；V3是Vβ或Vδ；并且V4是Vα或Vγ。
关于式I和II，优选的是，VH和VL位于不同的多肽链上，并且Vα或Vγ和Vβ或Vδ位于不同的多肽链上，并且二聚化结构域D1和D2是异二聚化结构域。特别优选的是，在抗原结合多肽中，V1是VH，V2是Vβ，V3是Vα，并且V4是VL。在一个实施方案中，抗原结合多肽的D1和D2是Fc结构域，优选是一对Fc结构域，并且优选是不同的并且包含迫使异二聚化的突变，优选是“杵臼”突变。
L1、L2、L3、L4如果存在，则可以是2-25、2-20或3-18个氨基酸长的。在一些实施方案中，接头诸如L1、L2、L3、L4可以是长度不超过14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸的肽。在其他实施方案中，接头诸如L1、L2、L3、L4可以是5-25、5-15、4-11、10-20或20-30个氨基酸长的。
在一个实施方案中，L1和/或L3具有5-15个氨基酸、优选5-10个氨基酸、更优选8个氨基酸的长度。在优选的实施方案中，L2和L4不存在并且L1和L3存在并且具有5-10个、优选8个氨基酸的长度。在一个实施方案中，如上文所述的根据本发明第一方面的抗原结合多肽可以以如上文所定义的任何形式使用，例如以双特异性形式或COVD形式。优选地，抗原结合多肽是双特异性分子。甚至更优选地，抗原结合多肽是双特异性分子。
在一个实施方案中，作为VH或VL的V1并且作为VH或VL的V2分别形成第一结合位点，并且包含VH和VL，诸如包含在如上详细定义的抗原结合多肽中，并且具有在如上定义的相应位置处的至少一个带正电荷的氨基酸。
在一个实施方案中，本文公开的双特异性分子包含如本文所述的形式，并且显示出如上文所述以功能EC50计算的增加的细胞毒性，并且优选具有小于1000pM、小于900pM、小于800pM、小于700pM、小于600pM并且特别是小于500pM的功能EC50。优选地，所述双特异性分子是如上文和下文所定义的双特异性/>分子，并且具有小于1000pM、小于900pM、小于800pM、小于700pM、小于600pM并且特别是小于500pM的功能EC50。
在优选的实施方案中，抗原结合多肽是指双特异性抗原结合多肽并且包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链形成第一抗原结合位点和第二抗原结合位点，其中第一多肽链和第二多肽链具有由如上定义的式(I)和(II)表示的结构，并且其中第一多肽链包含特异性结合α/βTCR/CD3复合物的第一结合位点并且包含第一可变结构域(V1)和第二可变结构域(V2)，并且其中第一可变结构域是重链可变结构域(VH)，并且第二可变结构域是如上文所定义的轻链可变结构域(VL)；并且其中第二多肽链包含第二抗原结合位点，所述第二抗原结合位点包含第三可变结构域(V3)和第四可变结构域(V4)，并且其中第三可变结构域包含可变α结构域(Vα)和可变β结构域(Vβ)。
在优选的实施方案中，抗原结合多肽包含第一多肽链，第一多肽链包含形成第一抗原结合位点的VH和VL，并且其中VH和VL包含具有如上在本发明的上下文中定义的至少一个带正电荷的氨基酸的HCDR和LCDR；并且抗原结合多肽包含形成第二结合位点的Vα和Vβ，并且其中Vα和Vβ包含TCR的VαCDR1-3和VβCDR1-3。在进一步优选的实施方案中，抗原结合多肽进一步在形成第一抗原结合位点的VH和VL中的VH中包含HFR1-4并且在VL中包含LFR1-4，如上文所定义，并且在形成第二结合位点的Vα和Vβ中包含Vα的FR1-4和Vβ的FR1-4。
在优选的实施方案中，抗原结合多肽包含第一多肽链，第一多肽链包含形成第一抗原结合位点的VH和VL，并且其中VH和VL包含具有如上定义的至少一个带正电荷的氨基酸的HCDR和LCDR以及在VH中位置90处的酪氨酸；并且抗原结合多肽包含形成第二结合位点的Vα和Vβ，并且其中Vα和Vβ包含TCR的VαCDR1-3和VβCDR1-3。在进一步优选的实施方案中，抗原结合多肽进一步在形成第一抗原结合位点的VH和VL中的VH中包含HFR1-4并且在VL中包含LFR1-4，如上文所定义，并且在形成第二结合位点的Vα和Vβ中包含Vα的FR1-4和Vβ的FR1-4。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含式[I]的第一多肽链，所述第一多肽链在其C末端进一步包含接头(L2)和二聚化结构域(D1)或其一部分；和/或包含式[II]的第二多肽链，所述第二多肽链在其C末端进一步包含接头(L4)和二聚化结构域(D2)或其一部分，其中D1和D2彼此特异性结合。二聚化结构域是上文“定义”部分中所定义的。优选地，接头L1和L3具有10-25个氨基酸或5-10个氨基酸、更优选8个氨基酸的长度。在一个实施方案中，式[I]的第一多肽链在其C末端进一步包含接头(L2)和Fc1结构域或其一部分，和/或式[II]的第二多肽链在其C末端进一步包含接头(L4)和Fc2结构域或其一部分。Fc结构域如上文“定义”部分中所定义，并且彼此特异性结合。Fc1和Fc2是不同的并且彼此特异性结合，并且它们的序列例如如下文所指示。
在一个实施方案中，Fc结构域是人IgG-Fc结构域，优选衍生自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，优选IgG1或IgG2，更优选IgG1。特别地，当双特异性抗原结合多肽包含两个Fc结构域(即，在上文所述形式中(诸如Fc1和Fc2))时，这两个Fc结构域可以是相同免疫球蛋白同种型或同种型亚类的，或者是不同免疫球球蛋白同种型或同种型亚类的，优选是相同的。因此，在一些实施方案中，Fc1和Fc2是IgG1亚类的，或IgG2亚类的，或者IgG3亚类的，或IgG4亚类的，优选IgG1亚类的，或IgG2亚类的，更优选IgG1亚类的。
在一些实施方案中，Fc结构域包含或进一步包含“RF”和/或“杵臼”突变，优选“杵臼”。优选的是，Fc1包含SEQ ID NO:124(臼)或由其组成，并且Fc2包含SEQ ID NO:125(杵)或由其组成。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有式[I]V1-L1-V2-L2-D1的第一多肽链，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:39或由其组成；并且包含含有式I[II]V3-L3-V4-L4-D2的第二多肽链，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:35或由其组成。在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有式[I]V1-L1-V2-L2-D1的第一多肽链，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:39或由其组成；并且包含含有式I[II]V3-L3-V4-L4-D2的第二多肽链，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:38或由其组成。
在一个实施方案中，抗原结合多肽包含含有式[I]V1-L1-V2-L2-D1的第一多肽链，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:39或由其组成；并且包含含有式I[II]V3-L3-V4-L4-D2的第二多肽链，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:36或由其组成。在此实施方案中，亲本抗原结合多肽可以包含第一多肽链，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:39或由其组成；并且可以包含第二多肽链，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:37或由其组成。
本发明的第二方面进一步涉及分离的核酸或核酸组，其包含编码本发明第一方面抗原结合多肽的序列；或包含所述核酸或核酸组的核酸载体。如果本发明抗原结合多肽包含两条或更多条多肽链，则可以使用核酸组。可替代地，两条或更多条多肽链可以由一个多顺反子核酸序列编码，或者可以被编码为包含切割位点的单一多肽，所述切割位点允许将初始单一多肽分离成两条或更多条多肽链。
在一个实施方案中，分离的核酸包含编码本发明抗原结合多肽的序列或由其组成。在一个实施方案中，核酸载体包含所述核酸，所述核酸包含编码本发明抗原结合多肽的序列或由其组成。典型地，所述核酸是DNA或RNA分子，其可以包含在任何合适的载体(诸如质粒、粘粒、附加体、人工染色体、噬菌体或病毒载体)中。
本发明的第三方面涉及一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含本发明第一方面的抗原结合多肽或本发明第二方面的核酸或核酸组或载体。典型地，用根据本发明第二方面的核酸和/或载体转化、转导或转染这种宿主细胞。通过转化或转导过程接收并且随后表达由DNA或RNA组成的外来核酸或载体的宿主细胞已被“转化”或“转导”。
在一个实施方案中，可以使用US20190216852中所述的方法转导细胞，将所述专利的内容通过引用整体特此并入。在一个实施方案中，根据本发明第三方面的核酸或核酸组可以用于在合适的表达系统中产生本发明重组抗原结合多肽。
在一个实施方案中，宿主细胞包含本发明第一方面的抗原结合多肽。优选地，本发明的宿主细胞包含如上所述的核酸或载体。宿主细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞(例如，人细胞)、酵母、植物、动物、真菌或藻类，或者可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。为了产生抗原结合多肽(诸如包含TCR或重组TCR的抗原结合多肽或者双特异性抗原结合多肽)的目的，宿主细胞优选是哺乳动物细胞，诸如淋巴细胞，优选T淋巴细胞或T淋巴细胞祖细胞。优选宿主细胞的例子是CD4或CD8阳性T细胞。用于重组表达的优选宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。用于筛选测定的合适宿主细胞可以是酵母细胞。
在一个实施方案中，宿主细胞包含根据本发明第一方面的抗原结合多肽，或者本发明的核酸或核酸组或载体，其中所述宿主细胞优选是淋巴细胞，诸如T淋巴细胞或T淋巴细胞祖细胞，优选CD4或CD8阳性T细胞。为了表达本发明抗原结合多肽的目的，表达载体可以是编码第一抗原结合多肽(诸如抗体重链或α链)的基因和编码第二多肽(诸如抗体轻链或β链)的基因存在于单独的载体上的类型的，或两个基因都存在于同一载体上的类型(串联型)的。
本发明的第四方面涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第一方面的抗原结合多肽、本发明第二方面的核酸或核酸组或载体或本发明第三方面的宿主细胞以及药学上可接受的载体、稀释剂、稳定剂和/或赋形剂。
在一个实施方案中，所述药物组合物包含治疗有效量的本发明的抗原结合多肽、核酸或核酸组或载体或宿主细胞。在一个实施方案中，本发明第四方面的药物组合物含有治疗有效量的活性成分，优选本发明第一方面的抗原结合多肽、本发明第二方面的核酸或载体或本发明第三方面的宿主细胞，优选呈纯化形式，连同合适量的载体和/或赋形剂，以便为患者提供适当施用的形式。在进一步的实施方案中，所述药物组合物包含抗原结合多肽、或编码抗原结合多肽的核酸或载体、或表达抗原结合多肽的宿主细胞和药物活性组合物。配制品应当符合施用方式。对于静脉内施用，优选载体是水性载体。在一个实施方案中，当与本发明抗原结合多肽组合时，这种水性载体能够赋予改善的特性，例如改善的溶解度、功效和/或改善的免疫疗法。
在一个实施方案中，所述药物组合物可以进一步包含治疗剂或药理学活性物质，诸如但不限于佐剂和/或额外的活性成分，呈选择为适合根据所选施用方式施用的药学上或生理上可接受的配制品。
在一个实施方案中，所述药物组合物可以采取溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释配制品等形式。为了制备本发明药物组合物，药学上可接受的载体可以是固体或液体并且优选是液体。液体形式的组合物包括溶液、混悬剂和乳剂，例如水、盐水溶液、葡萄糖水溶液、甘油溶液或水/丙二醇溶液。对于胃肠外注射(例如，静脉内、动脉内、骨内输注、肌内、皮下、腹膜内、皮内和鞘内注射)，液体制剂可以配制成溶液，例如聚乙二醇水溶液。当静脉内施用药物组合物时，盐水溶液是优选的载体。
在一个实施方案中，所述药物组合物呈单位剂型。以这种形式，可以将组合物细分成含有适量活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装组合物，包装含有离散量的组合物，诸如包装的片剂、胶囊剂和在小瓶或安瓿中的散剂。此外，单位剂型可以是胶囊剂、注射小瓶、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者它可以是适当数量的这些包装形式中的任一种。如果希望，所述药物组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。
药物组合物的形式、施用途径、剂量和方案天然取决于有待治疗的病症；疾患的严重程度；患者的年龄、体重和性别；治疗的希望持续时间等。此药物组合物可以呈任何合适的形式(取决于向患者施用此药物组合物的希望方法)。
在一个实施方案中，本发明第四方面的药物组合物含有对于能够被注射的配制品是药学上可接受的媒介物。特别地，这些可以是等渗的、无菌的盐溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等等或此类盐的混合物)，或干燥的、尤其是冻干的组合物，其在根据情况添加无菌水或生理盐水后允许构成可注射溶液。
为了制备药物组合物，可以将有效量的本发明抗原结合多肽溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。
适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体；包含芝麻油、花生油或丙二醇的配制品；以及用于制备无菌可注射溶液或分散体的无菌散剂。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。其在制造和储存条件下必须稳定并且必须抵抗微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用而保存。可以在与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物制备分散体。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。
在一个实施方案中，可以使用药学上可接受的盐将本发明的抗原结合多肽以中性或盐形式配制成药物组合物。
通过以下方式制备无菌可注射溶液：将所需量的活性化合物与上面列举的各种其他成分(根据需要)一起掺入适当的溶剂中，随后过滤灭菌。通常，通过以下方式制备分散体：将各种无菌活性成分掺入无菌媒介物中，所述媒介物含有基础分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌散剂的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，这些方法由先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外的所希望成分的散剂。
本发明的第五方面涉及本发明第一方面的抗原结合多肽、本发明第二方面的核酸或载体或本发明第三方面的宿主细胞或本发明第四方面的药物组合物，用于医学。
在一个实施方案中，所述抗原结合多肽、所述核酸或载体、所述宿主细胞或所述药物组合物用于医学。
本发明的第六方面涉及本发明第一方面的抗原结合多肽、本发明第二方面的核酸或载体或本发明第三方面的宿主细胞或本发明第四方面的药物组合物，用于诊断、预防和/或治疗增殖性疾病，优选癌症，或肿瘤或肿瘤性疾病和/或障碍。
在一个实施方案中，所述抗原结合多肽、所述核酸或载体、所述宿主细胞或所述药物组合物用于诊断、预防和/或治疗增殖性疾病。优选地，待诊断、预防和/或治疗的增殖性疾病是癌症。
在一个实施方案中，本发明第一方面的抗原结合多肽、本发明第二方面的核酸或载体或本发明第三方面的宿主细胞或本发明第四方面的药物组合物用于抑制肿瘤生长或治疗癌症。
在一个实施方案中，本公开文本可以包括治疗患有癌症的患者的方法，所述癌症呈递由与MHC蛋白复合的本文所述或通过引用并入本文的氨基酸序列组成的肽，所述方法包括向患者施用包含本文所述抗原结合蛋白的组合物。
在一个实施方案中，本公开文本可以包括引发患有癌症的患者的免疫反应的方法，所述癌症呈递由与MHC蛋白复合的本文所述氨基酸序列组成的肽，所述方法包括向患者施用包含本文所述抗原结合蛋白的组合物。
本发明的第七方面涉及一种用于改善抗原结合多肽的稳定性和/或结合的方法，其中将本文提供的取代引入抗原结合多肽中。特别地，所述方法包括将带正电荷的氨基酸引入HCDR和/或LCDR中和/或在根据Kabat编号的重链的位置90处引入酪氨酸。特别地，所述方法包括：
(i)将包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸用带正电荷的氨基酸取代；和/或
(ii)将包含SEQ ID NO:54的氨基酸的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸用带正电荷的氨基酸取代；和/或
(iii)将根据Kabat编号的HFR1中的位置30用带正电荷的氨基酸取代，和/或
(iv)将根据Kabat编号的HFR3中的位置90用酪氨酸(Y)取代，
其中
(1)与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽与α/βT细胞受体(TCR)/CD3复合物的结合增加；
(2)与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽与α/βT细胞受体(TCR)/CD3复合物的结合维持或增加并且所述抗原结合多肽的稳定性增加；或
(3)与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽的稳定性增加。
特别地，抗原结合多肽的一个或多个位置如上文和下文所提供以及如所附实施例中所示被取代。优选地，所述方法包括被带正电荷的氨基酸取代
在重链中：
(i)在位置30，
(ii)在位置31；
(iii)在位置53；
(iv)在位置54；和/或
在轻链中：
(i)在位置31；和/或
(ii)在位置56。
特别地，所述方法包括用酪氨酸取代重链中位置90处的组氨酸。用酪氨酸取代重链中位置90处的组氨酸可以与如下文和上文提供的重链和/或轻链中的其他取代组合。
在一个实施方案中，所述方法提供了抗原结合多肽，所述抗原结合多肽与不包含本发明取代的亲本抗原结合多肽(例如，SEQ ID NO:1(BMA031(V36)VH)和SEQ ID NO:2(BMA031(V36)VL))相比具有增加的结合，优选地通过评估如上文和下文所述的结合来测量。上文在抗原结合多肽的上下文中公开的作用也适用于本文提供的方法。在一个实施方案中，根据本发明第七方面的方法导致与亲本抗原结合多肽(例如，包含根据SEQ ID NO:1(BMA031(V36)VH)和SEQ ID NO:2(BMA031(V36)VL)的VH/VL)相比具有增加的Tm的抗原结合多肽。优选地，与亲本抗原结合多肽、优选亲本抗体(例如，包含根据SEQ ID NO:1(BMA031(V36)VH)和SEQ ID NO:2(BMA031(V36)VL)的VH/VL)相比，抗原结合多肽的Tm增加至少1℃-3℃。如在实施例中出乎意料地证明的，与不包含所述在位置90处被酪氨酸的取代的亲本抗原结合多肽(例如，包含根据SEQ ID NO:1(BMA031(V36)VH)和SEQ ID NO:2(BMA031(V36)VL)的VH/VL的抗原结合多肽)相比，用酪氨酸取代位置90处的组氨酸增加了稳定性。特别地，与不包含所述在位置90处被酪氨酸的取代的亲本抗原结合多肽相比，用酪氨酸取代位置90处的组氨酸使稳定性增加至少约1℃、优选至少约2℃、更优选至少约2.5℃或甚至更优选至少约3℃。
在一个实施方案中，所述方法导致产生抗原结合多肽，所述抗原结合多肽与亲本抗原结合多肽(例如，包含根据SEQ ID NO:1(BMA031(V36)VH)和SEQ ID NO:2(BMA031(V36)VL)的VH/VL)相比提供了增加的结合；并且与亲本抗原结合多肽、优选亲本抗体(例如，包含根据SEQ ID NO:1(BMA031(V36)VH)和SEQ ID NO:2(BMA031(V36)VL)的VH/VL)相比提供了增加的Tm。
在一个实施方案中，所述方法包括抗原结合多肽，其中重链的以下位置30、31、53和54中的至少一个被带正电荷的氨基酸取代。
在一个实施方案中，所述方法包括抗原结合多肽，其中轻链的以下位置31、56和93中的至少一个被带正电荷的氨基酸取代。
在一个实施方案中，所述方法包括抗原结合多肽，其中重链的以下位置30、31、53和54中的至少一个被带正电荷的氨基酸取代；并且轻链的以下位置31和56中的至少一个被带正电荷的氨基酸取代。
在一个实施方案中，与不包含所述一个或多个取代的亲本抗原结合多肽相比，所述取代增加了抗原结合多肽的稳定性和/或结合。
本发明的第八方面涉及一种用于检测、确定和/或富集表达α/βTCR/CD3复合物的细胞诸如T细胞的方法，所述方法包括使细胞与本发明第一方面的抗原结合多肽接触的步骤。所述方法可以进一步包括富集表达α/βTCR/CD3复合物的T细胞，例如富集与抗原结合多肽结合的T细胞。用于检测或确定表达α/βTCR/CD3复合物的细胞的方法可以进一步包括检测和/或确定与所述细胞结合的抗原结合多肽。所述方法可以进一步包括纯化步骤，其中纯化与本发明第一方面的抗原结合多肽结合的细胞。本发明进一步涉及本文提供的抗原结合多肽在检测、确定和/或富集表达α/βTCR/CD3复合物的细胞诸如T细胞中的用途。
另一方面涉及一种激活T细胞的方法，其中所述方法包括使T细胞与本发明第一方面的抗原结合多肽接触。
本发明的另一方面涉及一种生产本发明第一方面的抗原结合多肽的方法。
在一个实施方案中，所述生产抗原结合多肽的方法包括以下步骤：
a.提供合适的宿主细胞，
b.提供包含编码根据本发明第一方面的抗原结合多肽的编码序列的基因构建体，
c.将所述基因构建体引入根据本发明第三方面的所述合适的宿主细胞中，以及
d.通过所述合适的宿主细胞表达所述基因构建体，
e.任选地，分离所述抗原结合多肽。
所述基因构建体优选是根据本发明第二方面的核酸或载体。在一个实施方案中，所述方法进一步包括从合适的宿主细胞中分离和纯化抗原结合多肽，以及任选地，将所述抗原结合多肽重构在T细胞中。在一个实施方案中，所述基因构建体是包含与所述编码序列可操作连接的启动子序列的表达构建体。使用本领域已知的方法，例如转化、转导或转染，将基因构建体引入宿主细胞中。本发明的抗原结合多肽可以通过本领域中已知的任何技术来产生，诸如但不限于单独的或组合的任何化学、生物学、遗传或酶促技术。
本发明的另一方面涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含前述权利要求中任一项所述的抗原结合多肽。
根据上文，本发明优选涉及以下项目：
1.一种抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中
(1)所述VH包含
(a)重链互补决定区1(HCDR1)，所述重链互补决定区1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，
(b)HCDR2，所述HCDR2包含YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(SEQ ID NO:53)的氨基酸序列，其中
X1是A或N；
X2是E或Q；和/或
X3是Q或K
(c)HCDR3，以及
(d)重链框架区(HFR)1-4；
(2)所述VL包含
(a)轻链互补决定区1(LCDR1)，所述轻链互补决定区1包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，
(b)LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，
(c)LCDR3，以及
(d)轻链框架区(LFR)1-4；
其中
(i)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和/或
(ii)包含SEQ ID NO:54的氨基酸的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和/或
(iii)根据Kabat编号的HFR1中的位置30被带正电荷的氨基酸取代，和/或
(iv)根据Kabat编号的HFR3中的位置90被酪氨酸(Y)残基取代，
并且其中所述抗原结合多肽特异性结合α/βT细胞受体(TCR)/CD3复合物。
2.根据项目1所述的抗原结合多肽，其中所述带正电荷的氨基酸：
(i)在所述重链的以下位置中的一个或多个处：31、53和54；
和/或
(ii)在所述轻链的以下位置中的一个或多个处：31和56，
并且其中所述位置是根据Kabat编号的。
3.根据项目1或2所述的抗原结合多肽，其中
(a)所述重链中的带正电荷的氨基酸：
(i)位置30处为R、K或H；
(ii)位置31处为R、K或H；
(iii)位置53处为R、K或H；和/或
(iv)位置54处为R或K；和/或
(b)所述轻链中的带正电荷的氨基酸
(i)位置31处为R或K；和/或
(ii)位置56处为R或K。
4.根据项1至3中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述VH和VL形成第一结合位点，并且其中所述抗原结合多肽包含第二抗原结合位点，所述第二抗原结合位点优选特异性结合细胞表面蛋白、优选癌细胞的细胞表面蛋白，更优选特异性结合主要组织相容性(MHC)肽复合物、优选MHC I，优选特异性结合人白细胞抗原(HLA)肽复合体，并且最优选特异性结合癌细胞的人白细胞抗原(HLA)肽复合物。
5.根据项目4所述的抗原结合多肽，其中所述第二抗原结合位点至少包含以下的可变区：
(i)TCR的α(Vα)和/或β(Vβ)链；或
(ii)TCR的γ(Vγ)和/或δ(Vδ)链；或
iii)不同于如项目1中定义的VL的轻链和/或不同于如项目1中定义的VH的重链。
6.根据项目5所述的抗原结合多肽，其中所述第二抗原结合位点包含在两条单独的多肽链或同一条多肽链上的Vα和Vβ或Vγ和Vδ。
7.根据项目1至5中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述VL和VH是抗体的VL和VH。
8.根据项目1至7中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述第一抗原结合位点包含在两条单独的多肽链或同一条多肽链上的VH和VL。
9.根据项目1-8中任一项所述的抗原结合多肽，其中被所述带正电荷的氨基酸取代的至少一个氨基酸：
(1)在SEQ ID NO:52中；
(2)在SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53中；
(3)在SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:54中；
(4)在SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:55中；
(5)在SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55中；
(6)在SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中；
(7)在SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:55中；
(8)在SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55中；
(9)在SEQ ID NO:53中；
(10)在SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中；
(11)在SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:55中；
(12)在SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55中；
(13)在SEQ ID NO:54(LCDR1)中；
(14)在SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55中；或
(15)在SEQ ID NO:55中。
10.根据项目1-9中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述带正电荷的氨基酸选自精氨酸(R)、组氨酸(H)和赖氨酸(K)，优选地其中所述带正电荷的氨基酸是R或K。
11.根据项目1-10中任一项所述的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含在所述重链中的位置30处的丝氨酸(S)或天冬酰胺(N)，其中所述位置根据Kabat编号。
12.根据项目1至11中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽包含
(i)在所述重链CDR3(HCDR3)中的其他修饰，优选用带负电荷的氨基酸的取代，优选在位置100a处，更优选谷氨酸酯(E)；和/或
(ii)在所述轻链CDR3(LCDR3)中的其他修饰，优选用极性氨基酸取代，优选在位置93处，更优选天冬酰胺(N)，
其中所述位置是根据Kabat编号的。
13.根据项目12所述的抗原结合多肽，其中所述
(i)HCDR3具有序列GSYYDYX1GFVY(SEQ ID NO:56)，其中X1是D或E，优选E；和/或
(ii)LCDR3具有序列QQWSX1X2X3LT(SEQ ID NO:57)，其中X1是S或N；X2是选自Q、D、H、S、Y和A的氨基酸；并且X3是P或A；优选地其中所述LCDR3具有序列QQWSX1NPLT(SEQ ID NO:96)，其中X1是S或N，优选S。
14.根据项目1-13中任一项所述的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含
(i)如包含在SEQ ID NO:1(BMA031 V36_VH)、SEQ ID NO:97(GL1_BM_VH28_HV)、SEQ ID NO:98(GL1_BM_VH31_HV)、SEQ ID NO:99(HEBE1_H10_HV)、SEQ ID NO:100(HEBE1_H66_HV)和SEQ ID NO:101(HEBE1_H71_HV)中列出的VH中的HFR1、HFR2和HFR3，优选地其中所述HFR1、HFR2和HFR3包含在SEQ ID NO:1(BMA031V36_VH)中列出的VH中；和/或
(ii)如包含在SEQ ID NO:2(BMA031 V36_VL)或SEQ ID NO:102(GL1BMVK43_VL)中列出的VL中的LFR1、LFR2和LFR3，优选地其中所述LFR1、LFR2和LFR3包含在SEQ ID NO:2(BMA031 V36_VL)中列出的VL中；并且
任选地其中所述抗原结合多肽进一步包含如包含在SEQ ID NO:1(BMA031V36_VH)中列出的VH的HFR4；或如包含在SEQ ID NO:2(BMA031 V36_VL)中列出的VL中的LFR4。
15.根据项目1至14中任一项所述的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含：
(i)如SEQ ID NO:1中列出的HFR1或与如SEQ ID NO:1中列出的HFR1具有至少约60％序列同一性的人HFR1序列，任选地包含根据Kabat注释在位置30处的取代；
(ii)如SEQ ID NO:1中列出的HFR2或与SEQ ID NO:1具有至少约75％序列同一性的人HFR2序列；和
(iii)如SEQ ID NO:10中列出的HFR3或与SEQ ID NO:1具有至少约55％序列同一性的人HFR3序列，任选地包含根据Kabat注释在位置90处的取代。
16.根据项目1至15中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述VL结构域包含：
(i)如SEQ ID NO:2中列出的LFR1或与SEQ ID NO:2具有至少约50％序列同一性的人LFR1序列；
(ii)如SEQ ID NO:2中列出的LFR2或与SEQ ID NO:2具有至少约80％序列同一性的人LFR2序列；和
(iii)如SEQ ID NO:2中列出的LFR3或与SEQ ID NO:2具有至少约80％序列同一性的人LFR3序列。
17.根据项目1至16中任一项所述的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽进一步包含
(i)如SEQ ID NO:1中列出的HFR4或与SEQ ID NO:1具有至少约90％序列同一性的人HFR4序列；和/或
(ii)如SEQ ID NO:1中列出的LFR4或与SEQ ID NO:1具有至少约90％序列同一性的人LFR4序列。
18.根据项目1至17中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述VH包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:7(VH H90Y)；SEQ ID NO:9(VH_T30N_S31R)、SEQ ID NO:10(VH_T30S_S31R_Y53R_E100aD)、SEQ ID NO:11(VH_S31R)、SEQ ID NO:12(VH_T30S_Y53R)、SEQ ID NO:14(VH_N54K_H90Y)、SEQ ID NO:15(VH_T30N_S31N_Y53R)、SEQ ID NO:16(VH_T30N_S31R_V56I)、SEQ ID NO:17(VH_S31R_N54K_E100aD)、SEQ ID NO:19(VH_T30R)、SEQ ID NO:20(VHT30K)；SEQ ID NO:21(VH S31K)；SEQ ID NO:22(VH_Y53R)、SEQ ID NO:23(VH_Y53K)、SEQID NO:24(VH_N54R)、SEQ ID NO:25(VH N54K)、SEQ ID NO:29(VH_Y53H)、SEQ ID NO:30(VH_S31H)、SEQ ID NO:31(VH S31R H90Y)、SEQ ID NO:32(VH Y53R H90Y)、SEQ ID NO:33(VH N54R H90Y)、和SEQ ID NO:34(VH_E61Q_H90Y)、或包含分别与选自SEQ ID NO:7、9、10、11、12、14、15、16、17、19、20、21、22、23、24、25、29、30、31、32、33和34的氨基酸序列至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列的其VH变体，其中与具有根据SEQ ID NO:1的序列的VH相比，所述VH变体保留相应的一个或多个取代。
19.根据项目1至18中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述VL包含选自以下的氨基酸：SEQ ID NO:8(VL S31R S56R)、SEQ ID NO:13(VL S31N S56R S93N)、SEQ ID NO:18(VL S56R)、SEQ ID NO:26(VL_S31R)、SEQ ID NO:27(VL_S31K)、和SEQ ID NO:28(VL_S56K)、或包含分别与选自SEQ ID NO:8、13、18、26、27和28的氨基酸序列至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列的其VL变体，其中与具有根据SEQ ID NO:2的序列的VL相比，所述VL变体保留相应的一个或多个取代。
20.根据项目1至19中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述VH和VL包含选自以下的序列：
SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10和SEQID NO:2、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11和SEQID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:12和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:8、SEQID NO:19和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:2、SEQID NO:22和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:2、SEQID NO:25和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:27、SEQID NO:1和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:2、SEQID NO:7和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:18、SEQID NO:32和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:18、以及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:18。
21.根据项目1-20中任一项所述的抗原结合多肽，其中
a)所述重链中位置30处的苏氨酸(T)被天冬酰胺(N)或丝氨酸(S)取代；
b)所述重链中位置31处的S被天冬酰胺(N)取代；
c)所述重链中位置56处的缬氨酸(V)被异亮氨酸(I)取代；
d)所述重链中位置100a处的谷氨酸(E)被天冬氨酸(D)取代；和/或
e)所述轻链中位置31和/或位置93处的S被天冬酰胺(N)取代。
22.根据项目1至21中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述VH和VL或Vα和Vβ共价或非共价连接在一起。
23.根据项目1至22中任一项所述的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽进一步包含以下中的一个或多个：
(i)其他抗原结合位点；
(ii)跨膜区，所述跨膜区任选地包含胞质信号传导区；
(iii)诊断剂；和/或
(iv)治疗剂。
24.根据项目1至23中任一项所述的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含形成所述第一抗原结合位点和第二抗原结合位点的第一多肽链和第二多肽链，
其中所述第一多肽链具有由下式表示的结构：
V1-L1-V2-L2-D1[I]
其中
V1是第一可变结构域；
V2是第二可变结构域；
L1和L2是接头；L2存在或不存在；
D1是二聚化结构域并且存在或不存在；
并且其中所述第二多肽链具有由下式表示的结构：
V3-L3-V4-L4-D2[II]
其中
V3是第三可变结构域；
V4是第四可变结构域；
L3和L4是接头；L4存在或不存在；并且
D2是二聚化结构域并且存在或不存在；
其中D1和D2彼此特异性结合，
并且其中
V1或V2是项目1的VH，并且V3或V4是项目1的VL，并且
V3或V4是Vα或Vγ，并且V1或V2是项目5的Vβ或Vδ；
或
V1或V2是项目1的VL，并且V3或V4是项目1的VH，并且
V3或V4是Vα或Vγ，并且V1或V2是项目5的Vβ或Vδ；
或
V1或V2是项目1的VH，并且V3或V4是项目1的VL，并且
V3或V4是Vβ或Vδ，并且V1或V2是项目5的Vα或Vγ；
或
V1或V2是项目1的VL，并且V3或V4是项目1的VH，并且
V3或V4是Vβ或Vδ，并且V1或V2是项目5的Vα或Vγ。
25.根据项目24所述的抗原结合多肽，其中
(1)V1是VH，
V2是Vβ或Vδ，
V3是Vα或Vγ，并且
V4是VL；
(2)V1是Vβ或Vδ；
V2是VH；
V3是VL；并且
V4是Vα或Vγ；
(3)V1是Vβ或Vδ，
V2是VL，
V3是VH，并且
V4是Vα或Vγ；
(4)V1是VL，
V2是Vβ或Vδ，
V3是Vα或Vγ，并且
V4是VH；
(5)V1是VH，
V2是Vβ或Vδ，
V3是VL，并且
V4是Vα或Vγ；
(6)V1是Vβ或Vδ，
V2是VH；
V3是Vα或Vγ，并且
V4是VL；
(7)V1是VL，
V2是Vβ或Vδ；
V3是VH，并且
V4是Vα或Vγ；
(8)V1是Vβ或Vδ，
V2是VL；
V3是Vα或Vγ，并且
V4是VH；
(9)V1是VH，
V2是VL，并且
V3是Vα或Vγ；
V4是Vβ或Vδ；
(10)V1是VL；
V2是VH；
V3是Vα或Vγ；并且
V4是Vβ或Vδ；
(11)V1是VH；
V2是VL；
V3是Vβ或Vδ；并且
V4是Vα或Vγ；
(12)V1是VL；
V2是VH；
V3是Vβ或Vδ；并且
V4是Vα或Vγ。
26.根据项目24或25所述的抗原结合多肽，其中
(i)D1和D2是Fc结构域；
(ii)L1具有1-30个氨基酸的长度；和/或
(iii)L2如果存在，则具有1-30个氨基酸的长度；和/或
(iv)L3具有1-30个氨基酸的长度；和/或
(v)L4如果存在，则具有1-30个氨基酸的长度。
27.根据项目24-26中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽
(i)具有根据SEQ ID NO:39的第一多肽链并且具有根据SEQ ID NO:38的第二多肽链；或
(ii)具有根据SEQ ID NO:39的第一多肽链并且具有根据SEQ ID NO:35的第二多肽链。
28.一种编码根据项目1至26中任一项所述的抗原结合多肽的核酸或核酸组，或者一种包含所述核酸或核酸组的核酸载体。
29.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含根据项目1至27中任一项所述的抗原结合多肽或根据项目28所述的核酸或核酸组或者载体，其中所述宿主细胞是
(i)淋巴细胞，优选T淋巴细胞或T淋巴细胞祖细胞，例如CD4或CD8阳性T细胞；或
(ii)用于重组表达的细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或酵母细胞。
30.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据项目1至27中任一项所述的抗原多肽、根据项目28所述的核酸或核酸组或者载体、或根据项目29所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂稳定剂和/或赋形剂。
31.一种产生根据项目1至27中任一项所述的抗原结合多肽的方法，所述方法包括
(i)提供合适的宿主细胞，
(ii)提供包含编码根据项目1至22中任一项所述的抗原结合多肽的编码序列的基因构建体，
(iii)将所述基因构建体引入所述合适的宿主细胞中，以及
(iv)通过所述合适的宿主细胞表达所述基因构建体。
32.根据项目31所述的方法，所述方法进一步包括从所述合适的宿主细胞中分离和纯化所述抗原结合多肽，以及任选地，将所述抗原结合多肽重构在T细胞中。
33.根据项目1至27中任一项所述的抗原结合多肽、根据项目28所述的核酸或核酸组或者载体、根据项目29所述的宿主细胞、或根据项目30所述的药物组合物，用于医学。
34.根据项目1至27中任一项所述的抗原结合多肽、根据项目28所述的核酸或核酸组或者载体、根据项目29所述的宿主细胞、或根据项目30所述的药物组合物，用于诊断、预防和/或治疗增殖性疾病、优选癌症。
35.一种用于改善或维持所述抗原结合多肽的结合和/或改善所述抗原结合多肽的稳定性的方法，所述抗原结合多肽包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中
(1)所述VH包含
(a)重链互补决定区1(HCDR1)，所述重链互补决定区1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，
(b)HCDR2，所述HCDR2包含YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(SEQ ID NO:53)的氨基酸序列，其中
X1是A或N；
X2是E或Q；和/或
X3是Q或K
(c)HCDR3，以及
(d)重链框架区(HFR)1-4；
(2)所述VL包含
(a)轻链互补决定区1(LCDR1)，所述轻链互补决定区1包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，
(b)LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，
(c)LCDR3，以及
(d)轻链框架(LCR)1-4；
其中
(i)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和/或
(ii)包含SEQ ID NO:54的氨基酸的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和/或
(iii)根据Kabat编号的HFR1中的位置30被带正电荷的氨基酸取代，和/或
(iv)根据Kabat编号的HFR3中的位置90被酪氨酸(Y)残基取代，
其中
(1)与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽与α/βT细胞受体(TCR)/CD3复合物的结合增加；
(2)与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽与α/βT细胞受体(TCR)/CD3复合物的结合维持或增加并且所述抗原结合多肽的稳定性增加；或
(3)与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽的稳定性增加。
36.根据项目35所述的方法，其中
(i)所述重链的以下位置31、53和54中的至少一个被带正电荷的氨基酸取代；
和/或
(ii)所述轻链的以下位置31和56中的至少一个被带正电荷的氨基酸取代，并且其中所述位置是根据Kabat编号的。
37.根据项目35所述的方法，其中与不包含在重链的位置30、31、53和/或54处被所述带正电荷的氨基酸的取代、在轻链的位置31和/或56处被所述带正电荷的氨基酸的取代、和/或在重链的位置90处的酪氨酸(Y)取代的亲本抗原结合多肽相比，所述一个或多个取代增加所述抗原结合多肽的稳定性和/或结合。
38.根据前述项目中任一项所述的方法，其中根据Kabat编号在HFR3中位置90处被酪氨酸(Y)残基的取代与所述亲本抗原结合多肽相比增加了稳定性。
39.一种用于检测、确定或富集表达所述α/βTCR/CD3复合物的T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：使细胞与根据项目1-27中任一项所述的抗原结合多肽接触。
40.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据项目1-27中任一项所述的抗原结合多肽。
术语“约”在本发明的上下文中并且当关于特定的列举数值使用时是指一个值，并且意指所述值可以与列举值相差不超过5％、不超过4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.0％或0.5％。例如，如本文所用，表达“约100”包括95和105以及介于它们之间的所有值(例如，95.0、95.5、96.0、96.5、97.0、97.5、98.0、98.5、99.0、99.5、100.5、101.0、101.5、102.0、102.5、103.0、103.5、104.0、104.5和105.0)。
在整个本申请中，术语“和/或”是语法连接词，所述语法连接词应被解释为涵盖可能发生的其连接的一种或多种情况。例如，“此类天然序列蛋白可以使用标准重组和/或合成方法来制备”的措辞表明，天然序列蛋白可以使用标准重组和合成方法来制备，或者天然序列蛋白可以使用标准重组方法来制备，或者天然序列蛋白可以使用合成方法来制备。
此外，在整个本申请中，术语“包括”应被解释为涵盖所有具体提到的特征以及任选的、额外的、未指定的特征。如本文所用，术语“包括”的使用还公开了其中不存在除具体提及的特征之外的特征(即，“由……组成”)的实施方案。
此外，不定冠词“一个/种(a)”或“一个/种(an)”并不排除复数。在相互不同的从属权利要求中列举某些量度的纯粹事实并不表明这些量度的组合不能用于有利的以下实施例仅仅是对本发明的说明，并且不应被解释为以任何方式限制如由所附权利要求所指示的本发明范围。
实施例
实施例1
为了提供具有增加的稳定性和/或增加的结合亲和力的抗原结合多肽，将抗体BMA031(V36)(TPP-1374，Fab片段)的可变链转化为scFv(SEQ ID NO:44)，并且合成相应的DNA。通过重叠延伸PCR使用简并引物在可变重链的位置28至31、33、50、52、53、54、56、58和96至100b和/或可变轻链的位置27、29、49、50、53、55、56、91至94和96处引入CDR中的突变。将所得DNA串连接到基于pHAL的噬菌粒载体，并且转化到大肠杆菌(E.coli)TG1中，用于产生携带scFv的噬菌体，基本上如Unkauf等人2018中所述。将所得噬菌体颗粒用于选择策略，其包括首先用α/βTCR/CD3阴性Jurkat T细胞(J.RT3T3.5)的阴性选择步骤，然后用α/βTCR/CD3阳性Jurkat T细胞系(Jurkat，克隆E6-1)进行2轮选择的阳性选择，基本上如Wenzel等人2020中所述。通过辐照从Jurkat细胞衍生α/βTCR/CD3阴性Jurkat T细胞J.RT3T3.5，并且失去了其α/βTCR/CD3复合物的呈递，而保留了其他表面蛋白在无法区分的水平下的表达(Weiss和Stobo 1984)。在TCRβ链的转移以及因此还有TCR/CD3复合物在表面上的表达之后，J.RT3T3.5细胞系重获其功能(Ohashi等人1985)。因此，此细胞系被认为是阴性选择α/βTCR/CD3复合物结合物的良好工具。将最终克隆转导到大肠杆菌XL1中，以进行可溶性scFv分子的流式细胞术分析。分析所有克隆与两种Jurkat细胞系的结合，并且将保留特异性(结合Jurkat克隆E6-1，但不结合J.RT3T3.5，图1)的11种独特的结合改善的克隆(SEQ ID NO:45至55)转化为Fab形式(本文也称为Fab片段)，以进一步研究结合特性和稳定性评估。Fab片段包含通过二硫桥连接的相应VL-CL和VH-CH1。CH1的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:3中。CL的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:4中。亲本抗原结合多肽的示例性Fab片段(TPP1374-BMA031(V36)的Fab片段)显示在SEQ ID NO:5和6中。以下以Fab形式测试的抗原结合多肽还包含如SEQ ID NO:5和6所示的CL和CH1。此外，将额外的His标签添加到CH1的C末端，用于纯化和检测Fab片段。换言之，将测试的取代引入示例性亲本抗体中。除了插入的CDR突变(包括根据Kabat的VH中的位置30)之外，还从scFv噬菌体文库中选择了未计划的框架突变，即重链框架3(HFR3)中的H90Y。氨基酸残基的编号根据Kabat编号，除非另有指示。将所选可变结构域搅乱并且克隆到基于pCSE的Fab表达载体中，并且转染到HEK293细胞中进行瞬时可溶性蛋白表达(TPP-1357至TPP-1373)，始终伴随示例性亲本抗体(TPP-1374)的情况，基本上如等人2013中所述。通过固定化金属亲和色谱法从细胞培养上清液中纯化蛋白质，基本上如Siegemund等人2014中所述。
通过流式细胞术结合分析使用上述α/βTCR/CD3阳性(和γ/δ阴性)和阴性Jurkat细胞系并且应用纯化Fab片段的滴定系列(浓度为10μg/ml至10ng/ml，半对数步骤)来研究结合特性。简言之，所有细胞术步骤均在FACS缓冲液(PBS，2mM EDTA，5％ FCS)中进行。根据手册用CFSE CellTrace(ThermoFisher，C34554)标记抗原阴性的J.RT3T3.5细胞，并且以1:1的比率与抗原阳性的Jurkat克隆E6-1细胞混合。之后，通过在300rcf下离心，将细胞在FACS缓冲液中洗涤一次。随后将目的抗体Fab的稀释系列(100μl/孔，并且浓度如上所指示)与细胞混合物(100.000个细胞/孔)在冰上在FACS缓冲液中孵育15min。通过用FACS缓冲液进行一个洗涤步骤洗涤掉未结合的抗体。对于结合的检测，将抗HIS标签Alexa647标记的抗体(Biolegend，652513)以1:2000的稀释度(50μl/孔)在冰上在FACS缓冲液中(在黑暗中)使用15min。经由300rcf离心通过用FACS缓冲液进行三个洗涤步骤去除未结合的二次染色抗体。洗涤后，将细胞重悬于含有1x碘化丙啶(Roth，CN74.1)的FACS缓冲液(40μl/孔)中，用于活/死染色。最后，在流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener(Sartorius AG)或CytoFLEX(Beckmann Coulter，2089495-01))中确定细胞的染色，并且比较MFI(中值荧光强度)值。对于抗原阳性(CFSE CellTrace负染色)的活细胞(碘化丙啶负染色)，使用MFI和对数浓度值计算曲线下结合面积(结合AUC)。与示例性亲本抗体TPP-1374相比，所有所选变体都证明了增加的结合AUC值(图2)。同时，通过对TCR/CD3阴性Jurkat细胞进行相同测定来解决靶特异性。所有Fab片段均未显示出结合(图3)
通过纳米DSF使用Prometheus NT.48系统检查Fab片段的稳定性，计算当50％的蛋白质解折叠时Fab片段的熔点(表3)所有测量均在PBS pH 7.4中进行，Fab浓度为50μg/ml并且加热斜坡速率为1℃/min。通过PR.StabilityAnalysis(v.PR.StabilityAnalysis_x64_1.1.0.11077)进行熔解温度的评价。仅计算在一个实验中运行的变体的ΔTm值。在71.8℃时，亲本BMA031(V36)Fab片段已经显示出高稳定性，并且除了TPP-1366之外，所有其他蛋白质都可以在70℃的熔解温度之上保持其稳定性。与BMA031(V36)Fab片段相比，各种取代进一步改善了稳定性；参见表3。出人意料地，重链中的突变H90Y(根据Kabat编号)在温度稳定性方面提供了巨大增益，在高于75℃时偏移良好(参见表3)。
表3：成熟Fab分子的熔解温度。通过纳米DSF解决纯化Fab片段的熔解温度。TPP-1374用作参考分子。
| 分子 | 突变 | Tm[℃] |
| TPP-1357 | VH_H90Y_VL_S31R_S56R | 76.8 |
| TPP-1358 | VH_T30N_S31R_VL_wt | 71.4 |
| TPP-1359 | VH_T30S_S31R_Y53R_E100aD_VL_wt | 70.1 |
| TPP-1361 | VH_T30S_Y53R_VL_wt | 71.9 |
| TPP-1362 | VH_S31R_VL_LS31N_S56R_S93N | 71.6 |
| TPP-1364 | VH_T30N_S31N_Y53R_VL_wt | 71.9 |
| TPP-1365 | VH_T30N_S31R_V56I_VL_wt | 70.7 |
| TPP-1366 | VH_S31R_N54K_E100aD_VL_wt | 67.6 |
| TPP-1368 | VH_S31R_VL_S56R | 72.1 |
| TPP-1369 | VH_S31R_VL_S31R_S56R | 72.9 |
| TPP-1370 | VH_T30S_Y53R_VL_S56R | 71.7 |
| TPP-1371 | VH_T30S_Y53R_VL_S31R_S56R | 72.5 |
| TPP-1373 | VH_N54K_H90Y_VL_S31R_S56R | 76.6 |
| TPP-1374 | VH_wt_VL_wt | 71.8 |
实施例2：
在示例性亲本抗体(TPP-1374)中引入实施例1中选择的取代的组合。重链和轻链的CDR 1和2内的几个位置被带正电荷的氨基酸(碱性氨基酸)取代。在第一实验中，每条链只应用一个碱性氨基酸。另外，将框架突变H90Y引入所选变体中。Fab片段TPP-1360、TPP-1363、TPP-1372、TPP-1374至TPP-1384以及TPP-1387至TPP-1393如实施例1所描绘制备、纯化并且分析结合AUC和熔解温度。此外，通过用非线性4点曲线拟合进行MFI拟合来研究结合EC50；参见图6。与参考BMA031(V36)Fab(TPP-1374)相比，用碱性氨基酸(例如，R或K)替代重链的位置30导致与携带靶标的Jurkat克隆E6-1细胞的结合EC50改善(表4，表7，图5)。与亲本BMA031(V36)Fab相比，用精氨酸或赖氨酸取代重链的位置31处的丝氨酸改善了所有测试变体的结合EC50(表4，表6，表4，图5)。与BMA031(V36)Fab相比，在重链的位置54处具有交换的天冬酰胺残基的所有测试变体都产生了改善的结合特性(表4，表6，表7，图5)。
与BMA031(V36)Fab相比，在重链的位置53处用精氨酸取代替代酪氨酸改善了结合AUC(表4和表6)。
在轻链中，位置56处正电荷的替代增强了结合(表4，表7，图5)。
用正电荷替代轻链的位置31处的丝氨酸提供了降低的结合并且同时增加了稳定性(表4，图5)。
出乎意料地，在重链中引入H90Y使熔解温度增加超过3℃，达到最低水平75℃(除了VH_N54K_H90Y_VL_S56R(TPP-1372)使熔解温度增加2.8℃)。示例性Fab片段VH_H90YVL_S31R_S56R和VH_N54K_H90Y_VL_S31R_S56R甚至使熔解温度增加超过4℃(比较表4与表5、表6、图5)
此外，H90Y与重链位置31、53和54处的精氨酸取代的组合(TPP-1388、TPP-1390和TPP-1391)产生关于结合AUC的协同效应。对于分子VH_S31R和VH_Y53R与轻链位置56处的精氨酸的额外组合(TPP-1389和TPP-1392)，也发现了结合AUC的这种协同效应，导致最高的结合AUC值(表6，图5)。这些单一突变的组合对结合的巨大影响也可以通过改善的结合曲线和EC50值来描绘(表7，图6)
Fab片段的特异性再次通过如实施例1中的J.RT3T3.5细胞的流式细胞术分析来解决。所检查的蛋白质均未证明与此TCR/CD3阴性细胞系的任何交叉反应性，而所有变体都存在与靶细胞系的结合(图4)。
表4：成熟Fab分子(仅CDR突变)的特征。在范围为10μg/ml至10ng/ml的滴定系列中研究纯化Fab片段与α/βTCR/CD3阳性Jurkat细胞(克隆E6-1)的结合。对于MFI值和相应对数浓度，计算曲线下面积。示出了与VH_wt_VL_wt(TPP-1374)相比的结合AUC提高百分比以及熔解温度差异。
| 分子 | 突变 | 结合AUC提高％ | ΔTm[℃] | Tm[℃] |
| TPP-1375 | VH_T30R_VL_wt | 87 | -1.6 | 70.9 |
| TPP-1376 | VH_T30K_VL_wt | 83 | -1.8 | 70.7 |
| TPP-1360 | VH_S31R_VL_wt | 144 | 0.0 | 72.4 |
| TPP-1377 | VH_S31K_VL_wt | 56 | 0.8 | 73.3 |
| TPP-1378 | VH_Y53R_VL_wt | 79 | n.d. | n.d. |
| TPP-1379 | VH_Y53K_VL_wt | 1 | 1.0 | 73.5 |
| TPP-1380 | VH_N54R_VL_wt | 18 | -3.3 | 69.2 |
| TPP-1381 | VH_N54K_VL_wt | 98 | -3.0 | 69.5 |
| TPP-1382 | VH_wt_VL_S31R | -66 | 1.2 | 73.7 |
| TPP-1383 | VH_wt_VL_S31K | -73 | 1.0 | 73.4 |
| TPP-1367 | VH_wt_VL_S56R | 220 | -0.6 | 71.9 |
| TPP-1384 | VH_wt_VL_S56K | 203 | -0.1 | 72.3 |
| TPP-1374 | VH_wt_VL_wt | 0 | 0.0 | 72.5 |
表5：成熟Fab分子(包含重链框架突变H90Y的变体)的特征。在范围为10μg/ml至10ng/ml的滴定系列中研究纯化Fab片段与α/βTCR/CD3阳性Jurkat细胞(克隆E6-1)的结合。对于MFI值和相应对数浓度，计算曲线下面积。示出了与VH_wt_VL_wt(TPP-1374)相比的结合AUC提高百分比以及熔解温度差异。
/>
表6：成熟Fab分子的特征(特定突变的直接比较)。在范围为10μg/ml至10ng/ml的滴定系列中研究纯化Fab片段与α/βTCR/CD3阳性Jurkat细胞(克隆E6-1)的结合。对于MFI值和相应对数浓度，计算曲线下面积。示出了与VH_wt_VL_wt(TPP-1374)相比的结合AUC提高百分比以及熔解温度差异。
| 分子 | 突变 | 结合AUC提高％ | ΔTm[℃] | Tm[℃] |
| TPP-1360 | VH_S31R_VL_wt | 144 | 0.0 | 72.4 |
| TPP-1388 | VH_S31R_H90Y_VL_wt | 273 | 3.9 | 76.4 |
| TPP-1389 | VH_S31R_H90Y_VL_S56R | 423 | 3.6 | 76.0 |
| TPP-1378 | VH_Y53R_VL_wt | 79 | n.d. | n.d. |
| TPP-1390 | VH_Y53R_H90Y_VL_wt | 270 | 4.4 | 76.9 |
| TPP-1392 | VH_Y53R_H90Y_VL_S56R | 813 | 3.6 | 76.1 |
| TPP-1380 | VH_N54R_VL_wt | 18 | -3.3 | 69.2 |
| TPP-1391 | VH_N54R_H90Y_VL_wt | 245 | 3.3 | 75.8 |
| TPP-1367 | VH_wt_VL_S56R | 220 | -0.6 | 71.9 |
| TPP-1393 | VH_H90Y_VL_S56R | 226 | 3.2 | 75.7 |
| TPP-1374 | VH_wt_VL_wt | 0 | 0.0 | 72.5 |
| TPP-1387 | VH_H90Y_VL_wt | 14 | 3.9 | 76.4 |
表7：成熟Fab分子的结合EC50。在范围为10μg/ml至10ng/ml的滴定系列中研究纯化Fab片段与α/βTCR/CD3阳性Jurkat细胞(克隆E6-1)的结合。计算中值荧光强度(MFI)的EC50，并且示出了与VH_wt_VL_wt(TPP-1374)相比的倍数降低。
| 分子 | 突变 | EC50的倍数降低 |
| TPP-1389 | VH_S31R_H90Y_VL_S56R | 31.8 |
| TPP-1372 | VH_N54K_H90Y_VL_S56R | 21.5 |
| TPP-1392 | VH_Y53R_H90Y_VL_S56R | 16.6 |
| TPP-1393 | VH_H90Y_VL_S56R | 13.9 |
| TPP-1367 | VH_wt_VL_S56R | 8.8 |
| TPP-1381 | VH_N54K_VL_wt | 8.2 |
| TPP-1388 | VH_S31R_H90Y_VL_wt | 8.1 |
| TPP-1363 | VH_N54K_H90Y_VL_wt | 7.3 |
| TPP-1360 | VH_S31R_VL_wt | 5.7 |
| TPP-1390 | VH_Y53R_H90Y_VL_wt | 5.5 |
| TPP-1391 | VH_N54R_H90Y_VL_wt | 4.7 |
| TPP-1384 | VH_wt_VL_S56K | 4.1 |
| TPP-1377 | VH_S31K_VL_wt | 4.1 |
| TPP-1387 | VH_H90Y_VL_wt | 3.2 |
| TPP-1380 | VH_N54R_VL_wt | 2.9 |
| TPP-1376 | VH_T30K_VL_wt | 2.8 |
| TPP-1375 | VH_T30R_VL_wt | 2.1 |
实施例3：所选TCER变体(TPP-226(PPB-1156)、TPP-894(PPB-1155)、TPP-879(PPB-1152))
为了研究经修饰的BMA031分子的观察到的有益作用是否也改善双特异性抗原结合多肽的特性，构建了分子，其包含本文提供的经修饰的BMA031分子。因此，通过基因合成获得编码VH和VL(衍生自BMA031(V36)的优化变体)和Vα和Vβ的DNA序列以及编码接头的序列。用于表达重组蛋白的载体被设计为单顺反子的，由HCMV衍生的启动子元件pUC19衍生物控制。根据标准培养方法在大肠杆菌中扩增质粒DNA，并且随后使用可商购试剂盒(Macherey&Nagel)纯化。将纯化质粒DNA用于CHO细胞的瞬时转染。将转染的CHO细胞在32℃至37℃下培养10-11天。利用Sartoclear />实验室助滤剂(Sartorius)通过过滤(0.22μm)清除经调整的细胞上清液。使用配备用于在线进行亲和色谱法和尺寸排阻色谱法的/> Pure 25L FPLC系统(GE Lifesciences)纯化双特异性分子。按照标准亲和色谱方案在蛋白L柱(GE Lifesciences)上进行亲和色谱法。使用Superdex 200pg 16/600柱(GELifesciences)按照标准方案从亲和柱洗脱(pH 2.8)后直接进行尺寸排阻色谱法以获得高纯单体蛋白。根据预测的蛋白质序列，使用计算的消光系数在NanoDrop系统(ThermoScientific)上确定蛋白质浓度。如果需要，通过使用Vivaspin装置(Sartorius)调节浓度。最后，将纯化分子以约1mg/mL的浓度储存在2℃-8℃的温度下在磷酸盐缓冲盐水中。通过在Vanquish uHPLC系统中在MabPac SEC-1柱(5μm，4x300mm)上在含有300mM NaCl的50mM磷酸钠pH 6.8中运行HPLC-SEC来控制纯化双特异性分子的质量。在LDH释放测定中评估改善的BMA031变体的效力。因此，在渐增浓度的TCER分子的存在下将在其细胞表面上呈递不同水平的靶pHLA的肿瘤细胞系以及靶pHLA阴性的肿瘤细胞系用作衍生自健康HLA-A*02阳性供体的PBMC的靶标(E:T＝10:1)。在48小时后通过测量释放的LDH进行TCER诱导的细胞溶解的定量。使用非线性4点曲线拟合来计算剂量-反应曲线的EC50值。图7和图8分别示出了使用两个独立供体的PBMC进行的两次独立测定的结果。相应非线性曲线拟合的计算EC50值总结在表8中。这些结果证明，与包含BMA031(V36)的根据SEQ ID NO:1的VH和根据SEQ ID NO:2的VL的TPP-226相比，在/>支架内使用经修饰的BMA031分子(TPP-879、TPP-894)导致T细胞介导的对靶pHLA阳性肿瘤细胞系的杀伤效力增加。这些结果还显示，由优化募集结构域诱导的T细胞介导的对靶pHLA阴性肿瘤细胞系T98G的细胞毒性没有增加或仅微不足道的增加。
表8：由TCER分子诱导的T细胞介导的细胞毒性的EC50值的汇总
/>
本文提供了示例性参考文献，其中这些参考文献以其整体并入本文。
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/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
序列表
<110> 伊玛提克斯生物技术有限公司
<120> BMA031抗原结合多肽
<130> 1017-43 PCT
<150> EP21172352.3
<151> 2021-05-05
<150> US 63/184,698
<151> 2021-05-05
<160> 112
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BMA031 (V36) 的可变重链
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BMA031 (V36) 的可变轻链
<400> 2
Gln Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含His标签的BMA031 (V36) 的CH1
<400> 3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Ser Gly His His His His His His
100 105 110
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人κ轻链恒定结构域
<400> 4
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 5
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab重链BMA031 (V36)
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly
210 215 220
Ser Gly His His His His His His
225 230
<210> 6
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab轻链BMA031 (V36)
<400> 6
Gln Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_H90Y
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL_S31R_S56R
<400> 8
Gln Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Arg Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_T30N_S31R
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Asn Arg Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_T30S_S31R_Y53R_E100aD
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_S31R
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_T30S_Y53R
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 106
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<213> 人工序列
<220>
<223> VL_S31N_S56R_S93N
<400> 13
Gln Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asn Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_N54K_H90Y
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Lys Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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<211> 120
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Asn Arg Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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20 25 30
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<211> 120
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<213> 人工序列
<220>
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Lys Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
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<211> 120
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<213> 人工序列
<220>
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 22
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
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115 120
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<213> 人工序列
<220>
<223> VH_Y53K
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Lys Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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<213> 人工序列
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
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115 120
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<213> 人工序列
<220>
<223> VH_N54K
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Lys Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 26
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20 25 30
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 106
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<213> 人工序列
<220>
<223> VL_S31K
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Gln Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
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50 55 60
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65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL_S56K
<400> 28
Gln Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Lys Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_Y53H
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro His Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_S31H
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr His Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_S31R_H90Y
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_Y53R_H90Y
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_N54R_H90Y
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Arg Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_E61Q_H90Y
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCER链2 VH_S31R
<400> 35
Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu His Val Gln Glu Gly
1 5 10 15
Asp Ser Thr Lys Phe Thr Cys Ser Phe Pro Val Lys Glu Phe Gln Asp
20 25 30
Leu His Trp Tyr Arg Lys Glu Thr Ala Lys Ser Pro Glu Phe Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Gly Pro Tyr Gly Lys Glu Lys Lys Lys Gly Arg Ile Ser Ala
50 55 60
Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr Leu Tyr Ile Thr Asp Ser
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Leu Tyr Asn Asn Tyr
85 90 95
Asp Met Arg Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Thr Val Lys Pro Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
115 120 125
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
130 135 140
Tyr Lys Phe Thr Arg Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr
165 170 175
Lys Tyr Ala Glu Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr
180 185 190
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val His Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly
210 215 220
Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro
245 250 255
Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro
465
<210> 36
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCER链2 VH_Y53R_H90Y
<400> 36
Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu His Val Gln Glu Gly
1 5 10 15
Asp Ser Thr Lys Phe Thr Cys Ser Phe Pro Val Lys Glu Phe Gln Asp
20 25 30
Leu His Trp Tyr Arg Lys Glu Thr Ala Lys Ser Pro Glu Phe Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Gly Pro Tyr Gly Lys Glu Lys Lys Lys Gly Arg Ile Ser Ala
50 55 60
Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr Leu Tyr Ile Thr Asp Ser
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Leu Tyr Asn Asn Tyr
85 90 95
Asp Met Arg Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Thr Val Lys Pro Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
115 120 125
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
130 135 140
Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Asn Asp Val Thr
165 170 175
Lys Tyr Ala Glu Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr
180 185 190
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly
210 215 220
Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro
245 250 255
Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala
180 185 190
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys
<210> 49
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv-YU561-E01
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Asn Arg Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Ile Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Gln Ile Gln Met Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
145 150 155 160
Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala
180 185 190
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys
<210> 50
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv-YU561-C01
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Lys Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Gln Ile Gln Met Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
145 150 155 160
Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala
180 185 190
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys
<210> 51
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv-YU561-C02
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Gln Ile Gln Met Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
145 150 155 160
Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala
180 185 190
Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCR1 Kabat
<400> 52
Ser Tyr Val Met His
1 5
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR2 Kabat
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (12)..(12)
<223> 位置12处的Xaa是A或N
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (13)..(13)
<223> 位置13处的Xaa是E或Q
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (16)..(16)
<223> 位置16处的Xaa是Q或K
<400> 53
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe Xaa
1 5 10 15
Gly
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR1
<400> 54
Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR2
<400> 55
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR3 Kabat
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (7)..(7)
<400> 56
Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Xaa Gly Phe Val Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3 Kabat
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> 位置5处的Xaa是S或N
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (6)..(6)
<223> 位置6处的Xaa选自Q、D、H、S、Y、A和N
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (7)..(7)
<223> 位置7处的Xaa是P或A
<400> 57
Gln Gln Trp Ser Xaa Xaa Xaa Leu Thr
1 5
<210> 58
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH人源化BMA031 Shearman
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 59
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL人源化BMA031 Shearman
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ile Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 60
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC BMA031 (V36): huIgG1 (恒定结构域同种异型G1m17,1)
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 61
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含铰链的huIgG1 (G1m17,1) CH1和CH2
<400> 61
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR1 Chothia
<400> 62
Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR2 Chothia
<400> 63
Asn Pro Tyr Asn Asp Val
1 5
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR3 Kabat
<400> 64
Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Val Tyr
1 5 10
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3 Kabat
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (6)..(6)
<223> 位置6处的Xaa是选自Q、D、H、S、Y、A和N的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (7)..(7)
<223> 位置7处的Xaa是P或A
<400> 65
Gln Gln Trp Ser Ser Xaa Xaa Leu Thr
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3 Kabat
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> 位置5处的Xaa是S或N
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (7)..(7)
<223> 位置7处的Xaa是P或A
<400> 66
Gln Gln Trp Ser Xaa Asn Xaa Leu Thr
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3 Kabat
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> 位置5处的Xaa是S或N
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (6)..(6)
<223> 位置6处的Xaa是选自Q、D、H、S、Y、A和N的氨基酸
<400> 67
Gln Gln Trp Ser Xaa Xaa Pro Leu Thr
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 68
Gln Gln Trp Ser Ser Gln Pro Leu Thr
1 5
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 69
Gln Gln Trp Ser Ser Asp Pro Leu Thr
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 70
Gln Gln Trp Ser Ser His Pro Leu Thr
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 71
Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 72
Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 73
Gln Gln Trp Ser Ser Ala Pro Leu Thr
1 5
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 74
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 75
Gln Gln Trp Ser Ser Gln Ala Leu Thr
1 5
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 76
Gln Gln Trp Ser Ser Asp Ala Leu Thr
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 77
Gln Gln Trp Ser Ser His Ala Leu Thr
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 78
Gln Gln Trp Ser Ser Ser Ala Leu Thr
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 79
Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Ala Leu Thr
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 80
Gln Gln Trp Ser Ser Ala Ala Leu Thr
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 81
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Ala Leu Thr
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 82
Gln Gln Trp Ser Asn Gln Pro Leu Thr
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 83
Gln Gln Trp Asn Ser Asp Pro Leu Thr
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 84
Gln Gln Trp Asn Ser His Pro Leu Thr
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> QQWNSSPLT
<400> 85
Gln Gln Trp Asn Ser Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 86
Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 87
Gln Gln Trp Asn Ser Ala Pro Leu Thr
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 88
Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 89
Gln Gln Trp Ser Asn Gln Ala Leu Thr
1 5
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 90
Gln Gln Trp Asn Ser Asp Ala Leu Thr
1 5
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 91
Gln Gln Trp Asn Ser His Ala Leu Thr
1 5
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 92
Gln Gln Trp Asn Ser Ser Ala Leu Thr
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 93
Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Ala Leu Thr
1 5
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 94
Gln Gln Trp Asn Ser Ala Ala Leu Thr
1 5
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<400> 95
Gln Gln Trp Asn Ser Asn Ala Leu Thr
1 5
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> 位置5处的Xaa是S或N
<400> 96
Gln Gln Trp Ser Xaa Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 97
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GL1_BM_VH28_HV
<400> 97
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 98
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GL1_BM_VH31_HV
<400> 98
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 99
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HEBE1_H10_HV
<400> 99
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 100
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HEBE1_H66_HV
<400> 100
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 101
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HEBE1_H71_HV
<400> 101
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 102
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GL1BMVK43_VL
<400> 102
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 103
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HFR1
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr
20 25 30
<210> 104
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HFR2
<400> 104
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 105
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HFR3
<400> 105
Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 106
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HFR4
<400> 106
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 107
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFR1
<400> 107
Gln Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 108
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFR2
<400> 108
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 109
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFR3
<400> 109
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 110
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFR4
<400> 110
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 111
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc臼突变体
<400> 111
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro
225
<210> 112
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc杵突变体
<400> 112
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro
225
Claims (15)
1.一种抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中
(1)所述VH包含
(a)重链互补决定区1(HCDR1)，所述重链互补决定区1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，
(b)HCDR2，所述HCDR2包含YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(SEQ ID NO:53)的氨基酸序列，其中
X1是A或N；
X2是E或Q；和/或
X3是Q或K
(c)HCDR3，以及
(d)重链框架区(HFR)1-4；
(2)所述VL包含
(a)轻链互补决定区1(LCDR1)，所述轻链互补决定区1包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，
(b)LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，
(c)LCDR3，以及
(d)轻链框架区(LFR)1-4；
其中
(i)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和/或
(ii)包含SEQ ID NO:54的氨基酸的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和/或
(iii)根据Kabat编号的HFR1中的位置30被带正电荷的氨基酸取代，和/或
(iv)根据Kabat编号的HFR3中的位置90被酪氨酸(Y)残基取代，
并且其中所述抗原结合多肽特异性结合α/βT细胞受体(TCR)/CD3复合物。
2.根据权利要求1所述的抗原结合多肽，其中所述带正电荷的氨基酸：
(i)在所述重链的以下位置中的一个或多个处：31、53和54；和/或
(ii)在所述轻链的以下位置中的一个或多个处：31和56，
并且其中所述位置是根据Kabat编号的。
3.根据权利要求1或2所述的抗原结合多肽，其中
(a)所述重链中的带正电荷的氨基酸：
(i)位置30处为R、K或H；
(ii)位置31处为R、K或H；
(iii)位置53处为R、K或H；和/或
(iv)位置54处为R或K；和/或
(b)所述轻链中的带正电荷的氨基酸
(i)位置31处为R或K；和/或
(ii)位置56处为R或K。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述VH和VL形成第一结合位点，并且其中所述抗原结合多肽包含第二抗原结合位点。
5.根据权利要求4所述的抗原结合多肽，其中所述第二抗原结合位点至少包含以下的可变区：
(i)TCR的α(Vα)和/或β(Vβ)链；或
(ii)TCR的γ(Vγ)和/或δ(Vδ)链；或
(iii)不同于如权利要求1中定义的VL的轻链和/或不同于如权利要求1中定义的VH的重链。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗原结合多肽，其中所述带正电荷的氨基酸选自精氨酸(R)、组氨酸(H)和赖氨酸(K)，优选地其中所述带正电荷的氨基酸是R或K。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗原结合多肽，其中
(i)所述重链中位置30处的苏氨酸(T)被天冬酰胺(N)或丝氨酸(S)取代；
(ii)所述重链中位置31处的S被N取代；
(iii)所述重链中位置56处的缬氨酸(V)被异亮氨酸(I)取代；
(iv)所述重链中位置100a处的谷氨酸(E)被天冬氨酸(D)取代；和/或
(v)所述轻链中位置31和/或位置93处的S被N取代。
8.一种编码根据权利要求1至7中任一项所述的抗原结合多肽的核酸或核酸组，或者一种包含所述核酸的核酸载体。
9.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含根据权利要求1至7中任一项所述的抗原结合多肽或根据权利要求8所述的核酸或核酸组或者载体，其中所述宿主细胞是
(i)淋巴细胞，优选T淋巴细胞或T淋巴细胞祖细胞，例如CD4或CD8阳性T细胞；或
(ii)用于重组表达的细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或酵母细胞。
10.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至7中任一项所述的抗原多肽、根据权利要求8所述的核酸或核酸组或者载体、或根据权利要求9所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂稳定剂和/或赋形剂。
11.一种产生根据权利要求1至7中任一项所述的抗原结合多肽的方法，所述方法包括
(i)提供合适的宿主细胞，
(ii)提供包含编码所述抗原的编码序列的基因构建体；
(iii)根据权利要求1至7中任一项所述的结合多肽，
(iv)将所述基因构建体引入所述合适的宿主细胞中，以及
(iv)通过所述合适的宿主细胞表达所述基因构建体。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的抗原结合多肽、根据权利要求8所述的核酸或核酸组或者载体、根据权利要求9所述的宿主细胞、或根据权利要求10所述的药物组合物，用于医学。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的抗原结合多肽、根据权利要求8所述的核酸或载体、根据权利要求9所述的宿主细胞、或根据权利要求10所述的药物组合物，用于诊断、预防和/或治疗增殖性疾病、优选癌症。
14.一种用于改善或维持所述抗原结合多肽的结合和/或改善所述抗原结合多肽的稳定性的方法，所述抗原结合多肽包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中
(1)所述VH包含
(a)重链互补决定区1(HCDR1)，所述重链互补决定区1包含SEQ ID NO:52(SYVMH)的氨基酸序列，
(b)HCDR2，所述HCDR2包含YINPYNDVTKYX1X2KFX3G(SEQ ID NO:53)的氨基酸序列，其中
X1是A或N；
X2是E或Q；和/或
X3是Q或K
(c)HCDR3，以及
(d)重链框架区(HFR)1-4；
(2)所述VL包含
(a)轻链互补决定区1(LCDR1)，所述轻链互补决定区1包含SEQ ID NO:54(SATSSVSYMH)的氨基酸序列，
(b)LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:55(DTSKLAS)的氨基酸序列，
(c)LCDR3，以及
(d)轻链框架(LCR)1-4；
其中
(i)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和/或
(ii)包含SEQ ID NO:54的氨基酸的LCDR1的至少一个不带正电荷的氨基酸和/或包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的LCDR2的至少一个不带正电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代；和/或
(iii)根据Kabat编号的HFR1中的位置30被带正电荷的氨基酸取代，和/或
(iv)根据Kabat编号的HFR3中的位置90被酪氨酸(Y)残基取代，
其中
(1)与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽与α/βT细胞受体(TCR)/CD3复合物的结合增加；
(2)与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽与α/βT细胞受体(TCR)/CD3复合物的结合维持或增加并且所述抗原结合多肽的稳定性增加；或
(3)与亲本抗原结合多肽相比，所述抗原结合多肽的稳定性增加。
15.一种用于检测、确定或富集表达所述α/βTCR/CD3复合物的T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：使细胞与根据权利要求1-7中任一项所述的抗原结合多肽接触。
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- 2022-05-04 CN CN202280033077.1A patent/CN117255805A/zh active Pending
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| PB01 | Publication | ||
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