KR20240002224A

KR20240002224A - 개 줄기세포 유래 세포 분비물이 봉입된 마이크로스피어약물전달체 및 이의용도

Info

Publication number: KR20240002224A
Application number: KR1020230083495A
Authority: KR
Inventors: 김형식; 정지헌; 응웬티엔티엡; 서유진; 오수정
Original assignee: 부산대학교 산학협력단; 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2022-06-28
Filing date: 2023-06-28
Publication date: 2024-01-04

Abstract

본 발명은 개 줄기세포 유래 세포 분비물이 봉입된 마이크로스피어 약물전달체 및 이의 용도에 관한 것으로, 개 줄기세포 유래 분비인자(secretome)가 항염증 활성을 나타내고, 아토피 피부염 동물모델에 상기 분비인자를 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체에 봉입하여 투여하는 것이 약물전달체에 봉입하지 않고 투여하는 것보다 분비인자 전달 효율, 안정성 및 안전성이 증가하는 것을 확인함으로써, 개의 염증성 질환 예방 또는 치료 용도로써, 유용하게 활용될 수 있다.

Description

개 줄기세포 유래 세포 분비물이 봉입된 마이크로스피어 약물전달체 및 이의용도{Microsphere drug transporters comprising cell secretions derived from canine stem cells and uses thereof}

본 발명은 개 줄기세포 유래 세포 분비물이 봉입된 마이크로스피어 약물전달체 및 이의 용도에 관한 것이다.

반려견에서 발병하는 아토피성 피부염은 면역계의 과민반응으로 인해 발생하는 질환으로 알레르기와 관련된 염증성 만성 피부질환이다. 아토피성 피부염은 스트레스, 알레르기 및 면역학적 이상과 같은 다양한 원인으로 발병하게 된다. 이러한 아토피성 피부염은 과도한 가려움증, 피부 염증, 재채기 등과 같은 증상을 유발하며, 만성적으로 재발하여 반려견에게 큰 고통을 안겨주기 때문에 지속적인 관리가 필요하다. 또한, 정기적으로 반려견의 건강 상태를 확인하고 병원에서 치료를 받아야 하므로 보호자의 경제적 부담과 정신적 고통을 초래한다.

중간엽 줄기세포는 다양한 조직에서 쉽게 수집 및 분리가 가능한 다능성 성체 줄기세포로, 선천성 및 후천성 면역계와의 상호작용을 통해 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 자연 살해 세포를 포함한 면역세포의 활성화에 대한 억제 효과를 발휘한다.

이러한 중간엽 줄기세포의 면역 조절능을 임상적으로 적용하려는 시도가 늘고 있으며, 최근 여러 연구에서 중간엽 줄기세포 사용이 아토피 피부염에서 치료 효과가 있음이 입증되었다. 또한, 천식 및 비염과 같은 아토피 피부염과 유사한 알레르기 질환이나 염증성 질환에 효과적인 것으로 보고되고 있다. 그러나 줄기세포 자체를 치료에 이용하면 체내의 악화된 염증상황에 노출되면서 주입된 줄기세포가 빠르게 소실되어 치료효과가 오래 지속되지 못하고, 줄기세포 배양, 저장, 운송 과정 등에서 품질관리의 어려움이 크다. 이러한 측면에서 줄기세포에서 유래한 파라크라인 인자(paracrine factor)를 포함한 분비물질(secretome)을 치료에 적용하려는 시도가 증가하는 추세이나, 분비물질만을 단독으로 투여했을 때 효과를 발휘하기 전 빠르게 소실되는 문제가 지적되어 왔다. 최근 이러한 단점을 보강하기 위해 줄기세포 유래 분비물질을 생체적합성 마이크로입자(biocompatible polymeric microparticles)에 봉입하거나 생체적합성 고분자물질(biopolymers)과 혼입하여 이로운 인자들의 방출 속도와 패턴을 조절하려는 시도가 있으며, 특히 높은 생체적합성(biocompatibility)과 생체분해성(biodegradability)을 가지는 Poly(lactide-co-glycolide)(PLGA)가 이러한 목적으로 가장 많이 사용되고 있다. 이에 최근 심장 중간엽 줄기세포 유래 분비인자를 PLGA 마이크로입자에 봉입하고 마이크로입자의 표면을 세포막과 유사하게 변형하여 급성심근경색 마우스 모델에서 치료효과를 보여준 연구결과가 있으나, 가공 과정 중에 유기용매(organic solvent)를 사용하기 때문에 세포외소포체(extracellular vesicle)와 같이 지질 이중막을 갖는 분비물질 및 생체활성물질들이 손상되지 않고 봉입되는지에 대한 우려가 존재하므로 안정적으로 줄기세포 유래 분비물질을 생체적합성 물질에 봉입하고 체내에 전달하여 치료효능을 높이는 기술에 대한 수요가 높은 실정이다.

1. 대한민국 공개특허 KR 10-2013-0063483(2013.06.14. 공개)

본 발명의 목적은 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체로 봉입한 개(canine) 줄기세포 유래 분비인자를 유효성분으로 포함하는 개(canine) 염증성 피부질환 예방 또는 치료용 동물 의약품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체로 봉입한 개(canine) 줄기세포 유래 분비인자를 유효성분으로 포함하는 개(canine) 염증성 피부질환 예방 또는 개선용 동물 사료 첨가제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 개(canine) 개체에 상기 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체로 봉입한 개(canine) 줄기세포 유래 분비인자를 투여하는 단계를 포함하는 개(canine) 염증성 피부질환 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체로 봉입한 개(canine) 줄기세포 유래 분비인자를 유효성분으로 포함하는 개(canine) 염증성 피부질환 예방 또는 치료용 동물 의약품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체로 봉입한 개(canine) 줄기세포 유래 분비인자를 유효성분으로 포함하는 개(canine) 염증성 피부질환 예방 또는 개선용 동물 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 개(canine) 개체에 상기 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체로 봉입한 개(canine) 줄기세포 유래 분비인자를 투여하는 단계를 포함하는 개(canine) 염증성 피부질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 키토산을 계면활성제를 포함하는 석유 에테르(petroleum ether)에 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계(제1단계); 상기 제1단계의 혼합물을 25 내지 30℃, 3 내지 7분 및 20,000 내지 24,000rpm 조건에서 균질화(homogenize)하여 유중수형 에멀션(water-in-oil emulsion)을 형성하는 단계(제2단계); 상기 제2단계의 유중수형 에멀션을 교반하고, 수산화나트륨(NaOH)을 포함하는 에탄올에 첨가하여 경화된 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere)를 제조하는 단계(제3단계); 및 상기 제3단계의 경화된 키토산-마이크로스피어를 에탄올로 세척하고, 물에 분산시키거나, 동결 건조하는 단계(제4단계)를 포함하는, 상기 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 개 줄기세포 유래 분비인자가 항염증 활성을 나타내고, 아토피 피부염 동물모델에 상기 분비인자(secretome)를 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체에 봉입하여 투여하는 것이 약물전달체에 봉입하지 않고 투여하는 것보다 분비인자 전달 효율, 안정성 및 안전성이 증가하는 것을 확인함으로써, 개의 염증성 질환 예방 또는 치료 용도로써, 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 개 지방 유래 중간엽 줄기세포(adipose Tissue-Derived mesenchymal stem cell; 이하 ADMSC라 함)의 성상을 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 1A는 ADMSC를 광학 현미경으로 관찰한 이미지; 및 도 1B는 ADMSC에 대한 유세포 분석 결과이다.
도 2는 개의 ADMSC에서 유래한 분비인자를 포함한 배양액(Conditioned Media; CM)(이하 ADMSC-CM이라 함)의 항염증 활성을 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 2A~2B는 ADMSC-CM이 비장세포 증식에 미치는 영향; 도 2C는 Th2로 분화 유도한 세포에서 ADMSC-CM이 IL-4 발현이 미치는 영향; 도 2D~2E는 분화를 유도하지 않은 Th 세포(Th0)에서 ADMSC-CM이 각각 IL-10 생성 및 Foxp3 발현에 미치는 영향; 및 도 2F는 ADMSC-CM이 비만세포에 탈과립에 미치는 영향을 분석한 결과이다. *; p<0.05, **; p<0.01, ***; p<0.001, ****; p<0.0001.
도 3은 실시예 3에서 개시하는 ADMSC-CM 내 포함되어 있는 분비인자 분리 및 보관방법을 통해 분리/보관한 분비인자의 단백질 농도 및 아토피 피부염 치료 효능 연관 핵심인자 발현을 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 3A는 개의 ASMSC 유래 분비인자 분리방법에 대한 모식도; 및 도 3B~3C는 상기 분비인자에서 각각 단백질 농도 및 아토피 피부염 치료 효능 연관 핵심인자 발현을 분석한 결과이다.
도 4는 개의 ADMSC 유래 분비인자(secretome) 추출방법; 나노기공의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere; 이하 CS-MS라 함) 제조방법; 및 CS-MS 내 ADMSC 유래 분비인자 봉입에 대한 전반적인 모식도이다.
도 5는 CS-MS의 특성을 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 5A~5B는 CS-MS를 각각 광학 현미경 및 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope; SEM)으로 관찰한 이미지; 및 도 5C는 CS-MS의 크기를 분석한 결과이다.
도 6은 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin; 이하 BSA라 함)을 봉입한 CS-MS에서 다양한 요인에 따른 봉입율을 분석한 결과이다.
도 7은 개의 ADMSC 유래 분비인자(secretome)를 봉입한 CS-MS의 봉입율 및 세포 분비물 방출량을 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 7A는 CS-MS 내 분비인자 봉입에 대한 전반적인 모식도이고, 도 7B는 초기 분비인자 농도에 따른 CS-MS 내 분비인자 봉입율이며, 도 7C는 시간 경과에 따른 CS-MS 내 분비인자 방출량을 분석한 결과이다.
도 8은 마우스 모델에서 FITC-BSA를 봉입한 CS-MS의 FITC-BSA 잔존율 및 방출량을 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 8A는 실시예 4-4의 실험에 대한 전반적인 모식도; 도 8B~8C는 FITC-BSA를 봉입한 CS-MS를 주입한 마우스 모델에서 각각 FITC-BSA 잔존율 및 방출량을 분석한 결과이다.
도 9는 마우스 모델에서 CS-MS로 봉입한 세포 분비물의 아토피 피부염 개선 효과를 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 9A는 실시예 5의 실험에 대한 전반적인 모식도; 및 도 9B~9H는 마우스 모델에 CS-MS로 봉입한 세포 분비물을 투여한지 1달 후 각각 아토피 피부염 중증도 분석(B); 체중 및 비장 무게 분석(C); 면역글로불린(Immunoglobulin E; IgE) 발현 분석(D); H&E 및 Toluidine Blue 조직 염색 분석(E); 표피 두께 분석(F); 림프구 침투 분석(G); 및 비만세포 침투(H) 결과이다. ns; not significant, *; p<0.05, **; p<0.01, ***; p<0.001, ****; p<0.0001.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체를 제공한다.

상기 기공의 평균 입경은 0.05 내지 2μm일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약물전달체의 평균 입경은 5 내지 35μm일 수 있고, 바람직하게는 10 내지 20μm일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 분비인자는 세포 분비물(secretome)일 수 있고, 상기 세포 분비물(secretome)은 항염증 활성을 나타낼 수 있다.

상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)일 수 있고, 개의 지방에서 유래한 것일 수 있다.

상기 염증성 피부질환은 접촉피부염, 자극 접촉피부염, 알레르기 접촉피부염, 광독성 및 광알레르기 접촉 피부염, 접촉 두드러기 증후군, 자가 감작 피부염, 울체 피부염, 여드름, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 지루성 피부염, 구진상 두드러기, 습진 및 건선으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 동물 의약품 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태로 제조될 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LPTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPENSIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITIORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS) 및 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 동물 의약품 조성물의 투여량은 투여방법, 복용 동물의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.1 내지 100mg/kg(체중)으로 1회 이상 투여 가능하다. 다만, 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용 대상의 상태와 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제 조성물은 일반 사료와 함께 혼합하여 급여할 수 있고, 동물이 섭취하기 용이하여 적용범위가 넓다.

또한, 본 발명의 사료 첨가제 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 건조, 반-습윤(semimoist), 습윤 등의 다양한 형태로 제작이 가능하며, 예를 들어, 분말, 과립, 환, 펠릿, 젤리, 캔, 비스켓, 크로켓, 너겟, 플레이크 및 스낵으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 형태로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 사료 첨가제 조성물은 하나 이상의 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있고, 구체적으로, 상기 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 개(canine) 개체에 상기 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체로 봉입한 개(canine) 줄기세포 유래 분비인자를 투여하는 단계를 포함하는 개(canine) 염증성 피부 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 계면활성제는 Span-80, Tween-20, 폴리비닐알코올, 에틸렌비닐아세테이트 공중합체, 무수말레인산, 아크릴산, 글리시딜메타아크릴레이트 및 폴리에틸렌비닐알코올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 균질화는 균질기(homohenizer)를 통해 수행될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[ 실시예 1] 개의 ADMSC 성상 분석

개(canine)의 ADMSC를 피하지방 조직으로부터 분리배양 하였다. 이를 위해 경북대학교 동물실험 윤리위원회 승인번호 KNU2022-0348 실험 건으로부터 유래한 개(비글, 수컷)의 지방조직을 제공받아 분리배양에 이용하였다. 개 피하지방에서 분리한 조직을 1% P/S(Penicillin/Streptomycin)가 들어간 PBS(phosphate-buffered saline)를 이용하여 3번 반복해서 세척을 진행하였다. 조직을 1mg/mL collagenase type I 및 1% P/S가 포함된 digestion 용액에 넣고 37℃ 진탕배양기(shaking incubator)에서 배양시켰다. 조직이 완전히 용해된 후 10% FBS(fetal bovine serum)를 넣어 효소반응을 정지시키고, 1500rpm으로 5분 원심분리 후 100μM 셀 스트레이너(cell strainer)를 이용해서 여과하고 1~2 x 10⁶ cells/mL의 세포를 6 웰 플레이트에 심고, 10% FBS가 포함된 글루코스 함량이 낮은(low glucose) DMEM(Dulbecco's Modified Essential Medium)에서 배양하였다. 배양된 세포의 성상을 확인하기 위해, 유세포 분석을 통해 ADMSC의 세포 성상을 확인하였다. 그 결과, 도 1과 같이, ADMSC는 CD45 및 CD34에서 음성을 나타냈고, CD90 및 CD44에서 양성을 나타냈다.

[ 실시예 2] 개의 ADMSC 유래 CM의 항염증 활성 분석

상기 실시예 1의 ADMSC의 항염증 활성을 확인하기 위해, ADMSC-CM을 이용한 Treg 분화 및 아토피 피부염 관련 면역세포 활성 분석을 수행하였다.

ADMSC-CM이 비장세포의 증식을 억제하는지 확인하기 위해, 마우스(수컷, 8주령, Orient Bio Company, Republic of Korea) 비장에서 바로 분리한 세포와 ADMSC-CM을 같이 배양하여 CFSE(Carboxyfluorescein succinimidyl ester) 형광 염색을 하고 5일 후 유세포 분석을 통해 확인하였다. 그 결과, 도 2A~2B와 같이, ADMSC-CM이 비장세포의 증식을 유의하게 억제하였다. 또한, ADMSC-CM이 Th2 분화 억제 및 Treg 분화 유도를 하는지 확인하기 위해, 마우스에서 분리한 비장세포에서 Magnetic-activated cell sorting(MACS)와 mouse Naive CD4+ T Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec)를 이용하여 CD4⁺ T cell(Th0)을 분리하였다. 이후 ImmunoCult™ Mouse Th2 Differentiation Supplement(Stem Cell Technologies)를 처리하여 Th2를 유도한 후, 분비인자(CM)를 처리하고, Th2 유도 변화를 관찰하였다. 그 결과, 도 2C와 같이, ADMSC-CM의 처리가 Th2로 분화 유도한 세포의 IL-4 발현을 억제하였으나, 유의한 차이는 나타나지 않았다. Treg의 경우 Th0 세포에 ADMSC-CM을 처리하고 배양하여 Treg를 유도 할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, 도 2D~2E와 같이, 분화를 유도하지 않은 Th 세포(Th0)에서 ADMSC-CM 처리가 IL-10 생성 및 Foxp3 mRNA 발현을 촉진하여 Treg을 유도하는 것을 확인하였다. 마지막으로 ADMSC-CM이 비만세포 탈과립에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 마우스 골수에서부터 비만세포를 분리하고 배양 4주 후에 ADMSC-CM과 배양한 후, β-hexosaminidase activity assay kit(Cell Biolabs)를 이용하여 효소 활성 분석을 진행하였다. 그 결과, 도 2F와 같이 ADMSC-CM 처리 시 비만세포의 탈과립이 감소하였다. 상기 결과로부터, ADMSC-CM이 Treg 분화를 유도하고 비만세포 활성을 억제함으로써 염증제어를 할 수 있음을 확인하였다.

[ 실시예 3] 개의 ADMSC 유래 분비인자 분리 및 최적의 보관방법 분석

개의 ADMSC-CM 내 포함되어 있는 분비인자를 효율적으로 분리하고 안전하게 저장/복구하기 위해, 도 3A와 같이, 초원심 분리 및 ADMSC-CM 농축 후 동결건조를 통해 파우더화하는 방법의 프로토콜을 확립하였다. 보관 방법의 안정성을 확인하기 위해 ADMSC-CM 농축 후, 동결건조한 샘플의 단백질 농도를 측정한 결과, 도 3B와 같이, 단백질 농도가 안정적으로 유지되었고, 동결건조 후 아토피 피부염 치료 효능과 연관된 핵심인자[TGF-β1, LIF(leukemia inhibitory factor) 및 HGF(Hepatic growth factor)] 발현을 분석한 결과, 도 3C와 같이, 상기 핵심인자 발현이 일정하게 유지되는 것을 확인하였다.

[ 실시예 4] 약물전달체 제조

4-1. CS-MS 특성 분석

도 4와 같이, CS-MS(chitosan-microsphere)를 유중수형 에멀션(water-in-oil emulsion) 방법으로 제조하였다. 구체적으로, phase inversion regeneration 방법을 사용하여 준비되었다. 3ml의 1% 키토산(≥75% 탈아세틸화) 용액(0.2M 염화나트륨 및 1% 아세트산 포함)을 7.6%의 계면활성제 Span-80 및 0.4% Tween-20을 함유하는 25ml의 석유 에테르(petroleum ether)에 첨가하였다. 다음으로, 혼합물을 실온에서 5분 동안 22,000rpm에서 균질화(homogenize)하여 유중수형 에멀션을 형성하였다. 에멀션은 -20℃에서 최소 4시간 동안 급속 냉동시켰다. 실온에서 5분 동안 유지한 후, 차가운 에멀션을 5시간 이상 교반하면서 7% 5M NaOH(phase inversion solution 용액)를 함유하는 70ml의 에탄올에 첨가하였다. 그 후, 경화된 CS-MS를 에탄올로 3회 세척하였다. CS-MS를 물에 분산시키거나 동결건조하여 분말을 얻었다.

CS-MS의 나노 사이즈 기공(pore)은 저온(-20℃)에서 에멀션을 담금질한(quenching) 후, 에탄올 NaOH 용액에서 경화시켜 형성하였다. 키토산 용액에 첨가된 염화나트륨도 포로겐(porogen)으로 작용하여 물에 분산시킨 후 마이크로스피어 기공을 형성하였다. CS-MS을 광학 현미경 및 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope; SEM)으로 관찰한 결과, 도 5A~5B와 같이, CS-MS는 표면이 거칠고, 표면에 작은 기공이 있는 구형의 형태를 나타냈다. 또한, CS-MS의 크기(평균 입경)를 분석한 결과, 도 5C와 같이, CS-MS의 평균 입경은 5~35μm이고, 10~20μm의 빈도가 가장 높게 나타났다.

4-2. CS-MS 내 BSA 봉입 분석

CS-MS 내 BSA(bovine serum albumin) 봉입(loading)은 BSA 농도, pH 및 용액 부피, 반응 시간 및 반응 온도를 포함한 다양한 요인을 통해 평가하였다. CS-MS 1mg을 4℃ 또는 37℃에서 1~24시간 동안 250~5000μg/ml BSA를 포함하는 PBS(Phosphate-buffered saline, 0.2~1ml, pH 6.5 및 pH 7.0)로 배양하였다. 그 후, CS-MS를 벗겨내고 상등액을 수집하여 BCA assay을 통해 봉입되지 않은(unloaded) BSA 양을 측정하였다. 그 결과, 도 6과 같이, CS-MS에 봉입된 BSA의 양은 BSA 용액의 부피가 아닌 초기 BSA 농도에 비례하였다. 또한, pH 7.0 대비 pH 6.5 조건에서 BSA 봉입이 더 높게 나타났다. 또한, 37℃ 대비 4℃ 조건에서 BSA 봉입이 더 높게 나타났고, BSA 봉입은 배양 1시간 후 포화되었다. 상기 결과로부터, 추가적인 배양이 BSA 봉입을 증가시키지 않음을 확인하였다.

4-3. CS-MS 내 개의 ADMSC -CM 유래 분비인자 봉입

CS-MS에 개의 ADMSC-CM 유래 분비인자(secretome)를 봉입하기 위해, 도 7A와 같이, CS-MS 1mg을 4℃에서 1시간 동안 분비인자를 포함하는 1ml PBS 용액(pH 6.5)으로 배양하였다. 초기 분비인자 농도(2000μg/ml 및 5000μg/ml)에 따른 분비인자 봉입 양을 분석한 결과, 도 7B와 같이, 초기 분비인자 농도 2000μg/ml 및 5000μg/ml에서 분비인자가 각각 322±43μg 및 678±134μg로 나타났다. 또한, PBS에서 봉입된 CS-MS를 배양하고 상등액을 수집하여 방출된 분비인자 양을 측정함으로써, 분비인자 방출량을 분석한 결과, 도 7C와 같이, 배양 첫날에 ~30%까지 분비인자가 방출되었고, 방출 후 최소 7일 동안 지속적인 방출 패턴을 나타냈으며, 7일째에는 ~45%까지 세포 분비물이 방출되는 것을 확인하였다.

4-4. 단백질 잔존율 및 방출량 분석

CS-MS 내 ADMSC-CM 유래 분비인자(secretome)의 생물 활성 분자가 오랫동안 잔존(retention)하는지 확인하기 위해, FITC-BSA를 형광 라벨이 붙은 단백질 모델로 사용했고, FITC-BSA를 CS-MS 내에 봉입하고, 도 8A와 같이, C57BL/6 마우스(수컷, 8~12주령, Orient Bio Company, Republic of Korea)의 피하 공간에 주입한 후, FITC의 형광 신호를 in vivo 이미징 시스템(in vivo imaging system; IVIS)을 사용하여 시간 경과에 따라 관찰하였다. 그 결과, 도 8B와 같이, 봉입하지 않은 FITC-BSA(Free BSA)는 주입된 부위에서 빠르게 제거되었고, 1일 후 약 10%만이 남아있음을 확인하였다. 한편, CS-MS에 봉입한 FITC-BSA(BSA/CS-MS)는 30~40%가 5일 동안 남아있었다. 상기 결과로부터, CS-MS에 봉입하는 것이 FITC-BSA의 잔존율을 크게 향상시켰음을 확인하였다. 또한, 도 8B~8C와 같이, 주입 후 7일째에 봉입하지 않은 그룹(2.1±0.1%) 대비 CS-MS에 봉입한 그룹(10.5±2.5%)에서 FITC-BSA 신호가 약 5배 더 높게 나타났다. 상기 결과로부터, CS-MS가 단백질 방출 효과가 우수한 것을 확인하였다.

[ 실시예 5] CS-MS로 봉입한 분비인자의 동물실험 효능 확인

CS-MS로 봉입한 분비인자의 아토피 피부염 개선 효과를 확인하기 위해, NC/Nga 마우스(중앙실험동물)에 개의 ADMSC 유래 분비인자(ST) 및 분비인자를 봉입한 약물전달체(ST/CS-MS)를 각각 투여하여 아토피 피부염에 대한 치료효능 및 안전성 평가를 진행하였다. 4% SDS(sodium dodecyl sulfate)를 처리한 후 건조된 마우스 등에 일주일에 2회씩 3주 동안 집먼지 진드기(Dermatophagoides farinase; Df) 추출물을 균일하게 도포하여(한마리 당 10mg) 아토피를 유발하였다. 그 후, 도 9A와 같이, 개 ADMSC 유래 분비인자(CM)와 약물전달체에 봉입된 분비인자(MS)를 2주차 및 3주차에 아토피 유발 부위 주변 피하에 투여하였다. 구체적으로, 실험군은 하기와 같다.

1) 정상군(N.C.)(n=5)

2) 아토피 피부염 + 베히클(vehicle) 투여군(V.C.)(이하 대조군이라 함) (n=8): 100μl PBS

3) 아토피 피부염 + 약물전달체 투여군(C.C)(n=6): 100μl(3mg CS-MS)

4) 아토피 피부염 + 분비인자 투여군(ST)(n=10): 240μg/100μl

5) 아토피 피부염 + 약물전달체에 봉입된 분비인자 투여군(ST/CS-MS)(n=10)

: 240μg/100μl(0.5mg CS-MS)

한달 후에 아토피 유발 부위를 관찰한 결과, 도 9B와 같이, 대조군(V.C.) 대비 분비인자 봉입 CS-MS 투여군(ST/CS-MS)에서 아토피 중증도가 유의하게 감소하였고, 약물전달체 투여군(C.C) 및 분비인자 단독 투여군(ST)과 비교해도 아토피 피부염 증상 유의하게 개선되었다. 또한, 도 9C와 같이, 실험군간 유의한 체중 차이는 나타나지 않았고, 대조군 대비 분비인자 단독 투여군(ST) 및 분비인자 봉입 CS-MS 투여군(ST/CS-MS)의 비장 무게가 감소하였다. 또한, 도 9D와 같이, 분비인자 단독 투여군(ST) 및 분비인자 봉입 CS-MS 투여군(ST/CS-MS)의 혈액에서 면역글로불린 E(Immunoglobulin E; IgE) 발현이 감소하였고, 도 9E~9H와 같이, CS-MS 투여군(ST/CS-MS)에서 병변 부위의 외피 두께와 림프구, 비만세포 등 면역세포 침윤이 대조군 대비 유의적으로 감소하였으며, 표피 두께 지표에서는 분비인자 단독 투여군(ST)과도 유의적인 차이를 나타냈다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims

기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체.
제1항에 있어서, 상기 기공의 평균 입경은 0.05 내지 2μm인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
제1항에 있어서, 상기 약물전달체의 평균 입경은 5 내지 35μm인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
제1항의 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체로 봉입한 개(canine) 줄기세포 유래 분비인자를 유효성분으로 포함하는 개(canine) 염증성 피부질환 예방 또는 치료용 동물 의약품 조성물.
제4항에 있어서, 상기 분비인자는 세크리톰(secretome)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서, 상기 세크리톰(secretome)은 항염증 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서, 상기 줄기세포는 개 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서, 상기 줄기세포는 개의 지방에서 유래한 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 접촉피부염, 자극 접촉피부염, 알레르기 접촉피부염, 광독성 및 광알레르기 접촉 피부염, 접촉 두드러기 증후군, 자가 감작 피부염, 울체 피부염, 여드름, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 지루성 피부염, 구진상 두드러기, 습진 및 건선으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항의 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체로 봉입한 개(canine) 줄기세포 유래 분비인자를 유효성분으로 포함하는 개(canine) 염증성 피부질환 예방 또는 개선용 동물 사료 첨가제 조성물.
개(canine) 개체에 제1항의 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체로 봉입한 개(canine) 줄기세포 유래 분비인자를 투여하는 단계를 포함하는 개(canine) 염증성 피부질환 예방 또는 치료 방법.
키토산을 계면활성제를 포함하는 석유 에테르(petroleum ether)에 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계(제1단계);
상기 제1단계의 혼합물을 25 내지 30℃, 3 내지 7분 및 20,000 내지 24,000rpm 조건에서 균질화(homogenize)하여 유중수형 에멀션(water-in-oil emulsion)을 형성하는 단계(제2단계);
상기 제2단계의 유중수형 에멀션을 교반하고, 수산화나트륨(NaOH)을 포함하는 에탄올에 첨가하여 경화된 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere)를 제조하는 단계(제3단계); 및
상기 제3단계의 경화된 키토산-마이크로스피어를 에탄올로 세척하고, 물에 분산시키거나, 동결 건조하는 단계(제4단계)를 포함하는,
제1항의 기공이 있는 구형 형태의 키토산-마이크로스피어(chitosan-microsphere) 약물전달체 제조방법.
제12항에 있어서, 상기 계면활성제는 Span-80, Tween-20, 폴리비닐알코올, 에틸렌비닐아세테이트 공중합체, 무수말레인산, 아크릴산, 글리시딜메타아크릴레이트 및 폴리에틸렌비닐알코올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.