KR20230172466A - 항산화 작용을 갖는 유산균 음료 - Google Patents
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Abstract
[과제] 유산균 음료의 항산화성에 대해서 검토하는 것을 과제로 했다. 또한, 그의 유효 성분에 대해서 발견하는 것을 과제로 했다.
[해결 수단] 유산균 음료에 대해서 항산화성을 갖는 점을 발견했다. 또한, 그의 유효 성분으로 하는 항산화성 물질이 DDMP(2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one)인 것을 발견했다. 본 발명은 항산화 작용을 갖는 성분을 함유하는 유산균 음료에 관한 것이다. 또한, 항산화 작용을 갖는 성분은 DDMP이다.
[해결 수단] 유산균 음료에 대해서 항산화성을 갖는 점을 발견했다. 또한, 그의 유효 성분으로 하는 항산화성 물질이 DDMP(2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one)인 것을 발견했다. 본 발명은 항산화 작용을 갖는 성분을 함유하는 유산균 음료에 관한 것이다. 또한, 항산화 작용을 갖는 성분은 DDMP이다.
Description
본 발명은 유산균 음료에 관한 것이다. 특히, 항산화 작용을 갖는 유산균 음료에 관한 것이다.
유산균 음료는 널리 이용되고 있고, 오랜 세월에 걸쳐서 폭넓은 연령대에 지지를 받고 있다. 예를 들면, 피르크루(등록상표: 닛신 요크 가부시키가이샤)나 야쿠르트(등록상표: 가부시키가이샤 야쿠르트 본사) 등이 알려져 있다. 당해 유산균 음료에 대해서는, 장 내 환경을 개선하는 기능을 갖는 점이 널리 알려져 있다. 또한, 스트레스 개선이나, 혈당 저하, 피로 회복 등의 우수한 효과도 발휘하는 타입도 알려져 있다.
한편, 이 유산균 음료에 대해서는 상기 외에도 유용한 기능성이나 효과를 발휘하는 것이 기대된다. 예를 들면, 항산화성에 대해서는, 종래까지 유산균 음료에 있어서 항산화성을 갖는 점, 또는 그 항산화성 물질에 대해서 선행하는 특허문헌은 알려져 있지 않았다.
유산균 음료의 항산화성에 관련된 특허문헌으로서는, 특허문헌 1에 유산균 음료에 대한 항산화제의 기재가 있다. 그러나, 당해 특허문헌은 유제품 유산균 음료에 도코사헥사엔산(DHA)을 포함시키는 것을 주목적으로 하고, 그의 부수적 성분으로서 항산화제를 첨가하는 것이 기재되어 있는 것에 불과하다.
그래서, 본 발명자들은 유산균 음료의 항산화성에 대해서 검토하는 것을 과제로 했다. 또한, 그의 유효 성분에 대해서 발견하는 것을 과제로 했다.
본 발명자들의 예의 연구의 결과, 유산균 음료에 대해서, 항산화 작용을 갖는 기능을 확인하여, 본 발명을 완성시킨 것이다.
즉, 본원 제1 발명은,
"항산화 작용을 갖는 성분을 함유하는 유산균 음료"이다.
다음으로, 상기 항산화 작용을 갖는 성분은, DDMP(2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one)가 포함되어 있는 것을 발견했다.
즉, 본원 제2 발명은,
"상기 성분이 DDMP(2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one)인 청구항 1에 기재된 유산균 음료"이다.
다음으로 본 출원인은, DDMP를 유효 성분으로 하는 항산화용 유산균 음료도 의도하고 있다. 즉, 본원 제3 발명은,
"DDMP를 유효 성분으로 하는 항산화용 유산균 음료"이다.
다음으로, 상기 DDMP에 대해서는, 당해 유산균 음료에 있어서 150μM(μ㏖/L) 이상 함유하는 것이 바람직하다.
즉, 본원 제4 발명은,
"DDMP를 150μM 이상 함유하는 청구항 2 또는 3에 기재된 유산균 음료"이다.
다음으로, 상기 유산균 음료는, 원료로서 탈지유 및 당류를 이용하여, 당해 원료를 포함하는 재료유(乳)를 열로 살균하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다.
즉, 본원 제5 발명은,
"상기 유산균 음료가, 원료로서 탈지유 및 당류를 포함하는 재료유를 열로 살균하는 공정을 포함하는 제조 공정에 의해 제조되는 청구항 1∼4의 어느 것에 기재된 유산균 음료"이다.
다음으로, 상기 본원 제5 발명에 있어서는, 당류가 포도당을 함유하는 것이 바람직하다.
즉, 본원 제6 발명은,
"상기 당류가 포도당을 함유하는 청구항 5에 기재된 유산균 음료"이다.
다음으로, 본 출원인은, 항산화 작용을 갖는 취지를 상품 패키지 등에 표기한 유산균 음료도 의도하고 있다.
즉, 본원 제7 발명은,
"항산화 작용을 갖는 취지를 표시한 유산균 음료" 이다.
본 발명의 유산균 음료는 항산화 성분으로서 DDMP를 함유하고, 항산화 작용을 갖는다. 이에 따라 여러 가지의 유용한 효과를 발휘할 수 있다.
도 1은 시험예 1에 있어서 본 발명의 제1 실시 태양의 유산균 음료 및 다른 시판의 유산균 음료의 DPPH 라디칼 소거 활성을 비교한 도면이다.
도 2는 본 발명의 제1 실시 태양의 유산균 음료 및 Trolox의 DPPH 라디칼 소거 활성(항산화력)을 회귀 직선의 기울기를 이용하여 비교한 도면이다.
도 3은 시험예 2에 있어서의 발효액의 분획 스킴을 나타낸 플로우도이다.
도 4는 도 3에 있어서의 분획한 각 플랙션의 항산화 활성을 나타낸 도면이다.
도 5는 도 3에 있어서의 XAD4-25％ 에탄올 용출 플랙션에 대해서 칼럼·분리한 크로마토 차트와 각 플랙션의 DPPH 소거 활성을 나타낸 도면이다.
도 6은 도 5에 있어서의 플랙션 7을 ODS 칼럼을 이용하여 추가로 정제를 행한 크로마토 차트도이다.
도 7은 도 6에 있어서의 피크 부분의 흡수 스펙트럼을 나타낸 차트도이다.
도 8은 도 6에 있어서의 피크 부분의 LC/MS에 의한 분석을 실시한 결과의 차트도이다.
도 9는 도 6에 있어서의 피크 부분의 GC/MS에 의한 동정(同定)을 나타낸 결과의 차트도이다.
도 10은 시험예 3에 있어서의 본원의 제1 실시 태양 및 시장의 다른 유산균 음료에 포함되는 DDMP를 측정한 LC 차트도이다.
도 11은 본 발명의 제1 실시 태양의 유산균 음료의 항산화력에 대해서 아스코르빈산과 회귀 직선의 기울기를 이용하여 비교한 도면이다.
도 12는 도 11의 경우와 마찬가지로 다른 A사의 유산균 음료의 항산화력에 대해서 회귀 직선의 기울기를 이용하여 비교한 도면이다.
도 13은 시험예 4에 있어서의 재료유의 가열 시간 등에 의한 DDMP량의 변화를 나타낸 LC 차트도이다.
도 14는 시험예 5에 있어서의 당 원료를 바꾼 경우의 생성되는 DDMP량을 비교한 도면이다.
도 15는 시험예 6에 있어서의 리신의 첨가에 의한 효과를 나타낸 도면이다.
도 16은 시험예 7에 있어서의 각종 프로테아제의 첨가 효과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 제1 실시 태양의 유산균 음료 및 Trolox의 DPPH 라디칼 소거 활성(항산화력)을 회귀 직선의 기울기를 이용하여 비교한 도면이다.
도 3은 시험예 2에 있어서의 발효액의 분획 스킴을 나타낸 플로우도이다.
도 4는 도 3에 있어서의 분획한 각 플랙션의 항산화 활성을 나타낸 도면이다.
도 5는 도 3에 있어서의 XAD4-25％ 에탄올 용출 플랙션에 대해서 칼럼·분리한 크로마토 차트와 각 플랙션의 DPPH 소거 활성을 나타낸 도면이다.
도 6은 도 5에 있어서의 플랙션 7을 ODS 칼럼을 이용하여 추가로 정제를 행한 크로마토 차트도이다.
도 7은 도 6에 있어서의 피크 부분의 흡수 스펙트럼을 나타낸 차트도이다.
도 8은 도 6에 있어서의 피크 부분의 LC/MS에 의한 분석을 실시한 결과의 차트도이다.
도 9는 도 6에 있어서의 피크 부분의 GC/MS에 의한 동정(同定)을 나타낸 결과의 차트도이다.
도 10은 시험예 3에 있어서의 본원의 제1 실시 태양 및 시장의 다른 유산균 음료에 포함되는 DDMP를 측정한 LC 차트도이다.
도 11은 본 발명의 제1 실시 태양의 유산균 음료의 항산화력에 대해서 아스코르빈산과 회귀 직선의 기울기를 이용하여 비교한 도면이다.
도 12는 도 11의 경우와 마찬가지로 다른 A사의 유산균 음료의 항산화력에 대해서 회귀 직선의 기울기를 이용하여 비교한 도면이다.
도 13은 시험예 4에 있어서의 재료유의 가열 시간 등에 의한 DDMP량의 변화를 나타낸 LC 차트도이다.
도 14는 시험예 5에 있어서의 당 원료를 바꾼 경우의 생성되는 DDMP량을 비교한 도면이다.
도 15는 시험예 6에 있어서의 리신의 첨가에 의한 효과를 나타낸 도면이다.
도 16은 시험예 7에 있어서의 각종 프로테아제의 첨가 효과를 나타낸 도면이다.
(발명을 실시하기 위한 형태)
이하의 본 발명의 내용을 설명한다.
-유산균 음료-
본 발명에 말하는 유산균 음료란, 이하와 같은 공정으로 조제된다. 즉, 우선, 원료의 혼합 공정으로서, 원료가 되는 탈지유, 물이나 우유를 혼합하여 재료유(유(乳) 배지)를 조제하고, 다음으로 살균·냉각 공정으로서, 재료유를 고온에서 가열 살균하여, 발효에 필요한 온도에까지 식힌다.
다음으로, 유산균의 접종 공정으로서, 별도로 조제해 둔 종균(유산균을 배양해 둔 것(전(前) 배양))을 가열 후의 재료유에 더한다. 다음으로, 발효 공정으로서 탱크 내에서 일정한 온도로 유지하여 발효를 행한다. 다음으로, 냉각 후, 혼합·희석 공정으로서, 배양 후의 발효액에 시럽이나 과즙 등을 더하고, 필요에 따라서 희석수로 조정한다. 이것을 균질화한 것을 용기에 충전하여 유산균 음료가 완성한다.
또한, 유산균 음료의 종류별로서는, 「유제품 유산균 음료」와「유산균 음료」가 있다. 우선, 「유제품 유산균 음료」에 대해서는, 무지유 고형분(우유로부터 유지방분과 수분을 제거한 성분)을 3.0％ 이상 포함하고, 유산균수 또는 효모수가 1000만/ml 이상인 것을 말하고, 생균 타입과 살균 타입이 있다.
다음으로, 「유산균 음료」에 대해서는, 무지유 고형분이 3.0％ 미만에서 유산균수 또는 효모수가 100만/ml 이상인 것을 말한다.
본 발명에 있어서의 유산균 음료란, 상기의 「유제품 유산균 음료」 및 「유산균 음료」를 모두 포함하는 것으로 한다.
-본 발명에 있어서의 바람직한 유산균 음료의 제조 방법-
일반적인 유산균 음료의 제조 방법은 전술한 바와 같지만, 특히, 본 발명의 유산균 음료는 대체로 이하와 같이 제조하는 것이 바람직하다. 단, 본 발명은 이하의 제조 방법에 한정되는 것은 아니다.
(1) 재료유 용해(유 배지의 조제)
탈지유를 중심으로 한 유 원료를 5∼30중량％, 당류를 2∼20중량％가 되는 정도로 재료유(유 배지)를 조제한다. 또한, 바람직하게는, 유 원료를 15∼20중량％, 당류를 10∼15중량％로 한다.
또한, 재료유에 있어서의 당류는, 포도당을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 포도당이나 포도당 과당액당을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 아미노산으로서 리신을 첨가하는 것이 바람직하다.
(2) 가열
상기 재료유를 80℃∼100℃에서 30분∼180분 정도 가열한다. 또한, 가열 시간에 대해서는 바람직하게는 60분∼160분이다. 또한, 더욱 바람직하게는, 90분∼140분이다. 가장 바람직하게는, 100분∼120분으로 한다.
(3) 발효액(전 배양)
유산균(락토바실루스, 락토코쿠스, 페디오코쿠스, 류코노스톡, 스트렙토코쿠스, 엔테로코쿠스 등)을 배양한 배양액(스타터액)을 상기의 가열 후의 유 배지에 첨가하여 30℃∼40℃ 정도에서 소정의 유산 산도가 될 때까지 배양하여 발효액을 얻을 수 있다.
(4) 시럽액
설탕, 포도당, 과당 등을 포함하는 시럽액 베이스를 조제하여, 가열 살균 및 냉각을 행하여 시럽액을 얻는다.
(5) 혼합·균질화
상기 발효액과 시럽액을 1:1 또는 1:5∼5:1 정도의 중량 비율로 혼합, 균질화하여 유산균 음료를 완성시킨다.
이와 같이, 본 발명에 있어서는 유산균 음료의 바람직한 제조 방법으로서, 탈지분유 및 당류를 함유하는 재료유를 가열 후, 당해 가열 후의 재료유와 유산균의 배양액을 혼합하여 소정 시간의 발효 후, 당해 발효 후의 발효액에 시럽액을 혼합하여 조제하는 제조 방법을 채용한다.
본 공정 중, 탈지분유 및 당류를 함유하는 재료유의 가열 시간을 전술과 같이 하는 것이 바람직하다.
-항산화성-
항산화성에 대해서는, 생체에 있어서 여러 가지의 기능이 있다고 말해지고 있지만, 예를 들면, 피로(와 노화)의 원인인 과잉의 활성 효소를 억제할 수 있다고 여겨지고 있다.
즉, 활성 산소를 비롯한 프리 라디칼은 노화나 암, 생활 습관병의 원인인 것이 보고되어 있다. Harman에 의해 제창된 노화의 프리 라디칼설에서는, 에너지 대사의 부산물로서 주로 미토콘드리아에서 산생된 프리 라디칼이, DNA나 단백질, 지질 등을 산화시키는 것이 노화의 원인이라고 한다((1) D Harman, Free radical involvement in aging. Pathophysiology and therapeutic implications., Drugs Aging 1993 3(1) 60-80 (2) Wulf Droge, Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev 2002 82(1) 47-951). 사람은 호흡에 의해 산소를 체내에 취입하고, 미토콘드리아에 존재하는 전자 전달계에 의해 ATP를 산생하여, 생명 활동에 필요한 에너지를 획득하고 있다. 이 과정에서 다양한 활성 산소종이 발생한다. 활성 산소는 매우 높은 반응성을 갖는다(나카무라 시게오 활성 산소와 항산화 물질의 화학 일본의과대학 의학회 잡지 2013 9 164-169). 활성 산소는 지질과 반응함으로써 지질 과산화물이 생성되어, 동맥 경화, 심근경색 등의 원인이 되는 것이 보고되어 있다(J L Witztum, D Steinberg, Role of oxidized low density lipoprotein in atherogenesis. J Clin Invest. 1991 88(6) 1785-92).
또한, 활성 산소는 핵산과 반응하면 DNA쇄 절단이나 핵산 염기의 산화적 수식에 의한 DNA의 변이에 의해 발암을 일으킬 가능성이 있다(Miral Dizdaroglu, Pawel Jaruga, Mechanisms of free radical-induced damage to DNA. Free Radic Res 2012 46(4) 382-419).
생체에 있어서 발생한 활성 산소를 제거하는 구조를 생체는 구비하고 있다. 슈퍼 옥사이드 디스무타아제(SOD)나 카탈라아제와 같은 과산화 수소 제거 효소 등에 의해, 생체 내에서 발생한 활성 산소가 무해화된다. 한편, 천연에는 항산화 작용을 갖는 저분자 화합물이 많이 존재하고, 생체는 이들을 생합성하거나, 음식으로부터 취입함으로써, 활성 산소에 의한 산화 상해로부터 생체를 방어하고 있다. 대표적인 천연의 항산화 물질로서 아스코르빈산(비타민 C), α-토코페롤(비타민 E), 녹차에 포함되는 카테킨, 적와인에 포함되는 레스베라트롤 등의 폴리페놀이 있다(나카무라 시게오 활성 산소와 항산화 물질의 화학 일본의과대학 의학회 잡지 2013 9 164-169).
만성 피로의 원인에 대해서는 현 시점에서 불명확한 점이 많지만, 만성 피로자에 있어서는 프리 라디칼의 산생이 많아, 산화 스트레스가 원인일 가능성이 보고되어 있다(A C Logan, C Wong, Chronic fatigue syndrome: oxidative stress and dietary modifications. Altern Med Rev 2001 6(5) 450-9). 항산화 작용을 갖는 이미다졸디펩티드를 400㎎ 배합한 음료의 계속 섭취에 있어서, 일상 작업에 있어서 피로를 자각하고 있는 건강한 자의 피로감을 경감하는 것이 보고되어 있다(시미즈 케이치로, 후쿠다 마사히로, 야마모토 하루아키, 이미다졸디펩티드 배합 음료의 일상적인 작업 속에서 피로를 자각하고 있는 건강한 자에 대한 계속 섭취에 의한 유용성 약리와 치료 vol.37 no.3 2009 37(3) 255-637). 이와 같이 항산화 물질을 포함하는 식품의 일상적인 섭취는 피로감을 경감하는 효과가 기대된다.
여기에서, 요구르트나 유산균 음료는 유산균을 포함하고, 정장 작용(Iva Hojsak, Probiotics in Functional Gastrointestinal Disorders. Adv Exp Med Biol 2019 1125 121-137.), 면역 조절 작용(Yueh-Ting Tsai, Po-Ching Cheng, Tzu-Ming Pan, The immunomodulatory effects of lactic acid bacteria for improving immune functions and benefits. Appl Microbiol Biotechnol 2012 96(4) 853-62), 꽃가루 알레르기, 아토피성 피부염과 같은 알레르기의 예방(Wioletta Zukiewicz-Sobczak, Paula Wroblewska, Piotr Adamczuk, Wojciech Silny, Probiotic lacticacid bacteria and their potential in the prevention and treatment of allergic diseases. Cent Eur JImmunol 2014 39(1) 104-8), 궤양성 대장염의 개선(Maria Jose Saez-Lara, Carolina Gomez-Llorente, Julio Plaza-Diaz, Angel Gil, The role of probiotic lactic acid bacteria and bifidobacteria in the prevention and treatment of inflammatorybowel disease and other related diseases: a systematic review of randomized human clinical trials. Biomed Res Int 2015 2015:505878)과 같은 다양한 생리 활성이 보고되어 있다.
한편, 유산균 음료의 항산화 활성에 대한 보고는 적고, 물론, 유산균 음료에 포함되는 항산화 활성 물질에 대해서는 동정되어 있지 않다. 금회, 본 발명자들은 유제품 유산균 음료에 대해서 DPPH 라디칼 소거법에 의해 항산화 활성을 평가하고, 유제품 유산균 음료에 포함되는 항산화 물질을 분리·정제하여, DDMP를 동정했다.
-DDMP-
본건 발명에 있어서는, 유산균 음료에 있어서의 항산화능을 DPPH 라디칼 소거법에 의해 평가함과 함께, 그의 항산화성 물질을 분리·정제하여, DDMP인 것을 발견했다. 여기에서 DDMP란, 메일라드 반응에 의해 생성되는 물질로서 알려져 있다(Tetrahedron Letters No.15, pp.1243-1246, 1970). 특히, 본 발명의 유산균 음료에 있어서는, DDMP에 대해서 150μM 이상을 함유하는 것이 바람직하다.
(실시예)
이하에 본 발명의 실시예를 기재한다.
[시험예 1] 본 발명의 유산균 음료 및 타사의 유산균 음료의 DPPH의 라디칼 소거 활성의 비교
본 발명의 제1 실시 태양으로서 이하와 같이 유산균 음료를 조제했다. 당해 유산균 음료에 대해서 시험했다.
-본 발명의 제1 실시 태양의 유산균 음료의 제법-
탈지분유를 8중량％, 포도당 과당액당을 5중량％ 포함하는 유 배지를 조제하여 100℃, 약 120분 가열 살균 후, 락토바실루스·파라카제이의 스타터액(배양액)을 상기 가열 후의 유 배지에 접종하여, 37℃에서 소정의 유산 산도가 될 때까지 배양하여, 발효액을 얻었다.
한편, 설탕, 포도당 과당액당을 포함하는 시럽액 베이스를 조제하여, 가열 살균 및 냉각을 행하여 시럽액을 얻었다.
그 후, 상기 시럽액 500ml를, 소량의 향료와 함께 상기 발효액 500ml와 혼합·균질화 처리함으로써, 유산균 생균을 3×108/ml 이상 함유하는 유산균 음료 1000ml를 얻었다.
-DPPH 라디칼 소거 활성 평가법-
DPPH 라디칼 소거 활성 평가법에 대해서는 이하와 같이 행했다. 우선, 시약으로서는 이하를 사용했다.
(1) 200mM MES(2-morpholinoethanesulphonic acid) 완충액(pH6.0)
(2) 400μM DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 에탄올 용액
DPPH(도쿄카세이고교사 제조, D4313) 15.76㎎에 에탄올(100mL)을 첨가 후, 회전자를 넣고, 스터러로 교반하여 차광하에서 30분∼1시간에 걸쳐 용해했다. DPPH 용액은 안정성이 낮은 점에서 용시(用時) 조제했다.
(3) 2.0mM Trolox stock solution과 검량선용 Trolox 용액
Trolox(Wako사 제조, 209-18881) 12.51㎎을 50％ 에탄올 수용액으로 용해하여, 25mL에 정용(定容)했다. Trolox stock solution은 200μL씩 분주(分注)하고, －40℃에서 보관했다. 2.0mM Trolox stock solution(200μL)에 50％ 에탄올 수용액(3.9mL)을 첨가하여, 100μM Trolox 용액을 사용 직전에 조제했다. 100μM Trolox 용액을 50％ 에탄올 수용액으로 희석하여, 80, 60, 40, 20mM Trolox 용액을 조제했다.
샘플은 50％ 에탄올 수용액에 용해했다. 200mM MES 완충액을 50μL 분주한 96웰 플레이트에 각종 농도의 샘플을 100μL 분주한 후, 400μM DPPH 용액을 50μL 첨가하여, 반응을 개시시켰다. 실온, 차광하에서 20분간 반응 후, 분광 광도계 또는 마이크로 플레이트 리더로 520㎚ 또는 495㎚의 흡광도를 측정했다. 상기 농도의 Trolox 용액도 마찬가지로 DPPH 용액을 더하여 반응을 행했다. DPPH 라디칼 소거 활성은 Trolox로 작성한 회귀 직선의 기울기를 이용하여, 분석 시료의 첨가량에 상당하는 Trolox량으로서 이하의 계산식에 따라서 구했다.
DPPH 라디칼 소거 활성(nmol-Trolox 상당양/㏖ or ㎎)＝분석 시료의 기울기(A520 또는 A495/(μL or ㎍/assay))/Trolox의 기울기(A520 또는 A495/(nmol/assay))
-시험법-
본 발명의 유산균 음료에 대해서 DPPH 라디칼 소거법에 의해 샘플의 항산화 활성을 평가했다. 측정계에 샘플액을 40％ 첨가했을 때의 520㎚의 흡광도와 샘플 무첨가의 520㎚의 흡광도와의 비로부터 상대적 DPPH 라디칼 소거율을 산출하여, 항산화 활성을 평가했다. 각 샘플은 40,000×g, 10min, 4℃의 조건으로 원심 분리를 행하고, 유산균 균체를 제거한 상청을 측정에 이용했다. 결과를 도 1에 나타낸다.
-결과-
본 발명의 제1 실시 태양의 방법으로 조제한 유산균 음료에 대해서 DPPH 라디칼 소거 활성을 갖는 것을 확인했다.
-다른 시장의 유산균 음료에 대한 DPPH 라디칼 소거 활성 평가-
본 발명의 제1 실시 태양의 유산균 음료와 비교하기 위해 다른 시판의 각 사의 유산균 음료나 발효유(A사, B사-1, B사-2, B사-3, C사, D사)를 시장에서 구입했다.
당해 각 사의 유산균 음료, 발효유에 대해서 전술의 DPPH 라디칼 소거 활성 평가법을 실시했다. 측정의 결과를 도 1에 나타낸다.
다른 시판의 각 사의 유제품 유산균 음료, 발효유에 대해서도 DPPH 라디칼 소거 활성을 갖는 것을 확인했다. 한편, 본 발명의 제1 실시 태양의 제법에 의해 얻어진 유산균 음료는 DPPH법에 의한 항산화 활성 평가법에 있어서 다른 시판의 각 사의 유제품 유산균 음료, 발효유에 비하여 높은 항산화 활성을 나타냈다.
-Trolox 상당양의 산출-
본 발명의 제1 실시 태양의 제조 방법에 의해 얻어진 유산균 음료의 DPPH 라디칼 소거 활성은 Trolox로 작성한 회귀 직선의 기울기를 이용하여, 분석 시료의 첨가량에 상당하는 Trolox량으로서 이하의 계산식에 따라서 구했다.
DPPH 라디칼 소거 활성(nmol-Trolox 상당양/㏖ or ㎎)＝분석 시료의 기울기(A520 또는 A495/(μL or ㎍/assay))/Trolox의 기울기(A520 또는 A495/(nmol/assay))로 했다. 당해 결과를 도 2에 나타낸다.
제1 실시 태양의 유산균 음료의 상청 첨가량과 520㎚의 흡광도로 평가한 DPPH 라디칼 소거량과의 관계로부터 얻어진 직선의 기울기로부터 Trolox 상당양으로서 항산화력을 산출했다. 그 결과, 제1 실시 태양의 유산균 음료의 상청의 항산화력은 2.46(nmol-Trolox 상당양/㎎)으로 계산되었다.
[시험예 2] 유산균 음료로부터의 항산화성 물질의 분리·동정
본 발명의 제조 방법에 의해 제조한 유산균 음료에 대해서 항산화성 물질의 분리·동정을 시도했다.
-항산화성 성분의 검색-
본 발명의 제1 실시 태양의 유산균 음료의 제법에 의해 조제한 발효액을 이용하여 이하의 실험을 행했다. 당해 발효액을 원심 분리에 의해 유산균을 제거한 상청을 흡착 수지 XAD4에 통액하여, 증류수, 25％, 50％, 100％ 에탄올로 순차 용출하여, 각 플랙션을 회수했다. 회수한 각 플랙션은 로터리 이배포레이터 혹은 동결 건조에 의해 용매를 제거하여 건고시켰다. 각 샘플을 소정의 농도가 되도록 증류수로 용해하여, DPPH 라디칼 소거 활성을 평가했다. 분획 스킴과 각 플랙션의 항산화 활성을 도 3 및 도 4에 나타낸다.
25％ 에탄올 용출 플랙션은 56.68(nmol-Trolox 상당양/㎎)로 비교적 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내고, 50％ 에탄올 용출 플랙션과 비교하여 회수량이 컸다. 이 때문에, XAD4-25％ 에탄올 용출 플랙션(XAD4-25％ EtOH Fr.)을 추가로 HPLC로 분리·정제를 행했다. Shodex Asahipak GS320HQ 칼럼을 이용하여 실험 방법에 기재한 분리 조건으로 XAD4-25％ EtOH Fr.의 분리를 행했다.
-칼럼·분리 조건-
칼럼: Shodex Asahipak GS320 HQ
이동상: 150mM Sodium phosphate buffer(pH2.5)
유속: 0.6mL/min
검출 파장: 260㎚
칼럼 온도: 35℃
주입량: 50μL
샘플 인젝션 후, 5분 간격으로 60분 후까지 용리액을 회수하여(계 12플랙션), DPPH 라디칼 소거 활성을 평가했다. 크로마토 차트와 각 플랙션의 DPPH 소거 활성을 도 5에 나타낸다.
도 5에 있어서 DPPH 소거 활성은 컨트롤과 샘플의 492㎚의 흡광도의 차이로부터 산출했다. 리텐션 타임 30 내지 35분에 회수한 플랙션 7(GS Fr.7)에 비교적 높은 DPPH 소거 활성이 확인되었다. 이 때문에, GS Fr.7에 대해서 ODS 칼럼을 이용하여 추가로 정제를 행했다.
칼럼의 분리 조건은 이하와 같다.
-칼럼·분리 조건-
칼럼: Inertsil ODS-2 5μm(4.6×150㎜)
이동상: 아세토니트릴/0.1％ 포름산
그래디언트 조건: 아세토니트릴 농도 0min 0％→10min 10％→20min 95％→22min 95％
유속: 1.0mL/min,
검출 파장: 295㎚
칼럼 온도: 40℃
주입량: 50μL
도 6에 나타내는 크로마토 차트의 8min 부근의 피크에 DPPH 소거 활성이 확인되었다.
다음으로, 당해 피크에 대해서 흡수 스펙트럼을 측정한 결과, 도 7에 나타내는 바와 같이 295㎚에 흡수 극대를 나타냈다.
또한, 이 피크에 대해서 LC/MS에 의한 분석을 실시한 결과, 포지티브 이온 모드에서 m/z145를 나타냈다(도 8).
추가로 이 피크를 GC/MS에서 분석을 행하여, 얻어진 타겟 피크의 질량 스펙트럼 패턴으로부터 라이브러리 서치를 행한 결과, DDMP(CAS No.28564-83-2)로 동정되었다(도 9). 이와 같이 본 발명의 유산균 음료에 항산화 물질로서 DDMP를 포함하고 있는 것을 발견했다.
[시험예 3] 다른 제품 중에 포함되는 DDMP의 양
본 발명의 제조 방법에 있어서 분리·정제한 DPPH 라디칼 소거 활성을 갖는 물질로서 DDMP가 동정되었다. 다음으로, 다른 A사의 시장에서 구입 가능한 3종류의 제품(A사-1, A사-2, A사-3)에 대해서, DDMP의 표품을 이용하여 본 발명, A사-1의 DDMP 농도를 측정했다. 각각의 샘플의 ODS 칼럼을 이용하여 분리한 크로마토 차트(A사에 대해서는 A사-1만)를 도 10에 나타낸다. DDMP 검량선으로부터 계산한 각 샘플의 DDMP 농도를 표 1에 나타낸다. 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 유산균 음료는 타사의 유산균 음료(A사)에 대하여 2배 정도의 높은 DDMP 농도를 나타냈다.
-본 발명의 유산균 음료의 DPPH 라디칼 소거 활성에 있어서의 DDMP의 기여도에 대해서-
본 발명의 제1 실시 태양의 제조 방법에 의한 유산균 음료에 대해서 DDMP 표품을 이용하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 0.397(㏖-Trolox/㏖)의 항산화력을 나타냈다. 이 항산화력은 아스코르빈산 1.141(㏖-Trolox/㏖)에 대하여 약 35％로 계산되었다(도 11).
다음으로, 제1 실시 태양의 유산균 음료, A사의 유산균 음료에 포함되는 DDMP량으로부터 각각의 DPPH 소거 활성에 있어서의 DDMP의 기여도를 산출했다. 도 11에 나타내는 바와 같이 제1 실시 태양의 유산균 음료, A사의 유산균 음료에 대해서 DDMP량에 대한 DPPH 라디칼 소거를 나타내는 492㎚의 흡광도를 플롯했을 때에 얻어진 직선의 기울기를 DDMP 표품의 기울기와의 비로부터 기여도를 산출했다(도 12).
제품의 항산화 활성이 DDMP만으로 설명된다고 가정하면, 이 직선의 기울기는 1로 된다. 제1 실시 태양의 유산균 음료, A사의 유산균 음료의 DDMP 표품에 대한 기울기의 비는 각각, 1.533, 1.161로 되었다. 이 결과로부터, 본 발명의 제1 실시 태양의 유산균, A사의 유산균 음료의 항산화 활성에 있어서의 DDMP의 기여도는 약 65％(1/1.533), 약 86％(1/1.161)로 추정되었다.
[시험예 4] 유산균 음료의 제조 공정에 있어서의 가열하는 시간을 바꾼 경우의 효과
제1 실시 태양의 유산균 음료는 탈지분유와 포도당 과당액당으로 이루어지는 재료유(유 배지)를 유산균 발효시킴으로써 얻어진다. 또한, 재료유의 제조 공정에 있어서는 살균을 위해 가열 처리를 행한다.
여기에서 재료유의 가열 살균 시간을 10분으로 한 경우 및 120분으로 한 경우(본 발명의 제1 실시 태양의 경우에 상당)의 각각에 대해서 얻어진 재료유의 DDMP량의 변화를 조사했다. DDMP 피크의 면적비로부터 가열 살균 10분 후에 대하여, 가열 살균 120분 후의 유산균 음료의 DDMP량은 41.5배로 되었다(도 13(A)). 또한, 120분인 경우의 재료유에 유산균의 스타터액(배양액)을 접종하고, 유산균에 의해 발효시키는 공정에서는 DDMP량은 약간 감소했다(도 13(B)). 이들 실험 결과로부터, DDMP는 재료유의 가열 시간이 영향을 주는 것을 알았다. 또한, 도 13의 (A)와 (B)는 다른 실험이기 때문에 (A)의 가열 살균 120분과 (B)의 가열 살균 120분 발효 전의 피크 면적이 상이하다.
[시험예 5] 사용하는 당 원료를 바꾼 경우
본 발명의 유산균 음료의 제조에 사용하는 당 원료로서, 포도당 과당액당, 과당 또는 포도당의 어느 1종의 당과, 탈지분유로부터 시험적으로 조제한 유산균 음료용의 재료유에 대해서 DDMP의 생성에 대한 시험을 행했다. 각 당의 고형분을 동일하게 한 표 2에 나타내는 배합의 재료유를 탕욕 중에서 3시간 가열 살균했을 때의 DDMP 농도를 측정했다.
또한, 재료유로부터 맑고 깨끗한 상청을 회수하기 위해, 샘플 500μl에 60％ 트리클로로아세트산(TCA)을 100μl 첨가한 후, 원심 분리 처리를 행했다. 회수한 상청 중의 DDMP 농도를 HPLC에 의해 측정했다. 도 14에 나타내는 바와 같이 3시간 가열 살균 후의 재료유 중의 DDMP 농도는 포도당(1909μM), 포도당 과당액당(1585μM), 과당(734μM)의 순서로 높은 값이 되었다.
이와 같이 본 발명에 있어서는, 재료유의 당류로서는, 포도당을 이용하는 것이 바람직한 것을 알 수 있었다.
[시험예 6] 재료유에 리신을 첨가한 경우의 효과
재료유에의 리신 첨가의 효과에 대해서 검증을 행했다. 시험예 5에 있어서의 포도당(시험구 3), 포도당 과당액당(시험구 1)에 나타내는 시험적인 재료유에 리신을 첨가하고, 가열 시간을 변화시켜 조사했다(도 15).
결과적으로, 포도당을 당원으로 한 경우에 리신을 첨가한 경우(시험구 4) 또는 포도당 과당액당을 당원으로 한 경우에 리신을 첨가한 경우(시험구 5)의 어느 것에 있어서도 리신 농도 의존적으로 DDMP가 증가했다(도 15).
재료유에 리신을 첨가하면, DDMP를 증가시킬 수 있는 것을 알 수 있었다.
[시험예 7] 재료유에 프로테아제를 첨가한 경우의 효과
다음으로 재료유의 가열 살균 전에 프로테아제를 첨가하는 효과에 대해서 검토를 행했다. 시험예 5에 있어서의 시험구 1의 재료유에 대하여 도 16에 나타낸 각종 프로테아제(서모아제, 펩티다아제 R, 프로틴 SD, 프로테악스, 프로테아제 P, 프로테아제 M)를 최종 농도 0.1％가 되도록 재료유에 첨가하고, 서모아제에 대해서는 70℃에서, 그 외의 효소는 50℃에서 1시간 처리한 후에 비등수욕 중에서 3시간 가열 살균을 행했다. 재료유의 가열 살균 후의 DDMP 농도를 측정한 결과, 프로테아제 처리에 의해 가열 살균 후의 DDMP는 컨트롤에 대하여 높은 농도가 되고, 특히 펩티다아제 R 처리에 의해 높은 DDMP 농도로 되었다(도 16).
Claims (7)
- 항산화 작용을 갖는 성분을 함유하는 유산균 음료.
- 제1항에 있어서,
상기 성분이 DDMP(2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one)인 유산균 음료. - DDMP를 유효 성분으로 하는 항산화용 유산균 음료.
- 제2항 또는 제3항에 있어서,
DDMP를 150μM 이상 함유하는 유산균 음료. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유산균 음료가, 원료로서 탈지유 및 당류를 포함하는 재료유를 열로 살균하는 공정을 포함하는 제조 공정에 의해 제조되는 유산균 음료. - 제5항에 있어서,
상기 당류가 포도당을 함유하는 유산균 음료. - 항산화 작용을 갖는 취지를 표시한 유산균 음료.
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