CN117098457A - 具有抗氧化作用的乳酸菌饮料 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于对乳酸菌饮料的抗氧化性进行研究。另外，课题在于发现其有效成分。关于乳酸菌饮料，发现了具有抗氧化性的特点。另外，发现了作为其有效成分的抗氧化性物质为DDMP(2，3‑二氢‑3，5‑二羟基‑6‑甲基‑4H‑吡喃‑4‑酮)。本发明涉及含有具有抗氧化作用的成分的乳酸菌饮料。另外，具有抗氧化作用的成分是DDMP。

Description

具有抗氧化作用的乳酸菌饮料
技术领域
本发明涉及乳酸菌饮料。尤其涉及具有抗氧化作用的乳酸菌饮料。
背景技术
乳酸菌饮料已被广泛应用，多年来受到广泛年龄段人群的支持。例如，已知Pilkul(日文：ピルクル)(注册商标：Nissin York株式会社)、Yakult(日文：ヤクルト)(注册商标：Yakult株式会社总社)等。关于该乳酸菌饮料，具有改善肠道环境的功能的点广为人知。另外，发挥改善压力、降低血糖、消除疲劳等优异的效果的类型也是己知的。
另一方面，对于该乳酸菌饮料，期待除了上述效果之外，还发挥其他有用的功能性、效果。例如，关于抗氧化性，迄今为止，不能从现有专利文献中获知乳酸菌饮料具有抗氧化性、或该抗氧化性物质。
作为与乳酸菌饮料的抗氧化性有关的专利文献，专利文献1中有与乳酸菌饮料有关的抗氧化剂的记载。然而，该专利文献的主要目的是使乳制品乳酸菌饮料中含有二十二碳六烯酸(DHA)，仅记载了作为其附带成分而添加抗氧化剂。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开1995-327593号
发明内容
发明所要解决的课题
因此，本发明人等将对乳酸菌饮料的抗氧化性进行研究作为课题。另外，将发现其有效成分作为课题。
用于解决课题的手段
本发明人等进行了深入研究，结果，对于乳酸菌饮料，确认了具有抗氧化作用的功能，从而完成了本发明。
即，本申请第一发明是：
“一种乳酸菌饮料，其含有具有抗氧化作用的成分。”。
进而，发现上述具有抗氧化作用的成分包含DDMP(2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮，2，3-dihydro-3，5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one)。
即，本申请第二发明是：
“根据技术方案1所述的乳酸菌饮料，其中，上述成分为DDMP(2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮)。”。
进而，本申请人还请求保护一种将DDMP作为有效成分的抗氧化用乳酸菌饮料。即，本申请第三发明是：
“一种抗氧化用乳酸菌饮料，其将DDMP作为有效成分。”。
进而，关于上述DDMP，优选在该乳酸菌饮料中含有150μM(μmol/L)以上。
即，本申请第四发明是：
“根据技术方案2或3所述的乳酸菌饮料，其含有150μM以上的DDMP。”。
进而，上述乳酸菌饮料优选包括下述工序：利用脱脂乳和糖类作为原料，利用热对包含该原料的配制乳(日文：仕込乳)进行灭菌。
即，本申请第五发明是：
“根据技术方案1～4中任一项所述的乳酸菌饮料，其中，上述乳酸菌饮料是通过下述制造工序制造的，所述制造工序包括利用热对包含脱脂乳和糖类作为原料的配制乳进行灭菌的工序。”。
进而，上述本申请第四发明中，优选糖类含有葡萄糖。
即，本申请第六发明是：
“根据技术方案5所述的乳酸菌饮料，其中，上述糖类含有葡萄糖。”。
接着，本申请人还请求保护一种乳酸菌饮料，其中，在商品包装等上记载了具有抗氧化作用的内容。
即，本申请第七发明是：
“一种乳酸菌饮料，其显示出具有抗氧化作用的用途。”。
发明效果
本发明的乳酸菌饮料含有DDMP作为抗氧化成分，具有抗氧化作用。由此，能发挥各种有用的效果。
附图说明
图1为在试验例1中对本发明的第一实施方式的乳酸菌饮料和其他的在市场上销售的乳酸菌饮料的DPPH自由基清除活性进行比较的图。
图2为用回归直线的斜率对本发明的第一实施方式的乳酸菌饮料和Trolox(奎诺二甲基丙烯酸酯)的DPPH自由基清除活性(抗氧化能力)进行比较的图。
图3为表示试验例2中的发酵液的分级分离方法的流程图。
图4为表示经图3中的分级分离后的各级分(fraction)的抗氧化活性的图。
图5为对图3中的XAD4-25％乙醇洗脱级分进行色谱柱分离而得到的色谱图和表示各级分的DPPH清除活性的图。
图6为使用OD S柱进一步对图5中的级分7进行纯化而得到的色谱图。
图7为表示图6中的峰部分的吸收光谱的图。
图8为对图6中的峰部分实施基于LC/MS的分析而得到的结果的图。
图9为表示图6中的峰部分的基于GC/MS的鉴定的结果的图。
图10为试验例3中的测定本申请的第一实施方式和其他的市场上的乳酸菌饮料中包含的DDMP的LC图。
图11为利用回归直线的斜率对本发明的第一实施方式的乳酸菌饮料的抗氧化能力与抗坏血酸的抗氧化能力进行比较的图。
图12为与图11的情况同样地利用回归直线的斜率对另一A公司的乳酸菌饮料的抗氧化能力进行比较的图。
图13为表示试验例4中的由于加热时间等的不同而导致的配制乳的DDMP量的变化的LC图。
图14为试验例5中的对改变糖原料时生成的DDMP量进行比较的图。
图15为表示试验例6中的由于添加赖氨酸而带来的效果的图。
图16为表示试验例7中的各种蛋白酶的添加效果的图。
具体实施方式
对以下的本发明的内容进行说明。
-乳酸菌饮料-
本发明中所谓的乳酸菌饮料，是通过以下这样的工序制备的。即，首先，作为原料的混合工序，将成为原料的脱脂乳、水和/或牛奶混合，制备配制乳(乳培养基)，接下来，作为灭菌/冷却工序，在高温下对配制乳进行加热灭菌，冷却至发酵所需要的温度。
接下来，作为乳酸菌的接种工序，将另行预先制备的种子菌(日语：菌)(预先对乳酸菌进行培养而得到的产物(前培养))添加到加热后的配制乳中。接下来，作为发酵工序，在罐(tank)内保持一定温度而进行发酵。接下来，冷却后，作为混合/稀释工序，向培养后的发酵液中添加糖浆、果汁等，根据需要用稀释水进行调整。将其均质化，将所得产物填充至容器中，制成乳酸菌饮料。
需要说明的是，作为乳酸菌饮料的类别，有“乳制品乳酸菌饮料”和“乳酸菌饮料”。首先，关于“乳制品乳酸菌饮料”，是指包含3.0％以上的非脂乳固体成分(从牛奶中除去乳脂成分和水分后的成分)、乳酸菌数或酵母菌数为1000万/ml以上的饮料，有活菌型和灭菌型。
进而，关于“乳酸菌饮料”，是指非脂乳固体成分低于3.0％、且乳酸菌数或酵母菌数为100万/ml以上的饮料。
本发明中所谓的乳酸菌饮料，包括上述的“乳制品乳酸菌饮料”和“乳酸菌饮料”的任意者。
-本发明中的优选的乳酸菌饮料的制造方法-
一般的乳酸菌饮料的制造方法如上文所述，但特别地，本发明的乳酸菌饮料优选大体按照以下方式来制造。但本发明不限于以下的制造方法。
(1)配制乳溶解(乳培养基的制备)
使以脱脂乳为主要成分的乳原料成为5～30重量％左右，使糖类成为2～20重量％左右，以上述的量制备配制乳(乳培养基)。另外，优选乳原料为15～20重量％，糖类为10～15重量％。
需要说明的是，配制乳中的糖类优选包含葡萄糖。具体而言，优选利用葡萄糖、葡萄糖果糖液糖(日语：ぶどう糖果糖液糖)。另外，作为氨基酸，优选添加赖氨酸。
(2)加热
在80℃～100℃下对上述配制乳进行30分钟～180分钟左右加热。需要说明的是，关于加热时间，优选为60分钟～160分钟。另外，进一步优选为90分钟～140分钟。最优选为100分钟～120分钟。
(3)发酵液(前培养)
将对乳酸菌(乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、片球菌(Pediococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、链球菌(Streptococcus)、肠球菌(Enterococcus)等)进行培养而得到的培养液(发酵剂(starter)液)添加到上述的加热后的乳培养基中，在30℃～40℃左右的温度下进行培养，直至成为规定的乳酸酸度，从而能得到发酵液。
(4)糖浆液
制备包含砂糖、葡萄糖、果糖等的糖浆液基底，进行加热灭菌和冷却，得到糖浆液。
(5)混合/均质化
将上述发酵液和糖浆液以1：1或1：5～5∶1左右的重量比率混合，并进行均质化，制成乳酸菌饮料。
如上所述，本发明中，作为乳酸菌饮料的优选的制造方法，可采用下述制造方法：对含有脱脂奶粉和糖类的配制乳进行加热，然后将该加热后的配制乳与乳酸菌的培养液混合，进行规定时间的发酵，然后向该发酵后的发酵液中混合糖浆液，由此进行制备。
本工序中，优选如上文所述地设定含有脱脂奶粉和糖类的配制乳的加热时间。
-抗氧化性-
关于抗氧化性，据说在生物体中有各种功能，例如，认为能抑制导致疲劳(和老化)的过量的活性酶。
即，报道了以活性氧为代表的自由基是老化、癌、生活习惯病的原因。Harman提出的自由基老化学说中，作为能量代谢的副产物的主要由线粒体产生的自由基将DNA、蛋白质、脂质等氧化是老化的原因((1)D Harman，Free radical involvement inaging.Pathophysiology and therapeutic implications.，Drugs Aging 19933(1)60-80(2)Wulf Droge，Free radicals in the physiological control of cellfunction.Physiol Rev 200282(1)47-951)。人通过呼吸而将氧摄入体内，通过存在于线粒体中的电子传递系统而产生ATP，获得生命活动所需要的能量。在该过程中，产生各种活性氧类物质。活性氧具有非常高的反应性(中村成夫，活性氧和抗氧化物质的化学，日本医科大学医学会杂志20139164-169)。报道了活性氧通过与脂质反应而生成脂质过氧化物，成为动脉硬化、心肌梗塞等的原因(J L Witztum，D Steinberg，Role of oxidized lowdensity lipoprotein in atherogenesis.J Clin Invest.199188(6)1785-92)。
另外，活性氧与核酸反应时，由于因DNA链断裂、核酸碱基的氧化修饰而导致的DNA的突变，有可能引发癌症(Miral Dizdaroglu，Pawel Jaruga，Mechanisms of freeradical-induced damage to DNA.Free Radic Res 201246(4)382-419)。
生物体具有将在生物体中产生的活性氧除去的机制。通过超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(catalase)这样的过氧化氢去除酶等，将在生物体内产生的活性氧无害化。另一方面，自然界中存在很多具有抗氧化作用的低分子化合物，生物体通过生物合成它们、或从食物中摄取它们，来保护生物体免受因活性氧而导致的氧化损伤。作为代表性的天然的抗氧化物质，有抗坏血酸(维生素C)、α-生育酚(维生素E)、绿茶中含有的儿茶素、红酒中含有的白藜芦醇等多酚(中村成夫，活性氧和抗氧化物质的化学，日本医科大学医学会杂志20139164-169)。
关于慢性疲劳的原因，目前有很多不明之处，但有报道称，慢性疲劳者产生较多的自由基，氧化应激可能是原因(A C Logan，C Wong，Chronic fatigue syndrome：oxidativestress and dietary modifications.Altern Med Rev 20016(5)450-9)。据报道，在连续摄取配合有400mg具有抗氧化作用的咪唑二肽的饮料期间，减轻了在日常工作中感觉到疲劳的健康人的疲劳感(清水惠一郎，福田正博，山本晴章，连续摄取配合有咪唑二肽的饮料对在日常工作中感觉到疲劳的健康人的有用性，药理和治疗)vol.37no.3 2009 37(3)255-637)。如上所述，可期待含有抗氧化物质的食品的日常摄取具有减轻疲劳感的效果。
此处，酸奶(yoghurt)、乳酸菌饮料包含乳酸菌，报道了肠道调节作用(Iva Hojsak，Probiotics in Functional Gastrointestinal Disorders.Adv Exp Med Biol20191125121-137.)、免疫调节作用(Yueh-Ting Tsai，Po-Ching Cheng，Tzu-Ming Pan，Theimmunomodulatory effects of lactic acid bacteria for improving immunefunctions and benefits.Appl Microbiol Biotechnol 2012 96(4)853-62)、花粉症、特应性皮炎等过敏的预防(Wioletta Zukiewicz-Sobczak，Paula Wroblewska，PiotrAdamczuk，Wojciech Silny，Probiotic lacticacid bacteria and their potential inthe prevention and treatment of allergic diseases.Cent Eur JImmunol 2014 39(1)104-8)、溃疡性大肠炎的改善(Maria Jose Saez-Lara，Carolina Gomez-Llorente，Julio Plaza-Diaz，Angel Gil，The role ofprobiotic lactic acid bacteria andbifidobacteria in the prevention and treatment of inflammatorybowel diseaseand other related diseases：a systematic review of randomized human clinicaltrials.Biomed Res Int 20152015：505878)等各种生理活性。
另一方面，关于乳酸菌饮料的抗氧化活性的报道少，当然，乳酸菌饮料中包含的抗氧化活性物质也尚未被鉴定出。这次，本发明人等针对乳制品乳酸菌饮料，通过DPPH自由基清除法，对抗氧化活性进行评价，将乳制品乳酸菌饮料中包含的抗氧化物质分离、纯化，鉴定出DDMP。
-DDMP-
本发明中，通过DPPH自由基清除法对乳酸菌饮料中的抗氧化能力进行评价，并且，将其抗氧化性物质分离、纯化，发现其是DDMP。此处，所谓DDMP，作为通过美拉德反应生成的物质而为人所知(Tetrahedron Letters No.15，pp.1243-1246，1970.)。尤其是，本发明的乳酸菌饮料中，优选含有150μM以上的DDMP。
实施例
以下，记载本发明的实施例。
[试验例1]本发明的乳酸菌饮料和其他公司的乳酸菌饮料的DPPH的自由基清除活 性的比较
作为本发明的第一实施方式，按照以下方式制备乳酸菌饮料。对该乳酸菌饮料进行试验。
-本发明的第一实施方式的乳酸菌饮料的制造方法-
制备含有8重量％脱脂奶粉、5重量％葡萄糖果糖液糖的乳培养基，在100℃下进行约120分钟加热灭菌后，将副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的发酵剂液(培养液)接种于上述加热后的乳培养基，在37℃下进行培养，直至成为规定的乳酸酸度，得到发酵液。
另一方面，制备含有砂糖、葡萄糖果糖液糖的糖浆液基底，进行加热灭菌和冷却，得到糖浆液。
然后，将500ml上述糖浆液与少量的香料和500ml上述发酵液混合，进行均质化处理，由此，得到含有3×108/ml以上乳酸菌活菌的乳酸菌饮料1000ml。
-DPPH自由基清除活性评价方法-
关于DPPH自由基清除活性评价方法，按照以下方式进行。首先，作为试剂，使用以下试剂。
(1)200mM MES(2-吗啉乙磺酸，2-morpholinoethanesulphonic acid)缓冲液(pH6.0)。
(2)400μM DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)乙醇溶液。
向15.76mg DPPH(东京化成工业公司制，D4313)中添加乙醇(100mL)，然后放入转子，用搅拌器进行搅拌，在遮光下，经30分钟～1小时而进行溶解。由于DPPH溶液稳定性低，因此在使用时制备。
(3)2.0mM Trolox原液(Trolox stock solution)和标准曲线用Trolox溶液。
将12.51mg的Trolox(Wako公司制，209-18881)用50％乙醇水溶液溶解，定容至25mL。分次注入Trolox原液，每次200μL，在-40℃保存。向2.0mM Trolox原液(200μL)中添加50％乙醇水溶液(3.9mL)，在即将使用之前制备100μM Trolox溶液。将100μM Trolox溶液用50％乙醇水溶液稀释，制备80、60、40、20mM Trolox溶液。
将样品溶解于50％乙醇水溶液中。向分别注入有50μL的200mM MES缓冲液的96孔板中分别注入100μL各种浓度的样品，然后，添加50μL的400μM DPPH溶液，使反应开始。在室温、遮光下进行20分钟反应，然后用分光光度计或酶标仪(microplate reader)测定520nm或495nm的吸光度。对于上述浓度的Trolox溶液，也同样添加DPPH溶液而进行反应。对于DPPH自由基清除活性，使用用Trolox制成的回归直线的斜率，作为相当于分析试样的添加量的Trolox量，按照以下的计算式求出。
DPPH自由基清除活性(nmol-Trolox相当量/mol或mg)＝分析试样的斜率(A520或A495/(μL或μg/assay))/Trolox的斜率(A520或A495/(nmol/assay)
-试验方法-
对于本发明的乳酸菌饮料，通过DPPH自由基清除法，对样品的抗氧化活性进行评价。测定体系中，由添加了40％样品液时的520nm的吸光度与未添加样品的520nm的吸光度之比算出相对的DPPH自由基清除率，对抗氧化活性进行评价。对于各样品，在40,000×g、10min、4℃的条件下进行离心分离，将除去了乳酸菌菌体后的上清液用于测定。将结果示于图1。
-结果-
对于利用本发明的第一实施方式的方法制备的乳酸菌饮料，确认了具有DPPH自由基清除活性。
-其他的市场上的乳酸菌饮料的DPPH自由基清除活性评价-
为了与本发明的第一实施方式的乳酸菌饮料比较，从市场上购入了其他的在市场上销售的各公司的乳酸菌饮料、发酵乳(A公司、B公司-1、B公司-2、B公司-3、C公司、D公司)。
对于该各公司的乳酸菌饮料、发酵乳，实施上述的DPPH自由基清除活性评价方法。将测定结果示于图1。
对于其他的在市场上销售的各公司的乳制品乳酸菌饮料、发酵乳，也确认了具有DPPH自由基清除活性。另一方面，在通过DPPH法进行的抗氧化活性评价方法中，通过本发明的第一实施方式的制造方法得到的乳酸菌饮料与其他的在市场上销售的各公司的乳制品乳酸菌饮料、发酵乳相比，显示出更高的抗氧化活性。
-Trolox相当量的计算-
对于通过本发明的第一实施方式的制造方法得到的乳酸菌饮料的DPPH自由基清除活性，使用用Trolox制成的回归直线的斜率，作为相当于分析试样的添加量的Trolox量，按照以下的计算式求出。
DPPH自由基清除活性(nmol-Trolox相当量/mol或mg)＝分析试样的斜率(A520或A495/(μL或μg/assay))/Trolox的斜率(A520或A495/(nmol/assay)。将该结果示于图2。
根据由第一实施方式的乳酸菌饮料的上清液添加量与用520nm的吸光度评价的DPPH自由基清除量的关系得到的直线的斜率，作为Trolox相当量，算出抗氧化能力。结果，计算出第一实施方式的乳酸菌饮料的上清液的抗氧化能力为2.46(nmol-Trolox相当量/mg)。
[试验例2]从乳酸菌饮料中分离、鉴定抗氧化性物质
对于通过本发明的制造方法制造的乳酸菌饮料，尝试分离、鉴定抗氧化性物质。
-抗氧化性成分的检索-
利用通过本发明的第一实施方式的乳酸菌饮料的制造方法制备的发酵液，进行以下的实验。通过对该发酵液进行离心分离而除去乳酸菌，使所得上清液通过吸附树脂XAD4，依次用蒸馏水、25％、50％、100％乙醇洗脱，回收各级分。对于回收的各级分，通过旋转蒸发器或冷冻干燥将溶剂除去，干燥至干。用蒸馏水将各样品溶解，使得成为规定的浓度，对DPPH自由基清除活性进行评价。将分级分离方法和各级分的抗氧化活性示于图3和图4。
25％乙醇洗脱级分显示56.68(nmol-Trolox相当量/mg)这样的较高的DPPH自由基清除活性，与50％乙醇洗脱级分相比，回收量大。因此，进一步用HPLC对XAD4-25％乙醇洗脱级分(XAD4-25％EtOH Fr.)进行分离、纯化。使用Shodex Asahipak GS320HQ柱，在实验方法中记载的分离条件下，进行XAD4-25％EtOH Fr.的分离。
-柱、分离条件-
柱：Shodex Asahipak GS320 HQ；
移动相：150mM磷酸钠缓冲液(Sodium phosphate buffer)(pH2.5)；
流速：0.6mL/min；
检测波长：260nm；
柱温：35℃；
进样量：50μL。
进样后，以5分钟的间隔回收洗脱液直至60分钟后(合计12个级分)，对DPPH自由基清除活性进行评价。将色谱图和各级分的DPPH清除活性示于图5。
图5中，DPPH清除活性由对照与样品的492nm的吸光度的差值算出。对于在保留时间30～35分钟回收的级分7(GS Fr.7)，观察到较高的DPPH清除活性。因此，对于GS Fr.7，使用ODS柱进一步进行纯化。
柱的分离条件如下所述。
-柱、分离条件-
柱：Inertsil ODS-2 5μm(4.6×150mm)；
移动相：乙腈/0.1％甲酸；
梯度条件：乙腈浓度0min 0％→10min 10％→20min 95％→22min 95％；
流速：1.0mL/min；
检测波长：295nm；
柱温：40℃；
进样量：50μL。
对于图6所示的色谱图的8min附近的峰，观察到DPPH清除活性。
接下来，对于该峰，测定吸收光谱，结果，如图7所示，在295nm处表现出极大吸收。
另外，对于该峰，实施基于LC/MS的分析，结果，在正离子模式下，显示出m/z145(图8)。
进而，用GC/MS对该峰进行分析，根据得到的目标峰的质谱图谱进行谱库检索，结果，鉴定为DDMP(CAS No.28564-83-2)(图9)。如上所述，发现了本发明的乳酸菌饮料中含有作为抗氧化物质的DDMP。
[试验例3]其他产品中包含的DDMP的量
作为在本发明的制造方法中分离、纯化的具有DPPH自由基清除活性的物质，鉴定为DDMP。接下来，对于其他的A公司的能够从市场上购入的3种产品(A公司-1、A公司-2、A公司-3)，使用DDMP的标准品，测定本发明、A公司-1的DDMP浓度。将各样品的使用ODS柱分离的色谱图(关于A公司，只有A公司-1)示于图10。将由DDMP标准曲线计算的各样品的DDMP浓度示于表1。通过本发明的制造方法制造的乳酸菌饮料相对于其他公司的乳酸菌饮料(A公司)，显示出2倍左右的高DDMP浓度。
[表1]
-关于本发明的乳酸菌饮料的DPPH自由基清除活性中的DDMP的贡献度-
对于通过本发明的第一实施方式的制造方法得到的乳酸菌饮料，使用DDMP标准品测定DPPH自由基清除活性，结果，显示出0.397(mol-Trolox/mol)的抗氧化能力。计算出该抗氧化能力相对于抗坏血酸1.141(mol-Trolox/mol)约为35％(图11)。
接下来，由第一实施方式的乳酸菌饮料、A公司的乳酸菌饮料中包含的DDMP量，算出各自的DPPH清除活性中的DDMP的贡献度。如图11所示对于第一实施方式的乳酸菌饮料、A公司的乳酸菌饮料，由将对于DDMP量表示DPPH自由基清除的492nm的吸光度描点时得到的直线的斜率与DDMP标准品的斜率之比算出贡献度(图12)。
假设仅用DDMP来说明产品的抗氧化活性时，该直线的斜率成为1。第一实施方式的乳酸菌饮料、A公司的乳酸菌饮料相对于DDMP标准品的斜率之比分别成为1.533、1.161。由该结果推断，本发明的第一实施方式的乳酸菌、A公司的乳酸菌饮料的抗氧化活性中的DDMP的贡献度为约65％(1/1.533)、约86％(1/1.161)。
[试验例4]改变乳酸菌饮料的制造工序中的加热时间时的效果
第一实施方式的乳酸菌饮料通过使包含脱脂奶粉和葡萄糖果糖液糖的配制乳(乳培养基)进行乳酸菌发酵而得到。另外，在配制乳的制造工序中，为了灭菌，进行加热处理。
此处，对在将配制乳的加热灭菌时间设定为10分钟的情况和设定为120分钟的情况(相当于本发明的第一实施方式的情况)下分别得到的配制乳的DDMP量的变化进行调查。根据DDMP峰的面积比，相对于加热灭菌10分钟后，加热灭菌120分钟后的乳酸菌饮料的DDMP量成为41.5倍(图13(A))。另外，将乳酸菌的发酵剂液(培养液)接种于加热灭菌时间为120分钟的配制乳，在通过乳酸菌进行发酵的工序中，DDMP量稍微减少(图13(B))。由这些实验结果可知，DDMP受到配制乳的加热时间的影响。需要说明的是，图13的(A)和(B)是分别的实验，因此，(A)的加热灭菌120分钟与(B)的加热灭菌120分钟的发酵前的峰面积不同。
[试验例5]改变了使用的糖原料的情况
对于由作为本发明的乳酸菌饮料的制造中使用的糖原料的、葡萄糖果糖液糖、果糖或葡萄糖中的任一种糖、和脱脂奶粉试验制备的乳酸菌饮料用的配制乳，进行关于DDMP的生成的试验。将使各糖的固态成分量相同的表2所示的配合的配制乳在热水浴中进行3小时加热灭菌后，测定此时的DDMP浓度。
[表2]
葡萄糖果糖液糖的固态成分为75％，将果糖、葡萄糖与固形物量合并。
需要说明的是，为了从配制乳中回收澄清的上清液，向500μl样品中添加100μl的60％三氯乙酸(TCA)，然后进行离心分离处理。通过HPLC测定回收的上清液中的DDMP浓度。如图14所示，3小时加热灭菌后的配制乳中的DDMP浓度按照葡萄糖(1909μM)、葡萄糖果糖液糖(1585μM)、果糖(734μM)的顺序成为高的值。
如上所述可知，本发明中，作为配制乳的糖类，优选利用葡萄糖。
[试验例6]向配制乳中添加了赖氨酸时的效果
对向配制乳中添加了赖氨酸的效果进行了研究。向试验例5中的葡萄糖(试验区3)、葡萄糖果糖液糖(试验区1)所示的试验性配制乳中添加赖氨酸，改变加热时间而进行研究(图15)。
结果，在将葡萄糖作为糖源时添加赖氨酸的情况下(试验区4)或在将葡萄糖果糖液糖作为糖源时添加赖氨酸的情况下(试验区5)，DDMP均依赖于赖氨酸浓度地增加(图15)。
可知若在配制乳中添加赖氨酸，则能增加DDMP。
[试验例7]向配制乳中添加了蛋白酶时的效果
接下来，对在配制乳的加热灭菌前添加蛋白酶的效果进行了研究。对于试验例5中的试验区1的配制乳，将图16所示的各种蛋白酶(Thermoase(日文：サモァ一ゼ)、肽酶R(日文：ベプチダ一ゼR)、Protin SD(日文：プ口チンSD)、Proteax(日文：プ口テァックス)、蛋白酶P(日文：プ口テァ一ゼP)、蛋白酶M(日文：プ口テァ一ゼM))添加至配制乳中，使最终浓度成为0.1％，关于Thermoase，在70℃下进行1小时处理，对于其他酶，在50℃下进行1小时处理，然后在沸水浴中进行3小时加热灭菌。测定配制乳的加热灭菌后的DDMP浓度，结果，通过蛋白酶处理，加热灭菌后的DDMP成为比对照更高的浓度，尤其是，通过肽酶R处理，成为高的DDMP浓度(图16)。

Claims (7)

1.一种乳酸菌饮料，其含有具有抗氧化作用的成分。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌饮料，其中，所述成分为DDMP即2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮。
3.一种抗氧化用乳酸菌饮料，其将DDMP作为有效成分。
4.根据权利要求2或3所述的乳酸菌饮料，其含有150μM以上的DDMP。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的乳酸菌饮料，其中，所述乳酸菌饮料是通过下述制造工序制造的，
所述制造工序包括利用热对包含脱脂乳和糖类作为原料的配制乳进行灭菌的工序。
6.根据权利要求5所述的乳酸菌饮料，其中，所述糖类含有葡萄糖。
7.一种乳酸菌饮料，其显示出具有抗氧化作用的用途。
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