KR20230170114A - 희유 세포 및 무세포 분자를 위한 질량 태그 분석 - Google Patents

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KR20230170114A
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제인 베어드
로버트 그레이엄 쿡스
애덤 홀러바치
젱 오우양
마이클 푸지아
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제인 베어드
로버트 그레이엄 쿡스
애덤 홀러바치
젱 오우양
마이클 푸지아
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Abstract

본 발명은 일반적으로 희유 세포 및 무세포 분자를 위한 질량 태그 분석(mass tag analysis)에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 적어도 1개의 세공을 갖는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인과 작동적으로 연관된 마이크로웰(microwell), 및 전기장 발생기를 포함하는 장치를 제공한다. 장치는, 전기장 발생기에 의해 생성된 전기장이 마이크로웰 내 샘플과 작동적으로 상호작용하고, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 내 적어도 1개의 세공을 통해 샘플의 액적을 배출시키도록 구성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 장치는 불균질 샘플로부터 표적 분석물을, 예컨대 생물학적 샘플로부터 희유 표적 분석물 (예를 들어, 희유 세포)을 검출 및 임의로 정량화하는데 사용된다.

Description

희유 세포 및 무세포 분자를 위한 질량 태그 분석{MASS TAG ANALYSIS FOR RARE CELLS AND CELL FREE MOLECULES}
<관련 출원>
본 출원은 2015년 9월 24일에 출원된 미국 가출원 제62/222,940호를 우선권 주장하며, 상기 가출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
<발명의 분야>
본 발명은 일반적으로 희유(rare) 세포 및 무세포 분자를 위한 질량 태그 분석(mass tag analysis)에 관한 것이다.
세포 분석은 의료 적용, 예컨대 많은 질환의 진단에서 중요하다. 세포 내 포함되거나 또는 세포 결합된 희유 분자의 검출 또한 바람직하다. 세포 분석의 의료 적용은, 전형적으로 분석 하에 작은 분율의 샘플만을 대표하는 특정 관심 세포의 단리를 필요로 한다. 예를 들어, 순환 종양 세포 ("CTC")는 전이성 암의 진단에서 특히 관심의 대상이다. 통상의 방법에서, CTC는 먼저 용해에 의해 적혈구 (RBC)를 제거함으로써 전혈로부터 단리된다. 10 mL 혈액 샘플에서, 수백개의 CTC가 약 800,000,000개의 백혈구 ("WBC")로부터 분리되어야 한다. 따라서, 높은 분리 효율 및 세포 회수율을 갖는 방법이 필요하다.
그러나, 기존의 기술은 샘플로부터 희유 분자를 검출하는데 비효율적이다. 예를 들어, 희유 분자의 검출은, 희유 분자의 실측 수를 훨씬 초과하는 분자 카피(copy)의 수를 필요로 하는 통상의 친화성 검정법에 의해 달성될 수 없다. 희유 분자의 검출은 통상의 핵산 검정법에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 표적 핵산에 대해, 분석 시간이 수 일 소요될 수 있는 하나 이상의 장기 정제 단계 및 증폭을 수행하여야 한다.
다공성 매트릭스를 사용하여 희유 세포를 분리하는 세포 여과는 세포를 크기에 의해 분류하는데 사용되는 유용한 방법이며, 대개의 경우, 이러한 여과 방법은 셀의 추출에 이어 분리를 가능케 한다. 그러나, 기존의 여과 방법은, 예를 들어 단일 직경보다는 시험관내 세포에서 소정 범위의 직경을 포함한 특정 인자에 의해 제한된다. 부가적으로, 세포 여과 기술은 단지 몇몇 희유 세포만을 산출한다. 희유 분자의 카피의 수는 단지 세포 당 수만의 카피 (단백질의 경우) 또는 세포 당 소수의 카피 (유전자 돌연변이의 경우)만으로 상당할 수 있다.
희유 세포는 통상의 주사 현미경에 의해 단일 세포 수준까지 분석될 수 있다. 그러나, 심지어 스캐닝 및 분석의 자동화로도, 현미경 방법은 각 샘플을 스캐닝하는데 24시간 이상이 소요될 수 있다. 부가적으로, 다중 이미지를 갖는 모든 희유 세포는 측정된 단백질 양의 중요성을 결정하기 위해 병리학자가 육안으로 조사하여야 한다.
질량 분광법 (MS)은 MS가 일상적 친화성 반응 시스템에 비해 경쟁적이지 못하게 하는 몇몇 문제를 갖는다. 언급된 문제점은 관심 마커를 샘플 간섭으로부터 분리 불가능함 (매트릭스 중첩 피크), 임상 샘플 내 바탕으로 인한 감도의 손실 (피코몰 (pM)이 나노몰 (nM)로 감소), 적은 nL 샘플 부피로 작업 불가능함 (1 마이크로리터 (μL) 미만의 샘플은 혈액과 같은 복잡한 샘플에서 간섭 피크로부터 비효율적으로 단리되고 이온화에 있어서 비효율적으로 포획되기 때문)이다. 또한, MS는 종종, 이온화되는 동일 질량의 다른 분자와의 경쟁으로 인해 특정 질량을 검출할 수 없다. 이들 문제는 전형적으로 문제점을 야기하고 잘못된 결과를 제공한다.
본 발명은 희유 표적 검출을 수행하는데 있어서 질량 스펙트럼 분석이 사용될 때, 희석이 검출 감도를 실질적으로 감소시키기 때문에 검출 액체의 희석을 피하는 것이 중요함을 인식하였다. 검출 액체 중의 세포 또는 포획 입자는 각각 고유 성질을 갖기 때문에 개별적으로 검출되어야 한다. 따라서, 본 발명은 멤브레인으로부터 정확한 소량의 검출 액체의 방출을 제공하고, 검출 액체의 희석을 피하면서 질량 분광계 내로 액체 액적의 전달을 제공하는 장치 및 방법을 제공한다.
본 발명의 측면은, 적어도 1개의 세공을 포함하는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 (비-흡습성 멤브레인), 멤브레인과 작동적으로 연관된 마이크로웰(microwell), 및 멤브레인과 작동적으로 연관된 전기장 발생기를 포함하는 장치로 달성된다. 불균질 샘플 (예를 들어, 혈액 샘플)은 적어도 장치의 마이크로웰, 멤브레인, 또는 둘 다에 도입된다. 복수의 친화성 작용제(affinity agent)가 샘플에 도입된다. 각각의 복수의 친화성 작용제는 제1 분자를 포함한다. 복수의 친화성 작용제는 샘플 내 표적 분석물에 특이적으로 결합한다. 비결합된 친화성 작용제는 제거된다 (예를 들어, 세척에 의해). 하나 이상의 추가의 분자가 샘플에 도입된다. 하나 이상의 추가의 분자는 제1 분자와 상호작용하여 질량 분광법 표지를 형성한다. 적어도 1개의 세공을 통해 액적을 방출하기 위해 전기장 발생기를 통해 샘플에 전압이 제공된다. 액적은 질량 분광법 표지 및 샘플의 일부를 포함한다. 액적은 예를 들어 이온화된 질량 분광법 표지의 질량 분광법 분석에 의해 질량 분광법 표지의 존재에 대해 분석된다. 질량 분광법 표지의 존재는 샘플 내 표적 분석물의 존재를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 부가적으로, 분석된 질량 분광법 표지의 양을 정량화함으로써 샘플 내 표적 분석물을 정량화하는 것을 수반할 수 있다.
일반적으로, 적어도 1개의 세공은 근위(proximal) 개구부, 원위(distal) 개구부, 및 벽을 포함한다. 세공의 많은 상이한 배향은 본 발명의 범주 내에 있다. 예를 들어, 적어도 1개의 세공의 벽은 근위 및 원위 개구부에 대해 90°이도록 배향될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 1개의 세공의 벽은 근위 개구부로부터 원위 개구부 쪽으로 테이퍼진다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 1개의 세공의 벽은 원위 개구부로부터 근위 개구부 쪽으로 테이퍼진다.
특정 실시양태에서, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 복수의 세공을 포함한다. 복수의 세공은 동일한 치수를 가질 수 있다. 대안적으로, 복수의 세공은 상이한 치수를 가질 수 있다. 이러한 실시양태에서, 장치는 복수의 세공 중 하나만으로부터 액적을 생성하는 전기장 발생기로부터 전기장을 발생하도록 구성된다.
장치는 질량 분광계를 추가로 포함할 수 있다. 질량 분광계는 예를 들어 문헌 [Gao et al. (Z. Anal. 15 Chem. 2006, 78, 5994-6002)], [Gao et al. (Anal. Chem., 80:7198-7205, 2008)], [Hou et al. (Anal. Chem., 83:1857-1861, 2011)], [Sokol et al. (Int. J. Mass Spectrom., 2011, 306, 187-195)], [Xu et al. (JALA, 2010, 15, 433-439)]; [Ouyang et al. (Anal. Chem., 2009, 81, 2421-2425)]; [Ouyang et al. (Ann. Rev. Anal. Chem., 2009, 2, 187-25 214)]; [Sanders et al. (Euro. J. Mass Spectrom., 2009, 16, 11-20)]; [Gao et al. (Anal. Chem., 2006, 78(17), 5994-6002)]; [Mulligan et al. (Chem. Com., 2006, 1709-1711)]; 및 [Fico et al. (Anal. Chem., 2007, 79, 8076-8082)]에 기재된 바와 같이, 벤치-탑(bench-top) 질량 분광계 또는 소형 질량 분광계일 수 있으며, 각각의 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시양태에서, 장치는 예를 들어 미국 특허 제9,184,036호에 기재된 바와 같이, 전기장 발생기가 마이크로웰 내 샘플에 전기장을 유도 부여하도록 구성되며, 상기 특허의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시양태에서, 제1 분자는 질량 분광법 표지 전구체이다. 이러한 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 분자는 질량 분광법 표지 전구체와 상호작용하여 질량 분광법 표지를 형성하는 변경 작용제(alteration agent)이다.
다른 실시양태에서, 제1 분자는 변경 작용제이다. 이러한 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 분자는 변경 작용제와 상호작용하여 질량 분광법 표지를 형성하는 질량 분광법 전구체 표지이다.
특정 실시양태에서, 제1 분자는 질량 분광법 표지 전구체이고, 하나 이상의 추가의 분자는 질량 분광법 표지 전구체와 상호작용하여 질량 분광법 표지를 형성하는 제1 및 제2 변경 작용제이다.
친화성 작용제는 미립자 또는 비-미립자일 수 있다. 표적 분석물은 희유 세포일 수 있고, 불균질 샘플은 불균질 생물학적 샘플일 수 있다.
본 발명의 일부 예시적 방법은, 적어도 1개의 세공을 포함하는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인으로부터 액체를 방출시키는 방법에 관한 것이다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 액체를 보유할 수 있는 마이크로웰과 연관될 수 있다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 적어도 1개의 표면과 적어도 1개의 세공의 교차부는 약 30°내지 약 150°의 각도이다. 방법은, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상의 액체를 전기장에 노출시켜, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 적어도 1개의 세공을 통해 하나 이상의 액체의 액적을 방출시키는 것을 수반할 수 있다.
다른 예시적 방법은, 희유 분자 및 비-희유 분자의 하나 이상의 상이한 군집을 함유하는 것으로 생각되는 샘플 내 표적 희유 분자의 하나 이상의 상이한 군집을 검출하는 것을 수반한다. 샘플 (전형적으로 액체 형태)은, 적어도 1개의 세공을 갖는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 및 마이크로웰을 수반하는 장치와 접촉할 수 있다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 적어도 1개의 표면과 적어도 1개의 세공의 교차부는 약 30° 내지 약 150°의 각도이다. 샘플은, 표적 희유 분자의 각각의 상이한 군집에 있어서, 표적 희유 분자의 군집 중 하나의 표적 희유 분자에 대해 특이적이고 그에 결합하는 결합 파트너를 포함하는 친화성 작용제로 인큐베이션될 수 있다. 친화성 작용제는 질량 분광법 표지 전구체 또는 제1 변경 작용제를 포함한다. 친화성 작용제는 비-미립자 또는 미립자일 수 있다. 제1 변경 작용제는 질량 분광법 표지 전구체로부터의 질량 분광법 표지의 형성을 용이하게 하거나, 또는 친화성 작용제로부터 질량 분광법 표지 전구체를 포함하는 실체를 방출시킨다. 제1 변경 작용제가 질량 분광법 표지 전구체로부터의 질량 분광법 표지의 형성을 용이하게 하지 않는 경우, 샘플을 질량 분광법 표지 전구체로부터의 질량 분광법 표지의 형성을 용이하게 하는 제2 변경 작용제로 처리한다. 질량 분광법 표지는 표적 희유 분자의 군집 중 하나에 상응한다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상의 샘플은 전기장에 노출되어, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 적어도 1개의 세공을 통해 샘플의 하나 이상의 액적을 방출시킨다. 액적에 대해 질량 분광법 분석을 수행하여, 각각의 상이한 질량 분광법 표지의 존재 및/또는 양을 결정한다. 각각의 상이한 질량 분광법 표지의 존재 및/또는 양은 각 마이크로웰에 대한 샘플 내 표적 희유 분자의 각각의 상이한 군집의 존재 및/또는 양과 상관관계를 가질 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은, 세공을 포함하는 멤브레인 (예를 들어, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인이지만 임의로 흡수성인 멤브레인)에 표적 분석물을 포함하는 것으로 생각되는 샘플을 도입하는 것을 수반하는 샘플 분석 방법을 제공한다. 하나 이상의 시약이 멤브레인 상의 샘플에 도입되어, 샘플 내 표적 분석물 (존재하는 경우)과 회합된 질량 분광법 표지를 생성한다. 전기장이 멤브레인에 인가되어 샘플의 하나 이상의 액적을 생성하며, 이는 멤브레인의 세공으로부터 배출되고 질량 분광계 내로 도입된다. 표적 분석물의 존재는 질량 분광법 표지의 존재를 검출함으로써 질량 분광계를 통해 검출된다. 이어서, 멤브레인의 세공과 회합된 샘플의 일부가 멤브레인으로부터 추출되고 (표적 분석물이 검출 단계로부터의 결과에 기반하여 존재하는 경우), 샘플의 추출된 부분이 분석된다. 본 발명의 방법은 분석된 질량 분광법 표지의 양을 정량화함으로써 샘플 내 표적 분석물을 정량화하는 것을 추가로 수반할 수 있다.
멤브레인 상의 샘플에 하나 이상의 시약을 도입하는 것은, 각각 제1 분자를 포함하는 복수의 친화성 작용제를 샘플에 도입하는 단계이며, 여기서 복수의 친화성 작용제는 샘플 내 표적 분석물에 특이적으로 결합하는 것인 단계; 비결합된 친화성 작용제를 제거하는 단계; 샘플에 하나 이상의 추가의 분자를 도입하는 단계이며, 여기서 하나 이상의 추가의 분자는 제1 분자와 상호작용하여 질량 분광법 표지를 형성하는 것인 단계를 수반할 수 있다.
특정 실시양태에서, 제1 분자는 질량 분광법 표지 전구체이다. 이러한 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 분자는 질량 분광법 표지 전구체와 상호작용하여 질량 분광법 표지를 형성하는 변경 작용제이다.
다른 실시양태에서, 제1 분자는 변경 작용제이다. 이러한 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 분자는 변경 작용제와 상호작용하여 질량 분광법 표지를 형성하는 질량 분광법 전구체 표지이다.
다른 실시양태에서, 제1 분자는 질량 분광법 표지 전구체이고, 하나 이상의 추가의 분자는 질량 분광법 표지 전구체와 상호작용하여 질량 분광법 표지를 형성하는 제1 및 제2 변경 작용제이다.
모든 이와 같은 실시양태에서, 친화성 작용제는 미립자 또는 비-미립자일 수 있다. 예시적 실시양태에서, 표적 분석물은 희유 세포이고, 샘플은 불균질 생물학적 샘플이다.
도 1a-1c는 상이한 세공 배향을 갖는 본 발명의 장치의 예를 도시하는 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 장치의 또 다른 예를 도시하는 개략도이다.
도 3은 액적이 질량 분광계의 흡입구에 진입하는 도 1에 나타낸 장치로부터 액체 액적을 방출시키기 위한 본 발명의 장치 및 방법의 예를 도시하는 개략도이다.
도 4는 1개 초과의 세공을 갖는 본 발명의 장치 및 방법의 예를 도시하는 개략도이다. 세공 중 하나로부터 방출된 액적은 질량 분광계의 흡입구에 진입한다.
도 5는 도 4의 장치의 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인을 도시하며, 여기서 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상의 영역이 추가의 분석을 위해 식별된다.
도 6은 마이크로웰 어레이의 예를 도시하는 개략도이다.
도 7은 전기장 발생기 및 어레이를 포함하는 장치의 예를 도시하는 개략도이다.
도 8a-8c는 본 발명의 장치로부터 직접 분무된 FC-2 펩티드를 나타내는 질량 스펙트럼의 세트이다. 질량 스펙트럼의 세트는 다양한 농도의 펩티드 FC-2로부터 발생된 m/z 412에 대한 MS/MS 스펙트럼이다.
도 9a-9c는 본 발명의 장치로부터 직접 분무된 FC-2 펩티드를 나타내는 질량 스펙트럼의 세트이다. 질량 스펙트럼의 세트는 다양한 농도의 펩티드 FC-2로부터 발생된 m/z 412에 대한 MS/MS 스펙트럼이다.
도 10은 MS 유입구 내로 안내되는 본 발명의 장치로부터의 분무 플룸(plume)의 사진이다.
도 11은 DESI-활성 분무를 발생 및 안내하는 분무 디바이스를 나타내는 개략도를 나타낸다.
도 12는 저온 플라즈마 (LTP) 프로브의 실시양태를 나타내는 개략도를 나타낸다.
도 13은 이온 빔을 발생시키기 위해 한 장의 종이로 공급되는 이온의 발생을 위한 액체의 개략도를 나타낸다.
본 발명은 일반적으로, 특히 단지 소수의 분자 (펨토몰 (fM) 규모 또는 그 미만)를 함유하는 소량 (마이크로리터 (μL) 규모 또는 그 미만)의 액체의 분석 영역에서 멤브레인으로부터 액체를 방출시키기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 발명은 희유 분자 및 비-희유 분자의 하나 이상의 상이한 군집을 함유하는 것으로 생각되는 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액 샘플) 내 희유 분자의 하나 이상의 상이한 군집을 검출하기 위한 방법, 장치 및 키트에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액) 내에서 자유롭게 순환하는 희유 분자의 하나 이상의 상이한 군집을 검출하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은 희유 세포 및 비-희유 세포의 하나 이상의 상이한 군집을 함유하는 것으로 생각되는 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액 샘플) 내 희유 세포와 회합된 희유 분자의 하나 이상의 상이한 군집을 검출하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다.
샘플 내 표적 희유 분자의 하나 이상의 상이한 군집을 검출하기 위한 본 발명의 방법은 표적 희유 분자의 하나 이상의 상이한 군집의 농도를 비-희유 분자의 것에 비해 증강시키는 것을 수반할 수 있다. 농축된 샘플이 형성되고, 이는, 표적 희유 분자의 각각의 상이한 군집에 대해, 표적 희유 분자의 군집 중 하나의 표적 희유 분자에 대해 특이적이고 그와 결합하는 결합 파트너를 포함하는 친화성 작용제로 인큐베이션된다. 친화성 작용제는 비-미립자 또는 미립자일 수 있다. 친화성 작용제는 MS 표지 전구체로부터의 MS 표지의 형성을 용이하게 하거나, 또는 친화성 작용제로부터 MS 표지 전구체를 포함하는 실체를 방출시키는 질량 분광법 (MS) 표지 전구체 또는 제1 변경 작용제를 포함한다. MS 표지는 표적 희유 분자의 군집 중 하나에 상응한다. 보유액 및 여액은 인큐베이션된 샘플을 다공성 매트릭스와 접촉시킴으로써 형성된다. 제1 변경 작용제가 MS 표지 전구체로부터의 MS 표지의 형성을 용이하게 하지 않는 경우, 보유액 및 여액 중 하나 또는 둘다를 친화성 작용제로부터 MS 표지 전구체로부터의 MS 표지의 형성을 용이하게 하는 제2 변경 작용제로 처리한다. 보유액 및 여액 중 하나 또는 둘다에 대해 MS 분석을 수행하여 각각의 상이한 MS 표지의 존재 및/또는 양을 결정한다. 각각의 상이한 MS 표지의 존재 및/또는 양은 샘플 내 표적 희유 분자의 각각의 상이한 군집의 존재 및/또는 양과 관련된다.
또 다른 예에서, 희유 세포 및 비-희유 세포를 함유하는 것으로 생각되는 혈액 샘플 내 희유 세포 대 비-희유 세포의 비를 증가시킨다. 처리된 혈액 샘플은 혈액 샘플, 혈소판 불활성화제, 피브린-형성-정지제 및 피브린을 희유 세포의 미리 결정된 수준의 유합을 야기하기에 충분한 양으로 조합하여 제공함으로써 제조된다. 이어서, 처리된 혈액 샘플은 유합된 희유 세포가 다공성 매트릭스 상에 우선적으로 잔류되도록 다공성 매트릭스와 접촉시킨다.
또 다른 예에서, 희유 세포 및 비-희유 세포를 포함하는 샘플 내 비-희유 세포로부터 무손상 핵산을 갖는 희유 세포를 분리하는 방법이 사용된다. 샘플은 수성 매질과 조합되고, 조합물은 희유 세포가 아닌 비-희유 세포로부터 핵산을 선택적으로 방출하기 위해 소정 온도에서 및 소정 기간 동안 방치한다. 샘플에 대해 여과를 수행하여 비-희유 세포로부터 희유 세포를 분리한다.
일반 논의
본원에 기재된 장치는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상에 잔류하는 소량의 액체로부터 이온화된 액적의 형성을 가능케 하고, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 (비-흡습성 멤브레인)의 적어도 1개의 세공을 통해 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인으로부터의 후속적인 액적의 방출을 추가로 가능케 한다.
본 발명의 장치의 예는 도 1에 도시되어 있다. 장치(10)는 적어도 1개의 세공(18)이 있는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인(16) 및 마이크로웰(14)을 갖는 원형 벽(12)을 포함한다. 세공(18) 및 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인(16)은 90°의 각도로 지점(20)에서 교차된다. 세공은 장치(10)로부터 액적 (예를 들어, 액체 액적)의 발생 및 방출을 용이하게 하도록 작용한다.
본 발명의 장치의 또 다른 예는 도 2에 도시되어 있다. 장치(30)는 적어도 1개의 세공(38)이 있는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인(36) 및 마이크로웰(34)을 갖는 원형 벽(32)을 포함한다. 멤브레인(36)의 상부 표면(36a) 및 세공(38)의 내부 표면(38a)은 90°의 각도로 지점(40)에서 교차되고, 멤브레인(36)의 하부 표면(36b) 및 세공(38)의 내부 표면(38a)은 90°의 각도로 지점(42)에서 교차된다. 세공은 장치(30)로부터 액적 (예를 들어, 액체 액적)의 발생 및 방출을 용이하게 하도록 작용한다.
도 3은 도 1에 기재된 바와 같은 장치로부터 액적 (예를 들어, 액체 액적)을 방출하는 예를 도시한다. 액체(24)는 마이크로웰(14)에 함유되고, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인(16)의 세공(18)을 통과하기에 충분한 부피를 갖지 않는다. 전기장 발생기(20)는 와이어(20a)에 의해 활성화되어, 세공(18)을 통해 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인(16)으로부터의 액적(24a)의 방출을 초래하기에 충분한 강도를 갖는 전기장을 생성한다. 액적(24a)은 질량 분광계(28)의 유입구(26)에 수집된다.
질량 분광계(28)는 관련 기술분야에 공지된 임의의 유형의 질량 분광계, 예컨대 벤치-탑 질량 분광계 또는 소형 질량 분광계일 수 있다. 예시적 소형 질량 분광계는 예를 들어 문헌 [Gao et al. (Z. Anal. Chem. 2006, 78, 5994-6002)]에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 수천 와트의 전력으로 실험실-규모의 기구에 사용되는 펌핑 시스템과 비교하여, 소형 질량 분광계는 일반적으로 더 작은 펌핑 시스템, 예컨대 가오(Gao) 등에 기재된 시스템을 위한 단지 5 L/min (0.3 m3/hr) 다이아프램(diaphragm) 펌프 및 11 L/s 터보 펌프가 있는 18 W 펌핑 시스템을 갖는다. 다른 예시적 소형 질량 분광계는 예를 들어 문헌 [Gao et al. (Anal. Chem., 80:7198-7205, 2008)], [Hou et al. (Anal. Chem., 83: 1857-1861, 2011)] 및 [Sokol et al. (Int. J. Mass Spectrom., 2011, 306, 187-195)]에 기재되어 있으며, 각각의 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 소형 질량 분광계는 또한 예를 들어 문헌 [Xu et al. (JALA, 2010, 15, 433-439)]; [Ouyang et al. (Anal. Chem., 2009, 81, 2421-2425)]; [Ouyang et al. (Ann. Rev. Anal. Chem., 2009, 2, 187-214)]; [Sanders et al. (Euro. J. Mass Spectrom., 2009, 16, 11-20)]; [Gao et al. (Anal. Chem., 2006, 78(17), 5994-6002)]; [Mulligan et al. (Chem. Com., 2006, 1709-1711)]; 및 [Fico et al. (Anal. Chem., 2007, 79, 8076-8082)]에 기재되어 있으며, 각각의 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
도 4는 세공의 어레이를 포함하는 본 발명의 장치의 또 다른 예를 도시한다. 액체(64)는 장치(50)의 마이크로웰(54)에 함유되고, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인(56)의 세공(58a-58d)을 통과하기에 충분한 부피를 갖지 않는다. 마이크로웰(54)은 원형 벽(56)을 갖는다. 전기장 발생기(60)는 활성화되어, 개별 세공(58b)을 통해서만 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인(56)으로부터의 액적(64a)의 방출을 초래하기에 충분한 강도를 갖는 전기장을 생성한다. 액적(64a)은 질량 분광계(68)의 유입구(66)에 수집된다. 본 예에서, 전기장 발생기의 치수는 전기장을 정확하게 단일 세공에 또는 세공의 서브세트(subset)에 인가하도록 선택된다. 따라서, 전기장 발생기는 전기장 발생기가 그러한 인가를 가능케 하는 적어도 일부 (예컨대, 팁(tip), 와이어, 니들, 콘(cone), 직사각형 또는 구형)를 포함하도록 그에 준해서 설계된다. 본 예에서, 전기장 인가 지점에서의 전기장 발생기의 치수는 전기장의 선택적 인가가 요망되는 세공 또는 세공의 서브세트의 크기쯤 이어야 한다. 따라서, 전기장 인가 지점에서의 전기장 발생기의 치수는 세공 또는 세공의 서브세트의 크기의 약 200% 이하 및 약 50% 이상, 또는 약 150% 이하 및 약 25% 이상, 또는 약 100% 이하 및 약 50% 이상, 또는 약 50% 이하 및 약 25% 이상이어야 한다. 아울러, 질량 분광계의 유입구는 전기장 발생기와 동조되어야 한다. 일부 예에서, 질량 분광계의 유입구는 전기장 인가 지점에서의 전기장 발생기의 것과 상응하는 치수를 갖는다.
도 4 및 5에서, 액적(64a) 내 MS 표지는 MS 분석의 결과로서 식별되고, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인(56) 상의 상응하는 영역(59)은 추가의 분석을 위해 선택된다. 액체 또는 입자 (세포 포함)는 예를 들어 흡인, 펀칭, 절개 또는 추출, 또는 상기의 둘 이상의 조합에 의해 영역(59)으로부터 제거된다.
상기 기재된 장치에서, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 액체에 대해 본질적으로 또는 완전히 불투과성인 플랫(flat) 표면일 수 있다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 적어도 1개의 세공, 및 특정 실시양태에서 1개 초과의 세공 (예를 들어, 세공의 어레이)을 포함한다. 적어도 1개의 세공은 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 내에서 고정된 배향을 갖는다. 그와 같은 고정된 배향은 어떻게 세공의 벽이 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 표면과 교차되는지에 대해 기술할 수 있다. 예를 들어, 세공은 세공의 벽이 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 표면 (마이크로웰과 대면하는 상단 표면 (근위 표면) 및 질량 분광계와 대면하는 하단 표면 (원위 표면))과 90°로 교차되도록 수직 벽을 가질 수 있다. 이러한 세공의 배향은 도 1a에 나타나 있다.
다른 배향이 가능하고, 통상의 기술자라면 본 발명이 세공의 특정 배향으로 제한되지 않음을 인지할 것이다. 예를 들어, 세공의 벽은 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 표면과 두 표면의 교차부에서 약 30° 내지 약 150°의 각도로 교차될 수 있다. 이는 도 1b에 나타낸 바와 같이 세공이 근위 표면으로부터 원위 표면 쪽으로 테이퍼진 것을 가능케 한다 (즉, 세공이 더 좁아지도록 치수화됨). 대안적으로, 세공은 원위 표면으로부터 근위 표면으로 테이퍼질 수 있다 (도 1c) (즉, 세공이 더 폭넓어지도록 치수화됨). 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인이 1개 초과의 세공을 포함하는 일부 예에서, 교차부에서의 각도는 어느 한 세공으로부터 다른 세공까지 높은 정밀도 (1° 미만의 가변성)를 갖는다 (즉, 모든 세공이 동일한 치수를 가짐). 따라서, 본 예에서, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 표면과 세공의 각도는 또 다른 세공의 각도와 1°초과 만큼 상이하지 않다. 다른 실시양태에서, 세공의 일부 또는 전부는 서로 상이한 치수를 갖는다.
용어 "교차부"란 두 표면이 서로 접촉하는 지점 또는 일련의 지점을 의미한다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인이 1개 초과의 세공을 포함하는 일부 예에서, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 표면과 세공 중 하나의 각도는 또 다른 세공의 각도와 예를 들어 1° 초과, 또는 0.5° 초과, 또는 0.2° 초과, 또는 0.1° 초과, 또는 0.05° 초과, 또는 0.01° 초과, 또는 0.005° 초과, 또는 0.001° 초과 만큼 상이하지 않다.
일부 예에서, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상의 액체는 전기장에 노출되어, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인으로부터의 하나 이상의 액체 액적의 방출을 야기한다. 전기장은 또한 액적 내에서 분자의 이온화를 야기할 수 있다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 또한 전기장 발생기와 연관된다. 전기장 발생기의 활성화는 전기장을 생성하고, 이는 액체가 세공을 더 많이 관통하게 하고 액체 액적을 형성시키며, 상기 액체 액적은 적어도 1개의 세공을 통해 멤브레인으로부터 예를 들어 질량 분광계의 유입구 내로 방출된다.
상기 언급된 바와 같이, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 액체를 보유할 수 있는 마이크로웰과 연관된다. 어구 "과 연관된"이란, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 및 마이크로웰이 단일 유닛을 형성할 수 있음을 의미하며, 여기서 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 마이크로웰의 하단 또는 마이크로웰의 상단 상에 있을 수 있다.
액체는 MS 표지를 함유하는 샘플 또는 액체일 수 있다. 액체는 또한, 샘플에 도입되는 MS 표지일 수 있다. 일부 예에서, 액체는 용매, 예컨대 전기분무 질량 분광법에서 사용되는 분무 용매를 포함한다. 일부 예에서, 전기분무 이온화를 위한 용매는 예를 들어 극성 유기 화합물, 예컨대 알콜 (예를 들어, 메탄올, 에탄올 및 프로판올), 아세토니트릴, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 테트라히드로푸란, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드 및 니트로메탄; 비-극성 유기 화합물, 예컨대 헥산, 톨루엔, 시클로헥산; 및 물, 또는 그의 둘 이상의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 임의로, 용매는 예를 들어 개질제로서의 산 또는 염기, 예컨대 휘발성 염 및 완충제, 예를 들어 암모늄 아세테이트, 암모늄 바이카르보네이트, 휘발성 산, 예컨대 포름산, 아세트산 또는 트리플루오로아세트산, 헵타플루오로부티르산, 나트륨 도데실 술페이트, 에틸렌디아민 테트라아세트산, 및 비-휘발성 염 또는 완충제, 예컨대 나트륨 및 칼륨의 염화물 및 인산염 중 하나 이상을 함유할 수 있다.
멤브레인은 본질적으로 비-흡수성이며, 이는 멤브레인이 본질적으로 액체를 흡수할 수 없음 (비-흡습성)을 의미한다. 일부 예에서, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인에 의해 흡수되는 액체의 양은 약 2% (부피 기준) 미만, 또는 약 1% 미만, 또는 약 0.5% 미만, 또는 약 0.1% 미만, 또는 약 0.01% 미만, 또는 0%이다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 비-섬유질일 수 있으며, 이는 멤브레인에 섬유가 적어도 95% 없음, 또는 섬유가 적어도 99% 없음, 또는 적어도 99.5% 없음, 또는 섬유가 적어도 99.9% 없음, 또는 섬유가 100% 없음을 의미한다.
본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 액체 (멤브레인의 하나 이상의 세공을 관통하는 것 제외)에 불투과성인 비-가요성 고체 재료일 수 있다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 유기 또는 무기 재료 또는 수불용성 재료로 구성될 수 있다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 형상은 예를 들어 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인에 대한 보유물 또는 잔류물의 성질, 세공의 성질 및 형상, 세공과 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 각도, 마이크로웰의 성질, 전하 발생 성질, 및 질량 표지의 성질 중 하나 이상에 좌우된다. 일부 예에서, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 형상은 예를 들어 원형, 타원형, 직사각형, 정사각형, 육각형, 평면형 또는 플랫 표면 (예를 들어, 스트립, 디스크, 필름, 멤브레인 및 판)이다. 일부 예에서, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 경질 또는 비-가요성이며, 이는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인이 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 면으로부터 약 1° 이하, 또는 약 0.5° 이하, 또는 약 0.1° 이하로 구부려질 수 있음을 의미한다.
본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 폭넓게 다양한 재료로부터 제작될 수 있으며, 이는 천연 또는 합성, 중합체 또는 비-중합체일 수 있다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 제작을 위한 상기와 같은 재료의 예는, 제한이 아닌 예시로서, 예를 들어 그 자체로서 또는 서로 및/또는 다른 재료와 함께 사용되는 플라스틱, 예컨대 폴리카르보네이트, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 나일론, 폴리(비닐 부티레이트), 폴리(클로로트리플루오로에틸렌), 폴리(비닐 부티레이트), 폴리이미드, 폴리우레탄, 및 파라일렌; 실란; 규소; 질화규소; 흑연; 세라믹 재료 (예컨대, 알루미나, 지르코니아, PZT, 탄화규소, 질화알루미늄); 금속성 재료 (예컨대, 금, 탄탈럼, 텅스텐, 백금 및 알루미늄); 유리 (예컨대, 붕규산염, 소다 석회 유리, 및 파이렉스 (저-열팽창 붕규산염 유리, 코닝 인코포레이티드(Corning Incorporated))); 및 생흡수성 중합체 (예컨대, 폴리-락트산, 폴리카프로락톤 및 폴리글리콜산)를 포함한다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 제작을 위한 재료는 섬유질 재료, 예컨대 셀룰로스 (종이 포함), 니트로셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 레이온, 디아세테이트, 리그닌, 미네랄 섬유, 섬유질 단백질, 콜라겐, 합성 섬유 (예컨대, 나일론, 데이크론, 올레핀, 아크릴, 폴리에스테르 섬유), 또는 다른 섬유질 재료 (유리 섬유, 금속성 섬유)를 포함하지 않으며, 이들은 흡습성 및/또는 투과성이므로, 본원에 기재된 원리에 따르지 않는다.
각 마이크로웰에 있어서 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 적어도 1개의 세공을 포함한다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 제곱 센티미터 (cm2) 당 1개 초과의 세공, 예컨대 약 2,000,000개의 세공을 포함할 수 있다. 일부 예에서, cm2 당 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 세공의 수는 예를 들어 1 내지 약 2,000,000개, 또는 1 내지 약 1,000,000개, 또는 1 내지 약 500,000개, 또는 1 내지 약 200,000개, 또는 1 내지 약 100,000개, 또는 1 내지 약 50,000개, 또는 1 내지 약 25,000개, 또는 1 내지 약 10,000개, 또는 1 내지 약 5,000개, 또는 1 내지 약 1,000개, 또는 1 내지 약 500개, 또는 1 내지 약 200개, 또는 1 내지 약 100개, 또는 1 내지 약 50개, 또는 1 내지 약 20개, 또는 1 내지 약 10개, 또는 2 내지 약 500,000개, 또는 2 내지 약 200,000개, 또는 2 내지 약 100,000개, 또는 2 내지 약 50,000개, 또는 2 내지 약 25,000개, 또는 2 내지 약 10,000개, 또는 2 내지 약 5,000개, 또는 2 내지 약 1,000개, 또는 2 내지 약 500개, 또는 2 내지 약 200개, 또는 2 내지 약 100개, 또는 2 내지 약 50개, 또는 2 내지 약 20개, 또는 2 내지 약 10개, 또는 5 내지 약 200,000개, 또는 5 내지 약 100,000개, 또는 5 내지 약 50,000개, 또는 5 내지 약 25,000개, 또는 5 내지 약 10,000개, 또는 5 내지 약 5,000개, 또는 5 내지 약 1,000개, 또는 5 내지 약 500개, 또는 5 내지 약 200개, 또는 5 내지 약 100개, 또는 5 내지 약 50개, 또는 5 내지 약 20개, 또는 5 내지 약 10개이다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 내 세공의 밀도는 예를 들어 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 표면적의 약 1% 내지 약 20%, 또는 약 1% 내지 약 10%, 또는 약 1% 내지 약 5%, 또는 약 5% 내지 약 20%, 또는 약 5% 내지 약 10%이다. 일부 예에서, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 세공의 크기는 본원에 기재된 바와 같이 형성된 액체 액적의 통과를 허용하면서 액체를 우선적으로 잔류시키기에 충분한 정도이다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 세공의 크기는 예를 들어 액체의 성질, 세포의 크기, 포획 입자의 크기, 질량 표지의 크기, 분석물의 크기, 표지 입자의 크기, 비-희유 분자의 크기, 및 비-희유 세포의 크기에 좌우된다. 일부 예에서, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 세공의 평균 크기는 예를 들어 약 0.1 내지 약 20 마이크로미터, 또는 약 0.1 내지 약 5 마이크로미터, 또는 약 0.1 내지 약 1 마이크로미터, 또는 약 1 내지 약 20 마이크로미터, 또는 약 1 내지 약 5 마이크로미터, 또는 약 1 내지 약 2 마이크로미터, 또는 약 5 내지 약 20 마이크로미터, 또는 약 5 내지 약 10 마이크로미터이다.
상기 언급된 바와 같이, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 상단 및/또는 하단 표면과 세공의 내부 벽의 교차부는 예를 들어 약 30° 내지 약 150°, 또는 약 30° 내지 약 125°, 또는 약 30° 내지 약 110°, 또는 약 30° 내지 약 100°, 또는 약 30° 내지 약 95°, 또는 약 30° 내지 약 90°, 또는 약 45° 내지 약 150°, 또는 약 60° 내지 약 150°, 또는 약 75° 내지 약 150°, 또는 약 80° 내지 약 150°, 또는 약 85° 내지 약 150°, 또는 약 90° 내지 약 150°, 또는 약 45° 내지 약 125°, 또는 약 60° 내지 약 110°, 또는 약 70° 내지 약 100°, 또는 약 80° 내지 약 100°, 또는 약 85° 내지 약 95°, 또는 약 90°의 각도를 갖는다. 표면의 교차부는 예를 들어 세공과 같은 각각의 표면의 형상에 좌우되고, 선형, 원형, 타원형, 육각형, 정사각형 또는 직사각형, 또는 그의 조합일 수 있다.
멤브레인의 상기 특징은 멤브레인으로부터 액적으로서 방출되는 액체의 양의 높은 정밀 수준을 허용한다. 액적에서 액체의 양의 편차 (CV)는 예를 들어 약 1% (부피/부피) 이하, 또는 약 0.5% 이하, 또는 약 0.1% 이하일 수 있다. 아울러, 용매로부터의 질량 탈착이 발생하는 시간 (탈착 시간)은 덜 가변적 (즉, 약 500 밀리초(들) (msec) 이하, 또는 약 400 msec 이하, 또는 약 300 msec 이하, 또는 약 200 msec 이하, 또는 약 100 msec 이하, 또는 약 50 msec 이하, 또는 약 10 msec 이하 만큼 가변적)이어서, 이온의 트랩핑(trapping)을 단시간에 훨씬 더 용이하게 함으로써, 공지된 방법과 비교해서 더 작은 분무 부피를 가능케 한다. 탈착 시간은 경질의 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인에 있어서 더 감소된다. 또한, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인이 1개 초과의 세공을 포함하고, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 표면에서의 어느 한 세공에 대한 각도가 또 다른 세공에 대한 각도와 0.5°초과 만큼 상이하지 않는 경우, 50 msec 정도의 더 짧은 탈착 시간이 실현될 수 있다. 본원에 기재된 장치로 수득된 정밀도는 매우 정량적인 결과를 허용한다. 어구 "질량 탈착"이란 용매 분자로부터의 질량 표지 이온의 분리를 지칭한다.
예를 들어, 세공이 있는 멤브레인 및 마이크로웰은 예를 들어 마이크로전자기계 (MEMS) 기술, 금속 산화물 반도체 (CMOS) 기술, 마이크로시브(microsieve)의 생산을 위한 마이크로-제조 공정, 레이저 기술, 조사, 성형, 및 마이크로가공, 또는 그의 조합에 의해 제작될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 (비-흡습성 멤브레인)의 세공으로부터의 하전된 액적 및 분석물 이온을 함유하는 분석물 (또는 질량 태그)의 방출은 멤브레인 부근에서 전기장의 발생에 의해 달성된다. 전기장은 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인으로부터 0.05 mm 내지는 20 mm 거리에 위치한 전도성 부재 (이하, 전기장 발생기라 지칭됨)에 약 1 킬로볼트 (kV) 내지 약 10 킬로볼트 (kV), 또는 약 1 kV 내지 약 5 kV, 또는 약 2 kV 내지 약 10 kV, 또는 약 5 kV 내지 약 10 kV, 또는 약 6.0 내지 6.5 kV의 전기 전위를 제공함으로써 확립된다. 장치는 전형적으로, -300 V 내지는 +300 V의 전위로 유지될 수 있는 질량 분광계의 유입구 모세관으로부터 0.01 mm 내지 5 mm의 거리에 위치한다.
전기장의 성질 및 강도는 다음 중 하나 이상에 좌우된다: 액체의 성질, 세공 크기, 분무 액체의 양, 멤브레인과 전기장 발생기 간의 거리, 멤브레인과 질량 분광계의 유입구 간의 거리, 및 전기장 발생기 및 질량 분광계의 유입구에 인가된 전위. 일부의 경우, 전기 전위는 멤브레인으로부터 연속 분무를 발생시키기 위해 고전압 공급원을 통해 연속적으로 공급된다. 일부의 경우, 전기 전위는 전기장 발생기에 연결된 압전 디바이스 (예컨대, 대전방지 건(gun))를 압축 또는 압축해제하여 공급된다. 아울러, 멤브레인으로부터의 하전된 액적 및 분석물의 별개의 방출은 개별 펄스 당 0.5 ms 정도로 적은 내지는 개별 펄스 당 2분 정도의 많은 기간 동안 전기장 발생기에 1 kV 내지 약 15 kV 범위의 일련의 또는 한 전기적 펄스를 제공함으로써 달성될 수 있다.
세공 또는 세공들의 서브세트를 통해 배출되는 액체의 부피는 예를 들어 샘플의 부피, 세공의 크기, 분석 성질, 웰의 크기, 웰 내 세공의 수, 발생된 장 내 웰의 수, 발생된 장 내 세공의 수, 세공 크기, 세공 각도, 및 멤브레인의 강성에 좌우된다. 일부 예에서, 배출되는 액체의 부피는 예를 들어 약 1 fL 내지 약 1 μL, 또는 약 1 nL 내지 약 1 μL이다.
일부 예에서, 전기장 발생기는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인과 연관되고, 활성화되어 전기장을 생성한다. 일부 예에서, 전기장 발생기는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인을 위한 지지체와 일체형인 전기 그리드(grid) 라인이다. 일부 예에서, 전기장 발생기는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인과 별도인 전기 그리드이며, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인을 왕복하는 운동을 위해 배치된다. 일부 예에서, 전기장 발생기 및 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 중 하나 또는 둘다는, 전기장 발생기의 활성화가, 하기 논의된 바와 같은 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인이 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 어레이의 일부일 수 있는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 군 또는 특정의 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상의 또는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 소정 영역 상의 액적 형성을 선택적으로 유도하는 것을 가능케 하도록, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인에 대해 전기장 발생기를 배치하는 운동이 가능한 로봇식 아암(arm)에 부착된다.
일부 예에서 전기장 발생기는 라인, 판, 이온 스트림 또는 그의 조합이다. 예를 들어 전기장 발생기에의 전기 전위의 인가는 전기장 발생기의 활성화를 초래한다. 이온 스트림은 상이한 수단, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 유전체 배리어 방전에 의한 플라즈마의 발생, 적합한 전도성 부재에의 교류 전기 전위의 인가, 적합한 전도성 부재에의 정전기 전위의 인가, 또는 적합한 전도성 부재에 연결된 압전 재료의 압축에 의해 생성될 수 있다. 각 경우에, 적합한 전도성 부재는 전기장 강도 (전기 전위의 인가 시)가 주변 매질의 전기적 파괴를 야기할 만큼 충분한 크기의 것이도록, 적합한 기하구조의 전기 전도성 재료로 이루어진다. 일부의 경우, 상기 적합한 전도성 부재는 와이어, 돌출부 또는 일련의 돌출부, 판, 그리드 또는 매쉬, 뾰족한 막대, 또는 조도화된 표면일 수 있다. 이온 스트림은 또한, 적합한 액체를 전기분무하여 생성될 수 있다. 발생된 이온 스트림은 비-흡습성 멤브레인의 한쪽 측면에 안내되고, 멤브레인의 반대쪽 측면은 이전에 기재된 바와 같이 질량 분광계의 유입구 근처에 위치한다. 이온 스트림은, 이에 제한되지는 않으나, 이온 스트림이 비-흡습성 멤브레인 쪽으로 이동하고 그와 충돌함으로써 일련의 전도성 전극에 적합한 전기 전위를 제공하여 이온을 멤브레인 쪽으로 정전기적으로 안내하거나 또는 공압력(pneumatic force) (예컨대, 유동 기체)의 사용을 통해 이온 스트림을 멤브레인 쪽으로 운반하도록, 적절한 방식으로 이온 스트림 발생기를 위치시킴으로써 안내될 수 있다. 샘플의 유도 하전 및 유도성 이온화가 또한 사용될 수 있고, 이는 추가로 하기에 및 예를 들어 미국 특허 제9,184,036호에 기재되어 있으며, 상기 특허의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 마이크로웰일 수 있는 하우징(housing)과 연관될 수 있고, 여기서 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 예를 들어 하우징의 상단 또는 하단에 위치할 수 있다. 하우징은 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 재료와 상용성인 임의의 적합한 재료로 구성될 수 있다. 이러한 재료의 예는, 제한이 아닌 예로써, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인에 대해 상기 열거된 재료 중 어느 하나를 포함한다. 하우징 및 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인을 위한 재료는 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 일부 예에서, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 마이크로웰의 일부이다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 예에서, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 마이크로웰 또는 마이크로웰의 어레이의 일부이다. 적어도 2개의 마이크로웰의 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 동일하거나 상이할 수 있는 액체 샘플을 포함할 수 있고, 전기장은 활성화되어 적어도 2개의 마이크로웰의 각각의 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인으로부터 액적을 선택적으로 방출할 수 있다. 마이크로웰의 상단 또는 하단은 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인을 포함할 수 있다. 마이크로웰의 부피는 예를 들어 액체 샘플의 성질, 세공의 성질, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 성질 및 크기, 분무 용매, 포획 입자 또는 세포, 분석물 농도, 질량 표지 농도에 좌우된다. 일부 예에서, 마이크로웰의 부피는 약 1 펨토리터(들) (fL) 내지 약 100 마이크로리터 (μL), 또는 약 1 μL 내지 약 100 나노리터 (nL), 또는 약 1 μL 내지 약 50 nL, 또는 약 1 μL 내지 약 10 nL, 또는 약 1 μL 내지 약 5 nL, 또는 약 1 μL 내지 약 1 nL, 또는 약 1 nL 내지 약 2 nL이다. 일부 예에서, 마이크로웰이 원형인 경우, 마이크로웰의 직경은 약 5 마이크로미터 (㎛) 내지 약 40 밀리미터 (mm), 또는 약 5 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 또는 약 500 ㎛ 내지 약 2 mm, 또는 약 2 mm 내지 약 40 mm이다. 단일 세공 주위의 마이크로웰은 규정된 부피의 액체를 보유할 수 있고, 이는 규정된 분무 액체 부피 및 그에 따른 고정된 높은 농도의 분석물, 및 세공 내 액체의 짧은 탈착 시간을 허용한다.
어레이는 예를 들어 2 내지 약 100,000개의 마이크로웰, 또는 2 내지 약 50,000개의 마이크로웰, 또는 2 내지 약 10,000개의 마이크로웰, 또는 2 내지 약 5,000개의 마이크로웰, 또는 2 내지 약 2,500개의 마이크로웰, 또는 2 내지 약 1,000개의 마이크로웰, 또는 2 내지 약 500개의 마이크로웰, 또는 2 내지 약 100개의 마이크로웰, 또는 2 내지 약 50개의 마이크로웰, 또는 약 10 내지 약 100,000개의 마이크로웰, 또는 약 10 내지 약 50,000개의 마이크로웰, 또는 약 10 내지 약 10,000개의 마이크로웰, 또는 약 10 내지 약 5,000개의 마이크로웰, 또는 약 10 내지 약 2,500개의 마이크로웰, 또는 약 10 내지 약 1,000개의 마이크로웰, 또는 약 100 내지 약 10,000개의 마이크로웰, 또는 약 100 내지 약 5,000개의 마이크로웰, 또는 약 100 내지 약 2,500개의 마이크로웰, 또는 약 5,000 내지 약 10,000개의 마이크로웰, 또는 약 2,500 내지 약 7,500개의 마이크로웰을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 원리에 따른 예에서 장치(10)의 어레이는 도 5에 도시되어 있다. 장치(10)의 그리드 24x32개 (768개)를 포함하는 어레이(70)가 나타나 있고, 각각은 마이크로웰(14)을 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 마이크로웰의 어레이 및 전기장 발생기는 하나 또는 둘다가 하나 이상의 마이크로웰에 있어서 전기장을 선택적으로 활성화시키는 방식으로 움직일 수 있도록 서로 배치될 수 있다. 예는, 제한이 아닌 예시로서, 도 6-7에 나타나 있다. 장치(80)는 어레이(70) 및 전기장 발생기(74)를 포함한다. 로봇식 아암(72)이 어레이(70)의 운동을 제어하고, 임의로 로봇식 아암(76)이 전기장 발생기(74)의 운동을 제어한다. 장치(80)는 또한 하우징 (도시되지 않음)을 포함하며, 이는 로봇식 아암(72) 및 (76) 중 하나 또는 둘다를 위한 지지체를 제공한다. 각각의 로봇식 아암(72) 및 로봇식 아암(76)은, 어레이(70) 및 전기장 발생기(74) 중 하나 또는 둘다가 서로 움직일 수 있도록, 적합한 전자장치 및 제어기 (도시되지 않음)를 사용하여 별도로 제어가능하다. 질량 분광계 유입구는 전기장 발생기의 운동과 동조한다. 그러한 방식으로, 전기장은 어레이(70)를 포함하는 하나 이상의 장치(80)에 선택적으로 인가되어 어레이(70)의 마이크로웰의 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 특정 구역(들)의 복조(interrogation)를 가능케 할 수 있다. 선택된 구역의 이온화를 용이하게 하기 위해, 나노 구조물을 포함한 외부 구조물을 사용함으로써 또는 상기 구역에만 전기 전위를 인가함으로써 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 별개의 구역으로부터 액적의 이온화를 달성할 수 있다. 아울러, 어레이(70)는, 멤브레인으로부터 선택적으로 방출되는 액체의 액적에 대해 질량 스펙트럼 분석이 수행될 수 있도록 질량 분광계의 흡입구에 대해 배치될 수 있다 (도 4 참조).
도 6-7에 나타낸 예에서, 전기장 발생기(74)를 제어하는 로봇식 아암은 어레이(70) 위쪽에 나타나 있음을 참고하여야 한다. 이는 단지 예시이고; 일부 예에서, 로봇식 아암(76)은 예를 들어 어레이(70) 아래쪽에 또는 어레이(70)에 인접하여 (측면 상에) 있을 수 있다.
본 발명의 장치는 멤브레인 상의 정밀한 작은 부피의 액체의 방출이 요망되는 임의의 경우에 적용된다. 이러한 적용의 예는, 제한이 아닌 예시로서, 예를 들어 표적 희유 분자, 비-희유 분자, 비-희유 세포 및 희유 세포의 검출을 포함한다. 일부 예에서, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 1개 초과의 세공을 포함하고, 전기장은 활성화되어 개별 세공 또는 세공의 서브세트로부터 액적을 선택적으로 방출시킨다. 방출된 액적에 대해 질량 분광법 분석을 수행하여, 특정 MS 표지가 위치한 개별 세공 또는 세공의 서브세트에 인접한 영역을 결정한다. 상기 영역에 상응하는 멤브레인 상의 액체는 분석을 위해 하기에 보다 완전히 논의된 방법에 의해 제거된다. 개별 세공에 인접한 액체는 예를 들어 흡인, 멤브레인의 영역의 펀칭, 리프팅(lifting), 절개 또는 추출, 또는 그의 둘 이상의 조합에 의해 제거될 수 있다.
유도성 하전
유도성 전기분무 이온화에서, 예를 들어 미국 특허 제9,184,036호에 기재된 바와 같이, 전위는 샘플을 함유하는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인에 가깝게 놓인 하나 이상의 전극 (예를 들어, 전기장 발생기)에 인가될 수 있으며, 상기 특허의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 그것은 10 내지 2000 Hz 범위의 주파수의 양(positive) 또는 음(negative)의 모드로 반복적으로 펄싱한다. 강한 동적 전자기장이 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인에서 생성되고, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 구체적으로 표적화된 세공에서 장의 포커스를 제공하여, 세공으로부터 하전된 액적의 파열을 초래한다.
유도성 하전 시, 고전압 공급원 (예를 들어, 전기장 발생기)은 샘플, 또는 샘플을 함유하는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인과 접촉하지 않는다. 이 방식으로, 유도성 하전에 의해 이온이 발생된다 (즉, 1차 마이크로액적을 하전시키는데 유도성 방법이 사용됨). 이는 제어 및 포커싱된 액적 생성을 가능케 한다. 발생된 액적은 질량 분광계 내로 안내된다.
본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상의 특정 위치로부터의 하전된 액적 생성은 전극 (예를 들어, 전기장 발생기)을 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 목적하는 세공 근처 (전형적으로 2 내지 5 mm 거리)에 놓고, 그를 높은 양(positive)의 전위 (5 내지 7 kV, 50 내지 3,000 Hz, 펄스 폭 약 0.2 내지 2 ms)로 반복적으로 펄싱함으로써 달성될 수 있다. 전자기 유도는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 특정 세공에 근접하여 높은 전기장을 생성하며, 이는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 상기 세공만으로부터 하전된 액적의 파열을 초래한다.
일부 예에서, 본원에 논의된 바와 같은 MS 표지를 함유하는 액체는, 질량 태그 방출제 적용 후 질량 태그부착된 희유 세포 또는 입자를 보유하는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인으로부터 직접 배출될 수 있다. 따라서, 질량 분광계의 입구와 같은 더 작은 영역에의 방출 하전된 마이크로액적/용매화된 이온의 주위 정전 포커싱이 달성된다. 일부 예에서, 전기장 보조 하전된 액적 방출은 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 위쪽 또는 아래쪽 지점의 어레이에 의해 제공된 나노특징부로 달성되어, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 표면에 인접하여 높은 전기장을 제공한다.
일부 예에서, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 고유 나노특징부는 하전된 액적 장 방출에 의해, 습윤된 본질적으로 비-흡수성의 멤브레인으로부터 분석물-보유 이온의 분무를 생성하는데 사용될 수 있다. 질량 분광계에 의한 후속 분석을 위해 이온을 수집하기 위해 공압력 및 정전기력의 조합이 사용될 수 있다. 이는 공압력이 질량 분광계 유입구로부터의 흡인에 의해 (예컨대, 진공에 의해) 또는 질량 분광계와 무관하게 제공되는 기체 유동에 의해 제공되는 경우를 포함한다.
탈착 전기분무 이온화
본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상의 샘플에 안내되는 이온 빔의 발생을 위한 한 실시양태는 예를 들어 타카츠(Takats) 등 (미국 특허 제 7,335,897)에 기재되어 있는 탈착 전기분무 이온화 (DESI)를 사용하며, 상기 특허의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. DESI는 주위 조건 하에 대기압 또는 감압에서 재료 (분석물)의 이온화 및 탈착을 가능케 한다. DESI 시스템은 일반적으로, 연무 기체 내로 액체의 액적을 전달함으로써 DESI-활성 분무를 발생시키는 디바이스를 포함한다. 시스템은 또한, DESI-활성 분무를 표면 상으로 안내하는 수단을 포함한다. DESI-활성 분무는, 표면과의 접촉 지점에서, 하전 및 비-하전된 액체 액적 중 하나 또는 둘다, 기상 이온, 연무 기체 및 부근 대기의 분자를 포함할 수 있음을 이해한다. 공압 보조 분무는 샘플을 보유하는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상으로 안내되고 (하나 이상의 분석물 (샘플 내 존재하는 경우)과 상호작용하는 경우), 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 세공을 통해 분출되는 분석물 또는 분석물들의 탈착된 이온을 발생시킨다. 탈착된 이온은 질량 분석을 위한 질량 분석기, 크기에 의한 분리 및 생성된 전압 편차의 측정을 위한 IMS 디바이스, 스펙트럼 분석을 위한 불꽃 분광계 등으로 안내될 수 있다.
도 11은 DESI 시스템(100)의 한 실시양태를 개략적으로 도해한다. 이 시스템에서, 분무(110)는 통상의 전기분무 디바이스(120)에 의해 발생된다. 디바이스(120)는 분무 모세관(130)을 포함하며, 그를 통해 액체 용매(140)가 공급된다. 주변 네뷸라이저 모세관(150)은 환형(annular) 공간을 형성하며, 그를 통해 연무 기체, 예컨대 질소 (N2)가 고속으로 공급된다. 한 예에서, 액체는 물/메탄올 혼합물이고, 기체는 질소였다. 부재를 연결하는 금속을 통해 전원(170)에 의해 액체 용매에 고전압이 인가된다. 고속 유동 연무 기체가 모세관(130)을 이탈하는 액체와 상호작용한 결과는, 액체 액적을 포함하는 DESI-활성 분무(110)를 형성하는 것이다. DESI-활성 분무(110)는 또한 중성 대기 분자, 연무 기체, 및 기상 이온을 포함할 수 있다. 전기분무 디바이스(120)를 기재하였지만, 연무 기체 제트에 의해 운반되는 액체 액적의 스트림을 발생할 수 있는 임의의 디바이스가 DESI-활성 분무(11)를 형성하는데 사용될 수 있다.
분무(110)는 샘플을 보유하는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상으로 안내된다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 세공을 통해 샘플을 이탈하는 탈착된 이온은 수집되고, 분석을 위해 질량 분광계의 대기 유입구 또는 계면 내로 도입된다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 상이한 영역에서 샘플을 탈착 및 이온화시키기는 널리 공지된 구동 수단에 의해 x, y 또는 z 방향으로 움직일 수 있는 이동가능한 플랫폼(platform) 상에 탑재될 수 있거나 또는 이동가능한 플랫폼일 수 있다. 플랫폼의 전기 전위 및 온도는 또한 공지된 수단에 의해 제어될 수 있다. 질량 분광계에서 통상 발견되는 임의의 대기 계면은 본 발명에 사용하기에 적합할 것이다. 전형적인 가열 모세관 대기 계면을 사용하여 우수한 결과가 수득되었다. 우수한 결과는 또한, 금속 또는 절연체로 제조된 연장된 가요성 이온 이송 라인을 통해 샘플링하는 대기 계면을 사용하여 수득되었다.
저온 플라즈마
본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상의 샘플에 안내되는 이온 빔의 발생을 위한 한 실시양태는 오우양(Ouyang) 등 (미국 특허 제8,519,354호)에 기재되어 있는 저온 플라즈마 (LTP) 프로브를 사용하며, 상기 각각의 특허의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 전기분무 또는 레이저 기반 주위 이온화 공급원과 달리, 플라즈마 공급원은 전기분무 용매, 보조 기체, 및 레이저를 필요로 하지 않는다. LTP는 비교적 낮은 운동 에너지이나 반응성 이온 및 중성자와 함께, 고에너지 전자를 갖는 비-평형 플라즈마를 특징으로 할 수 있으며; 그 결과는 표면으로부터 분석물을 탈착 및 이온화시키고 분석물의 분자 이온 또는 단편 이온을 생성하는데 사용될 수 있는 저온 주위 플라즈마이다. 고온 (평형) 플라즈마와 비교하여 LTP의 구별되는 특징은, LTP가 분자를 원자 또는 소분자 단편으로 파괴시키지 않아, 생성된 이온에 분자 정보가 잔류한다는 것이다. LTP 이온화 공급원은 크기가 작은 전위를 갖고, 낮은 전력 및 기체를 소비 (또는 주위 공기만을 사용)하며, 이들 이점은 작동 비용의 감소로 이어질 수 있다. 비용 절감에 추가로, LTP 기반 이온화 방법은 장에서 실시간 분석적 분석을 위해 휴대용 질량 분광계로 이용되는 전위를 갖는다 ([Gao, L.; Song, Q.; Patterson, G. E.; Cooks, D. Ouyang, Z., Anal. Chem. 2006, 78, 5994-6002]; [Mulligan, C. C.; Talaty, N.; Cooks, R. G., Chemical Communications 2006, 1709-1711]; 및 [Mulligan, C. C.; Justes, D. R.; Noll, R. J.; Sanders, N. L.; Laughlin, B. C.; Cooks, R. G., The Analyst 2006, 131, 556-567]).
예시적 LTP 프로브는 도 12에 나타나 있다. 이러한 프로브는 방전 기체 유입구 포트(port), 프로브 팁, 2개의 전극, 및 유전체 배리어를 갖는 하우징을 포함할 수 있으며, 여기서 2개의 전극은 유전체 배리어에 의해 분리되고, 전원으로부터 전압의 인가는 전기장 및 저온 플라즈마를 발생시키고, 전기장, 또는 기체 유동, 또는 이들 둘 다는 프로브 팁에서부터 저온 플라즈마를 추진시킨다. 본원에 기재된 프로브의 이온화 공급원은 유전체 배리어 방전 (DBD; Kogelschatz, U., Plasma Chemistry and Plasma Processing 2003, 23, 1-46)에 기반한다. 유전체 배리어 방전은 유전체 배리어에 의해 분리된 2개의 전극 사이에 고전압 신호, 예를 들어 교류 전류를 인가함으로써 달성된다. 2개의 전극 사이에 비-열적(non-thermal) 저전력 플라즈마가 생성되며, 유전체는 변위 전류를 제한한다. 이와 같은 플라즈마는, 액체 및 기체의 이온화 뿐만 아니라 고체 샘플 표면으로부터의 분자를 탈착/이온화시키는데 사용될 수 있는 샘플의 주위 환경 내 반응성 이온, 전자, 라디칼, 여기(excited) 중성자, 및 준안정성 종을 함유한다. 플라즈마는 방전 구역으로부터 추출될 수 있고, 전기장에 의한 힘, 또는 전기장 및 기체 유동의 조합된 힘으로 샘플 표면 쪽으로 안내될 수 있다.
특정 실시양태에서, 프로브는 전원을 추가로 포함한다. 전원은 직류 전류 또는 교류 전류를 제공할 수 있다. 특정 실시양태에서, 전원은 교류 전류를 제공한다. 특정 실시양태에서, 방전 기체는 방전 기체 유입구 포트를 통해 프로브로 공급되고, 전기장 및/또는 방전 기체는 프로브 팁에서부터 저온 플라즈마를 추진시킨다. 방전 기체는 임의의 기체일 수 있다. 예시적 방전 기체는 헬륨, 압축 또는 주위 공기, 질소 및 아르곤을 포함한다. 특정 실시양태에서, 유전체 배리어는 전기 절연성 재료로 이루어진다. 예시적 전기 절연성 재료는 유리, 석영, 세라믹 및 중합체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 유전체 배리어는 각 말단부에서 개방된 유리 튜브이다. 다른 실시양태에서, 전기장에 변화를 주면 샘플 내 분석물로부터 발생된 이온의 에너지 및 단편화도가 조절된다.
저온 플라즈마 프로브로부터의 플라즈마 방전은 샘플을 보유하는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상으로 안내된다. 플라즈마는 샘플과 상호작용하고, 샘플의 액체 액적을 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 세공을 통해 분출시키고, 분석을 위해 질량 분광계의 대기 유입구 또는 계면 내로 도입시킨다.
습윤된 다공성 재료를 사용한 이온화
본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상의 샘플에 안내되는 이온 빔의 발생을 위한 한 실시양태는 오우양 등 (미국 특허 제8,859,956호)에 기재되어 있는 이온을 생성시키기 위해 습윤되는 다공성 재료로 구성된 프로브를 사용하며, 상기 각각의 특허의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예시적 프로브는 도 13에 나타나 있다. 재료에 높은 전기 전압이 인가될 때 재료의 연부로부터 직접 발생되는 액체 이온 빔을 보유 및 이송하기 위해 다공성 재료, 예컨대 종이 (예를 들어, 여과지 또는 크로마토그래피지) 또는 다른 유사한 재료가 사용된다. 다공성 재료는 용매의 연속 유동과 같은 용매의 유동과 별개로 (즉, 별도로 또는 단절되어) 있다. 그 대신에, 액체는 다공성 재료 상으로 스폿팅된다. 이어서, 스폿팅된 액체는 고전압 공급원에 연결되어 액체의 이온 빔을 생성하고, 이는 샘플을 보유하는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상으로 안내된다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 세공을 통해 샘플을 이탈하는 탈착된 이온은 수집되고, 분석을 위해 질량 분광계의 대기 유입구 또는 계면 내로 도입된다. 액체는 별도의 용매 유동의 필요 없이 다공성 재료를 통해 수송된다. 공압 도움은 필요로 하지 않고; 오히려, 전압이 간단하게 다공성 재료에 인가된다.
특정 실시양태에서, 다공성 재료는 임의의 셀룰로스-기반 재료이다. 다른 실시양태에서, 다공성 재료는 비-금속 다공성 재료, 예컨대 면화, 리넨 울(wool), 합성 텍스타일, 또는 식물 조직이다. 또 다른 실시양태에서, 다공성 재료는 종이이다. 종이의 이점은 다음을 포함한다: 비용 (종이는 저렴함); 완전히 상업화되어 있고, 그의 물리적 및 화학적 특성이 조절될 수 있음; 액체 샘플로부터 미립자 (세포 및 분진)를 여과할 수 있음; 용이하게 형상화됨 (예를 들어, 절단, 인열 또는 접힘이 용이함); 내부에서 모세관 작용 하에 (예를 들어, 외부 펌핑 및/또는 전원 없이) 액체가 유동함; 및 일회용임.
특정 실시양태에서, 다공성 재료는 분무를 위해 최적화되는 거시적(macroscopic) 각도를 갖는 고체 팁과 통합된다.
특정 실시양태에서, 다공성 재료는 여과지이다. 예시적 여과지는 셀룰로스 여과지, 무회(ashless) 여과지, 니트로셀룰로스지, 유리 마이크로섬유 여과지, 및 폴리에틸렌지를 포함한다. 임의의 세공 크기를 갖는 여과지가 사용될 수 있다. 예시적 세공 크기는 등급 1 (11 ㎛), 등급 2 (8 ㎛), 등급 595 (4-7 ㎛), 및 등급 6 (3 ㎛)을 포함한다. 세공 크기는 분무 재료 내부의 액체의 수송에 영향을 미칠 것일 뿐만 아니라, 팁에서 테일러(Taylor) 콘의 형성에도 영향을 미칠 수 있다. 최적 세공 크기는 안정한 테일러 콘을 발생시키고, 액체 증발을 감소시킬 것이다. 여과지의 세공 크기는 또한 여과에서 중요한 파라미터이다 (즉, 종이가 온라인 전처리 디바이스로서 작용함). 낮은 nm 범위의 세공 크기를 갖는 재생 셀룰로스의 상업적으로 입수가능한 한외여과 멤브레인은 1000 Da 정도로 작은 입자를 잔류시키도록 설계된다. 한외여과 멤브레인은 1000 Da 내지 100,000 Da 범위의 분자량 컷오프(cutoff)로 상업적으로 수득될 수 있다.
본 발명의 프로브는 간단하게 다공성 재료의 연부에서 발생된 높은 전기장의 사용에 기반하여 마이크로미터 규모의 액적 발생에 효과적이다. 특정 실시양태에서, 다공성 재료는 이온 발생을 위해 거시적으로 예리한 지점, 예컨대 삼각형의 지점을 갖도록 형상화된다. 본 발명의 프로브는 상이한 팁 폭을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 프로브 팁 폭은 적어도 약 5 ㎛ 또는 그 초과, 적어도 약 10 ㎛ 또는 그 초과, 적어도 약 50 ㎛ 또는 그 초과, 적어도 약 150 ㎛ 또는 그 초과, 적어도 약 250 ㎛ 또는 그 초과, 적어도 약 350 ㎛ 또는 그 초과, 적어도 약 400 ㎛ 또는 그 초과, 적어도 약 450 ㎛ 또는 그 초과 등이다. 특정 실시양태에서, 팁 폭은 적어도 350 ㎛ 또는 그 초과이다. 다른 실시양태에서, 프로브 팁 폭은 약 400 ㎛이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 프로브는 3차원 형상, 예컨대 원추형 형상을 갖는다.
표적 희유 분자의 검출
일부 예에서, 본 발명의 장치는, MS 기술을 사용하여 검출가능한 상이한 표지 및 친화성 작용제를 이용하여 표적 희유 분자의 상이한 군집을 검출하는데 사용된다. 일부 예에서, 표적 희유 분자의 상이한 군집 간을 구별하도록 선택되는 MS 표지를 생성하기 위해 하나 이상의 변경 작용제가 사용된다. 방법은 또한, 액체 액적을 생성시키고, MS 기술에 의해 각각의 상이한 MS 표지의 존재 및 양 중 하나 또는 둘다에 대해 조사하는 것을 포함하는 분리 방법을 이용한다. MS 표지의 구별은 표적 희유 분자의 각각의 상이한 군집의 존재 및 양 중 하나 또는 둘다에 대한 정보를 산출한다. MS 표지의 수는 표적 희유 분자 당 106개 이상 정도로 많거나 또는 표적 희유 분자 당 10개 정도로 적을 수 있다. 표적 희유 분자 당 MS 표지의 수는 예를 들어 약 10 내지 약 1012개, 또는 약 10 내지 약 1010개, 또는 약 10 내지 약 108개, 또는 약 10 내지 약 106개, 또는 약 10 내지 약 104개, 또는 약 10 내지 약 100개, 또는 약 100 내지 약 1010개, 또는 약 100 내지 약 108개, 또는 약 100 내지 약 106개, 또는 약 100 내지 약 104개일 수 있다.
일부 예에서, 방법은 희유 분자 및 비-희유 분자의 하나 이상의 상이한 군집을 함유하는 것으로 생각되는 샘플 내 표적 희유 분자의 하나 이상의 상이한 군집을 검출하기 위한 것이다. 액체 형태의 샘플을 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인을 포함하는 마이크로웰과 접촉시킨다. 임의로, 예를 들어 여과와 같은 적합한 기술을 사용함으로써, 표적 희유 분자의 하나 이상의 상이한 군집의 농도를 비-희유 분자의 것에 비해 증강시켜 농축된 샘플을 형성한다. 샘플은, 표적 희유 분자의 각각의 상이한 군집에 대해, 표적 희유 분자의 군집 중 하나의 표적 희유 분자에 대해 특이적이고 그와 결합하는 특이적 결합 파트너를 포함하는 친화성 작용제로 인큐베이션된다. 친화성 작용제는 질량 분광법 표지 전구체 또는 제1 변경 작용제를 포함한다. 친화성 작용제는 비-미립자 또는 미립자일 수 있다. 제1 변경 작용제는 질량 분광법 표지 전구체로부터의 질량 분광법 표지의 형성을 용이하게 하거나, 또는 친화성 작용제로부터 질량 분광법 표지 전구체를 포함하는 실체를 방출시킨다. 제1 변경 작용제가 질량 분광법 표지 전구체로부터의 질량 분광법 표지의 형성을 용이하게 하지 않는 경우, 샘플은 질량 분광법 표지 전구체로부터의 질량 분광법 표지의 형성을 용이하게 하는 제2 변경 작용제로 처리한다. 질량 분광법 표지는 표적 희유 분자의 군집 중 하나에 상응하거나 또는 그를 포함한다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상의 샘플은 전기장에 노출되어, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 적어도 1개의 세공을 통해 샘플의 액적을 방출시킨다. 액적에 대해 질량 분광법 분석을 수행하여 각각의 상이한 질량 분광법 표지의 존재 및/또는 양을 결정한다. 각각의 상이한 질량 분광법 표지의 존재 및/또는 양은 각각의 마이크로웰에 대한 샘플 내 표적 희유 분자의 각각의 상이한 군집의 및/또는 양과 상관관계를 가질 수 있다.
한 접근법에서, 입자 증폭이 이용되며, 이는 입자의 응집 또는 클러스터링(clustering)을 제공하여 입자 응집체를 형성한다. 한 예에서, 더 큰 입자 (캐리어 입자)는 많은 더 작은 입자 (표지 입자)로 코팅될 수 있다. 추가로 증폭을 달성하기 위해, 캐리어 입자는 하나 이상의 연결기를 사용하여 다른 캐리어 입자와 쇄화(chained)될 수 있다. 표지 입자는 표면 상에 MS 표지를 함유하며, 이는 질량 표지의 크기가 비교적 작기 때문에 105개 가량일 수 있다. 본 접근법에서, 매우 낮은 바탕 수준이 실현된다. 캐리어 입자 및 표지 입자는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 내 세공보다 더 작은 직경을 가져야 한다.
하기 논의된 식별 기술 중 하나 이상을 샘플에 적용한 후, 샘플을 본원에 기재된 원리에 따른 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인과 접촉시킬 수 있음을 참고하여야 한다. 따라서, 하나 이상의 표적 희유 분자를 식별하는 샘플의 분석을 위한 접근법은 먼저 어느 마이크로웰이 관심 표적 희유 분자를 갖는지를 식별하는 것을 포함한다. 따라서, 기술은 후속 분석을 위해 표적 희유 분자가 있는 샘플을 갖는 마이크로웰을 식별하는 스크리닝 기술로서 사용될 수 있다.
분석하고자 하는 샘플은 표적 희유 분자, 비-희유 세포 및 희유 세포를 함유하는 것으로 생각되는 것이다. 샘플은 생물학적 샘플 또는 비-생물학적 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 포유동물 대상체 또는 비-포유동물 대상체로부터 유래될 수 있다. 포유동물 대상체는 예를 들어 인간 또는 다른 동물 종일 수 있다. 생물학적 샘플은 예를 들어 생물학적 유체, 예컨대 전혈, 혈청, 플라즈마, 객담, 림프 유체, 정액, 질점액, 분뇨, 소변, 척수액, 타액, 대변, 뇌척수액, 눈물 및 점액을 포함한다. 생물학적 조직은, 예시로서, 예를 들어 모발, 피부, 기관 또는 다른 신체 부분으로부터의 절편 또는 절제 조직을 포함한다. 많은 경우, 샘플은 전혈, 플라즈마 또는 혈청이다. 희유 세포는 예를 들어 폐, 기관지, 결장, 직장, 췌장, 전립선, 유방, 간, 쓸개관, 방광, 난소, 뇌, 중추 신경계, 신장, 골반, 자궁 체부, 구강 또는 인두 또는 흑색종 암으로부터 유래될 수 있다. 희유 세포는 예를 들어 병원체, 예컨대 박테리아, 바이러스, 진균류, 및 원생류; 악성 세포, 예컨대 악성 신생물 또는 암 세포; 순환 내피 세포; 순환 종양 세포; 순환 암 줄기 세포; 순환 암 간엽 세포; 순환 상피 세포; 태아 세포; 면역 세포 (B 세포, T 세포, 대식세포, NK 세포, 단핵세포); 및 줄기 세포일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 예에서, 시험하고자 하는 샘플은 포유동물, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 인간 대상체로부터의 혈액 샘플이다. 혈액 샘플은 세포, 예컨대 비-희유 세포 및 희유 세포를 함유하는 것이다. 일부 예에서, 혈액 샘플은 전혈 또는 플라즈마이다.
어구 "표적 희유 분자"란 샘플 내 검출될 수 있는 바이오마커(biomarker)를 포함한 분자를 지칭하며, 이 경우 분자 또는 바이오마커는 세포의 특정 군집에 대한 지표이다. 표적 희유 분자는 항원 (예컨대, 단백질, 펩티드, 호르몬, 비타민, 알러젠, 자가면역 항원, 탄수화물, 지질, 당단백질, 공동 인자, 항체 및 효소) 및 핵산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
어구 "표적 희유 분자의 군집"이란 분자의 군에 대해 특이적인 공통 항원 또는 핵산을 공유하는 분자의 군을 지칭한다. 어구 "에 대해 특이적"이란 공통 항원 또는 핵산이 다른 분자로부터 분자의 군을 구별함을 의미한다.
비-희유 분자는 샘플 내 희유 분자의 양과 비교할 때 비교적 다량으로 존재한다.
어구 "세포의 군집"이란 그의 표면 상에 또는 세포 내부에 항원 또는 핵산을 갖는 세포의 군을 지칭하며, 여기서 항원은 군의 모든 세포에 공통적이고 세포의 군에 대해 특이적이다.
희유 세포는 샘플 내 비-희유 세포의 양과 비교할 때 비교적 소량으로 샘플에 존재하는 세포이다. 일부 예에서, 희유 세포는 희유 세포를 함유하는 것으로 생각되는 샘플 내 총 세포 군집의 중량 기준으로 약 10-8% 내지 약 10-2%의 양으로 존재한다. 희유 세포는 악성 세포, 예컨대 악성 신생물 또는 암 세포; 순환 내피 세포; 순환 상피 세포; 간엽 세포; 태아 세포; 면역 세포 (B 세포, T 세포, 대식세포, NK 세포, 단핵세포); 줄기 세포; 유핵 적혈구 (적혈모구 또는 적모세포); 및 미성숙 과립구일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
비-희유 세포는 샘플 내 희유 세포의 양과 비교할 때 비교적 다량으로 존재하는 세포이다. 일부 예에서, 비-희유 세포는 비-희유 세포 및 희유 세포를 함유하는 것으로 생각되는 샘플 내 총 세포 군집에서의 희유 세포의 양보다 적어도 약 10배, 또는 적어도 약 102배, 또는 적어도 약 103배, 또는 적어도 약 104배, 또는 적어도 약 105배, 또는 적어도 약 106배, 또는 적어도 약 107배, 또는 적어도 약 108배 더 많다. 비-희유 세포는 예를 들어 백혈구, 혈소판 및 적혈구일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
희유 세포의 표적 희유 분자는 예를 들어 암 세포 유형 바이오마커, 종양단백질 및 종양유전자, 내화학성 바이오마커, 전이능(metastatic potential) 바이오마커, 및 세포 타이핑(typing) 마커를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 암 세포 유형 바이오마커는, 제한이 아닌 예시로서, 예를 들어 사이토케라틴 (CK) (CK1, CK2, CK3, CK4, CKS, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK12, CK13, CK14, CK16, CK17, CK18, CK19 및 CK2), 상피 세포 접착 분자 (EpCAM), N-카드헤린, E-카드헤린 및 비멘틴을 포함한다. 돌연변이로 인해 치료 관련성을 가질 것으로 예상되는 종양단백질 및 종양유전자는 예를 들어 WAF, BAX-1, PDGF, JAGGED 1, NOTCH, VEGF, VEGHR, CAlX, MIB1, MDM, PR, ER, SELS, SEM1, PI3K, AKT2, TWIST1, EML-4, DRAFF, C-MET, ABL1, EGFR, GNAS, MLH1, RET, MEK1, AKT1, ERBB2, HER2, HNF1A, MPL, SMAD4, ALK, ERBB4, HRAS, NOTCH1, SMARCB1, APC, FBXW7, IDH1, NPM1, SMO, ATM, FGFR1, JAK2, NRAS, SRC, BRAF, FGFR2, JAK3, RA, STK11, CDH1, FGFR3, KDR, PIK3CA, TP53, CDKN2A, FLT3, KIT, PTEN, VHL, CSF1R, GNA11, KRAS, PTPN11, DDR2, CTNNB1, GNAQ, MET, RB1, AKT1, BRAF, DDR2, MEK1, NRAS, FGFR1 및 ROS1을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
내포 세포 타이핑 마커는, 제한이 아닌 예시로서, 예를 들어 CD136, CD105/엔도글린, CD144/VE-카드헤린, CD145, CD34, Cd41 CD136, CD34, CD90, CD31/PECAM-1, ESAM, VEGFR2/Fik-1, Tie-2, CD202b/TEK, CD56/NCAM, CD73/VAP-2, 클라우딘 5, Z0-1, 및 비멘틴을 포함한다.
전이능 바이오마커는 우로키나제 플라스미노겐 활성화제 (uPA), 플라스미노겐 활성화제 억제제 (PAI-1), CD95, 세린 프로테아제 (예를 들어, 플라스민 및 ADAM); 세린 프로테아제 억제제 (예를 들어, 비쿠닌); 매트릭스 메탈로프로테이나제 (예를 들어, MMP9); 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제 (예를 들어, TIMP-1)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 내화학성 바이오마커는, 제한이 아닌 예시로서, PL2L piwi 유사, 5T4, ADLH, β-인테그린, α6 인테그린, c-kit, c-met, LIF-R, CXCR4, ESA, CD 20, CD44, CD133, CKS, TRAF2 및 ABC 수송체, 암 줄기 세포에 대한 지표인 CD34를 함유하지만 CD45 또는 CD31이 없는 암 세포; 및 CD44를 함유하지만 CD24가 없는 암 세포를 포함한다.
본원의 방법에서, 백혈구는 비-희유 세포로서 제외될 수 있다. 예를 들어, 백혈구 상에 존재하는 마커, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 CD45, CTLA-4, CD4, CD6S 및 CDS는 세포가 관심 희유 세포가 아님을 나타내는데 사용될 수 있다. 특정의 비-제한적 예에서, 원래 백혈구 공통 항원이라 불리는 CD45 항원 (단백질 티로신 포스파타제 수용체 유형 C 또는 PTPRC라고도 공지됨)은 모든 백혈구를 검출하는데 유용하다.
부가적으로, CD45는 희유 세포로 간주될 수 있는 상이한 유형의 백혈구를 구별하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 과립구는 CD45+, CD15+로 나타내고; 단핵세포는 CD45+, CD14+로 나타내고; T 림프구는 CD45+, CD3+로 나타내고; T 헬퍼 세포는 CD45+, CD3+, CD4+로 나타내고; 세포독성 T 세포는 CD45+, CD3+, CDS+로 나타내고; β-림프구는 CD45+, CD19+ 또는 CD45+, CD20+로 나타내고; 혈전구는 CD45+, CD61+로 나타내며; 천연 킬러(killer) 세포는 CD16+, CD56+ 및 CD3-로 나타낸다. 아울러, 2개의 공통적으로 사용되는 CD 분자, 즉, CD4 및 CD8은 일반적으로, 각각 헬퍼 및 세포독성 T 세포에 대한 마커로서 사용된다. 이들 분자는 CD3+와 조합하여 규정되는데, 그 이유는 일부 다른 백혈구 또한 이들 CD 분자를 발현하기 때문이다 (일부 대식세포는 낮은 수준의 CD4를 발현하고; 수지상 세포는 높은 수준의 CDS를 발현함).
일부의 경우, 희유 세포는 병원체이며, 이는 그람-양성 박테리아 (예를 들어, 엔테로콕쿠스 종 군 B 스트렙토콕쿠스, 코아굴라제-음성 스타필로콕쿠스 종 스트렙토콕쿠스 비리단스, 스타필로콕쿠스 아우레우스 및 사프로파이티커스, 락토바실러스 및 그의 내성 균주); 효모, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 칸디다 알비칸스; 그람-음성 박테리아, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 대장균, 클레브시엘라 뉴모니아에, 시트로박터 코세리, 시트로박터 프레운디이, 클레브시엘라 옥시토카, 모르가넬라 모르가니이, 슈도모나스 아에루기노사, 프로테우스 미라빌리스, 세라티아 마르세센스, 및 디프테로이드 (gnb) 및 그의 내성 균주; 바이러스, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 HIV, HPV, 플루(Flu), 및 MERSA; 및 성매개 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 희유 세포 병원체의 검출의 경우, 희유 세포 병원체 군집에 결합하는 결합 파트너를 포함하는 입자 시약이 첨가된다. 부가적으로, 병원체 상의 세포 표적 희유 분자의 각 군집에 있어서, 군집 내 세포 표적 희유 분자에 결합하는 세포 표적 희유 분자에 대한 결합 파트너를 포함하는 시약이 첨가된다.
어구 "비-세포 표적 희유 분자"란, 세포에 결합되지 않고/거나 샘플 내 자유롭게 순환하는 표적 희유 분자를 지칭한다. 이러한 비-세포 표적 희유 분자는 예를 들어, 암, 심장 손상, 심혈관 질환, 신경계 질환, 울혈/혈행정지(hemastasis), 태아 모계 평가, 생식능력, 뼈 상태, 호르몬 수준, 비타민, 알러지, 자가면역 질환, 고혈압, 신장 질환, 당뇨병, 간 질환, 감염성 질환의 검출을 위한 바이오마커를 포함하나 이에 제한되지는 않는 질환의 의료적 진단에 유용한 생체분자, 및 질환의 의료적 진단에 유용한 다른 생체분자를 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 경우, 표적 희유 분자의 군집 중 하나 이상은 비-세포 표적 희유 분자의 군집일 수 있다. 이러한 경우, 비-세포 표적 희유 분자의 각 군집에 있어서, 비-세포 표적 희유 분자에 대한 결합 파트너를 포함하는 포획 입자 실체가 첨가되며, 이는 군집 내 비-세포 표적 희유 분자에 결합하여 입자-결합된 비-세포 표적 희유 분자를 형성함으로써 비-희유 분자의 것에 비해 비-세포 표적 희유 분자의 한 또는 상이한 군집의 농도의 증강을 수행하여 농축된 샘플을 형성할 목적으로 미립자 형태의 비-세포 표적 희유 분자가 되도록 한다.
입자의 조성물은 유기 또는 무기, 자성 또는 비-자성일 수 있다. 유기 중합체는, 제한이 아닌 예시로서, 그 자체로서 또는 다른 재료와 함께 사용되는, 예를 들어 니트로셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(히드록시에틸 메타크릴레이트), 폴리(스티렌/디비닐벤젠), 폴리(스티렌/아크릴레이트), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 멜라민 수지, 나일론, 폴리(비닐 부티레이트), 및 라텍스를 비롯한, 그의 마이크로입자 및 나노입자 형태를 포함한다. 입자는 또한 예를 들어 탄소 (예를 들어, 탄소 나노튜브), 금속 (예를 들어, 금, 은 및 철, 및 그의 금속 산화물), 콜로이드, 덴드리머, 덴드론, 핵산, 분지 쇄-DNA, 및 리포좀을 포함할 수 있다.
입자 실체의 입자의 직경은 예를 들어 표적 희유 분자의 성질, 샘플의 성질, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 성질 및 세공 크기, 입자의 멤브레인에의 접착력, 입자의 표면, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 표면, 액체 이온 강도, 액체 표면 장력 및 액체 내 구성요소, 부착된 친화성 작용제 및 MS 표지 전구체의 수, 크기, 형상 및 분자 구조 중 하나 이상에 좌우된다. 입자의 직경은 바탕 기여도를 허용되는 수준으로 감소시킬 만큼 커야 하지만, 비-희유 분자로부터의 입자의 비효율적 분리를 달성할 정도로 커서는 안된다. 일부 예에서, 본원에 기재된 원리에 따라, 입자의 평균 직경은 약 0.02 마이크로미터 (20 nm) 이상 및 약 200 마이크로미터 이하, 또는 약 120 마이크로미터 이하이어야 한다. 일부 예에서, 입자는 예를 들어 약 0.1 마이크로미터 내지 약 20 마이크로미터, 또는 약 0.1 마이크로미터 내지 약 15 마이크로미터, 또는 약 0.1 마이크로미터 내지 약 10 마이크로미터, 또는 약 0.02 마이크로미터 내지 약 0.2 마이크로미터, 또는 약 0.2 마이크로미터 내지 약 1 마이크로미터, 또는 약 1 마이크로미터 내지 약 5 마이크로미터, 또는 약 1 마이크로미터 내지 약 20 마이크로미터, 또는 약 1 마이크로미터 내지 약 15 마이크로미터, 또는 약 1 마이크로미터 내지 약 10 마이크로미터, 또는 약 5 마이크로미터 내지 약 20 마이크로미터, 또는 약 5 내지 약 15 마이크로미터, 또는 약 5 내지 약 10 마이크로미터, 또는 약 6 내지 약 15 마이크로미터, 또는 약 6 내지 약 10 마이크로미터의 평균 직경을 갖는다. 일부 예에서, 표면에의 입자의 접착력은 매우 강해, 입자 직경이 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 세공 크기보다 더 작을 수 있다. 다른 예에서, 물리적으로 입자가 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 세공에 빠질 수 없도록, 입자는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 세공 크기보다 충분히 더 크다.
포획 입자 실체는 또한, 비-세포 표적 희유 분자에 대해 특이적인 결합 파트너를 포함한다. 어구 "결합 파트너"란 특이적 결합 쌍의 구성원인 분자를 지칭한다. 특이적 결합 쌍의 구성원은 공동 내 또는 표면 상의 영역을 갖는 두 상이한 분자 중 하나이며, 다른 분자에 특이적으로 결합하여 그의 특정 공간 및 극성 조직화와 상보적으로 규정된다. 특이적 결합 쌍의 구성원은 면역학적 쌍, 예컨대 항원-항체 또는 합텐-항체, 비오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 효소-기질, 핵산 이중나선, IgG-단백질 A, 및 폴리뉴클레오티드 쌍, 예컨대 DNA-DNA 또는 DNA-RNA의 구성원일 수 있다. 결합 파트너는 입자 시약의 입자에 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합될 수 있다. "비-공유적으로"란 결합 파트너가 수소 결합, 반데르 발스 힘, 정전기력, 소수성 효과, 입자 내 물리적 봉입, 및 하전 상호작용 중 하나 이상의 결과로서 입자에 결합됨을 의미한다. "공유적으로"란 결합 파트너가, 탄소, 산소, 황, 질소 및 인을 포함하는 2 내지 약 60개 또는 그 초과의 원자의 쇄를 포함할 수 있고 지방족 또는 방향족일 수 있는 연결기 또는 결합에 의해 입자에 결합됨을 이미한다.
일부 예에서, 샘플은 대상체의 신체로부터 예를 들어 이에 제한되지는 않으나 컵, 백, 병(bottle), 모세관 또는 니들과 같은 적합한 용기 내로 수집된다. 혈액 샘플은 배큐테이너 (혈액 수집 튜브, BD로부터 상업적으로 입수가능) 내로 수집될 수 있다. 용기는 수집 매질을 함유할 수 있고, 그 내로 샘플이 전달된다. 수집 매질은 대개 건조 매질이고, 혈액 샘플과 혼합될 때 혈액 샘플 내 혈소판의 불활성화를 달성하기 위해 유효량의 혈소판 불활성화제를 포함할 수 있다.
혈소판 불활성화제는 킬레이트화제, 예컨대 트리아세트산 모이어티 또는 그의 염, 테트라아세트산 모이어티 또는 그의 염, 펜타아세트산 모이어티 또는 그의 염, 또는 헥사아세트산 모이어티 또는 그의 염을 포함하는 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 예에서, 킬레이트화제는 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA) 및 그의 염, 또는 에틸렌 글리콜 테트라아세테이트 (EGTA) 및 그의 염이다. 혈소판 불활성화제의 유효량은 예를 들어 혈소판 불활성화제의 성질, 혈액 샘플의 성질, 혈소판 활성화의 수준 및 이온 강도 중 하나 이상에 좌우된다. 일부 예에서, 항혈소판제로서의 EDTA에 있어서, 용기 내 건조 EDTA의 양은 혈액 1 mL 당 약 1.0 내지 약 2.0 mg, 또는 혈액 1 mL 당 약 1.5 mg의 농도를 생성하는 양이다. 혈소판 불활성화제의 양은 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%의 혈소판 불활성화를 달성하기에 충분한 양이다.
상기 언급된 바와 같이, 임의로, 표적 희유 분자의 하나 이상의 상이한 군집의 농도는 비-희유 분자의 것에 비해 증강되어 농축된 샘플을 형성한다. 일부 예에서, 샘플을 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인과 접촉시키기 전, 샘플에 대해 다공성 매트릭스를 사용하는 여과 절차를 수행하고, 이는 표적 희유 분자를 잔류시키면서 비-희유 분자가 다공성 매트릭스를 통과하는 것을 허용하여 표적 희유 분자의 농도를 증강시킨다. 하나 이상의 표적 희유 분자가 비-세포인 (즉, 세포 또는 다른 생물학적 입자와 회합되지 않은) 경우, 샘플은 하나 이상의 포획 입자 실체와 조합되며, 여기서 각각의 포획 입자 실체는 비-세포 표적 희유 분자의 각각의 군집의 비-세포 표적 희유 분자에 대한 결합 파트너를 포함하여, 미립자 형태의 비-세포 표적 희유 분자가 되게 한다 (즉, 입자-결합된 비-세포 표적 희유 분자를 형성함). 샘플 및 포획 입자 실체의 조합을 소정 온도에서 소정 기간 동안 방치하여, 포획 입자 실체의 상응하는 결합 파트너와 비-세포 표적 희유 분자의 결합을 가능케 한다. 통상 적당한 온도가 사용되며, 이는 약 5℃ 내지 약 70℃ 또는 약 15℃ 내지 약 70℃ 또는 약 20℃ 내지 약 45℃의 범위일 수 있다. 인큐베이션 기간에 대한 시간 범위는 예를 들어 약 0.2초 내지 약 6시간, 또는 약 2초 내지 약 1시간, 또는 약 1 내지 약 5분이다.
본질적으로 비-흡수성인 멤브레인에의 샘플의 접촉을 위한 시간 범위는 예를 들어 표적 희유 세포 및/또는 입자-결합된 표적 희유 분자의 상이한 군집의 성질 및 크기, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 성질, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 세공의 크기, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상의 샘플에 인가된 진공의 수준, 여과되는 부피, 및 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 표면적 중 하나 이상에 좌우될 수 있다. 일부 예에서, 접촉 기간은 약 1분 내지 약 1시간, 약 5분 내지 약 1시간, 또는 약 5분 내지 약 45분, 또는 약 5분 내지 약 30분, 또는 약 5분 내지 약 20분, 또는 약 5분 내지 약 10분, 또는 약 10분 내지 약 1시간, 또는 약 10분 내지 약 45분, 또는 약 10분 내지 약 30분, 또는 약 10분 내지 약 20분이다.
본원 방법에서, 비농축된 또는 농축된 샘플은, 표적 희유 분자의 각각의 상이한 군집에 있어서, 표적 희유 분자의 군집 중 하나의 표적 희유 분자에 대해 특이적이고 그와 결합하는 결합 파트너를 포함하는 친화성 작용제로 인큐베이션될 수 있다. 친화성 작용제는 또한, 각각의 상이한 MS 표지 전구체로부터의 MS 표지의 형성을 용이하게 하거나 또는 친화성 작용제로부터 MS 표지 전구체를 포함하는 실체를 방출시키는 MS 표지 전구체 또는 제1 변경 작용제를 포함한다. 많은 예에서, 상기 조합은 수성 매질 중에 제공되며, 이는 단독의 물일 수 있거나 또는 유기 용매, 예컨대 극성 비양성자성 용매, 극성 양성자성 용매, 예컨대 디메틸술폭시드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 아세토니트릴, 유기 산, 또는 알콜, 및 물과 혼화성인 비-극성 용매, 예컨대 디옥센을 약 0.1% 내지 약 50%, 또는 약 1% 내지 약 50%, 또는 약 5% 내지 약 50%, 또는 약 1% 내지 약 40%, 또는 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 20%, 또는 약 1% 내지 약 10%, 또는 약 5% 내지 약 40%, 또는 약 5% 내지 약 30%, 또는 약 5% 내지 약 20%, 또는 약 5% 내지 약 10% (부피 기준)의 양으로 또한 함유할 수 있다. 일부 예에서, 수성 매질에 대한 pH는 대개 중간 정도의 pH이다. 일부 예에서, 수성 매질의 pH는 약 5 내지 약 8, 또는 약 6 내지 약 8, 또는 약 7 내지 약 8, 또는 약 5 내지 약 7, 또는 약 6 내지 약 7, 또는 생리학적 pH이다. 임의의 인큐베이션 기간 동안 목적하는 pH를 달성하고 상기 pH를 유지하기 위해 다양한 완충제가 사용될 수 있다. 예시적 완충제는 보레이트, 포스페이트 (예를 들어, 포스페이트 완충 염수), 카르보네이트, TRIS, 바르비탈, PIPES, HEPES, MES, ACES, MOPS 및 BICINE를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
수성 매질의 사용량은 여러 인자, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 샘플의 성질 및 양, 시약의 성질 및 양, 표적 희유 세포의 안정성, 및 표적 희유 분자의 안정성에 좌우된다. 일부 예에서, 샘플 10 mL 당 수성 매질의 양은 약 5 mL 내지 약 100 mL, 또는 약 5 mL 내지 약 80 mL, 또는 약 5 mL 내지 약 60 mL, 또는 약 5 mL 내지 약 50 mL, 또는 약 5 mL 내지 약 30 mL, 또는 약 5 mL 내지 약 20 mL, 또는 약 5 mL 내지 약 10 mL, 또는 약 10 mL 내지 약 100 mL, 또는 약 10 mL 내지 약 80 mL, 또는 약 10 mL 내지 약 60 mL, 또는 약 10 mL 내지 약 50 mL, 또는 약 10 mL 내지 약 30 mL, 또는 약 10 mL 내지 약 20 mL, 또는 약 20 mL 내지 약 100 mL, 또는 약 20 mL 내지 약 80 mL, 또는 약 20 mL 내지 약 60 mL, 또는 약 20 mL 내지 약 50 mL, 또는 약 20 mL 내지 약 30 mL이다.
표적 희유 분자 중 하나 이상이 세포의 일부인 경우, 수성 매질은 또한 세포의 용해를 위한 용해제를 포함할 수 있다. 용해제는 세포의 멤브레인의 완전성을 붕괴하여 세포의 세포내 내용물을 방출시키는 화합물 또는 화합물들의 혼합물이다. 용해제의 예는 예를 들어 비-이온성 세제, 음이온성 세제, 양쪽이온성 세제, 저 이온 강도 수용액 (저장액), 박테리아성 작용제, 지방족 알데히드, 및 상보체 의존성 용해를 야기하는 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다양한 보조 재료가 희석 매질 중에 존재할 수 있다. 수성 매질 중의 모든 재료는 목적하는 효과 또는 기능을 달성하기에 충분한 농도 또는 양으로 존재한다.
일부 예에서, 표적 희유 분자 중 하나 이상이 세포의 일부인 경우, 샘플의 세포를 고정하는 것이 바람직할 수 있다. 세포의 고정은 세포를 부동화시키고, 세포 구조를 보존하고, 세포를 관심 항원이 특이적 친화성 작용제에 의해 인식될 수 있는 것 및 생체내-유사 조건에서와 같이 세포와 밀접하게 유사한 조건으로 유지시킨다. 고정제의 사용량은, 세포를 보존하지만 후속 검정법에서 잘못된 결과로 이어지지 않는 정도이다. 고정제의 양은 예를 들어 고정제의 성질 및 세포의 성질 중 하나 이상에 좌우될 수 있다. 일부 예에서, 고정제의 양은 약 0.05% 내지 약 0.15%, 또는 약 0.05% 내지 약 0.10%, 또는 약 0.10% 내지 약 0.15% (중량 기준)이다. 세포의 고정을 수행하는 작용제는 예를 들어 가교제, 예컨대 알데히드 시약 (예를 들어, 포름알데히드, 글루타르알데히드 및 파라포름알데히드); 알콜 (예를 들어 C1-C5 알콜, 예컨대 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올); 케톤 (예를 들어 C3-C5 케톤, 예컨대 아세톤)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 명칭 C1-C5 또는 C3-C5란 알콜 또는 케톤 내 탄소 원자의 수를 지칭한다. 고정된 세포에 대해 완충 수성 매질을 사용하여 하나 이상의 세척 단계를 수행할 수 있다.
고정 후 필요하다면, 세포 제제에 대해 투과화를 수행할 수도 있다. 일부 경우, 고정제, 예컨대 알콜 (예를 들어, 메탄올 또는 에탄올) 또는 케톤 (예를 들어, 아세톤) 또한 투과화를 초래하며, 추가의 투과화 단계는 필요하지 않다. 투과화는 세포 멤브레인을 관통하여 관심 표적 분자에 접근하는 것을 제공한다. 투과화제의 사용량은, 세포 멤브레인을 붕괴하고 표적 분자에의 접근을 가능케 하는 정도이다. 투과화제의 양은 투과화제의 성질 및 세포의 성질 및 양 중 하나 이상에 좌우된다. 일부 예에서, 투과화제의 양은 약 0.01% 내지 약 10%, 또는 약 0.1% 내지 약 10%이다. 세포의 투과화를 수행하기 위한 작용제는 알콜 (예를 들어 C1-C5 알콜, 예컨대 메탄올 및 에탄올); 케톤 (예를 들어 C3-C5 케톤, 예컨대 아세톤); 세제 (예컨대, 사포닌, TRITON X-100 (4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜, t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르 완충제, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)로부터 상업적으로 입수가능), 및 TWEEN-20 (폴리소르베이트(Polysorbate) 20, 시그마 알드리치로부터 상업적으로 입수가능))을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 투과화된 세포에 대해 완충 수성 매질을 사용하여 하나 이상의 세척 단계를 수행할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본원 방법에서 사용되는 친화성 작용제는 표적 희유 분자에 대해 특이적인 것이다. 친화성 작용제는 특이적 결합 쌍의 구성원이며, 특이적 결합 쌍의 구성원은 공동 내 또는 표면 상의 영역을 갖는 두 상이한 분자 중 하나이고, 다른 분자에 특이적으로 결합하여 그의 특정 공간 및 극성 조직화와 상보적으로 규정된다. 특이적 결합 쌍의 구성원은 면역학적 쌍, 예컨대 항원-항체 및 합텐-항체의 구성원일 수 있지만, 기타 특이적 결합 쌍은 예를 들어 비오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 효소-기질, 아프타머(aptamer), 핵산 이중나선, IgG-단백질 A, 및 핵산 쌍, 예컨대 DNA-DNA, DNA-RNA를 포함한다. 세포의 경우, 친화성 작용제는, 세포와 회합된 표적 분자 항원에 결합하거나 그를 특이적으로 인식하는 작용제이다.
특이적 결합은, 다른 분자를 실질적으로 덜 인식하는 것과 비교하여 두 상이한 분자 중 하나를 나머지에 비해 특이적으로 인식하는 것을 수반한다. 한편, 비-특이적 결합은, 특정 표면 구조와 비교적 무관한 분자 간 비-공유 결합을 수반한다. 비-특이적 결합은 분자 간 소수성 상호작용을 비롯한 몇몇 인자로부터 초래될 수 있다.
세포를 식별하는 면역검정법에서 사용되는 표적 분자에 대해 특이적인 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 이러한 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술, 예컨대 숙주의 면역화 및 혈청의 수집에 의해 (폴리클로날), 또는 연속 하이브리드 세포주를 제조하고 분비 단백질을 수집함으로써 (모노클로날), 또는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 돌연변이된 이형물을 클로닝 및 발현시켜 적어도 천연 항체의 특이적 결합에 필요한 아미노산 서열에 대해 코딩함으로써 제조될 수 있다.
항체는 완전한 면역글로불린 또는 그의 단편을 포함할 수 있으며, 면역글로불린은 다양한 부류 및 이소유형, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3, IgM 등을 포함한다. 그의 단편은 예를 들어 Fab, Fv 및 F(ab')2, 및 Fab'를 포함할 수 있다. 또한, 특정 분자에 대한 결합 친화성이 유지되는 한 적절한 경우, 면역글로불린 또는 그의 단편의 응집체, 중합체 및 접합체가 사용될 수 있다.
폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 한 접근법에서 모노클로날 항체는 체세포 혼성화 기술에 의해 수득된다. 모노클로날 항체는 문헌 [Koehler and Milstein, Nature 265:495-497, 1975]의 표준 기술에 따라 생성될 수 있다. 모노클로날 항체 기술에 대한 개관은 문헌 [Lymphocyte Hybridomas, ed. Melchers, et al. Springer-Verlag (New York 1978)], [Nature 266: 495 (1977)], [Science 208: 692 (1980)] 및 [Methods of Enzymology 73 (Part B): 3-46 (1981)]에서 찾아볼 수 있다. 일반적으로, 모노클로날 항체는 공지된 기술, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 크로마토그래피, 예를 들어 DEAE 크로마토그래피, ABx 크로마토그래피, 및 HPLC 크로마토그래피; 및 여과에 의해 정제될 수 있다.
친화성 작용제는 표적 핵산에 상보적인 핵산 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드)일 수 있다. 폴리뉴클레오티드란, 임의의 길이의 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 그의 유사체의 중합체 형태를 지칭한다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비-제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 구역, 연결부 분석으로부터 규정된 유전자좌들 (유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 개질 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 중합체의 어셈블리 전후에 뉴클레오티드 구조에 대한 개질이 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 구성요소가 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예컨대 표지 구성요소와 접합에 의해 추가로 개질될 수 있다.
친화성 작용제는, MS 표지가 표적 희유 분자의 군집 중 하나의 표적 희유 분자에 상응하는 경우 MS 표지 전구체로부터의 MS 표지의 형성을 용이하게 하는 MS 표지 전구체 또는 변경 작용제를 포함한다. MS 표지는 표적 희유 분자의 군집 중 하나를 희유 분자의 다른 군집으로부터 구별하는 것을 가능케 한다. 아울러, MS 표지의 선택을 수행하여 MS에 의한 분석에서 중첩 질량을 피함으로써, MS 분석에서의 바탕 간섭을 피하고 멀티플렉싱을 가능케 할 수 있다.
어구 "질량 분광법 표지" 또는 "MS 표지"란 바람직하게는 3 kDA 미만의 고유 질량을 갖는 하나의 또는 소정 군의 분자를 지칭하여, 각각의 고유 질량은 표적 희유 분자의 각각의 상이한 군집의 존재 및/또는 양을 결정하는데 사용되고 그에 상응한다. MS 표지는 규정된 질량의 분자이고, 예를 들어 폴리펩티드, 중합체, 지방산, 탄수화물, 유기 아민, 핵산, 및 유기 알콜을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 그 질량은 예를 들어 치환 및 쇄 크기에 의해 다양할 수 있다. 중합체 재료의 경우, 반복 단위 수는 질량이 샘플로부터의 바탕 질량과 중첩되지 않는 영역에 있도록 조절된다. 어구 "MS 표지"는 또한, 친화성 입자에 의해 포획되는 분석물, 유도체화된 분석물 (유도체화가 분석물을 이온성이 되도록 하는 경우), 및 이온 형태의 비-유도체화된 분석물을 포함한다. MS 표지는 이온화 시 단편화 및 구조로 인해 고유 질량 패턴을 생성한다.
용어 "분석물"이란 검출하고자 하는 분자 또는 분자들을 지칭한다. 예시적 분석물은, 제한이 아닌 예시로서, 약물, 대사물질, 살충제 및 오염물질을 포함한다. 대표적인 분석물은, 제한이 아닌 예시로서, 알칼로이드, 스테로이드, 락탐, 아미노알킬벤젠, 벤즈헤테로시클릭, 퓨린, 마리화나 유래 약물, 호르몬, 폴리펩티드, 예컨대 단백질, 면역억제제, 비타민, 프로스타글란딘, 트리시클릭 항우울제, 항신생물제, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오시드 및 폴리뉴클레오티드, 잡다한 개별 약물, 예컨대 메타돈, 메프로바메이트, 세로토닌, 메페리딘, 리도카인, 프로카인아미드, 아세틸프로카인아미드, 프로프라놀롤, 그리세오풀빈, 발프로산, 부티로페논, 항히스타민제, 클로람페니콜, 항콜린성 약물, 및 모든 상기의 대사물질 및 유도체를 또한 포함한다. 질환 상태 관련 대사물질, 아미노글리코시드, 예컨대 겐타마이신, 카나마이신, 토브라마이신 및 아미카신, 및 살충제, 예컨대 폴리할로겐화 바이페닐, 포스페이트 에스테르, 티오포스페이트, 카르바메이트 및 폴리할로겐화 술펜아미드 및 그의 대사물질 및 유도체가 또한 포함된다. 용어 "분석물"은 또한 폴리사카라이드 및 핵산, 폴리펩티드 및 단백질의 둘 이상의 조합을 포함한다. 이러한 조합은 예를 들어 박테리아, 바이러스, 염색체, 유전자, 미토콘드리아, 핵 및 세포 멤브레인의 구성요소를 포함한다. 단백질 분석물은 예를 들어 면역글로불린, 사이토킨, 효소, 호르몬, 암 항원, 영양 마커 및 조직 특이적 항원을 포함한다. 이러한 단백질은, 제한이 아닌 예시로서, 프로타민, 히스톤, 알부민, 글로불린, 경단백질, 인단백질, 점액단백질, 색단백질, 지단백질, 핵단백질, 당단백질, T-세포 수용체, 프로테오글리칸, HLA, 비분류 단백질, 예를 들어 소마토트로핀, 프로락틴, 인슐린, 펩신, 단백질 (인간 플라즈마에서 발견되는 것), 혈액 응고 인자, 단백질 호르몬, 예컨대 여포-자극 호르몬, 황체형성 호르몬, 루테오트로핀, 프로락틴, 융모 고나도트로핀, 조직 호르몬, 사이토킨, 암 항원, 예컨대 PSA, CEA, α-태아단백질, 산 포스파타제, CA19.9, CA15.3 및 CA125, 조직 특이적 항원, 예컨대 알칼리성 포스파타제, 미오글로빈, CPK-MB 및 칼시토닌, 및 펩티드 호르몬을 포함한다. 기타 관심 중합체 재료는 뮤코폴리사카라이드 및 폴리사카라이드이다. 상기 나타낸 바와 같이, 용어 분석물은 예를 들어 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 분석물, 예컨대 m-RNA, r-RNA, t-RNA, DNA 및 DNA-RNA 이중나선을 추가로 포함한다.
"MS 표지 전구체"는 변경 작용제의 작용에 의해 MS 표지를 생성하는 임의의 분자이다. MS 표지 전구체는 자체적으로, 변경 작용제의 작용을 통해, 예를 들어 절단에 의해, 모이어티와의 반응에 의해, 유도체화에 의해, 또는 분자, 전하 또는 원자의 부가 또는 차감에 의해 또는 상기의 둘 이상의 조합에 의해 또 다른 MS 표지로 전환되는 MS 표지일 수 있다.
용어 "변경 작용제"란 MS 표지 전구체를 변경시키는 능력을 갖는 물질을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 변경 작용제는, 약 1 Da 내지 약 3 kDa의 범위, 또는 약 1 Da 내지 약 50 Da의 범위, 또는 약 50 Da 내지 약 150 Da의 범위, 또는 약 150 Da 내지 약 700 Da의 범위, 또는 약 700 Da 내지 약 3 kDa의 범위의 고유 질량을 갖는 MS 표지를 달성하도록 MS 표지 전구체와 상호작용할 수 있다. 일부 예에서, MS 표지의 고유 질량은 약 3 kDa 미만이다. MS 표지 전구체는 결합 파단에 의해 변경되어 중성, 음 또는 양의 이온, 또는 라디칼을 형성할 수 있다. 변경 작용제에 의한 MS 표지 전구체의 변경은 MS 표지 전구체에의 원자, 전하 또는 전자의 부가, 또는 그로부터의 원자, 전하 또는 전자의 차감에 의한 것, 또는 MS 표지 전구체 내의 결합 절단 또는 결합 형성에 의한 것일 수 있다. 변경 작용제는 화학적 작용제, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 촉매 (예를 들어, 효소 (유사효소(pseudoenzyme) 포함) 및 금속), 산화제, 환원제, 산, 염기, 치환 반응 또는 교체 반응을 촉진하는 작용제; 및 이온화제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 예에서, 변경 작용제는 예를 들어 MS 표지 전구체와 모이어티의 반응을 촉진하여 MS 표지를 형성함으로써 MS 표지 전구체로부터의 MS 표지의 형성을 용이하게 한다. 일부 예에서, 변경 작용제는 예를 들어 MS 표지 전구체로부터의 MS 표지의 방출을 촉진함으로써 MS 표지 전구체로부터의 MS 표지의 형성을 용이하게 한다.
MS 표지 전구체의 성질은 예를 들어 MS 표지의 성질, 사용된 MS 방법의 성질, 사용된 MS 검출기의 성질, 표적 희유 분자의 성질, 친화성 작용제의 성질, 사용된 임의의 면역검정법의 성질, 샘플의 성질, 사용된 임의의 완충제의 성질, 분리 성질 중 하나 이상에 좌우될 수 있다. 일부 예에서, MS 표지 전구체는 질량이 치환 및/또는 쇄 크기에 의해 다양할 수 있는 분자이다. MS 표지 전구체로부터 생성된 MS 표지는 분석하고자 하는 샘플에 존재하여서는 안되는 규정된 질량의 분자이다. 아울러, MS 표지는 MS 검출기에 의해 검출되는 범위에 있어야 하고, 중첩 질량을 가져서는 안되며, 1차 질량에 의해 검출가능하여야 한다. 제한이 아닌 예시로서, 본 발명의 방법에서 사용되는 MS 표지 전구체의 예는, 제한이 아닌 예시로서, 폴리펩티드, 유기 및 무기 중합체, 지방산, 탄수화물, 시클릭 탄화수소, 지방족 탄화수소, 방향족 탄화수소, 유기 카르복실산, 유기 아민, 핵산, 유기 알콜 (예를 들어, 알킬 알콜, 아실 알콜, 페놀, 폴리올 (예를 들어, 글리콜), 티올, 에폭시드, 1차, 2차 및 3차 아민, 인돌, 3차 및 4차 암모늄 화합물, 아미노 알콜, 아미노 티올, 페놀성 아민, 인돌 카르복실산, 페놀성 산, 비닐로구스산, 카르복실산 에스테르, 포스페이트 에스테르, 카르복실산 아미드, 폴리아미드 및 폴리에스테르로부터의 카르복실산, 히드라존, 옥심, 트리메틸실릴 에놀 에테르, 아세탈, 케탈, 카르바메이트, 우레아, 구아니딘, 이소시아네이트, 술폰산, 술폰아미드, 술포닐우레아, 술페이트 에스테르, 모노글리세리드, 글리세롤 에테르, 스핑고신 염기, 세라민, 세레브로사이드, 스테로이드, 프로스타글란딘, 탄수화물, 뉴클레오시드 및 치료 약물을 포함한다.
MS 표지 전구체는 1 내지 약 100,000개의 MS 표지, 또는 약 10 내지 약 100,000개의 MS 표지, 또는 약 100 내지 약 100,000개의 MS 표지, 또는 약 1,000 내지 약 100,000개의 MS 표지, 또는 약 10,000 내지 약 100,000개의 MS 표지를 포함할 수 있다. MS 표지 전구체는 단백질, 폴리펩티드, 중합체, 입자, 탄수화물, 핵산, 지질, 또는 부착에 의해 MS 표지의 다중 반복 단위를 포함할 수 있는 다른 거대분자로 구성될 수 있다. 다중 MS 표지는 모든 MS 표지 전구체가 많은 MS 표지를 발생할 수 있기 대문에 증폭을 가능케 한다.
폴리펩티드 MS 표지 전구체로, 예를 들어, 폴리펩티드의 쇄 길이를 조절하여 바탕 피크 없이 질량 구역 내의 MS 표지를 얻을 수 있다. 아울러, MS 표지는, 시험된 샘플에 존재하지 않는 고유 질량을 갖는 MS 표지 전구체로부터 생성될 수 있다. 폴리펩티드 MS 표지 전구체는 추가의 아미노산 또는 유도체화된 아미노산을 포함할 수 있으며, 이는 방법이 멀티플렉싱되어 한 번에 1개 초과의 결과를 수득하는 것을 가능케 한다. 폴리펩티드 MS 표지 전구체의 예는 예를 들어 폴리글리신, 폴리알라닌, 폴리세린, 폴리트레오닌, 폴리시스테인, 폴리발린, 폴리류신, 폴리이소류신, 폴리메티오닌, 폴리프롤린, 폴리페닐알라닌, 폴리티로신, 폴리트립토판, 폴리아스파르트산, 폴리글루탐산, 폴리아스파라진, 폴리글루타민, 폴리히스티딘, 폴리리신 및 폴리아르기닌을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 아미노산 또는 유도체화된 아미노산의 혼합물로 구별되는 폴리펩티드 MS 표지 전구체는 라디칼이 존재하거나 부재하는 짝수 또는 홀수의 전자 이온을 갖는 질량을 발생시킨다. 일부 예에서, 폴리펩티드는 촉매작용에 의해 개질될 수 있을 것이다. 예를 들어, 제한이 아닌 예시로서, 페놀 및 방향족 아민을 촉매로서 퍼옥시다제 효소를 사용하여 폴리트레오닌에 부가할 수 있다. 또 다른 예에서, 제한이 아닌 예시로서, 전자를 촉매로서 퍼옥시다제 효소를 사용하여 방향족 아민에 이송할 수 있다. 또 다른 예에서, 제한이 아닌 예시로서, 포스페이트를 촉매로서 포스파타제를 사용하여 유기 포스페이트로부터 제거할 수 있다.
또 다른 예에서, 제한이 아닌 예시로서, 유도체화제를 모이어티로서 사용하여 MS 표지 전구체로부터 MS 표지를 생성한다. 예를 들어, MS 표지 전구체로부터 디니트로페닐 및 다른 니트로페닐 유도체가 형성될 수 있다. 그 밖의 예는, 제한이 아닌 예시로서, 에스테르화, 아실화, 실릴화, 보호 알킬화, 쉬프(Schiff) 염기와 같은 케톤-염기 축합물에 의한 유도체화, 고리화, 형광 유도체 및 무기 음이온의 형성을 포함한다. 유도체화 반응은 MS 분석 전이지만 친화성 반응 후에 마이크로반응으로 발생할 수 있거나, 또는 친화성 시약에 접합된 MS 표지 전구체를 생성하는데 사용될 수 있다.
일부 예에서, MS 표지 전구체는 예를 들어 동위원소, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 2H, 13C 및 18O를 포함할 수 있으며, 이는 MS 표지 전구체에서 유래된 MS 표지에 남아있다. MS 표지는 이온화 후 1차 질량 또는 2차 질량에 의해 검출될 수 있다. 일부 예에서, MS 표지 전구체는 결합 절단을 야기하도록 비교적 높은 전위를 갖는 것, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 알킬화 아민, 아세탈, 1차 아민 및 아미드이며, 이 경우 MS 표지는 라디칼이 존재하거나 부재하는 짝수 또는 홀수의 전자 이온을 갖는 질량을 생성할 수 있다. 폴리펩티드의 선택은 고유한 MS 스펙트럼 서명을 생성할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 변경 작용제는 효소 (유사효소 포함)일 수 있다. 일부 예에서, 촉매작용은, 예를 들어 실리카겔, 숯, DEAE-셀룰로스, DEAE-SEPHADEX (가교된 덱스트란 겔, 시그마 알드리치로부터 상업적으로 입수가능), 셀룰로스 시트레이트, 카올리나이트, 셀룰로스 포스페이트, 산 점토, AMBERLITE XE-97 (카르복실 양이온 교환 수지, 롬 앤드 하스(Rohm & Haas) 제조), 카르복시메틸 셀룰로스, 유리, 석영, 다우엑스(dowex)-50, 전분 겔, 폴리아크릴아미드 겔, 폴리아미노산, 또는 아미노벤질 셀룰로스로 부동화된 수불용성 효소 유도체에 의해 발생할 수 있다. 가교제는 효소를 부동화시키는데 사용될 수 있다. 이러한 가교제는 예를 들어 글루타르알데히드, 디메틸 아디프이미데이트, 카르보디이미드, 말레산 무수물, MDA 메틸렌디아닐린, 히드라지드, 및 아실 아지드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 예에서, 본원에 기재된 원리에 따른 목적상 효소는, 효소 기질 (예컨대, MS 표지 전구체)로서, 비전환된 기질의 존재 하 질량 분광계의 질량 검출기에 의해 검출되는 MS 표지로 전환될 수 있는 높은 턴오버(turnover) 속도를 갖는 임의의 효소이다. 효소는 시험된 샘플에 있으면 안되거나, 또는 샘플에 존재하는 경우 시험 전 샘플로부터 제거되어야 한다. 이와 같은 목적에 적합한 효소의 예는 예를 들어 포스파타제 (예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 지질 포스파타제, 티로신 포스파타제, 세린 포스파타제, 트레오닌 포스파타제, 및 히스티딘 포스파타제); 옥시다제 (예를 들어, 호스래디시(horse radish) 퍼옥시다제, 구리 아민 옥시다제, D-아미노산 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 플라즈마 아민 옥시다제, 트립토판 퍼옥시다제, 유리카제 옥시다제, 및 크산틴 옥시다제); β-갈락토시다제; 트랜스퍼라제 (예를 들어, D-알라닌 트랜스퍼라제, 글리코실 트랜스퍼라제, 아실 트랜스퍼라제, 알킬 트랜스퍼라제, 아릴 트랜스퍼라제, 단일 탄소 트랜스퍼라제, 케톤 트랜스퍼라제, 알데히드 트랜스퍼라제, 질소 트랜스퍼라제, 인 트랜스퍼라제, 황 트랜스퍼라제, 및 펜토실 트랜스퍼라제); 펩티다제 (예를 들어, 펩신, 파파인, 렌닌 (키모신), 레닌, 트롬빈, 트립신, 매트릭스 메탈로펩티다제, 카테스핀, 시스테인 프로테아제, 및 카르복시펩티다제); 알돌라제 (예를 들어, 카르복실 알돌라제, 알데히드 알돌라제, 옥소산, 트립토파나제); 지방산 효소 (예를 들어, 지방산 아민 히드롤라제, 지방산 신타제, 및 콜린 아세틸트랜스퍼라제), 및 상기의 둘 이상의 조합 (예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 산 포스파타제, 옥시다제, β-갈락토시다제, 퍼옥시다제, 아실라제, 아스파라기나제, 카탈라제, 키모트립신, 아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 옥시다제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 인버타제, 리파제, 포스포글루코뮤타제, 리보뉴클레아제, 아세틸콜린에스터라제, 알콜 데하이드로게나제, 알돌라제, 콜린에스터라제, 시트레이트 신테타제, 우레아제, 아밀글루코시다제, 카르복시펩티다제, 콜린에스터라제, 루시퍼라제, 리보뉴클레아제, 피루베이트 키나제, 및 서브틸로펩티다제 중 둘 이상)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
효소에 대한 기질은, 기질 상의 효소의 작용에 의해 방출되는 MS 표지를 포함하는 MS 표지 전구체이다. 효소 기질의 일부일 수 있는 상기와 같은 MS 표지는, 제한이 아닌 예시로서, 예를 들어 페놀 (예를 들어, p-니트로페닐 포스페이트, p-니트로페닐-β-D-갈락토시드, 아미노산, 펩티드, 탄수화물 (6-포스포-D-글루코네이트), 지방산 (아세틸-CoA), 알킬 아민, 글리세롤과 같은 기질 유래); 및 나프톨 (예를 들어, p-니트로나프틸 포스페이트, p-니트로-나프틸-β-D-갈락토시드와 같은 기질 유래)을 포함한다.
친화성 작용제에 부착된 모이어티로부터 MS 표지를 방출시키는데 사용될 수 있는 금속은 예를 들어 전이 금속 (예를 들어, 팔라듐, 백금, 금, 루테늄, 로듐 또는 이리듐), 킬레이트화된 금속 (예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세테이트 (EDTA), N-(2-히드록시에틸)-에틸렌디아민트리아세트산 (HEDTA), 또는 트란스-1,2-시클로헥산디아민테트라아세트산 (CDTA) 등에 의해 착물화된 철, 구리, 코발트, 마그네슘), 금속 산화제 (예를 들어, 나트륨 하이포클로라이트, 칼륨 퍼아이오데이트, 은 산화물, 크롬산, 칼륨 퍼망가네이트, 및 나트륨 퍼보레이트) 및 금속 환원제 (예를 들어, 리튬 알루미늄 하이드라이드, 나트륨 보로하이드라이드, 나트륨 아스코르베이트, 포스파이트, 및 나트륨)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
MS 표지가 직접 검출될 수 있거나 또는 방출된 MS 표지가 또 다른 화합물과 추가로 반응하여 유도체 MS 표지를 형성할 수 있으며, 이는 MS 기술에 의해 검출된다. 유도체 MS 표지는, 화합물이 MS 기술에 의해 또한 검출가능한 경우 MS 표지 전구체로부터 수득된 MS 표지로부터 형성되는 화합물이다. 유도체 MS 표지를 형성하는 이와 같은 접근법은 본원에 기재된 원리에 따른 방법의 멀티플렉싱 능력을 추가로 증강시킨다. 예를 들어, 방출된 페놀 또는 나프톨은 퍼옥시다제의 존재 하에 방향족 아민에 커플링될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,182,213호 참조, 특허의 관련 개시내용은 본원에 참조로 포함됨). 한 예에서, 방출된 나프톨은 알칼리성 매질 중의 과산화 활성 물질의 존재 하에 α-페닐렌디아민 디히드로클로라이드와 같은 페닐렌디아민과 커플링되어 유도체 MS 표지를 생성한다. 멀티플렉싱은 상이한 나프톨 및/또는 상이한 페닐렌디아민을 사용하여 달성될 수 있다.
내부 표준은 질량 스펙트럼 분석의 중요한 측면이다. 일부 예에서, 희유 표적 분자의 검출에 사용되는 MS 표지에 추가로 (내부 표준으로서) 측정될 수 있는 제2 질량 표지가 부가될 수 있다. 내부 표준은 질량에서 약간의 이동이 있는 MS 표지와 유사한 구조를 갖는다. 추가의 아미노산 또는 유도체화된 아미노산을 포함하는 내부 표준이 제조될 수 있다. 대안적으로, 내부 표준은 예를 들어 동위원소 표지, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 2H (D), 13C 및 18O를 혼입함으로써 제조될 수 있다. MS 동위원소 표지는 천연 물질보다 더 높은 질량을 갖는다. 예를 들어, 동위원소 표지된 MS 표지, 예를 들어 글리세롤-C-d7, 나트륨 아세테이트-C-d7, 나트륨 피루베이트-C-d7, D-글루코스-C-d7, 중수소화 글루코스, 및 덱스트로스-C-d7은 각각 글리세롤, 나트륨 아세테이트, 나트륨 피루베이트, 글루코스 및 덱스트로스에 대한 내부 표준으로서의 기능을 할 것이다.
MS 표지 전구체 또는 변경 작용제는 연결기의 중개를 통해 또는 결합에 의해 직접 공유적으로 친화성 작용제에 부착될 수 있다 (개질된 친화성 작용제가 얻어짐). 일부 실시양태에서, 개질된 친화성 작용제의 제조는, 직접 결합에 의해 친화성 작용제에 MS 표지 전구체 또는 변경 작용제를 부착시키기에 적합한 관능기를 사용함으로써 수행될 수 있다. 사용되는 관능기의 성질은, 예를 들어, MS 표지 전구체의 성질, 변경 작용제의 성질, 및 친화성 작용제의 성질, 및 친화성 작용제의 일부일 수 있는 캐리어 입자 및 표지 입자와 같은 하나 이상의 상이한 입자의 성질 중 하나 이상에 좌우된다. 다수의 적합한 관능기가 아미노 기 및 알콜에의 부착에 이용가능하며; 이러한 관능기는 예를 들어 활성화된 에스테르, 예컨대 카르복실산 에스테르, 이미드산 에스테르, 술폰산 에스테르 및 포스페이트 에스테르; 활성화된 니트라이트; 알데히드; 케톤; 및 알킬화제를 포함한다.
연결기는, 통상 탄소, 산소, 황, 질소 및 인, 대개 탄소 및 산소로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된 1 내지 약 60개 또는 그 초과의 원자, 또는 1 내지 약 50개 원자, 또는 1 내지 약 40개 원자, 또는 1 내지 30개 원자, 또는 약 1 내지 약 20개 원자, 또는 약 1 내지 약 10개 원자의 쇄일 수 있다. 연결기 내 헤테로원자의 수는 약 0 내지 약 8개, 약 1 내지 약 6개, 또는 약 2 내지 약 4개의 범위일 수 있다. 연결기의 원자는 예를 들어 알킬, 아릴, 아르알킬, 히드록실, 알콕시, 아릴옥시 또는 아르알콕시 기의 형태에서 수소 이외의 원자, 예컨대 탄소, 산소 및 질소 중 하나 이상으로 치환될 수 있다. 보통, 특정 연결기의 길이는 합성의 편의를 제공하도록 임의적으로 선택될 수 있되, 단, 연결된 분자가 본원에 개시된 방법과 관련된 그의 기능을 수행하는 능력을 갖는 연결기에 의해 극미한 간섭이 야기된다.
연결기는 지방족 또는 방향족일 수 있다. 헤테로원자가 존재하는 경우, 산소는 통상, 탄소, 황, 질소 또는 인에 결합된 옥시 또는 옥소로서 존재할 것이고; 황은 통상 티오에테르 또는 티오노로서 존재할 것이고; 질소는 통상, 대개 탄소, 산소, 황 또는 인에 결합된 니트로, 니트로소 또는 아미노로서 존재할 것이고; 인은 통상, 포스포네이트 및 포스페이트 모노- 또는 디에스테르로서 대개 탄소, 황, 산소 또는 질소에 결합될 것이다. 연결기 내 존재하는 관능기는 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 티오아미드, 에테르, 우레아, 티오우레아, 구아니딘, 아조 기, 티오에테르, 카르복실레이트 등을 포함할 수 있다. 연결기는 또한 거대분자, 예컨대 폴리사카라이드, 펩티드, 단백질, 뉴클레오티드, 및 덴드리머일 수 있다.
일부 실시양태에서, 경우에 따라 MS 표지 전구체, 또는 변경 작용제, 및 친화성 작용제는 비-공유적으로 함께 연결될 수 있다. 결합 쌍, 대개 특이적 결합 쌍의 구성원이 사용되며, 이 경우 어느 한 구성원은 친화성 작용제에 연결되고 나머지 구성원은 MS 표지 전구체 또는 변경 작용제에 연결된다. 결합 쌍 구성원의 결합은 친화성 작용제 및 MS 표지 전구체 또는 변경 작용제의 비-공유 연결을 초래한다. 결합 쌍 구성원은 MS 표지 전구체, 또는 변경 작용제, 및 친화성 작용제 중의 하나 또는 둘다에 직접 연결되거나, 또는 연결기의 중개를 통해 간접 연결될 수 있으며, 그 성질은 상기 논의되어 있다. 일부 예에서, 특이적 결합 쌍의 구성원은, 제한이 아닌 예시로서, 예를 들어 아비딘 (스트렙트아비딘)-비오틴 결합, 플루오레세인 (FITC) 및 FITC에 대한 항체, 로다민 (텍사스 레드(Texas red)) 및 로다민에 대한 항체, 디기토닌 (DIG) 및 DIG에 대한 항체, 비-인간 종 항체 (예를 들어, 염소, 토끼, 마우스, 닭, 양) 및 항-종(anti-species) 항체와 같이 비교적 높은 결합 상수를 갖는다.
개질된 친화성 작용제는 각각의 상이한 친화성 작용제를 별도의 개별 반응으로 MS 표지 전구체 또는 변경 작용제에 연결한 다음, 개질된 친화성 작용제를 조합하여 개질된 친화성 작용제를 포함하는 혼합물을 형성함으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 상이한 친화성 작용제를 조합할 수 있고, 조합물에 대해, 친화성 작용제를 MS 표지 전구체 또는 변경 작용제에 연결하는 반응을 수행할 수 있다. 이는 방법이 한 번에 1개 초과의 결과를 위해 멀티플렉싱되는 것을 가능케 한다.
본 발명의 방법에 사용되는 각각의 상이한 개질된 친화성 작용제의 양은 예를 들어 표적 희유 분자의 각각의 상이한 군집의 성질 및 전위량, MS 표지의 성질, 친화성 작용제의 성질, 세포의 성질 (존재하는 경우), 입자의 성질 (이용되는 경우), 및 블로킹제의 양 및 성질 (이용되는 경우) 중 하나 이상에 좌우된다. 일부 예에서, 각각의 상이한 개질된 친화성 작용제의 사용량은 약 0.001 ㎍/μL 내지 약 100 ㎍/μL, 또는 약 0.001 ㎍/μL 내지 약 80 ㎍/μL, 또는 약 0.001 ㎍/μL 내지 약 60 ㎍/μL, 또는 약 0.001 ㎍/μL 내지 약 40 ㎍/μL, 또는 약 0.001 ㎍/μL 내지 약 20 ㎍/μL, 또는 약 0.001 ㎍/μL 내지 약 10 ㎍/μL, 또는 약 0.5 ㎍/μL 내지 약 100 ㎍/μL, 또는 약 0.5 ㎍/μL 내지 약 80 ㎍/μL, 또는 약 0.5 ㎍/μL 내지 약 60 ㎍/μL, 또는 약 0.5 ㎍/μL 내지 약 40 ㎍/μL, 또는 약 0.5 ㎍/μL 내지 약 20 ㎍/μL, 또는 약 0.5 ㎍/μL 내지 약 10 ㎍/μL이다.
사용되는 변경 작용제의 수는 MS 표지 전구체의 성질, 변경 작용제의 성질 (변경 작용제가 매질에 없거나 또는 개질된 친화성 작용제의 일부인지와는 관계없이) 및 사용된 상이한 친화성 시약의 성질 및 수 중 하나 이상에 따라, MS 표지 전구체 당 하나, 또는 두 MS 표지 전구체 당 하나, 또는 세 MS 표지 전구체 당 하나, 내지는 사용된 모든 MS 표지 전구체 당 하나일 수 있다. 예를 들어, 각각의 MS 표지 전구체가 상이한 MS 표지의 친화성 작용제에의 불안정한 에스테르 또는 불안정한 아미드 연결부를 포함하는 경우, 디술피드, 에스테르 또는 아미드 연결부의 가수분해를 초래하는 단일 변경 작용제를 사용하여 상이한 MS 표지를 얻을 수 있다. 다른 예에서, 한 변경 작용제, 또는 MS 표지 전구체의 수보다 더 적은 변경 작용제를 이용하는 것을 사용할 수 있다. 또 다른 예에서, 사용된 각각의 상이한 유형의 친화성 작용제에 대한 MS 표지를 생성하기 위해 상이한 변경 작용제를 사용할 수 있다.
수성 매질 중의 개질된 친화성 작용제 및 샘플 (임의로 농축됨)을 포함하는 조합은 세포 또는 입자 시약 상의 표적 희유 분자에의 개질된 친화성 작용제의 결합을 위해 소정 온도에서 소정 기간 동안 방치함으로써 처리된다. 변경 작용제를 포함하는 각각의 개질된 친화성 작용제에 있어서, 변경 작용제가 작용하는 MS 표지 전구체가 상기 조합에 포함되고, 여기서 MS 표지 전구체는 MS 표지로 전환된다. 일부 예에서, 추가의 모이어티가 부가되며, 이 경우 변경 작용제는 MS 표지를 얻기 위한 MS 표지 전구체와 모이어티의 반응을 용이하게 한다. 일부 예에서, 개질된 친화성 작용제는 MS 표지 전구체를 포함하고, 변경 작용제는 매질 중의 비결합된 물질로서 상기 조합에 포함된다. 본 예에서, 변경 작용제는 친화성 작용제의 MS 표지 전구체에 작용하여 MS 표지를 생성한다. 일부 예에서, 친화성 작용제로부터 MS 표지 전구체를 포함하는 실체를 방출시키는 제1 변경 작용제를 사용한 후, MS 표지 전구체로부터의 MS 표지의 형성을 용이하게 하기 위해 제2 변경 작용제를 사용한다.
이와 같은 처리의 온도 및 기간은 예를 들어 샘플의 성질, 표적 희유 분자의 성질, 비-희유 분자의 성질, 개질된 친화성 작용제의 성질, MS 표지 전구체의 성질, 및 변경 작용제의 성질에 좌우된다. 일부 예에서, 통상 적당한 온도 및 대개 일정한 온도, 바람직하게는 실온이 사용된다. 소정 기간의 방치 동안 온도는 통상 예를 들어 약 5℃ 내지 약 99℃ 또는 약 15℃ 내지 약 70℃, 또는 약 20℃ 내지 약 45℃의 범위이다. 방치 기간은 예를 들어 약 0.2초 내지 약 24시간, 또는 약 1초 내지 약 6시간, 또는 약 2초 내지 약 1시간, 또는 약 1 내지 약 15분이다. 시간 범위는 예를 들어 매질의 온도 및 다양한 시약의 결합 속도에 좌우된다.
표적 희유 분자에 결합되는 개질된 친화성 작용제 (즉, 변경 작용제가 작용한 친화성 작용제)는 임의로, 표적 분자에 결합되지 않는 개질된 친화성 작용제로부터 분리된다. 일부 예에서, 이와 같은 분리는 샘플 내 비-희유 분자의 수를 감소시키는 것을 수반한다.
처리된 샘플과 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 접촉은 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 표면 상의 표적 희유 세포 또는 입자-결합된 표적 희유 분자의 체류를 달성하기에 충분한 기간 동안 계속되어, 상기 논의된 바와 같은 표적 희유 세포 또는 입자-결합된 표적 희유 분자의 상이한 군집을 갖는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 표면이 수득된다. 시간 범위는 예를 들어 표적 희유 세포 또는 입자-결합된 표적 희유 분자의 상이한 군집의 성질 및 크기, 다공성 매트릭스의 성질, 다공성 매트릭스의 세공의 크기, 다공성 매트릭스 상의 혈액 샘플에 인가된 진공의 수준, 여과되는 부피, 및 다공성 매트릭스의 표면적 중 하나 이상에 좌우될 수 있다. 일부 예에서, 접촉 기간은 예를 들어 약 1분 내지 약 1시간, 약 5분 내지 약 1시간, 또는 약 5분 내지 약 45분, 또는 약 5분 내지 약 30분, 또는 약 5분 내지 약 20분, 또는 약 5분 내지 약 10분, 또는 약 10분 내지 약 1시간, 또는 약 10분 내지 약 45분, 또는 약 10분 내지 약 30분, 또는 약 10분 내지 약 20분이다.
제1 변경 작용제가 MS 표지 전구체로부터의 MS 표지의 형성을 용이하게 하지 않는 경우 보유액은 제2 변경 작용제로 처리되며, 이는 친화성 작용제로부터 MS 표지 전구체로부터의 MS 표지의 형성을 용이하게 한다.
보유액에 대해 MS 분석을 수행하여 각각의 상이한 MS 표지의 존재 및/또는 양을 결정한다. 각각의 상이한 MS 표지의 존재 및/또는 양은 표적 희유 세포 및/또는 입자-결합된 표적 희유 분자의 각각의 상이한 군집의 존재 및/또는 양과 관련된다.
MS 분석은 정확한 식별 및 측정을 위해 분자의 질량-대-전하 비 (m/z)를 결정한다. MS 방법은 분자를, 예를 들어 대기압 화학적 이온화 (APCI), 전기분무 이온화 (ESI), 유도성 전기분무 이온화 (iESI), 화학적 이온화 (CI), 및 전자 이온화 (EI), 고속 원자 타격 (FAB), 장탈착/장이온화 (FC/FI), 열분무 이온화 (TSP), 나노분무 이온화를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 여러 기술에 의해 입자로서의 질량으로 이온화할 수 있다. 질량은, 제한이 아닌 예시로서, 타임-오브-플라이트(Time-of-Flight, TOF), 이온 트랩, 사중극자 질량 필터, 섹터 질량 분석, 다중 반응 모니터링 (MRM), 및 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 (FTICR)을 포함하는 여러 기술에 의해 질량 검출기에서 여과 및 분리된다. MS 방법은 예를 들어 마이크로채널 판, 전자 체배기(multiplier), 또는 패러데이(Faraday) 컵을 사용하여 분자를 검출한다. MS 방법은 탠덤(tandem) MS/MS 방법으로서 반복될 수 있고, 여기서 제1 MS로부터의 하전된 질량 입자는 제2 MS로 분리된다.
질량 분석기는 예를 들어 사중극자, 타임-오브-플라이트 (TOF) 분석기, 자성 섹터, 푸리에 변환 이온 트랩, 및 사중극자 이온 트랩을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 탠덤 (MS-MS) 질량 분광계는 1개 초과의 분석기를 갖는 기구이다. 탠덤 질량 분광계는 예를 들어 사중극자-사중극자, 자성 섹터-사중극자, 사중극자-타임-오브-플라이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 질량 분광계의 검출기는, 제한이 아닌 예시로서, 예를 들어 광체배기, 전자 체배기, 또는 마이크로-채널 판일 수 있다.
질량 분광법에 의한 분석 후, 각각의 상이한 질량 분광법 표지의 존재 및/또는 양은 표적 희유 세포 및/또는 입자-결합된 표적 희유 분자의 각각의 상이한 군집의 존재 및/또는 양과 관련된다. MS 표지 및 표적 분자 간의 관계는 표적 분자에 대해 특이적인 사용되는 개질된 친화성 작용제에 의해 확립된다. 샘플 내 표적 희유 분자의 양 및 MS 표지로부터의 신호의 양 간의 관계를 확립하기 위해 캘리브레이터(calibrator)가 사용된다. 샘플에 대해 추가의 분석을 수행할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 1개 초과의 세공을 포함할 수 있고, 전기장은 활성화되어 개별 세공으로부터 액적을 선택적으로 방출시킬 수 있다. 방출된 액적에 대해 질량 분광법 분석을 수행하여, 특정 MS 표지가 위치한 개별 세공에 인접한 영역을 결정한다. 상기 영역에 상응하는 멤브레인 상의 액체는 분석을 위해 제거된다. 개별 세공에 인접한 액체는 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 의해 제거될 수 있다. 분석을 위한 방법은 예를 들어 면역검정법, 효소 증폭, 세포 여과, 핵산 시퀀싱, 질량 분석, 화학적 분석, 핵산 증폭, 핵산 발현, 세포 성장 및 세포 반응 검정법, 또는 그의 둘 이상의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 예에서, 샘플은 적합한 세포 완충제가 있는 용기 내로 수집된다. 수집된 샘플에 대해 여과를 수행하여, 샘플 내 다른 분자, 예컨대 비-희유 세포의 것에 비해 세포-결합된 표적 희유 분자의 수를 농축시킨다. 세포-결합된 표적 희유 분자에 대해 특이적인 항체에 연결된 변경 작용제를 포함하는 친화성 작용제는, 여과 디바이스의 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상에 잔류하는 농축된 샘플과 조합된다. 적합한 인큐베이션 기간 후, 멤브레인을 완충제로 세척한다. MS 표지 전구체를 멤브레인 상의 샘플에 첨가한다. 친화성 작용제의 변경 작용제는 친화성 작용제 및 세포-결합된 표적 분자를 포함하는 면역 착물의 일부이다. 표적 희유 분자가 샘플에 존재하는 경우, 변경 작용제는 MS 표지 전구체에 작용하여, 표적 희유 분자에 상응하는 MS 표지를 생성한다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인에 전기장을 인가하고, MS 표지를 수집한다. 일부 실시양태에서, 분무 액체 또는 분무 용매를 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인을 포함하는 웰에 첨가하고, 이를 전기장 및 임의로 진공에 노출시켜 다공성 멤브레인으로부터 액체의 액적을 방출시킨다. 표적 희유 분자가 샘플에 존재하는 경우, MS 표지는 표적 희유 분자에 상응하는 특유의 스펙트럼을 제공할 것이다. 이 스펙트럼은 멤브레인 상의 희유 세포의 농도 및 위치와 상관관계를 가질 수 있다. 멤브레인 상의 희유 세포의 위치는 추가의 분석을 위해 어디에서 희유 세포를 제거할지를 식별할 수 있다. 상기 예에서, 단지 1개의 표적 희유 분자만을 검출하는 것이 도시되어 있으나; 단일 샘플에 대해 상기 논의된 바와 같은 다양한 MS 표지 전구체를 사용하여 단일 방법으로 임의의 수의 표적 희유 분자를 결정할 수 있음을 인지하여야 한다.
또 다른 예에서, 샘플은 적합한 세포 완충제가 있는 용기 내로 수집된다. 수집된 샘플에 대해 여과를 수행하여, 샘플 내 다른 분자, 예컨대 비-희유 세포의 것에 비해 세포-결합된 표적 희유 분자의 수를 농축시킨다. 세포-결합된 표적 희유 분자에 대해 특이적인 항체에 연결된 MS 표지 전구체를 포함하는 친화성 작용제는, 여과 디바이스의 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상에 잔류하는 농축된 샘플과 조합된다. 적합한 인큐베이션 기간 후, 멤브레인을 완충제로 세척한다. 변경 작용제를 멤브레인 상의 샘플에 첨가한다. 친화성 작용제의 MS 표지 전구체는 친화성 작용제 및 세포-결합된 표적 분자를 포함하는 면역 착물의 일부이다. 표적 희유 분자가 샘플에 존재하는 경우 변경 작용제는 MS 표지 전구체에 작용하여, 표적 희유 분자에 상응하는 MS 표지를 생성한다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인에 전기장을 인가하고, MS 표지를 수집한다. 일부 실시양태에서, 분무 액체 또는 분무 용매를 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인을 포함하는 웰에 첨가하고, 이를 전기장 및 임의로 진공에 노출시켜 다공성 멤브레인으로부터 액체의 액적을 방출시킨다. 표적 희유 분자가 샘플에 존재하는 경우, MS 표지는 표적 희유 분자에 상응하는 특유의 스펙트럼을 제공할 것이다. 이 스펙트럼은 멤브레인 상의 희유 세포의 농도 및 위치와 상관관계를 가질 수 있다. 상기 예에서, 단지 1개의 표적 희유 분자만을 검출하는 것이 도시되어 있으나; 단일 샘플에 대해 상기 논의된 바와 같은 다양한 MS 표지 전구체를 사용하여 단일 방법으로 임의의 수의 표적 희유 분자를 결정할 수 있음을 인지하여야 한다.
또 다른 예에서, 샘플은 용기 내로 수집되고, 희석 또는 비-희석된 형태로 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인에 첨가된다. 본 예에서, 표적 희유 분자는 비-미립자이다 (즉, 표적 희유 분자가 세포 또는 다른 입자에 결합되지 않음). 수집된 샘플은, 표적 희유 분자에 대한 항체가 부착된 입자를 포함하는 입자 시약과 조합된다. 비-세포-결합된 표적 희유 분자를 입자 상의 항체에 결합시켜 입자-결합된 비-세포-결합된 표적 희유 분자를 제공하는 것을 가능케 하는 인큐베이션 기간 후, 샘플에 대해 여과를 수행하여 샘플 내 다른 분자, 예컨대 비-희유 세포의 것에 비해 입자-결합된 비-세포-결합된 표적 희유 분자의 수를 농축시킨다. 여과 디바이스의 표면 상에 잔류하는 샘플은 적합한 완충제로 세척한다. 입자-결합된 비-세포-결합된 표적 희유 분자에 대해 특이적인 항체에 연결된 변경 작용제를 포함하는 친화성 작용제는 여과 디바이스의 멤브레인 상에 잔류하는 농축된 샘플과 조합된다. 적합한 인큐베이션 기간 후, 멤브레인은 완충제로 세척한다. MS 표지 전구체를 멤브레인 상의 샘플에 첨가한다. 친화성 작용제의 변경 작용제는 친화성 작용제 및 입자-결합된 비-세포-결합된 표적 분자를 포함하는 면역 착물의 일부이다. 표적 희유 분자가 샘플에 존재하는 경우, 변경 작용제는 MS 표지 전구체에 작용하여, 표적 희유 분자에 상응하는 MS 표지를 생성한다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인에 전기장을 인가하고, MS 표지를 수집한다. 일부 실시양태에서, 분무 액체 또는 분무 용매를 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인을 포함하는 웰에 첨가하고, 이를 전기장 및 임의로 진공에 노출시켜 다공성 멤브레인으로부터 액체의 액적을 방출시킨다. 표적 희유 분자가 샘플에 존재하는 경우, MS 표지는 표적 희유 분자에 상응하는 특유의 스펙트럼을 제공할 것이다. 이 스펙트럼은 멤브레인 상의 희유 세포의 농도 및 위치와 상관관계를 가질 수 있다. 상기 예에서, 단지 1개의 비-세포-결합된 표적 희유 분자만을 검출하는 것이 도시되어 있으나; 단일 샘플에 대해 상기 논의된 바와 같은 다양한 MS 표지 전구체를 사용하여 단일 방법으로 임의의 수의 표적 희유 분자 (세포-결합된 및 비-세포 결합된 것 모두)를 결정할 수 있음을 인지하여야 한다.
또 다른 예에서, 액체 샘플은 용기 내로 수집되고, 희석 또는 비-희석된 형태로 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인에 첨가된다. 본 예에서, 표적 희유 분자는 비-미립자이다 (즉, 표적 희유 분자가 세포 또는 다른 입자에 결합되지 않음). 수집된 샘플은, 표적 희유 분자에 대한 항체가 부착된 입자를 포함하는 입자 시약과 조합된다. 비-세포-결합된 표적 희유 분자를 입자 상의 항체에 결합시켜 입자-결합된 비-세포-결합된 표적 희유 분자를 제공하는 것을 가능케 하는 인큐베이션 기간 후, 샘플에 대해 여과를 수행하여 샘플 내 다른 분자, 예컨대 비-희유 세포의 것에 비해 입자-결합된 비-세포-결합된 표적 희유 분자의 수를 농축시킨다. 여과 디바이스의 표면 상에 잔류하는 샘플은 적합한 완충제로 세척한다. 입자-결합된 비-세포-결합된 표적 희유 분자에 대해 특이적인 항체에 연결된 MS 표지 전구체를 포함하는 친화성 작용제는, 여과 디바이스의 멤브레인 상에 잔류하는 농축된 샘플과 조합된다. 적합한 인큐베이션 기간 후, 멤브레인은 완충제로 세척한다. 변경 작용제를 멤브레인 상의 샘플에 첨가한다. 친화성 작용제의 MS 표지 전구체는 친화성 작용제 및 입자-결합된 비-세포-결합된 표적 분자를 포함하는 면역 착물의 일부이다. 표적 희유 분자가 샘플에 존재하는 경우, 변경 작용제는 MS 표지 전구체에 작용하여, 표적 희유 분자에 상응하는 MS 표지를 생성한다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인에 전기장을 인가하고, MS 표지를 수집한다. 일부 실시양태에서, 분무 액체 또는 분무 용매를 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인을 포함하는 웰에 첨가하고, 이를 전기장 및 임의로 진공에 노출시켜 다공성 멤브레인으로부터 액체의 액적을 방출시킨다. 표적 희유 분자가 샘플에 존재하는 경우, MS 표지는 표적 희유 분자에 상응하는 특유의 스펙트럼을 제공할 것이다. 이 스펙트럼은 멤브레인 상의 희유 세포의 농도 및 위치와 상관관계를 가질 수 있다. 상기 예에서, 단지 1개의 비-세포-결합된 표적 희유 분자만을 검출하는 것이 도시되어 있으나; 단일 샘플에 대해 상기 논의된 바와 같은 다양한 MS 표지 전구체를 사용하여 단일 방법으로 임의의 수의 표적 희유 분자 (세포-결합된 및 비-세포 결합된 것 모두)를 결정할 수 있음을 인지하여야 한다.
또 다른 예에서, 샘플은 용기 내로 수집되고, 희석 또는 비-희석된 형태로 본질적으로 비-흡수성인 다공성 멤브레인에 첨가된다. 본 예에서, 표적 희유 분자는 비-미립자이다 (즉, 표적 희유 분자가 세포 또는 다른 입자에 결합되지 않음). 수집된 샘플은, 표적 희유 분자에 대한 항체가 부착된 입자를 포함하는 입자 시약과 조합된다. 비-세포-결합된 표적 희유 분자를 입자 상의 항체에 결합시켜 입자-결합된 비-세포-결합된 표적 희유 분자를 제공하는 것을 가능케 하는 인큐베이션 기간 후, 샘플에 대해 여과를 수행하여 샘플 내 다른 분자, 예컨대 비-희유 세포의 것에 비해 입자-결합된 비-세포-결합된 표적 희유 분자의 수를 농축시킨다. 여과 디바이스의 표면 상에 잔류하는 샘플은 적합한 완충제로 세척한다. 비-세포-결합된 표적 희유 분자를 MS 표지로 전환시키는 변경 작용제를 멤브레인 상의 샘플에 첨가한다. 적합한 인큐베이션 기간 후, 멤브레인은 완충제로 세척한다. 표적 희유 분자가 샘플에 존재하는 경우, 변경 작용제는 표적 희유 분자에 작용하여, 표적 희유 분자에 상응하는 MS 표지를 생성한다. 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인에 전하 장을 인가하고, MS 표지를 수집한다. 일부 실시양태에서, 분무 액체 또는 분무 용매를 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인을 포함하는 웰에 첨가하고, 이를 전기장 및 임의로 진공에 노출시켜 다공성 멤브레인으로부터 액체의 액적을 방출시킨다. 표적 희유 분자가 샘플에 존재하는 경우, MS 표지는 표적 희유 분자에 상응하는 특유의 스펙트럼을 제공할 것이다. 이 스펙트럼은 멤브레인 상의 희유 세포의 농도 및 위치와 상관관계를 가질 수 있다. 상기 예에서, 단지 1개의 비-세포-결합된 표적 희유 분자만을 검출하는 것이 도시되어 있으나; 단일 샘플에 대해 상기 논의된 바와 같은 다양한 MS 표지 전구체를 사용하여 단일 방법으로 임의의 수의 표적 희유 분자 (세포-결합된 및 비-세포 결합된 것 모두)를 결정할 수 있음을 인지하여야 한다.
입자 증폭을 사용하는 방법의 예
상기 언급된 바와 같이, 한 접근법에서, 입자 증폭이 이용되고, 이는 입자의 응집 또는 클러스터링을 제공하여 MS 표지 또는 MS 표지 전구체를 포함하는 입자 응집체를 형성한다.
어구 "입자 증폭"이란 입자의 응집체 또는 클러스터의 형성을 지칭하며, 여기서 단일 표적 희유 분자에 대한 지표인 여러 표지 입자가 증강된다. 일부 예에서, 표적 희유 분자에 대한 지표인 입자 응집체 내 표지 분자의 수는 1010 내지 1개, 또는 109 내지 1개, 또는 108 내지 1개, 또는 107 내지 1개, 또는 106 내지 1개, 또는 105 내지 1개, 또는 104 내지 1개, 또는 103 내지 1개, 또는 102 내지 1개, 또는 10 내지 1개, 또는 1010 내지 102개, 또는 1010 내지 103개, 또는 1010 내지 104개, 또는 1010 내지 105개이다. 입자 증폭은, 그와 회합된 많은 MS 표지 또는 MS 표지 전구체를 갖는 더 작은 많은 표지 입자와 회합된 보다 큰 입자 (캐리어 입자)를 사용함으로써 달성된다
용어 "와 회합된"이란 2개의 모이어티가 서로 결합되어 있는 방식을 지칭한다. 회합은 상기 규정된 바와 같은 공유 또는 비-공유 결합을 통한 것일 수 있다. 2개의 모이어티 간에 직접 결합에 의해 부착이 달성될 수 있거나, 또는 2개의 모이어티 간에 연결기가 사용될 수 있다. 연결기는 예를 들어 상기 기재된 바와 같을 수 있다.
캐리어 입자의 조성은 예를 들어 포획 입자 실체에 대해 상기 기재된 바와 같을 수 있다. 캐리어 입자의 크기는 하나 이상의 표지 입자를 수용할 만큼 크다. 표지 입자 대 단일 캐리어 입자의 비는 예를 들어 106 대 1, 또는 105 대 1, 또는 104 대 1, 또는 103 대 1, 또는 102 대 1, 또는 10 대 1일 수 있다. 캐리어 입자의 직경은 또한 예를 들어 표적 희유 분자의 성질, 샘플의 성질, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 성질 및 세공 크기, 입자의 멤브레인에의 접착력, 입자의 표면, 멤브레인의 표면, 액체 이온 강도, 액체 표면 장력, 및 액체 내 구성요소, 및 회합된 표지 입자의 수, 크기, 형상 및 분자 구조 중 하나 이상에 좌우될 수 있다. 다공성 매트릭스가 여과 분리 단계에서 사용되는 경우, 캐리어 입자의 직경은 입자 증폭의 유익을 달성하도록 여러 표지 입자를 보유할 만큼 커야 하지만, 여과 디바이스의 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 세공을 통과할 만큼 작아야 한다. 일부 예에서, 캐리어 입자의 평균 직경은 약 0.1 마이크로미터 이상 및 약 1 마이크로미터 이하, 또는 약 5 마이크로미터 이하이어야 한다. 일부 예에서, 캐리어 입자는 약 0.1 마이크로미터 내지 약 5 마이크로미터, 또는 약 1 마이크로미터 내지 약 3 마이크로미터, 또는 약 4 마이크로미터 내지 약 5 마이크로미터, 약 0.2 마이크로미터 내지 약 0.5 마이크로미터, 또는 약 1 마이크로미터 내지 약 3 마이크로미터, 또는 약 4 마이크로미터 내지 약 5 마이크로미터의 평균 직경을 갖는다.
표지 입자의 조성은 예를 들어 포획 입자 실체에 대해 상기 기재된 바와 같을 수 있다. 표지 입자의 크기는 예를 들어 캐리어 입자의 성질 및 크기, MS 표지 또는 MS 표지 전구체의 성질 및 크기, 변경 작용제의 성질 및 크기, 표적 희유 분자의 성질, 샘플의 성질, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 성질 및 세공 크기, 입자의 표면, 멤브레인의 표면, 액체 이온 강도, 및 액체 표면 장력, 및 액채 내 구성요소 중 하나 이상에 좌우될 수 있다. 일부 예에서, 표지 입자의 평균 직경은 약 0.01 마이크로미터 이상 및 약 0.1 마이크로미터 이하, 또는 약 1 마이크로미터 이하이어야 한다. 일부 예에서, 표지 입자는 약 0.01 마이크로미터 내지 약 1 마이크로미터, 또는 약 0.01 마이크로미터 내지 약 0.5 마이크로미터, 또는 약 0.01 마이크로미터 내지 약 0.4 마이크로미터, 또는 약 0.01 마이크로미터 내지 약 0.3 마이크로미터, 또는 약 0.01 마이크로미터 내지 약 0.2 마이크로미터, 또는 약 0.01 마이크로미터 내지 약 0.1 마이크로미터, 또는 약 0.01 마이크로미터 내지 약 0.05 마이크로미터, 또는 약 0.1 마이크로미터 내지 약 0.5 마이크로미터, 또는 약 0.05 마이크로미터 내지 약 0.1 마이크로미터의 평균 직경을 갖는다. 일부 예에서, 표지 입자는 실리카 나노입자일 수 있고, 이는 이온성 회합에 의해 자유 카르복실산 기를 갖는 자성 캐리어 입자에 연결될 수 있다.
예를 들어, 표지 입자와 회합된 MS 표지 또는 MS 표지 전구체의 수는 예를 들어 MS 표지 또는 MS 표지 전구체의 성질 및 크기, 표지 입자의 성질 및 크기, 링커 아암(linker arm)의 성질, 표지 입자 상의 관능기의 수 및 유형, 및 MS 표지 전구체 상의 관능기의 수 및 유형 중 하나 이상에 좌우될 수 있다. 일부 예에서, 단일 표지 입자와 회합된 MS 표지 또는 MS 표지 전구체의 수는 약 107 내지 1개, 또는 약 106 내지 1개, 또는 약 105 내지 1개, 또는 약 104 내지 1개, 또는 약 103 내지 1개, 또는 약 102 내지 1개, 또는 약 10 내지 1개이다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 예는, 희유 분자 및 비-희유 분자의 하나 이상의 상이한 군집을 함유하는 것으로 생각되는 샘플 내 표적 희유 분자의 하나 이상의 상이한 군집에 대한 방법에 관한 것이다. 비-희유 분자의 것에 비해, 미립자 형태인 표적 희유 분자의 하나 이상의 상이한 군집의 증강된 농도를 갖는 샘플은, 표적 희유 분자의 각각의 상이한 군집에 있어서, 표적 희유 분자의 군집 중 하나의 표적 희유 분자에 대해 특이적이고 그와 결합하는 결합 파트너를 포함하는 친화성 작용제로 인큐베이션된다. 친화성 작용제는 MS 표지 전구체 또는 제1 변경 작용제를 포함한다. 표적 희유 분자의 각각의 상이한 군집에 있어서, 친화성 작용제는 입자 시약을 포함한다. 제1 변경 작용제는 MS 표지 전구체로부터의 MS 표지의 형성을 용이하게 하거나, 또는 친화성 작용제로부터 MS 표지 전구체를 포함하는 실체를 방출시킨다. 인큐베이션 동안, 표적 희유 분자의 각각의 상이한 군집에 있어서, 친화성 작용제의 입자 시약으로부터 입자 응집체가 형성된다. 보유액 및 여액은 인큐베이션된 샘플을 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인과 접촉시킴으로써 형성된다. 보유액은 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상에 배치된다. 분무 액체 또는 분무 용매를 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인을 포함하는 웰에 첨가하고, 이를 전기장 및 임의로 진공에 노출시켜 다공성 멤브레인으로부터 액체의 액적을 방출시킨다.
일부 예에서, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인 상의 샘플에 진공을 인가하여, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 세공을 통한 액체 액적의 통과를 용이하게 한다. 인가되는 진공의 수준은 예를 들어 희유 세포 및/또는 입자 시약의 상이한 군집의 성질 및 크기, 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 성질, 및 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 세공의 크기 중 하나 이상에 좌우될 수 있다. 일부 예에서, 인가되는 진공의 수준은 약 1 밀리바 내지 약 100 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 80 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 50 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 40 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 30 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 25 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 20 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 15 밀리바, 또는 약 1 밀리바 내지 약 10 밀리바, 또는 약 5 밀리바 내지 약 100 밀리바, 또는 약 5 밀리바 내지 약 80 밀리바, 또는 약 5 밀리바 내지 약 50 밀리바, 또는 약 5 밀리바 내지 약 30 밀리바, 또는 약 5 밀리바 내지 약 25 밀리바, 또는 약 5 밀리바 내지 약 20 밀리바, 또는 약 5 밀리바 내지 약 15 밀리바, 또는 약 5 밀리바 내지 약 10 밀리바이다. 진공의 인가는 액체 액적이 본원에 기재된 원리에 따른 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인을 포함하는 개별 마이크로웰로부터 선택적으로 방출될 수 있도록 전기장의 인가와 협력된다.
액적에 대해 MS 분석을 수행하여 각각의 상이한 MS 표지의 존재 및/또는 양을 결정한다. 각각의 상이한 MS 표지의 존재 및/또는 양은 샘플 내 비-세포 표적 희유 분자의 각각의 상이한 군집의 존재 및/또는 양과 관련된다. 이 방식으로, 샘플은 추가의 분석을 위해 식별될 수 있다. 한 접근법에서, 관심 재료를 함유하는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인은 임의의 편리한 방법에 의해 제거될 수 있다. 이러한 방법의 예는 예를 들어, 여과에 의한 또는 관심의 대상인 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 일부를 펀칭해 내는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
입자 응집체의 크기는 예를 들어 포획 입자의 성질 및 크기, 캐리어 입자의 성질 및 크기, 표지 입자의 성질 및 크기, 연결기의 성질 및 크기, MS 표지 또는 MS 표지 전구체의 성질 및 크기, 변경 작용제의 성질, 표적 희유 분자의 성질, 샘플의 성질, 여과 매트릭스의 성질 및 세공 크기, 입자의 표면, 매트릭스의 표면, 액체 이온 강도, 및 액체 표면 장력 및 액체 내 구성요소 중 하나 이상에 좌우된다. 본원에 기재된 원리에 따른 일부 예에서, 입자 응집체의 평균 직경은 약 0.1 마이크로미터 이상 및 약 500 마이크로미터 이하, 또는 약 1,000 마이크로미터 이하이다. 일부 예에서, 입자 응집체는 예를 들어 약 0.1 마이크로미터 내지 약 1,000 마이크로미터, 또는 약 0.1 마이크로미터 내지 약 500 마이크로미터, 또는 약 0.1 마이크로미터 내지 약 100 마이크로미터, 또는 약 0.1 마이크로미터 내지 약 10 마이크로미터, 또는 약 0.1 마이크로미터 내지 약 5 마이크로미터, 또는 약 0.1 마이크로미터 내지 약 1 마이크로미터, 또는 약 1 마이크로미터 내지 약 10 마이크로미터, 또는 약 10 마이크로미터 내지 약 500 마이크로미터, 또는 약 10 마이크로미터 내지 약 100 마이크로미터의 평균 직경을 갖는다.
한 예에서, 표적 희유 분자는 약 10 마이크로미터 (㎛) 정도의 세포의 표면에 부착된다. 본 예에서 약 1 ㎛의 평균 직경을 갖는 캐리어 입자가 제1 연결기에 의해 특이적 결합 파트너, 예컨대, 표적 희유 분자에 대한 항체에 연결된다. 제2 연결기는 추가의 캐리어 입자를 선형 방식으로 서로 연결한다. 본 예에서, 세포 당 캐리어 입자의 수는 약 1,000개이다. 아울러, 각각의 캐리어 입자 당 대략 100개의 표지 입자 (직경 약 200 nm)가 제3 연결기에 의해 그에 연결된다. 각각의 표지 입자에 대해 약 105개의 MS 표지 (질량 표지)가 제4 연결기에 의해 그에 연결된다. 본 예에서, MS 표지는 약 1 nm의 크기를 갖는다. 연결기는 상기 기재된 바와 같은 임의의 연결기로부터 선택될 수 있고, 그의 둘 이상이 동일할 수 있거나 또는 각각의 연결기가 서로 상이할 수 있다. 일부 예에서, 연결기 중 하나 이상은, 예를 들어 캐리어 입자가 서로 또는 세포로부터 절단될 수 있고/거나 표지 입자가 캐리어 입자로부터 절단될 수 있고/거나 MS 표지 또는 MS 표지 전구체가 표지 입자로부터 절단될 수 있도록, 절단성 모이어티를 갖는다. 다양한 연결기의 절단은 연결기의 절단성 모이어티가 서로 상이한 경우 순차적으로 수행될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 하나 이상의 연결기는 절단제에 의해 절단가능한 절단성 모이어티를 포함할 수 있다. 절단제의 성질은 절단성 모이어티의 성질에 좌우된다. 절단성 모이어티의 절단은 예를 들어 산화, 환원, 용매화분해, 예를 들어 가수분해, 광분해, 열분해, 전기분해, 초음파 처리, 및 화학적 치환 중 하나 이상을 수반하는 화학적 또는 물리적 방법에 의해 달성될 수 있다. 절단성 모이어티 및 상응하는 절단제의 예는, 제한이 아닌 예시로서, 환원제 (예를 들어, 티올)을 사용하여 절단될 수 있는 디술피드; 산화제 (예를 들어, 퍼아이오데이트)를 사용하여 절단될 수 있는 디올; 퍼망가네이트 또는 오스뮴 테트록시드에 의해 절단될 수 있는 디케톤; 히드로술파이트로 절단될 수 있는 디아조 연결부 또는 옥심 연결부; 염기성 조건 하에 절단될 수 있는 β-술폰; 염기로 절단될 수 있는 테트라알킬암모늄, 트리알킬술포늄, 테트라알킬포스포늄 (α-탄소가 예를 들어 카르보닐 또는 니트로로 활성화됨); 알칼리성 조건 하에 가수분해제, 예컨대 히드록실아민, 암모니아 또는 트리알킬아민 (예를 들어, 트리메틸아민 또는 트리에틸아민)을 사용하여 절단될 수 있는 에스테르 및 티오에스테르 연결부; 퀴논 (환원으로 제거가 발생함); 광분해적으로 절단될 수 있는 치환된 벤질 에테르; 열적으로 절단될 수 있는 카르보네이트; 금속 킬레이트 (리간드가 더 높은 친화성 리간드로 대체될 수 있음); 단일항 산소로 절단될 수 있는 티오에테르; 산성 조건 하에 절단가능한 히드라존 연결부; 4차 암모늄 염 (예를 들어 수산화나트륨 수용액에 의해 절단가능함); 트리플루오로아세트산-절단성 모이어티, 예컨대 벤질 알콜 유도체, 테이코플라닌 아글리콘, 아세탈 및 티오아세탈; 예를 들어 HF 또는 크레졸을 사용하여 절단될 수 있는 티오에테르; 술포닐 (예를 들어 트리플루오로메탄 술폰산, 트리플루오로아세트산, 또는 티오아니솔에 의해 절단가능함); 친핵체-절단성 자리, 예컨대 프탈아미드 (예를 들어 치환된 히드라진으로 절단가능함); 매질의 이온 강도의 변화, 붕괴성 이온 물질의 첨가, pH의 저하 또는 상승, 계면활성제의 첨가, 초음파 처리, 및 하전된 화학 물질의 첨가에 의해 절단을 실현할 수 있는 이온성 회합 (반대로 하전된 모이어티의 인력); 및 적절한 파장을 갖는 광, 예컨대 300 nm 이상의 UV 광으로 절단가능한 광절단성 결합을 포함한다.
한 예에서, 절단성 연결부는 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트) (SPDP)와의 접합을 사용하여 형성될 수 있으며, 이는 디술피드 결합을 포함한다. 예를 들어, 아민 관능기를 포함하는 표지 입자는 SPDP에 접합시킨 후, 생성된 접합체를 티올 관능기를 포함하는 MS 표지와 반응시킬 수 있으며, 이는 접합체에의 MS 표지 모이어티의 연결부를 초래한다. 디술피드 환원제 (예컨대, 디티오트레이톨 (DTT) 또는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP))는 MS 표지로서의 티올화 펩티드를 방출하는 변경 작용제로서 사용될 수 있다.
제한이 아닌 예시로서, 여과 디바이스의 멤브레인 상의 입자 응집체 (입자 클러스터)의 형성의 예는 다음에 논의된다. 샘플 내 비-미립자 표적 희유 분자를 포획한 세포 또는 포획 입자는 여과 슬라이드의 멤브레인과 접촉시키며, 여기서 멤브레인의 세공의 크기는 잔류 세포 또는 입자-결합된 표적 희유 분자에 대해 상기 기재된 바와 같다. 상기 논의된 바와 같이 적합한 세척에 의해 비-미립자 재료를 제거하고 비-희유 분자 및 비-희유 세포의 수를 감소시킨 후, 상기 기재된 바와 같은 캐리어 입자의 세트를 표적 희유 분자의 각각의 상이한 군집에 대해 첨가하고, 이 경우 각 세트의 캐리어 입자는 결정하고자 하는 상이한 표적 희유 분자에 대해 특이적인 특이적 결합 파트너를 포함한다. 특이적 결합 파트너는 제1 연결기에 의해 캐리어 입자에 연결된다. 캐리어 입자는 제2 연결기를 사용하여 서로 연결된다. 또 다른 세척 단계 후 표지 입자가 첨가되고, 이 경우 각 세트의 표지 입자는 결정하고자 하는 상이한 표적 희유 분자에 대한 MS 표지 또는 MS 표지 전구체를 포함한다. 표지 입자는 캐리어 입자 상의 관능기와 반응하는 관능기를 포함한다. 관능기의 반응은 제3 연결기의 형성을 제공한다. MS 표지 또는 MS 표지 전구체는 제4 연결기에 의해 표지 입자에 결합된다. 그 결과, 표적 희유 분자, 캐리어 입자, 표지 입자 및 MS 표지 또는 MS 표지 전구체를 포함하는 입자 클러스터가 형성된다.
일부 예에서, 하나 이상의 연결기는 상기 논의된 바와 같은 관능기의 적절한 상응하는 관능기를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 공유적으로 형성된다. 일부 예에서, 하나 이상의 연결기는 상기 논의된 바와 같이 비-공유적으로 형성된다. 결합 쌍, 대개 특이적 결합 쌍의 구성원이 사용되며, 이 경우 어느 한 구성원은 한 연결기 모이어티에 연결되고, 나머지 구성원은 제2 연결기 모이어티에 연결된다. 결합 쌍 구성원이 결합될 때, 결합 쌍 구성원 및 2개의 연결기 모이어티를 포함하는 연결기가 형성된다. 결합 쌍 구성원의 결합은 궁극적으로 연결기를 형성하는 2개의 연결기 모이어티의 비-공유 연결을 초래한다. 연결기 모이어티는 상기 논의된 바와 같은 결합 또는 연결기일 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 결합 쌍의 구성원은, 제한이 아닌 예시로서, 예를 들어 아비딘 (스트렙타비딘)-비오틴 결합, 플루오레세인 (FITC) 및 FITC에 대한 항체, 로다민 (텍사스 레드) 및 로다민에 대한 항체, 디기토닌 (DIG) 및 DIG에 대한 항체, 비-인간 종 항체 (예를 들어, 염소, 토끼, 마우스, 닭, 양) 및 항-종 항체와 같이 비교적 높은 결합 상수를 갖는다.
일부 예에서, 제한이 아닌 예시로서, 제1 연결기는 비오틴에 연결된 2차 항체를 사용하는 비-절단성 결합을 수반할 수 있고, 이 경우 2차 항체는 표적 희유 분자에 대한 항체에 결합하고, 비오틴은 캐리어 입자의 표면 상의 스트렙타비딘 분자에 결합한다. 대안적으로, 항체는, 통상적으로 공지된 생물접합 방법을 사용하여 항체 상의 아민 및 입자 상의 카르복실산에 결합된 아미드를 통해 캐리어 입자에 직접 접합될 수 있다. 또 다른 예에서, 제1 연결기는, 예를 들어 SPDP와의 반응에 의해 제조된 디술피드 링커에 의해 항체에 부착되고 비오틴에 연결된 소분자 펩티드를 사용하는 절단성 연결부를 수반할 수 있다. 일부 예에서, 제2 연결기는 비-절단성 연결부를 포함할 수 있으며, 이 경우 캐리어 입자는 그 표면 상에 스트렙타비딘 분자를 갖고, 비오틴 및 소분자의 접합체, 예컨대 비오틴-FITC를 사용하여 연결기를 형성한다. 제2 연결기에 절단성 연결부가 요망되는 경우, 비오틴-FITC 작용제는 절단성 모이어티, 예컨대 디술피드 결합을 포함한다. 제2 연결기의 소분자 부분, 예를 들어 FITC 부분은 캐리어 입자의 표면 상의 소분자에 대한 결합 파트너 (예를 들어, FITC에 대한 항체)에 결합한다. 제3 연결기는 비-절단성 연결부를 포함할 수 있거나 (이 경우 연결 모이어티는 아미드 결합에 의해 FITC 또는 비오틴에 부착된 펩티드를 가짐), 또는 제3 연결기는 절단성 연결부를 포함할 수 있다 (이 경우 연결 모이어티는 디술피드 결합에 의해 FITC 또는 비오틴에 부착된 펩티드를 가짐). 제3 연결기는 이온성 연결부를 포함할 수 있으며, 이 경우 표지 입자 상의 이온화된 아민 또는 다른 기는 표지 입자 상의 이온화된 카르복실산 또는 다른 기로 유인된다. 상기 설명된 바와 같이, MS 표지 또는 MS 표지 전구체는, 이에 제한되지는 않으나, 디술피드 결합에 의해 부착된 펩티드 또는 다른 MS 표지와 같이 절단성 결합에 의해 표지 입자에 부착된다.
어구 "소분자"란 예를 들어 약 100 내지 약 2,000, 또는 약 200 내지 약 2,000, 또는 약 300 내지 약 2,000, 또는 약 500 내지 약 2,000, 또는 약 1,000 내지 약 2,000, 또는 약 500 내지 약 1,500, 또는 약 1,000 내지 약 1,500, 또는 약 1,000 내지 약 1,200 범위의 분자량을 갖는 분자를 지칭한다. 소분자의 예는, 제한이 아닌 예시로서, 예를 들어 비오틴, 디곡신, 디곡시게닌, 2,4-디니트로페닐, 플루오레세인, 로다민, 소분자 펩티드 (상기한 분자량 한도 충족), 비타민 B 12 및 엽산을 포함한다. 소분자-소분자 쌍에 대한 결합 파트너의 예는, 제한이 아닌 예시로서, 예를 들어 비오틴-비오틴에 대한 결합 파트너 (예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘, 및 비오틴에 대한 항체), 디곡신-디곡신에 대한 결합 파트너 (예를 들어, 디곡신에 대한 항체), 디곡시게닌-디곡시게닌에 대한 결합 파트너 (예를 들어, 디곡시게닌에 대한 항체), 2,4-디니트로페닐 및 2,4-디니트로페닐에 대한 결합 파트너 (예를 들어, 2,4-디니트로페닐에 대한 항체), 플루오레세인-플루오레세인에 대한 결합 파트너 (예를 들어, 플루오레세인에 대한 항체), 로다민-로다민에 대한 결합 파트너 (예를 들어, 로다민에 대한 항체), 펩티드-펩티드에 대한 결합 파트너 (예를 들어, 펩티드에 대한 항체), 분석물-특이적 결합 파트너 (예를 들어, B12에 대한 고유 인자, 엽산에 대한 엽산 결합 인자)를 포함한다.
MS 표지로서도 기능할 수 있는 소분자 펩티드의 예는, 제한이 아닌 예시로서, 히스티딘, 리신, 페닐알라닌, 류신, 알라닌, 메티오닌, 아스파라진, 글루타민, 아스파르트산, 글루탐산, 트립토판, 프롤린, 발린, 티로신, 글리신, 트레오닌, 세린, 아르기닌, 시스테인 및 이소류신 및 그의 유도체 중 둘 이상을 포함하는 펩티드를 포함한다. 일부 예에서, 펩티드는 약 100 내지 약 3,000 질량 단위의 분자량을 갖고, 3 내지 30개의 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 예에서, 펩티드는 티로신, 글리신, 메티오닌, 트레오닌, 세린, 아르기닌, 페닐알라닌, 시스테인 및 이소류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 9개의 아미노산을 포함하고, 1,021.2; 1,031.2; 1,033.2; 1,077.3; 1,087.3; 1,127.3; 1,137 질량 단위의 질량을 갖거나; 또는 상기 군으로부터의 3개의 아미노산을 포함하고, 335.4, 433.3, 390.5, 426.5 및 405.5 질량 단위의 질량을 갖는다. 펩티드 내 아미노산의 수는 예를 들어 사용된 MS 기술의 성질에 의해 결정된다. 예를 들어, 검출을 위해 MALDI를 사용하는 경우, 펩티드는 약 600 내지 약 3,000 범위의 질량을 가질 수 있고, 약 6 내지 약 30개의 아미노산으로 구성된다. 대안적으로, 검출을 위해 EIS를 사용하는 경우, 펩티드는 예를 들어 약 100 내지 약 1,000 범위의 질량을 갖고, 1 내지 9개의 아미노산 또는 그의 유도체로 구성된다. 일부 예에서, 펩티드 표지 내 아미노산의 수는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개일 수 있다.
MS 표지로서 펩티드를 사용하는 것은 여러 이점을 가지며, 이는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 1) 단백질, 항체, 입자 및 다른 생화학적 실체에의 접합이 비교적 용이함; 2) 질량을 변화시켜 많은 상이한 질량을 허용함으로써 멀티플렉싱된 검정법 포맷 및 표준을 제공하는 것을 가능케 하기가 비교적 용이함; 및 3) 사용된 질량 분광계에 질량을 조절가능함. 접합을 위해, 펩티드는 접합에서 사용되는 말단 시스테인을 가질 수 있다. 이온화를 위해, 펩티드는 하전된 아민 기를 가질 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 펩티드는 N-말단 자유 아민 및 C-말단 자유 산을 갖는다. 일부 예에서, 아미노산 펩티드는 동위원소 표지되거나 또는 동위원소로 유도체화된다. 펩티드는 소분자에 대한 상응하는 결합 파트너 (본 예에서, 스트렙타비딘, 또는 플루오레세인에 대한 항체)에 결합하기 위해 비오틴 또는 플루오레세인과 같은 소분자에 접합될 수 있다. 비오틴 또는 플루오레세인은 N-말단에서 접합될 수 있고, 여기서 C-말단는 자유 산이다.
본원에 기재된 방법은 미량 분석 (즉, 1 내지 약 100,000 카피의 희유 세포 또는 표적 희유 분자 정도의 극미량의 재료)을 수반한다. 이 공정은 질량 분광계의 검출 한계에서 미량 분석을 수반하기 때문에, 이들 극미량의 재료는 검출 부피가 극히 낮아 (예를 들어, 10-15 리터) 농도가 검출 내에 있을 때에만 검출될 수 있다. 본원에 기재된 원리에 따른 방법 및 장치의 예는 증발을 감소시키거나 피한다.
희유 세포 또는 표적 희유 분자에 대해 방출되는 MS 표지 또는 MS 표지 전구체의 양에서 재현성을 얻는 것은 캐리어 및 표지 입자의 본질적으로 완전한 회수 및 그의 형성을 측정하는 것을 필요로 한다. 따라서, 한 접근법에서 캐리어 입자, 표지 입자, 연결기 및/또는 MS 표지 또는 MS 표지 전구체는 형광 분자, 예컨대 이에 제한되지는 않으나 FITC, 로다민 화합물, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드, 형광 희토류 킬레이트, 아미노-쿠마린, 움벨리페론, 옥사진, 텍사스 레드, 아크리돈, 페릴렌, 인다신, 예컨대 4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센 및 그의 변이체, 9,10-비스-페닐에티닐안트라센, 스쿠아레인 염료 및 플루오레스카민의 존재로 인해 형광이 될 수 있다. 이어서, 형광 현미경을 사용하여, 처리 전후의 캐리어 입자, 표지 입자, 연결기, 및/또는 MS 표지 또는 MS 표지 전구체의 위치를 결정할 수 있다. 이는 시스템 기능의 확인 수단으로서의 역할을 하고, 세포 구조물 또는 포획 입자 상의 희유 세포 또는 표적 희유 분자의 위치에 대한 추가의 정보로 가치가 있다.
방법의 수행을 위한 키트
본 발명의 장치 및 시약은 본 발명의 방법을 편리하게 수행하기에 유용한 키트에 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, 키트는, 각각 상이한 표적 희유 분자를 위한 것인 개질된 친화성 작용제 및 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인의 패키징된 조합을 포함한다. 키트는 또한, 분석으로부터 제거될 수 있도록 비-희유 세포로 안내되는 하나 이상의 비-표지된 항체 또는 핵산 프로브를 포함할 수 있다. 개질된 친화성 작용제가 MS 표지 전구체 또는 변경 작용제를 포함하는지의 여부에 따라, 키트는 또한, 개질된 친화성 작용제의 일부가 아닌 나머지 MS 표지 전구체 또는 변경 작용제를 포함할 수 있다. 키트는 또한, MS 표지 전구체와 반응하여 MS 표지를 생성하는 모이어티를 위한 기질을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 예를 들어 세포에 대한 비-특이적 결합을 방지하는 블로킹제, 투과화제 및 고정제 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 방법을 수행하기 위한 다른 시약이 또한 키트에 포함될 수 있으며, 이러한 시약의 성질은 사용되는 특정 포맷에 좌우된다. 시약은 각각 별도의 용기에 있을 수 있거나, 또는 시약의 교차-반응성 및 안정성에 따라 다양한 시약이 하나 이상의 용기에서 조합될 수 있다. 키트는 예를 들어, 방법의 수행을 위한 그 밖의 별도로 패키징된 시약, 예컨대 보조 시약, 결합제, 샘플의 수집을 위한 용기, 및 분석의 수행을 위한 세포에 대한 지지체, 예컨대 현미경 슬라이드를 추가로 포함할 수 있다.
키트 내 다양한 시약의 상대량은 폭넓게 다양하여, 본 방법 동안 발생해야 하는 반응을 실질적으로 최적화시키고 추가로 방법의 감도를 실질적으로 최적화시키는 시약의 농도를 제공할 수 있다. 적절한 상황 하에, 키트 내 시약 중 하나 이상은 부형제를 포함한, 대개 동결건조된 건조 분말로서 제공될 수 있으며, 이는 용해 시에 본원에 기재된 원리에 따른 방법을 수행하기에 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 것이다. 키트는 본원에 기재된 원리에 따른 시약을 이용하는 방법의 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 어구 "적어도"란, 명시된 항목의 수가 언급된 수와 동일하거나 그를 초과할 수 있음을 의미한다. 본원에 사용되는 어구 "약"이란, 언급된 수가 ±10% 만큼 상이할 수 있음을 의미하며; 예를 들어, "약 5"는 4.5 내지 5.5의 범위를 의미한다.
하기 실시예는 제한이 아닌 예시로서 본 발명의 특정 실시양태를 추가로 기술하며, 본 발명의 범주를 제한하는 것이 아닌 기술하도록 의도된다. 본원에 개시된 부 및 백분율은 달리 나타내지 않는 한 부피 기준이다.
참조로 포함
본 개시내용 전반에 걸쳐 기타 문헌, 예컨대 특허, 특허 출원, 특허 공보, 학술지, 책, 논문, 웹 내용에 대한 언급 및 인용이 이루어졌다. 여기서 이러한 모든 문헌은 모든 목적상 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
등가물
본원에 기재 및 나타낸 것들에 추가로, 본 발명의 다양한 변경 및 그의 많은 추가의 실시양태는 본원에 인용된 과학 및 특허 문헌에 대한 기재를 비롯하여 본 문헌의 완전한 내용으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 본원의 대상은 그의 다양한 실시양태 및 그의 등가물에서 본 발명의 실시에 적합화될 수 있는 중요한 정보, 예시 및 지침을 함유한다.
<실시예>
실시예 1: 멤브레인으로부터 액체 액적의 방출
시험을 위해 총 3개의 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인을 사용하였다. 제1 멤브레인은 높이 360 ㎛ 및 직경이 대략 70 ㎛인 마이크로웰 6400개로 이루어진 8 x 8 mm2 규소 구역을 함유한 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인이었다. 각 웰의 하단은 1 ㎛ 두께의 질화규소 (Si3N4) 경질 멤브레인으로 피복되어 있고, 여기서 5 ㎛ 홀이 웰 개구부 내의 대략 중심에 있다. 홀과 멤브레인의 표면의 교차부에서 형성된 각도는 90°였다. 제2 멤브레인은 5 ㎛ 직경의 세공을 약 108,000개 함유하는 구역을 갖는 단일 마이크로웰로 이루어진 8 x 8 mm2의 본질적으로 비-흡수성인 1 ㎛ 두께의 질화규소 (Si3N4) 경질 멤브레인이었고, 여기서 제2 멤브레인은 마이크로웰 개구부 내의 대략 중심에 있다. 모든 세공 홀과 멤브레인의 표면의 교차부에서 형성된 각도는 90°였고, 1°초과 만큼 차이가 나지 않았다. 제3 멤브레인은 가요성인 본질적으로 비-흡수성의 폴리카르보네이트 멤브레인이었다. 제3 멤브레인은 3.7 cm2였고, 단일 마이크로웰의 하단에 위치하였다. 제3 멤브레인은 8 ㎛ 직경의 세공을 약 100,000개 가졌다. 세공의 홀과 멤브레인의 표면의 교차부에서 형성된 각도는 개별 세공들 간에 30 내지 150°로 다양하였다.
ESI는 용매-공기 계면에서의 전기장 강도의 크기가 액체의 표면 장력으로 인한 힘을 극복하기에 충분할 때 발생한다. 이 시점에서, 액체는 콘 내로 들어가고, 그로부터 하전된 액적가 배출되었다. 이들 액적은 증발 및 분열 사이클을 거쳐 궁극적으로 기체-상 이온을 생성하고, 이는 분석을 위해 질량 분광계의 진공 시스템 내로 들어갔다. 본 예에서, 멤브레인 표면으로부터 직접 전기분무의 발생 시, 분무되는 용액은 마이크로웰을 함유하는 칩 (에칭된 규소 웨이퍼 하우징)의 상단-측면을 충분히 습윤시켜야 한다. 표면에 대한 이상적 습윤성을 나타내는 용매는 본래 용매 첨가 시 웰을 충전시켜, 분무 사건 동안 연속 용매 전달을 위한 모세관 유동을 제공할 것이다. Si3N4 멤브레인의 배면은 이상적으로는 분무 용매와 비-습윤 상호작용을 가져야 한다. 이와 같은 유형의 상호작용은 각각의 5-㎛ 세공 상에서 액체를 단일 점적으로 단리한다. 개별 액적의 존재는 높은 곡도 (습윤된 플랫 표면과 비교하여)를 생성하고, 이는 전기 전위의 인가 하에 더 큰 전기장 강도를 생성하여 전기분무의 형성을 돕는다. 부가적으로, 질량 분광계의 모세관 유입구를 멤브레인의 하단 측면에 가까이 근접하게 위치시킴으로써, 전기장 강도는 추가로 증강되고 멤브레인의 선택된 구역으로부터의 전기분무의 발생을 가능케 하여 공간적 정보를 회수한다. 분무 용매는 충분히 극성이어야 하고, 공기의 전기적 파괴를 생성하는 것보다 더 낮은 전기장 강도로 전기분무를 가능케 할 만큼 낮은 표면 장력을 가져야 한다.
직접 멤브레인 분무의 초기 시험을 위한 분무 용매로서 아세토니트릴 및 메탄올을 선택하였다. 실험을 수행하였고, 여기서 THERMO LTQ (선형 이온 트랩) 질량 분광계 (써모 일렉트론 노쓰 아메리카 엘엘씨(Thermo Electron North America LLC))의 대기압 유입구 (API)에 대한 표준 직선형 모세관을 90° 각도로 굽은 연장된 모세관으로 교체하여 개구부가 위로 향하도록 하였다. 모든 실험에서, 멤브레인은 하단 측면이 굽은 모세관 유입구로부터 대략 1 mm 거리로 지상에 평행하도록 위치하였다. 굽은 모세관 및 멤브레인의 하단 측면을 다이오드 레이저를 사용하여 조명하였고, CMOS 카메라로 동영상을 기록하였다.
제1 세트의 실험에서, 50 μL의 메탄올 (또는 아세토니트릴)을 멤브레인의 상단 측면 상에 직접 피펫팅하였고, 대전방지 건으로부터 플라즈마를 용매 쪽으로 안내함으로써 전위를 인가하였다. 이와 같은 방식으로 전위가 인가될 때, 별개의 분무 사건이 시각화되었고, 기록된 질량 스펙트럼에는 나노ESI를 통한 동일한 용액의 분무를 대표하는 피크가 나타났다. 용매의 공핍(depletion) 시, 스펙트럼은 크게 상이하였고, MS 유입구에서 비-폐쇄된 대전방지 건을 점화할 때 보여지는 것과 같은 특징이 있었다.
추가의 실험으로부터, 다공성 멤브레인이 분무할 것이만 분무된 재료의 양은 가변적 (20% cv)이며, 분석물을 함유하는 하전된 액적 및 분석물 이온의 분출이 발생하는 시간이 100 msec 초과 만큼 또한 가변적이어서 이온의 트랩핑이 작은 분무 부피와 함께 단시간 규모에 걸쳐 발생할 때 어렵게 되는 것으로 나타났고; 그에 따라, 정량적이지 않은 방법을 초래한다. 대조군으로서, 고정된 배향의 세공을 갖고 가요성인 (1° 초과의 각도 야기) 불투과성 층을 시험하였다. 이와 같은 층에 의한 결과는 분무된 재료가 20% CV 초과 만큼 차이가 난다는 것이었다. 본원에 기재된 원리에 따른 특징을 갖는 사용된 멤브레인은 1% CV 미만인 분무량을 산출하였다.
가요성 및 비-가요성 멤브레인의 성능의 비교는 가요성 및 비-가요성 멤브레인 둘 다로부터 4차 펩티드 (FC-2)를 함유하는 용액의 분무에 의해 이루어졌다. 상기 비교는 혈액을 여과하는데 이전에 사용되어 온 멤브레인을 사용하여 이루어졌다. 가요성 멤브레인의 경우, 굽은 MS 유입구보다 대략 0.5 mm 위쪽에 멤브레인을 위치시켰고, 멤브레인보다 대략 5 mm 위쪽에 위치한 와이어 (전기장 발생기)에 6.5 kV 전위를 인가하였다. 이어서, FC-2 펩티드를 함유하는 용액 (0.1% 포름산이 있는 4:1 메탄올:물 25 μL)을 멤브레인의 상단에 가하면서 이온 m/z 412의 MS/MS 스펙트럼을 기록하였다. 양(positive)의 모드로 전기분무될 때, FC-2 펩티드는 m/z 412의 분자 이온을 생성한다 (CID 단편으로 처리될 때에는 주로 m/z 353). 비-가요성 멤브레인의 경우, 절차는 동일하였고 다음의 변화가 있었다: 전기장 발생기의 전압은 6.0 kV로 설정하였고, 가한 액체의 양은 5 μL였음. 각 경우에 FC-2 펩티드의 농도는 1, 10 및 100 nM로 조절하였다. m/z 412의 CID 스펙트럼은 가요성 및 비-가요성 멤브레인에 있어서 각각 도 8a-8c 및 도 9a-9c에 나타나 있다. 가요성 멤브레인으로부터의 분무 형성은 멤브레인에 액체를 가한 후 1-3초의 기간에 걸쳐 발생하였고, 전개된 분무의 사진은 도 10에 나타나 있다. 비-가요성 멤브레인의 경우, 필적하는 분무 플룸이 관찰되지 않았는데, 이는 개별 웰로부터 분무 형성이 발생함을 시사한다.

Claims (21)

  1. 적어도 1개의 세공을 포함하는 본질적으로 비-흡수성인 멤브레인, 멤브레인과 작동적으로 연관된 마이크로웰(microwell), 및 멤브레인과 작동적으로 연관된 전기장 발생기를 포함하는 장치를 제공하는 단계;
    적어도 상기 멤브레인에 불균질 샘플을 도입하는 단계;
    각각 제1 분자를 포함하는 복수의 친화성 작용제(affinity agent)를 샘플에 도입하는 단계이며, 여기서 복수의 친화성 작용제는 샘플 내 표적 분석물에 특이적으로 결합하는 것인 단계;
    비결합된 친화성 작용제를 제거하는 단계;
    하나 이상의 추가의 분자를 샘플에 도입하는 단계이며, 여기서 하나 이상의 추가의 분자는 제1 분자와 상호작용하여 질량 분광법 표지를 형성하는 것인 단계;
    전기장 발생기를 통해 샘플에 전압을 제공하여 적어도 1개의 세공을 통해 액적을 방출시키는 단계이며, 여기서 액적은 질량 분광법 표지 및 샘플의 일부를 포함하는 것인 단계; 및
    액적을 질량 분광법 표지의 존재에 대해 분석하는 단계이며, 여기서 질량 분광법 표지의 존재는 샘플 내 표적 분석물의 존재를 나타내는 것인 단계
    를 포함하는, 불균질 샘플로부터 표적 분석물을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 분자가 질량 분광법 표지 전구체인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 하나 이상의 추가의 분자가, 질량 분광법 표지 전구체와 상호작용하여 질량 분광법 표지를 형성하는 변경 작용제(alteration agent)인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 제1 분자가 변경 작용제인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 하나 이상의 추가의 분자가, 변경 작용제와 상호작용하여 질량 분광법 표지를 형성하는 질량 분광법 전구체 표지인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 제1 분자가 질량 분광법 표지 전구체이고, 하나 이상의 추가의 분자가, 질량 분광법 표지 전구체와 상호작용하여 질량 분광법 표지를 형성하는 제1 및 제2 변경 작용제인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 친화성 작용제가 미립자인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 친화성 작용제가 비-미립자인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 표적 분석물이 희유 세포이고, 불균질 샘플이 불균질 생물학적 샘플인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 분석된 질량 분광법 표지의 양을 정량화함으로써 샘플 내 표적 분석물을 정량화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  11. 표적 분석물을 포함하는 것으로 생각되는 샘플을 세공을 포함하는 멤브레인에 도입하는 단계;
    샘플 내에 표적 분석물이 존재하는 경우 표적 분석물과 회합된 질량 분광법 표지가 생성되도록 멤브레인 상의 샘플에 하나 이상의 시약을 도입하는 단계;
    멤브레인에 전기장을 인가함으로써 샘플의 하나 이상의 액적을 생성시키고, 이를 멤브레인의 세공으로부터 배출시키고 질량 분광계 내로 도입하는 단계;
    질량 분광계를 통해 질량 분광법 표지의 존재를 검출함으로써 표적 분석물의 존재를 검출하는 단계;
    검출 단계로부터의 결과에 기반하여 표적 분석물이 존재하는 경우 멤브레인으로부터 멤브레인의 세공과 회합된 샘플의 일부를 추출하는 단계; 및
    샘플의 추출된 부분을 분석하는 단계
    를 포함하는 샘플 분석 방법.
  12. 제11항에 있어서, 멤브레인 상의 샘플에 하나 이상의 시약을 도입하는 단계가,
    각각 제1 분자를 포함하는 복수의 친화성 작용제를 샘플에 도입하는 단계이며, 여기서 복수의 친화성 작용제는 샘플 내 표적 분석물에 특이적으로 결합하는 것인 단계;
    비결합된 친화성 작용제를 제거하는 단계; 및
    하나 이상의 추가의 분자를 샘플에 도입하는 단계이며, 여기서 하나 이상의 추가의 분자는 제1 분자와 상호작용하여 질량 분광법 표지를 형성하는 것인 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 제1 분자가 질량 분광법 표지 전구체인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 하나 이상의 추가의 분자가, 질량 분광법 표지 전구체와 상호작용하여 질량 분광법 표지를 형성하는 변경 작용제인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 제1 분자가 변경 작용제인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 하나 이상의 추가의 분자가, 변경 작용제와 상호작용하여 질량 분광법 표지를 형성하는 질량 분광법 전구체 표지인 방법.
  17. 제12항에 있어서, 제1 분자가 질량 분광법 표지 전구체이고, 하나 이상의 추가의 분자가, 질량 분광법 표지 전구체와 상호작용하여 질량 분광법 표지를 형성하는 제1 및 제2 변경 작용제인 방법.
  18. 제12항에 있어서, 친화성 작용제가 미립자인 방법.
  19. 제12항에 있어서, 친화성 작용제가 비-미립자인 방법.
  20. 제11항에 있어서, 표적 분석물이 희유 세포이고, 샘플이 불균질 생물학적 샘플인 방법.
  21. 제11항에 있어서, 분석된 질량 분광법 표지의 양을 정량화함으로써 샘플 내 표적 분석물을 정량화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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CN (1) CN108779426A (ko)
BR (1) BR112018006045A2 (ko)
CA (1) CA2999918A1 (ko)
WO (1) WO2017053911A1 (ko)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8207497B2 (en) 2009-05-08 2012-06-26 Ionsense, Inc. Sampling of confined spaces
US8822949B2 (en) 2011-02-05 2014-09-02 Ionsense Inc. Apparatus and method for thermal assisted desorption ionization systems
US9337007B2 (en) 2014-06-15 2016-05-10 Ionsense, Inc. Apparatus and method for generating chemical signatures using differential desorption
US10677793B2 (en) * 2015-04-21 2020-06-09 General Automation Lab Technologies Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods using lateral flow for high throughput microbiology applications
EP4012416A1 (en) * 2016-01-22 2022-06-15 Purdue Research Foundation Use of a charged mass labeling system for the detection of target analytes
US20180284108A1 (en) * 2017-04-01 2018-10-04 Michael Joseph Pugia Method for complete and fragmented markers
US20180283998A1 (en) * 2017-04-01 2018-10-04 Mike Joseph Pugia Methods and apparatus for removal of small volume from a filtration device
US10636640B2 (en) 2017-07-06 2020-04-28 Ionsense, Inc. Apparatus and method for chemical phase sampling analysis
WO2019231859A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Ionsense Inc. Apparatus and method for reducing matrix effects when ionizing a sample
US11424116B2 (en) 2019-10-28 2022-08-23 Ionsense, Inc. Pulsatile flow atmospheric real time ionization
US11913861B2 (en) 2020-05-26 2024-02-27 Bruker Scientific Llc Electrostatic loading of powder samples for ionization
US20230384290A1 (en) * 2020-10-16 2023-11-30 Biomems Analytics Llc Cellular Response Analysis Method
CN113005036B (zh) * 2021-03-29 2023-06-30 厦门大学 一种产生扰流的可拆卸式细胞培养流动腔室

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5182213A (en) 1991-03-18 1993-01-26 Miles Inc. Method for detecting the presence of peroxidatively active substance in basic media
WO1998037417A1 (en) * 1997-02-20 1998-08-27 The Regents Of The University Of California Plasmon resonant particles, methods and apparatus
JP2004257873A (ja) 2003-02-26 2004-09-16 Yamanashi Tlo:Kk 試料ガスのイオン化方法およびイオン化装置
JP2007508552A (ja) * 2003-10-10 2007-04-05 プロテイン・デイスカバリー・インコーポレーテツド マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ｍａｌｄｉ）質量分析法（ｍｓ）を包含する化学分析のための被検体の濃縮および精製のための方法および装置
GB0514964D0 (en) * 2005-07-21 2005-08-24 Ms Horizons Ltd Mass spectrometer devices & methods of performing mass spectrometry
US7335897B2 (en) * 2004-03-30 2008-02-26 Purdue Research Foundation Method and system for desorption electrospray ionization
WO2006091743A2 (en) * 2005-02-24 2006-08-31 University Of Notre Dame Integrated micro-pump and electro-spray
US20080152509A1 (en) * 2006-02-24 2008-06-26 Hsueh-Chia Chang Integrated micro-pump and electro-spray
US20080001525A1 (en) 2006-06-30 2008-01-03 Au Optronics Corporation Arrangements of color pixels for full color OLED
KR100866230B1 (ko) 2007-04-12 2008-10-30 삼성전자주식회사 파노라마 사진 촬영 방법
WO2008154523A2 (en) * 2007-06-08 2008-12-18 Protein Discovery, Inc. Improved methods and devices for concentration and fractionation of analytes for chemical analysis including matrix-assisted laser desorption/ionization (maldi) mass spectrometry (ms)
US20090000718A1 (en) 2007-06-28 2009-01-01 Dirk Frans Rouckhout Air barrier composition
EP2253009B1 (en) 2008-02-12 2019-08-28 Purdue Research Foundation Low temperature plasma probe and methods of use thereof
US20100122907A1 (en) * 2008-05-06 2010-05-20 Government of the United States of America, Single molecule mass or size spectrometry in solution using a solitary nanopore
EP4152360A1 (en) * 2009-04-30 2023-03-22 Purdue Research Foundation Ion generation using wetted porous material
EP2666182B1 (en) * 2011-01-20 2019-11-13 Purdue Research Foundation (Prf) Synchronization of ion generation with cycling of a discontinuous atmospheric interface
JP6357098B2 (ja) * 2011-06-06 2018-07-11 ウオーターズ・テクノロジーズ・コーポレイシヨン 試料中の標的分析物を定量化するための組成物、方法およびキット
ITTO20110565A1 (it) 2011-06-28 2012-12-29 St Microelectronics Srl Struttura multistrato avente un canale microfluidico e un sistema di rilevamento di perdite dal canale microfluidico e metodo per rilevare perdite in un dispositivo microfluidico
WO2013033647A2 (en) * 2011-09-01 2013-03-07 The Regents Of The University Of California Apparatus and method for electrical detection of oligonucleotides through pore blockades
US9184038B2 (en) * 2012-06-06 2015-11-10 Purdue Research Foundation Ion focusing
US20140001588A1 (en) 2012-06-28 2014-01-02 Intersil Americas LLC Optical sensors devices including a hybrid of wafer-level inorganic dielectric and organic color filters
US9865230B2 (en) 2012-07-02 2018-01-09 Microsoft Technology Licensing, Llc Animated visualization of alpha channel transparency

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