KR20230162973A - 지질 화합물 및 이의 핵산 전달에서의 응용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인접한 시스-이중 결합 구조를 가진 이온화 가능한 지질 화합물 및 이의 제조방법, 및 이의 활성 치료제(예를 들면 핵산) 전달에서의 응용을 제공한다. 본 발명의 이온화 가능한 지질 화합물은 상대적으로 높은 활성 물질 캡슐화 효율, 보다 우수한 세포 또는 생체내 형질감염 효율을 제공할 수 있으며, 특히 중실 구조를 갖는 나노 입자의 제조에 적합하다.

Description

지질 화합물 및 이의 핵산 전달에서의 응용
본 출원은 2021년 5월 28일자로 출원된 발명의 명칭이 “화합물 및 이의 핵산 전달에서의 응용”인 중국 특허출원 제202110592439.8호를 기초로 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 본 출원에 원용된다.
본 발명은 의약 화합물 기술분야에 속하고, 구체적으로 이온화 가능한 지질 화합물, 이의 제조 방법, 및 이의 활성 치료제(예를 들면 핵산) 전달에서의 응용에 관한 것이다.
핵산은 소간섭 RNA(siRNA), 메신저 RNA(mRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 리보자임, 플라스미드 및 면역자극 핵산을 포함하고, 다양한 메커니즘을 통해 작용한다. mRNA를 예로 들면, mRNA는 유전 정보를 DNA에서 세포질의 리보솜으로 전달하여 단백질 번역을 하는 RNA의 일종으로, 세포핵에 들어갈 필요가 없으므로, 유전적 돌연변이의 위험을 가져오지 않으며, 특정 세포 생성물의 발현을 실현하는데 사용될 수 있다. 이러한 핵산은 단백질이나 효소의 결핍과 관련된 질병의 치료에 유용하다. 그러나, 핵산은 치료 환경에서 많은 문제에 직면한다. 예를 들어, mRNA는 단일 가닥 구조가 매우 불안정하여 체내에 들어간 직후 뉴클레아제에 의해 분해된다. 또한 mRNA는 분자량이 크고 음전하를 많이 가지고 있어서 음전하를 띤 세포막을 통과하여 표적 세포로 들어가기 어렵다. 따라서 mRNA를 세포에 효과적으로 전달하는 것은 생체 내 적용을 구현하는 기술적인 핵심이다. 다양한 치료용 핵산에서 유사한 문제가 존재합니다.
유전자 요법에서, 이온화 가능한 지질 화합물은 다양한 질병을 치료하는 핵산의 우수한 전달 벡터임이 입증되었다. 상기 이온화 가능한 지질 화합물의 아민기는 적절한 산성 조건에서 양성화되어 양전하를 띤 헤드기(head group)를 형성할 수 있으며 테일은 소수성 탄소 사슬로 구성되고, 전하를 띤 부분은 음전하를 띤 RNA와 정전기적으로 결합되기 위한 것이고, 동시에 소수성 테일은 친지성 입자로 자가 조립될 수 있도록 한다. 이온화 가능한 지질 화합물과 기타 3종 또는 4종 지질(예를 들면 DSPC(디스테아로일포스파티딜콜린) 또는 DOPE(디올레오일포스파티딜에탄올아민), 콜레스테롤(CHOL) 및 PEG화 지질[DMG-PEG2000(1,2-Dimyristyl-rac-glycerol-3-methoxypolyethylene glycol 2000) 또는 DSPE-PEG2000(distearoylphosphatidylethanolamine-polyethylene glycol 2000)] 결합되어 자가 조립된 지질 나노 입자(LNP))은 핵산을 전달하는 데 사용되며, 핵산을 뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호하고 세포 흡수를 촉진할 수 있다. 현재 이온화 가능한 지질 화합물은 핵산 전달에서 큰 발전을 이루었지만 여전히 전달 효율이 낮은 문제가 있으며, 이는 산업 발전을 한정하는 병목 현상 중 하나이다.
본 발명은, 생리활성 분자(예를 들면, mRNA, siRNA, micRNA, 단백질, 폴리펩타이드 등)의 전달에 사용될 수 있는 신규한 이온화 가능한 지질 화합물을 제공한다. 아민기 구조가 양성화되어 양전하를 띤 양이온성 기를 형성할 수 있는 점을 고려하여, 본 발명의 이온화 가능한 지질 화합물은 특히 DNA, RNA 또는 기타 뉴클레오티드 분자와 같은 음전하를 띤 활성 물질을 전달하는데 적합하다.
본 발명은 상기 이온화 가능한 지질 화합물을 포함하는 생리활성 물질 전달 시스템을 더 제공하고, 상기 전달 시스템은 마이크로 입자, 나노 입자, 리포솜, 지질 나노 입자 또는 마이크로 버블일 수 있다. 본 발명의 일 실시방식에서, 상기 전달 시스템은 지질 나노 입자이다. 이러한 지질 나노 입자는 생리활성 물질(예를 들면 mRNA)을 세포, 조직 또는 기관으로 효율적으로 전달하여, 생리활성 물질의 효율적인 조절을 실현할 수 있다. 본 발명에서, 상기 이온화 가능한 지질 화합물은 표적 세포 또는 개체로 전달되는 생리활성 물질 또는 추가로 포함되는 다른 물질(예를 들면, 기타 음이온, 양이온 또는 이온화 가능한 지질 화합물, 합성 또는 천연 중합체, 계면활성제, 콜레스테롤, 탄수화물, 단백질, 인지질 등)과 함께 마이크로 입자, 나노 입자, 리포솜, 지질 나노 입자 또는 마이크로 버블을 형성한다. 상술한 생리활성 물질은 가스, 액체 또는 고체 형태일 수 있으며, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 펩티드 또는 소분자일 수 있다. 본 발명에서, 상기 전달 시스템은 이어서 약제학적 부형제와 임의로 조합되어 약제학적 조성물을 형성할 수 있다.
본 발명은 이러한 신규한 이온화 가능한 지질 화합물의 합성 방법을 더 제공한다.
본 발명은 상기 신규한 이온화 가능한 지질 화합물의 생리활성 물질 전달 시스템의 제조에서의 응용을 더 제공한다. 상기 전달 시스템은 마이크로 입자, 나노 입자, 리포솜, 지질 나노 입자 또는 마이크로 버블일 수 있다. 본 발명의 일 실시방식에서, 상기 전달 시스템은 지질 나노 입자이다.
본 발명의 이온화 가능한 지질 화합물은 식 I로 표시되는 구조를 가지고,
Q는 치환 또는 비치환된 선형 C2-20알킬렌이고, 상기 알킬렌의 하나 이상의 C원자는 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 헤테로 원자로 임의로 대체되거나, 또는, Q는 치환 또는 비치환, 포화 또는 불포화 4-6원 고리이고, 상기 4-6원 고리의 고리 원자는 O, S, N로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로 원자를 임의로 함유하고, 상기 치환된 치환기는 할로겐, -OH, 선형 또는 분지형 C1-20알킬, 선형 또는 분지형 C1-20알콕시, 선형 또는 분지형 C2-20알케닐, 선형 또는 분지형 C2-20알키닐, -CH2CH(OH)R5, 로부터 선택되고,
R1, R2, R3, R4는 동일하거나 상이할 수 있고, 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 선형 또는 분지형 C1-30알킬, 치환 또는 비치환된 선형 또는 분지형 C2-30알케닐, 치환 또는 비치환된 선형 또는 분지형 C2-30알키닐, 또는 -CH2CH(OH)R5로부터 선택되고, 상기 알킬, 알케닐 또는 알키닐의 하나 이상의 C원자는 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 헤테로 원자로 임의로 대체되고, 상기 치환된 치환기는 할로겐, -OH, 선형 또는 분지형 C1-10알킬, 선형 또는 분지형 C1-10알콕시로부터 선택되고,
조건은, R1, R2, R3, R4 중 적어도 하나는 인 것이고,
R5는 수소, 치환 또는 비치환된 선형 또는 분지형 C1-30알킬, 치환 또는 비치환된 선형 또는 분지형 C2-30알케닐, 치환 또는 비치환된 선형 또는 분지형 C2-30알키닐로부터 선택되고, 상기 알킬, 알케닐 또는 알키닐의 하나 이상의 C원자는 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 헤테로 원자로 임의로 대체되고, 상기 치환된 치환기는 할로겐, -OH, 선형 또는 분지형 C1-10알킬, 선형 또는 분지형 C1-10알콕시로부터 선택되고,
R6은 수소, C1-3알킬, C1-3알콕시, -OH로부터 선택되고,
n은 1~8의 정수로부터 선택되고, m은 0~8의 정수로부터 선택되고, n 및 m은 서로 독립적이고, 동일하거나 상이할 수 있고,
R1, R2, R3, R4 중 적어도 2개가 인 경우, 각 상기 그룹의 n 및 m은 서로 독립적이고, 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시방식에서, Q는 치환 또는 비치환된 선형 C2-20알킬렌이고, 상기 알킬렌의 하나 이상의 C원자는 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 헤테로 원자로 임의로 대체되고,
바람직하게는, Q는 이고, R8, R9는 서로 독립적으로 치환 또는 비치환된 선형 C1-10알킬렌으로부터 선택되고, 상기 알킬렌의 하나 이상의 C원자는 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 헤테로 원자로 임의로 대체되고, R7은 수소, 할로겐, -OH, 선형 또는 분지형 C1-20알킬, 선형 또는 분지형 C2-20알케닐, 선형 또는 분지형 C2-20알키닐, 또는 -CH2CH(OH)R5, 또는 이고, 상기 치환된 치환기는 할로겐, -OH, 선형 또는 분지형 C1-10알킬, 선형 또는 분지형 C1-10알콕시이고,
바람직하게는, Q는 이고, x 및 y는 동일하거나 상이할 수 있고, 독립적으로 1~8의 정수로부터 선택되고, R7의 정의는 상술한 바와 동일하고, 바람직하게는, x 또는 y는 동일하거나 상이하고, 1, 2 또는 3과 같이 1~3의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는, R7은 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸과 같은 선형 또는 분지형 C1-4알킬이다.
본 발명의 일부 실시예에서, 상기 포화 또는 불포화 4-6원 고리는 피페라지닐 또는 시클로헥실이다.
본 발명의 바람직한 실시방식에서, R6은 -OH이다.
본 발명의 바람직한 실시방식에서, n은 4~8의 정수로부터 선택되고, m은 4~8의 정수로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시방식에서, 상기 식 I의 화합물은 하기 식 A, B, C 또는 D이다：
여기서, 각 n1은 모두 서로 독립적이고, 동일하거나 상이할 수 있고, 각 n1은 1~8의 정수로부터 선택되고, 각 m1은 모두 서로 독립적이고, 동일하거나 상이할 수 있고, 각 m1은 0~8의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는, 각 n1은 4~8의 정수로부터 선택되고, 각 m1은 4~8의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는, 각 n1은 모두 서로 동일하고, 각 m1은 모두 서로 동일하다.
여기서, 각 n2는 모두 서로 독립적이고, 동일하거나 상이할 수 있고, 각 n2는 1~8의 정수로부터 선택되고, 각 m2는 모두 서로 독립적이고, 동일하거나 상이할 수 있고, 각 m2는 0~8의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는, 각 n2는 4~8의 정수로부터 선택되고, 각 m2는 4~8의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는, 각 n2는 모두 서로 동일하고, 각 m2는 모두 서로 동일하다.
여기서, 각 n3은 모두 서로 독립적이고, 동일하거나 상이할 수 있고, 각 n3은 1~8의 정수로부터 선택되고, 각 m3은 모두 서로 독립적이고, 동일하거나 상이할 수 있고, 각 m3은 0~8의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는, 각 n3은 4~8의 정수로부터 선택되고, 각 m3은 4~8의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는, 각 n3은 모두 서로 동일하고, 각 m3은 모두 서로 동일하다.
여기서, 각 n4는 모두 서로 독립적이고, 동일하거나 상이할 수 있고, 각 n4는 1~8의 정수로부터 선택되고, 각 m4는 모두 서로 독립적이고, 동일하거나 상이할 수 있고, 각 m4는 0~8의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는, 각 n4는 4~8의 정수로부터 선택되고, 각 m4는 4~8의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는, 각 n4는 모두 서로 동일하고, 각 m4는 모두 서로 동일하다.
본 발명의 일부 구체적인 실시방식에서, 상기 식 I의 화합물은 표 1에 나타낸 하기 화합물로부터 선택된다.
표 1
본 발명의 이온화 가능한 지질 화합물은 해당 분야의 기존 방법으로 합성할 수 있고, 예를 들면, 적절한 조건에서 1당량 이상의 아민과 1당량 이상의 에폭시 종결 화합물을 반응시켜 형성된다. 이온화 가능한 지질 화합물의 합성은 용매를 사용하거나 사용하지 않고 진행되고, 또한 상기 합성은 25-100℃범위 내의 상대적으로 높은 온도에서 진행된다. 얻어진 이온화 가능한 지질 화합물은 선택적으로 정제될 수 있다. 예를 들면, 이온화 가능한 지질 화합물의 혼합물을 정제하여 특정 이온화 가능한 지질 화합물을 얻을 수 있다. 또는 혼합물을 정제하여 특정 입체이성질체 또는 위치이성질체를 얻을 수 있다. 상기 에폭사이드는 상업적으로 구입하거나 합성하여 제조할 수 있다.
일부 실시예에서, 아민의 모든 아미노기는 모두 에폭시 종결 화합물과 완전히 반응하여 3차 아민을 형성한다. 다른 실시예에서, 아민의 모든 아미노기가 에폭시 종결 화합물과 완전히 반응하는 것은 아니므로 이온화 가능한 지질 화합물에서 1차 또는 2차 아민을 생성한다. 이러한 1차 또는 2차 아민을 그대로 유지시키거나 다른 에폭시 종결 화합물과 같은 다른 친전자체와 반응시킬 수 있다. 당업자는 과량의 아민을 에폭시 종결 화합물과 반응시키면 다양한 수의 테일을 갖는 다양한 서로 다른 이온화 가능한 지질 화합물을 생성함을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 디아민 또는 폴리아민은 분자의 다양한 아미노 부분에 1개, 2개, 3개 또는 4개의 에폭시 유래 화합물 테일을 포함하여 1차, 2차 및 3차 아민을 생성할 수 있다. 일부 실시예에서, 두 가지 동일한 유형의 에폭시 종결 화합물이 사용된다. 다른 실시예에서, 2종 이상의 상이한 에폭시 종결 화합물이 사용된다.
본 발명의 일부 실시방식에서, 본 발명의 이온화 가능한 지질 화합물은 다음과 같은 일반적인 제조 방법으로 제조할 수 있다.
단계 1：환원
환원제의 존재 하에, 화합물 A1의 카르복실기를 하이드록실기로 환원시켜 화합물 A2를 얻는다. 환원제의 예로는 수소화알루미늄리튬, 수소화디이소부틸알루미늄 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 반응에 사용된 용매의 예로는 에테르(예를 들어, 에틸 에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산 등), 할로겐화 탄화수소(예를 들어, 클로로포름, 디클로로메탄, 디클로로에탄 등), 탄화수소(예를 들어, n-펜탄, n-헥산, 벤젠, 톨루엔 등) 및 이들 용매 중 2종 이상으로 형성된 혼합 용매를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
단계 2：산화
산화제의 존재 하에, 화합물 A2의 하이드록실기를 알데히드기로 산화시켜 화합물 A3을 얻는다. 산화제의 예로는 2-요오독시벤조산(IBX), 피리디늄클로로크로롬산(PCC), 피리디늄중크롬산염(PDC), 데스마틴 페리오디난, 이산화망간 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 반응에 사용된 용매의 예로는 할로겐화 탄화수소(예를 들면 클로로포름, 디클로로메탄, 디클로로에탄 등), 탄화수소(예를 들면 n-펜탄, n-헥산, 벤젠, 톨루엔 등), 니트릴(예를 들면 아세토니트릴 등) 및 이들 용매 중 2종 이상으로 형성된 혼합 용매를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
단계 3：할로겐화-환원
먼저 산성 조건에서, 화합물 A3의 알데히드 α-수소를 할로겐화 시약과 할로겐화 반응시켜 α-할로겐화 알데히드 중간체를 얻은 다음, 환원제의 존재 하에, α-할로겐화 알데히드의 알데히드기를 하이드록실기로 환원시켜 화합물 A4를 얻었다. 산성 조건을 제공하는 예로는 DL-프롤린을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 할로겐화 시약의 예로는 N-클로로숙신이미드(NCS) 및 N-브로모숙신이미드(NBS)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 환원제의 예로는 수소화붕소나트륨, 수소화시아노붕소나트륨, 트리아세톡시수소화붕소나트륨을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
단계 4：에폭시화
화합물 A4를 염기의 존재 하에 분자내 친핵성 치환 반응시켜 에폭시 화합물 A5를 얻는다. 염기의 예로는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수소화나트륨 등의 알칼리 금속의 수산화물 또는 수소화물을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 반응에 사용되는 용매의 예로는 디옥산과 물의 혼합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
단계 5：개환 반응
화합물 A5를 아민(예를 들면 N,N-비스(2-아미노에틸)메틸아민)과 개환 반응시켜 최종 화합물을 얻는다. 반응에 사용되는 용매의 예로는 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 테트라히드로푸란, 트리클로로메탄, 헥산, 톨루엔, 에틸 에테르 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
상기 제조방법에서 원료 A1은 상업적으로 구입하거나 통상적인 방법으로 합성할 수 있다.
본 발명의 이온화 가능한 지질 분자 구조에는 2개의 인접한 시스-이중 결합이 포함되어 있으므로, 후속적으로 전달 시스템에 적용되어 활성 물질(예를 들어 mRNA와 같은 핵산)을 캡슐화할 때, 상대적으로 높은 캡슐화 효율 및 상대적으로 우수한 세포 형질감염 효율을 갖도록 하고, 또한, 지질 나노 입자를 제조할 때, 얻어진 지질 나노 입자의 입경이 더욱 균일하다. 본 발명의 이온화 가능한 지질 화합물은 중실 구조의 나노 입자의 제조에 특히 적합하다.
본 발명의 이온화 가능한 지질 화합물은 약물 전달 시스템에 사용될 때, 폴리뉴클레오티드, 소분자, 단백질, 펩티드, 금속을 포함하는 약제를 캡슐화할 수 있다. 상기 이온화 가능한 지질 화합물은 약물 전달 시스템의 제조에 적합한 다음의 몇 가지 특성을 가지고 있다: 1) 지질 복합 및 불안정한 약제를 "보호"하는 능력; 2) 생체내 pH값을 완화시키는 능력; 3) "양성자 스펀지"로 작용하고 생체 내에서 용해를 일으키는 능력; 4) 음전하를 띤 활성 물질의 전하를 중화시키는 능력.
상기 약물 전달 시스템은 입자 형태일 수 있다. 일부 실시예에서, 입자 직경은 1㎛ 내지 1000㎛ 범위 내이다. 일부 실시예에서, 입자 직경은 1 nm 내지 1000 nm 범위 내이다. 예를 들어, 입자 직경이 1㎛ 내지 100㎛ 범위 내, 또는 1㎛ 내지 10㎛ 범위 내, 또는 10㎛ 내지 100㎛ 범위 내, 또는 20㎚ 내지 800㎚ 범위 내, 또는 50 nm 내지 500 nm 범위 내, 또는 80 nm 내지 200 nm 범위 내, 또는 1 nm 내지 100 nm 범위 내, 또는 1 nm 내지 10 nm 범위 내이다. 입자의 입경 범위가 1 nm 내지 1000 nm 범위 내이면 본 분야의 일반적인 나노 입자이다. 상기 입자는 해당 분야에서 공지된 임의의 방법으로 제조할 수 있다. 이러한 방법은 분무 건조, 단일 및 이중 에멀젼 용매 증발, 용매 추출, 상 분리, 나노 침전, 미세 유체 공학, 단순 및 복합 코아세르베이션, 및 당업자에게 잘 알려진 기타 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
상기 약물 전달 시스템은 또한 약물 전달에 매우 적합한 마이크로 버블, 리포솜 또는 지질 나노 입자일 수 있다.
본 발명의 이온화 가능한 지질 화합물에 의해 형성될 수 있는 전달 시스템에 의해 전달되는 활성 물질은 치료제, 진단제 또는 예방제일 수 있다. 활성 물질은 소분자 화합물, 핵산, 단백질, 펩티드, 금속, 동위원소 표지 화합물, 백신 등의 성질을 가질 수 있다.
본 발명의 이온화 가능한 지질 화합물에 의해 형성된 전달 시스템은 또한 특정 세포, 조직 또는 기관을 표적화할 수 있는 표적화제가 될 수 있도록 표적화 분자로 변형될 수 있다. 표적 분자는 전체 전달 시스템에 포함되거나 그 표면에만 위치할 수 있다. 표적 분자는 단백질, 펩티드, 당단백질, 지질, 소분자, 핵산 등일 수 있고, 표적 분자의 예로는 항체, 항체 단편, 저밀도 지단백(LDL), 트랜스페린(transferrin), 아시알리코프로테인(asialycoprotein), 수용체 리간드, 시알산, 앱타머 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 이온화 가능한 지질 화합물에 의해 형성된 전달 시스템은 하나 이상의 약제학적 부형제와 조합되어 인간을 포함하는 동물에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물을 형성할 수 있다. "약제학적 부형제"라는 용어는 모든 유형의 무독성, 불활성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제 등을 의미하고, 유당, 트레할로오스, 포도당 및 자당과 같은 당류; 옥수수 전분, 감자 전분 등의 전분; 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 에틸셀룰로오스, 아세트산셀룰로오스 등의 셀룰로오스 및 그 유도체; 젤라틴; 활석; 낙화생유, 면실유, 홍화유, 올리브유, 옥수수유, 대두유 등의 유지; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 에틸올레이트, 에틸라우레이트 등의 에스테르류; Tween 80과 같은 계면활성제; 인산염 완충액, 아세트산염 완충액 및 구연산염 완충액과 같은 완충액; 착색제, 감미료, 조미료, 향료, 방부제, 항산화제 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물은 인간 및/또는 동물에게 경구, 직장, 정맥, 근육, 질내, 비강, 복강, 협측 또는 경구 또는 비강 스프레이 형태로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "알킬"이라는 용어는 1 내지 30개의 탄소 원자를 함유하는 탄화수소 모이어티로부터 단일 수소 원자를 제거하여 얻은 포화된 히드로카르빌을 의미한다. 알킬의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-데실, n-운데실 및 n-도데실을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
"알케닐"이라는 용어는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 탄화수소 모이어티로부터 단일 수소 원자를 제거함으로써 얻어지는 1가 기를 의미한다. 알케닐은 예를 들어 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 1-메틸-2-부텐-1-일 등을 포함한다.
“알키닐”이라는 용어는 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 탄화수소 모이어티로부터 단일 수소 원자를 제거하여 얻은 1가 기를 지칭한다. 대표적인 알키닐은 에티닐, 2-프로피닐(프로파길), 1-프로피닐 등을 포함한다.
"알콕시"라는 용어는 위에서 정의된 바와 같은 알킬이 산소 원자를 통해 모체 분자에 연결된 것을 의미한다. 알콕시의 예로는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, tert-부톡시, 네오펜톡시 및 n-헥속시를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
“할로" 및 "할로겐"이라는 용어는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로부터 선택된 원자를 의미한다.
"포화 또는 불포화 4-6원 고리"라는 용어는, C, N, S, O일 수 있는 4-6개의 고리 원자를 갖는 고리를 의미하고, 예로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 4~6원 포화 시클로알킬; 페닐과 같은 4-6원 아릴; 피롤리디닐, 피페리딜, 피페라지닐, 모르폴리닐 등과 같은 4-6원 헤테로시클릴; 트리아졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴 등과 같은 4-6원 헤테로아릴을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일부 실시예에서, 상기 포화 또는 불포화 4-6원 고리는 바람직하게는 피페라지닐 또는 시클로헥실이다.
"치환된"(앞에 "임의로"라는 용어가 존재하는지 여부에 관계없이) 및 "치환기"라는 용어는 모든 원자의 원자가 수가 유지된다면 하나의 작용기를 다른 작용기로 변화시키는 능력을 의미한다. 임의의 특정 구조에서 하나 이상의 위치가 특정 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있는 경우, 상기 치환기는 각 위치에서 동일하거나 상이할 수 있다.
도 1은 이온화 가능한 지질 II-37의 pKa의 곡선이다.
도 2는 이온화 가능한 지질 II-37에 의해 형성된 mRNA를 캡슐화한 LNP의 세포 형질감염 효율이다.
도 3은 이온화 가능한 지질 II-37에 의해 형성된 pDNA를 캡슐화한 LNP의 세포 형질감염 효율이다
도 4는 이온화 가능한 지질 II-37에 의해 형성된 siRNA를 캡슐화한 LNP의 세포 형질감염 효율이다.
도 5는 이온화 가능한 지질 II-37 및 상용 분자 MC3에 의해 각각 형성된 mRNA를 캡슐화한 LNP의 세포 형질감염 효율이다.
도 6은 로딩된 mRNA를 Cy5로 표기하고, 이온화 가능한 지질II-37 및 상용 분자 MC3에 의해 mRNA를 캡슐화한 LNP를 각각 형성하고, mRNA를 세포 내로 전달하는 LNP의 효율을 형광 염색에 의해 관찰한 것을 보여준다.
도 7은 이온화 가능한 지질II-37 및 C14-113에 의해 각각 형성된 mRNA를 캡슐화한 LNP의 세포 형질감염 효율을 비교한 것이다.
도 8은 MTT법에 의해 II-37-LNP 및 C14-113-LNP의 세포 독성을 측정한 것이다.
이하 구체적인 실시예를 결합하여 본 발명의 기술방안을 보다 상세하게 설명한다. 이해해야 할 것은, 하기 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하고 해석하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안된다. 본 발명의 상술한 내용에 기초하여 구현된 기술은 모두 본 발명의 보호 범위에 포함된다.
별도의 언급이 없는 한 하기 실시예에 사용된 원료 및 시약은 시판되는 것이거나 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
실시예 1 이온화 가능한 지질 Ⅱ-37의 합성
리놀레일 알코올(a2)의 합성: LiAlH4(7.20g), 리놀레산(50g, a1)을 0℃에서 테트라히드로푸란(950mL)에 첨가한 후, 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 박층크로마토그래피(TLC)에 의해 반응이 종료된 것으로 나타나면, 반응액에 물(7.2mL), NaOH 수용액(7.2mL, 질량분율: 15%) 및 물(21.6mL)을 순차적으로 첨가하여 켄칭하고, 적절한 양의 Na2SO4를 첨가하고, 15분 동안 교반한 후, 부흐너 깔대기로 여과하고, 필터 케이크를 에틸 아세테이트로 세척하고, 여액을 수집하고 증발 농축하여, 목표 생성물인 리놀레일 알코올(a2, 47.4g)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.27-5.44 (m, 4 H), 3.63 (t, J = 6.63 Hz, 2 H), 2.77(t, J = 6.44 Hz, 2 H), 1.97-2.12 (m, 4 H), 1.57-1.63 (m, 1 H), 1.20-1.46 (m, 18 H), 0.83-0.95 (m, 3 H)
(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디날(a3)의 합성: 실온에서, 리놀레일 알코올(25.0g, a2) 및 2-요오독시벤조산(39.4g)을 아세토니트릴(170mL)에 첨가한 다음, 혼합물을 85℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응액을 부흐너 깔때기로 여과하고, 필터 케이크를 디클로로메탄으로 세척 및 여과하고, 여액을 수집하고 증발 농축하여 목표 생성물인 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디날(a3)(24.0g)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.76 (t, J = 1.76 Hz, 1 H), 5.25-5.43 (m, 4 H), 2.76 (t, J = 6.17 Hz, 2 H), 2.41 (td, J = 7.33, 1.87 Hz, 2 H), 2.04 (q, J = 6.84 Hz, 4 H), 1.56-1.68 (m, 2 H), 1.22-1.36 (m, 14 H), 0.88 (t, J = 6.73 Hz, 3 H)
(9Z,12Z)-2-클로로-옥타데카-9,12-디엔-1-올(a4)의 합성: 0℃에서, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디날(43.0g, a3), DL-프롤린(5.62g) 및 N-클로로숙신이미드를 아세토니트릴(246 mL)에 첨가한 후, 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응이 종료된 후, 반응액을 무수 에탄올(246mL)로 희석하고 수소화붕소나트륨(8.8g)을 첨가한 다음, 0℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물(120mL)을 첨가하여 켄칭하고 메틸 tert-부틸 에테르로 추출하고, 유기상을 합친 후 포화 식염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 증발 농축하여 목표 생성물인 (9Z,12Z)-2-클로로-옥타데카-9,12-디엔-1-올(a4 , 46 g)을 얻었고, 바로 다음 단계에 사용하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.25 - 5.51 (m, 4 H), 3.97-4.07 (m, 1 H), 3.79 (dd, J = 12.01, 3.63 Hz, 1 H), 3.59-3.70 (m, 1 H), 2.67-2.90 (m, 2 H), 1.96-2.15 (m, 5 H), 1.64-1.82 (m, 1 H), 1.20-1.49 (m, 15 H), 0.89 (br t, J = 6.75 Hz, 3 H)
2-[(7Z,10Z)-헥사데카-7,10-디엔-1-일]옥시란(a5)의 합성: 실온에서, (9Z,12Z)-2-클로로-옥타데카-9,12-디엔-1-올(45g, a4) 및 수산화나트륨 수용액(120g의 수산화나트륨을 585mL의 물에 용해)을 1,4-디옥산(450mL)에 첨가하고, 적가 완료 후 혼합물을 35℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC에 의해 반응이 종료된 것으로 나타나면 반응액을 분리 깔때기로 분리하고, 포화 식염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조한 후 여과하고 증발 농축하며, 이어서 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피를 통해 석유 에테르/에틸 아세테이트로 용리하여 정제함으로써, 목표 생성물인 2-[(7Z,10Z)-헥사데카-7,10-디엔-1-일]옥시란(a5, 29.11g)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.27-5.46 (m, 4 H), 2.87-2.98 (m, 1 H), 2.70-2.85 (m, 3 H), 2.46 (dd, J = 5.00, 2.75 Hz, 1 H), 1.94-2.21 (m, 4 H), 1.24 -1.58 (m, 17 H), 0.78 - 1.00 (m, 3 H)
II-37의 합성: 실온에서, 2-[(7Z,10Z)-헥사데카-7,10-디엔-1-일]옥시란(5g) 및 N,N-비스(2-아미노에틸)메틸아민(739mg)을 에탄올(10 mL)에 첨가한 후 혼합물을 90 °C에서 36시간 동안 교반하였다. 반응액을 증발 농축하고, 이어서 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피를 통해 디클로로메탄/메탄올로 용리하여 정제함으로써, 조생성물II-37(4g)을 얻었다. 다시 플래시 컬럼 크로마토그래피를 통해 디클로로메탄/메탄올로 목표 생성물을 정제하여 II-37(2.2g)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.27-5.44 (m, 12 H), 3.48-3.79 (m, 3 H), 2.63-3.00 (m, 12 H), 2.16-2.61 (m, 12 H), 2.05 (q, J = 6.80 Hz, 12 H), 1.18-1.57 (m, 51 H), 0.89 (t, J = 6.88 Hz, 9 H)
ESI-MS：m/z 910.8 [M+H]+, 911.8 [M+2H]+, 912.8 [M+3H]+
실시예2 이온화 가능한 지질 Ⅱ-37의 해리 상수(pKa)
이온화 가능한 지질은 핵산과 결합하고 세포에서 핵산 분자의 방출을 허용하는 두 가지 주요 작용이 있다. 지질의 pKa는 중요한 요소인데, 이는 지질이 핵산과 결합하기 위해 낮은 pH 값에서 양전하를 띠어야 하지만 중성 pH 값에서는 전하를 띠지 않아야만 형성된 LNP가 독성을 일으키지 않기 때문이다. TNS 염료-결합 검정에 의해 이온화 가능한 지질 II-37의 pKa를 측정하면 6.81이고, 결과는 도 1에 나타낸 바와 같다.
실시예3 II-37에 mRNA를 캡슐화하여 지질 나노 입자를 제조
이온화 가능한 지질 Ⅱ-37, DSPC, CHOL 및 DMG-PEG2000을 각각 35%:15%:48.5%:1.5%의 몰비로 에탄올 용액을 만들어 유기상으로 사용하고, Lucferase mRNA(LucRNA)를 pH 4의 수용액에 용해시켜 수성상으로 사용하였다. 수성상과 유기상의 부피비 3:1에 따라 나노 약물 제조기(PrecisionNanoSystems Inc.(PNI), 캐나다, 모델: Ignite)에서 미세 유체 공학 기술에 의해 나노 입자 현탁액을 제조하였다. 제조 완료 후, 한외여과 농축하여 최종 LucRNA-LNP 지질 나노 입자를 얻었고, 추후 사용을 위해 2°C 내지 8°C에서 보관하였다.
Zetasizer Pro 나노 입자 크기 전위차계(Malvern Panalytical)로 LucRNA-LNP의 입경 및 제타 전위를 특성화하였다. F-280 형광 분광광도계(Tianjin Gangdong Sci.&Tech. Co. Ltd)를 사용하여 Ribogreen 방법으로 LucRNA-LNP의 캡슐화 효율을 검출하였다. 제조된 LucRNA-LNP의 CHO 세포 형질감염 효율은 다중 모드 마이크로플레이트 판독기(BioTek, 모델: SLXFATS)를 사용하는 플루오레세인 리포터 유전자 분석으로 검출하였다. LucRNA의 시험관내 전사 방법은 다음과 같다: CHO-K1 세포를 2.5Х105개 세포/mL의 세포 밀도로 도말하고, 세포 융합도가 30%-50%일 때 형질감염을 수행하였다. 2 μg의 LucRNA를 각 웰에 형질감염시키고, 양성 대조군은 형질감염 시약 Lipofectamine MessagerMAX(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 형질감염시키고, 형질감염 작업은 형질감염 시약의 제품 지침에 따라 수행하였다. 형질감염 48시간 후, 다중 모드 마이크로플레이트 판독기로 단백질 발현량을 검출하였다. 음성 대조군은 LucRNA-LNP를 첨가하지 않은 세포 배양 배지다. 실시예 3의 검출 결과는 표 2에 나타낸 바와 같다.
표 2
실시예 3의 결과로부터 알 수 있듯이, 신규한 지질 화합물의 배합으로 제조된 지질 나노 입자 LucRNA-LNP의 입경은 약 108 nm이고, LucRNA-LNP의 입경 분포가 상대적으로 좁고(PDI가 상대적으로 작고), 캡슐화 효율은 최대 96%임을 알 수 있다. 시험관내 세포 형질감염 효율은 최대 100만이다. 이온화 가능한 지질 II-37로 제조된 LNP는 mRNA를 캡슐화하여 매우 우수한 물리화학적 파라미터를 가질 뿐만 아니라 매우 높은 세포 형질감염 효율을 가짐을 보여준다.
추가로, 동일한 LNP를 사용하고, 제조된 LucRNA-LNP의 HEK293T 세포 형질감염 효율은 다중 모드 마이크로플레이트 판독기(BioTek, 모델명: SLXFATS)를 사용하는 플루오레세인 리포터 유전자 분석으로 검출하였고, 형질감염된 LucRNA의 양은 각각 0.5 μg, 1.0 μg 및 2.0 μg이다. LucRNA의 시험관 내 전사 방법은 다음과 같다: HEK293T 세포를 2.5 Х 105개 세포/mL의 세포 밀도로 도말하고, 세포 융합도가 30%-50%일 때 형질감염을 수행하였다. 양성 대조군은 형질감염 시약 Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 0.5㎍의 LucRNA를 형질감염시키고, 형질감염 작업은 형질감염 시약의 제품 지침에 따라 수행하였다. 형질감염 48시간 후, 다중 모드 마이크로플레이트 판독기로 단백질 발현량을 검출하였다. 음성 대조군은 LucRNA-LNP를 첨가하지 않은 세포 배양 배지다. 시험관내 세포 형질감염 효율은 도 2에 도시된 바와 같고, 이는 이온화 가능한 지질 II-37로 제조된 LNP는 mRNA를 캡슐화하여 매우 우수한 물리화학적 파라미터를 가지며, mRNA를 동일한 양으로 형질감염시킬 경우, 시판 중인 Lipofectamine 2000보다 약 10배 정도 높음을 보여준다.
실시예 4: II-37에 DNA를 캡슐화하여 지질 나노 입자를 제조
이온화 가능한 지질 II-37, DSPC, CHOL, DMG-PEG2000을 45%:10%:43.5%:1.5%의 몰비로 에탄올 용액을 만들어 유기상으로 사용하고, Lucferase DNA(pDNA)를 pH=4의 수용액에 용해시켜 수성상으로 사용한다. 수성상과 유기상의 부피비 3:1에 따라 나노 약물 제조기(PNI, 캐나다, 모델: Ignite)에서 미세 유체 공학 기술에 의해 나노 입자 현탁액을 제조하였다. 제조 완료 후, 다시 한외여과 농축하여 최종 pDNA-LNP 지질 나노 입자를 얻었고, 추후 사용을 위해 2°C 내지 8°C에서 보관하였다.
pDNA-LNP의 입경 및 제타 전위는 Zetasizer Pro 나노 입자 크기 전위차계(Malvern Panalytical)로 특성화하였다. 실시예 4의 검출 결과는 표 3에 나타낸 바와 같고, 신규한 지질 화합물의 배합으로 제조된 지질 나노 입자 pDNA-LNP의 입경은 약 173 nm이고, pDNA-LNP의 입경 분포는 비교적 좁다(PDI는 상대적으로 작다).
표 3
제조된 pDNA-LNP의 293T 세포 형질감염 효율은 다중 모드 마이크로플레이트 판독기(BioTek, 모델명: SLXFATS)를 사용하는 플루오레세인 리포터 유전자 분석으로 검출하였고, 형질감염된 pDNA의 양은 각각 0.5 μg, 1.0 μg 및 2.0 μg이었다. 시험관내 전사 방법은 다음과 같다: 293T 세포를 2.0 Х 105개 세포/mL의 세포 밀도로 도말하고, 세포 융합도가 30%-50%일 때 형질감염을 수행하였다. 양성 대조군은 형질감염 시약 Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 2㎍의 pDNA를 형질감염시키고, 형질감염 작업은 형질감염 시약의 제품 지침에 따라 수행하였다. 형질감염 48시간 후, 다중 모드 마이크로플레이트 판독기로 단백질 발현량을 검출하였다. 음성 대조군은 pDNA-LNP를 첨가하지 않은 세포 배양 배지다. 시험관내 세포 형질감염 효율은 도 3에 도시된 바와 같고, 이온화 가능한 지질 II-37로 제조된 LNP는 DNA를 캡슐화하여 매우 높은 세포 형질감염 효율을 가짐을 보여준다: II-37로 제조된 LNP로 1.0 μg의 pDNA를 형질감염시킨 단백질 발현량은 Lipofectamine 2000으로 2 μg의 pDNA를 형질감염시킨 양보다 높으며, 동일한 2 μg의 pDNA를 형질감염시킬 경우, II-37의 시험관내 세포 형질감염 효율은 시판되는 Lipofectamine 2000보다 약 3배 이상 높다.
실시예 5: II-37에 siRNA를 캡슐화하여 지질 나노 입자를 제조
이온화 가능한 지질 II-37, DSPC, CHOL, DMG-PEG2000을 45%:15%:38.5%:1.5%의 몰비로 에탄올 용액을 만들어 유기상으로 사용하고, Lucferase siRNA(siRNA)를 pH 4의 수용액에 용해시켜 수성상으로 사용한다. 수성상과 유기상의 부피비 3:1에 따라 나노 약물 제조기(PNI, 캐나다, 모델: Ignite)에서 미세 유체 공학 기술에 의해 나노 입자 현탁액을 제조하였다. 제조 완료 후, 다시 한외여과 농축하여 최종 siRNA-LNP 지질 나노 입자를 얻었고, 추후 사용을 위해 2℃~ 8℃에서 보관하였다.
siRNA-LNP의 입경 및 제타 전위는 Zetasizer Pro 나노 입자 크기 전위차계(Malvern Panalytical)로 특성화하였다. 실시예 5의 검출 결과는 표 4에 나타낸 바와 같고, 신규한 지질 화합물의 배합으로 제조된 지질 나노 입자 siRNA-LNP의 입경은 약 294 nm이다.
표 4
제조된 siRNA-LNP 293T 세포 형질감염 효율은 다중 모드 마이크로플레이트 판독기(BioTek, 모델명: SLXFATS)를 사용하는 플루오레세인 리포터 유전자 분석으로 검출하였고, 형질감염된 siRNA의 양은 각각 0.5μg, 1.0μg, 2.0μg이었다. 시험관내 전사 방법은 다음과 같다: Lucferase 리포터를 안정적으로 형질감염시킨 293T 세포를 2.0 Х 105개 세포/mL의 세포 밀도로 도말하고, 세포 융합도가 30%-50%일 때 형질감염을 수행하였다. 양성 대조군은 형질감염 시약 Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 1.0μg의 siRNA로 형질감염시키고, 형질감염 작업은 형질감염 시약의 제품 지침에 따라 수행하였다. 형질감염 24시간 후, 다중 모드 마이크로플레이트 판독기로 단백질 발현량을 검출하였다. 음성 대조군은 siRNA-LNP를 첨가하지 않은 세포 배양 배지다. 시험관내 세포 형질감염 효율은 도 4에 도시된 바와 같고, 이온화 가능한 지질 II-37로 제조된 LNP는 siRNA를 캡슐화하여 매우 높은 단백질 녹다운 효율을 가짐을 보여준다.
실시예 6 II-37와 상업적 이온화 가능한 양이온성 지질 분자 MC3의 효과 비교
MC3의 분자식은 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(N,N-디메틸아미노)부타노에이트이다.
실시예 3의 방법에 따라 II37 및 MC3를 각각 사용하여 지질 나노 입자를 제조하였고, 구체적인 몰비는 II-37 : DSPC : CHOL : DMG-PEG2000 = 45 : 15 : 38.5 : 1.5；MC3 : DSPC : CHOL : DMG-PEG2000 = 45 : 15 : 38.5 : 1.5이고, N/P비는 5:1이다.
제조된 지질 나노 입자의 물리화학적 및 품질 관리 데이터는 아래 표와 같다:
상기 표를 통해 알 수 있듯이, II-37로 제조된 지질 나노 입자의 캡슐화 효율은 최대 90.5%로 MC3로 제조된 지질 나노 입자보다 훨씬 높으며, 입경은 더 작고 균일하며, 전위가 더 높다.
실시예 3과 동일한 형질감염 방법을 사용하여, 제조된 지질 나노 입자를 CHO-K1 세포에 형질감염시켜, 단백질의 발현을 파악하였고, 결과는 도 5에 나타낸 바와 같다. 형질감염시킨 mRNA의 양이 동일할 경우, II-37(도면에서 C2로 나타냄)로 제조된 지질 나노 입자가 mRNA를 운반하여 세포를 형질감염시킨 후, 세포 내 단백질 발현량은 MC3보다 훨씬 높고, 이는 II-37로 제조된 지질 나노 입자의 세포 형질감염 효율이 매우 높음을 보여준다.
또한, 로드된 mRNA를 Cy5로 표기하여 Cy5-mRNA-LNP(II-37) 및 Cy5-mRNA-LNP(MC3)를 얻었다. 293T 세포와 2시간 및 6시간 공동 배양한 후, LysoSensorTM Green으로 세포의 리소좀을 염색하고, Cy5-mRNA가 세포 내로 들어가는 효과를 관찰하였다. 도 6을 통해 알 수 있듯이, Cy5-mRNA-LNP(II-37)를 세포와 함께 6시간 동안 배양한 후, 대부분의 Cy5-mRNA가 리소좀에 도달하였고, colocalization 계수가 0.626에 도달하였고, Cy5-mRNA-LNP(MC3)를 세포와 함께 6시간 동안 배양한 후, Cy5-mRNA는 세포로 상대적으로 적게 들어갔고, 이러한 비교로부터 알 수 있듯이, II-37 분자의 핵산 전달 효율은 MC3 분자보다 우수하다.
실시예 6의 결과를 통해 신규한 지질 화합물의 배합으로 제조된 지질 나노 입자는 핵산 전달 효율 및 시험관내 세포 형질감염 효율이 모두 MC3분자에 비해 우수하다는 것을 알 수 있다.
실시예 7 II-37와 이의 구조적 유사체 분자 C14-113의 비교
C14-113의 구조식은 아래와 같다:
실시예 3의 방법에 따라, II37 및 C14-113를 각각 사용하여 지질 나노 입자를 제조하였고, 구체적인 몰비는 II-37 : DSPC : CHOL : DMG-PEG2000 = 45 : 15 : 38.5 : 1.5이고; C14-113 : DSPC : CHOL : DMG-PEG2000 = 45 : 15 : 38.5 : 1.5이고, N/P비는 10:1이다.
제조된 지질 나노 입자의 물리화학적 및 품질 관리 데이터는 아래 표와 같다:
실시예 3과 동일한 형질감염 방법을 사용하여, 제조된 지질 나노 입자를 293T 세포에 형질감염시켜, 단백질 발현을 파악하였고, 결과는 도 7에 도시된 바와 같다. 형질감염시킨 mRNA의 양이 동일할 경우, II-37(도면에서 II-37-LNP로 나타냄)로 제조된 지질 나노 입자가 mRNA를 운반하여 세포를 형질감염시킨 후, 세포 내 단백질 발현량은 C14-113보다 훨씬 높고, 이는 II-37로 제조된 지질 나노 입자의 세포 형질감염 효율이 매우 높음을 보여준다.
또한, MTT 방법으로 II-37-LNP와 C14-113-LNP의 세포 독성을 측정하고, 벡터 투여량, 작용 시간 등 요인이 정상 세포(293T)의 증식에 미치는 영향을 고찰하였다. 결과는 도 8에 도시된 바와 같고, II-37(도면에서 II-37-LNP로 나타냄)로 제조된 지질 나노 입자가 mRNA를 운반하여 세포를 형질감염시킨지 48시간 후, 더 높은 투여량(2 μg/mL)에서 여전히 상대적으로 우수한 세포 활성을 유지했으며, 이는 II-37로 제조된 지질 나노 입자의 세포 독성이 매우 낮다는 것을 보여준다.
실시예 7의 결과를 통해 신규한 지질 화합물의 배합으로 제조된 지질 나노 입자는 세포 독성이 낮고, mRNA 형질감염 효율이 구조적 유사체 분자인 C14-113보다 우수함을 알 수 있다.
이상, 본 발명의 실시방식을 설명하였다. 그러나, 본 발명은 상술한 실시방식에 의해 한정되지 않는다. 본 발명의 사상 및 원칙 내에서 이루어진 모든 수정, 동등한 교체, 개선 등은 모두 본 발명의 보호 범위에 포함된다.

Claims (10)

  1. 식 I로 표시되는 구조를 갖는 화합물에 있어서,

    Q는 치환 또는 비치환된 선형 C2-20알킬렌이고, 상기 알킬렌의 하나 이상의 C원자는 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 헤테로 원자로 임의로 대체되거나, 또는, Q는 치환 또는 비치환, 포화 또는 불포화 4-6원 고리이고, 상기 4-6원 고리의 고리 원자는 O, S, N로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로 원자를 임의로 함유하고, 상기 치환된 치환기는 할로겐, -OH, 선형 또는 분지형 C1-20알킬, 선형 또는 분지형 C1-20알콕시, 선형 또는 분지형 C2-20알케닐, 선형 또는 분지형 C2-20알키닐, -CH2CH(OH)R5, 로부터 선택되고,
    R1, R2, R3, R4는 동일하거나 상이할 수 있고, 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 선형 또는 분지형 C1-30알킬, 치환 또는 비치환된 선형 또는 분지형 C2-30알케닐, 치환 또는 비치환된 선형 또는 분지형 C2-30알키닐, 또는 -CH2CH(OH)R5로부터 선택되고, 상기 알킬, 알케닐 또는 알키닐의 하나 이상의 C원자는 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 헤테로 원자로 임의로 대체되고, 상기 치환된 치환기는 할로겐, -OH, 선형 또는 분지형 C1-10알킬, 선형 또는 분지형 C1-10알콕시로부터 선택되고,
    조건은, R1, R2, R3, R4 중 적어도 하나는 인 것이고,
    R5는 수소, 치환 또는 비치환된 선형 또는 분지형 C1-30알킬, 치환 또는 비치환된 선형 또는 분지형 C2-30알케닐, 치환 또는 비치환된 선형 또는 분지형 C2-30알키닐로부터 선택되고, 상기 알킬, 알케닐 또는 알키닐의 하나 이상의 C원자는 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 헤테로 원자로 임의로 대체되고, 상기 치환된 치환기는 할로겐, -OH, 선형 또는 분지형 C1-10알킬, 선형 또는 분지형 C1-10알콕시로부터 선택되고,
    R6은 수소, C1-3알킬, C1-3알콕시, -OH로부터 선택되고,
    n은 1~8의 정수로부터 선택되고, m은 0~8의 정수로부터 선택되고, n 및 m은 서로 독립적이고, 동일하거나 상이할 수 있고,
    R1, R2, R3, R4 중 적어도 2개가 인 경우, 각 상기 그룹의 n 및 m은 서로 독립적이고, 동일하거나 상이할 수 있는, 화합물.
  2. 제1항에 있어서,
    Q는 이고,
    R8, R9는 서로 독립적으로 치환 또는 비치환된 선형 C1-10알킬렌으로부터 선택되고, 상기 알킬렌의 하나 이상의 C원자는 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 헤테로 원자로 임의로 대체되고, R7은 수소, 할로겐, -OH, 선형 또는 분지형 C1-20알킬, 선형 또는 분지형 C2-20알케닐, 선형 또는 분지형 C2-20알키닐, 또는 -CH2CH(OH)R5, 또는이고, 상기 치환된 치환기는 할로겐, -OH, 선형 또는 분지형 C1-10알킬, 선형 또는 분지형 C1-10알콕시인, 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    Q는 이고, x 및 y는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 1~8의 정수로부터 선택되고,
    바람직하게는, x 및 y는 동일하거나 상이하고, 1~3의 정수로부터 선택되고,
    바람직하게는, R7은 선형 또는 분지형 C1-4알킬기인, 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    R6은 -OH인, 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    n은 4~8의 정수로부터 선택되고, m은 4~8의 정수로부터 선택되는, 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 식 A, B, C 또는 D로부터 선택되고,

    A
    여기서, 각 n1은 모두 서로 독립적이고, 동일하거나 상이하고, 각 n1은 1~8의 정수로부터 선택되고, 각 m1은 모두 서로 독립적이고, 동일하거나 상이하고, 각 m1은 0~8의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는, 각 n1은 4~8의 정수로부터 선택되고, 각 m1은 4~8의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는, 각 n1은 모두 서로 동일하고, 각 m1은 모두 서로 동일하고,

    B
    여기서, 각 n2는 모두 서로 독립적이고, 동일하거나 상이하고, 각 n2는 1~8의 정수로부터 선택되고, 각 m2는 모두 서로 독립적이고, 동일하거나 상이하고, 각 m2는 0~8의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는, 각 n2는 4~8의 정수로부터 선택되고, 각 m2는 4~8의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는, 각 n2는 모두 서로 동일하고, 각 m2는 모두 서로 동일하고,

    C
    여기서, 각 n3은 모두 서로 독립적이고, 동일하거나 상이하고, 각 n3은 1~8의 정수로부터 선택되고, 각 m3은 모두 서로 독립적이고, 동일하거나 상이하고, 각 m3은 0~8의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는, 각 n3은 4~8의 정수로부터 선택되고, 각 m3은 4~8의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는, 각 n3은 모두 서로 동일하고, 각 m3은 모두 서로 동일하고,

    D
    여기서, 각 n4는 모두 서로 독립적이고, 동일하거나 상이하고, 각 n4는 1~8의 정수로부터 선택되고, 각 m4는 모두 서로 독립적이고, 동일하거나 상이하고, 각 m4는 0~8의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는, 각 n4는 4~8의 정수로부터 선택되고, 각 m4는 4~8의 정수로부터 선택되고, 바람직하게는, 각 n4는 모두 서로 동일하고, 각 m4는 모두 서로 동일하고,
    바람직하게는, 인, 화합물.
  7. 바람직하게 전달 시스템은 마이크로 입자, 나노 입자, 리포솜, 지질 나노 입자 또는 마이크로 버블인, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 생리활성 물질 전달 시스템의 제조에서의 응용.
  8. 생리활성 물질 전달 시스템에 있어서,
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하고, 바람직하게는, 상기 전달 시스템은 마이크로 입자, 나노 입자, 리포솜, 지질 나노 입자 또는 마이크로 버블인, 생리활성 물질 전달 시스템.
  9. 제8항에 따른 생리활성 물질 전달 시스템을 함유하는 약학 조성물.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 제조방법에 있어서,

    1)환원제의 존재 하에, 화합물 A1의 카르복실기를 하이드록실기로 환원시켜 화합물 A2를 얻고, 2)산화, 산화제의 존재 하에, 화합물 A2의 하이드록실기를 알데히드기로 산화시켜 화합물 A3을 얻고, 3)할로겐화-환원, 먼저 산성 조건에서, 화합물 A3의 알데히드 α-수소를 할로겐화 시약과 할로겐화 반응시켜 α-할로겐화 알데히드 중간체를 얻은 다음, 환원제의 존재 하에, α-할로겐화 알데히드의 알데히드기를 하이드록실기로 환원시켜 화합물 A4를 얻고, 4)에폭시화, 화합물 A4를 염기의 존재 하에서 분자내 친핵성 치환 반응시켜 에폭시 화합물 A5를 얻고, 5)개환 반응, 화합물 A5를 아민과 개환 반응시켜 최종 화합물을 얻는, 화합물의 제조방법.
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