KR20230161447A - 엑사테칸 유도체, 링커-페이로드 및 이의 접합체 - Google Patents

엑사테칸 유도체, 링커-페이로드 및 이의 접합체 Download PDF

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강 친
토니 얀타오 장
구앙밍 첸
폴 에이치. 송
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밍유 후
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진콴텀 헬스케어 (쑤저우) 씨오., 엘티디.
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Abstract

본 개시내용은 바이오 약제학 분야, 특히, 엑사테칸 유도체, 링커-페이로드, 접합체 및 이의 항체-약물 접합체, 및 이의 상응하는 제조방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

엑사테칸 유도체, 링커-페이로드 및 이의 접합체
본 개시내용은 바이오 약제학 분야, 특히, 엑사테칸 유도체, 링커-페이로드(payload), 접합체(conjugate) 및 이의 항체-약물 접합체, 및 이의 상응하는 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
전통적인 종양(tumor) 치료에서, 화학요법은 주요 치료 전략 중 하나이다. 그러나, 정상 조직에서의 비특이적 축적으로부터의 오프-타겟 독성, 좁은 치료 창 및 낮은 내성은 화학요법 약물 개발을 제한한다. 최근 수십 년 동안, 종양 세포 표면 상의 특정 마커에 결합하는 단클론 항체 및 폴리펩티드를 사용하는 표적 요법은 화학요법보다 독성이 덜한 것으로 입증되었다. 그러나, 이들 둘 다는 종양 세포를 사멸하는데 있어 효능이 부족하다.
표적 세포를 선택적으로 사멸시키기 위해 독소로 무장한 항체의 치료 전략은 1970년에 처음 제안되었다. 종양-표적 약물 접합체는 주로 일반적으로 종양 세포의 표면 항원을 특이적으로 인식하는 항체를 링커를 통해 종양 조직을 효과적으로 사멸시키는 화학 독소와 결합시키는 ADC로 구성된다.
2021년까지, 120개 이상의 ADC가 임상 개발 과정에 있었다.
개발된 세포독성 페이로드의 대부분은 두 가지 주요 계열에 속한다: 튜불린 억제제(메이탄시노이드 또는 아우리스타틴) 및 DNA-손상제(주로 칼리케아 마이신). 이들 모두는 나노몰 및 피코몰 범위의 IC50(세포의 50%를 억제하는 억제 농도), 및 전신으로 투여되는 경우 불리한 독성 프로파일을 특징으로 하는 매우 강력한 세포독성 약물이다. ADC로의 접합은 혈류에 세포독성 약물을 숨겨 이를 종양 세포로 직접 전달하므로, 이러한 강력한 제제의 독성을 크게 감소시킨다. 일반적으로, 보다 유리한 치료 지수를 갖는 약물은 탄두(warhead)로서 개발하기에 부적합한 것으로 간주되며, IC50이 너무 낮아 종양 세포로 전달되는 양으로 방출될 때 효과적이지 않다.
DAR이 증가하거나 방관자 효과(bystander effect)를 나타내는 ADC에 대한 연구는 세포독성이 덜한 약물을 탄두로 활용하는 유망한 새로운 접근 방식을 제안한다.
지금까지, 아우리스타틴(예를 들어, 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 및 F (MMAF))과 같은 항-미세소관 제제가 개발된 탄두의 대다수를 나타낸다. 브렌툭시맙 베도틴, 폴라투주맙 베도틴 및 엔포르투맙 베도틴은 모두 MMAE 페이로드를 지닌 승인된 ADC이다.
토포이소머라제 I(TOP1) 억제제는 여러 ADC에서 탄두로 사용된다. 사시투주맙 고비테칸은 이리노테칸의 활성 대사산물인 SN-38을 탄두로 보유한다. 엔허투(fam-트라스투주맙 데룩스테칸, DS8201a), T-Dxd로도 알려짐)는 엑사테칸 유도체 데룩스테칸(Dxd)을 탄두로 보유하며(WO2014057687A), 최근 유방암 치료용으로 승인되었다. 이에 기반하여, 더 큰 활성, 안정성, 물리화학적 특성을 갖는 단독으로 또는 ADC의 성분으로 사용되는 신규한 소분자 토포이소머라제 I 억제제가 현장에서 요구된다.
그러나, 한편으로, 엔허투 뿐만 아니라 다른 상업적으로 이용 가능한 ADC 및 임상 시험에서의 대부분의 ADC는 티오숙신이미드 구조(티오숙신이미드 결합)를 사용하여 소분자 약물을 표적화 항체 또는 단백질과 접합시키는 화학적 접합에 의해 제조된다. 티오숙신이미드 구조는 티올 그룹과 말레이미드의 반응에 의해 형성된다. 티오숙신이미드 결합은 안정적이지 않다. 유기체에서, 역 마이클 부가(reverse Michael addition) 또는 다른 티올 그룹과의 교환은 ADC로부터의 세포독소의 감소 및 오프-타겟 독성을 유도하여, 안전성을 감소시키고 임상 적용을 제한한다. 예를 들어, 엔허투는, 대단한 효능에도 불구하고, 간질성 폐질환(interstitial lung disease)의 10% 이상을 유발하여, 일부 환자에서 이의 사용을 제한하였다. 다른 한편으로, 화학적 커플링 반응은 부위 특이적이지 않으며, 생성된 ADC는 높은 이질성을 보인다.
보다 높은 효능 및 더 적은 독성을 가진 신규한 ADC가 여전히 시급하다.
제1 측면에서, 화학식 I의 화합물이 제공된다:
[화학식 I]
여기서,
opSu는 또는 이고;
R0는 C1-10 알킬이고;
n은 2 내지 20의 임의의 정수이고;
k1 및 k2는 독립적으로 1 내지 7의 정수이고;
i는 1-100의 정수이고;
j는 1-100의 정수이고;
P1 및 P2는 독립적으로 화학식 i'의 구조를 갖는 페이로드이고:
[화학식 i']
여기서,
a는 0 또는 1이고;
p1* 및 p2*로 표시된 탄소 원자는 각각 비대칭 중심이고, 비대칭 중심은 S 배위(configured), R 배위 또는 라세미(racemic)이고;
L1은, 치환되지 않거나 할로겐, -OH 및 -NH2로부터 선택된 하나의 치환체로 치환된 C1-6 알킬렌으로부터 선택되고;
M은 -CH2-, -NH- 또는 -O-이고;
L2는 C1-3 알킬렌이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, 할로겐 및 C1-6 알콕시로부터 선택된다.
제2 측면에서, 화학식 II의 구조를 갖는 접합체가 제공된다:
[화학식 II]
여기서,
A는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고; 항체 또는 항원 결합 단편은 바람직하게는 화학식 I의 화합물에서 (Gly)n 모이어티(moiety)와 연결되도록 변형되며;
z는 1 내지 20; 바람직하게는 1 내지 4; 특히 2의 정수이고;
P1, P2, R0, opSu, n , k1, k2, i 및 j는 화학식 I에 정의된 바와 같다.
제3 측면에서, 본 개시내용의 접합체, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
제4 측면에서, 질환을 치료하기 위한 약제(medicament)의 제조에 있어서의, 본 개시내용의 접합체, 또는 본 개시내용의 약제학적 조성물의 용도가 제공되며; 여기서 상기 질환은 종양 또는 자가면역 질환(autoimmune disease); 바람직하게는 HER2-양성 종양 세포를 포함하는 종양이다.
제5 측면에서, 화학식 i의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:
[화학식 i]
여기서,
a, p1* 및 p2*로 표시되는 탄소 원자, L1, M, L2, R1 및 R2는 화학식 I에 정의된 바와 같다.
제6 측면에서, 화학식 1의 화합물이 제공된다:
[화학식 1]
여기서,
k는 1 내지 7; 바람직하게는 1, 또는 3 또는 5, 특히 5의 정수이고,
P는 화학식 i'의 구조를 갖는 페이로드이고, 여기서 화학식 i'의 구조는 화학식 I에 정의된 바와 같다.
도 1은 SK-BR-3 HER2-고 세포주에서 접합체의 효능을 보여준다.
도 2는 NCI-N87 HER2-고 세포주에서 접합체의 효능을 보여준다.
도 3은 MDA-MB-468 HER2-음성 세포주에서 접합체의 효능을 보여준다.
도 4a 및 도 4b는 SK-BR-3 및 MDA-MB-468의 공동-배양 시스템에서 접합체의 효능을 보여준다. 도 4a는 GFP 형광에 의해 검출된 결과를 보여준다. 도 4b는 루시퍼라제 기질 화학발광에 의해 검출된 결과를 보여낸다. 도 4a 및 도 4b에서, 왼쪽에서 오른쪽으로 각각 CH-2-589, CH-2-593, CH-2-518, LC1184(8) 및 LC302-2-4(4)이다.
도 5는 GFP 형광에 의해 검출된 SK-BR-3 및 MDA-MB-468의 공동-배양 시스템에서 접합체의 효능을 보여준다.
도 6은 5mg/kg의 접합체를 투여한 JIMT1 CDX 모델을 사용한 SCID 베이지색 마우스에서 시간 경과에 따른 평균 종양 용적 변화를 보여준다.
도 7은 5mg/kg의 접합체를 투여한 Capan-1 CDX 모델을 사용한 BALB/c 누드 마우스에서 시간 경과에 따른 평균 종양 용적 변화를 보여준다.
도 8a 및 도 8b는 5mg/kg의 접합체를 투여한 Capan-1 CDX 모델을 사용한 BALB/c 누드 마우스에서 시간 경과에 따른 평균 종양 용적 변화 및 체중 변화를 보여준다.
도 9a 및 도 9b는 5mg/kg의 접합체를 투여한 NCI-N87 CDX 모델을 사용한 BALB/c 누드 마우스에서 시간 경과에 따른 평균 종양 용적 변화 및 체중 변화를 보여준다.
도 10은 풀링된 인간 혈청에서 0, 24, 48 및 96시간 배양 후의 접합체의 생체외 혈청 안정성을 보여준다.
구체적인 실시양태는 본 개시내용의 기술적 내용을 예시하기 위해 아래에 제공된다. 당업계의 숙련가들은 본 명세서에 개시된 내용을 통해 본 개시내용의 다른 장점 및 효과를 용이하게 이해할 수 있다. 본 개시내용은 또한 다른 상이한 구체적인 실시양태를 통해 구현 또는 적용될 수 있다. 다양한 수정 및 변형이 본 개시내용의 취지를 벗어나지 않고 당업계의 숙련가들에 의해 이루어질 수 있다.
정의
이하에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 당업계의 숙련가들에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 사용된 기술은 당업계의 숙련가들에게 명백한 변형 및 등가의 치환을 포함하여, 당업계에서 일반적으로 이해되는 것을 지칭한다. 이하의 용어들은 당업계의 숙련가들에 의해 용이하게 이해될 수 있는 것으로 여겨지지만, 다음의 정의는 본 개시내용을 보다 잘 예시하기 위해 제시된다. 상표명이 본원에 존재하는 경우, 이는 상응하는 상품 또는 이의 활성 성분을 지칭한다. 본원에 인용된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 공보는 본원에 참고로 포함된다.
특정 양, 농도 또는 다른 값 또는 파라미터가 범위, 바람직한 범위, 또는 바람직한 상한 또는 바람직한 하한의 형태로 제시되는 경우, 이는 상기 범위가 명시적으로 인용되는지 여부에 관계없이 임의의 상한 또는 바람직한 값을 임의의 하한 또는 바람직한 값과 조합함으로써 형성된 임의의 범위를 구체적으로 드러내는 것과 동등하다는 것을 이해해야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 열거된 수치 범위는 범위의 종점과 범위 내의 모든 정수 및 분수(소수)를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 표현 "i는 1 내지 20의 정수이다"는 i가 1 내지 20의 임의의 정수임을 의미하며, 예를 들어, i는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20일 수 있다. j, k 및 g와 같은 다른 유사한 표현도 유사한 방식으로 이해되어야 한다.
문맥에서 달리 명확하게 지시하지 않는 한, "a" 및 "the"와 같은 단수형은 복수형을 포함한다. 표현 "하나 이상" 또는 "적어도 하나"는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
용어 "약" 및 "대략"은, 수치 변수와 관련하여 사용될 때, 일반적으로 변수의 값 및 변수의 모든 값이 실험 오차 내에 있거나(예를 들어, 평균에 대한 95% 신뢰 구간 내) 또는 특정된 값의 ± 10% 이내, 또는 더 넓은 범위에 있음을 의미한다.
용어 "임의의" 또는 "임의로"는 후속적으로 기술된 사건이 반드시 일어날 수 있는 것은 아니지만 일어날 수도 있음을 의미하며, 설명은 상기 사건 또는 상황이 일어나거나 일어나지 않는 경우를 포함한다.
"포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "함유하는(containing)" 및 "갖는(having)"이라는 표현은 개방적이며, 인용되지 않은 추가 요소, 단계 또는 성분을 배제하지 않는다. "구성된"이라는 표현은 지정되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. "필수적으로 구성된"이라는 표현은 범위가 명시된 요소, 단계 또는 성분, 플러스 청구된 주제의 본질적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 임의로 존재하는 요소, 단계 또는 성분으로 제한됨을 의미한다. "포함하는"이라는 표현은 "본질적으로 구성된" 및 "구성된"이라는 표현을 포함하는 것으로 이해해야 한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 광범위한 방식으로 사용되며, 특히 이들이 원하는 생물학적 활성을 갖는 한, 무손상 단클론 항체, 다클론 항체, 단일특이적 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함한다. 항체는 임의의 서브타입 (예를 들어 IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA) 또는 서브클래스일 수 있고, 임의의 적합한 종으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 또는 뮤린 기원이다. 항체는 또한 완전 인간 항체, 인간화 항체 또는 재조합 방법에 의해 제조된 키메라 항체일 수 있다.
단클론 항체는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하기 위해 본원에서 사용되며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 소수의 가능한 천연 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 단일 항원 부위에 대해 매우 특이적이다. 단어 "단클론"은 항체의 특성이 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 유래되는 것을 지칭하며, 항체를 생산하기 위해 어떤 특정 방법을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
무손상 항체 또는 전장 항체는 본질적으로 항원-결합 가변 영역(들)뿐만 아니라 경쇄 불변 영역(CL) 및 중쇄 불변 영역(들)을 포함하며, 이는 항체의 서브타입에 따라 CH1, CH2, CH3 및 CH4를 포함할 수 있다. 항원-결합 가변 영역 (단편 가변 영역, Fv 단편으로도 공지됨)은 전형적으로 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 불변 영역은 천연 서열을 갖는 불변 영역(예를 들어, 인간 천연 서열을 갖는 불변 영역) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 가변 영역은 표적 항원을 인식하고 상호작용한다. 불변 영역은 면역계에 의해 인식되고 상호작용할 수 있다.
항체 단편은 무손상 항체의 일부, 바람직하게는 이의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, Fv 단편, 단 일-도메인 항체 (dAb) 단편, 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. Fab 단편은 전장 면역글로불린의 파파인 소화에 의해 수득된 항체 단편이거나, 예를 들어 재조합 발현에 의해 생산된 동일한 구조를 갖는 단편이다. Fab 단편은 경쇄 (VL 및 CL을 포함함) 및 또 다른 쇄를 포함 하고, 여기서 상기 다른 쇄는 중쇄의 가변 도메인(VH) 및 중쇄의 불변 영역 도메인(CH1)을 포함한다. F(ab')2 단편은 pH 4.0-4.5에서 면역글로불린의 펩신 소화에 의해 수득된 항체 단편이거나, 예를 들어 재조합 발현에 의해 생산된 동일한 구조를 갖는 단편이다. F(ab')2 단편은 본질적으로 2개의 Fab 단편을 포함하고, 여기서 각각의 중쇄 부분은 2개의 단편을 연결하는 디설파이드 결합을 형성하는 시스테인을 포함하는 몇 개의 추가 아미노산을 포함한다. Fab' 단편은 F(ab')2 단편(중쇄 1개 및 경쇄 1개)의 절반을 포함하는 단편이다. 항체 단편은 예를 들어, 디설파이드 결합을 통해 및/또는 펩티드 링커를 통해 함께 결합된 복수의 쇄를 포함할 수 있다. 항체 단편의 예는 또한 단일쇄 Fv (scFv), Fv, dsFv, 디아바디, Fd 및 Fd' 단편, 및 변형된 단편을 포함한 다른 단편을 포함한다. 항체 단편은 전형적으로 적어도 또는 약 50개의 아미노산, 및 전형적으로 적어도 또는 약 200개의 아미노산을 포함한다. 항원-결합 단편은, 항체 프레임워크 내로 삽입될 때 (예를 들어, 상응하는 영역의 치환에 의해) 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체를 초래할 수 있는 임의의 항체 단편을 포함할 수 있다.
본 개시내용에 따른 항체는 다음 기술 또는 이들의 조합과 같은 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 제조될 수 있다: 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술, 또는 당업계에 공지된 다른 기술. 예를 들어, 유전자 조작된 재조합 항체 (또는 항체 모방체)는 적합한 배양 시스템 (예를 들어, 대장균 또는 포유동물 세포)에 의해 발현될 수 있다. 조작은, 예를 들어, 말단에 리가제-특이적 인식 서열을 도입하는 것을 지칭할 수 있다.
HER2는 표피 성장 인자(EGFR) 수용체 티로신 키나제 계열에 속하는 인간 표피 성장 인자 수용체-2를 지칭한다. 본원에서, ErbB2 및 HER2라는 용어는 동일한 의미를 가지며, 상호교환 가능하게 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체-약물 접합체"는 "접합체"로 지칭된다.
소분자 화합물은 의학에서 일반적으로 사용되는 유기 분자에 필적하는 크기를 갖는 분자를 지칭한다. 상기 용어는 생물학적 거대분자 (예를 들어, 단백질, 핵산 등)를 포괄하지 않지만, 저분자량 펩티드 또는 이의 유도체, 예를 들어 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드 등을 포괄한다. 전형적으로, 소분자 화합물의 분자량은 예를 들어, 약 100 내지 약 2000 Da, 약 200 내지 약 1000 Da, 약 200 내지 약 900 Da, 약 200 내지 약 800 Da, 약 200 내지 약 700 Da, 약 200 내지 약 600 Da, 약 200 내지 약 500 Da일 수 있다.
스페이서는 상이한 구조 모듈 사이에 위치하며 구조 모듈을 공간적으로 분리할 수 있는 구조이다. 스페이서의 정의는 이것이 특정 기능을 가지고 있는지 또는 생체내에서 절단되거나 분해될 수 있는지 여부에 의해 제한되지 않는다. 스페이서의 예는 아미노산 및 비-아미노산 구조를 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 여기서 비-아미노산 구조는 아미노산 유도체 또는 유사체일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. "스페이서 서열"은 스페이서로서 기능하는 아미노산 서열을 지칭하며, 이의 예는 단일 아미노산, 복수의 아미노산을 함유하는 서열, 예를 들어 GA 등과 같은 2개의 아미노산을 함유하는 서열, 또는 예를 들어 GGGGS, GGGGSGGGS, GGGGSGGGGSGGS 등을 포함한다. 자가-희생 스페이서(self-immolative spacer)는 전구체에서 보호 부분의 활성화 후 두 화학 결합의 절단을 상관시키도록 맞춤화된 공유 조립체이다: 자극시, 보호 모이어티(예를 들어 절단 가능한 서열)가 제거되어 더 작은 분자의 일시적인 순차적 방출을 야기하는 일련의 분해 반응을 생성한다. 자가-희생 스페이서의 예는 PABC (p-벤질옥시카보닐), 아세탈, 헤테로아세탈 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "알킬"은 탄소 원자 및 수소 원자로 구성된 포화 지방족 탄화수소 그룹을 지칭하며, 이는 단일 결합을 통해 분자의 나머지에 연결된다. 알킬 그룹은 직쇄 알킬, 분지형 알킬 또는 사이클릭 알킬(사이클로알킬) 또는 부분 사이클릭 알킬(예를 들어, 사이클로알킬-선형 알킬 및 사이클로알킬-분지형 알킬)을 포함한다. 알킬 그룹은 1 내지 10개 탄소 원자를 함유할 수 있으며, C1-10 알킬 그룹, 예를 들어, C1-6 알킬 그룹, C1-4 알킬 그룹, C1-3 알킬 그룹, C1-2 알킬, C3 알킬, C4 알킬, C3-6 알킬을 지칭한다. 선형 알킬 그룹의 비제한적인 예는 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 분지형 알킬 그룹의 비제한적인 예는 이소프로필, 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸, 이소펜틸, 2-메틸부틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 네오펜틸, 1,1-디메틸프로필, 4-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 1-메틸펜틸, 2-에틸부틸, 1-에틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 1,1-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸 또는 1,2-디메틸부틸 등을 들 수 있다.
용어 "사이클릭 알킬" 및 "사이클로알킬"은 동일한 의미를 가지며, 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 사이클릭 알킬 그룹은 모노- 또는 폴리사이클릭 (예를 들어, 2개 또는 2개 이상의 융합 환을 가짐) 그룹을 포함할 수 있다. 멀티사이클릭 사이클로알킬에서, 2개 이상의 환은 함께 융합되거나 가교되거나 스피로화될 수 있다. 사이클릭 알킬 그룹의 환-형성 탄소 원자는 옥소 (즉, C(O))에 의해 임의로 치환될 수 있다. 사이클릭 알킬 그룹은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 환-형성 탄소 원자 (C3-10)를 가질 수 있다. 사이클릭 알킬 그룹의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 바이사이클로[1.1.1]펜틸 및 바이사이클로[2.1.1]헥실을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 사이클릭 알킬은 C3-6 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 알킬, 바람직하게는 C3-6 모노사이클릭 알킬, 특히 사이클로프로필이다.
용어 "부분 사이클릭"은 그룹이 하나 이상의 사이클릭 모이어티 및 하나 이상의 비사이클릭 (즉, 선형 또는 분지형) 모이어티를 함유하는 것을 지칭한다. 부분 사이클릭 알킬 그룹은 사이클릭 알킬-선형 알킬 그룹 및 사이클릭 알킬-분지형 알킬 그룹을 포함할 수 있다. 부분 사이클릭 알킬 그룹은 환-형성 탄소 원자 및 비-환-형성 탄소 원자를 포함하여 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 탄소 원자 (C3-10)를 가질 수 있다. 부분 사이클릭 알킬 그룹의 예는 C3-9 사이클릭 알킬-C1 알킬 그룹, C3-8 사이클릭 알킬-C2 알킬 그룹, C3-7 사이클릭 알킬-C3 선형 알킬 그룹, C3-6 사이클릭 알킬-C4 선형 알킬 그룹, C3-5 사이클릭 알킬-C5 선형 알킬 그룹, C3-4 사이클릭 알킬-C6 선형 알킬 그룹, C3 사이클릭 알킬-C7 선형 알킬 그룹, C3-7 사이클릭 알킬-C3 분지형 알킬 그룹, C3-6 사이클릭 알킬-C4 분지형 알킬 그룹, C3-5 사이클릭 알킬-C5 분지형 알킬 그룹, C3-4 사이클릭 알킬-C6 분지형 알킬 그룹 및 C3 사이클릭 알킬-C7 분지형 알킬 그룹을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 부분 사이클릭 알킬은 C3-9 사이클릭 알킬-C1 알킬 그룹, 바람직하게는 C3-6 사이클릭 알킬-C1-2 알킬 그룹, C3-6 사이클릭 알킬-C1 알킬 그룹, 보다 바람직하게는 C3-4 사이클릭 알킬-C1-2 알킬 그룹, 특히 C3-4 사이클릭 알킬-C1 알킬 그룹, 특히 사이클로프로필-메틸이다.
2가 라디칼은 자유 원자가 전자(들)를 갖는 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 상응하는 1가 라디칼로부터 수득되는 그룹을 지칭한다. 2가 라디칼은 분자의 나머지에 연결되는 2개의 연결 부위를 가지며, 여기서 2개의 연결 부위는 2가 라디칼의 동일한 원자 상에 또는 2개의 상이한 원자 상에 있을 수 있다.
"알킬렌" 또는 "알킬리덴"은 포화 2가 탄화수소 그룹을 지칭한다. 알킬렌 그룹은 선형, 분지형, 사이클릭 또는 부분 사이클릭 그룹을 포함한다. Examples of 선형 알킬렌 그룹의 예는 메틸렌 (-CH2-), -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6- 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 분지형 알킬렌 그룹의 예는 -CH(CH3)-, -CH(C2H5)-, -CH(CH3)-CH2-, -CH(C3H7)-, -CH(C2H5)-CH2-, -C(CH3)2-CH2-, -(CH(CH3))2-, -CH(CH3)-(CH2)2-, -CH2-CH(CH3)-CH2-, -CH(C4H9)-, -C(CH3)(C3H7)-, -C(C2H5)2-, -CH(C3H7)-CH2-, -CH(C2H5)-CH(CH3)-, -CH(C2H5)-(CH2)2-, -CH2-CH(C2H5)-CH2-, -C(CH3)2-(CH2)2-, -CH2-C(CH3)2-CH2-, -CH(CH3)-(CH2)3-, -CH2-CH(CH3)-(CH2)2-, -CH(C5H11)-, -C(C2H5)(C3H7)-, -C(CH3)(C4H9)-, -CH(C4H9)-CH2-, -C(C2H5)2-CH2-, -C(CH3)(C3H7)-CH2-, -CH(C2H5)-CH(C2H5)-, -CH(CH3)-CH(C3H7)-, -C(CH3)2-C(CH3)2-, -CH(C3H7)-(CH2)2-, -CH2-CH(C3H7)-CH2-, -CH(C2H5)-C(CH3)2-, -C(CH3)2-CH(CH3)-CH2-, -CH(CH3)-C(CH3)2-CH2-, -CH(C2H5)-CH(CH3)-CH2-, -CH(CH3)-CH(C2H5)-CH2-, -CH(CH3)-CH2-CH(C2H5)-, -CH(CH3)-C(CH3)2-CH2-, -(CH(CH3))3-, -C(CH3)2-(CH2)3-, -CH(C2H5)-(CH2)3-, -CH2-CH(C2H5)-(CH2)2-, -CH2-CH(CH3)-CH(CH3)-CH2-, -(CH(CH3))2-(CH2)2-, -CH(CH3)-(CH2)2-CH(CH3)-, -(CH2)2-CH(CH3)-(CH2)2-, -CH2-CH(CH3)-(CH2)3-, -CH(CH3)-(CH2)4- 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "사이클릭 알킬렌" 및 "사이클로알킬렌"은 동일한 의미를 가지며, 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 사이클릭 알킬렌 그룹의 예는 사이클로프로필렌, 사이클로부틸렌, 사이클로펜틸렌, 사이클로헥실렌, 사이클로헵틸렌 및 사이클로옥틸렌, 및 융합, 스피로 또는 가교된 환을 함유하는 2가 멀티사이클릭 알킬 그룹을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 사이클릭 알킬렌은 C3-6 사이클릭 알킬렌 그룹, 특히 C3-4 사이클릭 알킬렌 그룹, 특히 사이클로프로필이다.
부분 사이클릭 알킬렌 그룹은 분자의 나머지에 연결되는 2개의 연결 부위가 둘 다 하나 이상의 선형 또는 분지형 알킬 모이어티 상에 있거나, 또는 둘 다 하나 이상의 사이클릭 알킬 모이어티 상에 있거나, 또는 각각 사이클릭 알킬 모이어티 및 선형 또는 분지형 알킬 모이어티 상에 있을 수 있는 2가 라디칼을 포함할 수 있다. 부분 사이클릭 알킬렌 그룹의 예는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: (1) 각각 독립적으로 하나 이상의 선형 또는 분지형 알킬 그룹으로 치환되는, 사이클로프로필렌, 사이클로부틸렌, 사이클로펜틸렌, 사이클로헥실렌, 사이클로헵틸렌 및 사이클로옥틸렌, 및 융합, 스피로 또는 가교된 환을 함유하는 2가 멀티사이클릭 알킬 그룹; (2) 각각 독립적으로 하나 이상의 사이클릭 알킬 그룹으로 치환되는 선형 또는 분지형 알킬렌 그룹; 및 (3) 화학적으로 안정한 구조가 형성되는 한, 하나 이상의 사이클릭 알킬렌 그룹 및 하나 이상의 선형 또는 분지형 알킬렌 그룹을 조합하여 형성된 그룹. 일부 실시양태에서, 부분 사이클릭 알킬렌은 C3-9 사이클릭 알킬-C1 알킬렌 그룹, 바람직하게는 C3-6 사이클릭 알킬-C1-2 알킬렌 그룹, C3-6 사이클릭 알킬-C1 알킬렌 그룹, 보다 바람직하게는 C3-4 사이클릭 알킬-C1-2 알킬렌 그룹, 특히 C3-4 사이클릭 알킬-C1 알킬렌 그룹, 특히 사이클로프로필-메틸렌이다.
본 발명의 화합물은 자연에서 가장 풍부하게 발견되는 원자 질량 또는 질량 수와는 상이한 원자 질량 또는 질량 수를 갖는 하나 이상의 원자를 함유하는 동위원소-표지된 또는 -농축된 형태로 존재할 수 있다. 동위원소는 방사성 또는 비-방사성 동위원소일 수 있다. 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 불소, 염소 및 요오드와 같은 원자의 동위원소는 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 32P, 35S, 18F, 36Cl 및 125I를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 페이로드 (예를 들어 화학식 i의 화합물)는 동위원소-표지된 또는 -농축된 형태, 특히 중수소화 형태로 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 표현 "항체-접합된 약물" 및 "항체-약물 접합체"는 동일한 의미를 갖는다.
화학식 i의 화합물
한 측면에서, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 입체이성질체, 용매화물, 다형체(polymorph), 호변이성질체(tautomer), 동위원소 화합물, 대사산물 또는 전구약물(prodrug)이 제공되며, 여기서 상기 화합물은 화학식 i의 구조를 갖는다:
화학식 i
여기서,
a는 0 또는 1이고;
p1* 및 p2*로 표시된 탄소 원자는 각각 비대칭 중심이고, 비대칭 중심은 S 배위, R 배위 또는 라세미이고;
L1은, 치환되지 않거나 할로겐, -OH 및 -NH2로부터 선택된 하나의 치환체로 치환된 C1-6 알킬렌으로부터 선택되고;
M은 -CH2-, -NH- 또는 -O-이고;
L2는 C1-3 알킬렌이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, 할로겐 및 C1-6 알콕시로부터 선택된다.
실시양태에서, L1은 C1-6 선형 알킬렌, C1-6 분지형 알킬렌, C3-6 사이클릭 알킬렌 및 C3-4 사이클릭 알킬-C1-2 선형 알킬렌 그룹으로부터 선택되고, 이는 각각 독립적으로 치환되지 않거나 할로겐, -OH 및 -NH2로부터 선택된 하나의 치환체로 치환된다. 실시양태에서, L1은, 치환되지 않거나 할로겐, -OH 및 -NH2로부터 선택된 하나의 치환체로 치환된C1 -4 알킬렌으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, L1은 -CH2-, -C2H4-, 로부터 선택되고, 이것은 각각 독립적으로 치환되지 않거나 할로겐, -OH 및 -NH2로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환된다. 바람직한 실시양태에서, L1은 -CH2-, 로부터 선택되고, 여기서 "#"은 카보닐에 부착된 위치를 표시한다. 보다 바람직한 실시양태에서, L1은 -CH2-, 로부터 선택되고, 여기서 "#"은 카보닐에 부착된 위치를 표시한다. 특정 실시양태에서, L1은 -CH2-, 및 로부터 선택되고, 여기서 "#"은 카보닐에 부착된 위치를 표시한다. 바람직한 실시양태에서, 할로겐은 F, Cl 및 Br, 특히 F로부터 선택된다.
실시양태에서, a는 1이고, M은 -CH2-, -NH- 또는 -O-이고; L2는 -C2H4-이다. 또 다른 실시양태에서, a는 1이고, M은 -CH2-이고, L2는 -CH2-이다.
실시양태에서, p1*로 표시된 탄소 원자는 S 배위 또는 라세미, 바람직하게는 S 배위이다. 또 다른 실시양태에서, p2*로 표시된 탄소 원자는 S 배위 또는 라세미, 바람직하게는 S 배위이다.
실시양태에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-3 알킬, 할로겐 및 C1-3 알콕시로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 CH3-, F, Cl, Br 및 CH3O-로부터 선택된다. 실시양태에서, R1은 CH3- 및 Cl로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, R2는 F이다.
실시양태에서, a는 0이고, L1은 -CH2-, 및 로부터 선택되고, 여기서 "#"는 카보닐에 부착된 위치를 표시한다. 실시양태에서, a는 1이고, L1은 이고, M은 O이고, L2는 -C2H4-이다.
실시양태에서, a는 0이고, R1은 Cl이고, R2는 F이고, L1은 -CH2-, 및 로부터 선택된다. 실시양태에서, a는 0이고, R1은 CH3-이고, R2는 F이고, L1은 및 로부터 선택되고, 여기서 "#"는 카보닐에 부착된 위치를 표시한다.
실시양태에서, a는 1이고, R1은 CH3-이고, R2는 F이고, L1은 이고, M은 O이고, L2는 -C2H4-이다.
실시양태에서, 화합물은 다음으로부터 선택된다:
실시양태에서, 화합물은 다음으로부터 선택된다:
바람직한 실시양태에서, 화합물은 다음으로부터 선택된다:
바람직한 실시양태에서 화합물은 다음으로부터 선택된다:
보다 바람직한 실시양태에서, 화합물은 다음으로부터 선택된다:
특정 실시양태에서 화합물은 다음으로부터 선택된다:
한 측면에서, 다음으로부터 선택되는 화합물이 제공된다:
화학식 I의 화합물
한 측면에서, 화학식 I의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:
화학식 I
여기서,
opSu는 또는 이고;
R0는 C1-10 알킬이고;
n은 2 내지 20의 임의의 정수이고;
k1 및 k2는 독립적으로 1 내지 7의 정수이고;
i는 1-100의 정수이고;
j는 1-100의 정수이고;
P1 및 P2는 독립적으로 화학식 i'의 구조를 갖는 페이로드이고:
화학식 i'
여기서,
a, p1* 및 p2*로 표시된 탄소 원자, L1, M, L2, R1 및 R2는 화학식 i에 정의된 바와 같다.
실시양태에서, 페이로드는 다음으로부터 선택된다:
실시양태에서, 페이로드는 다음으로부터 선택된다:
바람직한 실시양태에서, 페이로드는 다음으로부터 선택된다:
바람직한 실시양태에서, 페이로드는 다음으로부터 선택된다:
보다 바람직한 실시양태에서, 페이로드는 다음으로부터 선택된다:
특정 실시양태에서, 페이로드는 다음으로부터 선택된다:
실시양태에서, R0는 C1-6 알킬이다. 바람직한 실시양태에서, R0는 C1-3 알킬이다. 특정 실시양태에서, R0는 메틸이다.
실시양태에서, n은 2 내지 5의 정수이다. 특정 실시양태에서, n은 3이다.
실시양태에서, k1 및 k2는 독립적으로 1, 또는 3 또는 5이다. 특정 실시양태에서, k1 및 k2는 독립적으로 5이다.
실시양태에서, i는 독립적으로 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 12, 보다 바람직하게는 2 내지 8의 정수이다. 특정 실시양태에서, i는 4이다.
실시양태에서, j는 독립적으로 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 12, 보다 바람직하게는 8 내지 12, 특히 8 또는 12의 정수이다. 특정 실시양태에서, j는 12이다.
실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 I-1의 구조를 갖는다:
[화학식 I-1]
여기서,
P1, P2, R0, opSu, n, i 및 j는 화학식 I에 정의된 바와 같다.
실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
BH-1 및
BH-2
화학식 I의 화합물의 구체적인 실시양태
한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물의 구조는 다음 표에 나타낸 바와 같다.
참고: 나열된 모든 화합물에 대해, P1 및 P2는 동일하며, 페이로드로서 기재된다.
화학식 I의 화합물의 제조
실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 링커를 페이로드와 연결함으로써 또는 일련의 적합한 구성 블록을 연결함으로써 합성될 수 있다. 이러한 구성 블록은 역합성 분석에 의해 용이하게 설계될 수 있으며, 당업계에 공지된 임의의 반응이 사용될 수 있다.
한 측면에서, 화학식 1의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:
화학식 1
여기서,
k는 1 내지 7의 정수이고;
P는 화학식 i'의 구조를 갖는 페이로드이고, 여기서 화학식 i'의 구조는 상기 정의된 바와 같다.
바람직한 실시양태에서, k는 1, 또는 3 또는 5이다. 특정 실시양태에서, k는 5이다.
화학식 1의 화합물은 제EP2907824A호에 개시된 바와 같은 합성 방법(예를 들어, 제EP2907824A호의 화학식 2 또는 2b에 대한 합성 방법)과 유사한 방법을 사용하여, 화학식 i의 화합물 및 다른 필요한 구성 블록을 사용하여 합성될 수 있다. 적합한 구성 블록은 연결-유닛 HX20113 및 연결-유닛 HX20111을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
그후, 그 안의 말레이미드 그룹은 화학식 I의 화합물에 대한 또 다른 구성 블록 상의 티올 그룹과 반응할 수 있다. 생성된 티오숙신이미드는 생리학적 조건하에서 불안정하고, 역 마이클 부가(reverse Michael addition)를 일으키기 쉬워 연결 부위에서 절단을 야기한다. 더욱이, 또 다른 티올 화합물이 시스템에 존재하는 경우, 티오숙신이미드는 또한 다른 티올 화합물과 티올 교환을 겪을 수 있다. 이러한 반응 둘 다는 페이로드의 감소를 유발하고 독성 부작용을 초래한다. 그후 티오숙신이미드는 개환 반응을 겪는다. 그후 화학식 I의 화합물이 수득될 수 있다.
개환 반응의 방법은 제WO2015165413A1호에서 찾아볼 수 있다. 개환된 숙신이미드 모이어티를 포함하는 화합물은 숙신이미드 개환 반응의 효율에 관계없이 고순도 및 정의된 조성으로 수득하기 위해 반분취/분취 HPLC 또는 다른 적절한 분리 수단에 의해 정제될 수 있다.
본 개시내용에서, 링커-페이로드(링커-소분자 중간체)에 적용될 때, 개환된 숙신이미드 구조는 더 이상 역 마이클 부가 또는 티올 교환을 겪지 않으며, 따라서 생성물은 보다 안정하다.
리가제 수용체 또는 공여체(donor) 기질의 인식 서열을 포함하는 모이어티
실시양태에서, 화학식 I의 화합물의 (Gly)n 모이어티는 리가제 수용체 또는 공여체 기질의 인식 서열이고, 이는 리가제의 촉매작용 하에서 화학식 I의 화합물과 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 효소-촉매된 커플링을 용이하게 한다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 임의로 변형되고, 리가제 수용체 또는 공여체 기질의 상응하는 인식 서열을 포함한다.
실시양태에서, 리가제는 트랜스펩티다제이다. 실시양태에서, 리가제는 천연 트랜스펩티다제, 비천연 트랜스펩티다제, 이의 변이체, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 비천연 트랜스펩티다제 효소는 천연 트랜스펩티다제의 조작에 의해 수득된 것일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 리가제는 천연 소르타제(Sortase), 비천연 소르타제, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 천연 소르타제의 종은 소르타제 A, 소르타제 B, 소르타제 C, 소르타제 D, 소르타제 L. 플란타룸 ( plantarum ) 등을 포함한다(US20110321183A1). 리가제의 유형은 리가제 인식 서열에 상응하며, 이에 의해 상이한 분자 또는 구조 단편 사이의 특이적 접합을 달성하는 데 사용된다.
실시양태에서, 화학식 I의 화합물의 (Gly)n 모이어티는 리가제 수용체 기질(ligase receptor substrate)의 인식 서열이고; 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 임의로 변형되며 리가제 공여체 기질의 상응하는 인식 서열을 포함한다
일부 실시양태에서, 리가제는 소르타제 A, 소르타제 B, 소르타제 C, 소르타제 D 및 소르타제 L. 플란타룸(plantarum)으로부터 선택되는 소르타제이다.
특정 실시양태에서, 리가제는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)로부터의 소르타제 A이다. 따라서, 리가제 공여체 기질의 리가제 인식 서열은 효소의 전형적인 LPXTG 인식 서열일 수 있다. 또 다른 특정 실시양태에서, 리가제 공여체 기질의 인식 서열은 LPXTGJ이고, 여기서 X는 천연 또는 비천연인 임의의 단일 아미노산일 수 있고; J는 부재하거나, 임의로 표지된 1-10개의 아미노산을 포함하는 아미노산 단편이다. 실시양태에서, J는 부재한다. 또 다른 실시양태에서, J는 1-10개의 아미노산을 포함하는 아미노산 단편이고, 여기서 각 아미노산은 독립적으로 임의의 천연 또는 비천연 아미노산이다. 또 다른 실시양태에서, J는 (Gly)m이고, 여기서 m은 1 내지 10의 정수이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 리가제 공여체 기질의 인식 서열은 LPETG이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 리가제 공여체 기질의 인식 서열은 LPETGG이다.
실시양태에서, 리가제는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus )로부터의 소르타제 B이고, 상응하는 공여체 기질 인식 서열은 NPQTN일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 리가제는 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)로부터의 소르타제 B이고, 상응하는 공여체 기질 인식 서열은 NPKTG일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 리가제는 스트렙토코커스 피로게네스 (Streptococcus pyogenes)로부터의 소르타제 A이고, 상응하는 공여체 기질 인식 서열은 LPXTGJ일 수 있으며, 여기서 J는 상기 정의된 바와 같다. 또 다른 실시양태에서, 리가제는 스트렙토마이세스 코엘리컬러 ( Streptomyces coelicolor )로부터의 소르타제 서브패밀리 5이고, 상응하는 공여체 기질 인식 서열은 LAXTG일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 리가제는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)으로부터의 소르타제 A이고, 상응하는 공여체 기질 인식 서열은 LPQTSEQ일 수 있다.
리가제 인식 서열은 또한 수동 스크리닝에 의해 최적화된 트랜스펩티다제에 대한 다른 완전히 새로운 인식 서열일 수 있다.
접합체 및 이의 제조
또한, 리가제 인식 서열을 포함하는 모이어티를 갖는 페이로드-보유 화합물 (화학식 I의 화합물)은 리가제 인식 서열을 포함하는 다른 분자와 접합될 수 있고, 이에 의해 예를 들어 항체-약물 접합체와 같은 항체-소분자 접합체의 제조에 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 화학식 I의 화합물, 및 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 접합체가 제공된다.
또 다른 측면에서, 화학식 II의 구조를 갖는 접합체가 제공된다:
화학식 II
여기서,
A는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
z는 1 내지 20의 정수이고;
P1, P2, R0, opSu, n , k1, k2, i 및 j는 화학식 I에 정의된 바와 같다.
바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 화학식 I의 화합물에서 (Gly)n 모이어티와 연결되도록 변형된다.
바람직한 실시양태에서, z는 1 내지 4이다. 특정 실시양태에서, z는 2이다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편
실시양태에서, 항체는 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-CD22 항체, 항-CD25 항체, 항-CD30/TNFRSF8 항체, 항-CD33 항체, 항-CD37 항체, 항-CD44v6 항체, 항-CD56 항체, 항-CD70 항체, 항-CD71 항체, 항-CD74 항체, 항-CD79b 항체, 항-CD117/KITk 항체, 항-CD123 항체, 항-CD138 항체, 항-CD142 항체, 항-CD174 항체, 항-CD227/MUC1 항체, 항-CD352 항체, 항-CLDN18.2 항체, 항-DLL3 항체, 항-ErbB2/HER2 항체, 항-CN33 항체, 항-GPNMB 항체, 항-ENPP3 항체, 항-넥틴(anti-Nectin)-4 항체, 항-EGFRvIII 항체, 항-SLC44A4/AGS-5 항체, 항-CEACAM5 항체, 항-PSMA 항체, 항-TIM1 항체, 항-LY6E 항체, 항-LIV1 항체, 항-넥틴4 항체, 항-SLITRK6 항체, 항-HGFR/cMet 항체, 항-SLAMF7/CS1 항체, 항-EGFR 항체, 항-BCMA 항체, 항-AXL 항체, 항-NaPi2B 항체, 항-GCC 항체, 항-STEAP1 항체, 항-MUC16 항체, 항-메조텔린(anti-Mesothelin) 항체, 항-ETBR 항체, 항-EphA2 항체, 항-5T4 항체, 항-FOLR1 항체, 항-LAMP1 항체, 항-카드헤린(anti-Cadherin) 6 항체, 항-FGFR2 항체, 항-FGFR3 항체, 항-CA6 항체, 항-CanAg 항체, 항-인테그린 αV 항체, 항-TDGF1 항체, 항-에프린 A4 항체, 항-TROP2 항체, 항-PTK7 항체, 항-NOTCH3 항체, 항-C4.4A 항체, 항-FLT3 항체, 항-B7H3/4 항체, 항-조직 인자 항체, 또는 항-ROR1/2 항체; 바람직하게는 항-HER2 항체, 항-FGFR3 항체, 항-Trop2 항체, 항-HER3 항체 또는 항-FRα 항체이다.
바람직한 실시양태에서, 항체는 항-HER2 항체이다. 실시양태에서, 항체는 항-인간 HER2 항체이다. 항-인간 HER2 항체의 예는 페르투주맙 및 트라스투주맙을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 페르투주맙은 HER2의 두 번째 세포외 도메인(ECD2)에 결합하며 HER2-양성 유방암의 치료를 위해 승인되었다. 트라스투주맙은 HER2의 네 번째 세포외 도메인(ECD4)에 결합하며 Her2-양성 유방암 및 위암의 치료를 위해 승인되었다.
한 실시양태에서, 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 항-HER2 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며, 여기서 VL은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하고, VH는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함한다. 한 실시양태에서, CDR 영역은 KABAT에 의해 정의된다. 한 실시양태에서, 항체는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 항-HER2 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 여기서 VL은 서열 번호 7과 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, VH는 서열 번호 8과 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 항-HER2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 여기서 VL은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖고, VH는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-HER2 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 여기서 경쇄는 서열 번호 9의 아미노산 1 내지 214의 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고: 중쇄는 서열 번호 10과 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 항-인간 HER2 항체는 트라스투주맙에 기초한 조작된 항-HER2 항체로부터 선택되는 하나 이상이다. 한 실시양태에서, 항체는 변형된 트라스투주맙, 바람직하게는 Ab0001-LCCTL-H (경쇄 서열 번호 9, 중쇄 서열 번호 10을 가짐)이다. Ab0001-LCCTL-HC의 서열은 트라스투주맙의 아미노산 서열에 기초하고, GALPETGG는 경쇄의 C-말단에 도입되었고, 여기서 LPETGG는 리가제 공여체 기질의 인식 서열이고, GA는 스페이서 서열이다.
바람직한 실시양태에서, 항-인간 HER2 항체는 단클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 항체 단편, 및 항체 모방체로부터 선택된 재조합 항체이다. 실시양태에서, 항체 모방체는 scFv, 미니바디, 디아바디, 나노바디로부터 선택된다. 화학식 I의 화합물과의 접합을 위해, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 화학식 I의 화합물에서 (Gly)n 모이어티와 접합하기 위한 변형된 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 변형된 모이어티의 도입 위치는 제한되지 않으며, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 상의 도입 위치는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단 또는 N-말단에 위치할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
대안적인 실시양태에서, 화학식 I의 화합물에서 (Gly)n 모이어티와 접합하기 위한 변형된 모이어티는 예를 들어 화학적 변형 방법을 사용하여 항체의 중쇄 또는 경쇄의 비-말단 위치에 도입될 수 있다.
실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 말단 변형을 포함할 수 있다. 말단 변형은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단 또는 N-말단에서의 변형을 지칭하며, 이는 예를 들어 리가제 인식 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 말단 변형은 2-100개의 아미노산을 포함하는 스페이서 Sp를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 항체, Sp 및 리가제 인식 서열은 순차적으로 연결된다. 바람직한 실시양태에서, Sp는 2-20개의 아미노산을 함유하는 스페이서 서열이다. 특정 실시양태에서, Sp는 GA, GGGGS, GGGGSGGGGS 및 GGGGSGGGGSGGGS, 특히 GA로부터 선택된 스페이서 서열이다.
바람직한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄는 3가지 유형을 포함한다: 야생형(LC); 리가제 인식 서열 LPXTG의 직접 도입에 의해 변형되는 C-말단 변형된 경쇄(LCCT) 및 짧은 펩티드 스페이서와 리가제 공여체 기질 인식 서열 LPXTG의 도입에 의해 변형되는 C-말단 변형된 경쇄(LCCTL). 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄는 3가지 유형을 포함한다: 야생형(HC); 리가제 인식 서열 LPXTG의 직접 도입에 의해 변형되는 C-말단 변형된 중쇄(HCCT); 및 짧은 펩티드 스페이서와 리가제 공여체 기질 인식 서열 LPXTG의 도입에 의해 변형디는 C-말단 변형된 중쇄(HCCTL). X는 임의의 천연 또는 비천연 단일 아미노산일 수 있다. 화학식 II의 화합물에서 z가 1 또는 2인 경우, 상기 중쇄 및 경쇄의 조합은 8개의 바람직한 항체 분자를 형성할 수 있다.
실시양태에서, 화학식 II의 화합물은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
CH-1 및
CH-2.
접합체의 구체적인 실시양태
실시양태에서, 페이로드는 세포독소 또는 이의 단편이다. 실시양태에서, 항체-약물 접합체는 다음 표에 나타낸 바와 같다.
ADC의 명명법: 괄호 안의 숫자는 항체에 연결되도록 의도된 페이로드(약물) 분자의 수를 나타낸다.
참고: 1. 나열된 모든 ADC에 대해, P1과 P2는 동일하며, 페이로드로서 기재되고; z는 2이고; 항체는 Ab0001-LCCTL-HC (경쇄 서열 번호 9, 중쇄 서열 번호 10)이다.
2. 상기 열거된 ADC가 상기 열거된 링커-페이로드 및 상기 열거된 항체 (표적화 분자)에 의해 형성될 때, 항체의 LPETGG 서열에서 GG의 상류 펩티드 결합은 소르타제 A에 의해 절단되고, 생성된 중간체는 링커-페이로드에서 G3의 자유 N- 말단에 연결되어 새로운 펩티드 결합을 생성하여, 이에 따른 아미노산 서열 LPXTG3을 형성한다.
접합체의 제조
본 개시내용의 접합체 (즉, 화학식 II의 화합물)는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 접합체는 항체 또는 항원 결합 단편 및 화학식 I의 화합물의 리가제-촉매된 부위-특이적 접합에 의해 제조되고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 리가제 인식 서열에 의해 변형된다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 화학식 1의 화합물은 기질의 리가제-특이적 인식 서열을 통해 서로 연결된다. 인식 서열은 사용된 특정 리가제에 따라 좌우된다. 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 및/또는 중쇄의 C-말단에 도입된 인식 서열-기반 말단 변형을 갖는 항체이고, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 야생형 또는 최적화된 조작 리가제 또는 이의 임의의 조합의 촉매작용 하에, 및 적절한 촉매 반응 조건하에, 화학식 I의 화합물과 접합된다.
특정 실시양태에서, 리가제는 소르타제 A이고 접합 반응은 하기 반응식으로 나타낼 수 있다:
삼각형은 항체의 일부를 나타내고; 오각형은 화학식 II의 화합물의 일부를 나타내고; Gn은 (Gly)n 모이어티를 나타낸다. n, X 및 J는 각각 상기 정의된 바와 같다. 수용체 기질의 상응하는 인식 서열인 Gn과 접합될 때, LPXTGJ 서열에서 글리신의 상류 펩티드 결합은 소르타제 A에 의해 절단되고, 생성된 중간체는 Gn의 자유 N-말단에 연결되어 새로운 펩티드 결합을 생성한다. 생성된 아미노산 서열은 LPXTGn이다. 서열 Gn 및 LPXTGJ는 상기 정의된 바와 같다.
따라서, 한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물에서 Gn 모이어티는 리가제의 리가제 수용체 기질의 인식 서열이고; 항체는 화학식 I의 화합물에서 Gn 모이어티와 연결하기 위해 리가제 공여체 기질의 인식 서열을 포함하도록 변형된다;
바람직하게는,
(a) 리가제는 소르타제 A, 소르타제 B, 소르타제 C, 소르타제 D 및 소르타제 L. 플란타룸으로부터 선택되는 소르타제; 바람직하게는 스타필로코커스 아우레우스로부터의 소르타제 A이고/이거나;
(b) 리가제 공여체 기질의 인식 서열은 LPXTGJ이고, J는 부재이거나 Gm이고, 여기서 G는 글리신이고, m은 1 내지 10의 정수이고, X는 천연 또는 비천연인 임의의 단일 아미노산이고; 바람직하게는, 리가제 공여체 기질의 인식 서열은 LPXTG 또는 LPETGG이고/이거나;
LPXTGJ와 Gn의 연결은 LPXTGn을 초래한다.
본 개시내용의 화학식 I의 화합물은 정의된 구조, 정의된 조성 및 고순도를 가지므로, 항체와의 접합 반응이 수행될 때, 더 적은 불순물이 도입되거나 또는 다른 불순물이 도입되지 않는다. 이러한 중간체가 리가제 인식 서열을 함유하는 변형된 항체와의 리가제-촉매된 부위-특이적 접합을 위해 사용될 때, 고도로 제어 가능한 품질을 갖는 균질한 ADC가 수득된다.
생리학적 환경에서의 접합체의 대사
일부 또는 전체 링커가 종양 세포에서 절단되는 경우, 페이로드가 방출된다. 링커가 항종양 화합물에 대한 연결 위치에서 절단됨에 따라, 항종양 화합물은 이의 고유 구조로 방출되어 이의 고유 항종양 효과를 나타낸다.
실시양태에서, 화학식 I의 화합물에 의해 포함되는 GGFG (Gly-Gly-Phe-Gly) 모이어티는 리소좀 효소 (예를 들어, 카텝신 B 및/또는 카텝신 L)에 의해 절단될 수 있다.
실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 자가-희생 스페이서를 포함한다. 실시양태에서, 자가-희생 스페이서는 아세탈 또는 헤테로아세탈이다. 실시양태에서, 화학식 I의 화합물에 의해 포함된 -GGFG-NH-CH2-O- 모이어티는 제한 효소 부위 및 자가-희생 스페이서의 조합을 나타내며, 이는 세포에서 절단되고 목적된 분자 (예를 들어 항종양 화합물)를 방출한다.
약제학적 조성물 및 약제학적 제제
본 개시내용의 또 다른 목적은 본 개시내용의 접합체 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 인간 또는 동물의 증상을 예방, 완화, 예방 또는 치료하는 효과를 달성하는 한 어떠한 방식으로도 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여 경로에 따라 다양한 적절한 투여 형태, 특히 주사용 동결건조 분말, 주사제, 또는 주사용 멸균 분말과 같은 주사제를 제조할 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용되는"은 통상의 의학적 판단의 범위 내에서 환자의 조직과 접촉하였을 때, 과도한 독성, 자극 또는 알레르기 반응 등이 야기되지 않고, 합리적인 장점-단점 비율을 가지며 의도된 용도에 효과적인 것을 의미한다.
용어 약제학적으로 허용되는 담체는 약제학적으로 허용되고 접합체의 생체활성 및 특성을 방해하지 않는 담체 물질을 지칭한다. 수성 담체의 예는 완충 염수 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용되는 담체는 또한 조성물을 생리학적 조건에 근접하게 가져오는 담체 물질, 예를 들어, pH 조절제, 완충제, 독성 조절제 등, 및 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등을 포함한다.
실시양태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 약 1 내지 약 20, 예를 들어 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 8, 약 1 내지 약 6, 약 1 내지 약 4, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 4, 또는 약 3 내지 약 4의 정수 또는 비-정수(non-integer)의 약물 대 항체 비율 (DAR)을 갖는다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 접합체는 약 4의 DAR을 갖는다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 접합체는 약 3.3 내지 약 3.75, 특히 약 3.4 내지 약 3.65의 DAR을 갖는다.
치료 방법 및 용도
본 개시내용의 접합체는 종양 및/또는 자가면역 질환의 치료에 유용하다. 접합체 치료에 취약한 종양에는 특정 종양-관련 항원 또는 세포 표면 수용체를 특징으로 하는 종양이 포함되며, 이들은 접합체의 표적 분자(항체)에 의해 인식될 것이며 접합체의 페이로드/세포독소에 의해 사멸될 수 있다.
따라서, 또 다른 측면에서, 종양 또는 자가면역 질환으로부터 선택된 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 본 개시내용의 접합체, 또는 본 개시내용의 약제학적 조성물의 용도가 또한 제공된다.
또 다른 측면에서, 종양 또는 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 본 개시내용의 접합체, 또는 본 개시내용의 약제학적 조성물이 제공된다.
추가의 측면에서, 종양 또는 자가면역 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 개시내용의 접합체, 또는 본 개시내용의 약제학적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 항-HER2 항체와 소분자 세포독소의 접합에 의해 형성된 본 개시내용의 접합체는 종양 세포의 표면 상의 HER2에 특이적으로 결합하고 HER2-발현 종양 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 항-인간 HER2 항체는 항-인간 HER2 항체이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, HER2-양성 종양으로부터 선택되는 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 본 개시내용의 접합체, 또는 본 개시내용의 약제학적 조성물의 용도가 제공된다. 보다 바람직한 실시양태에서, 질환, 장애 또는 병태는 유방암, 위암, 폐암, 난소암, 요로상피암 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
대상체에 투여되는 접합체의 투여량은 상당한 정도로 조절될 수 있다. 투여량은 특정 투여 경로 및 대상체의 필요에 따라 달라질 수 있으며, 의료 전문가의 판단에 따를 수 있다.
상기 정의된 바와 같이, 본 개시내용의 실시양태들은 또한 하기 [1] 내지 [20]으로서 기재될 수 있다:
[1] 화학식 I의 화합물:
화학식 I
여기서,
opSu는 또는 이고;
R0는 C1-10 알킬이고;
n은 2 내지 20의 임의의 정수이고;
k1 및 k2는 독립적으로 1 내지 7의 정수이고;
i는 1-100의 정수이고;
j는 1-100의 정수이고;
P1 및 P2는 독립적으로 화학식 i'의 구조를 갖는 페이로드이고:
화학식 i'
여기서,
a는 0 또는 1이고;
p1* 및 p2*로 표시된 탄소 원자는 각각 비대칭 중심이고, 비대칭 중심은 S 배위, R 배위 또는 라세미이고;
L1은, 치환되지 않거나 할로겐, -OH 및 -NH2로부터 선택된 하나의 치환체로 치환된 C1-6 알킬렌으로부터 선택되고;
M은 -CH2-, -NH- 또는 -O-이고;
L2는 C1-3 알킬렌이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, 할로겐 및 C1-6 알콕시로부터 선택된다.
[2] 화학식 I-1의 구조를 갖는, [1]의 화합물:
화학식 I-1
여기서,
P1, P2, R0, opSu, n, i 및 j는 [1]에 정의된 바와 같다.
[3] 화학식 i'에서:
L1이, 각각 독립적으로 치환되지 않거나 할로겐, -OH 및 -NH2로부터 선택된 하나의 치환체로 치환된 C1-6 선형 알킬렌, C1-6 분지형 알킬렌, C3-6 사이클릭 알킬렌 및 C3-4 사이클릭 알킬-C1-2 선형 알킬렌 그룹으로부터 선택되고;
바람직하게는,
L1이, 각각 독립적으로 치환되지 않거나 할로겐, -OH 및 -NH2로부터 선택된 하나의 치환체로 치환된 C1-4 선형 알킬렌, C1-4 분지형 알킬렌, C3-4 사이클릭 알킬렌 및 사이클로프로필-메틸렌으로부터 선택되고;
바람직하게는, L1이, 각각 독립적으로 치환되지 않거나 할로겐, -OH 및 -NH2로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환된 -CH2-, -C2H4-, 로부터 선택되고;
보다 바람직하게는, L1이 -CH2-, 로부터 선택되고, 여기서 "#"은 카보닐에 부착된 위치를 표시하고;
추가로 바람직하게는, L1이 -CH2-, 로부터 선택되고, 여기서 "#"은 카보닐에 부착된 위치를 표시하고;
특히, L1이 -CH2-, 및 로부터 선택되고, 여기서 "#"은 카보닐에 부착된 위치를 표시하고/하거나;
할로겐이 F, Cl 및 Br로부터 선택되는, [1] 또는 [2]의 화합물.
[4] 화학식 i'에서:
M이 -CH2-, -NH- 또는 -O-이고; L2가 -C2H4-이거나;
M이 -CH2-이고, L2가 -CH2-인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 화합물.
[5] 화학식 i'에서:
p1*로 표시된 탄소 원자가 S 배위 또는 라세미, 바람직하게는 S 배위이고/이거나;
p2*로 표시된 탄소 원자가 S 배위 또는 라세미, 바람직하게는 S 배위인, [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 화합물.
[6] 화학식 i'에서:
R1 및 R2가 각각 독립적으로 수소, C1-3 알킬, 할로겐 및 C1-3 알콕시로부터 선택되고;
바람직하게는, R1 및 R2가 각각 독립적으로 CH3-, F, Cl, Br 및 CH3O-로부터 선택되고;
보다 바람직하게는,
R1이 CH3- 및 Cl로부터 선택되고/되거나;
R2가 F이고;
추가로 바람직하게는,
a가 0이고, R1이 Cl이고, R2가 F이고, L1이 -CH2-, 및 로부터 선택되거나;
a가 0이고, R1이 CH3-이고, R2가 F이고, L1이 및 로부터 선택되고, 여기서 "#"가 카보닐에 부착된 위치를 표시하거나;
a가 1이고, R1이 CH3-이고, R2가 F이고, L1이 이고, M이 O이고, L2가 -C2H4-인, [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 화합물.
[7] 페이로드가 다음으로부터 선택되고:
바람직하게는 다음으로부터 선택되고:
보다 바람직하게는 다음으로부터 선택되고:
특히 다음으로부터 선택되는, [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 화합물:
.
[8] R0가 C1-6 알킬, 바람직하게는 C1-3 알킬; 특히 메틸이고/이거나;
n이 2 내지 5, 특히 3의 정수이고/이거나;
k1 및 k2가 독립적으로 1, 또는 3 또는 5, 특히 5이고;
i가 독립적으로 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 12, 보다 바람직하게는 2 내지 8, 특히 4의 정수이고/이거나;
j가 독립적으로 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 12, 보다 바람직하게는 8 내지 12, 특히 8 또는 12, 특히 12의 정수인, [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 화합물.
[9] 다음으로부터 선택되는, [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 화합물:
[10] 화학식 II의 구조를 갖는 접합체:
화학식 II
여기서,
A는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고; 항체 또는 항원 결합 단편은 바람직하게는 화학식 I의 화합물에서 (Gly)n 모이어티와 연결되도록 변형되며;
z는 1 내지 20; 바람직하게는 1 내지 4; 특히 2의 정수이고;
P1, P2, R0, opSu, n , k1, k2, i 및 j는 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 정의된 바와 같다.
[11] 다음으로부터 선택되는, [10] 중 어느 하나의 접합체:
[12] 항체가 항-인간 HER2 항체, 바람직하게는 트라스투주맙인, [10] 내지 [11] 중 어느 하나의 접합체.
[13] 예방적 또는 치료적 유효량의 [10] 내지 [12] 중 어느 하나의 접합체, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
[14] 접합체가 1 내지 8, 특히 3 내지 4의 정수 또는 비-정수의 약물 대 항체 비율 (DAR)을 갖는, [13]의 약제학적 조성물.
[15] 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, [10] 내지 [12] 중 어느 하나의 접합체, 또는 [13] 또는 [14]의 약제학적 조성물의 용도로서; 여기서 질환은 종양 또는 자가면역 질환; 바람직하게는 HER2-양성 종양 세포를 포함하는 종양인 용도.
[16] HER2-양성 종양 세포를 포함하는 종양이 HER2 저-발현 종양 세포를 추가로 포함하고;
여기서 HER2 저-발현 종양 세포가 HER2-양성 종양 세포보다 더 낮은 수준의 HER2를 발현하는, [15]의 용도.
[17] 화학식 i의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 입체이성질체, 용매화물, 다형체, 호변이성질체, 동위원소 화합물, 대사산물 또는 전구약물:
화학식 i
여기서,
a, p1* 및 p2*로 표시된 탄소 원자, L1, M, L2, R1 및 R2는 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 정의된 바와 같다.
[18] 다음으로부터 선택되고:
바람직하게는 다음으로부터 선택되고:
보다 바람직하게는 다음으로부터 선택되고:
특히 다음으로부터 선택되는, [17]의 화합물:
.
[19] 화학식 1의 화합물:
화학식 1
여기서,
k는 1 내지 7; 바람직하게는 1, 또는 3 또는 5, 특히 5의 정수이고,
P는 화학식 i'의 구조를 갖는 페이로드이고, 여기서 화학식 i'의 구조는 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 정의된 바와 같다.
[20] 다음으로부터 선택되는, [19]의 화합물:
유익한 효과
단독으로 또는 ADC의 성분으로서 사용되는 본 개시내용에 제공된 신규한 소분자 토포이소머라제 I 억제제는 선행 기술을 능가하는 더 큰 활성, 안정성, 물리화학적 특성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 항체-약물 접합체는 특별히 설계된 링커-페이로드를 사용하며, 큰 효능 및 방관자 사멸 효과를 달성할 수 있다. 동시에, 보다 낮은 DAR을 갖고, 따라서 부작용을 줄이고 치료 지수를 높일 수 있으며, 이는 방관자 사멸에 특히 중요한다. 본 발명의 항체-약물 접합체는 개환 숙신이미드 구조와 같은 이의 구조가 보다 안정하다.
본 개시내용은 독특한 구조를 가진 링커를 사용하고, 표적화 분자(항체)와 페이로드의 접합을 촉매하기 위해 리가제를 사용한다. 본 개시내용의 접합체는 양호한 균질성 및 높은 활성을 갖는다. 또한, 링커-페이로드 중간체의 독성은 유리 페이로드의 독성보다 훨씬 낮고, 따라서 약물의 제조 공정이 덜 해로우며, 이는 산업 생산에 유리하다.
본 개시내용의 접합체는 다음의 기술적 효과 중 적어도 하나를 달성한다:
(1) 표적 세포에 대한 높은 억제 활성, 및 강력한 방관자 사멸 효과.
(2) 우수한 물리화학적 특성(예를 들어, 용해도, 물리적 및/또는 화학적 안정성).
(3) 우수한 약동학적 특성(예를 들어, 혈장에서 우수한 안정성, 적절한 반감기 및 작용 지속기간).
(4) 우수한 안전성(비표적 정상 세포 또는 조직에 대한 낮은 독성 및/또는 더 적은 부작용, 더 넓은 치료 창) 등.
(5) 고도의 모듈식 설계, 다중 약물의 간단한 조립.
실시예
제조 실시예
상기 목적들 및 기술적 해결책들을 보다 명확하게 예시하기 위해, 본 개시내용은 구체적인 실시예를 참조하여 이하에서 추가로 기재된다. 실시예는 본 개시내용의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 하기 실시예에서 언급하지 않았던 구체적인 실험 방법은 종래의 실험 방법에 따라 수행하였다.
기기, 재료 및 시약
달리 언급되지 않는 한, 실시예에서 사용된 기기 및 시약은 상업적으로 이용 가능하다. 시약은 추가 정제 없이 직접 사용할 수 있다.
MS: Thermo Fisher Q Exactive Plus, Water2795-Quattro 마이크로 삼중 사중극자 질량분석기
HPLC : Waters 2695, Agilent 1100, Agilent 1200
반분취 HPLC: Lisure HP plus 50D
유세포 분석: CytoFLEX S
HIC-HPLC: 부틸-HIC; 이동상 A: 25 mM PB, 2M (NH4)2SO4, pH 7.0; 이동상 B: 25 mM PB, pH 7.0; 유속: 0.8 ml/분; 획득 시간: 25분; 주입량: 20 μg; 컬럼 온도: 25℃; 검출 파장: 280 nm; 샘플 챔버 온도: 8℃.
SEC-HPLC: 컬럼: TSK-gel G3000 SWXL, TOSOH 7.8 mm ID × 300 mm, 5 μm; 이동상: 0.2 M KH2PO4, 0.25 M KCl, pH 6.2; 유속 : 0.5 ml/분; 획득 시간: 30분; 주입량: 50 μl; 컬럼 온도: 25℃; 검출 파장; 280 nm; 샘플 트레이 온도: 8℃.
CHO는 Thermo Fisher Scientific으로부터 입수하였고; pcDNA 3.3은 Life Technology로부터 입수하였고; HEK293F는 Prejin으로부터 입수하였고; PEIMAX 형질감염 시약은 Polyscience로부터 입수하였고; MabSelect Sure ProA는 GE로부터 입수하였고; Capto S ImpAct는 GE로부터 입수하였고; 링크-아미드-MBHA 수지 및 디클로로 수지는 Nankai synthesis로부터 입수하였고; HCC1954는 ATCC CAT#CRL-2338로부터 입수하였고; SK-BR-3은 ATCC CAT# HTB-30으로부터 입수하였고; BT-474는 ATCC CAT# HTB-20으로부터 입수하였고; NCI-N87 세포는 ATCC CAT# CRL-5822로부터 입수하였고; MCF7은 ATCC CAT# HTB-22로부터 입수하였고; MDA-MB-231은 ATCC CAT# HTB-26으로부터 입수하였고; MDA-MB-468은 ATCC CAT# HTB-132로부터 입수하였고; CFPAC-1은 ATCC CAT# CRL-1918로부터 입수하였고; NCI-H2110은 ATCC CAT# CRL-5924로부터 입수하였고; JIMT-1은 Wuxi Apptech로부터 입수하였고; Capan-1은 ATCC CAT# CRL-1573으로부터 입수하였고; 항체 트라스투주맙은 공지된 서열에 따라 제조되고; 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus )로부터 유래된 최적화된 재조합 효소 소르타제 A는 대장균(E. coli )에서 제조된다.
일부 경우에, 전술한 반응식을 수행하는 순서는 반응을 용이하게 하거나 원치않는 반응 생성물을 피하기 위해 변경될 수 있다. 본 발명이 보다 완전하게 이해될 수 있도록 하기 실시예가 제공된다. 이들 실시예는 예시적일 뿐이며, 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1 페이로드 소분자의 제조
중간체 11
단계 A: N-(2-브로모-5-플루오로페닐)아세트아미드: 아세트산 (500 mL) 중의 아세트산 무수물 (214 g, 2.10 mol)의 교반 용액에 con. H2SO4 (3 mL)을 첨가한 다음 2-브로모-5-플루오로아닐린 (100 g, 526.27 mmol)을 실온에서 소량씩 나누어 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 교반한 다음 2000 mL 빙수에 부었다. 침전물이 형성되었으며, 이를 여과에 의해 수집하고 실온에서 진공에서 건조시켜 N-(2-브로모-5-플루오로페닐)아세트아미드 (105 g)를 황색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.68 (dd, J = 8.9, 6.0 Hz, 1H), 7.61 (ddd, J = 10.7, 5.3, 3.1 Hz, 1H), 7.02 (ddd, J = 8.9, 8.0, 3.1 Hz, 1H), 2.11 (s, 3H). LCMS m/z 232.0(M+H).
단계 B: N-(5-플루오로-2-(1-하이드록시사이클로부틸)페닐)아세트아미드: THF (1000 mL) 중의 N-(2-브로모-5-플루오로페닐)아세트아미드 (105 g, 452.48 mmol)의 교반 용액에 n-BuLi (594 mL, n-헥산 중의 1.6 M, 950.22 mmol)를 -78℃에서 1시간에 걸쳐 적가하였다. 완료 후, 혼합물을 N2 하에 0.5시간 동안 교반하였다. 그후 THF (50 mL) 중의 사이클로부타논 (38.06 g, 542.98 mmol)의 용액을 -78℃에서 0.5시간에 걸쳐 적가하고, 혼합물을 -78℃에서 실온으로 6시간 동안 교반하였다. 혼합물을 0℃에서 500 mL 포화 NH4Cl aq에 부었다. 에틸 아세테이트 (500 mL x 3)로 추출하고, 염수 (250 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고 농축시켰다. 혼합물을 (PE/EA =1:1, 100 mL)로 10분 동안 연마하고, 여과하고 케이크를 수집하고 진공에서 건조시켜 N-(5-플루오로-2-(1-하이드록시사이클로부틸)페닐)아세트아미드 (24 g)를 황색 고체로서 제공하였다. LCMS m/z 206.1(M-18+H), 246.1(M+Na).
단계 C: N-(3-플루오로-8-옥소-5,6,7,8-테트라하이드로나프탈렌-1-일)아세트아미드: CH2Cl2 (170 mL) 및 물 (170 mL) 중의 N-(5-플루오로-2-(1-하이드록시사이클로부틸)페닐)아세트아미드 (24 g, 107.50 mmol)의 교반 혼합물에 질산은 (AgNO3) (5.48 g, 32.25 mmol) 및 과황산칼륨 (K2S2O8) (58.12 g, 215.01 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 30℃에서 6시간 동안 교반하였다. 혼합물을 셀라이트 상에서 여과하고 CH2Cl2 (100 mL)로 세척하고, 여액을 농축시키고 FCC(EA/PE=0-40%)로 정제하여 N-(3-플루오로-8-옥소-5,6,7,8-테트라하이드로나프탈렌-1-일)아세트아미드 (14 g)를 담황색 고체로서 제공하였다. LCMS m/z 222.1(M+H).
단계 D: N-(3-플루오로-7-(하이드록시이미노)-8-옥소-5,6,7,8-테트라하이드로나프탈렌-1-일)아세트아미드: 0℃에서 THF (500 mL) 중의 N-(3-플루오로-8-옥소-5,6,7,8-테트라하이드로나프탈렌-1-일)아세트아미드 (14 g, 63.28 mmol)의 교반 혼합물에 1-부틸 니트라이트 (8.48 g, 63.28 mmol)를 첨가한 다음 t-BuOK(8.52 g, 75.94 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 완료 후, 혼합물을 HCl (2 N)에 의해 산성화시켜 pH=3으로 조절하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (200 mL x 3)로 추출하고, 염수 (100 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고 감압하에 농축시켰다. 조 혼합물을 3급-부틸 메틸 에테르 (200 mL)로 10분 동안 연마한 다음 여과하고 케이크를 수집하고 진공에서 건조시켜 N-(3-플루오로-7-(하이드록시이미노)-8-옥소-5,6,7,8-테트라하이드로나프탈렌-1-일)아세트아미드 (12 g)를 황색 고체로서 제공하였다. LCMS m/z 251.1(M+H).
단계 E: N,N'-(3-플루오로-8-옥소-5,6,7,8-테트라하이드로나프탈렌-1,7-디일)디아세트아미드: 아세트산 무수물 (90 mL) 및 THF (90 mL) 중의 N-(3-플루오로-7-(하이드록시이미노)-8-옥소-5,6,7,8-테트라하이드로나프탈렌-1-일)아세트아미드 (12 g, 47.96 mmol)의 용액에 10% Pd/C (1 g)를 첨가하고, 혼합물을 25℃에서 H2 대기하에 16시간 동안 교반하였다. 0℃로 냉각시킨 후, Et3N (20 mL)를 적가하고, 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 셀라이트 상에서 여과하고, 여액을 빙수 (500 mL)에 부었다. 에틸 아세테이트 (500 mL x 3)로 추출하고, 염수 (250 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 3급-부틸 메틸 에테르 (120 mL)로 10분 동안 연마하고, 여과하고 케이크를 수집하고 진공에서 건조시켜 N,N'-(3-플루오로-8-옥소-5,6,7,8-테트라하이드로나프탈렌-1,7-디일)디아세트아미드 (7.9 g)를 황색 고체로서 제공하였다. LCMS m/z 279.1(M+H).
단계 F: N,N'-(3-플루오로-8-옥소-5,6,7,8-테트라하이드로나프탈렌-1,7-디일)디아세트아미드: MeOH (150 mL) 중의 N,N'-(3-플루오로-8-옥소-5,6,7,8-테트라하이드로나프탈렌-1,7-디일)디아세트아미드 (7.9 g, 28.39 mmol)의 용액에 HCl aq (2 N, 150 mL)을 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 7시간 동안 교반하였다. 0℃로 냉각시킨 후, Sat. NaHCO3 aq를 적가하여 pH = 8로 추출하였다. 에틸 아세테이트 (200 mL x 3)로 추출하고, 염수 (200 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고 감압하에 농축시켜 N,N'-(3-플루오로-8-옥소-5,6,7,8-테트라하이드로나프탈렌-1,7-디일)디아세트아미드 (6.0 g)를 황색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 6.57 (s, 3H), 6.18 (td, J = 11.1, 2.4 Hz, 2H), 4.52 (dt, J = 13.3, 5.0 Hz, 1H), 3.13 (ddd, J = 17.5, 13.0, 4.6 Hz, 1H), 3.00 - 2.81 (m, 1H), 2.69 (dtd, J = 9.4, 4.6, 2.5 Hz, 1H), 2.09 (s, 3H), 1.79 (qd, J = 13.0, 4.3 Hz, 1H). LCMS m/z 237.1(M+H).
단계 G: N-(8-아미노-5-클로로-6-플루오로-1-옥소-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-2-일)아세트아미드: DMF (80 mL) 중의 N,N'-(3-플루오로-8-옥소-5,6,7,8-테트라하이드로나프탈렌-1,7-디일)디아세트아미드 (4.0 g, 16.93 mmol)의 용액에 0℃에서 NCS (2.26 g, 16.93 mmol)를 소량씩 나누어 첨가하고, 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 200 mL 빙수에 부었다. 침전물이 형성되었으며, 이를 여과에 의해 수집하고 실온에서 진공에서 건조시켜 N-(8-아미노-5-클로로-6-플루오로-1-옥소-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-2-일)아세트아미드 (4.0 g)를 황색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.11 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.71 (s, 2H), 6.62 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.53 (ddd, J = 13.0, 8.0, 4.7 Hz, 1H), 3.18 - 3.04 (m, 1H), 2.91 (ddd, J = 17.5, 12.4, 4.8 Hz, 1H), 2.21 - 2.08 (m, 1H), 1.99 - 1.83 (m, 4H). LCMS m/z 271.0(M+H).
단계 H: N-((9S)-4-클로로-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아세트아미드: 톨루엔 (400 mL) 중의 N-(8-아미노-5-클로로-6-플루오로-1-옥소-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-2-일)아세트아미드 (4.0 g, 14.78 mmol)의 혼합물에 (S)-4-에틸-4-하이드록시-7,8-디하이드로-1H-피라노[3,4-f]인돌리진-3,6,10(4H)-트리온 (4.28 g, 16.25 mmol), 피리디늄 p-톨루엔 설포네이트 (1.11 g, 4.43 mmol) 및 o-크레졸 (10 mL)을 첨가하고, 혼합물을 N2 하에 24시간 동안 환류되도록 가열하였다. 용매를 감압에 의해 제거하고 혼합물을 FCC(THF/CH2Cl2=0-60%)로 정제하여 N-((9S)-4-클로로-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아세트아미드 (4.1 g)를 갈색 고체로서 제공하였다. LCMS m/z 498.1(M+H).
단계 I: (9S)-1-아미노-4-클로로-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-1,2,3,9,12,15-헥사하이드로-10H,13H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13-디온: 20 mL con. HCl aq 중의 N-((9S)-4-클로로-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아세트아미드 (2.0 g, 4.02 mmol)의 혼합물을 70℃에서 N2 하에 36시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압하에 농축시켜 조악한 (9S)-1-아미노-4-클로로-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-1,2,3,9,12,15-헥사하이드로-10H,13H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13-디온 하이드로클로라이드 (2 g)를 갈색 고체로서 제공하였다. LCMS (ESI) m/z 456.1 [M+H]+.
중간체 12
중간체 12：(9S)-1-아미노-4-브로모-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-1,2,3,9,12,15-헥사하이드로-10H,13H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13-디온 하이드로브로마이드는 중간체 11에 대해 상기와 유사한 과정을 사용하여 2-브로모-5-플루오로아닐린으로부터 합성하였다. LCMS (ESI) m/z 500.0 [M+H]+.
중간체 13
중간체 13：(9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메톡시-1,2,3,9,12,15-헥사하이드로-10H,13H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13-디온 하이드로클로라이드는 중간체 11에 대해 상기와 유사한 과정을 사용하여 2-브로모-5-플루오로-4-메톡시아닐린으로부터 합성하였다. LCMS (ESI) m/z 452.1 [M+H]+.
C730 및 C731의 과정
C730 및 C731은 (9S)-1-아미노-4-클로로-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-1,2,3,9,12,15-헥사하이드로-10H,13H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13-디온 하이드로클로라이드 (중간체 11)로부터 TFA 염으로서 prep-HPLC에 의해 제조하였다.
표 I.
상기 HPLC의 조건: 장비: Agilent 1200; 크로마토그래피 컬럼: Waters XBridge C18 4.6*50mm,3.5um; 유동: 2.0mL/분; 구배 용리: 5.0%-95.0%-95.0%-5.0%-5.0%, 0.00분-1.50분-2.50분-2.52분-3.00분; 온도 : 40℃; 이동상 : A: 아세토니트릴, B: H2O (0.05% TFA); 파장: 214 nm/254 nm.
C518의 과정
단계 J: N-((1S,9S)-4-클로로-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-2-하이드록시아세트아미드: 2 mL DMF 중의 조악한 (9S)-1-아미노-4-클로로-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-1,2,3,9,12,15-헥사하이드로-10H,13H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13-디온 하이드로클로라이드 (50 mg, 0.10 mmol)의 용액에 0℃에서 2-하이드록시아세트산 (11.6 mg, 0.15mmol), HATU (57.9 mg, 0.15 mmol)에 이어 Et3N (20.5 mg, 0.20mmol)을 적가하고, 혼합물을 0℃에서 실온으로 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 10 mL 빙수에 붓고, 에틸 아세테이트 (20 mL x 3)로 추출하고, 염수 (20 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 prep-HPLC로 정제하여 N-((1S,9S)-4-클로로-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-2-하이드록시아세트아미드 (6 mg)를 황색 고체로서 제공하고 N-((1R,9S)-4-클로로-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-2-하이드록시아세트아미드 (5 mg)를 황색 고체로서 제공하였다.
하기 표 II에서 제조된 화합물은 실시예 C518과 동일한 방법으로 반응시키고 후처리하였다.
표 II.
상기 HPLC의 조건: 장비: Agilent 1200; 크로마토그래피 컬럼: Waters XBridge C18 4.6*50mm,3.5um; 유동: 2.0mL/분; 구배 용리: 5.0%-95.0%-95.0%-5.0%-5.0%, 0.00분-1.50분-2.50분-2.52분-3.00분; 온도 : 40℃; 이동상 : A: 아세토니트릴, B: H2O (0.05% TFA); 파장: 214 nm/254 nm.
하기 표 III에서 제조된 화합물은 C518에 대해 상기와 유사한 과정을 사용하여 중간체 12 또는 중간체 13으로부터 합성하였다.
표 III.
상기 HPLC의 조건: 장비: Agilent 1200; 크로마토그래피 컬럼: Waters XBridge C18 4.6*50mm,3.5um; 유동: 2.0mL/분; 구배 용리: 5.0%-95.0%-95.0%-5.0%-5.0%, 0.00분-1.50분-2.50분-2.52분-3.00분; 온도 : 40℃; 이동상 : A: 아세토니트릴, B: H2O (0.05% TFA); 파장: 214 nm/254 nm.
C589의 과정
단계 K: (S)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-3-하이드록시부탄아미드: 2 mL DMF 중의 (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-1,2,3,9,12,15-헥사하이드로-10H,13H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13-디온 메실레이트(50 mg, 0.10 mmol, CAS:169869-90-3)의 용액에 0℃에서 (S)-3-하이드록시부탄산 (15.6 mg, 0.15mmol), HATU (57.9 mg, 0.15 mmol)에 이어 Et3N (20.5 mg, 0.20mmol)를 적가하고, 혼합물을 0℃에서 실온으로 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 10 mL 빙수에 붓고, 에틸 아세테이트 (20 mL x 3)로 추출하고, 염수 (20 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 prep-HPLC로 정제하여 (S)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-3-하이드록시부탄아미드 (9.4 mg)를 황색 고체로서 제공하였다.
하기 표 IV에서 제조된 화합물은 실시예 C589와 동일한 방법으로 반응시키고 후처리하였다.
표 IV.
상기 HPLC의 조건: 장비: Agilent 1200; 크로마토그래피 컬럼: Waters XBridge C18 4.6*50mm,3.5um; 유동: 2.0mL/분; 구배 용리: 5.0%-95.0%-95.0%-5.0%-5.0%, 0.00분-1.50분-2.50분-2.52분-3.00분; 온도 : 40℃; 이동상 : A: 아세토니트릴, B: H2O (0.05% TFA); 파장: 214 nm/254 nm.
실시예 2 링커의 제조
2.1 링커 HX20113의 제조
HX20113은 종래의 고체상 폴리펩티드 합성법에 의해 링크-아미드-MBHA-수지를 사용하여 합성하였다. Fmoc는 연결 단위에서 아미노산을 보호하기 위해 사용되었다. 접합 시약은 HOBT, HOAt/DIC, DCC, EDCI 또는 HATU로부터 선택되었다. 합성 후, 수지를 트리플루오로아세트산을 사용하여 절단하였다. 생성물을 HPLC로 정제하고, 동결건조시키고, 사용을 위해 저장하였다. 이론적 질량: 1207.59, 측정치: [M-H]- = 1206.7.
링커 HX20111의 제조
HX20111은 종래의 고체상 폴리펩티드 합성법에 의해 링크-아미드-MBHA-수지를 사용하여 합성하였다. Fmoc는 연결 단위에서 아미노산을 보호하기 위해 사용되었다. 접합 시약은 HOBT, HOAt/DIC, DCC, EDCI 또는 HATU로부터 선택되었다. 합성 후, 수지를 트리플루오로아세트산을 사용하여 절단하였다. 생성물을 HPLC로 정제하고, 동결건조시키고, 사용을 위해 저장하였다. 이론적 질량: 1383.70, 측정치: [M-H]- = 1382.6.
실시예 3 링커- 페이로드 중간체의 제조
3.1 중간체 Mc-GGFG-Dxd의 제조
중간체 Mc-GGFG-Dxd는 상업적으로 이용 가능하거나 제EP2907824호에 기재된 과정에 따라 제조된다. 이 화합물은 링커-페이로드 중간체(화학식 I의 화합물)를 제조하는 데 사용되며, 참조 ADC LC1184(8) 및 LC1184(4)를 제조하기 위해 (임의로 변형된) 항체에 직접 연결하는 데에도 사용된다.
3.2 H0019의 제조
HX21008-a의 합성
4.33 g Fmoc-Gly-Gly-OH 및 6.84 g Pb(OAc)4를 칭량하고 500 ml 단구 환저 플라스크에 첨가하였다. 무수 THF/톨루엔 (120/40 ml)을 질소 대기하에 첨가하고 용해를 위해 교반하였다. 그후 1.16 mL의 피리딘을 반응 시스템에 첨가하였다. 반응 시스템을 80℃로 가열하고 질소 대기하에 5시간 동안 환류시켰다. 샘플을 채취하고 HPLC로 검출하여 반응을 모니터링하였다.
반응 시스템을 실온으로 냉각시키고, 여과하고, 필터 케이크를 EA로 3회 세척하였다. 여액을 배합하고 건조될 때까지 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 (PE: EA = 100: 0 ~ 50: 100) 약 2000 mg의 표적 생성물을 44%의 수율로 백색 고체로 제공하였다.
H0005-a의 합성
200 mg HX21008-a를 칭량하고 100 ml 단구 환저 플라스크에 첨가하였다. 그후 15 ml THF를 첨가하고 용해를 위해 교반하였다. 그후 H0005 (316 mg, 3.0 eq) 및 TsOH·H2O (15 mg, 0.15 eq)를 반응 시스템에 첨가하였다. 반응 시스템을 실온에서 밤새 반응시켰다. 샘플을 채취하고 TLC (PE/EA=1:1)로 검출하여 반응을 모니터링하였다. 원료는 기본적으로 사라졌으며, 새로운 점이 검출되었다.
포화 중탄산나트륨 용액을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 추출은 EA로 3회 수행하였다. 유기 상을 배합하고 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 농축시켰다. 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피 (PE: EA = 5: 1 ~ 1: 1)로 정제하여 약 165 mg의 표적 생성물을 60%의 수율로 무색 오일로 제공하였다. MS: [M+H]+ = 503.4.
H0005-b의 합성
200 mg의 H0005-a를 칭량하고 100 ml 단구 환저 플라스크에 첨가하였다. 그후 10 ml의 EtOH 및 5 ml의 EA를 첨가하여 완전히 용해시켰다. 그후 40 mg의 팔라듐 탄소를 질소 대기하에 반응 시스템에 첨가하고, 반응 시스템을 수소 가스로 3회 퍼징하였다. 반응 시스템을 수소 대기하에 유지시키고 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. 샘플을 채취하고 TLC (DCM/MeOH=10:1)로 검출하여 반응을 모니터링하였다. 원료는 기본적으로 사라졌으며, 새로운 점이 검출되었다.
반응 시스템을 여과하고, 필터 케이크를 EA로 3회 세척하였다. 여액을 배합하고 건조될 때까지 농축시켜 200 mg 생성물을 100% 수율로 백색 고체로 제공하였다. 생성물을 정제 없이 후속 반응에 바로 사용할 수 있다. [M+H]+ = 413.3.
H0005의 합성
2.0 g의 디클로로수지를 칭량하고 폴리펩티드 합성 튜브에 넣었다. DCM (10 ml)을 첨가하고 실온에서 30분 동안 팽윤시켰다. 용매를 진공 흡인에 의해 제거하였다. 수지를 DCM으로 2회 세척하였으며, 각 세척을 위해 용적을 7 mL로 하고 시간 길이를 1분으로 하였다. 용매를 진공 흡인에 의해 제거하였다. 그후 H0005-b (200 mg)를 칭량하고 50 ml 원심분리 튜브에 첨가하였다. DCM (약 10 ml)을 첨가하고, 고체를 진탕에 의해 용해시켰다. 상기 수지에 첨가하였다. 모든 수지를 용액에 침지시키기 위해 교반을 수행하였다(튜브 벽에 수지가 부착되어 있는 경우, 소량의 DCM을 사용하여 튜브 벽을 세척함). 4-5시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 적당량의 메탄올을 첨가하였다. 30분 동안 교반을 수행하였다. 용매를 진공 흡인에 의해 제거하였다. 수지를 DMF로 1회, 메탄올로 1회, DMF로 1회, 메탄올로 1회 및 DMF로 2회 순서대로 세척하였으며, 각 세척을 위해 용적을 10 mL로 하고 시간 길이를 1분으로 하였다. 용매를 진공 흡인에 의해 제거하였다. 닌히드린 검출을 위해 소량의 건조 수지를 채취하였다. 수지는 무색 투명하고, 용액은 황색을 띠었으며, 이는 후속 커플링 단계에 적합함을 나타낸다.
10 mL 기성품 20% 피페리딘/DMF 용액을 첨가하고 각 회당 10분 동안 반응시켜 탈보호를 2회 수행하였다. 반응이 완료된 후, 용액을 진공 흡인에 의해 제거하였다. 수지를 DMF로 2회, 메탄올로 1회, DMF로 1회, 메탄올로 1회 및 DMF로 2회 순서대로 세척하였으며, 각 세척을 위해 용적을 10 mL로 하고 시간 길이를 1분으로 하였다. 용매를 진공 흡인에 의해 제거하였다. 닌히드린 검출을 위해 소량의 건조 수지를 채취하였다. 수지 및 용액 둘 다는 진청색이었다.
50 mL 원심분리 튜브에 563 mg Fmoc-Phe-OH, 197 mg HOBt를 첨가하였다. 그후 약 7 mL DMF를 첨가하였다. 고체를 진탕에 의해 용해시켰다. 그후 0.24 mL DIC를 첨가하였다. 10-30분 동안 활성화시켜 활성화된 반응 용액을 제공하였다.
3몰 당량의 활성화된 반응 용액을 수지에 첨가하였다. 수지를 용액에 완전히 침지시키기 위해 교반을 수행하였다(튜브 벽에 수지가 부착되어 있는 경우 소량의 DCM을 사용하여 튜브 벽을 세척함). 2-3시간 동안 교반을 수행하였다. 반응이 완료된 후, 용매를 진공 흡인에 의해 제거하였다. 수지를 DMF로 2회, 메탄올로 1회, DMF로 1회, 메탄올로 1회 및 DMF로 2회 순서대로 세척하였으며, 각 세척을 위해 용적을 10 mL로 하고 시간 길이를 1분으로 하였다. 용매를 진공 흡인에 의해 제거하였다. 닌히드린 검출을 위해 소량의 건조 수지를 채취하였다. 수지는 무색 투명하고, 용액은 황색을 띠며, 이는 후속 커플링 단계에 적합함을 나타낸다.
10 mL 기성품 20% 피페리딘/DMF 용액을 첨가하고 각 회당 10분 동안 반응시켜 탈보호를 2회 수행하였다. 반응이 완료된 후, 용액을 진공 흡인에 의해 제거하였다. 수지를 DMF로 2회, 메탄올로 1회, DMF로 1회, 메탄올로 1회 및 DMF로 2회 순서대로 세척하였으며, 각 세척을 위해 용적을 10 mL로 하고 시간 길이를 1분으로 하였다. 용매를 진공 흡인에 의해 제거하였다. 닌히드린 검출을 위해 소량의 건조 수지를 채취하였다. 수지 및 용액 둘 다는 진청색이었다.
50 mL 원심분리 튜브에 531 mg Fmoc-GG-OH, 197mg HOBt를 첨가하였다. 그후 약 10 mL DMF를 첨가하였다. 고체를 진탕에 의해 용해시켰다. 그후 0.24 mL DIC를 첨가하였다. 10-30분 동안 활성화시켜 활성화된 반응 용액을 제공하였다.
3몰 당량의 활성화된 반응 용액을 수지에 첨가하였다. 수지를 용액에 완전히 침지시키기 위해 교반을 수행하였다(튜브 벽에 수지가 부착되어 있는 경우 소량의 DCM을 사용하여 튜브 벽을 세척함). 2-3시간 동안 교반을 수행하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 진공 흡인에 의해 제거하였다. 수지를 DMF로 2회, 메탄올로 1회, DMF로 1회, 메탄올로 1회 및 DMF로 2회 순서대로 세척하였으며, 각 세척을 위해 용적을 10 mL로 하고 시간 길이를 1분으로 하였다. 용매를 진공 흡인에 의해 제거하였다. 닌히드린 검출을 위해 소량의 건조 수지를 채취하였다. 수지는 무색 투명하고, 용액은 황색을 띠며, 이는 후속 커플링 단계에 적합함을 나타낸다.
10 mL 기성품 20% 피페리딘/DMF 용액을 첨가하고 각 회당 10분 동안 반응시켜 탈보호를 2회 수행하였다. 반응이 완료된 후, 용액을 진공 흡인에 의해 제거하였다. 수지를 DMF로 2회, 메탄올로 1회, DMF로 1회, 메탄올로 1회 및 DMF로 2회 순서대로 세척하였으며, 각 세척을 위해 용적을 10 mL로 하고 시간 길이를 1분으로 하였다. 용매를 진공 흡인에 의해 제거하였다. 닌히드린 검출을 위해 소량의 건조 수지를 채취하였다. 수지 및 용액 둘 다는 진청색이었다. 그후, 462 mg MC-OSu를 50 mL 원심분리 튜브에 넣고, 약 10 mL DMF를 첨가하였다. 고체를 진탕에 의해 용해시켰다. 그후 0.24 mL DIEA를 수지에 첨가하였다. 수지를 용액에 완전히 침지시키기 위해 교반을 수행하였다(튜브 벽에 수지가 부착되어 있는 경우 소량의 DCM을 사용하여 튜브 벽을 세척함). 2-3시간 동안 교반을 수행하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 진공 흡인에 의해 제거하였다. 수지를 DMF로 2회, 메탄올로 1회, DMF로 1회, 메탄올로 1회 및 DMF로 2회 순서대로 세척하였으며, 각 세척을 위해 용적을 10 mL로 하고 시간 길이를 1분으로 하였다. 용매를 진공 흡인에 의해 제거하였다. 닌히드린 검출을 위해 소량의 건조 수지를 채취하였다. 수지는 무색 투명하고, 용액은 황색을 띠며, 이는 후속 커플링 단계에 적합함을 나타낸다.
수지를 10 mL의 메탄올로 2회 세척하였다. 그후 진공 흡인에 의해 용매를 완전히 제거하였다. 수지를 붓고 칭량하였다. 250mL 코니컬 플라스크에서 용해 완충액을 제조하였다, 여기서: TFE/DCM의 비율은 80%/20%이고 용적은 펩티드 수지의 중량의 7-8배였다. 용해 완충액을 펩티드 수지에 첨가하고 잘 진탕시켰다. 수지를 용해 완충액에 완전히 침지시키고, 용해를 실온에서 2-3시간 동안 수행하였다. 그후 용해 완충액을 시린지로 만든 단순 필터를 사용하여 여과하고, 수지를 1-2 ml DCM로 세척하고 버렸다. 그후 150 mL 예비냉각된 무수 에테를 용해 완충액에 첨가하고, 잘 진탕시킨 다음 20-30분 동안 정치시켰다. 50 mL 원심분리 튜브를 사용하여, 상기 시스템을 3500 rpm에서 3분 동안 원심분리기에서 원심분리하고, 상청액을 부어내어 버렸다. 고체를 예비냉각된 무수 에테르와 함께 진탕시키고, 초음파하에서 1회 세척하고, 3500rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 부어내어 버렸다. 고체를 원심분리 튜브에 넣고 밤새 공기 건조시킨 다음 분취용 정제에 적용하여 125 mg의 생성물을 40%의 수율로 백색 고체로 제공하였다. [M+H]+ = 645.4.
H0013의 합성
150 mg의 원료 H0005 및 55 mg의 TSTU를 칭량하고 10 mL 단구 환저 플라스크에 첨가하고, 무수 DMF (3 mL)를 was added 질소 대기하에 첨가하고 20분 동안 교반하였다. 그후 18 mg TSN00643 및 20 μl DIEA를 순서대로 반응 시스템에 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 질소 대기하에 교반을 수행하였다. 샘플을 채취하고 HPLC로 검출하여 반응을 모니터링하였다. 원료 피크는 완전히 사라졌으며, 새로운 피크가 검출되었다.
반응 시스템을 분취용 정제에 적용하고, 표적 생성물을 수집하고 동결건조시켜 약 22mg의 생성물을 황색을 띤 고체로 제공하였다. [M+H]+ = 1062.7.
H0019의 합성
H0013 (30mg)을 칭량하고 10 ml 단구 환저 플라스크에 첨가하고, 정제수 (2ml)를 첨가하였다. 용해를 위해 교반을 수행하였다. HX20111 (19.5 mg)을 함유하는 DMF 용액 (2 ml)을 반응 시스템에 첨가하고 교반하였다. 밤새 반응시킨 후, HPLC를 사용하여 모든 원료가 중간체로 전환될 때까지 반응을 모니터링하였다. 그후 반응 시스템을 0 ~ 10℃로 냉각시키고 0.5% LiOH 용액을 반응 시스템의 pH가 약 12가 될 때까지 제어된 온도하에서 반응 시스템에 첨가하였다. 반응을 20분 동안 교반하고, 모든 중간체가 소모될 때까지 HPLC에 의해 반응을 모니터링한 다음 30% 아세트산 (1.5 mL)을 반응 시스템에 첨가하여 반응을 켄칭시켰다.
반응 시스템을 분취용 정제에 적용하고, 표적 생성물을 수집하고 동결건조시켜 약 25mg의 생성물을 황색을 띤 고체로 제공하였다. [(M+3H)/3]+ = 1182.3.
3.3 H0020, H0021, H0034 및 H0035
하기 링커-페이로드 중간체 H0020, H0021, H0034 및 H0035는 유사한 합성 경로 및 시약을 사용하여 제조할 수 있다. 중간체 H0014, H0015, H0026 및 H0032를 H0013에 대한 유사한 방법을 사용하여 합성한 다음 각각 H0020, H0021, H0034 및 H0035를 합성하는 데 사용한다.
LC-Ms 데이터는 아래 표에 나타내어져 있다:
3.4 LB302-2-4의 제조
HX20111 및 중간체 MC-GGFG-Dxd (몰 비 ~1:2)를 칭량하고 물 및 DMF에 각각 용해시킨 다음 완전히 혼합하여 혼합물을 제공하고, 이를 0-40℃에서 0.5-30시간 동안 반응시켰다. 일단 반응이 완료되면, 반응 혼합물을 적당량의 Tris 염기 용액 또는 개환 반응을 촉진시키는 기타 용액과 함께 바로 첨가하고, 반응을 0-40℃에서 또 다른 0.2-20시간 동안 수행하였다. 반응이 완료된 후, 생성물을 반분취/분취 HPLC로 정제하고 동결건조시켜 링커-페이로드 중간체 LB302-2-4를 수득하였다. 이론적 질량: 3486.52, 측정치: [(M+3H)/3]+ = 1163.3.
3.5 LB302-2-1의 제조
LB302-2-1은 유사한 합성 경로 및 시약을 사용하여 제조할 수 있다.
실시예 4 항체 발현 벡터의 작제 , 항체 발현, 정제 및 동정
4.1 변형된 항-인간 HER2 항체 Ab0001-LCCTL-HC의 생산
항체 Ab0001-LCCTL-HC (경쇄 서열 번호 9, 중쇄 서열 번호 10)에 대한 발현 플라스미드를 다음과 같이 작제하였다. 항체 Ab0001-LCCTL-HC:의 서열은 트라스투주맙의 아미노산 서열에 기반하며, GALPETGG를 경쇄의 C-말단에 도입하였고, 여기서 LPETGG는 리가제 공여체 기질의 인식 서열이고, GA는 스페이서 서열이다. 플라스미드를 CHO 세포에 형질감염시키고, 세포 집단을 확립하고, 고도로 발현된 세포 집단에 대해 스크리닝하고, 이를 5-10L 반응기에서 트라스투주맙의 배양 과정을 참조하여 배양하고, 상청액을 수집하였다.
4.2 항체 Ab0001-LCCTL-HC의 정제
Ab0001-LCCTL-HC의 정제는 MabSelect 친화성 크로마토그래피 및 세파로스 S 양이온 교환 크로마토그래피의 조합을 사용하는 표준 공정으로 수행하였으며, 정제된 생성물을 원래의 트라스투주맙 약물 완충액(5mM 히스티딘-HCl, 2% 트레할로스, 0.009% 폴리소르베이트 20, PH 6.0)에 용해시키고, 작은 분취량으로 동결시켰다.
4.3 항체 Ab0001-LCCTL-HC의 품질 관리
상기 정제된 항체 Ab0001-LCCTL-HC의 순도는 SDS-PAGE에 의해 98.5%이고; 샘플의 고분자량 중합체의 함량은 SEC-HPLC에 의해 0.4% 미만이며; 내독소 함량은 0.098 EU/mg 미만이다.
4.4 다른 변형된 항-인간 항체의 제조
유사한 방법에 따라, 리가제 인식 서열에 기반한 말단 변형을 각각 트라스투주맙의 경쇄 및/또는 중쇄의 C-말단에 도입하여, 변형된 항체를 제공하였다.
Ab0001(트라스투주맙)에 기반한 변형된 항-인간 HER2 항체는 다음 표에 열거되어 있다. 말단 변형 서열에서 LPETGG는 리가제 공여체 기질의 인식 서열이고, GA는 스페이서 서열이다.
변형된 항-인간 HER2 항체
*: "-"은 말단 변형이 없음을 나타낸다.
실시예 5 항체- 소분자 접합체의 제조
5.1 링커-페이로드 중간체를 각각 리가제에 의해 부위-특이적 방식으로 항체에 접합시켜 ADC를 형성하였다. 접합 반응을 위한 방법은 제WO2015165413A1호에서 찾아볼 수 있다. 생성된 ADC는 아래 표에 열거된 바와 같다:
5.2 기준 ADC LC1184(8) 및 LC1184(4)는 중간체 Mc-GGFG-Dxd를 Ab0001-LCCTL-HC에 직접 연결하여 각각 제조한다(Cys 접합, 즉 Cys의 티올 그룹(들)과 말레이미드 구조(들)에 의해 형성된 연결을 통한 접합). 접합 반응을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. LC1184(8)은 환원된 사슬간 시스테인에 도입된 8개의 Mc-GGFG-Dxd를 갖는다. LC1184(4)는 환원된 사슬간 시스테인에 도입된 4개의 Mc-GGFG-Dxd를 갖는다.
효과 실시예 1 세포 증식에 대한 소분자의 효과
연구 목적: 당해 실험에서는 고 HER2 종양 세포주 SK-BR-3의 증식에 대한 소분자 화합물의 효과를 평가하고, 종양 세포의 증식에 대한 소분자 화합물의 효과를 분석하기 위해 CellTiter-Glo를 사용하여 세포 생존율을 검출하였다.
재료 및 장비
PBS: Gibco, Cat# 10010-023); 트립신: Gibco, Cat# 25200056); FBS: Gibco, Cat# 10270-106); CellTiter-Glo® 발광 세포 생존율 분석: Promega, Cat# G7573); McCoy'5A: Gibco, Cat# 16600-082); L15: 하이클론, Cat# SH30525.01); DMEM: Gibco, Cat# 11995-065). 96-웰 플레이트: Corning/3603; 96-웰 딥-웰 플레이트: Thermo/278743; 15 ml EP 튜브:Thermo/339650; 1.5ml EP 튜브: Beaver.
세포 플레이팅 -1일차
(1) 세포의 현미경 검사
(2) 소화: 2mL 0.25% 트립신을 사용하여 3분 동안 소화;
(3) 원심분리: 5분 동안 1000rpm;
(4) 세포 계수
A. 세포 희석:
B. 세포 플레이팅: 100 μl/웰로
C. 배양: 37℃, 5% CO2, 밤새
세포 시험
(1) 현미경 검사
(2) 약물 제조:
A. 샘플의 제조를 위한 완충액의 제조: 시험용 세포를 위한 배양 배지(10% FBS)를 사용하여 샘플 제조를 위한 원하는 양의 완충액을 제조하였다;
B. 샘플 제조: 샘플을 96-웰 딥-웰 플레이트에서 제1 농도로부터 원하는 농도로 희석하였다.
시험 화합물: 세포 배지로 희석하여 10가지 최종 농도를 제조한다: 1000, 200, 40, 8, 1.6, 0.32, 0.064, 0.0128, 0.00256 및 0.000512 nM.
양성 대조군 퓨로마이신: 2.5 mg/ml의 스톡 용액을 사용하고, 세포 배지로 희석하였다. 250배의 희석물을 예비형성한 다음 퓨로마이신에 대한 시험 농도 5 μg/ml에 도달하기 위해 화합물을 적용할 때 2배의 희석물을 예비형성하였다.
(3) 화합물의 적용: 희석된 일련의 각 농도에 대해, 화합물을 삼중으로 적용하였다. 100 μl/웰에서.
(4) 약물이 첨가된 후, 세포를 120시간 동안 배양기에서 인큐베이터배양하였다.
세포 생존율 시험
(1) 검출 시약의 제조: CellTiter-Glo 발광 세포 생존율 분석 검출 시약은 빛으로부터 보호하면서 실온으로 가온하였다.
(2) 세포 제조: 시험할 세포를 배양기로부터 꺼내어 실온(25℃)에서 30분 동안 평형화시켰다.
(3) ATP 검출: 배양 배지를 버리고 100 μl/웰 DMEM을 첨가하고, 50 μl/홀 CTG를 96-웰 플레이트에 첨가하고, 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하고, 200 rpm의 실온에서 10분 동안 와류 진동기를 사용하여 진동시켰다.
(4) 검출 절차: 절차를 설정한 후, 흑색-벽 투명 바닥판을 덮개 없이 기기에 배치하였다.
(5) 데이터 획득.
5. 데이터 처리 및 분석
데이터를 처리하기 위해 GraphPad 소프트웨어를 사용하였다. 세포 증식 억제율은 데이터-피팅을 위한 4-파라미터 곡선 모델을 사용하여 대조 샘플 또는 시험 샘플의 농도에 대하여 플롯팅하였고, 대조 샘플 및 시험 샘플의 R2 (4 유효 자리까지 반올림) 및 IC50 (4 유효 자리까지 반올림) 또는 EC50을 각각 수득하였다. 필요한 경우, 샘플 A의 상대적인 생물학적 활성, 즉 비율 활성을 계산하였다. Dxd는 비율 활성 계산을 위한 대조 샘플로서 사용되었다.
세포 증식 억제율(%) = (약물-처리 그룹의 발광 값 - 퓨로 그룹의 발광 값)/(블랭크 대조 그룹의 발광 값 - 퓨로 그룹의 발광 값) × 100; 여기서 퓨로 그룹은 퓨로마이신으로 처리된 그룹을 지칭한다
샘플의 비율 활성(%) = (대조 샘플의 IC50 값/시험 샘플의 IC50 값) × 100
대조 샘플의 비율 활성(%) = (대조 샘플의 IC50 값/이전 대조 샘플의IC50 값) × 100
6. 결과 검증
R2 값 ≥ 0.950; 병렬 접속구 사이의 CV% ≤ 30%.
결과:
결과는 다음 표에 열거되어 있다.
효과 실시예 2 세포 증식에 대한 HER2를 표적으로 하는 접합체의 효과
연구 목적: 2개의 고 HER2 종양 세포주 SK-BR-3, NCI-N87 및 HER2-음성 종양 세포주 MDA-MB-468의 증식에 대한 ADC의 효과를 평가하기 위해 및 종양 세포의 증식에 대한 ADC의 효과를 분석하기 위해 CellTiter-Glo 검정에 의해 세포 생존율을 검출하였다.
재료 및 장비
PBS: Gibco, Cat# 10010-023); 트립신: Gibco, Cat# 25200056); FBS: Gibco, Cat# 10270-106); CellTiter-Glo® 발광 세포 생존율 분석: Promega, Cat# G7573); McCoy'5A: Gibco, Cat# 16600-082); L15: 하이클론, Cat# SH30525.01); DMEM: Gibco, Cat# 11995-065). 96-웰 플레이트: Corning/3603; 96-웰 딥-웰 플레이트: Thermo/278743; 15 ml EP 튜브:Thermo/339650; 1.5 ml EP 튜브: Beaver.
세포 플레이팅 -1일차
(1) 세포의 현미경 검사
(2) 소화: 2mL 0.25% 트립신을 사용하여 3분 동안 소화;
(3) 원심분리: 5분 동안 1000rpm;
(4) 세포 계수
A. 세포 희석:
B. 세포 플레이팅: 100 μl/웰로
C. 배양: 37℃, 5% CO2, 밤새
세포 시험
(1) 현미경 검사
(2) 약물 제조:
A. 샘플의 제조를 위한 완충액의 제조: 시험용 세포를 위한 배양 배지(10% FBS)를 사용하여 샘플 제조를 위한 원하는 양의 완충액을 제조하였다;
B. 샘플 제조: 샘플을 96-웰 딥-웰 플레이트에서 제1 농도로부터 원하는 농도로 희석하였다.
시험 화합물: 세포 배지로 희석하여 10가지 최종 농도를 제조한다: 200, 40, 8, 1.6, 0.32, 0.064, 0.0128, 0.00256, 0.000512 및 0.0001024 nM.
양성 대조군 퓨로마이신: 10 mg/ml의 스톡 용액을 사용하고, 세포 배지로 희석하였다. 100배의 희석물을 예비형성한 다음 퓨로마이신에 대한 시험 농도 5 μg/ml에 도달하기 위해 화합물을 적용할 때 10배의 희석물을 예비형성하였다.
(4) 화합물의 적용: 희석된 일련의 각 농도에 대해, 화합물을 삼중으로 적용하였다. 100 μl/웰에서.
(5) 약물이 첨가된 후, 세포를 120시간 동안 배양기에서 인큐베이터배양하였다.
세포 생존율 검출
(1) 검출 시약의 제조: CellTiter-Glo 발광 세포 생존율 분석 검출 시약은 빛으로부터 보호하면서 실온으로 가온하였다.
(2) 세포 제조: 시험할 세포를 배양기로부터 꺼내어 실온(25℃)에서 30분 동안 평형화시켰다.
(3) ATP 검출: 배양 배지를 버리고 100 μl/웰 DMEM을 첨가하고, 50 μl/홀 CTG를 96-웰 플레이트에 첨가하고, 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하고, 200 rpm의 실온에서 10분 동안 와류 진동기를 사용하여 진동시켰다.
(4) 검출 절차: 절차를 설정한 후, 흑색-벽 투명 바닥판을 덮개 없이 기기에 배치하였다.
(5) 데이터 획득.
5. 데이터 처리 및 분석
데이터를 처리하기 위해 GraphPad 소프트웨어를 사용하였다. 세포 증식 억제율은 데이터-피팅을 위한 4-파라미터 곡선 모델을 사용하여 대조 샘플 또는 시험 샘플의 농도에 대하여 플롯팅하였고, 대조 샘플 및 시험 샘플의 R2 (4 유효 자리까지 반올림) 및 IC50 (4 유효 자리까지 반올림) 또는 EC50을 각각 수득하였다.
세포 증식 억제율(%) = (약물-처리 그룹의 발광 값 - 퓨로 그룹의 발광 값)/(블랭크 대조 그룹의 발광 값 - 퓨로 그룹의 발광 값) × 100; 여기서 퓨로 그룹은 퓨로마이신으로 처리된 그룹을 지칭한다
6. 결과 검증
R2 값 ≥ 0.950; 병렬 접속구 사이의 CV% ≤ 30%.
결과:
결과는 다음 표 및 도 1, 도 2 및 도 3에 나타내어져 있다.
HER2 고-발현 SK-BR-3 및 NCI-N87에서, 접합체(CH-2-589, CH-2-593, CH-2-518, LC302-2-1(4) 및 LC302-2-4(4))는 뛰어난 효능을 나타내었다. 접합체의 IC50 값은 소분자 페이로드 Dxd보다 낮다. HER2 음성 세포에서, 접합체는 최소한의 효능을 나타내었다. HER2 음성 세포 MDA-MB-468에서 세포독성이 관찰되지 않았으며, 이는 페이로드의 오프-타겟 방출이 감소하여 안전성이 우수한 접합체의 안정성을 입증하였다. 이는 접합체가 용량 의존적 방식으로 HER2-의존성 세포독성 활성을 발휘하여, 우수한 표적화 능력, 뛰어난 효능 및 우수한 안전성을 나타낸다는 것을 보여준다.
효과 실시예 3 방관자 사멸 효과의 평가
실험의 목적 HER2-양성 종양 세포주 SK-BR-3 및 HER2-음성 종양 세포주 MDA-MB-468의 공동-배양 시스템에서 MDA-MB-468 세포에 대한 ADC(CH-2-589, CH-2-593, CH-2-518 및 LC302-2-4(4))의 방관자 사멸 활성을 시험하였으며, DS8201a와 유사한 구조를 가진 기준 ADC(LC1184(8))와 방관자 사멸 효과를 비교하였다.
재료 및 장비
L15: 하이클론, SH30525.01; McCoy's 5A: Gibco, 16600-082; FBS: Gibco, 10099-141; 반딧불이 루시퍼라제 리포터 유전자 분석 키트: Beyotime, RG006; 50ml 원심분리 튜브: corning, 430829; 15ml 원심분리 튜브: corning, 430791; 96-웰 플레이트: corning, 3599; CO2 세포 배양기: Thermo; 원심분리기: Thermos, L550; 현미경: Nikon, ISZ; 세포 계수기: Countstar, IC1000; Cytation3 플레이트 판독기: BioTek, Cytation3; HTX 다중-모드 마이크로플레이트 판독기: BioTek, Synergy HTX; SK-BR-3: ATCC, HTB-30; MDA-MB-468-Luc-GFP: 렌티바이러스 감염을 사용하여 자체 제조.
실험 방법
1) 세포 수집 및 계수.
2) 세포 밀도는 1*105개 세포/ml로 조정되었다.
3) 세포 혼합물을 제조하였으며, 여기서 SKBR3:MDA-MB-468-Luc-GFP=4:1, 5ml.
세포 플레이팅: 1*104개 세포/웰, 100μl/웰
시험 샘플: 세포 배지로 희석하여 3개의 최종 농도를 제조한다: 50, 10 및 1 nM.
4) 약물은 다음날, 100μl/웰로 투여하였다.
5) 37℃에서 120시간 동안 5% CO2 배양기에서 배양한다.
① PBS로 세척하여 사멸 세포를 제거하고, Cytation3 플레이트 판독기로 검출한다;
② Biyuntian 루시퍼라제 리포터 유전자 분석 키트: 100μl 용해 완충액을 사용하여 37℃ 배양기에서 10분 동안 용해시켰다. 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액 100μl를 채취하였다. 100μl 기질을 첨가하였다. 화학발광은 마이크로플레이트 판독기에 의해 검출하였다(증가: 200).
결과:
두 가지 방법(GFP 형광 계수 및 루시퍼라제 기질 발광 방법)이 방관자 사멸 효과를 측정하기 위해 사용되었다(도 4a, 4b 및 도 5).
접합체(CH-2-593, CH-2-589, CH-2-518 및 LC302-2-4(4))는 모두 두 가지 방법을 모두 사용한 검출에서 뛰어난 방관자 사멸 효과를 보인다. CH-2-593은 LC1184(8)에 필적하거나 더 강한 방관자 사멸 효과를 보인다.
효과 실시예 4 생체내 접합체의 평가
4.1 JIMT-1 인간 유방암 이종이식 모델
5x106개 JIMT-1 인간 유방암 세포(HER2 배지)를 SCID 베이지색 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 7일 후, 종양 용적이 평균 142㎣에 도달했을 때, 종양을 보유한 마우스를 배정하고 LC1184(8) 및 다른 5가지 상이한 접합체를 5mg/kg로 정맥내 투여하였다. 종양 용적은 캘리퍼로 주 2회 측정하였다. LC1184(8)는 LC1184(4)보다 양호한 효능을 보였으며, 이는 동일한 페이로드를 사용하여, 더 높은 DAR이 보다 양호한 효능을 초래한다는 것을 시사한다. LC302-2-1(4) 및 LC302-2-4(4)는 LC1184(8)보다 양호한 효능을 보였다(도 6). 본 발명의 접합체는 낮은 DAR에서 큰 효능을 달성한다.
4.2 Capan-1 인간 췌장암 이종이식 모델(1)
5x106개 Capan-1 인간 췌장암 세포(HER2 저)를 BALB/c 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하여 이종이식 모델을 생성하였다. 8일 후, 종양 용적이 평균 178㎣에 도달했을 때, 종양을 보유한 마우스에 LC1184(8) 및 다른 5가지 상이한 접합체를 5mg/kg로 정맥내 투여하였다. 종양 용적은 캘리퍼로 주 2회 측정하였다. LC1184(8)은 LC1184(4)보다 양호한 효능을 보였다. LC302-2-1(4) 및 LC302-2-4(4)는 LC1184(8)에 필적하는 효능을 보였다(도 7).
4.3 Capan-1 인간 췌장암 이종이식 모델(2)
연구 목적: 연구의 목적은 암컷 BALB/c 누드 마우스에서 피하 Capan-1 인간 췌장암 이종이식 모델의 치료에서의 CH-2-589, CH-2-593, CH-2-518 및 LC302-2-4(4)의 생체내 항-종양 효능을 평가하는 것이다.
연구 설계:
세포 배양: Capan-1 종양 세포(ATCC-HTB-79)는 공기 중 5% CO2의 대기에서 37℃에서 20% 소 태아 혈청, 1% 항생제-항진균제가 보충된 IMDM에서 단층 배양으로 시험관내에서 유지될 것이다. 종양 세포는 트립신-EDTA 처리에 의해 매주 2회 일상적으로 계대배양될 것이다. 지수 성장 단계에서 성장하는 세포를 종양 접종을 위해 수확하고 계수할 것이다.
동물: BALB/c 누드, 암컷, 6~8주, 체중 약 18~20g. 연구에는 총 48마리(30마리 + 60%)가 필요하며, Shanghai Lingchang Laboratory Animal Co., LTD. 또는 기타 인증된 공급업체에서 구입할 것이다.
종양 접종: 각 마우스에 종양 발달을 위해 Matrigel(1:1)을 갖는 0.2 mL의 PBS 중의 Capan-1 종양 세포(5×106)를 오른쪽 옆구리에 피하 접종할 것이다. 동물을 무작위 배정하고 효능 연구를 위해 평균 종양 용적이 약 150~200㎣에 도달할 때 치료를 시작할 것이다. 각 그룹에서 시험 물품 투여 및 동물 수는 하기 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
그룹 및 처리
N: 동물 수;
투여 용적: 체중에 기초하여 10mL/kg 투여 용적 조정.
실험 지속기간은 종양 용적에 따라 조정될 것이다.
동물 사육: 동물이 실험실 환경에 익숙해지기 위해 동물 도착과 종양 접종 사이에 대략 1주일의 적응 기간이 허용될 것이다. 마우스는 병원체가 없는 특별한 환경 및 개별 환기 케이지(케이지당 3마리)에서 유지될 것이다. 모든 케이지, 침구 및 물은 사용 전에 멸균될 것이다. 마우스 룸에서 일할 때, 연구원은 실험실 가운 및 라텍스 또는 비닐 장갑을 착용할 것이다. 각 케이지에는 동물 수, 성별, 품종, 받은 날짜, 치료, 연구 번호, 그룹 번호 및 치료 시작 날짜를 나타내는 케이지 카드가 명확하게 표시될 것이다. 음식과 물이 담긴 케이지는 일주일에 두 번 교체될 것이다. 동물실 환경 및 광주기의 표적 조건은 다음과 같을 것이다:
온도 20~26℃
습도 40~70%
명 주기 : 12시간 빛 및 12시간 어둠
식이 재료: 모든 동물은 표준 인증 상업 실험실 식이에 자유롭게 접근할 것이다. 식이에서 오염물질의 최대 허용 농도는 제조업체에 의해 통제되고 일상적으로 분석된다. 인간이 소비하기에 적합한 오토클레이빙된 도시 수돗물은 자유롭게 동물에게 제공될 것이다. 종양 성장에 영향을 줄 수 있는 식이 물질에는 알려진 오염물질이 없는 것으로 간주된다.
그룹에의 할당: 치료를 시작하기 전에, 모든 동물을 칭량하고 종양 용적을 측정할 것이다. 종양 용적이 주어진 치료의 효과에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 마우스는 이들의 종양 용적에 따라 계층화된 무작위화를 수행하는 Excel-기반 무작위화 소프트웨어를 사용하여 그룹별로 할당될 것이다. 이것은 모든 그룹이 기준선에서 필적하도록 보장한다.
관찰: 당해 연구에서 동물의 관리 및 사용과 관련된 프로토콜 및 임의의 수정사항(들) 또는 절차는 수행 전에 WuXi AppTec의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 검토되고 승인될 것이다. 연구 동안, 동물의 관리 및 사용은 AAALAC(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)의 규정에 따라 수행될 것이다. 접종 후, 동물을 이환율 및 사망률에 대해 매일 확인할 것이다. 일상적인 모니터링시, 동물은 이동성, 음식 및 물 소비, 체중 증가/감소(체중은 매주 2회 측정될 것이다), 눈/모발 매트 및 기타 비정상적인 효과와 같은 정상적인 행동에 대한 종양 성장 및 치료의 영향에 대해 확인될 것이다. 사망 및 관찰된 임상 징후는 각 하위세트 내의 동물 수를 기준으로 하여 기록될 것이다.
종점: 주요 종점은 종양 성장이 지연될 수 있는지 또는 마우스가 치유될 수 있는지 알아보는 것이다. 종양 크기는 캘리퍼를 사용하여 2차원으로 매주 2회 측정되고, 용적은 공식을 사용하여 ㎣으로 표현될 것이다: V = 0.5 a x b 2, 여기서 a및 b는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경이다. 그후 종양 크기를 TGI(%) 및 상대 종양 증식 속도 T/C(%) 값의 계산에 사용한다. TGI는 다음 공식을 사용하여 각 그룹에 대해 계산된다: TGI(%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] ×100; Ti는 주어진 날짜의 치료 그룹의 평균 종양 용적이고, T0는 치료 첫날의 치료 그룹의 평균 종양 용적이며, Vi는 Ti와 동일한 날짜에 비히클 대조 그룹의 평균 종양 용적이고, V0는 치료 첫날의 비히클 그룹의 평균 종양 용적이다.
T/C(%) 값은 다음 공식을 사용하여 각 그룹에 대해 계산된다: T/C % = TRTV / CRTV Х 100 % (TRTV： 치료 그룹의 상대 평균 종양 용적 (RTV), CRTV： TRTV와 동일한 날짜에 비히클 대조 그룹의 상대 평균 종양 용적 (RTV)). 상대 종양 용적(RTV)은 다음 공식을 사용하여 각 그룹에 대해 계산된다: RTV = Vt / V0; V0는 치료 첫날의 종양 용적이고, Vt는 주어진 날짜의 종양 용적이다.
종료:
1) 체중 감소: 하루에 20% 체중 감소를 나타내는 동물은 인도적으로 살해하거나 수의사에게 연락한다.
2) 종양 부담: 종양 부담은 3,000㎣를 초과하지 않아야 한다. 개별 동물은 이의 종양 용적이 3,000㎣에 도달하면 즉시 희생될 것이다.
궤양: 종양 궤양이 발생하면 다음 절차가 적용될 것이다:
· 궤양성 종양이 있는 동물은 임상 징후에 따라 빈도를 증가시키면서 주당 적어도 3회, 최대 매일 모니터링될 것이다.
· 딱지가 생기지 않은 궤양화된 종양은 적절한 상처 세정액(예를 들어, Novalsan)으로 세정해야 한다. 항생제 크림은 수의사의 지시가 있는 경우에만 궤양/병변에 도포해야 한다.
안락사에 대한 기준은 병변이 ( 다음중 하나 이상을 충족)하는 경우를 포함한다:
· 1주일 이내에 치유되지 않거나 딱지가 생기지 않음.
· 직경이 5mm보다 큼.
· 캐비테이션이 됨(cavitated).
감염의 징후(예를 들어 고름의 존재) 또는 출혈이 발생하거나, 동물이 불편함의 징후(예를 들어 부위를 과도하게 핥고 물기) 또는 질병의 전신 징후(무기력, 활동 감소, 음식 소비 감소, 신체 상태 저하 또는 체중 감소)를 보이는 경우. 임의의 가능한 예외에 대해 논의하기 위해 수의사에게 연락한다.
3) 임상 징후: 동물이 빈사 상태인 것으로 판명되면 안락사시켜야 한다(적절한 타당한 이유에 기반하여 IACUC에 의해 특별 허가가 승인되지 않는 한, 이는 프로토콜에 포함되어야 하고 따뜻한 SQ 수액, 동물이 음식에 닿을 수 있도록 동물 옆에 있는 다이어트 젤 음식 컵, 보충 열을 위한 난방 패드의 케이지 등과 같은 제공되는 지원 치료를 늘려야 한다. 참고: 빈사 상태는 동물이 생존할 가능성이 낮다는 것을 나타낸다.) 이러한 종점에 관한 질문에 대해서는 수의사에게 연락한다.
이환율의 임상적 예는 다음을 포함할 수 있다:
· 구부러짐(Hunched).
· 지속적인 누운 자세 및 취급 또는 기타 자극에 대한 반응 부족.
· 심각한 장기 또는 시스템 장애의 징후.
· 쇠약.
· 저체온증.
· CNS 결핍: 경련.
· 호흡기: 빠른 호흡률, 가쁜 숨소리, 기침, 수포음(rale).
· GI: 설사 지속 > 2일, 황달(jaundice).
위의 임상적 문제를 나타내는 모든 동물은 CO2에 의해 인도적으로 희생될 것이다.
예기치 않은 사망시 부검은 시행하지 않을 것이다.
통계 분석: 두 그룹 간의 비교를 위해, 독립적인 샘플 t-검정이 사용될 것이다. 3개 이상의 그룹 간의 비교를 위해, 일원 ANOVA가 수행될 것이다. 유의한 F-통계(오차 분산에 대한 처리 분산의 비율)가 수득되면, ANOVA 후에 다중 비교 절차가 적용될 것이다. 모든 데이터는 SPSS 17.0을 사용하여 분석될 것이다. p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주된다.
결과:
모든 접합체는 뛰어난 종양 억제 효과를 보인다((도 8a 및 도 8b).
4.4 NCI-N87 인간 위암 이종이식 모델
연구 목적: 연구의 목적은 암컷 BALB/c 누드 마우스에서 피하 NCI-N87 인간 위암 이종이식 모델의 치료에서 CH-2-589, CH-2-593, CH-2-518 및 LC302-2-4(4)의 생체내 항-종양 효능을 평가하는 것이다.
연구 설계:
세포 배양: NCI-N87 종양 세포(ATCC, Manassas, VA, cat # CRL-5822)는 공기 중 5% CO2의 대기에서 37℃에서 10% 소 태아 혈청, 1% 항생제-항진균제가 보충된 RPMI 1640 배지에서 단층 배양물로서 시험관내에서 유지될 것이다. 종양 세포는 트립신-EDTA 처리에 의해 매주 2회 일상적으로 계대 배양될 것이다. 지수 성장 단계에서 성장하는 세포를 종양 접종을 위해 수확하고 계수할 것이다.
동물: BALB/c 누드, 암컷, 6~8주, 체중 대략 18~22g. 연구에는 총 36마리(30마리 + 20%)가 필요하며 Shanghai Lingchang Laboratory Animal Co., LTD. 또는 기타 인증된 공급업체에서 구입할 것이다.
종양 접종: 각 마우스에 종양 발달을 위해 Matrigel(1:1)을 갖는 0.2 mL의 PBS 중의 NCI-N87 종양 세포(10×106)를 오른쪽 옆구리에 피하 접종할 것이다. 동물을 무작위 배정하고 효능 연구를 위해 평균 종양 용적이 약 150~200㎣에 도달할 때 치료를 시작할 것이다. 각 그룹에서 시험 물품 투여 및 동물 수는 하기 실험 설계 표에 나타내어져 있다.
그룹 및 처리
N: 동물 수;
투여 용적: 체중에 기초하여 10mL/kg 투여 용적 조정.
실험 지속기간은 종양 용적에 따라 조정될 것이다.
결과:
모든 접합체는 뛰어난 종양 억제 효과를 보인다(도 9a 및 도 9b).
효과 실시예 5 접합체의 생체외 혈청 안정성
생체외 혈청 안정성 연구를 위해, 접합체 LC302-2-1(4), LC302-2-4(4) 및 LC1184(8)를 각각 37℃에서 풀링된 인간 혈청에 접종하였다. 0, 24, 48 및 96시간에, 접합체는 항원에 의해 포획된 다음 글리코시다제에 의해 탈글리코실화되고, 산에 의해 해리되었다. 상청액을 수집하고 원심분리한 다음 고분해능 LC-MS로 검출하여 DAR을 결정하였다.
LC302-2-1(4) 및 LC302-2-4(4)는 혈청에서 96시간 동안 배양한 후 매우 안정적이다. 96시간 동안 배양한 후 LC302-2-1(4) 및 LC302-2-4(4)의 DAR에서 관찰 가능한 감소는 없다. 그러나, LC1184(8)의 DAR은 96시간 동안 배양한 후 7.8에서 2.6으로 떨어졌다(도 10). 링커의 안정성은 표적 종양으로의 더 많은 페이로드의 전달 및 오프-타겟 자유 페이로드 방출의 감소를 나타내며, 따라서 치료 지수를 증가시킨다.
서열 목록

Claims (20)

  1. 화학식 I의 화합물:
    화학식 I

    여기서,
    opSu는 또는 이고;
    R0는 C1-10 알킬이고;
    n은 2 내지 20의 임의의 정수이고;
    k1 및 k2는 독립적으로 1 내지 7의 정수이고;
    i는 1-100의 정수이고;
    j는 1-100의 정수이고;
    P1 및 P2는 독립적으로 화학식 i'의 구조를 갖는 페이로드(payload)이고:
    화학식 i'

    여기서,
    a는 0 또는 1이고;
    p1* 및 p2*로 표시된 탄소 원자는 각각 비대칭 중심이고, 비대칭 중심은 S 배위(configured), R 배위 또는 라세미(racemic)이고;
    L1은, 치환되지 않거나 할로겐, -OH 및 -NH2로부터 선택된 하나의 치환체로 치환된 C1-6 알킬렌으로부터 선택되고;
    M은 -CH2-, -NH- 또는 -O-이고;
    L2는 C1-3 알킬렌이고;
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, 할로겐 및 C1-6 알콕시로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 I-1의 구조를 갖는 화합물:
    화학식 I-1

    여기서,
    P1, P2, R0, opSu, n, i 및 j는 제1항에 정의된 바와 같다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학식 i'에서:
    L1이, 각각 독립적으로 치환되지 않거나 할로겐, -OH 및 -NH2로부터 선택된 하나의 치환체로 치환된 C1-6 선형 알킬렌, C1-6 분지형 알킬렌, C3-6 사이클릭 알킬렌 및 C3-4 사이클릭 알킬-C1-2 선형 알킬렌 그룹으로부터 선택되고;
    바람직하게는,
    L1이, 각각 독립적으로 치환되지 않거나 할로겐, -OH 및 -NH2로부터 선택된 하나의 치환체로 치환된 C1-4 선형 알킬렌, C1-4 분지형 알킬렌, C3-4 사이클릭 알킬렌 및 사이클로프로필-메틸렌으로부터 선택되고;
    바람직하게는, L1이, 각각 독립적으로 치환되지 않거나 할로겐, -OH 및 -NH2로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환된 -CH2-, -C2H4-, 로부터 선택되고;
    보다 바람직하게는, L1이 -CH2-, 로부터 선택되고, 여기서 "#"은 카보닐에 부착된 위치를 표시하고;
    추가로 바람직하게는, L1이 -CH2-, 로부터 선택되고, 여기서 "#"은 카보닐에 부착된 위치를 표시하고;
    특히, L1이 -CH2-, 및 로부터 선택되고, 여기서 "#"은 카보닐에 부착된 위치를 표시하고/하거나;
    할로겐이 F, Cl 및 Br로부터 선택되는 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 i'에서:
    M이 -CH2-, -NH- 또는 -O-이고; L2가 -C2H4-이거나;
    M이 -CH2-이고, L2가 -CH2-인 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 i'에서:
    p1*로 표시된 탄소 원자가 S 배위 또는 라세미, 바람직하게는 S 배위이고/이거나;
    p2*로 표시된 탄소 원자가 S 배위 또는 라세미, 바람직하게는 S 배위인 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 i'에서:
    R1 및 R2가 각각 독립적으로 수소, C1-3 알킬, 할로겐 및 C1-3 알콕시로부터 선택되고;
    바람직하게는, R1 및 R2가 각각 독립적으로 CH3-, F, Cl, Br 및 CH3O-로부터 선택되고;
    보다 바람직하게는,
    R1이 CH3- 및 Cl로부터 선택되고/되거나;
    R2가 F이고;
    추가로 바람직하게는,
    a가 0이고, R1이 Cl이고, R2가 F이고, L1이 -CH2-, 및 로부터 선택되거나;
    a가 0이고, R1이 CH3-이고, R2가 F이고, L1이 및 로부터 선택되고, 여기서 "#"가 카보닐에 부착된 위치를 표시하거나;
    a가 1이고, R1이 CH3-이고, R2가 F이고, L1이 이고, M이 O이고, L2가 -C2H4-인 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드가 다음으로부터 선택되고:



    바람직하게는 다음으로부터 선택되고:


    보다 바람직하게는 다음으로부터 선택되고:

    특히 다음으로부터 선택되는 화합물:
    .
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    R0가 C1-6 알킬, 바람직하게는 C1-3 알킬; 특히 메틸이고/이거나;
    n이 2 내지 5, 특히 3의 정수이고/이거나;
    k1 및 k2가 독립적으로 1, 또는 3 또는 5, 특히 5이고;
    i가 독립적으로 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 12, 보다 바람직하게는 2 내지 8, 특히 4의 정수이고/이거나;
    j가 독립적으로 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 12, 보다 바람직하게는 8 내지 12, 특히 8 또는 12, 특히 12의 정수인 화합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 다음으로부터 선택되는 화합물:


  10. 화학식 II의 구조를 갖는 접합체(conjugate):
    화학식 II

    여기서,
    A는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고; 항체 또는 항원 결합 단편은 바람직하게는 화학식 I의 화합물에서 (Gly)n 모이어티(moiety)와 연결되도록 변형되며;
    z는 1 내지 20; 바람직하게는 1 내지 4; 특히 2의 정수이고;
    P1, P2, R0, opSu, n, k1, k2, i 및 j는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같다.
  11. 제10항에 있어서, 다음으로부터 선택되는 접합체:

  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    (i) 항체가 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-CD22 항체, 항-CD25 항체, 항-CD30/TNFRSF8 항체, 항-CD33 항체, 항-CD37 항체, 항-CD44v6 항체, 항-CD56 항체, 항-CD70 항체, 항-CD71 항체, 항-CD74 항체, 항-CD79b 항체, 항-CD117/KITk 항체, 항-CD123 항체, 항-CD138 항체, 항-CD142 항체, 항-CD174 항체, 항-CD227/MUC1 항체, 항-CD352 항체, 항-CLDN18.2 항체, 항-DLL3 항체, 항-ErbB2/HER2 항체, 항-CN33 항체, 항-GPNMB 항체, 항-ENPP3 항체, 항-넥틴(anti-Nectin)-4 항체, 항-EGFRvIII 항체, 항-SLC44A4/AGS-5 항체, 항-CEACAM5 항체, 항-PSMA 항체, 항-TIM1 항체, 항-LY6E 항체, 항-LIV1 항체, 항-넥틴4 항체, 항-SLITRK6 항체, 항-HGFR/cMet 항체, 항-SLAMF7/CS1 항체, 항-EGFR 항체, 항-BCMA 항체, 항-AXL 항체, 항-NaPi2B 항체, 항-GCC 항체, 항-STEAP1 항체, 항-MUC16 항체, 항-메조텔린(anti-Mesothelin) 항체, 항-ETBR 항체, 항-EphA2 항체, 항-5T4 항체, 항-FOLR1 항체, 항-LAMP1 항체, 항-카드헤린(anti-Cadherin) 6 항체, 항-FGFR2 항체, 항-FGFR3 항체, 항-CA6 항체, 항-CanAg 항체, 항-인테그린 αV 항체, 항-TDGF1 항체, 항-에프린 A4 항체, 항-TROP2 항체, 항-PTK7 항체, 항-NOTCH3 항체, 항-C4.4A 항체, 항-FLT3 항체, 항-B7H3/4 항체, 항-조직 인자 항체, 또는 항-ROR1/2 항체; 바람직하게는 항-HER2 항체, 항-FGFR3 항체, 항-Trop2 항체, 항-HER3 항체 또는 항-FRα 항체이고;
    추가로 바람직하게는, 항체가 항-HER2 항체, 바람직하게는 항-인간 HER2 항체, 보다 바람직하게는 트라스투주맙이고/이거나;
    (ii) 제1항에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물에서 Gn 모이어티가 리가제의 리가제 수용체 기질(ligase receptor substrate)의 인식 서열이고;
    항체가 제1항에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물에서 Gn 모이어티와 연결하기 위해 리가제 공여체(donor) 기질의 인식 서열을 포함하도록 변형되고;
    바람직하게는,
    (a) 리가제가 소르타제(Sortase) A, 소르타제 B, 소르타제 C, 소르타제 D 및 소르타제 L. 플란타룸(plantarum)으로부터 선택되는 소르타제; 바람직하게는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus )로부터의 소르타제 A이고/이거나;
    (b) 리가제 공여체 기질의 인식 서열이 LPXTG이고, J가 부재하거나 Gm이고, 여기서 G가 글리신이고, m이 1 내지 10의 정수이며, X가 천연 또는 비천연인 임의의 단일 아미노산이고; 바람직하게는, 리가제 공여체 기질의 인식 서열이 LPXTG 또는 LPETGG이고/이거나;
    LPXTGJ와 Gn의 연결이 LPXTGn을 야기하는 접합체.
  13. 예방적 또는 치료적 유효량의 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 접합체, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 접합체가 1 내지 8, 특히 3 내지 4의 정수 또는 비-정수(non-integer)의 약물 대 항체 비율 (DAR)을 갖는 약제학적 조성물.
  15. 질환을 치료하기 위한 약제(medicament)의 제조에 있어서의, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 접합체, 또는 제13항 또는 제14항의 약제학적 조성물의 용도로서; 여기서 질환이 종양(tumor) 또는 자가면역 질환(autoimmune disease); 바람직하게는 HER2-양성 종양 세포를 포함하는 종양인 용도.
  16. 제15항에 있어서, HER2-양성 종양 세포를 포함하는 종양이 HER2 저-발현 종양 세포를 추가로 포함하고;
    여기서 HER2 저-발현 종양 세포가 HER2-양성 종양 세포보다 더 낮은 수준의 HER2를 발현하는 용도.
  17. 화학식 i의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 입체이성질체, 용매화물, 다형체(polymorph), 호변이성질체(tautomer), 동위원소 화합물, 대사산물 또는 전구약물(prodrug):
    화학식 i

    여기서,
    a, p1* 및 p2*로 표시된 탄소 원자, L1, M, L2, R1 및 R2는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같다.
  18. 제17항에 있어서, 다음으로부터 선택되고:



    바람직하게는 다음으로부터 선택되고:

    보다 바람직하게는 다음으로부터 선택되고:

    특히 다음으로부터 선택되는 화합물:
    .
  19. 화학식 1의 화합물:
    화학식 1

    여기서,
    k는 1 내지 7; 바람직하게는 1, 또는 3 또는 5, 특히 5의 정수이고,
    P는 화학식 i'의 구조를 갖는 페이로드이고, 여기서 화학식 i'의 구조는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같다.
  20. 제19항에 있어서, 다음으로부터 선택되는 화합물:
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