KR20230156844A - 고농도 조성물 및 피하 투여에 적합한 신규한 항-angptl3 항체 - Google Patents
고농도 조성물 및 피하 투여에 적합한 신규한 항-angptl3 항체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 의약에 사용하기 위한, 및 특히 혈장 중성지방 수준을 낮추는 것을 필요로 하는 환자, 예컨대 죽상경화성 심혈관 질환(ASCVD)과 같은 고중성지방 혈증 및/또는 심혈관 질환을 앓고 있거나 이런 질환의 위험이 있는 환자에게서 혈장 중성지방 수준을 낮추기 위한 신규한 1가 항-ANGPTL3 항체 뿐만 아니라 피하 투여에 적합한 약학적 조성물 및 이러한 화합물 및 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
Description
기술분야
의약에 사용하기 위한 항-ANGPTL3 항체 및 이러한 화합물을 포함하는 조성물.
서열 목록의 참조에 의한 통합
본 출원은 서열 목록과 함께 전자 형식으로 출원된다. 서열 목록의 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.
인간 안지오포이에틴-유사 단백질 3(hANGPTL3)은 Conklin 등에 의해 처음 식별된 460 아미노산 길이의 단백질이다(Conklin, Gilbertson 등의 문헌[(1999) Genomics 62(3): 477-482). hANGPTL3은 단백질의 N-말단 부분에 존재하는 2개의 코일-코일 도메인에 의해 만들어진 삼량체로서 혈장 내에서 순환한다. hANGPTL3은 지단백질 리파아제(LPL) 및 내피 리파아제(EL)를 억제함으로써 지질 대사에 영향을 미치는 안지오포이에틴-유사 단백질 계열의 일부이다.
hANGPTL3은 이 계열 중 가장 풍부하게 발현되는 구성원이며, 잘 기술된 LPL 억제제이다. 이는 주로 공복이 아닌 상태에서 그 작용을 발휘한다. LPL은 내피 세포에 고정되며, 중성지방이 풍부한 지방 입자(VLDL 및 유미미립)로부터 중성지방을 가수분해하는 주요 효소이다. LPL 활성이 많을수록, 순환으로부터 중성지방이 더 많이 제거된다.
hANGPTL3에 의한 LPL의 억제는 혈장에서 중성지방 및 LDL 농도를 증가시킨다.
hANGPTL3에 의한 LPL 억제는 인간 안지오포이에틴 유사 단백질 8(hANGPTL8) 및 가능하게는 인간 안지오포이에틴 유사 단백질 4(hANGPTL4)와의 상호작용을 통해 기능하는 것으로 여겨진다. hANGPTL8은 hANGPTL3이 없을 때는 시험관내 억제 기능을 갖지 않는 반면, hANGPTL3은 자체적으로 LPL을 억제할 수 있다. hANGPTL4는 hANGPTL3 및 8과 무관하게 LPL을 억제하는 것으로도 알려져 있다. hANGPTL3은 일반적으로 간에 의해 발현되는 반면, hANGPTL4 및 8은 상이한 유기체에서 상이한 발현 패턴을 나타내고, hANGPTL4 및 8은 주로 외부 자극에 의해 발현되는 반면, hANGPTL3은 간으로부터 높은 구성적 발현을 나타낸다.
순환에는 상이한 절단 형태가 존재한다(Ono, Shimizugawa 등의 문헌[(2003) J Biol Chem 278(43): 41804-41809]). N-말단 도메인을 함유하는 전장 hANGPTL3 및 hANGPTL3의 절단된 형태는 모두 LPL 및 EL을 억제하여 중성지방 수준을 증가시킨다.
hANGPTL3을 암호화하는 유전자에서의 기능 상실 변이체는 고지질혈증과 관련이 있고 죽상경화성 심혈관 질환에 대한 보호와 관련이 있다. hANGPTL3에 대한 단클론 항체인 에비나쿠맙(Evkeza®)(WO2012/174178)은 동형접합성 가족성 고콜레스테롤혈증 환자를 대상으로 4주마다 1회 15 mg/kg(체중)을 투여했을 때 이점을 나타냈다(Rall 등의 문헌[(2020) NEJM, 383(8), 711-720]).
치료에 필요한 고 투여량은 현재 이용 가능한 항체 생성물인 Evkeeza®(EVKEEZA의 권장 투여량은 15 mg/kg을 4주마다 1회, 60분에 걸쳐 인라인 또는 부가 필터를 사용해 i.v. 주입에 의해 투여하는 것임)를 자가 투여로 이용할 수 없으므로, 보다 최적의 치료 시나리오가 환자 모집단에 유익할 수 있다.
당업계에는 개선된 항-hANGPTL3 항체에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 인간 ANGPTL3(hANGPTL3)에 결합할 수 있고 hANGPTL3-매개 LPL 억제를 감소시킬 수 있는 1가 항체 및 이의 항원 결합 단편, 및 의약에 있어서 뿐만 아니라 이러한 화합물을 포함하는 약학적 조성물에 있어서 이의 용도에 관한 것이다.
일 양태에서, 1가 항체 및 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3에 결합할 수 있고 인간 혈장에서 중성지방의 농도를 감소시킬 수 있다.
일 양태에서, 1가 항체 및 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3에 결합할 수 있고 인간 혈장에서 중성지방의 농도를 감소시켜 LPL의 억제를 감소시킬 수 있다.
일 양태에서, 1가 항체 및 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3에 결합할 수 있고 hANGPTL3-매개 LPL의 억제를 억제할 수 있다.
일 양태에서, 1가 항체 및 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3에 결합할 수 있고 hANGPTL3-매개 LPL의 억제를 억제할 수 있을 뿐 아니라 인간 혈장에서 hANGPTL3의 농도를 감소시켜 hANGPTL3-매개 LPL의 억제를 감소시킬 수 있다.
하나의 특정 양태에서, 본 발명은 인간 ANGPTL3(hANGPTL3)(서열번호 1)에 결합할 수 있는 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것으로서, 여기서
a) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄는:
- 아미노산 잔기 SYWMT(서열번호 2)의 CDR1 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 또는 1개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 SISSHSTYIYYADSVKG(서열번호 3)의 CDR2 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 , 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR2 서열, 및
- 아미노산 잔기 EGWYDNWFDP(서열번호 4)의 CDR3 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 , 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR2 서열을 포함하거나,
b) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄는:
- 아미노산 잔기 SYWMT(서열번호 24)의 CDR1 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 또는 1개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 SISSHSTYIYYADSVKG(서열번호 25)의 CDR2 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 , 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR2 서열, 및
- 아미노산 잔기 EGWYDNWNDP(서열번호 26)의 CDR3 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 , 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR3 서열을 포함하고;
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄는:
- 아미노산 잔기 RASQNIRSPYLA(서열번호 9)의 CDR1 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개, 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있는, CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 GVSSRAA(서열번호 10)의 CDR2 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개, 1개, 또는 2개가 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있는, CDR1 서열, 및
아미노산 잔기 QQYDDHPYT(서열번호 11)의 CDR3 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개, 1개, 또는 2개가 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있는, CDR1 서열을 포함한다.
일 양태에서, 1가 항체 및 이의 항원 결합 단편은 고농도 조성물로 제형화될 수 있다.
일 양태에서, 1가 항체 및 이의 항원 결합 단편은 피하 투여에 적합하다.
도 1a~d는 서열번호 2~28을 표 형식으로 보여준다.
도 2는 1가 항체의 (비제한적인) 개략도를 도시한다.
도 3은 tmAb0.1, tmAb0.2, tmAb0.3, tmAb0.4, 및 에비나쿠맙 서열 동일 유사체(SIA)의 투여가 다양한 시점에 마우스 혈장 내 중성지방 농도에 미치는 효과를 보여준다.
도 4a 및 4b는 tmAb0.1, tmAb0.2, tmAb0.3, tmAb0.4, 에비나쿠맙 서열 동일 유사체(SIA), 및 비히클의 투여가 마우스 혈장 내 총 ANGPTL3 농도에 미치는 효과를 보여준다. 도 4b는 100000~400000 pg/mL ANGPTL3 혈장 농도 범위에 초점을 맞춘 것인데, 이는 에비나쿠맙 SIA로 치료한 마우스 내 ANGPTL3의 혈장 수준 미만이므로 에비나쿠맙 SIA 데이터는 도면에 도시되지 않는다.
도 5는 tmAb0.1, tmAb0.2, tmAb0.3, 및 tmAb0.4, 에비나쿠맙 서열 동일 유사체(SIA)를 투여한 후 이들의 마우스 플라즈마 농도를 보여준다.
도 6a~6e는 상이한 pH 값에서 에비나쿠맙 SIA(도 6a), tmAb1(도 6b), tmAb2(도 6c), tmAb3(도 6d), tmAb4(도 6e)를 포함하는 항체-ANGPTL3 복합체의 SE-UPLC 프로파일을 보여준다. 점선은 pH 6에서 분석한 복합체를 나타낸다. 실선은 pH 7.4에서 분석한 복합체를 나타낸다.
도 7은 상이한 pH 값에서 "mAb1"로 지정된 tmAb1 및 이의 2가 형태의 자기-결합을 보여준다.
도 8은 고 이온 강도 제형 및 저 이온 강도 제형 내 mAb1 및 tmAb1의 사진을 보여준다. mAb1(2가)의 경우 고 이온 강도에서 농축시킨 후 겔 형성이 관찰된다(흰색 화살표 참조).
도 9는 시노몰구스 원숭이의 혈장 샘플에서 tmAb1의 수준을 보여준다.
도 10은 tmAb1를 3가지 상이한 투여량으로 투여한 시노몰구스 원숭이의 혈장 샘플에서 중성지방의 수준을 보여준다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 인간 ANGPTL3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 2, 3, 및 4는 tmAb1의 중쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 1~3의 아미노산 서열을 각각 나타낸다.
서열번호 5는 tmAb1의 중쇄 가변 도메인(VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 6은 C-말단 Gly-Lys 결실(des-(Gly-Lys))을 포함하는 tmAb1의 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 7은 C-말단 Gly-Lys 결실(des-(Gly-Lys))을 또한 포함하는 tmAb1, tmAb2, tmAb3, 및 tmAb4의 절단된 중쇄(tHC)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 8은 C-말단 Gly-Lys 결실을 갖지 않는다는 점에서 서열번호 7과 상이한 대안적인 절단된 중쇄(tHC)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 9, 10, 및 11은 tmAb1, tmAb2, tmAb3, 및 tmAb4의 경쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 1~3의 아미노산 서열을 각각 나타낸다.
서열번호 12는 tmAb1, tmAb2, tmAb3, 및 tmAb4의 경쇄 가변 도메인(VL)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 13은 tmAb1, tmAb2, tmAb3, 및 tmAb4의 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 14, 15, 및 16은 tmAb2의 중쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 1~3을 각각 나타낸다.
서열번호 17은 tmAb2의 중쇄 가변 도메인(VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 18은 tmAb2의 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 19, 20, 및 21는 tmAb3의 중쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 1~3의 아미노산 서열을 각각 나타낸다.
서열번호 22는 tmAb3의 중쇄 가변 도메인(VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 23은 tmAb3의 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 24, 25, 및 26은 tmAb4의 중쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 1~3의 아미노산 서열을 각각 나타낸다.
서열번호 27는 tmAb4의 중쇄 가변 도메인(VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 28은 tmAb4의 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 1가 항체의 (비제한적인) 개략도를 도시한다.
도 3은 tmAb0.1, tmAb0.2, tmAb0.3, tmAb0.4, 및 에비나쿠맙 서열 동일 유사체(SIA)의 투여가 다양한 시점에 마우스 혈장 내 중성지방 농도에 미치는 효과를 보여준다.
도 4a 및 4b는 tmAb0.1, tmAb0.2, tmAb0.3, tmAb0.4, 에비나쿠맙 서열 동일 유사체(SIA), 및 비히클의 투여가 마우스 혈장 내 총 ANGPTL3 농도에 미치는 효과를 보여준다. 도 4b는 100000~400000 pg/mL ANGPTL3 혈장 농도 범위에 초점을 맞춘 것인데, 이는 에비나쿠맙 SIA로 치료한 마우스 내 ANGPTL3의 혈장 수준 미만이므로 에비나쿠맙 SIA 데이터는 도면에 도시되지 않는다.
도 5는 tmAb0.1, tmAb0.2, tmAb0.3, 및 tmAb0.4, 에비나쿠맙 서열 동일 유사체(SIA)를 투여한 후 이들의 마우스 플라즈마 농도를 보여준다.
도 6a~6e는 상이한 pH 값에서 에비나쿠맙 SIA(도 6a), tmAb1(도 6b), tmAb2(도 6c), tmAb3(도 6d), tmAb4(도 6e)를 포함하는 항체-ANGPTL3 복합체의 SE-UPLC 프로파일을 보여준다. 점선은 pH 6에서 분석한 복합체를 나타낸다. 실선은 pH 7.4에서 분석한 복합체를 나타낸다.
도 7은 상이한 pH 값에서 "mAb1"로 지정된 tmAb1 및 이의 2가 형태의 자기-결합을 보여준다.
도 8은 고 이온 강도 제형 및 저 이온 강도 제형 내 mAb1 및 tmAb1의 사진을 보여준다. mAb1(2가)의 경우 고 이온 강도에서 농축시킨 후 겔 형성이 관찰된다(흰색 화살표 참조).
도 9는 시노몰구스 원숭이의 혈장 샘플에서 tmAb1의 수준을 보여준다.
도 10은 tmAb1를 3가지 상이한 투여량으로 투여한 시노몰구스 원숭이의 혈장 샘플에서 중성지방의 수준을 보여준다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 인간 ANGPTL3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 2, 3, 및 4는 tmAb1의 중쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 1~3의 아미노산 서열을 각각 나타낸다.
서열번호 5는 tmAb1의 중쇄 가변 도메인(VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 6은 C-말단 Gly-Lys 결실(des-(Gly-Lys))을 포함하는 tmAb1의 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 7은 C-말단 Gly-Lys 결실(des-(Gly-Lys))을 또한 포함하는 tmAb1, tmAb2, tmAb3, 및 tmAb4의 절단된 중쇄(tHC)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 8은 C-말단 Gly-Lys 결실을 갖지 않는다는 점에서 서열번호 7과 상이한 대안적인 절단된 중쇄(tHC)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 9, 10, 및 11은 tmAb1, tmAb2, tmAb3, 및 tmAb4의 경쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 1~3의 아미노산 서열을 각각 나타낸다.
서열번호 12는 tmAb1, tmAb2, tmAb3, 및 tmAb4의 경쇄 가변 도메인(VL)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 13은 tmAb1, tmAb2, tmAb3, 및 tmAb4의 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 14, 15, 및 16은 tmAb2의 중쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 1~3을 각각 나타낸다.
서열번호 17은 tmAb2의 중쇄 가변 도메인(VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 18은 tmAb2의 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 19, 20, 및 21는 tmAb3의 중쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 1~3의 아미노산 서열을 각각 나타낸다.
서열번호 22는 tmAb3의 중쇄 가변 도메인(VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 23은 tmAb3의 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 24, 25, 및 26은 tmAb4의 중쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 1~3의 아미노산 서열을 각각 나타낸다.
서열번호 27는 tmAb4의 중쇄 가변 도메인(VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 28은 tmAb4의 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
인간 혈장에서 중성지방을 낮추기 위해 LPL의 ANGPTL3 억제를 억제하는 데 사용되는, Evkeeza®와 같은 항-ANGPTL3 항체를 정맥내(i.v.) 투여한 후, ANGPTL3의 투여량 의존적 축적이 관찰되었다(Ahmad 등의 문헌[(2019) Circulation Aug 6; 140(6): 470-486]; 보충 정보는 도 2 참조).
이 현상은 항체-매개 항원 축적으로서 알려져 있으며, 이는 치료 효능에 도달하기 위해 필요한 항체 투여량을 크게 증가시킬 수 있다. 높은 치료적 유효 투여량에 대한 필요성으로 인해 투여 경로와 관련된 어려움이 생길 수 있다. 예를 들어, 고 투여량의 항체를 피하(s.c.) 투여하려면, 용액 상태의 가용성, 자기 결합, 및 점도와 관련하여 항체가 충분히 양호한 특성을 가져야 한다.
이러한 항체에 의해 결합된 가용성 항원의 제거를 전반적으로 증가시키기 위한 소위 스위핑 항체가 개발되었지만(Igawa 등의 문헌[(2016) Immun. Rev. 270:132-151)], 여러 항체가 동일한 표적에 결합되어 Fc 수용체에게 여러 번의 결합 기회가 노출될 때, ANGPTL3과 같은 올리고머 표적 단백질은 이러한 개념에 대한 특이적인 어려움을 제기한다. 이는 항체 재활용 메커니즘에서 항체-Fc 수용체 친화도에 결합력을 부가함으로써 항체가 엔도솜에 흡수되는데 도움을 준다. 그러나, 동시에, 이는 pH 의존적 항원 방출과 엔도솜/리소좀에서의 스위핑을 어렵게 하며, 여러 항체가 단일 다량체 항원에 결합할 때 생성되는 다성분 면역 복합체(IC)의 제거를 촉발함으로써 항체 재순환을 어렵게 한다.
각 항체 분자 상에 2개 이상의 Fab 모이어티가 존재하면, 올리고머 표적이 동일한 항체에 여러 번 결합할 기회를 유사하게 노출시켜 복잡한 이종 IC 네트워크 형성할 수 있으며, 그 크기는 면역학적 반응 및 IC의 제거와 상관된다(Opolka-Hoffmann 등의 문헌[(2021) mAbs,13:1,1995929]; St. Clair 등의 문헌[(2017) PLOS one, 12(1):e0170556]).
본 발명자들은, pH-의존적 결합 특성을 추가로 갖는 1가 항체 포맷을 사용함으로써 항체의 개선된 점도 프로파일을 달성할 수 있고, 이에 의해 s.c. 투여에 의해 항체를 투여하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 놀랍게도, 분자 당 하나의 ANGPTL3 결합 부위만을 갖는 1가 포맷으로의 전환한 결과 분자 당 2개의 ANGPTL3 결합 부위를 갖는 Evkeza®와 동등한 중성지방 저하 효능이 생성되었다. 본원에 개시된 항체의 크기가 작을수록 s.c. 투여에 대한 가능성이 더 강화된다. 본원에 개시된 항체는, 최대 20 mg/ml 농도의 i.v. 주입 백으로 제조되도록 정해진 Evkeeza®와 대조적으로, 적어도 70 mg/ml의 용액 농도를 가능하게 하는 생물물리학적 특성을 갖는다.
따라서, 본 발명은 인간 hANGPTL3에 결합할 수 있고 hANGPTL3-매개 LPL 억제를 감소시킬 수 있는 1가 항체 및 이의 항원 결합 단편, 및 의약에 있어서 뿐만 아니라 이러한 화합물을 포함하는 약학적 조성물(s.c. 투여에 적합한 약학적 조성물 포함)에 있어서 이의 용도에 관한 것이다.
일 양태에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3에 결합하여 인간 혈장에서 중성지방의 농도를 감소시킬 수 있다.
이러한 일 양태에서, 1가 항체 및 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3에 결합하여 인간 혈장에서 hANGPTL3의 농도를 감소시켜 LPL의 억제를 감소시킬 수 있다.
또 다른 이러한 양태에서, 1가 항체 및 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3에 결합할 수 있고 hANGPTL3-매개 LPL의 억제를 억제할 수 있는 길항제이다.
일 양태에서, 1가 항체 및 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3에 결합할 수 있고 hANGPTL3-매개 LPL의 억제를 억제할 수 있을 뿐 아니라 인간 혈장에서 hANGPTL3의 농도를 감소시켜 hANGPTL3-매개 LPL의 억제를 감소시킬 수 있다.
일 양태에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 투여된 후 인간 혈장에서 hANGPTL3의 농도를 증가시키지 않는다.
일 양태에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 투여된 후 인간 혈장에서 hANGPTL3의 농도를 저하시킨다.
일 양태에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상응하는 2가 항체와 비교했을 때, 용액의 넓은 pH 간격에 걸쳐 감소된 점도, 감소된 겔 형성, 및 낮은 자기 결합 경향을 제공한다.
일 양태에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 조성물로 제조될 수 있으며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 25 mg/ml 이상, 바람직하게는 50 mg/ml 이상, 예컨대 70 mg/ml 이상이다.
본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 특정 용어를 먼저 정의한다.
용어 “하나(a 또는 an)”는 “하나 이상”을 의미하도록 의도된다. 단계 또는 요소의 앞에서 이를 수식할 때의 용어 “포함하는(comprise 및 이의 변형된 표현인 comprises 및 comprising)”은 추가의 단계 또는 요소의 임의로 존재할 수 있고 이를 배재하지 않음을 의미하도록 의도된다.
용어 “약”은 대략, 얼추, 또는 거의를 의미하도록 본원에서 사용된다. 용어 “약”이 수치 범위와 함께 사용될 때, 이는 제시된 수치 값의 위 아래로 경계를 연장시킴으로써 그 범위를 변경한다. 일반적으로, 용어 “약”은 수치 값을 표시된 값의 위 또는 아래로 약 10%만큼 (더 높이 또는 더 낮게) 수정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "길항성 항체"는 항체가 결합하는 항원, 예컨대 hANGPTL3의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3에 특이적으로 결합하여 LPL에 대한 hANGPTL3의 억제 효과를 부분적으로 또는 완전히 차단함으로써 인간 환자의 혈장에서, 예를 들어 중성지방 수준을 감소시킨다.
용어 “항체”는 적어도 4개의 폴리펩티드 사슬(이황화 결합에 의해 연결된 2개의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC))을 포함하는 전장 항체뿐만 아니라, 적어도 3개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 항체(이황화 결합에 의해 연결된 2개의 중쇄(HC) 및 1개의 경쇄(LC))도 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 중쇄 중 하나는 절단된 중쇄일 수 있다.
특정 약학적 관심 면역글로불린들의 하나의 부류는 IgG이다. 인간에서, IgG 클래스는 이의 중쇄 불변 영역 서열에 기초하여 4개의 하위-클래스 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 나누어질 수 있다. 경쇄는 이의 서열 성분 차이에 기초하여 2가지 유형, 즉 카파 및 람다 사슬로 나누어질 수 있다. IgG 분자는 2개 이상의 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄, 및 이황화 결합에 의해 중쇄에 각각 부착된 2개의 경쇄로 구성된다.
IgG 중쇄는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 최대 3개의 중쇄 불변 도메인(CH), 즉 CH1, CH2 및 CH3을 포함할 수 있다. 경쇄는 경쇄 가변 도메인(VL) 및 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함할 수 있다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성의 영역, 또는 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되고, 더 보존된 영역과 산재된 초가변 영역(HvR)으로 더 세분화될 수 있다. VH 및 VL 도메인은 일반적으로 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 이들은 다음의 순서로 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 배치된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 초가변 영역(CDR)을 함유하는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 항원과 상호 작용할 수 있는 구조를 형성하는 반면, 항체의 불변 영역은 면역 체계의 다양한 세포(작동자 세포), Fc 수용체, 및 고전적인 보체 시스템의 C1 복합체의 제1 성분인 C1q를 포함하되 이들로 한정되지 않는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 발명의 항체는 단클론 항체(mAbs), 예컨대 1가 단클론 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 당업자에게 공지된 다양한 방법을 사용하여 생산되고 정제될 수 있다. 예를 들어, 항체는 하이브리도마 세포로부터 생산될 수 있다. 항체는 B 세포 증식에 의해 생산될 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 재조합에 의해 포유류 또는 미생물 발현 시스템에서 발현되거나, 시험관내 번역에 의해 발현될 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 파지 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 효모 디스플레이, 포유동물 세포 디스플레이, 또는 리보솜 또는 mRNA 디스플레이에 의해 세포 표면 결합 분자로서 재조합적으로 발현될 수도 있다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이들의 상보성 결정 영역(CDR)과 관련하여 정의될 수 있다. 용어 “상보성 결정 영역(complementarity-determining region)” 또는 “CDR”이 본원에서 사용되는 경우, 이들은 항원 결합에 관여하는 아미노산 잔기가 위치하는 항체의 영역을 지칭한다. CDR은 항체 가변 도메인의 아미노산 정렬에 있어서 가장 높은 변동성을 갖는 영역으로서 식별될 수 있다. Kabat 데이터베이스와 같은 데이터베이스가 CDR 식별에 위해 사용될 수 있으며, CDR은, 예를 들어 경쇄 가변 도메인의 아미노산 잔기 24~34(L1), 50~56(L2) 및 89~97(L3) 및 중쇄 가변 도메인의 31~35(H1), 50~65(H2) 및 95~102(H3)를 포함하는 것으로서 정의된다; (Kabat 등의 1991 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조). 일반적으로, 이러한 영역에서의 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat 등의 전술한 문헌에 기술된 방법에 의해 수행된다. 본원에서의 “Kabat 위치”, “Kabat 잔기”, 및 “Kabat에 따른”과 같은 구절은 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대한 이러한 넘버링 시스템을 지칭하며, 문맥상 모순되지 않는 한 Kabat에 따른 넘버링이 본원에서 사용된다.
항체의 불변 영역 내 아미노산 잔기의 넘버링은 인간 IgG1의 결정 구조에 사용된 넘버링을 참조하여 수행되며(Edelman 등의 문헌[(1969) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63: 78-85]), 본원에서 “EU 위치”, “EU 잔기”, 및 “EU 인덱스에 따른”과 같은 문구는 Edelman 등의 문헌[(1969) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63: 78-85]에 따른 중쇄 및 경쇄 불변 도메인의 넘버링을 지칭한다.
중쇄 (또는 경쇄) 내의 위치, 예컨대 “위치 250에서의 발린 (V)”을 언급하는 것은 문맥에 의해 달리 언급되거나 모순되지 않는 한, 발린이 (주어진 잔기 위치가 2개의 중쇄 모두에 존재하는 한) 2개의 중쇄 모두의 위치 250에서 발견됨을 의미한다.
항체의 “항원 결합 단편”이라는 용어는 본원에 기술된 바와 같이 ANGPTL3 및 특히 hANGPTL3와 같은 항원에 특이적으로 결합하거나 이를 인식하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편(들)을 지칭한다. 항원 결합 단편의 예는 단일 VH와 단일 VL 도메인 둘 다와 Fc-수용체 상호작용 영역을 포함하는 1가 분자를 포함한다(그러나 이에 한정되지는 않음).
본 발명의 항체 단편은, 예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄(들)의 N-말단 및/또는 C-말단 단부로부터 하나 이상의 아미노산의 결실에 의해 만들어질 수 있다. 단편은 하나 이상의 내부 결실에 의해 생성될 수도 있다.
본 발명은 본원에 개시된 항체의 변이체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는데, 이들은 본원에 개시된 개별 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다.
“치환” 변이체는 바람직하게는 하나 이상의 아미노산(들)을 동일한 수의 아미노산(들)으로 치환하는 것을 포함한다. 치환은 보존적 치환일 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 아미노산은 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환될 수 있는데, 예를 들어, 염기성 아미노산은 또 다른 염기성 아미노산으로(예를 들어, 리신에서 아르기닌으로) 치환될 수 있고, 산성 아미노산은 또 다른 산성 아미노산으로(예를 들어, 글루타메이트에서 아스파르테이트로) 치환될 수 있고, 중성 아미노산은 또 다른 중성 아미노산으로(예를 들어, 트레오닌에서 세린으로) 치환될 수 있고, 하전된 아미노산은 다른 하전된 아미노산으로(예를 들어, 글루타메이트에서 리신으로) 치환될 수 있고, 친수성 아미노산은 또 다른 친수성 아미노산으로(예를 들어, 아스파라긴에서 글루타민으로) 치환될 수 있고, 소수성 아미노산은 또 다른 소수성 아미노산으로(예를 들어, 알라닌에서 발린으로) 치환될 수 있고, 극성 아미노산은 또 다른 극성 아미노산으로(예를 들어, 세린에서 트레오닌으로) 치환될 수 있고, 방향족 아미노산은 또 다른 방향족 아미노산으로(예를 들어, 페닐알라닌에서 트립토판으로) 치환될 수 있으며, 지방족 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산으로(예를 들어, 류신에서 이소류신으로) 치환될 수 있다.
바람직한 변이체는, 서열에서 나타나는 아미노산 잔기 대신에, 아미노산 잔기의 구조적 유사체를 포함하는 변이체를 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편은 Fc 수용체로 불리는 세포 표면 수용체와 상호작용할 수 있는 영역, 예컨대 결정화 가능한 영역(“Fc 도메인”으로도 알려진 “Fc 영역”; 이에 한정되지는 않음)을 포함한다. Fc 영역은 항체의 C-말단 영익이며, 이는 힌지 도메인과 불변 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. Fc 도메인은 Fc 수용체로 불리는 세포 표면 수용체뿐만 아니라 보체 시스템의 일부 단백질과도 상호 작용할 수 있다. Fc 영역은 항체가 면역 체계와 상호 작용할 수 있게 한다. 본 발명의 일 양태에서, 항체는 Fc 영역 내에서 특히 혈장 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 단백질 안정성, 및/또는 세포의 항원 의존성 세포독성과 같은 항체의 기능적 특성 중 하나 이상을 일반적으로 변경시키거나 이를 결여시키는 변형(예: T252L/T254S/T256F Ghetie 등의 문헌[(1997) Nature Biotechnol. 15:637-640]; M428L/N434S Zalevsky 등의 문헌[(2010) Nat. Biotechnol. 28:157-159]; H433K/N434F, Ober의 문헌[(2014) (US8834871)}; T307A/E380A/N434A, Petkova 등의 문헌[(2006) Int. Immunol 18:1759-1769]; T250A/M428L, Hinton 등의 문헌[(2006) J. Immunol. 176:346-356]; M252Y/S254T/T256E, US2003/0190311, Dall’Acqua 등의 문헌[(2006) J. Biol. Chem. 281:23514-23524]; N434H, Zheng 등의 문헌[(2011) Clin. Pharm.&Ther. 89:283-290]; M252Y/T256D, T256D/T307Q, T256D/T307W, Mackness 등의 문헌[(2019) mAbs 11:1276-1288], EU 인덱스에 따른 잔기 넘버링)을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 화학적으로 변형되거나 (예를 들어 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있거나), 항체의 글리코실화를 변경하고 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 다시 변경하도록 변형될 수 있다.
IgG1 항체와 같은 항체는 Q311R 및 P343R과 같은 특정 Fc-감마 수용체에 대한 결합을 증가시키게 될 다음 치환 중 하나 이상을, 바람직하게는 모두를 L234Y, P238D, T250V, V264I, T307P, 및 A330K(EU 인덱스에 따른 잔기 넘버링)와 함께 포함하는 변형된 Fc 도메인을 가질 수 있다. 대안적으로, FcRn 및/또는 Fc-감마 수용체 결합을 증가시키는 것으로 당업계에 알려진 다른 아미노산 치환이, 임의로 위에 언급된 치환과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, WO2016/125495 뿐만 아니라 WO2013/002362, WO2014/104165, WO2012/115241, WO2014/030728, WO2014/163101, 및 WO2017/104783을 참조하고, 이들 모두는 참조로서 본원에 통합된다.
IgG1 항체는 혈장 반감기를 증가시키게 되는 치환을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 치환은 M252Y, S254T, 및 T256E를 함께 포함한다(EU 인덱스에 따른 잔기 넘버링). 또한 본원에 참조로서 통합된 US2003/0190311 참조.
용어 “결합 친화도”는 2개의 분자 간의, 예를 들어 항체 또는 이의 단편과 항원 간의 비-공유 상호 작용의 강도의 척도이다. 상기 용어는 1가 상호작용을 기술하도록 사용된다. 1가 상호작용을 통한 2개의 분자(예를 들어 항체 또는 이의 단편, 및 항원) 간의 결합 친화도는 평형 해리 상수(KD)를 결정함으로써 정량화될 수 있다. KD는 예를 들어 표면 플라스몬 공명(SPR) 방법 또는 등온 적정형 열량측정(Isothermal Titration Calorimetry, ITC) 방법에 의해 복합체의 형성 및 해리의 동역학을 측정함으로써 결정될 수 있다. 1가 복합체의 결합 및 해리에 상응하는 속도 상수는 결합 속도 상수 ka (또는 kon) 및 해리 속도 상수 kd (또는 koff)로서 각각 지칭된다. KD는 등식 KD = kd / ka를 통해 ka 및 kd와 연관된다.
상기 정의에 따르면, 상이한 분자 상호작용과 연관된 결합 친화되, 예컨대 주어진 항원에 대한 상이한 항체의 결합 친화도는, 개별 항체/항원 복합체에 KD 값을 비교함으로써 비교할 수 있다.
해리 상수의 값은 잘 알려진 방법에 의해 직접 결정될 수 있다. 표적에 대한 리간드(예: 항체)의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 분석법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, RIA, 및 유세포 계측 분석을 포함한다. 항체의 결합 동역학 및 결합 친화도 또한 당업계에 공지된 표준 분석법, 예컨대 SPR에 의해 평가될 수 있다.
표적에 대한 항체의 결합을, 해당 항체의 또 다른 리간드(예: 또 다른 항체)가 존재하는 가운데 표적의 결합과 비교하는 경쟁 결합 검정이 수행될 수 있다.
문맥에 의해 모순되지 않는 한, KD는 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된다(실시예 7 참조).
“종간 반응성(cross-species reactive)” 항체는 비슷한 친화도로, 특히 100배 범위의, 예컨대 50배 범위 이내의, 20배 범위 이내의, 또는 10배 범위 이내의 KD로, 모든 표시된 종(예: 인간, 마우스, 및 시노몰구스 원숭이) 유래의 ANGPTL3에 결합한다. 정의된 X배의 KD 범위 이내란, 열거된 특정 종에 대한 가장 높은 친화도가 열거된 상이한 종에 대한 결합에 대해 측정된 가장 낮은 친화도보다 X배 이하임을 의미한다. 당업자는, 열거된 모든 종에 대한 KD 측정에 동일한 조건이 적용되는 한, 임의의 친화도 측정 방법이, 종간 반응성 항체가 본원에 기술된 것과 같은 주어진 KD 배수 범위 이내에서 열거된 모든 종 유래의 표적 항원에 결합한다는 것을 검증하는 데 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 바람직하게는, KD 값은 SPR을 사용하여, 특히 25℃에서 측정된다. 바람직하게는, 친화도는 종간 반응성 항체를 Fab 단편으로서 사용하여 측정된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “혈장 내 상승된 중성지방 농도”는 150~500 mg/dL의 혈장 수준을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “혈장 내 고도로 상승된 중성지방 농도”는 500 mg/dL를 초과하는 혈장 수준을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “혈장 내 정상 중성지방 농도”는 150 mg/dL 미만의 혈장 수준을 지칭한다.
당업계에 공지된 바와 같이, 용어 "동일성(identity)"은 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같이, 2개 이상의 폴리펩티드의 서열 간의 관계를 지칭한다. 당업계에서, "동일성"은 또한 2개 이상의 아미노산 잔기의 스트링 간의 일치의 수에 의해 결정된 바와 같이, 폴리펩티드들 간의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성"은 특정 수학 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, 알고리즘)에 의해 다루어지는 gap 정렬(존재하는 경우)을 사용해 둘 이상의 서열 중 더 작은 것들 간의 동일한 일치 백분율을 측정하는 것이다. 관련 폴리펩티드의 동일성은 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 본 발명에서, 유사성 및 동일성은 gap 개방 및 연장에 대해 각각 10 및 0.5의 파라미터를 사용하여(gapopen=10, gapextend=0.5) EMBOSS-6.6.0의 Needleman(Needleman 등의 문헌[J. Mol. Biol. 1970; 48:443-453])을 사용해 결정하였다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “1가 항체”는 하나의 항원 분자에 결합할 수 있고 항원 가교 결합을 할 수 없는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일 아암(one-armed)"은 항체 단일 경쇄, 중쇄, 및 적어도 중쇄 Fab 영역이 결여된 절단된 중쇄로 구성된 특정 유형의 1가 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일 특이적" 항체는 단일 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 프레임워크 영역의 적어도 일부 및/또는 CDR 영역의 적어도 일부가 유래되는 가변 도메인을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 유래되는 가변 도메인을 가질 수 있다. 또한, 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역 또는 이의 일부분도 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 바람직하게는, 인간 항체는 단클론 항체이다.
용어 “중쇄”는 전장 중쇄를 포함한다. 전장 중쇄는 가변 도메인 VH, 및 3개의 불변 도메인 CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노 말단에 있고, CH 도메인은 카르복실 말단에 있으며, CH3은 -COOH 말단에 가장 가깝게 위치한다. 중쇄의 C-말단 단부는 C-말단 Gly-Lys 결실(des-(Gly-Lys))을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "경쇄"는 전장 경쇄를 포함한다. 전장 경쇄는 가변 도메인 VL 및 불변 도메인 CL을 포함한다. 경쇄의 가변 도메인은 폴리펩티드의 아미노 말단에 있다. 본원에 기술된 바와 같은 경쇄는 카파 사슬 및 람다 사슬을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 “면역 복합체(immune complex)”는 하나 이상의 항체(들)가 하나 이상의 표적 항원(들)에 결합할 때 형성되는 복합체를 지칭한다. 그 예로는, 2개 이상의 ANGPTL3 분자에 결합한 하나 이상의 항-ANGPTL3 항체(들)가 있다. 상기 용어는 “면역복합체(immunocomplex)”와 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 “등전점” 또는 “pI”는 단백질(예: 항체)의 전체 순전하가 0인 pH 값을 지칭한다. 단백질에는 많은 하전된 기가 있을 수 있으며, pI에서는 이러한 모든 전하의 합이 0이다. pI를 초과하는 pH에서, 단백질의 전체 순전하는 음인 반면, pI 미만의 pH 값에서, 단백질의 전체 순전하가 양일 것이다.
pI는 이론적인 pI이거나 실험적으로 결정된 pI일 수 있다.
당업자는 단백질의 pI를 결정하는 방법을 알고 있다. 가장 일반적으로, 단백질의 pI는 단백질의 아미노산 서열에 기반하여 연산된다. 단백질의 등전점을 결정할 수 있는 “ExPASy Compute pI/Mw”와 같은 많은 (온라인) 도구를 이용할 수 있다; John M. Walker (ed)의 문헌[The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005), pp. 571-607]에서 Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A. 참조.
pI는 실험적으로 결정될 수도 있고, 전하 변이체는, 예를 들어 등전점 전기영동(IEF) 겔 전기영동 또는 모세관 등전점 전기영동(cIEF) 겔 전기영동과 같은 전하 기반 분리 기술을 사용하여 분리될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "다량체화 도메인"은 예를 들어 1가 항체의 각 중쇄의 영역을 지칭한다. “다량체화 도메인”은 키메라 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 엔티티 간의 안정한 상호작용을 촉진한다. 바람직하게는, 다량체화 도메인은 제1 중쇄와 제2 중쇄 간의 상호작용을 촉진함으로써, 원하는 이종다량체 1가 항체의 형성을 향상시키고 원하지 않는 동종다량체 항체가 형성될 확률을 실질적으로 감소시킨다. 다량체화 도메인은 키메라 이종다량체의 키메라 분자 사이에서 분자간 이황화 결합을 형성하는 면역글로불린 서열, 류신 지퍼, 소수성 영역, 친수성 영역, 또는 유리 티올을 통해 상호작용할 수 있다. 유리 티올은 폴리펩티드의 자연 발생 잔기를, 예를 들어 제1 중쇄와 제2 중쇄 사이에서 이황화 결합의 형성을 가능하게 하는 위치에 있는, 시스테인과 치환함으로써 하나 이상의 상호작용하는 폴리펩티드의 계면 내로 도입될 수 있다. 다량체화 도메인은 면역글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다. 가능한 다량체화 도메인은 하이브리드 면역글로불린이 기술된 PCT/US90/06849에 개시되어 있다. 또한, 다량체화 영역은, 입체 상호작용이 안정한 상호작용을 촉진할 뿐만 아니라, 단량체의 혼합물로부터 동종이량체보다 이종이량체의 형성을 추가로 촉진하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 헤테로-올리고머화를 위해 제1 및 제2 폴리펩티드 간의 계면에 대한 “돌출부-공동(protuberance-into-cavity)” 전략이 개시된 PCT/US96/01598, 및 특히 WO98/50431을 참조한다. “돌출부”는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예: 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 작제된다. 돌출부와 크기가 같거나 비슷한 맞물리는 “공동”은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것(예: 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 제2 폴리펩티드의 계면 상에 임의로 생성된다. 면역글로불린 서열은 면역글로불린 불변 도메인이다. 본원에 개시된 것과 같은 항체 내의 면역글로불린 모이어티는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아형으로부터 수득될 수 있다.
키메라, 하이브리드, 또는 비대칭 면역글로불린을 생성하기 위한 많은 기술이 존재하며, 본 출원에 사용된 절단 기술(Merchant 등의 문헌[(2013) PNAS USA 110:E2987-2996])이 잠재적으로 키메라 포맷 중 어느 하나(예: DEEK (De Nardis 등의 문헌[(2017) J. Biol. Chem. 292:14706-14717]), ART-Ig 및 FAST-Ig (Shiraiwa 등의 문헌[(2019) Methods 154:10-20]; Yamaguchi 등의 문헌[(2020) Blood 136:19]) 또는 DuoBody (Labrijn 등의 문헌[(2013) PNAS USA 110: 5145-5150])와 함께 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “혈장 반감기”는 환자에게 투여된 물질의 양의 절반이 정상적인 생물학적 과정에 의해 환자의 혈청 또는 혈장으로부터 대사되거나 제거되는데 필요한 시간을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “표면 노출된 아미노산 잔기”는 용매 분자(일반적으로, 이는 대부분 물 분자일 수 있음)와 접촉할 수 있는 측쇄를 가진 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러나, 측쇄가 용매 분자와 완전히 접촉해야하는 것은 아니며, 측쇄의 일부가 용매 분자와 접촉할 때에도, 아미노산 잔기는 “표면에 위치한 아미노산”으로서 정의된다. 폴리펩티드의 표면에 위치된 아미노산 잔기는 항체 표면에 가깝게 위치한 잔기를 포함할 수도 있는데, 이러한 잔기는 용매 분자와 (비록 부분적이라도) 접촉하는 측쇄를 가진 다른 아미노산 잔기(들)와 상호 전하 영향을 주고 받을 수 있다. 당업자는, 예를 들어 상업적으로 또는 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하는 상동성 모델링 또는 머신 러닝에 의해, 폴리펩티드 또는 항체의 상동성 모델 또는 머신 러닝 기반 3차원 분자 모델을 제작할 수 있따. 대안적으로, 3차원 분자 모델 생성을 위해 X-선 결정학과 같은 방법을 사용하는 것이 가능하다. 표면 상에서 노출될 수 있는 아미노산 잔기는, MOE(Chemical Computing Group) 또는 Bioluminate(Schrodinger)와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 항체의 3차원 분자 모델의 좌표를 사용해 결정할 수 있다. 표면 노출된 부위는 당 기술 분야에 알려진 알고리즘을 사용해 결정할 수 있다(예를 들어, Lee 및 Richards의 문헌[(1971) J. Mol. Biol. 55:379-400]; Connolly, J. Appl. Cryst.의 문헌[(1983) 16:548-558]). 표면 노출 가능한 부위는 항체로부터 수득한 3차원 구조 정보의 단백질 모델링 및 분석에 적합한 소프트웨어를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 목적을 위해 이용할 수 있는 소프트웨어는, 예를 들어 MOE(Chemical Computing Group) 또는 Bioluminate(Schrodinger)를 포함한다. 용매가 접근할 수 있는 표면적(Å2 단위)은 프로브 반경이 1.4 Å인 물 프로브를 사용하여 계산된다. 또한, 퍼스널 컴퓨터용 소프트웨어를 사용하여 표면 노출된 영역 및 면적을 결정하는 방법은 Pacios에 의해 기술된 적이 있다(Pacios의 문헌[Comput. Chem. 18(4):377-386 (1994)]; [J. Mol. Model. 1:46-53 (1995)]). 전술한 것과 같은 이러한 정보에 기초하여, 용매와 접촉하는 항체의 표면에 위치한 적절한 아미노산 잔기를 선택할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “치료”는 이를 필요로 하는 임의의 인간 대상체의 의학적 요법을 지칭한다. 상기 대상체는 의사에게 신체 검사를 받았을 것이고, 의사는 상기 특이적 치료제의 사용이 상기 인간 대상체의 건강에 유익하다는 것을 나타내는 감별 진단(tentative diagnosis) 또는 확정 진단(definite diagnosis)을 내렸을 것으로 예상된다. 상기 치료의 시기 및 목적은 대상체의 현재 건강 상태에 따라 개인마다 다를 수 있다. 따라서, 상기 치료는 예방적, 완화적, 대증적, 및/또는 치유적일 수 있다. 본 발명의 관점에서, 예방적, 완화적, 대증적, 및/또는 치유적 치료는 본 발명의 별도의 양태를 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “치료(treating, treat, 또는 treatment)” 및 이의 변형된 표현은 장애의 적어도 하나의 증상을 감소시키거나 제거하기에 충분한, 본원에 개시된 것과 같은 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, “치료”가 반드시 치유인 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “예방(preventing, prevent, 또는 prevention)” 또는 이의 변형된 표현은 질환의 적어도 하나의 증상이 발생하는 것으로부터 대상체를 보호하거나 장애 증상의 중증도를 감소시키는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “절단된 중쇄”는 가변 도메인의 적어도 일부가 결여되어 더 이상 hANGPTL3에 결합할 수 없고, 제1 불변 IgG 도메인(CH1) 또는 이의 일부가 임의로 결여되어 중쇄/경쇄 페어링에 적합한 시스테인 잔기(예: IgG1 Cys220 EU 잔기)를 포함하지 않는 중쇄를 지칭한다. 일 구현예에서, “절단된 중쇄”는 IgG1 Asp221(EU 잔기)이 N-말단 아미노산 잔기가 되도록 전체 가변 도메인, CH1, 및 힌지 영역의 일부가 결여된 중쇄를 지칭한다. 명료성을 위해, 위치 446 및 447에서 C-말단 글리신-리신 잔기만이 제거되는 중쇄는 따라서 “절단된 중쇄”로 간주되지 않는다.
또 다른 구현예에서, 절단된 중쇄는, Fab 영역이 존재하지 않는 다는 점에서, 및 서열번호 8의 위치 446 및 447에서 C-말단 글리신-리신 잔기(EU 잔기)가 각각 존재하거나(서열번호 8) 존재하지 않는다는(서열번호 7) 점에서 전장 중쇄와 상이하다.
하나의 이러한 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 1가 항체는 중쇄 및 절단된 중쇄를 포함하되, 상기 두 사슬 모두는 IgG1 이소형이거나 IgG1 이소형을 기반으로 하고, Fab 영역 및 위치 446 및 447에서의 Gly-Lys C-말단 잔기(EU 잔기) 각각이 절단된 중쇄에 존재하지 않고, 중쇄의 위치 446 및 447에서의 Gly-Lys C-말단 잔기(EU 잔기)가 존재하지 않는다.
바람직한 구현예에서, 절단된 중쇄는 서열번호 7을 포함한다.
약학적 조성물과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “고농도”는 50 mg/ml 이상의 농도를 의미한다.
1가 항체의 생산
본원에 개시된 것과 같은 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 3개의 상이한 폴리펩티드 사슬, 특히 중쇄, 절단된 중쇄, 및 경쇄를 발현하는 하나의 숙주 세포주에서 생산될 수 있으며, 이러한 항체의 비제한적인 예시는 예를 들어 도 2를 참조한다. 완전한 기능성 분자를 수득하기 위해서 항체의 추가적인 아암-교환 또는 시험관내 재접힘이 필요하지는 않다.
일 구현예에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2개의 상이한 중쇄, 예컨대 전장 중쇄와 절단된 중쇄의 이종이량체화를 용이하게 하는 소위 노브-인-홀 치환을 포함한다. 다양한 세트의 노브-인-홀 치환이 존재하며, 바람직한 구현예에서, 중쇄는 T366W(EU 잔기)를 포함하고, 절단된 중쇄는 T366S, L368A, 및 Y407V(EU 잔기)를 포함한다. 본원에 참조로서 통합된 WO98/50431을 또한 참조한다.
바람직한 구현예에서, 1가 항체는 경쇄, 전장 중쇄, 및 절단된 중쇄(221~445, EU 잔기)를 함유하는데, 이들 모두는 항체를 생산하기에 적합한 숙주 세포에서 공동으로 발현되고 조립된다.
바람직한 또 다른 구현예에서, 1가 항체는 경쇄, C-말단 des-Gly-Lys 중쇄(1~445, EU 잔기), 및 C-말단 des-Gly-Lys 절단된 중쇄(221~445, EU 잔기)를 함유하는데, 이들 모두는 항체를 생산하기에 적합한 숙주 세포에서 공동으로 발현되고 조립된다.
hANGPTL3 및 본원에 개시된 것과 같은 항체를 포함하는 복합체는 중성 pH(pH 7.4)에서 관찰되므로, 1가 항체의 친화도는 hANGPTL3에 효율적으로 결합하기에 충분하다. 2~3개의 1가 항체가 삼량체 hANGPTL3 항원에 결합하는 것이 입증되었는데, 그 결과 에비나쿠맙 SIA 항체/hANGPTL3 면역 복합체와 비교하여 더 균일하고 덜 이질적인 hANGPTL3/항체 면역 복합체가 생성하였다(실시예 6 참조).
일 구현예에서, 본원에 개시된 것과 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 에비나쿠맙 SIA 항체/hANGPTL3 면역 복합체와 비교하여 더 작고 덜 이질적인 항체/hANGPTL3 면역 복합체를 제공한다. 더 작고/작거나 덜 이질적인 면역 복합체는, 항체/hANGPTL3 복합체가 더 크고/크거나 더 이질적인 경우와 비교하여 면역원성의 감소를 유도할 것으로 예상된다.
항체-항원 복합체의 세포 흡수 증가
본원에 개시된 것과 같은 1가 항체는 hANGPTL3에 pH-의존적으로 결합할 수 있고, 항체-항원 복합체의 세포 흡수를 증가시키기 위한 치환을 포함한다.
pH-의존적 항체
본원에 개시된 것과 같은 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중성 pH 범위보다 산성 pH 범위에서 더 낮은 항원 결합 활성을 갖는다. 결과적으로, 낮은 pH에서 hANGPTL3에 대한 친화도가 감소하면(실시예 7 참조) 낮은 pH(pH 6.0)에서 hANGPTL3/항체 복합체가 완전한 또는 거의 완전히 해리된다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 20 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 30 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 40 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 50 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 60 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 70 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 80 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 90 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 95 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 100 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 110 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 120 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 130 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 140 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 150 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 160 이상, 예컨대 166 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 170 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 180 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 190 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 200 이상이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 40 내지 500 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 40 내지 400 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 40 내지 300 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 40 내지 200 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 90 내지 500 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 90 내지 400 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 90 내지 300 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 90 내지 200 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 80 내지 250 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 80 내지 200 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 80 내지 170 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 90 내지 250 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 90 내지 200 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 90 내지 170 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 90 내지 166 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 95 내지 250 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 95 내지 200 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 95 내지 170 범위이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD와 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 가지며, 상기 값은 95 내지 166 범위이다.
개선된 Fc 수용체 결합
본 발명의 맥락에서, 순환하는 hANGPTL3의 수준을 낮추기 위해서는 항체-항원 복합체의 증가된 세포 흡수가 바람직하다.
일부 구현예에서, 항체-항원 복합체의 증가된 세포 흡수는 세포 표면에 대한 1가 항체의 친화도를 증가시킴으로써 촉진된다. 항체의 Fc 부분에 양전하를 추가로 도입하면, 세포의 음으로 하전된 표면과의 상호작용 증가로 인해 흡수가 증가하여, 항체 및 항체-항원 복합체의 세포 흡수가 전반적으로 증가한다.
일부 구현예에서, 항체-항원 복합체의 증가된 세포 흡수는 인간 FcγRIIb(CD32)에 대한 1가 항체의 친화도 증가에 의해 촉진된다. 항체의 Fc 부분에서의 아미노산 치환에 의해, 인간 FcγRIIb(CD32)에 대한 친화도는 pH 7.4에서 증가하지만, 치환은 세포 표면 상의 다른 Fc 수용체에 대한 항체의 친화도에 영향을 미치지는 않는다.
일부 구현예에서, 항체-항원 복합체의 증가된 세포 흡수는 인간 FcγRIIb(CD32)에 대한 항체-항원 면역복합체의 결합력 증가에 의해 촉진된다. 항체의 Fc 부분에서의 아미노산 치환에 의해, 인간 FcγRIIb(CD32)에 대한 항체-항원 면역복합체의 결합력이 pH 7.4에서 증가하지만, 치환은 세포 표면 상의 다른 Fc 수용체에 대한 결합력에 영향을 미치지는 않는다.
일 구현예에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하지 않는 것에 비해, 순환으로부터 hANGPTL3의 제거를 적어도 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 또는 약 80%만큼 향상시킨다. hANGPTL3의 순환 수준은, 당업계에 잘 알려져 있고 본원에 기술된 시험관내 검정에 의해 측정될 수 있다(실시예 5 참조).
1가 항체의 억제 효과
hANGPTL3-매개 LPL 억제에 대한 본원에 기술된 것과 같은 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 억제 활성은 본원의 실시예 4에 기술된 것과 같은 방법에 의해 결정될 수 있다.
일 양태에서, 본원에 기술된 것과 같은 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 혈장에서 중성지방의 농도를 감소시킬 수 있다.
일 양태에서, 본원에 기술된 것과 같은 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 혈장에서 중성지방의 농도의 상승을 억제할 수 있다.
적응증
본원에 개시된 것과 같은 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여함으로써 치료 가능한 질환 또는 장애는, 항-hANGPTL3 항체 치료가 없을 때의 질환 또는 장애(예를 들어, hANGPTL3-매개 질환 또는 장애)와 비교해, hANGPTL3을 제거하거나, 억제하거나, 감소시키거나, 달리 이를 활발하게 방해함으로써 개선되거나, 완화되거나, 억제되거나, 예방되거나, 이으 발생률이 감소하는 임의의 질환 또는 병태이다.
치료 가능한 질환 또는 장애의 예는 다음을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다: 예를 들어 LDL 수용체(LDLR) 활성의 감소 및/또는 LDL 수용체 결핍(예: LDLR-/-를 동반하는 동형접합성 가족성 고콜레스테롤혈증), ApoC2 변경, ApoE 결핍증, ApoB 증가, 초저밀도 지단백질(VLDL)의 생산 증가 및/또는 제거 감소 등에 의해 유발되는 고지혈증, 고지질단백질혈증, 및 이상지질혈증과 같은 지질 대사를 수반하는 질환 또는 장애로서, 죽상경화성 이상지질혈증, 당뇨병성 이상지질혈증, 고중성지방혈증, 고콜레스테롤혈증, 유미지립혈증, 혼합형 이상지질혈증(비만, 대사 증후군, 당뇨병, 등) 등을 포함하는 질환 또는 장애.
본원에 개시된 것과 같은 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 고지혈증, 고지질단백질혈증, 및/또는 이상지질혈증과 연관이 있거나 이로 인한 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 데에도 유용하며, 상기 질환 또는 장애는 죽상경화증, 죽상경화성 심혈관 질환, 협심증, 뇌졸중, 뇌혈관 질환, 울혈성 심부전, 관상 동맥 질환, 심근경색, 말초 혈관 질환 등과 같은 심혈관 질환 또는 장애를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
약학적 조성물
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 예컨대 본원에 기술된 것과 같은 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된 본 발명의 하나 이상의 1가 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 0.25 mg/ml 내지 250 mg/ml, 예컨대 1 mg/ml 내지 250 mg/ml, 예컨대 25 mg/ml 내지 250 mg/ml의 농도로 존재하는 이러한 1가 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이며, 여기서 상기 조성물은 4.0 내지 9.0의 pH를 갖는다. 조성물은 다음 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: 완충액 시스템, 보존제, 등장화제, 킬레이트제, 안정화제, 또는 계면활성제를 비롯하여 이들의 다양한 조합. 약학적 조성물에 보존제, 등장화제, 킬레이트제, 안정화제 및 계면활성제를 사용하는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참조할 수 있다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은 수성 조성물이다. 이러한 조성물은 통상적으로 용액 또는 현탁액이지만, 콜로이드, 분산액, 유화액, 및 다상 물질을 포함할 수도 있다. 용어 “수성 조성물”은 적어도 50% w/w의 물을 포함하는 조성물로서 정의된다. 마찬가지로, 용어 "수용액(aqueous solution)"은 적어도 50% w/w의 물을 포함하는 용액으로서 정의되며, 용어 "수성 현탁액(aqueous suspension)"은 적어도 50% w/w의 물을 포함하는 현탁액으로서 정의된다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 사용 전에 용매 및/또는 희석제가 첨가되는 동결 건조된 조성물이다.
추가 양태에서, 약학적 조성물은 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 수용액, 및 완충액을 포함하되, 항체는 1 mg/ml 이상의 농도로 존재하고, 상기 조성물은 약 5.0 내지 약 8.0의 pH를 갖는다.
추가 양태에서, 약학적 조성물은 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 수용액, 및 완충액을 포함하되, 항체는 1 mg/ml 내지 150 mg/ml의 농도로 존재하고, 상기 조성물은 약 5.0 내지 약 8.0의 pH를 갖는다.
이러한 일 양태에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 조성물로 제조될 수 있으며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 50 mg/ml 이상이다. 일 양태에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 조성물로 제조될 수 있으며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 60 mg/ml 이상이다. 일 양태에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 조성물로 제조될 수 있으며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 70 mg/ml 이상이다. 일 양태에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 조성물로 제조될 수 있으며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 80 mg/ml 이상이다. 일 양태에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 조성물로 제조될 수 있으며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 90 mg/ml 이상이다. 일 양태에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 조성물로 제조될 수 있으며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 100 mg/ml 이상이다. 일 양태에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 조성물로 제조될 수 있으며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 110 mg/ml 이상이다. 일 양태에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 조성물로 제조될 수 있으며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 120 mg/ml 이상이다. 일 양태에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 조성물로 제조될 수 있으며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 130 mg/ml 이상이다. 일 양태에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 조성물로 제조될 수 있으며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 140 mg/ml 이상이다.
일 양태에서, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 조성물로 제조될 수 있으며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 150 mg/ml 이상이다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 조성물이 포함된 주사 장치에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 주사 장치에 사용되고/되거나 담기도록 의도된다. 일부 구현예에서, 주사 장치는 FlexTouch® 유형(공급업체 Novo Nordisk A/S, 덴마크)의 일회용, 사전 충전식, 다중 투여량 펜이다. 일부 구현예에서, 주사 장치는 1회 주입 장치이다.
일부 구현예에서, 주사 장치는 고정 투여량 장치, 예컨대, 소정의 다중 투여량의 약물을 전달하도록 구성된 장치로서, 때로는 고정 다중 투여량 장치 또는 고정 투여량 다중 주입 장치로서 지칭된다.
투여 및 투여량
본원에 개시된 바와 같은 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 정맥내, 예컨대 근육내, 예컨대 피하 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 피하 투여된다. 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예방적으로 투여될 수 있다. 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 치료적으로(요구 시) 투여될 수 있다.
전달될 화합물의 투여량은 1일당 약 0.01 mg 내지 500 mg의 화합물일 수 있다.
적절한 투여량은 해당 항체의 특성(해당 항체의 생체내 혈장 반감기 또는 평균 체류 시간, 및 해당 항체의 생물학적 활성 포함)에 기반하여 특정 화합물에 대해 조정될 수도 있다.
본원에 개시된 것과 같은 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는 조성물은 예방적 치료를 위해 투여될 수 있고/있거나 일부 구현예에서는 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료적 용도에서, 본원에 개시된 것들과 같은 약학적 조성물은 본원에 기술된 것 중 어느 하나와 같은 질환을 이미 앓고 대상체에게 상기 질환 또는 이의 합병증을 치유, 완화, 또는 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로 투여된다. 이를 달성하기에 적절한 양은 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"으로서 정의된다. 당업가 이해할 수 있듯이, 이러한 목적에 효과적인 양은 질환 또는 부상의 중증도뿐만 아니라 대상체의 체중 및 전반적인 상태에 따라 달라지게 된다.
구현예
일 구현예에서, 본원에 개시된 것과 같은 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (동일한 중쇄를 포함하는) 상응하는 2가 항체의 용액 점도보다 낮은 용액 점도를 제공한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 것과 같은 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (동일한 중쇄를 포함하는) 상응하는 2가 항체의 용액 안정성보다 높은 용액 안정성을 제공한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 것과 같은 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 넓은 pH 간격에 걸쳐 (동일한 중쇄를 포함하는) 상응하는 2가 항체의 점도 및 자기 결합 경향보다 더 낮은 점도 및 자기 결합 경향을 제공한다.
일 구현예에서, 1가 항체는 이들 지정된 tmAb1 또는 이의 항원 결합 단편, tmAb2 또는 이의 항원 결합 단편, tmAb3 또는 이의 항원 결합 단편, 및 tmAb4 또는 이의 항원 결합 단편이다.
본 발명은 하기 구현예들에 의해 추가적으로 기술된다:
1. 인간 ANGPTL3(hANGPTL3)(서열번호 1)에 결합할 수 있는 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD 및 pH7.4에서 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 갖고, 그 값은 40 이상, 예컨대 50, 60, 70, 80, 90, 95, 100, 105, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 165, 166, 170, 180, 190, 200 이상이며,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 혈장에서 hANGPTL3의 농도를 감소시킬 수 있는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
2. 구현예 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH6에서 항원에 대한 KD 및 pH7.4에 항원에 대한 KD의 비로서 정의된 KD(pH6)/KD(pH7.4) 값을 갖고, 그 값은 90~105, 예컨대 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 또는 105인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
3. 구현예 1 내지 2 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 세포 표면 수용체와 상호작용할 수 있는 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fc 영역, 예컨대 1개 또는 2개의 Fc 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 항체 이소형은 IgG이고, CH2 또는 CH3 도메인에서 적어도 하나의 음으로 하전된 아미노산 잔기 또는 중성 표면 노출된 아미노산 잔기는, 등전점 전기영동을 사용해 결정했을 때 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 등전점을 증가시키도록, 양으로 하전된 아미노산 잔기로 치환되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 항체 이소형은 IgG이고 중쇄(들)에서 (EU 잔기) 위치 311 및/또는 343의 아르기닌(R)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 항체 이소형은 IgG이고 중쇄(들)에서 (EU 잔기) 위치 311 및 343의 아르기닌(R)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 항체 이소형은 IgG이고, Fc 영역은 FcRIIb에 대한 결합을 향상시키도록 변형되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(들)에서 다음 중 하나 이상을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(EU 잔기) 위치 234의 티로신(Y),
위치 238의 아스파르테이트(D),
위치 250의 발린(V),
위치 264의 이소류신(I),
위치 307의 프롤린(P), 및/또는
위치 330의 리신(K).
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(들)에서 다음을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(EU 잔기) 위치 234의 티로신(Y),
위치 238의 아스파르테이트(D),
위치 250의 발린(V),
위치 264의 이소류신(I),
위치 307의 프롤린(P), 및
위치 330의 리신(K).
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 항체 이소형은 IgG이고, Fc 영역은 FcRn에 대한 결합을 향상시키도록 변형되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(들)에서 다음을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
위치 252의 티로신(Y),
위치 254의 트레오닌(T), 및
위치 256의 글루타메이트(E).
13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3-매개 지단백질 리파아제(LPL)의 억제를 감소시킬 수 있는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3-매개 지단백질 리파아제(LPL)의 억제를 억제시킬 수 있는 길항제인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 혈장에서 hANGPTL3의 농도를 감소시킬 수 있는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
16. 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3-매개 지단백질 리파아제(LPL)의 억제를 억제할 수 있고 인간 혈장에서 hANGPTL3의 농도를 감소시킬 수 있는 길항제인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서,
a) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄는:
- 아미노산 잔기 SYWMT(서열번호 2)의 CDR1 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 또는 1개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 SISSHSTYIYYADSVKG(서열번호 3)의 CDR2 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 , 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR2 서열, 및
- 아미노산 잔기 EGWYDNWFDP(서열번호 4)의 CDR3 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 , 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR2 서열을 포함하거나,
b) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄는:
- 아미노산 잔기 SYWMT(서열번호 24)의 CDR1 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 또는 1개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 SISSHSTYIYYADSVKG(서열번호 25)의 CDR2 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 , 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR2 서열, 및
- 아미노산 잔기 EGWYDNWNDP(서열번호 26)의 CDR3 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 , 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR3 서열을 포함하고;
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄는:
- 아미노산 잔기 RASQNIRSPYLA(서열번호 9)의 CDR1 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개, 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있는, CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 GVSSRAA(서열번호 10)의 CDR2 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개, 1개, 또는 2개가 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있는, CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 QQYDDHPYT(서열번호 11)의 CDR3 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개, 1개, 또는 2개가 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있는, CDR1 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
18. 구현예 17에 있어서, 상기 치환(들)은 보존적 치환(들)인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
19. 구현예 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄는:
- 아미노산 잔기 SYWMT(서열번호 2)의 CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 SISSHSTYIYYADSVKG(서열번호 3)의 CDR2 서열, 및
- 아미노산 잔기 EGWYDNWFDP(서열 번호 4)의 CDR3 서열을 포함하고;
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄는:
- 아미노산 잔기 RASQNIRSPYLA(서열번호 9)의 CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 GVSSRAA(서열번호 10)의 CDR2 서열, 및
- 아미노산 잔기 QQYDDHPYT(서열번호 11)의 CDR3 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 5와 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 12와 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서,
a) 중쇄 가변 도메인은 서열번호 5를 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 12를 포함하거나,
b) 중쇄 가변 도메인은 서열번호 17을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 12를 포함하거나,
c) 중쇄 가변 도메인은 서열번호 22를 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 12를 포함하거나,
d) 중쇄 가변 도메인은 서열번호 27을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 12를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
22. hANGPTL3(서열번호 1)에 결합할 수 있는 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
a) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄는:
- 아미노산 잔기 SYWMT(서열번호 2)의 CDR1 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 또는 1개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 SISSHSTYIYYADSVKG(서열번호 3)의 CDR2 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 , 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR2 서열, 및
- 아미노산 잔기 EGWYDNWFDP(서열번호 4)의 CDR3 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 , 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR2 서열을 포함하거나,
b) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄는:
- 서열번호 24의 아미노산 잔기 31 내지 35(SYWMT)의 CDR1 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 또는 1개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR1 서열, 및
- 서열번호 25의 아미노산 잔기 50 내지 66(SISSHSTYIYYADSVKG)의 CDR2 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0, 1, 2, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR2 서열, 및
- 서열번호 26의 아미노산 잔기 99 내지 110(EGWYDNWNDP)의 CDR3 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0, 1, 2, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR3 서열을 포함하고;
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄는:
- 아미노산 잔기 RASQNIRSPYLA(서열번호 9)의 CDR1 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개, 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있는, CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 GVSSRAA(서열번호 10)의 CDR2 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개, 1개, 또는 2개가 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있는, CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 QQYDDHPYT(서열번호 11)의 CDR3 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개, 1개, 또는 2개가 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있는, CDR1 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
23. 구현예 22에 있어서, 상기 치환(들)은 보존적 치환(들)인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
24. 구현예 17 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 세포 표면 Fc 수용체와 상호작용할 수 있는 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
25. 구현예 17 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fc 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
26. 구현예 17 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3-매개 지단백질 리파아제(LPL)의 억제를 감소시킬 수 있는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
27. 구현예 17 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3-매개 지단백질 리파아제(LPL)의 억제를 억제시킬 수 있는 길항제인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
28. 구현예 17 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 혈장에서 hANGPTL3의 농도를 감소시킬 수 있는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
29. 구현예 17 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3-매개 지단백질 리파아제(LPL)의 억제를 억제할 수 있고 인간 혈장에서 hANGPTL3의 농도를 감소시킬 수 있는 길항제인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
30. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄는:
- 아미노산 잔기 SYWMT(서열번호 2)의 CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 SISSHSTYIYYADSVKG(서열번호 3)의 CDR2 서열, 및
- 아미노산 잔기 EGWYDNWFDP(서열 번호 4)의 CDR3 서열을 포함하고;
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄는:
- 아미노산 잔기 RASQNIRSPYLA(서열번호 9)의 CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 GVSSRAA(서열번호 10)의 CDR2 서열, 및
- 아미노산 잔기 QQYDDHPYT(서열번호 11)의 CDR3 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
31. 구현예 22 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 5, 17, 22, 27, 또는 32와 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 12와 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
32. 구현예 22 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 5를 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 12를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
33. 구현예 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 이소형은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
34. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 이소형은 IgG1을 기반으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
35. 구현예 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 이소형은 IgG1을 기반으로 하고, 중쇄(들)에서 (EU 잔기) 위치 446 및/또는 447의 글리신 및/또는 리신이 각각 결실되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
36. 구현예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 절단된 중쇄의 이소형은 IgG1을 기반으로 하고, 중쇄(들)에서 (EU 잔기) 위치 446 및/또는 447의 글리신 및 리신이 각각 결실되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
37. 구현예 17 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 항체 이소형은 IgG이고, CH2 또는 CH3 도메인에서 적어도 하나의 음으로 하전된 아미노산 잔기 또는 중성 표면 노출된 아미노산 잔기는, 등전점 전기영동을 사용해 결정했을 때 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 등전점을 증가시키도록, 양으로 하전된 아미노산 잔기로 치환되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
38. 구현예 17 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(들)에서 (EU 잔기) 위치 311 및/또는 343의 아르기닌(R)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
39. 구현예 17 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(들)에서 (EU 잔기) 위치 311 및 343의 아르기닌(R)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
40. 구현예 17 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 항체 이소형은 IgG이고, Fc 영역은 FcRIIb에 대한 결합을 향상시키도록 변형되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
41. 구현예 17 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(들)에서 다음 중 하나 이상을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(EU 잔기) 위치 234의 티로신(Y),
위치 238의 아스파르테이트(D),
위치 250의 발린(V),
위치 264의 이소류신(I),
위치 307의 프롤린(P), 및
위치 330의 리신(K).
42. 구현예 17 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(들)에서 다음을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(EU 잔기) 위치 234의 티로신(Y),
위치 238의 아스파르테이트(D),
위치 250의 발린(V),
위치 264의 이소류신(I),
위치 307의 프롤린(P), 및
위치 330의 리신(K).
43. 구현예 17 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 항체 이소형은 IgG이고, Fc 영역은 FcRn에 대한 결합을 향상시키도록 변형되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
44. 구현예 17 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(들)에서 다음을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
위치 252의 티로신(Y),
위치 254의 트레오닌(T), 및
위치 256의 글루타메이트(E).
45. 구현예 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 다량체화 도메인을 각각 포함하는 제1 및 제2 중쇄를 포함하되, 상기 중쇄의 서열은 상이하고, 상기 중쇄는 상기 다량체화 도메인의 상호작용에 의해 다량체화되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
46. 구현예 1 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 제1 및 제2 중쇄를 포함하고, 상기 제1 중쇄는
(EU 잔기) 위치 366의 트립토판(W)을 포함하고,
상기 제2 중쇄는
위치 366의 세린(S),
위치 368의 알라닌(A), 및
위치 407의 발린(V)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
47. 구현예 1 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 제1 및 제2 중쇄를 포함하고, 상기 제1 및 제2 중쇄는 (EU 잔기) 위치 214의 리신(K)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
48. 구현예 1 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 제1 및 제2 중쇄를 포함하고, 상기 제1 및 제2 중쇄는
(EU 잔기) 위치 214의 리신(K),
위치 311 및 343의 아르기닌(R),
위치 234의 티로신(Y),
위치 238의 아스파르테이트(D),
위치 250의 발린(V),
위치 264의 이소류신(I),
위치 307의 프롤린(P),
위치 330의 리신(K),
위치 252의 티로신(Y),
위치 254의 트레오닌(T),
위치 256의 글루타메이트(E)를 포함하고,
상기 제1 중쇄는
(EU 잔기) 위치 366의 트립토판을 추가로 포함하고,
상기 제2 중쇄는
위치 366의 세린,
위치 368의 알라닌,
위치 407의 발린을 추가로 포함하고,
임의로, 상기 제1 및/또는 제2 중쇄의 위치 446 및/또는 447의 글리신 및 라이신이 각각 결실되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
49. 구현예 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 서열번호 6에 따른 제1 중쇄 및 서열번호 7 또는 8에 따른 제2 중쇄 및 서열번호 13에 따른 단일 경쇄를 포함하는, 항체.
50. 인간 ANGPTL3(hANGPTL3)(서열번호 1)에 결합할 수 있는 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 제1 중쇄, 제2 중쇄, 및 경쇄를 포함하되, 제1 중쇄는 서열번호 6을 포함하고, 제2 중쇄는 서열번호 7을 포함하고, 경쇄는 서열번호 13을 포함하는, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
51. 구현예 1 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH-독립적으로 hANGPTL3에 결합할 수 있는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
52. 구현예 1 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 hANGPTL3 사이에 형성된 면역 복합체의 크기를 감소시킬 수 있는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
53. 구현예 1 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 hANGPTL3 사이에 형성된 면역 복합체의 동질성을 증가시킬 수 있는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
54. 구현예 1 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3 혈장 농도를 감소시킬 수 있는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
55. 구현예 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3 혈장 농도를 증가시키지 않고 혈장 내 중성지방 농도를 감소시킬 수 있는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
56. 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화 또는 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
57. 구현예 1 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 아암 항체인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
58. 구현예 1 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종간 반응성을 갖는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
59. 구현예 58에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 마우스 ANGPTL3, 랫트 ANGPTL3, 돼지 ANGPTL3, 개과 ANGPTL3, 및/또는 시노몰구스 원숭이 ANGPTL3에 결합할 수 있는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
60. 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체(들)를 포함하는 약학적 조성물.
61. 의약에 사용하기 위한 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 60에 따른 조성물.
62. 인간 혈장에서 중성지방 농도 상승을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한, 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 60에 따른 조성물.
63. 인간 혈장에서 중성지방 농도의 상승을 억제하는 데 사용하기 위한, 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 60에 따른 조성물.
64. 인간 혈장에서 중성지방 농도가 상승된 환자를 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 60에 따른 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
65. 인간 혈장에서 중성지방 농도가 고도로 상승된 환자를 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 60에 따른 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
66. 인간 혈장에서 중성지방을 감소시키는 방법으로서, 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 60에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
67. 혈장에서 중성지방 농도의 상승을 억제하는 방법으로서, 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 60에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
68. 중성지방이 상승된 환자를 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한, 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 60에 따른 조성물의 용도.
69. 중성지방이 고도로 상승된 환자를 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한, 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 60에 따른 조성물의 용도.
70. 구현예 61 내지 69 중 어느 하나에 따른 용도 또는 방법 또는 구현예 60에 따른 조성물로서, 환자는 죽상경화성 심혈관 질환(ASCVD) 및/또는 2형 당뇨병으로 진단된, 용도 또는 방법 또는 조성물.
71. 심혈관 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 60에 따른 조성물.
72. 죽상경화성 심혈관 질환(ASCVD)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 60에 따른 조성물.
73. 환자에게서 심혈관 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 60에 따른 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
74. 환자에게서 죽상경화성 심혈관 질환(ASCVD)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 60에 따른 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
75. 심혈관 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약을 제조하기 위한 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 60에 따른 조성물의 용도.
76. 죽상경화성 심혈관 질환(ASCVD)의 치료 또는 예방을 위한 의약을 제조하기 위한 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 60에 따른 조성물의 용도.
77. 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 60에 따를 조성물 및 사용 지침을 포함하는 키트.
78. 구현예 45 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 제1 중쇄는 절단된 중쇄인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
79. 구현예 45 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 제2 중쇄는 절단된 중쇄인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시예
약어 목록
BSA: 소 혈청 알부민
ELISA 효소 결합 면역흡착 검정
hIgG 인간 면역글로불린 G
HPC4: 단백질 C의 12개의 아미노산 서열
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피
LPL: 지단백질 리파아제
LC (실시예 2): 경쇄
LC (실시예 3): 액상 크로마토그래피
LLOQ: 정량화 하한
LOCI: 발광 산소 채널링 면역검정
MRT: 평균 유지 시간
MS: 질량 분광분석
OD600: 600 nm에서의 광학 밀도
QC: 품질 관리
hANGPTL3: 인간 ANGPTL3
rhANGPTL3: 재조합 인간 ANGPTL3
P20: 폴리소르베이트 20
PBS: 인산염 완충 식염수
PEG: 폴리 에틸렌 글리콜
RT: 유지 시간
SE-HPLC: 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피
SE-UPLC: 크기 배제 초고성능 액체 크로마토그래피
SIA: 서열 동일 유사체
SPR: 표면 플라스몬 공명
ULOQ: 정량화 상한
UV-VIS: 자외선-가시광 분광분석
실시예 1: pH 의존적 항체 변이체의 생성
초기 인간-항체 라이브러리
고도로 안정한 프레임워크 및 1010개가 넘는 다양한 CDR로 인간 Fab 라이브러리를 작제하였다:
파지 패닝 초기 스크린:
비오티닐화된 hANGPTL3을 M280-스트렙트아비딘 다이나비드(Thermo Fisher Scientific #11205D) 상에 코팅하였다. 비특이적 결합제를 위해, 코팅되지 않은 스트렙트아비딘 다이나비드로 파지 디스플레이 라이브러리(>1013 pfu/mL)를 고갈시킨 다음, pH 7.4에서의 결합을 위해 hANGPTL3로 코팅된 비드를 첨가하였다. PBS, 0.05% Tween20으로 10회 세척하고 PBS로 3회 세척한 후, 비드를 ANGPLT3 결합된 파지와 함께 1 mL PBS에 현탁시키고, 2×YT 배지(2% 포도당, 25 ug/ml 클로람페니콜, 10 ug/ml 테트라시클린)에서 9 mL의 활발하게 성장하는 대장균 XL-Blue 배양물(OD600 = 0.6)과 혼합하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 모든 세포를 원심분리하고 24 cm x 24 cm 플레이트에서 2×YT 배지와 함께 37℃에서 밤새 재현탁하였다. 대장균 세포를 M13K07 헬퍼 파지로 감염시켜 증폭시키고 파지를 생산하였다. 24시간 후, 대장균 세포를 제거하고, PEG/NaCl 용액으로 침전시켜 파지를 수확한 다음, 다음 회차의 패닝을 위해 PBS-완충액에서 재현탁하였다.
항체 식별:
4회의 패닝 후, 생거 시퀀싱과 ELISA를 위해 단일 콜로니를 선별하였다. 전체 항체 포맷으로 유전자를 합성하기 위해 상위 히트를 선택하였다. 발현 및 정제 후(실시예 2 참조), pH 7.4 및 pH 6에서의 ANGPTL3 결합에 대해 전체 항체를 SPR 분석에 의해 시험하였다(실시예 7 참조). 항체 mAb0은 hANGPTL3에 대해 가장 이상적인 결합을 갖는 것으로 확인되었다.
pH 의존적 결합의 통합을 위한 라이브러리의 작제
ANGPTL3에 결합하는 mAb0의 가변 도메인에 pH-스위치를 통합시키기 위해, 상동성 모델에 대해 연산 분석을 수행하였다. 간략하게, 계면에서 양으로 하전된 잔기로부터 7.5 옹스트롬 거리 내에 있는 모든 mAb0 잔기를 식별하였다. 식별된 위치를 히스티딘, 하전된 또 다른 잔기(양성 또는 음성), 또는 프롤린과 같은 안정화 치환으로 차례로 변경하였다. 상동성 모델로부터 아미노산 치환의 입체화학 및 분자 내 상호작용을 연산에 의해 평가하였다. 다음으로, 대략 107의 다양성을 갖는 16개의 돌연변이 부위를 갖는 변성 코돈을 사용해 라이브러리를 작제하였다.
mAb0의 pH 의존적 변이체를 식별하기 위한 파지 패닝
비오티닐화된 hANGPTL3을 M280-스트렙트아비딘 다이나비드 상에 코팅하였다. 생산된 파지 라이브러리(1012 pfu/mL)를 코팅되지 않은 스트렙트아타비딘 다이나비드로 고갈시켰다. 고갈된 파지 라이브러리를 pH 7.4에서의 결합을 위해 hANGPTL3(17~460)으로 코팅된 비드에 첨가하였다. PBT로 3회 및 PB로 3회 세척한 후, 결합된 파지를 pH 5.5의 용리 완충액으로 2회 용리한 다음, 15분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 용리된 파지 입자를 증폭시키고 스크리닝을 1회 추가로 수행하였다.
용리액을 1.5 mL 마이크로퓨지 튜브로 옮기고 1 M Tris-HCl(pH 8.0)로 중화시켰다. 중화시킨 파지 용액의 절반을 10 μg/mL 테트라시클린을 함유하는 2×YT 배지에서 1 mL의 활발하게 성장하는 대장균 NEB 5-알파 F′(OD600 = 0.8)과 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1 × 1010 pfu의 M13K07 헬퍼 파지를 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 감염된 대장균을 50 μg/mL 카르베니실린 및 25 μg/mL 카나마이신을 함유하는 50 mL 2×YT 배지에서 200 rpm으로 진탕하고 37℃에서 밤새 성장시켜 증폭시켰다. 다음 날, 다음 회차의 패닝을 위해, PEG/NaCl 용액으로 침전시키고 PBS 완충액에 재현탁하여 파지를 수확하였다.
hANGPTL3의 pH 의존적 결합을 나타내는 항체의 식별
차세대 시퀀싱을 위해 3회의 패닝 후 파지 풀을 수집하였다. 가장 풍부한 Ab 서열을 유전자 합성을 위해 선택한 다음 발현시키고 및 정제하였다(실시예 2 참조). 제조된 항체를 실시예 7에서와 같이 본질적으로 SPR에 의해 분석하였다. SPR 센서 칩 상에 고정된 항-His 항체에 의해 전장 His6-태그된 hANGPTL3을 포획하고, 항-hANGPTL3 항체를 pH 6.0 및 pH 7.4에서 각각 흘렸다. pH 7.4보다 pH 6.0에서의 친화도가 상대적으로 약한 항체를 선택하였다. 이러한 접근법을 사용하여 tmAb0.1 및 tmAb1의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 함유하는 항체를 식별하였다. 이들 항체는 hANGPTL3에 대한 억제 활성을 보유하였다.
실시예 2: 항체 또는 이의 단편의 재조합 발현
제조사의 지침을 엄격히 따라서, HEK293 현탁 세포(293Expi, Invitrogen)의 일시적 형질감염을 사용해 항체 또는 이의 단편을 발현시켰다. 293Expi 세포는 1% P/S(GIBCO 카탈로그 번호 15140-122)로 보충된 Expi293F 발현 배지(Invitrogen, 카탈로그 번호 A1435104)에서 3 내지 4일마다 전형적으로 계대배양하였다. Expifectamine을 사용하여 Expi293F 세포를 2.5 내지 3백만/mL의 세포 밀도로 형질감염시켰다. 1리터의 Expi293F 세포마다, 총 1 mg의 플라스미드 DNA(1:1 비율의 VH-CH1 (Fab의 경우) 또는 HC (mAb의 경우) 및 LC 플라스미드)를 50 mL Optimem(GIBCO, 카탈로그 번호 51985-026, 희석물 A)에 희석시키고 2.7 mL Expifectamine을 50 mL Optimem(희석물 B)에 희석하여 형질감염을 수행하였다. 공동-형질감염물을 생산하는 Fab 및 mAb의 경우, VH-CH1 및 LC 플라스미드(Fab)와 HC 및 LC 플라스미드(mAb)를 각각 1:1 비율로 사용하였다. 희석물 A 및 B를 혼합하고 실온에서 10~20분 동안 배양하였다. 여기서부터, 형질감염 혼합물을 Expi293F 세포에 첨가하고, 세포를 37℃의 습윤된 인큐베이터 내에서 궤도 회전(85~125 rpm)시키면서 배양하였다. 형질감염 후 1일차에, 형질감염 세포를 5 ml의 ExpiFectamine 293 Transfection Enhancer 1 및 50 ml의 ExpiFectamine 293 Transfection Enhancer 2로 보충하였다. 세포 배양 상청액은 통상적으로 형질감염 후 4~5일차에 원심분리 후 여과에 의해 수확하였다.
1가 항체의 발현은 본질적으로 전술한 것과 같이 수행하되, 3개의 상이한 플라스미드의 공동-형질감염물을 사용하여 수행하였다. 단일 아암 항체는 하나의 중쇄(HC), 하나의 절단된 중쇄(tHC), 및 하나의 LC로 구성되므로, 형질감염은 1:1:1 비율의 HC, tHC, 및 LC 플라스미드의 DNA 혼합물을 사용하여 설정하였다.
tmAb1, tmAb2, tmAb3, 및 tmAb4로 지정된 1가 항체는 인간 IgG1 카파 이소형을 기반으로 한 HC, tHC, 및 LC를 포함한다. tmAb1-4 HC 및 tHC의 불변 영역을, 야생형 IgG1과 비교하여 다음 치환을 포함하도록 조작하였다: L234Y, P238D, T250V, M252Y, S254T, T256E, V264I, T307P, Q311R, A330K, 및 P343R (EU 잔기). 효율적인 tmAb1-4 생산을 위해 정확한 HC 및 tHC 이종이량체화를 보장하기 위해, 노브-인-홀 기술(미국 특허 출원 20030078385)을 이용하였다. 즉, T366W 돌연변이(노브)를 HC에 삽입하고, T366S, L368A, Y407V 돌연변이(홀)를 tHC에 삽입하거나, 그 반대로 하였다.
실시예 3: 항체 또는 이의 단편의 정제 및 특성 분석
모든 정제 단계는 4℃에서 수행하였다. 실험실 규모 정제를 위해, Milli-Q 수를 사용해 완충액을 제조하였다. SE-HPLC 분석에 사용된 HPLC 시스템은 Aglient 1100이었다. QC를 위해 응집 및 LC/MS를 평가하였다.
Fab의 포획은, 1× PBS(10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl), pH 7.4 중의 결합 완충액을 이용해 HiTrap KappaSelect (Cytiva) 친화도 크로마토그래피로 수행하였다. 0.1 M 글리신, pH 2.8로 1단계 용리를 수행하였다. 용리된 Fab를 추가로 정제하고, 320 mL Superdex 200 26/60 컬럼(Cytiva)을 이용한 크기-배제 크로마토그래피에 의해 pH 7.4의 제형화 완충액(20 mM HEPES, 150mM NaCl)으로 완충액-교환하고, 원심분리 울트라필터(30 KD C.O.)에 의해 농축시켜 -80℃에서 보관하였다.
정제된 Fab의 품질을 평가하기 위해, SDS-PAGE 및 고성능 크기 배제 크로마토그래피(SE-HPLC) 분석을 수행하였다. Fab 단백질의 동일성을 식별하기 위해 LC/MS를 수행하였다. 모든 Fab의 분자량(MW)은 중쇄 및 경쇄의 이론적인 MW와 각각 일치하는 것으로 나타났다.
항체 정제 및 특성 분석
항체의 정제는 단백질 A MabSelect PrismA 수지(Cytiva)를 사용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 소규모의 항체 생산을 위해, 단백질 A 기반 정제를 96-웰 플레이트에서 수행하였고, 더 큰 규모의 생산을 위해, AktaXpress 크로마토그래피 시스템(Cytiva)을 pH 7.2의 20 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl로 이루어진 평형화 완충액, 및 pH 3.5의 10 mM 포름산으로 이루어진 용리 완충액과 함께 사용하였다. 세포 상청액을 사전 평형화된 MabSelect SuRe 칼럼에 임의의 조절 없이 직접 적용하였다. 칼럼을 대략 5 칼럼 부피의 평형 완충액으로 세척하고, 항체를 약 2~5 칼럼 부피의 용리 완충액 중에서 등용매 방식으로(isocratically) 용리하였다. 응집체의 제거를 위해 320 mL Superdex 200 26/60 컬럼(Cytiva) 상에 용리된 항체를 직접 도포하고, 20 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 7.4로의 완충액 교환하였다.
정제된 항체는 SDS-PAGE/쿠마시, 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC), 및 액체-크로마토그래피 질량 분광분석(LC-MS)과 같은 상이한 방법을 사용해 그 특성을 분석하였다. SDS-PAGE/쿠마시 분석은 NuPage 4~12% 비스-트리스 겔(Invitrogen, 카탈로그 번호 NP0321BOX)을 사용하여 수행하였다. 여기서, 모든 항체는 예상대로의 경쇄 및 중쇄 성분을 나타냈다. 온전한 분자 질량의 결정은, 탈염 칼럼(desalting column) MassPREP(Waters, 카탈로그 번호 USRM10008656)이 구비된 Agilent 6210 장비를 이용해 액체 크로마토그래피 전기 분무 이온화 비행시간 질량 분광분석법 장비를 사용해 수행하였다. 사용된 완충액 시스템은 LC-MS 등급 H2O 중의 0.1% 포름산으로 이루어진 평형 완충액 및 LC-MS 등급 아세토니트릴(ACN) 중의 0.1% 포름산으로 이루어진 용리 완충액이었다. 분석은 N-글리코시다아제 F(Roche Diagnostics, 카탈로그 번호 11365177001) 및 환원제(메르캅토에탄올 또는 DTT)를 사용하여 수행하였다. 모든 항체는 예상대로 서열 및 하나의 중쇄 N-글리칸에 따른 온전한 분자 질량을 나타냈다. 순도는 SE-HPLC에 기초하여 결정하였다. 최종 단백질 순도는, Agilent LC 1100/1200 시스템 상의 SE-HPLC 방법 장비에 기초하여, BIOSep-SEC-S3000 300´7.8mm 칼럼(Phenomenex, 카탈로그 번호 00H-2146-K0), 및 200 mM 인산나트륨(pH 6.9), 300 mM 염화칼슘 및 10% 이소프로판올로 구성된 런닝 완충액을 사용해 분석하였다. 검출을 위해 UV280 및 형광(Ex 280 nm/Em 354 nm) 검출기를 사용하였다. 항체는 항체의 크기를 반영하는 보유 시간에 단일 대칭 피크로서 용리되었다. 순도 추정치는 상이한 항체에 대해 모두 95~99% 사이에 있었다. 최종 단백질 농도를 측정하기 위해, NanoDrop 분광 광도계(Thermo Scientific)를 각각의 항체에 대한 특이적 소광 계수와 함께 사용하였다.
실시예 4: rhANGPTL3-매개 LPL 억제의 억제를 결정하기 위한 검정
hANGPTL3-매개 LPL 억제의 억제는 재조합 hANGPTL3-LPL 검정에서 측정하였다. 이 검정에서는, EnzChek™ 리파아제를 기질로 사용하여 지단백질 리파아제(LPL)의 시험관내 효소 활성을 측정한다. 소 LPL의 활성은 재조합 hANGPTL3(rHANGPTL3)을 첨가하여 억제한다. 그런 다음, 이러한 억제를 본원에 개시된 항-hANGPTL3 항체와 같은 rhANGPTL3 억제 화합물에 의해 차단할 수 있다. 항-hANGPTL3 항체의 겉보기 친화도는 에비나쿠맙 SIA에 대해 상대적으로 측정하였다.
rhANGPTL3-LPL 효소 활성 절차
초순수로 제조한 EnzChek™/Zwittergent 시약을 제외하고, 모든 용액은 검정 완충액(DPBS(1x) (Gibco 14190-144) + 1% 지방산 무함유 BSA(MP Biomedicals 05033))로 제조하였다.
항-rhANGPTL3 항체의 연속 희석물을 다음과 같이 제조하였다. 시작 농도는 3 μM이었고, 검정 완충액에서 3배 희석물을 제조하였다. 이를 7회 반복하여 연속 희석물을 제조하였다. 분석을 위한 화합물의 혼합은 아래에 기술되어 있다.
검정 완충액 및 10 μL의 각 희석물을 검정 플레이트(96-웰, 절반이 검정색인 플레이트, Corning 3993)에서 10 μL 1.2 μM rhANGPTL3(서열번호 1) 및 10 μL 60 nM 헤파린(Sigma H3149)과 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 사전 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 10 μL 1.8 μM 인간 ApoCII(화학적으로 합성한 잔기 59~79) 및 10 μL 60 nM 소 LPL(Sigma L2254)을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 15분동안 계속 인큐베이션하였다. 마지막으로, 10 μL EnzChek™/Zwitrgent 기질(4.8 μM EnzChek™ 리파아제(Thermo Fisher Scientific E33955), 0.03% Zwittergent 3-18(Merck 41570)을 각 웰에 첨가하고, Envision 다중모드 플레이트 판독기(Perlkin Plate)에서 485 nm의 여기 파장과 535 nm의 방출 파장을 사용해 형광을 동적으로(20분 간 1분마다) 측정하였다.
희석된 화합물 이외에, 플레이트에는 화합물이 10 μL 검정 완충액으로 대체된 6개의 웰 및 화합물과 rhANGPTL3 모두가 10 μL 분석 완충액으로 각각 대체된 6개의 웰이 포함되어 있었다. 이들 웰을 사용하여 완전히 억제된 LPL 활성 수준과 전혀 억제되지 않은 LPL 활성 수준을 각각 확립하였다. 또한, 플레이트에는, rhANGPTL3가 존재하지 않을 때, 항-ANGPTL3 항체가 LPL 활성에 직접적으로 미치는 효과를 평가하기 위한 화합물 당 하나의 웰이 포함되어 있는데, 이 웰은 가장 높은 화합물 농도의 바로 아래 농도를 사용하지만 rhANGPTL3이 포함되지 않는다.
각각의 플레이트에는 에비나쿠맙 SIA의 2회 연속 희석물이 포함되어 있었다.
통계적 분석
검정 플레이트의 각 웰에서의 LPL 활성은, 동역학 데이터로부터 5개의 연속 시점의 윈도우에 걸쳐 한 세트의 선형 회귀를 수행하고, 기울기가 가장 가파르고(Vmax) 0.95 초과의 결정과 상관된 피팅을 선택하고, 선택된 선의 기울기를 계산함으로써 계산하였다. 그런 다음, 완전히 억제된 6개의 LPL 활성 대조군 웰의 Vmax 평균을 값 0으로 사용하고, 6개의 억제되지 않은 LPL 활성 대조군 웰의 Vmax 평균을 값 1로서 사용하여 Vmax 값을 정규화하였다. 시험된 화합물에 대한 rhANGPTL3에 대한 겉보기 친화도는, 화합물의 연속 희석물의 정규화된 Vmax 농도 데이터의 비선형 4-파라미터 로지스틱(4PL) 곡선 피팅으로부터 계산하였다. 피팅은 drc R 패키지의 LL.4 함수를 사용하여 수행하였다. 값 0(즉, 완전히 억제된 6개의 LPL 활성 수준 대조군 웰의 Vmax의 정규화된 평균)을 피팅에서 더 낮은 공통 점근선으로서 사용하였다. 화합물의 겉보기 친화도를 IC50으로 명명된 “e” 파라미터로서 4PL 피팅으로부터 추출하고, 상대 겉보기 친화도는 온-플레이트 에비나쿠맙 SIA IC50의 평균을 분모로서 사용해 계산하였다. 또한, 각각의 화합물에 대해, rhANGPTL3이 없을 때 LPL 활성에 화합물이 직접적으로 미치는 효과를 평가하는 대조군 웰의 정규화된 Vmax는 1(즉, 억제되지 않은 LPL 활성 대조군 웰의 정규화된 Vmax의 평균)과 유의하게 상이하지 않은 것으로 결정되었다.
결과
표 1은 5개의 화합물의 rhANGPTL3-매개 LPL 억제의 평균 상대 IC50 및 표준 편차를 보여준다. 완전성을 위해, 평균의 근거를 형성하는 복제물의 수가 포함된다. 에비나쿠맙 SIA의 경우, 평균 상대 IC50은 1.0/정의이지만, 58개의 복제물에 대한 표준 편차는 개별 결과로부터 계산된다. tmAb4는 한 번만 분석되었으므로, 표준 편차를 계산할 수 없었다. 에비나쿠맙 SIA에 비하면, 1가 항체는 rhANGPTL3의 억제에 대해 유사하거나 약간 감소된 활성을 나타내며, 에비나쿠맙 SIA에 대해 측정된 상대 IC50 값과 비교했을 때 1을 초과하는 비를 나타냈다.
실시예 5: 정상적인 마우스를 대상으로 한 항-ANGPTL3 항체의 생체내 평가
프랑스 Janvier Labs의 건강한 수컷 C57bl6/6J 마우스를 대상으로 tmAb0.1, tmAb0.2, tmAb0.3, 및 tmAb0으로 지정된 1가 항-ANGPTL3 항체를 사용해 혈장 중성지방 수준 및 내인성 ANGPLT3(T=0h에서 250~300 μg/ml) 수준에 ANGPTL3이 미치는 억제 효과를 측정하는 연구를 아래에 기술된 것과 같이 수행하였다.
시험된 1가 항체는 Fc 영역의 234, 238, 250, 252, 254, 256, 264, 307, 311, 330, 343 위치가 변형되지 않는다음 점에서, 즉 상기 위치에서 야생형 인간 IgG1 잔기를 포함한다는 점에서 tmAb1~4와 상이하다.
마우스 내 Fc 치환의 기능성 결여로 인해, 상기 위치에는 야생형 인간 IgG1 잔기(특히 234L, 238P, 250T, 252M, 254S, 256T, 264V, 307T, 311Q, 330A, 343P)를 사용하였다. Fc 치환이 tmAb1~4에 도입되었을 때, 그 효과는 인간 수용체에 특이적이다(실시예 2 참조).
혈액 채취
각 군의 12마리의 마우스로부터 0시간, 48시간, 168시간, 240시간, 및 336시간차에 혈액 샘플을 채취하였다. 혈액 샘플(120 μL)을 설하 정맥(혀 혈액)을 천공하여 채취하여, EDTA로 코팅된 튜브(Microvette® VetMed 200 K3E, Sarstedt nr 09.1293.100)에 옮겼다. 20분 이내에, 혈액을 6000 G, 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 중성지방 측정을 위한 25 μl의 혈장 샘플 및 mANGPTL3 및 hIgG 측정(항체 혈장 노출 측정)을 위한 25 μl의 혈장 샘플을 마이크로닉 튜브에 옮겼다.
중성지방은 COBAS 6000 다중분석기를 제조사의 권장사항(Roche Diagnostics)에 따라 이용해 측정하였다.
R&D Systems의 ELISA(마우스 안지오포이에틴-유사 3 ELISA 키트 - Quantikine ELISA, 카달로그 번호 MANL30)를 키트 프로토콜에 따라 사용하여 마우스 혈장 샘플을 마우스 ANGPTL3에 대해 분석하였다. 매트릭스 효과를 피하기 위해, 샘플을 키트의 칼리브레이터 희석액에서 최소 250X로 희석하였다. 검정 범위는 62.5 ~ 4000 pg/ml이다. ULOQ를 초과하는 것으로 측정된 샘플을 캘리브레이터 희석액에서 추가로 희석하였다. LLOQ는 15.625 pg/ml(250 x 62.5 pg/ml)이었다.
마우스 혈장에서 마우스 ANGPTL3의 분석
R&D Systems의 ELISA(마우스 안지오포이에틴-유사 3 ELISA 키트 - Quantikine ELISA, 카달로그 번호 MANL30)를 키트 프로토콜에 따라 사용하여 마우스 혈장 샘플을 마우스 ANGPTL3에 대해 분석한다. 매트릭스 효과를 피하기 위해, 샘플을 키트의 칼리브레이터 희석액에서 최소 250X로 희석한다. 검정 범위는 62.5 ~ 4000 pg/ml이다. ULOQ를 초과하는 것으로 측정된 샘플은 캘리브레이터 희석액에서 추가로 희석한다. LLOQ는 15.625 pg/ml(250 x 62.5 pg/ml)이다.
항-ANGPTL3 항체 농도 결정을 위한 LOCI 검정의 원리
발광 산소 채널링 면역 검정(LOCI)을 사용하여, 혈장 샘플을 항-ANGPTL3 항체(hIgG)에 대해 분석한다. 공여자 비드는 스트렙트아비딘으로 코팅하고, 수용자 비드는 항-ANGPTL3 항체의 Fc 영역에 특이적인 제1 단클론 마우스 항-인간 IgG Fc 항체(Southern Biotech, 카달로그 번호 9040-01)와 접합시킨다. 사용된 다른 항체는 염소 유래의 다클론 항체이며 인간 IgG Fc 영역에 특이적이다(Jackson ImmunoResearch, 코드:109-005-098). 이러한 다클론 항체는 자체적으로 비오틴화한다. 3개의 반응물(스트렙트아비딘으로 코팅한 공여자 비드, 표적-특이적 Ab와 접합된 수용자 비드, 및 또 다른 비오틴화된 표적-특이적 Ab)을 항-ANGPTL3 항체(hIgG)와 합치고, 2개의 부위를 갖는 면역 복합체를 형성한다. 복합체의 발광은 공여자 비드로부터 일중항 산소 원자를 방출한다. 이들은 수용자 비드 내로 채널링되어 화학발광을 유발하는데, 이는 EnVision 플레이트 판독기에 의해 측정된다. 광의 양은 항-ANGPTL3 항체(tmAb0.1)의 농도에 비례한다.
마우스 혈장에서 hIgG의 분석
1 μL의 혈장 샘플/교정자/대조군을 384-웰 LOCI 플레이트의 웰에 도포한 다음, mAb 항-hIgG 및 비오틴화된 pAb 항-hIgG로 코팅된 15 μL의 수용자 비드(0.5 μg/웰) 혼합물을 도포한다. 플레이트를 실온(RT)에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음, 30 μL 스트렙트아비딘-코팅된 공여자-비드(2 μg/웰)를 각 웰에 첨가하고, RT에서 30분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 680 nm 레이저로 여기한 후, 21~22℃에서 520~645 nm 대역폭의 필터가 구비된 Envision 플레이트 판독기에서 플레이트를 판독된다. 웰당 총 측정 시간은 70 ms 여기 시간을 포함하여 210 ms이다. 교정자 물질은 마우스 혈장(미처리 K2EDTA 혈장, Bioreclamation에서 여과한 0.22 μm)에서 희석한 항-ANGPTL3 항체이다. 교정자가 항체마다 다르기 때문에, 정량화의 하한은 실행할 때 마다 추정한다(일반적으로 100~500 pM).
검정 범위는 41~30.000 pM이다. 마우스 샘플을 희석하지 않은 상태로 시험하고, 마우스 혈장에서 20X로 희석한다. ULOQ를 초과하는 것으로 측정된 샘플은 마우스 혈장에서 추가로 희석한다.
연구 군의 생체내 연구 1:
군. 1: 11마리의 마우스에게 비히클을 (i.v.) 투여하였다.
군 2: 11마리의 마우스에게 에비나쿠맙 SIA 40 nmol/kg을 (i.v.) 투여하였다.
군 3: 11마리의 마우스에게 tmAb0.1 40 nmol/kg을 (i.v.) 투여하였다.
군 4: 11마리의 마우스에게 tmAb0.2 40 nmol/kg을 (i.v.) 투여하였다.
군 5: 11마리의 마우스에게 tmAb0.3 40 nmol/kg을 (i.v.) 투여하였다.
군 6: 11마리의 마우스에게 tmAb0.4 40 nmol/kg을 (i.v.) 투여하였다.
비히클은 20 mM HEPES; 150 mM 염화나트륨, pH=7.4였고; 주사 부피는 5 ml/kg이었고, 투여 용액의 농도는 8 nmol/ml이었다.
결과
TG 수준
에비나쿠맙 SIA 및 tmAb0.1과 함께 투여한 모든 항체는 투여한지 48시간 후 중성지방(TG) 수준을 50~60%만큼 낮추었고, TG를 낮추는데 최고의 능력을 나타냈다. 에비나쿠맙 SIA, tmAb0.1, 및 tmAb0.3은 168시간 후 여전히 TG를 58~67%만큼 낮출 수 있었지만, tmAb0.2 및 tmAb0.4의 효능은 덜 두드러졌다(31~38%). 336시간이 지난 후에서야, 에비나쿠맙 SIA 및 tmAb0.1은 비히클 군과 비교했을 때 TG 수준을 유의하게 낮추는 것으로 관찰되었는데, 둘 다 베이스라인보다 40~45% 아래였다. 도 3 참조.
ANGPTL3 수준
에비나쿠맙 SIA는 48시간 후에 혈장 총 ANGPTL3 수준을 베이스라인 대비 약 10배 증가시켰으며, 이후에는 베이스라인을 향해 서서히 감소했다. 대조적으로, tmAb0.1, tmAb0.2, tmAb0.3은 전체 임상연구 기간 동안 혈장 총 ANGPTL3 수준을 베이스라인 수준으로 또는 베이스라인 미만으로 감소시켰다. 도 4a 및 4b 참조.
항체 수준
모든 항체는 나노몰 범위로 혈장에 존재하였으며, 에비나쿠맙 SIA 및 tmAb0.1은 임상연구 기간 전체에 걸쳐 200 nM을 초과하여 존재함으로써 가장 높은 노출 수준을 나타냈다. 도 5 참조.
결론
본 임상연구로부터, tmAb0.1은 TG를 낮추는 효능의 측면에서 에비나쿠맙 SIA와 동등한 것으로 보인다.
결과는 tmAb0.1, tmAb0.2, tmAb0.3, 및 tmAb0.4가 1가 항체(즉, 각각 하나의 길항성 ANGPTL3 결합 부위만을 가짐)라는 점에서 인상적이다. 또한, 에비나쿠맙 SIA에 비해 tmAb0.1, tmAb0.2, tmAb0.3, 및 tmAb0.4의 노출이 더 낮다는 것은(도 5), 1가 항체의 혈장 농도가 더 낮음에도 불구하고, 이들은 혈장 내 중성지방 수준을 에비나쿠맙 SIA를 사용할 때 수득되는 것과 유사한 수준까지 감소시킬 수 있음을 보여준다.
또한, tmAb0.1, tmAb0.2, tmAb0.3, 및 tmAb0.4는 혈장에서 표적 ANGPTL3을 제거하는 능력을 보여준다. 대조적으로, 에비나쿠맙 SIA의 투여는 혈장에서 총 ANGPTL3을 축적시켰다. 본원에 기술된 것과 같은 Fc 치환을 tmAb0.1~0.4의 Fab와 조합하는 경우(tmAb1~4로 이어짐)에, 본 발명자들의 예상은 순환하는 hANGPTL3의 수준이 인간 환경에서 상당히 감소될 것이라는 것이다.
실시예 6: SE-UPLC 크로마토그래피에 의한 ANGPTL3 항체 복합체의 결정
면역 복합체를 Waters ACQUITY UPLC 시스템을 이용해 SE-UPLC로 분석하였다. 복합체는, 0.2~2.0 mg/ml의 농도 범위인 항체를 rhANGTPL3과 1:3 몰비로 혼합하여 형성하였다. 항체-항원 혼합물을 1시간 동안 평형화시킨 후, ACQUITY UPLC 단백질 BEH SEC 컬럼(450 Å, 2.5 μm)을 이용해 분석하였다. 각각의 샘플을 A) 300 mM NaCl, 10 mM 구연산 나트륨, pH 6.0 또는 B) 300 mM NaCl, 10 mM TRIS/HCl, pH 7.4로 이루어진 실행 완충액 중 20 uL의 주입 부피 및 0.3 mL/분의 유속을 사용해 2회 주입하였다. 컬럼 온도를 22℃ +/- 2℃에서 일정하게 유지하면서, 샘플 챔버를 4℃로 냉각시켰다. 용리 프로파일을 276 nm에서 UV-VIS 흡수로 모니터링하였다.
면역 복합체 크기 및 pH 의존적 표적 결합의 정량화
복합체의 크기는 이들의 유지 시간뿐만 아니라 평균 유지 시간, 즉 크로마토그래피 트레이스의 질량 중간점에 의해 평가하였다. 반면에, 표적 결합의 pH-반응성은 pH 7.4에서의 평균 유지 시간으로부터 pH 6.0에서의 평균 유지 시간을 차감하여 평가하였다.
결과
SE-UPLC 분석의 결과는 도 6a~6e 및 아래의 표 2에 기술되어 있다. 에비나쿠맙 SIA와 tmAb1, tmAb2, tmAb3, 및 tmAb4가 표적 항원인 rhANGTPL3과 면역 복합체를 형성하는 것이 명백하다. 그러나, 에비나쿠맙 SIA는 tmAbs1~4에 비해 더 크고 더 다분산성인 면역 복합체를 형성한다(도 6a~6e 참조).
또한, 표 2의 MRT 이동을 비교함으로써 알 수 있듯이, tmAb1 면역 복합체의 형성은 pH의 변화에 상당히 더 민감하다. tmAb1을 사용하는 경우, 복합체는 에비나쿠맙 SIA에 의해 형성된 것들에 비해 덜 이질적인(더 균일한) 것으로 나타난다. 잘 정의된 항체/항원 복합체는 복합체의 세포 흡수를 증가시키는 데 중요하다. 세포-표면에서 Fc 수용체에 대한 결합 부위를 하나 이상 갖는 것은 결합능을 증가시켜 복합체의 흡수를 증가시킨다. 또한, 복합체 크기와 복잡도는 면역학적 반응과 상관되는데, 이는 항체/항원 복합체가 작을수록 덜 두드러지는 것으로 여겨진다. pH6.0에서 거의 완전한 해리가 관찰된다. pH 6.0에서 해리가 높을수록, 항체는 더 양호한 스위핑 전위를 갖는 것으로 여겨진다. 항체-항원 복합체가 세포에 의해 흡수될 때 항원을 완전히 방출할 수 있는 능력은 항체의 스위핑 거동에 중요하다. 항원을 방출할 수 있고, 항원의 지속적인 기능/결합을 위해 순환계로 재활용될 수 있는 항체의 경우(Igawa 등의 문헌[(2016) Immun. Rev. 270:132-151]).
실시예 7: ANGPTL3 단백질에 대한 1가 항체의 상호작용 동역학의 특성 분석
표면 플라스몬 공명을 통해 실시간으로 분자 상호작용을 측정하는 Biacore 8K(GEHealthcare)를 이용해 결합 연구를 수행하였다. 실험은 37℃에서 수행하였고, 샘플은 15℃의 샘플 저장부에 보관하였다. Biacore에 의해 보고된 신호(RU, 반응 단위)는 4개의 연속된 플로우셀(flow cell) 내의 개별 센서 칩 표면 상의 질량과 직접적으로 상관된다. 제조사의 지침에 따라 C1 센서 칩의 활성 채널 내의 2개의 플로우셀 모두의 위에 항-HPC4 단클론 항체를 고정시켰다. 단백질을 실행 완충액(20 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.05% v/v P20, 0.1% BSA pH 7.4; 또는 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.05% v/v P20, 0.1% BSA, pH6.0) 내로 희석하여 정제된 삼량체 표적 단백질 인간(C-말단 HPC4 태그를 갖는 서열번호 1 잔기 17~220)을 포획하고 플루우셀 2에 주입하여, 항-HPC4 항체만이 고정된 플루우셀 1에 기준 표면을 생성하였다. 상이한 1가 항체가 기준 표면에 결합하는 것 대비 포획된 표적에 결합하는 것의 비교 분석을 가능하게 하도록, 2개의 플로우셀 모두의 위에 분석물(1가 항체)을 주입함으로써 포획된 표적에 대한 1가 항체의 결합을 수행하였다. 1가 항체를 실행 완충액 내로 연속 희석하고, 240초 동안 30 μl/분의 속도로 주입하고, 300초 동안 해리시켰다. 분석물의 각 주입 사이클 후에는 20 mM 트리스, 150 mM NaCl, 50 mM EDTA, 0.05% P20, pH7.4를 주입하여 C1 표면을 재생시켰다. 이러한 재생 단계는 고정된 포획 항체 표면으로부터 포획된 표적과 임의의 결합된 1가 항체를 제거하여, 다음 상호작용 샘플 쌍의 후속 결합을 가능하게 하였다. 재생 절차는 직접 고정된 항-HPC4 포획 항체를 칩 표면으로부터 제거하지 않았다.
복합체 형성 및 해리의 동역학을 측정함으로써 결정된 평형 해리 상수(KD)를 결정함으로써 1가 항체와 표적 간의 결합 친화도를 정량화하였다. 1가 복합체의 결합과 해리에 상응하는 속도 상수, 예컨대 ka(결합 속도) 및 kd(해리 속도)를, 데이터 분석을 위한 Biacore 평가 소프트웨어를 사용하여 로컬 Rmax를 갖는 1:1 랑뮤어 모델에 대한 글로벌 피팅 데이터에 의해 검색하였다. KD는 등식 KD = kd / ka를 통해 ka 및 kd와 연관된다.
결합 곡선은 이중 참조에 의해 가공하였다(데이터 분석에 앞서 기준 표면 신호를 차감하고, 포획된 이중특이적 단백질에 블랭크 완충액 주입). 이를 통해 샘플 주입 동안 기기 노이즈, 벌크 이동, 및 드리프트를 보정할 수 있었다.
표 3은 인간 ANGPTL3과 tmAbs1~4의 상호작용에 대한 결합 상수 KD(평형 해리 상수)의 측정 결과를 보여준다. KD의 계산된 비율은 pH6.0에서의 값/pH7.4에서의 값으로서 표현된다.
HC G26D 돌연변이를 tmAb1에 도입할 때(tmAb2가 생성됨), KD는 더 느린 온-속도에 의해 2배 증가하였다. pH7.4에서 더 약한 결합은 pH6.0에서 더 약한 결합과 관련이 있었다. 열거된 모든 변이체는 낮은 (μM 범위) 친화도에 의해 그 특성을 분석하였다.
실시예 8: 1가 포맷은 자기 결합을 감소시킨다
바이오프로세싱 단계의 성공적인 개발 및 제형화를 보장하기 위해서는, 항체가 넓은 pH 간격에 걸쳐 낮은 자기 결합 경향을 갖는 것이 중요하다. 여기서, 항체 포맷을 2가에서 1가로 변경하는 것이 미치는 효과를 조사하기 위해, tmAb1 및 “mAb1”로 지정된 이의 2가 형태의 자기 결합을 평가하였다.
물질 및 방법
초기 단백질 스톡 용액으로서 10 mM L-히스티딘, 10 mM NaCl, pH 6.0에서 tmAb1 및 mAb1을 40 mg/ml 농도로 제조하였다. 단백질 스톡 용액을 pH 스크린 스톡과 1:1(10 μl 단백질 스톡: 10 μl pH 스크린)로 혼합하여 3.3, 3.7, 4.2, 5.2, 5.6, 6.0, 6.4, 6.9, 7.2, 7.5, 8.1, 8.4의 최종 pH 값 및 20 mg/ml의 최종 단백질 농도에 도달하였다. pH 스크린 스톡 용액은 관심 pH에 맞게 조정된 70 mM 숙신산, 70 mM L-히스티딘으로 구성된다. 단백질 스톡 용액 및 pH 스크린 스톡 용액을 384 웰 플레이트(corning 3540)에서 혼합하고, 투명 플라스틱 필름으로 밀봉하고, 실온에서 차광 상태로 밤새 인큐베이션한다. 이후, 플레이트를 1400 rpm(169 x g에 상응함)로 5분 동안 원심분리한 다음, 5초의 획득 시간 및 샘플 당 40개의 획득으로 설정된 동적 광 산란(DLS) 플레이트 판독기(Wyatt DynaPro)로 분석한다. 유체역학적 반경(Rh)을 기기 소프트웨어를 사용하여 유추하고 pH의 함수로서 도표화한다(Houen G. (eds)의 문헌[Therapeutic Antibodies. Methods in Molecular Biology, vol 2313. Humana, New York, NY] 중 Dingfelder 등의 (2022) 문헌 참조).
결과 및 논의
mAb1의 유체역학적 반경(Rh)의 증가는, 이러한 분자의 추가 개발을 훼손시킬 정도로 자기 결합이 매우 높음을 시사한다. 특히, pH 6.4 내지 8.4의 pH 범위에서, Rh의 현저한 증가가 관찰되든데, 이 또한 생체내에서 문제를 야기할 수 있다. 분자 포맷을 2가 형태로부터 1가 형태로 변화시킴으로써, 자기-결합 경향의 극적인 감소가 관찰되었는데, pH 6.4 내지 8.4에서는 미묘하게만 증가하였다. tmAb1의 자기 결합의 미묘한 증가는 낮고 허용 가능한 것으로 간주한다. 표 4 및 도 7 참조. 데이터는 피하 투여에 적합한 고농축 조성물(제형)을 제조할 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 9: 1가 포맷은 겔 형성을 감소시킨다
약으로서의 항체를 성공적으로 개발하기 위해서는, 높은 단백질 농도(50~175 mg/ml)에서 높은 물리적 안정성이 일반적으로 중요하다. 이는 정제 프로세스, 제형화 프로세스의 마지막 단계들을 포함하는 개발의 많은 단계 동안 요구되고, 피하 투여를 위해서도 요구된다. 여기서, 물리적 안정성은 높은 단백질 농도에서, 생리학적 pH에서, 낮은 이온 강도 및 높은 이온 강도에서 평가된다.
물질 및 방법
tmAb1 및 “mAb1”로 지정된 이의 2가 형태를 고이온 강도 제형(20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.4) 및 저이온 강도 제형(20 mM Hepes, pH 7.4)으로 완충액 교환하였다. 이후, 70 mg/ml에 도달하기 위해, 샘플을 실온에서 Amicon 30 kDa 원심 분리기 필터에서 농축시켰다. 단백질 농도는 280 nm에서의 흡광도로 결정하였다.
결과 및 논의
tmAb1은 70 mg/ml까지 쉽게 농축되었지만, mAb1(2가)의 경우, 고 이온 강도 제형에서는 30 mg/ml를 초과하는 농도로 농축하는 것이 불가능하였다. mAb1에 대해 시각적으로 관찰된 바와 같이, 고이온 강도 제형에서의 겔 형성은 상 분리를 초래하여 제형 관련 농도까지 농축시킬 수 없었다. 도 8 참조.
데이터는, 피하 투여에 적합한 고농축 제형을 제조할 수 있음을 뒷받침하며, 여기서 1가 항체 tmAb1 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 70 mg/ml 이상일 수 있다.
실시예 10: 1가 포맷은 점도를 감소시킨다
항체 용액의 낮은 용액 점도는 최종 생산 단계, 제형화, 및 피하 투여에 중요하다. 여기서, 2가 포맷(mAb1)에서 1가 포맷(tmAb1)으로의 변화가 용액 점도에 미치는 효과를 평가한다.
물질 및 방법
tmAb1 및 mAb1를 고이온 강도 제형(20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.4) 및 저이온 강도 제형(20 mM Hepes, pH 7.4)으로 완충액 교환하였다. 이후, 70 mg/ml을 목표로, 샘플을 실온에서 Amicon 30 kDa 원심 분리기 필터에서 농축시켰다.
점도는 5℃의 온도에서 50 μl의 샘플을 사용하여 Rheosense Initium 기기를 사용하여 측정하였다. 뉴턴 용액을 제시하는 1.000~10.000의 1/s 전단에서 시험할 때는 전단 효과가 관찰되지 않았으므로, 비교를 위해 5.000 1/s의 단일 전단 속도를 사용하였다.
결과 및 논의
저이온 강도 제형에서, mAb1은 10.2 mPa*s의 높은 점도를 갖는 반면, tmAb1은 6.6 mPa*s의 상당히 낮은 점도를 갖는다(표 5 참조). 고이온 강도 제형에서, tmAb1은 5.8 mPa*s의 유사한 점도를 갖는데, 이는 제형의 이온 강도가 미치는 효과가 제한적임을 시사한다. 그러나, mAb1의 경우, 고이온 강도 제형에서 30 mg/ml를 초과하는 농도로 농축하는 것이 불가능하였는데, 이는 시각적으로 관찰된 것과 같이 겔 형성으로 인해 상이 분리되었기 때문이다.
결과는, 고농도 mAb1 용액의 부족한 특성이 항체 포맷을 2가에서 1가로 바꿈으로서 어떻게 구조될 수 있는지를 보여준다. mAb1은 약물화할 수 없는 것으로 간주되는 반면, tmAb1은 양호하고 허용 가능한 생물물리학적 성질을 갖는데, 이는 피하 투여에 적합한 고농축 제형을 제조할 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 11: 건강한 시노몰구스 원숭이를 대상으로 한 tmAb1의 생체내 평가
본 연구의 목적은 항-ANGPTL3 단클론 항체 tmAb1의 약동학 및 중성지방에 미치는 효과를 결정하는 것이었다.
tmAb1을 3가지 상이한 투여량 수준(0.3, 3, 및 30 mg/kg)으로 정상지질혈증 시노몰구스 원숭이에게 1회 정맥 내 볼루스 주사로서 투여하였다. 주입 부피는 0.3 mL/kg이었다. 모든 동물은 치료 항체 및 다른 단백질 기반 치료제의 투여에 노출된 적이 없었다.
채혈 및 샘플 분석:
다음 시점에 모든 동물로부터 혈액 샘플(0.5 mL)을 채취하였다: 투여 전, 투여 후 10분, 30분, 1, 2, 4, 8, 14, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 및 240시간차. 혈액은 대퇴 정맥에서 채취하여, 1.75 mg의 EDTA/mL(혈액)가 담긴 Teklab K3EDTA 튜브(품번 3K200PP)에 수집하였다. 샘플을 뒤집어서 완전히 혼합한 직후, 젖은 얼음 위에 최대 30분 동안 둔 후 원심분리하였다. 샘플을 대략 2000 g로 2~8℃에서 10분 동안 원심분리하고, 혈장 분획을 마이크로닉 튜브(카탈로그 번호 MP32022)에 옮겼다.
샘플을 분석하여 tmAb1 및 중성지방 농도를 정량화하였다.
중성지방
중성지방은 COBAS 6000 다중분석기를 제조사의 권장사항(Roche Diagnostics)에 따라 이용해 측정하였다.
인간 IgG 측정 (tmAb1), 검정 원리:
발광 산소 채널링 면역 검정(LOCI)을 사용하여, 혈장 샘플을 항-ANGPTL3 hIgG(tmAb1)에 대해 분석한다. 공여자 비드를 스트렙트아비딘으로 코팅한 반면, 수용자 비드는 시노몰구스 IgG에 교차 결합시키지 않은 인하우스 단클론 마우스 항-인간 IgG와 접합시켰다. 인간 IgG-Fc(시노몰구스 아님)에 교차 결합시킨 비오틴화된 재조합 항체 단편(나노바디/VHH)는 ThermoFisher(CaptureSelect, cat:7103322500)에서 수득하였다. 3개의 반응물(스트렙트아비딘으로 코팅한 공여자 비드, 표적-특이적 Ab와 접합된 수용자 비드, 및 비오틴화된 표적-특이적 항체 단편)을 항-ANGPTL3 항체(hIgG)와 합쳐 2개의 부위를 갖는 면역 복합체를 형성하였다. 복합체의 발광은 공여자 비드로부터 일중항 산소 원자를 방출한다. 이들은 수용자 비드 내로 채널링되어 화학발광을 유발하는데, 이는 제조사의 지침에 따라 EnVision 플레이트 판독기(PerkiElmer)에 의해 측정된다. 광의 양은 항-ANGPTL3 항체(tmAb1)의 농도에 비례한다.
인간 IgG 측정 (tmAb1), 검정 절차:
2 μL의 혈장 샘플/교정자/대조군을 384-웰 LOCI 플레이트의 웰에 도포한 다음, MAb 항-hIgG 및 비오틴화된 항체 단편으로 코팅된 15 μL의 수용자 비드 혼합물(0.5 μg/웰)을 도포하였다. 플레이트를 실온(RT)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 30 μL 스트렙트아비딘-코팅된 공여자-비드(2 μg/웰)를 각 웰에 첨가하고, RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 680 nm 레이저로 여기한 후, 21~22℃에서 520~645 nm 대역폭의 필터가 구비된 Envision 플레이트 판독기에서 플레이트를 판독하였다. 웰당 총 측정 시간은 70 ms 여기 시간을 포함하여 210 ms였다. 교정자 물질은 PBS + 1% 시노몰구스 혈장에서 희석한 tmAb1였다. 검정 범위는 11~20.000 pM이다. 시험한 시노몰구스 샘플을 PBS 혈장에서 100X 희석하였다. 정량 상한(ULOQ)을 초과하여 측정된 샘플을 PBS + 1% 시노몰구스 혈장에서 추가로 희석하였다.
결과
PK
tmAb1의 약동학(PK)은 도 9에 도시되어 있다. PK는 240시간 동안 모든 투여량 수준에서 선형으로 나타나며, 모든 투여량 수준에서 광범위한 비선형성의 징후가 나타난다.
비구획 분석 및 “선형-업 로그-다운” 방법을 사용하여 계산한 반감기는 모든 동물에 대해 90.9~171 범위였으며, 0.3, 3, 및 30 mg/kg군의 경우 각각 119, 107, 및 107시간의 기하 평균은 240시간 동안의 관찰에 기반한다.
TG
TG에 미치는 효과를 0~240시간 동안 평가하였다(도 10). 3 mg/kg 및 30 mg/kg은 TG 수준을 신속하게 감소시켰는데, 4시간 후 약 40~50%가 감소하였다. 임상연구 중에 나타난 최대 감소는 56~78%로 다양하였다. 일반적으로, TG에 미치는 효과는 적어도 240시간 동안 지속되었다. 0.3 mg/kg 투여량 수준에서는, 4시간 후에 TG 수준에 대해 28~44%의 일시적인 효과가 관찰되며, 12시간 후에 TG 수준은 베이스라인 수준으로 복귀한다.
실시예 12: tmAb2, tmAb3, tmAb4 생성
pH 의존적 표적 결합(실시예 6 및 7 참조) 및 LPL 활성(실시예 4)을 추가로 조절할 가능성을 탐색하기 위해, tmAb1의 가변 도메인 서열의 CDR 단일 부위 돌연변이유발 라이브러리를 생성하였다. 제형에 미치는 효과(실시예 8, 9, 및 10), 활성 및 표적 결합 파라미터(실시예 4 및 7), IC 형성(실시예 6), 및 생체내 효과기 기능(실시예 5)과 관련하여 가장 뛰어난 분자를 tmAb로서 평가하여, tmAb2, tmAb3, 및 tmAb4를 선택하였다.
Claims (18)
- 인간 ANGPTL3(hANGPTL3)(서열번호 1)에 결합할 수 있는 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
a) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄는:
- 아미노산 잔기 SYWMT(서열번호 2)의 CDR1 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 또는 1개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 SISSHSTYIYYADSVKG(서열번호 3)의 CDR2 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 , 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR2 서열, 및
- 아미노산 잔기 EGWYDNWFDP(서열번호 4)의 CDR3 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 , 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR2 서열을 포함하거나,
b) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄는:
- 아미노산 잔기 SYWMT(서열번호 24)의 CDR1 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 또는 1개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 SISSHSTYIYYADSVKG(서열번호 25)의 CDR2 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 , 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR2 서열, 및
- 아미노산 잔기 EGWYDNWNDP(서열번호 26)의 CDR3 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개 , 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는, CDR3 서열을 포함하고;
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄는:
- 아미노산 잔기 RASQNIRSPYLA(서열번호 9)의 CDR1 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개, 1개, 2개, 또는 3개가 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있는, CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 GVSSRAA(서열번호 10)의 CDR2 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개, 1개, 또는 2개가 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있는, CDR1 서열, 및
- 아미노산 잔기 QQYDDHPYT(서열번호 11)의 CDR3 서열로서, 이들 아미노산 잔기 중 0개, 1개, 또는 2개가 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있는, CDR1 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항에 있어서, 상기 치환(들)은 보존적 치환(들)인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 5와 적어도 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 12와 적어도 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제3항 어느 한 항에 있어서,
a) 중쇄 가변 도메인은 서열번호 5를 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 12를 포함하거나,
b) 중쇄 가변 도메인은 서열번호 17을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 12를 포함하거나,
c) 중쇄 가변 도메인은 서열번호 22를 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 12를 포함하거나,
d) 중쇄 가변 도메인은 서열번호 27을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 12를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(들)에서
(EU 잔기) 위치 252의 티로신(Y),
위치 254의 트레오닌(T), 및
위치 256의 글루타메이트(E)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(들)에서
(EU 잔기) 위치 234의 티로신(Y),
위치 238의 아스파르테이트(D),
위치 250의 발린(V),
위치 264의 이소류신(I),
위치 307의 프롤린(P), 및/또는
위치 330의 리신(K) 중 하나 이상을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(들)에서 (EU 잔기) 위치 311 및 343의 아르기닌(R)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 hANGPTL3-매개 지단백질 리파아제(LPL)의 억제를 억제할 수 있고 인간 혈장에서 hANGPTL3의 농도를 감소시킬 수 있는 길항제인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fc 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제9항 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 이소형은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 기반으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄, 절단된 중쇄, 및 경쇄를 포함하되, 중쇄는 서열번호 6을 포함하고, 절단된 중쇄는 서열번호 7을 포함하고, 경쇄는 서열번호 13을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 인간 ANGPTL3(hANGPTL3)(서열번호 1)에 결합할 수 있는 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 중쇄, 절단된 중쇄, 및 경쇄를 포함하되, 중쇄는 서열번호 6을 포함하고, 상기 절단된 중쇄는 서열번호 7을 포함하고, 경쇄는 서열번호 13을 포함하는, 1가 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체(들)를 포함하는 약학적 조성물.
- 의약에 사용하기 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제13항에 따른 조성물.
- 인간 혈장에서 중성지방 농도 상승을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제13항에 따른 조성물.
- 죽상경화성 심혈관 질환(ASCVD)과 같은 심혈관 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제13항에 따른 조성물.
- 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 조성물은 피하 투여되는 방법 또는 용도.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제13항에 따른 조성물, 및 사용 지침을 포함하는 키트.
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