KR20230155448A - 화합물, 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본원의 개시내용은 무엇보다도 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 바이러스 게놈을 전달하기 위해 유용한 지질, 조성물 및 방법을 포함한다.

Description

화합물, 조성물 및 이의 사용 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2021년 2월 10일자로 출원된 미국 가특허 출원 제63/147,959호; 2021년 4월 29일자로 출원된 미국 가특허 출원 제63/181,899호; 및 2021년 4월 29일자로 출원된 미국 가특허 출원 제63/181,917호에 대한 우선권 및 이득을 주장하고, 이들 각각의 내용은 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
지질은 비경구 투여 시 표적 세포로 전달하기 위해 핵산 기반 치료제, 예를 들어 siRNA 또는 mRNA를 캡슐화하는 지질-NA 나노입자를 형성하는 능력으로 인해 핵산(NA) 전달을 위한 물질로 사용된다(참조: Zimmermann, 2006, Nature, doi: 10.1038/nature04688; August at al., 2021, Nat Med, doi: 10.1038/s41591-021-01573-6).
대상체를 치료하고 면역화하기 위한 핵산의 전달은 수년 동안 목표였다. DNA 또는 RNA, 예를 들어, 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클의 DNA 또는 RNA(또는 "누출된" 백신에서는 심지어 전달 비히클이 없음), 복제 또는 비복제 벡터 또는 바이러스 또는 비바이러스 벡터의 사용을 포함하는 다양한 접근법이 시험되었다.
더욱 개선된 핵산 기반 치료 및 백신, 특히 핵산 치료제 전달의 개선된 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
본 발명의 개요
본 출원은 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 전달하는데 유용한 지질, 조성물 및 방법을 제공한다.
따라서, 하나의 양상에서 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이 본원에 제공된다:
[화학식 I]
상기 식에서:
A는 -N(CH2RN1)(CH2RN2) 또는 적어도 하나의 N을 함유하는 4-7원 헤테로사이클릴 환이고, 여기서 4-7원 헤테로사이클릴 환은 0-6개의 R3으로 임의로 치환되고;
각각의 X는 독립적으로 -O-, -N(R1)-, 또는 -N(R2)-이고;
R1은 임의로 치환된 C1-C31 지방족 및 스테로이딜로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 임의로 치환된 C1-C31 지방족 및 스테로이딜로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 임의로 치환된 C1-C6 지방족이고;
RN1 및 RN2는 각각 독립적으로 수소, 하이드록시-C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 또는 C3-C7 사이클로알킬이고;
L1은 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 쇄 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L2는 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 쇄 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L3은 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌 쇄, 또는 임의로 치환된 2가 C3-C7 사이클로알킬렌이고;
단, A가 -N(CH3)(CH3)이고 X가 O인 경우, L3은 C1-C6 알킬렌 쇄이다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-a의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
[화학식 I-a]
상기 식에서: m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다.
일부 구현예에서, A는 하나 이상의 S를 함유한다. 일부 구현예에서, A는 정확하게 하나의 N을 함유하는 임의로 치환된 4-7원 헤테로사이클릴 환이다. 일부 구현예에서, A는 임의로 치환된 5-6원 헤테로사이클릴 환이다. 일부 구현예에서, A는 정확하게 하나의 N을 함유하는 임의로 치환된 6원 헤테로사이클릴 환이다. 일부 구현예에서, A는 3차 아민이다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-b의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
[화학식 I-b]
상기 식에서: n은 0, 1, 2, 또는 3이고; m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-bii의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
[화학식 I-bii]
상기 식에서: m은 0, 1, 2 또는 3이고; p 및 q는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 또는 3이고, 여기서 q + p는 3 이하이다.
일부 구현예에서, n은 1이다. 일부 구현예에서, n은 2이다. 일부 구현예에서, n은 3이다. 일부 실시형태에서, m은 0이다. 일부 실시형태에서, m은 1이다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-c의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
[화학식 I-c]
일부 구현예에서, X는 O이다. 일부 구현예에서, X는 NR1 또는 NR2이다.
일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1-C31 알킬 또는 임의로 치환된 C2-C31 알케닐이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 동일하다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C10-C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 분지형 C10-C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 상이하다. 일부 구현예에서, R1은 임의로 치환된 C6-C20 알케닐이고, R2는 임의로 치환된 C10-C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 C6-C20 알케닐이고, R2는 분지형 C10-C20 알킬이다.
일부 구현예에서, L1은 임의로 치환된 C1-C10 알킬렌 쇄이고, L2는 임의로 치환된 C1-C10 알킬렌 쇄이다. 일부 구현예에서, L1은 임의로 치환된 C1-C5 알킬렌 쇄이고, L2는 임의로 치환된 C1-C5 알킬렌 쇄이다. 일부 구현예에서, L1은 임의로 치환된 C1-C3 알킬렌 쇄이고, L2는 임의로 치환된 C1-C3 알킬렌 쇄이다. 일부 구현예에서, L1 및 L2는 각각 -CH2CH2CH2-이다.
일부 구현예에서, L3은 C1-C3 알킬렌 쇄이다. 일부 구현예에서, L3은 결합이다. 일부 구현예에서, L3은 2가 C3-C7 사이클로알킬렌이다. 일부 구현예에서, L3은 결합이다. 일부 구현예에서, L3은 -CH2-이다.
일부 구현예에서, 티올레이트의 S와 A에 포함된 가장 가까운 N 사이의 탄소 원자의 수는 2-10이다. 일부 구현예에서, 티올레이트의 S와 A에 포함된 가장 가까운 N 사이의 탄소 원자의 수는 2-8이다. 일부 구현예에서, 티올레이트의 S와 A에 포함된 가장 가까운 N 사이의 탄소 원자의 수는 2-5이다. 일부 구현예에서, 티올레이트의 S와 A에 포함된 가장 가까운 N 사이의 탄소 원자의 수는 2-4이다. 일부 구현예에서, 티올레이트의 S와 A에 포함된 가장 가까운 N 사이의 탄소 원자의 수는 3이다.
일부 구현예에서, R3은 C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알케닐이고, 여기서, 각각의 C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알케닐은 임의로 1-3 C3-C6 사이클로알킬 또는 -OH로 치환된다. 일부 구현예에서, R3은 C1-C3 알킬이다. 일부 구현예에서, R3은 -CH3이다.
일부 구현예에서, RN1 및 RN2는 각각 독립적으로 수소, 하이드록시-C1-C3 알킬, C2-C4 알케닐, 또는 C3-C4 사이클로알킬로부터 선택된다. 일부 구현예에서, RN1 및 RN2는 각각 독리적으로 수소, -CH2CH=CH2, -CH2CH2OH, , 또는 로부터 선택된다. 일부 구현예에서, RN1 및 RN2는 동일하다. 일부 구현예에서, RN1 및 RN2는 상이하다. 일부 구현예에서, RN1 및 RN2 중 하나는 수소이고 다른 하나는 이다.
또 다른 양상에서, 본원에서는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물들 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이 제공된다:
일부 구현예에서, 화합물은
, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다.
일부 구현예에서, 화합물은
, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다.
일부 구현예에서, 화합물은
, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다.
또 다른 양상에서, 본원에서는
, 및 로부터 선택되는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이 제공된다.
또 다른 양상에서, 본원에서는 화학식 A의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 제공된다:
[화학식 A]
여기서:
n은 10 내지 200의 정수이고, 모든 종점이 포함되고;
LP1은 -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
RP1은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이고;
RP2는 수소 또는 -CH3이고,
단, 화학식 A는 HO-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)17CH3가 아니다.
일부 구현예에서, LP1은 -CH2C(O)O-, -CH2CH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2CH2OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이다. 일부 구현예에서, 화합물은 화학식 A-a, 화학식 A-b, 화학식 A-c, 화학식 A-d, 또는 화학식 A-e의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
[화학식 A-a]
[화학식 A-b]
[화학식 A-c]
[화학식 A-d]
[화학식 A-e]
.
일부 구현예에서, RP1은 C14-C18 알킬 또는 C14-C18 알케닐이고; 일부 구현예에서, RP1은 C14 알킬, C16 알킬 또는 C18 알킬이다.
일부 구현예에서, n은 평균 약 20, 약 40, 약 45, 약 50, 약 68, 약 75, 또는 약 100이다.
일부 구현예에서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고;
H3CO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고;
HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)15CH3, n은 평균 약 45이고;
HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)13CH3, n은 평균 약 45이고;
HO-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이다.
또한 본원에서는 본원에 기재된 화합물, 예를 들어, 화학식 I의 화합물을 포함하는 지질 나노입자(LNP)가 제공된다. 일부 구현예에서, LNP는 헬퍼 지질, 구조 지질, 및 본원에 기재된 PEG-지질과 같은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 화학식 A'의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
[화학식 A']
상기 식에서:
n은 10 내지 200의 정수이고, 모든 종점이 포함되고;
LP1’은 결합, -C(O)-, -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
RP1’은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이고;
RP2’는 수소 또는 -CH3이다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고;
H3CO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고;
HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)15CH3, n은 평균 약 45이고;
HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)13CH3, n은 평균 약 45이고;
HO-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 100이고;
HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 20이고;
HO-(CH2CH2O)n-(CH2)15CH3, n은 평균 약 20이고;
HO-(CH2CH2O)n-C18H35, n은 약 20이다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 100이고;
HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 50이고;
HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 40이고;
HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 100이고;
HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 50이고;
HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 40이다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 DMG-PEG(2000) 또는 DPG-PEG(2000)이다.
또 다른 양상에서, 본원에서는 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질, 이온화 가능한 지질, 헬퍼 지질, 및 구조적 지질을 포함하는 LNP가 제공되고, 여기서 LNP는 약 0.001% 내지 약 5%의 PEG-지질의 몰비를 갖고, 여기서 PEG-지질은 화학식 A''의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
[화학식 A'']
상기 식에서:
n은 10 내지 200의 정수이고, 모든 종점이 포함되고;
LP1''은 결합, -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
RP1''은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이고;
RP2''는 수소 또는 -CH3이다.
일부 구현예에서, LP1''은 결합, -CH2C(O)O-, -CH2CH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2CH2OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 화학식 A''-a, 화학식 A''-b, 화학식 A''-c, 화학식 A''-cd, 화학식 A''-e, 또는 화학식 A''-f의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
[화학식 A''-a]
[화학식 A''-b]
[화학식 A''-c]
[화학식 A''-d]
[화학식 A''-e]
[화학식 A''-f]
.
일부 구현예에서, RP1''은 C14-C18 알킬 또는 C14-C18 알케닐이다. 일부 구현예에서, RP1''은 C14 알킬, C16 알킬 또는 C18 알킬이다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 화학식 A''-f1, 화학식 A''-f2, 또는 화학식 A''-f3의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
[화학식 A''-f1]
[화학식 A''-f2]
[화학식 A''-f3]
.
또 다른 양상에서, 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질, 이온화 가능한 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질, 및 바이러스 게놈을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 LNP가 제공되고, LNP는 약 0.001% 내지 약 5%의 PEG-지질의 몰비를 갖고, 여기서 PEG-지질은 화학식 B의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
[화학식 B]
상기 식에서: n은 10 내지 200의 정수이고 모든 종점은 포함되고; RB1은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이다. 일부 구현예에서, RB1은 C15-C17 알킬 또는 C15-C17 알케닐이고; 일부 구현예에서, PEG-지질은 화학식 B-a 또는 화학식 B-b의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
[화학식 B-a]
[화학식 B-b]
.
일부 구현예에서, n은 평균 약 20, 약 40, 약 45, 약 50, 약 68, 약 75, 또는 약 100이다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 약 200 달톤 내지 약 10,000 달톤, 약 500 달톤 내지 약 7,000 달톤, 약 800 달톤 내지 약 6,000 달톤, 약 1,000 달톤 내지 약 5,000 달톤 또는 약 1,500 내지 약 3,500 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 평균 분자량이 약 800, 약 900, 약 1,000, 약 1,500, 약 1,750, 약 2,000, 약 2,250, 약 2,500, 약 2,750, 약 3,000, 약 3,250, 약 3,500, 약 3,750, 약 4,000, 약 4,500, 또는 약 5,000 달톤인 PEG 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 평균 분자량이 약 800, 약 900, 약 1,000 달톤, 약 1,500, 약 2,000, 약 2,500, 약 3,000, 약 3,500, 약 4,000, 약 4,500, 또는 약 5,000 달톤인 PEG 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 100이고; HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 20이고; HO-(CH2CH2O)n-(CH2)15CH3, n은 평균 약 20이고; HO-(CH2CH2O)n-C18H35, n은 평균 약 20이다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다: HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고; H3CO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고; HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)15CH3, n은 평균 약 45이고; HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)13CH3, n은 평균 약 45이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 100이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 50이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 40이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 100이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 50이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 40이다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA(MC3), COATSOME® SS-LC(이전 명칭: SS-18/4PE-13), COATSOME® SS-EC(이전 명칭: SS-33/4PE-15), COATSOME® SS-OC, COATSOME® SS-OP, Di((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데카네디오에이트(L-319), N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 II-1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
[화학식 II-1]
상기 식에서:
R1a 및 R1b는 각각 독립적으로 C1-C8 지방족 또는 -O(C1-C8 지방족)-이고, 여기서 O 원자는 존재하는 경우 피페리딘 환에 결합되고;
Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 -C(O)O-*, -OC(O)-*, -C(O)N(Rx 1)-*, -N(Rx 1)C(O)-*, -O(C=O)N(Rx 1)-*, -N(Rx 1)(C=O)O-*, 또는 -O-이고, 여기서 -*는 각각 R2a 또는 R2b에 대한 부착점을 나타내고, 각각 존재하는 Rx 1은 독립적으로 수소 및 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 스테롤 잔기, 지용성 비타민 잔기 또는 C13-C23 지방족이다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 II-2의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
[화학식 II-2]
상기 식에서:
R1a’및 R1b'는 각각 독립적으로 C1-C8 알킬렌 또는 -O(C1-C8 알킬렌)이고, 여기서 O 원자는 존재하는 경우 피페리딘 환에 결합되고;
Ya' 및 Yb'는 각각 독립적으로 -C(O)O-*, -OC(O)-*, -C(O)N(Rx 1)-*, -N(Rx 1)C(O)-*, -O(C=O)N(Rx 1)-*, -N(Rx 1)(C=O)O-*, -N(Rx 1)C(O)N(Rx 1)- 또는 -O-이고, 여기서 -*는 R2a 또는 R2b에 대한 부착점을 나타내고, 각각 존재하는 Rx 1은 독립적으로 수소 및 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
Za' 및 Zb'는 각각 독립적으로 임의로 치환된 아릴렌-C0-C8 알킬렌 또는 임의로 치환된 아릴렌-C0-C8 헤테로알킬렌이고, 여기서 알킬렌 또는 헤테로알킬렌 그룹은 각각 Ya' 및 Yb'에 결합되고;
R2a' 및 R2b'는 각각 독립적으로 스테롤 잔기, 지용성 비타민 잔기 또는 C12-C22 지방족이다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 II-1a의 화합물이다:
[화학식 II-1a]
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 II-2a의 화합물이다:
[화학식 II-2a]
.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 본원에 기재된 화합물, 예를 들어, 화학식 I의 화합물이다.
일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜 -에탄올아민(DSPE) , 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 디메틸포스파티딜에탄올아민, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 에그 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스 토일 포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일로레이올포스파티딜글리세롤(POPG), 디에라이도일포스파티딜에탄올아민(DEPE), 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜 세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀, 포스파티디카산, 세레브로사이드, 디세틸포스페이트, 리소포스파티딜콜린, 딜리놀레오일포스파티딜콜린 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 DSPC이다.
일부 구현예에서, 구조 지질은 스테로이드이다. 일부 구현예에서, 구조 지질은 콜레스테롤이다.
일부 구현예에서, LNP는 화학식 A''의 PEG-지질 또는 본원에 개시된 이온화 가능한 지질(예를 들어, 화학식 I의 이온화 가능한 지질)이 결여된 대조군 LNP와 비교하여 감소된 생체내 면역 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 LNP의 가속화된 혈액 소거율(ABC: accelerated blood clearance)이다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 IgM 반응이다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공되는 LNP는 화학식 I의 화합물, 콜레스테롤인 구조 지질, DSPC인 헬퍼 지질, 및 화학식 A''의 화합물인 PEG-지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
및 일부 구현예에서, PEG-지질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이다: HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 100이고; HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)13CH3, n은 평균 약 45이고; HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공되는 LNP는 화학식 II-1a의 화합물, 콜레스테롤인 구조 지질, DSPC인 헬퍼 지질, 및 화학식 A''의 화합물인 PEG-지질을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고; H3CO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고; HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)15CH3, n은 평균 약 45이고; HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)13CH3, n은 평균 약 45이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3이고, n은 평균 약 100이다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공되는 LNP는 화학식 II-1a의 화합물, 콜레스테롤인 구조 지질, DSPC인 헬퍼 지질, 및 화학식 B의 화합물인 PEG-지질을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 100이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 50이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 40이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 LNP는 본원에 기재된 이온화 가능한 지질, 예를 들어, 화학식 I의 화합물의 약 40% 내지 약 70%, 예를 들어, 약 45% 내지 약 55%, 또는 약 49% 내지 약 64%의 몰비를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 본원에 기재된 이온화 가능한 지질, 예를 들어, 화학식 I의 화합물의 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 58% 또는 약 60%의 몰비를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 LNP는 약 0.1 몰% 내지 약 4 몰%, 예를 들어, 약 0.2 몰% 내지 약 0.8 몰%, 약 0.4 몰% 내지 약 0.6 몰%, 약 0.7 몰% 내지 약 1.3 몰%, 약 1.2 몰% 내지 약 1.8 몰%, 또는 약 1 몰% 내지 약 3.5 몰%의 PEG-지질의 몰비를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 약 0.25%, 약 0.5%, 약 1.5%, 또는 약 3%의 PEG-지질의 몰비를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공되는 LNP는 약 5% 내지 약 50%, 예를 들어 약 5% 내지 약 10%, 약 25% 내지 약 35%, 또는 약 35% 내지 약 50% 구조 지질의 몰비를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 약 20%, 약 22.5%, 약 25%, 약 27.5%, 약 30%, 약 32.5%, 약 35%, 약 37.5%, 약 40%, 약 42.5%, 약 45% 또는 약 50%의 구조 지질의 몰비를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공되는 LNP는 약 5% 내지 약 50%, 예를 들어, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 25%, 또는 약 25% 내지 약 50%의 헬퍼 지질의 몰비를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 약 5%, 약 7%, 약 9%, 약 12%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 또는 약 30%의 헬퍼 지질의 몰비를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공되는 LNP는 약 45% 내지 약 55%의 이온화 가능한 지질, 약 5% 내지 약 9%의 헬퍼 지질, 약 36% 내지 약 44%의 구조적 지질, 및 약 2.5% 내지 약 3.5%의 PEG-지질의 몰비를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 LNP는 약 45% 내지 약 55%의 본원에 기재된 이온화 가능한 지질, 예를 들어 화학식 I의 화합물, 약 5% 내지 약 9%의 DSPC, 약 36% 내지 약 44%의 콜레스테롤, 및 약 2.5% 내지 약 3.5%의 DMG-PEG(2000)의 몰비를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 LNP는 본원에 개시된 이온화 가능한 지질, 예를 들어 화학식 I의 화합물의 약 49% 내지 약 60%, 약 18% 내지 약 22%의 헬퍼 지질, 약 22% 내지 약 28%의 구조 지질, 및 약 0.2% 내지 약 0.8%의 PEG-지질, 예를 들어 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질의 몰비를 포함한다: HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고; H3CO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고; HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)15CH3, n은 평균 약 45이고; HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)13CH3, n은 평균 약 45이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 LNP는 본원에 개시된 이온화 가능한 지질, 예를 들어 화학식 II-1a의 화합물의 약 44% 내지 약 54%의, 약 19% 내지 약 25%의 헬퍼 지질, 약 25% 내지 약 33%의 구조 지질, 및 약 0.2% 내지 약 0.8%의 PEG-지질, 예를 들어 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질의 몰비를 포함한다: HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 100이고; HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 20이고; HO-(CH2CH2O)n-(CH2)15CH3, n은 평균 약 20이고; HO-(CH2CH2O)n-C18H35, n은 평균 약 20이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 100이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 50이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 40이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 100이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 50이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 40이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 LNP는 약 44% 내지 약 54%의 본원에 개시된 이온화 가능한 지질, 예를 들어 화학식 II-1a의 화합물, 약 19% 내지 약 25%의 헬퍼 지질, 약 24% 내지 약 32%의 구조 지질, 및 약 1.2% 내지 약 1.8%의 PEG-지질, 예를 들어 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질의 몰비를 포함한다: HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 100이고; HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 20이고; HO-(CH2CH2O)n-(CH2)15CH3, n은 평균 약 20이고; HO-(CH2CH2O)n-C18H35, n은 평균 약 20이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 100이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 50이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 40이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 100이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 50이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 40이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 LNP는 약 44% 내지 약 54%의 본원에 개시된 이온화 가능한 지질, 예를 들어 화학식 II-1a의 화합물, 약 8% 내지 약 14%의 헬퍼 지질, 약 35% 내지 약 43%의 구조 지질, 및 약 1.2% 내지 약 1.8%의 PEG-지질, 예를 들어 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질의 몰비를 포함한다: HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 100이고; HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 20이고; HO-(CH2CH2O)n-(CH2)15CH3, n은 평균 약 20이고; HO-(CH2CH2O)n-C18H35, n은 평균 약 20이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 100이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 50이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 40이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 100이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 50이고; HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 40이다.
일부 구현예에서, LNP는 페이로드 분자를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 페이로드 분자는 하나 이상의 핵산, 음이온성 단백질, 음이온성 펩타이드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 페이로드 분자는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 단일 가닥 RNA(ssRNA), siRNA, 마이크로RNA, mRNA, 원형 RNA, 작은 활성화 RNA, CRISPR용 가이드 RNA, 자가 증폭 RNA, 바이러스 RNA(vRNA), 단일 가닥 DNA(ssDNA), 이중 가닥 DNA(dsDNA), 상보적 DNA(cDNA), 폐환 DNA(ccDNA), 레플리콘 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 하나 이상의 치료학적 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료학적 단백질은 사이토킨(예를 들어, 에리트로포이에틴), 응고 인자, 항체, 이중특이적 T 세포 인게이저 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 바이러스 게놈으로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 게놈은 양성 단일 가닥 RNA 바이러스 게놈 양성 단일 가닥 RNA 바이러스 게놈이다. 일부 구현예에서, 바이러스 게놈은 종양 용해 바이러스(예를 들어, 콕사키에바이러스(Coxsackievirus) A21(CVA21), 세네카 밸리(Seneca Valley) 바이러스(SVV), 토가비리대(Togaviridae) 또는 알파바이러스(Alphavirus)(예를 들어, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스, 로스 리버(Ross River) 바이러스 또는 키쿤구니야(Chikungunya) 바이러스))를 암호화한다. 일부 구현예에서, 페이로드 분자는 콕사키에바이러스를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하고, 임의로 콕사키에바이러스는 CVA21 균주이다. 일부 구현예에서, 페이로드 분자는 SVV를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 구현예에서, 페이로드 분자는 외인성 단백질을 추가로 암호화하고, 여기서 외인성 단백질은 형광 단백질, 효소 단백질, 사이토킨, 케모킨, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자 또는 세포 표면 수용체에 대한 리간드이다. 일부 구현예에서, 바이러스 게놈은 양성 단일 가닥 RNA 바이러스 게놈이다. 일부 구현예에서, 바이러스 게놈은 종양 용해 바이러스(예를 들어, 콕사키에바이러스 A21(CVA21), 또는 세네카 밸리 바이러스(SVV), 토가비리대 또는 알파바이러스(예를 들어, 신드비스 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 로스 리버 바이러스 또는 키쿤구니야 바이러스))를 암호화한다. 일부 구현예에서, 바이러스 게놈은 콕사키에바이러스를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈이고, 임의로 콕사키에바이러스는 CVA21 균주이다. 일부 구현예에서, 바이러스 게놈은 SVV를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈이다. 일부 구현예에서, 바이러스 게놈은 추가로 외인성 단백질을 암호화하고, 여기서 외인성 단백질은 형광 단백질, 효소 단백질, 사이토킨, 케모킨, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자 또는 세포 표면 수용체에 대한 리간드이다.
일부 구현예에서, LNP는 약 1 대 약 25의 지질-질소-대-포스페이트(N:P) 비율을 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 14의 N:P 비율을 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 9의 N:P 비율을 갖는다.
또한 본원에서는 본원에 개시된 화합물 또는 본원에 개시된 LNP 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
또한 본원에서는 하기를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다: (1) 페이로드 분자; 및 (2) 본원에 개시된 LNP. 일부 구현예에서, 페이로드 분자는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 페이로드 분자는 콕사키에바이러스 또는 SVV를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP에 포함된 바이러스 게놈은 콕사키에바이러스 또는 SVV를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 미리 결정된 역치 값에 필적하는 생체내 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 미리 결정된 역치 값을 초과하는 생체내 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 미리 결정된 역치 값 미만의 생체내 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 미리 결정된 역치 값에 필적하는 생체내 AUC를 갖는다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 미리 결정된 역치 값을 초과하는 생체내 AUC를 갖는다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 미리 결정된 역치 값 미만의 생체내 AUC를 갖는다. 일부 구현예에서, 미리 결정된 역치 값은 LNP가 화학식 A'의 PEG-지질 또는 본원에 개시된 이온화 가능한 지질(예를 들어, 화학식 I의 이온화 가능한 지질)이 결여된 것을 제외하고는 동일한 페이로드 분자 및 LNP를 포함하는 대조군 조성물에서 결정된다.
일부 구현예에서, LNP는 약 50 nm, 약 60 nm, 약 70 nm, 약 80 nm, 약 90 nm, 약 100 nm, 약 110 nm, 약 120 nm, 또는 약 125 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, LNP에 의한 페이로드 분자의 캡슐화 효율은 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100%이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 10 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 또는 약 50 mM의 총 지질 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 또는 약 6의 pH에서 제형화된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 다중 투여를 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 후속 투여는 제1 투여 후 적어도 3일, 적어도 5일, 적어도 7일, 적어도 9일, 적어도 11일, 적어도 14일 또는 적어도 21일에 투여된다.
또한 본원에 개시된 LNP 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 구현예에서, 암은 폐암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 고환암, 결장직장암, 결장암, 췌장암, 간암, 신장 세포 암종, 위암, 두경부암, 갑상선암, 악성 신경교종, 교모세포종, 흑색종, B세포 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, 결정되지 않은 유의성의 모노클로날 감마글로불린병증(MGUS: monoclonal gammopathy of undetermined significance), 메르켈 세포 암종, 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL: Merkel cell carcinoma, diffuse large B-cell lymphoma), 육종, 신경모세포종, 신경내분비암, 횡문근육종, 수모세포종, 방광암 및 변연부 림프종(MZL: marginal zone lymphoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 폐암, 유방암, 결장암, 췌장암, 방광암, 신장 세포 암종, 난소암, 위암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 신장 세포 암종, 폐암 또는 간암이다. 일부 구현예에서, 폐암은 소세포 폐암 또는 비-소세포 폐암(예를 들어, 편평 세포 폐암 또는 폐 선암종)이다. 일부 구현예에서, 간암은 간세포 암종(HCC: hepatocellular carcinoma)(예를 들어, B형 간염 바이러스 관련 HCC)이다. 일부 구현예에서, 전립선암은 치료-응급 신경내분비 전립선암이다. 일부 구현예에서, 암은 폐암, 간암, 전립선암(예를 들어, CRPC-NE), 방광암, 췌장암, 결장암, 위암, 유방암, 신경모세포종, 신장 세포 암종, 난소암, 횡문근육종, 수모세포종, 신경내분비암, 메르켈 세포 암종 또는 흑색종이다. 일부 구현예에서, 암은 소세포 폐암(SCLC: small cell lung cancer) 또는 신경모세포종이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 투여는 페이로드를 종양 세포로 전달한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 투여는 종양 성장을 억제한다.
일부 구현예에서, LNP 또는 약제학적 조성물은 비경구적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 투여되는 LNP 또는 약제학적 조성물은 종양내 및/또는 정맥내로 투여된다.
도 1a는 상이한 냉동 방지제로 스파이킹된 LNP 조성물의 동적 광산란 실험의 결과를 도시하는 그래프이다. 도 1b는 RiboGreen에 의해 측정된 이들 LNP 조성물의 캡슐화 효율을 도시하는 그래프이다.
도 2a는 농축 후 또는 투석 후 LNP 조성물의 동적 광 산란 실험의 결과를 도시하는 그래프이다. 도 2b는 RiboGreen에 의해 측정된 이들 LNP 조성물의 캡슐화 효율을 도시하는 그래프이다.
도 3a는 마우스에서 PEG-지질로서 PEG2k-DPG를 포함하는 LNP 조성물의 PK 연구의 결과를 도시하는 그래프이다. 도 3b는 마우스에서 PEG-지질로서 Brij S100을 포함하는 LNP 조성물의 PK 연구의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 4a는 본원 개시내용의 PEG-지질을 포함하는 LNP 조성물의 동적 광 산란 실험의 결과를 도시하는 그래프이다. 도 4b는 RiboGreen에 의해 측정된 이들 LNP 조성물의 캡슐화 효율을 도시하는 그래프이다.
도 5a는 본원 개시내용의 LNP 조성물의 반복 투여 시 종양의 성장을 보여주는 H446 마우스 종양 모델의 결과를 도시하는 그래프이다. 도 5b는 LNP 조성물의 투여 시 H446 마우스 종양 모델의 체중 변화를 도시하는 그래프이다.
도 6a는 본원 개시내용의 LNP 조성물의 반복 투여 시 종양의 성장을 보여주는 H446 마우스 종양 모델의 결과를 도시하는 그래프이다. 도 6b는 LNP 조성물의 투여 시 H446 마우스 종양 모델의 체중 변화를 도시하는 그래프이다.
도 7a는 Brij S100 또는 Myrj S40을 포함하는 LNP 조성물의 동적 광 산란 실험의 결과를 도시하는 그래프이다. 도 7b는 RiboGreen에 의해 측정된 이들 LNP 조성물의 캡슐화 효율을 도시하는 그래프이다.
도 8a 및 도 8c는 본원 개시내용의 LNP 조성물의 반복 투여 시 종양의 성장을 보여주는 SK-MEL-28 마우스 종양 모델의 결과를 도시한다. 도 8b 및 도 8d는 본원 개시내용의 LNP 조성물의 투여 시 SK-MEL-28 마우스 종양 모델의 체중 변화를 도시한다. 도 8e는 CVA21 복제에 대한 RT-qPCR 측정을 보여준다.
도 9는 LNP/피코나바이러스 RNA 조성물 및 작동 모드의 도식을 보여준다. LNP/피코나바이러스 RNA는 전신 투여되고 피코나바이러스 RNA 게놈은 그들이 복제하고 피코나바이러스 비리온을 생산하는 허용 종양 세포로 전달된다. 이어서, 피코나바이러스 감염은 종양 용해 및 항바이러스 면역 반응을 유발하는 이웃 종양 세포로 퍼진다.
도 10a 및 도 10b는 LNP 조성물의 동적 광산란 실험에서 측정된, 입자 크기(도 10a) 및 다분산도 지수(도 10b)를 도시한다. 도 10c는 RiboGreen에 의해 측정된 이들 LNP 조성물의 캡슐화 효율을 도시한다.
도 11a 및 도 11b는 접선 유동 여과(TFF)를 통해 또는 올리고-dT 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피를 통해 정제된 SVV-RNA를 캡슐화하는 LNP의 동적 광산란 실험에서 결정된 입자 크기(도 11a) 및 다분산도 지수(도 11b)를 도시한다. 도 11c는 RiboGreen에 의해 측정된 이들 LNP 조성물의 캡슐화 효율을 도시한다.
도 12a 및 도 12b는 다양한 RNA 산성화 완충액으로 제조된 CAT4 및 CAT5 LNP 조성물의 동적 광산란 실험에서 결정된 입자 크기(도 12a) 및 다분산도 지수(도 12b)를 도시한다. 도 12c는 RiboGreen에 의해 측정된 이들 LNP 조성물의 캡슐화 효율을 도시한다.
도 13a 및 도 13b는 LNP 조성물의 동적 광산란 실험에서 결정된, 입자 크기(도 13a) 및 다분산도 지수(도 13b)를 도시한다. 도 13c는 RiboGreen에 의해 측정된 이들 LNP 조성물의 캡슐화 효율을 도시한다.
도 14a는 -20℃에서 저장된 LNP 조성물의 동적 광산란 실험에서 결정된 입자 크기(좌측) 및 RiboGreen에 의해 측정된 캡슐화 효율(우측)을 도시한다.
도 14b는 -80℃에서 저장된 LNP 조성물의 동적 광산란 실험에서 결정된 입자 크기(좌측) 및 RiboGreen에 의해 측정된 캡슐화 효율(우측)을 도시한다.
도 15는 LNP 제형에 대한 제형화 공정의 도식을 보여준다.
도 16a, 도 16b 및 도 16c는 각각의 LNP 제형의 투여 96시간 후 NanoLuc 루시퍼라제 활성화에 의해 생성된 발광에 의해 측정된 RNA 수준을 도시한다.
도 16d, 도 16e 및 도 16f는 각각의 LNP 제형의 투여 72시간 후 NanoLuc 루시퍼라제 활성화에 의해 생성된 발광에 의해 측정된 RNA 수준을 도시한다.
도 17a-17e는 각각의 LNP 제형으로 처리된 마우스의 처리 경과일에 걸쳐 종양 용적(좌측) 및 체중 변화(우측)를 도시한다.
도 18a는 각각의 LNP 제형의 투여 72시간 후 NanoLuc 루시퍼라제 활성화에 의해 생성된 발광에 의해 측정된 RNA 수준을 도시한다. 도 18b는 각각의 LNP 제형으로 처리된 마우스의 처리 경과일에 걸쳐 종양 용적(우측) 및 체중 변화(좌측)를 도시한다.
도 19a-19e는 LC-MS에 의해 측정된 처리된 마우스의 혈장에서 LNP(SS-OC)에 포함된 이온화 가능한 지질의 농도를 도시한다.
도 20a-20d는 LC-MS에 의해 측정된 처리된 마우스의 혈장에서 LNP(SS-OC)에 포함된 이온화 가능한 지질의 농도를 도시한다.
도 21a-21f는 LC-MS에 의해 측정된 처리된 마우스의 혈장에서 LNP(SS-OC 또는 CAT7)에 포함된 이온화 가능한 지질의 농도를 도시한다.
도 22a-22e는 LC-MS에 의해 측정된 처리된 마우스의 혈장에서 LNP(SS-OC, CAT7 또는 CAT11)에 포함된 이온화 가능한 지질의 농도를 도시한다.
도 23a 및 도 23b는 ELISA 검정에 의해 측정된 각각의 LNP 제형으로 처리된 마우스의 나타낸 시점에서의 IgM 수준을 도시한다.
도 24a 및 도 24b는 ELISA 검정에 의해 측정된 각각의 LNP 제형으로 처리된 마우스의 나타낸 시점에서의 IgG 수준을 도시한다.
도 25a 및 도 25b는 ECL 검정에 의해 측정된 mRNA BiTE(도 25a) 또는 hEPO(도 25b)의 혈장 수준을 도시한다.
도 26은 CAT7을 포함하는 LNP에 대한 스크리닝 실험의 A-최적 디자인을 도시한다.
도 27은 CAT7을 포함하는 LNP에 대한 실험 수행의 디자인에 기초하고 자가-검증된 앙상블 모델링 방법을 사용하는 모델링된 예측 프로파일러를 보여준다.
정의
화학적 정의
본원에서 사용되는 용어 "지방족" 또는 "지방족 그룹"은 완전히 포화되거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유하는 직쇄(즉, 비분지형) 또는 분지형, 치환 또는 비치환 탄화수소 쇄, 또는 완전히 포화되었거나 하나 이상의 불포화 단위를 포함하지만 방향족이 아니고 분자의 나머지 부분에 단일 부착점을 갖는 모노사이클릭 탄화수소 또는 바이사이클릭 탄화수소(또한 본원에서는 "카보사이클", "지환족" 또는 "사이클로알킬"이라고도 칭함)를 의미한다. 달리 특정되지 않은 경우, 지방족 그룹은 1-6개의 지방족 탄소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 지방족 그룹은 1-5개의 지방족 탄소 원자를 함유한다. 다른 구현예에서, 지방족 그룹은 1-4개의 지방족 탄소 원자를 함유한다. 여전히 다른 구현예에서, 지방족 그룹은 1-3개의 지방족 탄소 원자를 함유하고, 또 다른 구현예에서, 지방족 그룹은 1-2개의 지방족 탄소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, "지환족"(또는 "카보사이클" 또는 "사이클로알킬")은 완전히 포화되거나 하나 이상의 불포화 단위를 포함하지만 방향족이 아니며 나머지 분자에 대한 단일 부착점을 갖는 모노사이클릭 C3-C6 탄화수소를 지칭한다. 적합한 지방족 그룹은 선형 또는 분지형, 치환되거나 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐 그룹 및 이들의 혼성체, 예를 들어, (사이클로알킬)알킬, (사이클로알케닐)알킬 또는 (사이클로알킬)알케닐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬"은 특정 수의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 비분지형 포화 탄화수소 그룹이다. 일부 구현예에서, 알킬은 3개의 탄소 원자 (C3)를 갖는 분지형 또는 비분지형 포화 탄화수소 그룹을 지칭한다. 일부 구현예에서, 알킬은 6개의 탄소 원자(C6)를 갖는 분지형 또는 비분지형 포화 탄화수소 그룹을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "알킬"은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, s-부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, s-펜틸, 네오펜틸 및 헥실을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "알킬렌"은 2가 알킬 그룹을 지칭한다. "알킬렌 쇄"는 폴리메틸렌 그룹, 즉 -(CH2)n-이고, 여기서 n은 양의 정수, 바람직하게는 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2 또는 2 내지 3이다. 치환된 알킬렌 쇄는 하나 이상의 메틸렌 수소 원자가 치환체로 대체된 폴리메틸렌 그룹이다. 적합한 치환체는 치환된 지방족 그룹에 대해 하기된 것들을 포함한다.
단독으로 또는 "아르알킬", "아르알콕시" 또는 "아릴옥시알킬"에서와 같이 보다 큰 모이어티의 일부로서 사용되는 용어 "아릴"은 총 5 내지 14개의 환 구성원을 갖는 모노사이클릭 및 바이사이클릭 환 시스템을 지칭하고, 여기서 시스템에서 적어도 하나의 환은 방향족이고 시스템에서 각각의 환은 3 내지 7개의 환 구성원을 포함한다. 용어 "아릴"은 용어 "아릴 환"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 본원 개시내용의 특정 구현예에서, "아릴"은 페닐, 바이페닐, 나프틸, 안트라실 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 방향족 환 시스템을 지칭하고, 이는 하나 이상의 치환기를 보유할 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "아릴"의 범위 내에는 인다닐, 프탈이미딜, 나프티미딜, 페난트리디닐 또는 테트라하이드로나프틸 등과 같은 방향족 환이 하나 이상의 비방향족 환과 융합된 그룹이 포함된다.
단독으로 또는 보다 큰 모이어티, 예를 들어, "헤테로아르알킬" 또는 "헤테로아르알콕시"의 일부로서 사용되는 용어 "헤테로아릴" 및 "헤테로아르-"는 5 내지 10개 환 원자, 바람직하게 5, 6, 또는 9개 환 원자를 갖고; 사이클릭 배열에서 공유되는 6, 10, 또는 14개 π 전자를 갖고; 탄소 원자 외에 1 내지 5개 헤테로원자를 갖는 그룹을 지칭한다. 용어 "헤테로원자"는 질소, 산소 또는 황을 지칭하고, 모든 산화 형태의 질소 또는 황, 및 모든 4급화된 형태의 염기성 질소를 포함한다. 헤테로아릴 그룹은, 제한 없이, 티에닐, 푸라닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 옥사디아졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 티아디아졸릴, 피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 인돌리지닐, 퓨리닐, 나프티리디닐 및 프테리디닐을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "헤테로아릴" 및 "헤테로아르-"는 또한 헤테로방향족 환이 하나 이상의 아릴, 지환족 또는 헤테로사이클릴 환에 융합된 그룹을 포함하고, 여기서 라디칼 또는 부착점은 헤테로방향족 환 상에 있다. 비제한적 예는 인돌릴, 이소인돌릴, 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 디벤조푸라닐, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤즈티아졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 4H-퀴놀리진일, 카바졸릴, 아크리디닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 및 피리도[2,3-b]-1,4-옥사진-3(4H)-온을 포함한다. 헤테로아릴 그룹은 모노- 또는 바이사이클릭일 수 있다. 용어 "헤테로아릴"은 용어 "헤테로아릴 환", "헤테로아릴 그룹" 또는 "헤테로방향족"과 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 이들 용어 중 임의의 것은 임의로 치환된 환을 포함한다. 용어 "헤테로아르알킬"은 헤테로아릴에 의해 치환된 알킬 그룹을 지칭하고, 여기서 알킬 및 헤테로아릴 부분은 독립적으로 임의로 치환된다.
용어 "할로지방족"은 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 지방족 그룹을 지칭한다.
용어 "할로알킬"은 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 직쇄 또는 분지형 알킬 그룹을 지칭한다.
용어 "할로겐"은 F, Cl, Br, 또는 I를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "헤테로사이클", "헤테로사이클릴", "헤테로사이클릭 라디칼" 및 "헤테로사이클릭 환"은 상호 교환적으로 사용되고, 포화 또는 부분 불포화되고 탄소 원자 외에 하나 이상, 바람직하게는 1 내지 4개의 상기 정의된 헤테로원자를 갖는 안정한 5 내지 7원 모노사이클릭 또는 7-10원 바이사이클릭 모이어티를 지칭한다. 헤테로사이클의 환 원자와 관련하여 사용될 때, 용어 "질소"는 치환된 질소를 포함한다. 예로서, 산소, 황 또는 질소로부터 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 포화되거나 부분적으로 불포화된 환에서, 질소는 N(3,4-디하이드로-2H-피롤릴에서와 같이), NH(피롤리디닐에서와 같이), 또는 +NR(TV-치환된 피롤리디닐에서와 같이)일 수 있다. 헤테로사이클릭 환은 안정한 구조를 생성하는 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서 이의 펜던트 그룹에 부착될 수 있고 임의의 환 원자는 임의로 치환될 수 있다. 이러한 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 라디칼의 예는, 제한 없이, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티오페닐 피롤리디닐, 피페리디닐, 피롤리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 데카하이드로퀴놀리닐, 옥사졸리디닐, 피페라지닐, 디옥사닐, 디옥솔라닐, 디아제피닐, 옥사제피닐, 티아제피닐, 모르폴리닐 및 퀴누클리디닐을 포함한다. "헤테로사이클", "헤테로사이클릴", "헤테로사이클릴 환", "헤테로사이클릭 그룹", "헤테로사이클릭 모이어티" 및 "헤테로사이클릭 라디칼"이라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 또한 헤테로사이클릴환이 하나 이상의 아릴, 헤테로아릴 또는 지환족 환, 예를 들어, 인돌리닐, 3H-인돌릴, 크로마닐, 페난트리디닐 또는 테트라하이드로퀴놀리닐과 융합되고, 여기서 라디칼 또는 부착점은 헤테로사이클릴 환 상에 있다. 헤테로사이클릴 그룹은 모노- 또는 바이사이클릭일 수 있다. 용어 "헤테로사이클릴알킬"은 헤테로사이클릴에 의해 치환된 알킬 그룹을 지칭하고, 여기서 알킬 및 헤테로사이클릴 부분은 임의로 치환된다.
헤테로사이클릭 환은 안정한 구조를 생성하는 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서 이의 펜던트 그룹에 의의 부착될 수 있고 임의의 환 원자는 임의로 치환될 수 있다. 이러한 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 라디칼의 예는, 제한 없이, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티오페닐 피롤리디닐, 피페리디닐, 피롤리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 데카하이드로퀴놀리닐, 옥사졸리디닐, 피페라지닐, 디옥사닐, 디옥솔라닐, 디아제피닐, 옥사제피닐, 티아제피닐, 모르폴리닐 및 퀴누클리디닐을 포함한다. "헤테로사이클", "헤테로사이클릴", "헤테로사이클릴 환", "헤테로사이클릭 그룹", "헤테로사이클릭 모이어티" 및 "헤테로사이클릭 라디칼"이라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 또한 헤테로사이클릴환이 하나 이상의 아릴, 헤테로아릴 또는 지환족 환, 예를 들어, 인돌리닐, 3H-인돌릴, 크로마닐, 페난트리디닐 또는 테트라하이드로퀴놀리닐과 융합되고, 여기서 라디칼 또는 부착점은 헤테로사이클릴 환 상에 있다. 헤테로사이클릴 그룹은 모노- 또는 바이사이클릭일 수 있다. 용어 "헤테로사이클릴알킬"은 헤테로사이클릴에 의해 치환된 알킬 그룹을 지칭하고, 여기서 알킬 및 헤테로사이클릴 부분은 임의로 치환된다.
본원에 기재된 바와 같이, 본원 개시내용의 화합물은 "임의로 치환된" 모이어티를 포함할 수 있다. 일반적으로, "임의로"라는 용어가 선행되든 아니든 "치환된"이라는 용어는 지정된 모이어티의 하나 이상의 수소가 적합한 치환체로 대체됨을 의미한다. 달리 명시되지 않는 경우, "임의로 치환된" 그룹은 그룹의 치환 가능한 각 위치에 적합한 치환체를 가질 수 있고, 임의의 소정의 구조에서 하나 이상의 위치가 특정 그룹으로부터 선택된 하나 초과의 치환체로 치환될 수 있는 경우, 치환체는 모든 위치에서 동일하거나 상이할 수 있다. 본원 개시내용에 의해 예상되는 치환체의 조합은 바람직하게는 안정하거나 화학적으로 실현가능한 화합물을 형성하는 것들이다. 본원에서 사용되는 용어 "안정한"은 화합물의 생성, 검출, 및 특정 구현예에서 화합물의 회수, 정제 및 본원에 기재된 하나 이상의 목적을 위한 사용을 허용하는 조건에 적용되었을 때 실질적으로 변경되지 않는 화합물을 지칭한다.
"임의로 치환된" 그룹의 치환 가능한 탄소 원자 상에 적합한 1가 치환체는 독립적으로 할로겐; ―(CH2)0-4Ro; ―(CH2)0-4ORo; ―O(CH2)0-4Ro, ―O―(CH2)0-4C(O)ORo; ―(CH2)0-4CH(ORo)2; ―(CH2)0-4SRo; Ro로 치환될 수 있는 ―(CH2)0-4Ph; Ro로 치환될 수 있는 -(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph; Ro로 치환될 수 있는 ―CH=CHPh; Ro로 치환될 수 있는 ―(CH2)0-4O(CH2)0-1-피리딜; ―NO2; ―CN; ―N3; ―(CH2)0-4N(Ro)2; ―(CH2)0-4N(Ro)C(O)Ro; ―N(Ro)C(S)Ro; ―(CH2)0-4N(Ro)C(O)NRo 2; ―N(Ro)C(S)NRo 2; ―(CH2)0-4N(Ro)C(O)ORo; ―N(Ro)N(Ro)C(O)Ro; ―N(Ro)N(Ro)C(O)NRo 2; ―N(Ro)N(Ro)C(O)ORo; ―(CH2)0-4C(O)Ro; ―C(S)Ro; ―(CH2)0-4C(O)ORo; ―(CH2)0-4C(O)SRo; ―(CH2)0-4C(O)OSiRo 3; ―(CH2)0-4OC(O)Ro; ―OC(O)(CH2)0-4SRo, SC(S)SRo; ―(CH2)0-4SC(O)Ro; ―(CH2)0-4C(O)NRo 2; ―C(S)NRo 2; ―C(S)SRo; ―SC(S)SRo, ―(CH2)0-4OC(O)NRo 2; ―C(O)N(ORo)Ro; ―C(O)C(O)Ro; ―C(O)CH2C(O)Ro; ―C(NORo)Ro; ―(CH2)0-4SSRo; ―(CH2)0-4S(O)2Ro; ―(CH2)0-4S(O)2ORo; ―(CH2)0-4OS(O)2Ro; ―S(O)2NRo 2; ―(CH2)0-4S(O)Ro; ―N(Ro)S(O)2NRo 2; ―N(Ro)S(O)2Ro; ―N(ORo)Ro; ―C(NH)NRo 2; ―P(O)2Ro; ―P(O)Ro 2; ―OP(O)Ro 2; ―OP(O)(ORo)2; SiRo 3; ―(C1-4　직쇄 또는 분지형 알킬렌)O―N(Ro)2; 또는 ―(C1-4직쇄 또는 분지형 알킬렌)C(O)O―N(Ro)2이고, 여기서 각각의 Ro는 아래 정의된 바와 같이 치환될 수 있고 독립적으로 수소, C1-6 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1PH, -CH2-(5-6원 헤테로아릴 환) 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 포화, 부분 불포화 또는 아릴 환, 또는 위의 정의에도 불구하고 2개의 독립적으로 존재하는 Ro가 개재 원자(들)와 함께 하기에 정의된 바와 같이 치환될 수 있는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 3-12-원 포화, 부분 불포화 또는 아릴 모노- 또는 바이사이클릭 환을 형성한다.
Ro(이들 개재 원자들과 함께 2개의 독립적으로 존재하는 Ro에 의해 형성되는 환) 상의 적합한 1가 치환체는 독립적으로 할로겐, ―(CH2)0-2R●, -(할로R●), ―(CH2)0-2OH, ―(CH2)0-2OR●, ―(CH2)0-2CH(OR●)2; ―O(할로R●), ―CN, ―N3, ―(CH2)0-2C(O)R●, ―(CH2)0-2C(O)OH, ―(CH2)0-2C(O)OR●, ―(CH2)0-2SR●, ―(CH2)0-2SH, ―(CH2)0-2NH2, ―(CH2)0-2NHR●, ―(CH2)0-2NR● 2, ―NO2, ―SiR● 3, ―OSiR● 3, ―C(O)SR●, ―(C1-4　직쇄 또는 분지형 알킬렌)C(O)OR●, 또는 ―SSR●이고. 여기서 각각의 R●는 비치환되거나 "할로"가 선행되는 경우 단지 하나 이상의 할로겐으로 치환되고, 독립적으로 C1-4　지방족, ―CH2Ph, ―O(CH2)0-1Ph, 또는 5-6-원 포화, 부분 불포화, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 임의의 아릴로부터 선택된다. R의 포화 탄소 원자 상의 적합한 2가 치환체는 =O 및 =S를 포함한다.
"임의로 치환된" 그룹의 포화 탄소 원자 상의 적합한 2가 치환체는 하기를 포함한다: =O, =S, =NNR*2, =NNHC(O)R*, =NNHC(O)OR*, =NNHS(O)2R*, =NR*, =NOR*, ―O(C(R*2))2-3O―, 또는 ―S(C(R*2))2-3S―이고, 각각 독립적으로 존재하는 R*는 수소, 하기 정의된 바와 같이 치환될 수 있는 C1-6　지방족, 비치환된 5-6원 포화, 부분 불포화, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-4개의 헤테로원자를 갖는 아릴 환으로부터 선택된다. "임의로 치환된" 그룹의 인접한 치환 가능한 탄소에 결합된 적합한 2가 치환체는 ―O(CR*2)2-3O―를 포함하고, 여기서 각각 독립적으로 존재하는 R*은 수소, 하기 정의된 바와 같이 치환될 수 있는 C1-6　지방족, 비치환된 5-6원 포화, 부분 불포화, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-4개의 헤테로원자를 갖는 아릴 환으로부터 선택된다.
R*의 지방족 그룹 상의 적합한 치환체는 할로겐, ―R●, -(할로R●), ―OH, ―OR●, ―O(할로R●), ―CN, ―C(O)OH, ―C(O)OR●, ―NH2, ―NHR●, ―NR● 2, 또는 ―NO2를 포함하고, 여기서 각각의 R●는 비치환되거나 "할로"가 선행하는 경우 단지 하나 이상의 할로겐으로 치환되고, 독립적으로 C1-4　지방족 ―CH2Ph, ―O(CH2)0-1Ph, 또는 5-6원 포화, 부분 불포화 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 아릴 환이다.
"임의로 치환된" 그룹의 치환 가능한 질소 상의 적합한 치환체는 ―R†, ―NR† 2, ―C(O)R†, ―C(O)OR†, ―C(O)C(O)R†, ―C(O)CH2C(O)R†, ―S(O)2R†, ―S(O)2NR† 2, ―C(S)NR† 2, ―C(NH)NR† 2, 또는 ―N(R†)S(O)2R†을 포함하고; 여기서 각각의 R†는 독립적으로 수소, 하기 정의된 바와 같이 치환될 수 있고 비치환된 -OPh 또는 비치환된 5-6원 포화, 부분 불포화된 C1-6　지방족, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 아릴 환이거나, 상기 정의에도 불구하고, 2개의 독립적으로 존재하는 R†는 이들의 개재 원자(들)과 함께 비치환된 3-12원 포화, 부분 불포화, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 아릴 모노- 또는 바이사이클릭 환을 형성한다.
R†의 지방족 그룹 상의 적합한 치환체는 독립적으로 할로겐, ―R●, -(할로R●), ―OH, ―OR●, ―O(할로R●), ―CN, ―C(O)OH, ―C(O)OR●, ―NH2, ―NHR●, ―NR● 2, 또는 ―NO2이고, 여기서 각각의 R●은 비치환되거나 "할로"가 선행하는 경우 단지 하나 이상의 할로겐으로 치환되고, 독립적으로 C1-4　지방족 ―CH2Ph, ―O(CH2)0-1Ph, 또는 5-6원 포화, 부분 불포화 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 아릴 환이다.
본원에 사용된 바와 같은 "부분 불포화"라는 용어는 적어도 하나의 이중 또는 삼중 결합을 포함하는 환 모이어티를 지칭한다. "부분 불포화"라는 용어는 다중 불포화 부위를 갖는 환을 포함하는 것으로 의도되지만 본원에서 정의된 바와 같은 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 "약제학적으로 허용되는 염"이라는 용어는 적절한 의학적 판단의 범주 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 사람 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 적정한 이득/위험 비율에 맞는 염을 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 염은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들면 S. M. 버지(Berge) 등은 약제학적으로 허용되는 염을 문헌[J. Pharmaceutical Sciences, 1977: 66 (1-19)]에서 기재하고 있고, 이는 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 적합한 무기 및 유기산 및 염기로부터 유래된 것들을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염의 예로는 무기산, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산을 사용하거나, 유기산, 예를 들어, 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론산을 사용하거나, 당업계에 사용된 다른 방법, 예를 들어, 이온 교환을 사용하여 형성된 아미노 그룹의 염인 비독성 산 부가 염이다. 기타 약제학적으로 허용되는 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이술페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실술페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 히드로요오다이드, 2-히드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 술페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다.
적절한 염기로부터 유래된 염은 알칼리 금속, 알칼린 토금속, 암모늄 및 N(C1-4알킬)4 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 추가의 약제학적으로 허용되는 염은, 적절한 경우 비독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 반대이온, 예를 들어, 할라이드, 히드록시드, 카복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 저급 알킬 설포네이트 및 아릴 설포네이트를 사용하여 형성된 아민 양이온을 포함한다.
"약제학적으로 허용되는 유도체"는 수용자에게 투여 시 직접 또는 간접적으로 본원 개시내용의 화합물 또는 이의 활성 대사물 또는 잔기를 제공할 수 있는 본원 개시내용의 화합물의 비독성 염, 에스테르, 에스테르 염 또는 기타 유도체를 의미한다.
"3급 아민"이라는 용어는 3개의 탄소-함유 그룹에 부착된 아민(질소 원자)을 기재하는 데 사용되고, 각 그룹은 그룹 내의 탄소 원자를 통해 아민 그룹에 공유 결합된다. 3급 아민은 양성자화되거나 루이스 산과 착물을 형성할 수 있다.
본원에서 변수의 임의의 정의에서 화학적 그룹의 목록의 언급은 단일 그룹 또는 열거된 그룹의 조합으로서 상기 변수의 정의를 포함한다. 본원의 변수에 대한 구현예의 언급은 임의의 단일 구현예 또는 임의의 다른 구현예 또는 이의 일부와 조합된 구현예를 포함한다.
달리 명시하지 않는 한, 본원에 묘사된 구조는 또한 구조의 모든 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 및 기하학적(또는 형태적) 형태; 예를 들어 각 비대칭 중심의 R 및 S 형태, Z 및 E 이중 결합 이성질체, Z 및 E 형태 이성질체 등을 포함함을 의미한다. 따라서, 본원의 화합물의 단일 입체화학적 이성질체 및 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 및 기하학적(또는 입체형태) 혼합물도 본원 개시내용의 범위 내에 있다. 달리 명시되지 않는 경우, 본원 개시내용의 화합물의 모든 호변이성체 형태는 본원 개시내용의 범위 내에 있다.
기타 정의
본원 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 단수 형태 "a," "an," 및 "the"는 내용이 달리 명백하게 나타내지 않는 경우 복수의 언급을 포함한다.
"약"이라는 용어는 본원에서 대략, 또는 주변 영역에서, 대략적으로를 의미하는 데 사용된다. "약"이라는 용어가 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 제시된 수치 값의 위와 아래로 경계를 확장하여 해당 범위를 변경한다. 따라서, 용어 "약"은 당업계에서 허용되는 수준에 따라 달라지는 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다. 일부 구현예에서, 상기 변화는 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 많이 다양할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 변화는 참조 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 10% 정도로 많이 다양할 수 있다.
"가속화된 혈액 소거" 또는 "ABC"라는 용어는 특정 약제학적 제제(예를 들어, PEG 함유 LNP)가 두 번째 및 후속 투여 시 혈액으로부터 빠르게 소거되는 현상을 지칭한다. ABC는 리포좀 및 LNP를 포함하는 많은 지질-전달 비히클에 대해 관찰되었다.
본원에서 용어 "투여"는 대상체에게 조성물을 도입하거나 조성물을 세포 및/또는 조직과 접촉시키는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "및/또는"은 달리 명시되지 않는 한 본원 개시내용에서 "및" 또는 "또는"으로 사용된다.
"항체"라는 용어는 면역글로불린(Ig) 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 하나의 에피토프 인지 부위를 통해 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질 또는 폴리펩타이드와 같은 특정 표적에 결합할 수 있는 Ig 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 용어는 온전한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 천연 면역글로불린 분자는 2개의 중쇄 폴리펩타이드와 2개의 경쇄 폴리펩타이드로 구성된다. 각각의 중쇄 폴리펩타이드는 중쇄와 경쇄 폴리펩타이드 사이의 쇄간 이황화 결합에 의해 경쇄 폴리펩티드와 연합하여 2개의 이종이량체 단백질 또는 폴리펩타이드(즉, 2개의 이종 폴리펩타이드 쇄로 구성된 단백질)를 형성한다. 이어서, 2개의 이종이량체 단백질은 중쇄 폴리펩타이드 사이의 추가 쇄간 디설파이드 결합에 의해 연합하여 면역글로불린 단백질 또는 폴리펩타이드를 형성한다.
"암"이라는 용어는 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서 생리학적 병태를 지칭하거나 기재한다.
본원에 사용된 용어 "조합", "조합된" 및 관련 용어는 본원 개시내용에 따른 치료학적 제제의 동시 또는 순차적 투여를 지칭한다. 예를 들어, 본원 개시내용의 화합물은 별도의 유닛 투여 형태로 또는 단일 유닛 투여 형태로 함께 다른 치료학적 제제와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 따라서, 본원 개시내용은 제공된 화합물, 추가의 치료학적 제제, 및 악제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 비히클을 포함하는 단일 유닛 투여 형태를 제공한다.　
본원에서 사용된 용어 "생물학적 샘플"은, 제한 없이, 세포 배양물 또는 이의 추출물; 포유동물로부터 수득된 생검 물질 또는 이의 추출물; 혈액, 타액, 소변, 대변, 정액, 눈물 또는 기타 체액 또는 그 추출물을 포함한다. 상기 목적의 예는 수혈, 장기 이식, 생물학적 검체 보관, 및 생물학적 검정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 표현 "투약 단위 형태"는 치료할 환자에게 적합한 물리적으로 분리된 단위의 제제를 지칭한다. 그러나, 본원 개시내용의 화합물 및 조성물의 1일 총 사용량은 주치의에 의하여 적절한 의학적 판단의 범주 내에서 결정된다. 임의의 특정 환자에 대한 구체적인 유효 용량 수준은 치료할 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 특정 화합물의 활성; 사용된 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로 및 사용된 특졍한 화합물의 배출 속도; 치료의 기간; 사용된 특정 화합물과 조합하여 또는 동시에 사용되는 약물; 의학 분야에 널리 공지된 유사 요인들을 포함한 다양한 인자들에 따라 다양할 것이다.
"캡슐화 효율" 또는 "EE %"라는 용어는 LNP에 성공적으로 포집된 페이로드의 비율을 지칭한다. 일부 구현예에서, 캡슐화 효율은 다음 식을 사용하여 계산될 수 있다.
여기서, Wt는 LNP 현탁액 중에 약물의 총 양이고 Wi는 제조 동안에 처음에 투여되는 약물의 총 양이다. 예시적인 예로서, 초기에 조성물에 제공된 총 100 mg의 페이로드 분자 중 97 mg의 페이로드 분자가 LNP에 포집되는 경우, 캡슐화 효율은 97%로 주어질 수 있다.
"반감기"라는 용어는 페이로드 분자(예를 들어, 지질 나노입자에 캡슐화된 페이로드 분자)의 약동학적 성질을 지칭한다. 반감기는 투여 후, 대상체의 신체(예를 들어, 사람 환자 또는 기타 포유류)로부터 또는 이의 특정 구획으로부터, 예를 들어, 혈청에서 즉, 순환계 반감기 또는 기타 조직에서 생체 내에서 공지된 양의 페이로드 분자의 50 퍼센트(50%)를 생물학적 공정(예를 들어, 대사, 배설, 혈액 소거 가속화 등)을 통해 제거하는 데 필요한 시간으로 표현될 수 있다. 일반적으로, 반감기의 증가는 투여된 페이로드 분자의 순환계 내 평균 체류 시간(MRT)의 증가를 초래한다.
"지질-질소-대-포스페이트 비율" 또는 "(N:P)"라는 용어는 지질 나노입자 내 양으로 하전 가능한 지질 아민 그룹 대 핵산 포스페이트 그룹의 비율을 지칭한다.
본원에 사용된 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 의미하고, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 염기의 단일 또는 이중 가닥 중합체 또는 올리고머를 포함한다. 핵산은 또한 단편과 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드", "핵산 서열", "뉴클레오타이드 서열" 및 "핵산 단편"은 임의로 합성, 비천연 또는 변경된 뉴클레오타이드 염기를 함유하는 단일- 또는 이중 가닥인 RNA 및/또는 DNA의 중합체 또는 올리고머를 나타내기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 뉴클레오타이드(일반적으로 5'-모노포스페이트 형태로 발견됨)는 당업계에 통상적으로 알려진 그들의 단일 문자 표시로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 또 다른 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 유래되는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 "모계" 또는 "참조" 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은 당업계에 잘 알려진 경로를 사용하여 투여될 때 일반적으로 알레르기 또는 기타 심각한 부작용을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 동물, 특히 사람에 사용하기 위해 일반적으로 인정되는 기타 약전에 등재된 분자 실체 및 조성물은 "약제학적으로 허용되는" 것으로 간주된다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 또는 비히클"은 이것이 제형화된 화합물(들)의 약리학적 활성을 파괴하지 않는 비독성 담체, 보조제 또는 비히클을 지칭한다. 본원에 개시된 화합물의 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 비히클은 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예를 들어, 사람 혈청 알부민, 완충 물질, 예를 들어, 포스페이트, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들어 황산프로타민, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연염, 콜로이드 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스 기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모 지방을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 지칭되는 "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 중합체를 의미한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA이거나 변형된 전령 RNA, 전달 RNA 및 소형 RNA를 포함하는 뉴클레오타이드 중 어느 하나의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형은 브로모우리딘과 같은 염기 변형, 아라비노사이드 및 2',3'-디데옥시리보스와 같은 리보스 변형 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐라데이트 및 포스포로아미데이트와 같은 뉴클레오타이드간 연결 변형을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 DNA를 지칭할 때 단일 가닥 및 이중 가닥 형태를 포함한다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 공유 결합된 아미노산의 단일, 선형 및 연속 배열을 지칭한다. 폴리펩타이드는 하나 이상의 쇄내 디설파이드 결합을 형성할 수 있다.
본원에서 사용되는 "예방"은 질환 증상의 완전한 예방, 질환 증상의 발병 지연, 또는 후속적으로 발병되는 질환 증상의 중증도 감소를 의미할 수 있다. 전형적으로, 반드시 그런 것은 아니지만, 예방학적 용량은 질환의 이전 단계 또는 초기 단계에서 대상체에서 사용되기 때문에 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적다.
치료 방법에 대한 "반응"은 음성 증상의 감소 또는 개선, 질환 또는 이의 증상의 진행 감소, 유익한 증상 또는 임상 결과의 증가, 부작용의 감소, 질환의 안정화, 특히 질환의 부분적 또는 완전한 치료를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성"은 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 사이 또는 2개 이상의 폴리펩타이드 서열 사이의 관계를 지칭한다. 하나의 서열의 위치가 비교 서열의 상응하는 위치에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기에 의해 점유되는 경우, 서열은 해당 위치에서 "동일한"것으로 일컬어진다. 서열 동일성 퍼센트는 2개 서열 둘 다에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 수를 결정하여 동일한 위치의 수를 산출함으로써 계산된다. 이어서 동일한 위치의 수를 비교 창의 총 위치 수로 나누고 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 산출한다. 서열 동일성의 퍼센트는 비교 윈도우 사에 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함에 의해 결정된다. 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 비교 창은, 예를 들어 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 이상의 핵산 길이일 수 있다. 폴리펩타이드 서열에 대한 비교 창은, 예를 들어 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300개 이상의 아미노산 길이일 수 있다. 비교를 위해 서열을 최적으로 정렬하기 위해, 비교 창의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 일부는 참조 서열이 일정하게 유지되는 동안 갭이라고 불리는 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 최적의 정렬은 갭이 있더라도 참조 서열과 비교 서열 사이에 가능한 최대 수의 "동일한" 위치를 생성하는 정렬이다. 2개 서열 사이의 "서열 동일성" 퍼센트는 2004년 9월 1일 현재 국립 생명공학 정보 센터에서 이용 가능한 "BLAST 2 서열" 프로그램 버전을 사용하여 결정할 수 있고, 상기 프로그램에는 프로그램 BLASTN(뉴클레오타이드 서열 비교용) 및 BLASTP(폴리펩타이드 서열 비교용)가 포함되고, 이러한 프로그램은 카를린(Karlin) 및 알트슐(Altschul)(참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993)의 알고리즘을 기반으로 한다. "BLAST 2 서열"을 활용하는 경우, 2004년 9월 1일 현재 디폴트 파라미터였던 파라미터를 워드 크기(3), 개방 갭 페널티(11), 연장 갭 페널티(1), 갭 드랍오프(50), 예상값(10) 및 매트릭스 옵션을 포함하되 이에 제한되지 않는 임의의 기타 요구되는 파라미터에 대해 사용될 수 있다. 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 "실질적으로 유사한 서열 동일성"을 갖거나 2개 서열이 서로에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 "실질적으로 동일한"것으로 간주된다.
투여가 고려되는 용어 "대상체" 또는 "환자"는 사람(즉, 임의의 연령 그룹의 남성 또는 여성, 예를 들어 소아 대상체(예를 들어, 유아, 어린이, 청소년) 또는 성인 대상체(예를 들어, 젊은 성인, 중년 성인 또는 노년 성인)) 및/또는 다른 영장류(예를 들어, 시노몰구스 몽키, 레서스 몽키); 소, 돼지, 말, 양, 염소, 고양이 및/또는 개와 같은 상업적으로 관련된 포유류를 포함한 포유류; 및/또는 닭, 오리, 거위, 메추라기 및/또는 칠면조와 같은 상업적으로 관련된 조류를 포함한 조류를 포함하지만 이에 제한되지 않는 것으로 고려된다. 바람직한 대상체는 사람이다.
본원에 사용된 "치료학적 유효량"은 목적하는 생물학적 반응을 유발하는 물질(예를 들어, 치료학적 제제, 조성물 및/또는 제형)의 양을 의미한다. 일부 구현예에서, 물질의 치료학적 유효량은 질환, 장애 및/또는 병태를 앓고 있거나 이에 민감한 대상체에게 투여 용법의 일부로 투여될 때 질환, 장애 및/또는 병태의 발병을 치료하고/하거나 진단하기에 충분한 양이다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 물질의 유효량은 목적하는 생물학적 평가변수, 전달될 물질, 표적 세포 또는 조직 등과 같은 요인에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 LNP 및 이의 조성물의 치료학적 유효량은 치료할 병태, 병태의 중증도 및 경과, LNP 또는 이의 조성물이 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 치료 요법, 대상체의 임상 이력 및 사용된 LNP 또는 이의 조성에 대한 반응, 주치의의 재량에 따라 다양하다. 일부 구현예에서, 질환, 장애, 및/또는 병태를 치료하기 위해 제공된 LNP 또는 이의 조성물의 유효량은 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특성을 완화시키고, 개선시키고, 경감시키고, 중증도를 감소시키고/시키거나 발병률을 감소시키는 양이다. 일부 구현예에서, "치료학적 유효량"은 적어도 제공된 화합물, 또는 제공된 화합물을 함유하는 조성물의 최소량이고, 이는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하는 데 충분하다.
용어 "치료한다", "치료" 또는 "치료하는"은 질환(예를 들어, 본원에 기재된 질환 또는 장애)의 발병 또는 진행을 감소, 억제, 약화, 감소, 정지 또는 안정화시키고, 질환의 중증도를 감소시키거나 질환과 연관된 증상을 개선시키는 것을 의미한다. 치료는 질환, 장애 또는 병태의 증상을 치료함을 포함한다. 원치 않는 병태(예를 들어, 대상체의 질환 또는 다른 원치않는 상태)의 임상적 증상 전에 투여되는 경우, 치료는 예방학적(즉, 이것은 원치않는 병태의 발병으로부터 대상체를 보호한다)이고, 반면, 원치않는 병태의 증상 후 투여되는 경우, 치료는 치료학적(즉, 이것은 기존의 원치 않는 병태 또는 이의 부작용을 감소시키거나, 완화시키거나 안정화시키기 위해 의도된다)이다.
본원에 사용된 용어 "변이체" 또는 "변이체들"은 참조 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 서열과 상이하지만 모계 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 필수 성질을 유지하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일반적으로, 변이체 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열은 전체적으로 매우 유사하고, 많은 영역에서 모계 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 동일하다. 예를 들어, 변이체 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 모계 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 서열 동일성을 나타낼 수 있다.
화합물
화학식 I의 화합물
다양한 구현예에서, 본원에서는 화학식 I의 화합물이 제공된다:
화학식 I
상기 식에서:
A는 -N(CH2RN1)(CH2RN2) 또는 적어도 하나의 N을 함유하는 4-7원 헤테로사이클릴 환이고, 여기서 4-7원 헤테로사이클릴 환은 0-6개의 R3으로 임의로 치환되고;
각각의 X는 독립적으로 -O-, -N(R1)-, 또는 -N(R2)-이고;
R1은 임의로 치환된 C1-C31 지방족 및 스테로이딜로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 임의로 치환된 C1-C31 지방족 및 스테로이딜로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 임의로 치환된 C1-C6 지방족이고;
RN1 및 RN2는 각각 독립적으로 수소, 하이드록시-C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 또는 C3-C7 사이클로알킬이고;
L1은 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 쇄 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L2는 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 쇄 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L3은 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌 쇄, 또는 임의로 치환된 2가 C3-C7 사이클로알킬렌이고;
일부 구현예에서, A가 -N(CH3)(CH3)이고 X가 O인 경우, L3은 C1-C6 알킬렌 쇄가 아니다.
일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 화학식 I-a의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다:
화학식 I-a
상기 식에서, m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다.
일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 화학식 I-b의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다:
화학식 I-b
상기 식에서, n은 0, 1, 2, 또는 3이고; m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다.
일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 화학식 I-bi의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다:
화학식 I-bi
일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 화학식 I-bii의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다:
화학식 I-bii
상기 식에서, m은 0, 1, 2 또는 3이고; p 및 q는 각각 0, 1, 2, 또는 3이고, 여기서 q + p는 3 이하이다.
일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 화학식 I-biii의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다:
화학식 I-biii
일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 화학식 I-c의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다:
화학식 I-c
일부 구현예에서, A는 -N(CH2RN1)(CH2RN2) 또는 적어도 하나의 N을 함유하는 임의로 치환된 4-7원 헤테로사이클릴 환이다.
일부 구현예에서, A는 -N(CH2RN1)(CH2RN2)이다. 일부 구현예에서, RN1 및 RN2는 각각 독립적으로 수소, 하이드록시-C1-C3 알킬렌, C2-C4 알케닐, 또는 C3-C4 사이클로알킬로부터 선택된다.
일부 구현예에서, RN1 및 RN2는 각각 독리적으로 수소, -CH2CH=CH2, -CH2CH2OH, , 또는 로부터 선택된다. 일부 구현예에서, RN1 및 RN2는 동일하다. 일부 구현예에서, RN1 및 RN2는 각각 수소이다. 일부 구현예에서, RN1 및 RN2는 각각 C2-C4 알케닐, 예를 들어, -CH2CH=CH2이다. 일부 구현예에서, RN1 및 RN2는 각각 하이드록시-C1-C3 알킬렌, 예를 들어, -CH2CH2OH이다. 일부 구현예에서, RN1 및 RN2는 상이하다. 일부 구현예에서, RN1 및 RN2 중 하나는 수소이고 다른 하나는 C3-C4 사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, RN1 및 RN2 중 하나는수소이고 다른 하나는 이다.
일부 구현예에서, A는 적어도 하나의 N을 함유하는 임의로 치환된 4-7원 헤테로사이클릴 환이다. 일부 구현예에서, A는 정확하게 하나의 N을 함유하는 임의로 치환된 4-7원 헤테로사이클릴 환이다. 일부 구현예에서, A는 적어도 하나의 N을 함유하는 치환된 4-7원 헤테로사이클릴 환이다. 일부 구현예에서, A는 정확하게 하나의 N을 함유하는 비치환된 4-7원 헤테로사이클릴 환이다. 일부 구현예에서, A는 적어도 하나의 N을 함유하는 임의로 치환된 5-6원 헤테로사이클릴 환이다. 일부 구현예에서, A는 적어도 하나의 N을 함유하는 비치환된 5-6원 헤테로사이클릴 환이다.
일부 구현예에서, A는 적어도 하나의 N을 함유하는 임의로 치환된 4-7원 헤테로사이클릴 환이고, A의 N 원자는 3급 아민이다.
일부 구현예에서, A는 적어도 하나의 N을 함유하고, 추가로 하나 이상의 S를 함유하는 임의로 치환된 4-7원 헤테로사이클릴 환이다. 일부 구현예에서, A는 적어도 하나의 N을 함유하고, 추가로 정확하게 하나의 S를 함유하는 임의로 치환된 4-7원 헤테로사이클릴 환이다.
일부 구현예에서, A는 아제티딘, 피롤리딘, 피페리딘, 아제판 및 티오모르폴린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, A는 피롤리딘 및 피페리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, L1은 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 쇄 및 임의로 치환된 2가의 C1-C20 알케닐렌 쇄로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, L2는 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 쇄 및 임의로 치환된 2가의 C1-C20 알케닐렌 쇄로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, L1은 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 쇄이다. 일부 구현예에서, L2는 C1-C20 알킬렌 쇄이다.
일부 구현예에서, L1 및 L2는 동일하다. 일부 구현예에서, L1 및 L2는 상이하다.
일부 구현예에서, L1은 임의로 치환된 C1-C10 알킬렌 쇄이다. 일부 구현예에서, L2는 임의로 치환된 C1-C10 알킬렌 쇄이다. 일부 구현예에서, L1은 임의로 치환된 C1-C5 알킬렌 쇄이다. 일부 구현예에서, L2는 임의로 치환된 C1-C5 알킬렌 쇄이다.
일부 구현예에서, L1 및 L2는 각각 -CH2CH2CH2CH2-이다. 일부 구현예에서, L1 및 L2는 각각 -CH2CH2CH2-이다. 일부 구현예에서, L1 및 L2는 각각 -CH2CH2-이다.
일부 구현예에서, L3은 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌 쇄, 또는 임의로 치환된 2가 C3-C6 사이클로알킬렌이다. 일부 구현예에서, L3은 결합이다. 일부 구현예에서, L3은 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌 쇄이다. 일부 구현예에서, L3은 임의로 치환된 C1-C3 알킬렌 쇄이다. 일부 구현예에서, L3은 비치환된 C1-C3 알킬렌 쇄이다. 일부 구현예에서, L3은 -CH2-이다. 일부 구현예에서, L3은 -CH2CH2-이다. 일부 구현예에서, L3은 -CH2CH2CH2-이다. 일부 구현예에서, L3은 2가 C3-C6 사이클로알킬렌이다. 일부 구현예에서, L3은 이다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 티올레이트의 S와 A의 N 사이의 탄소 원자 수는 2-10이다. 일부 구현예에서, 화학식 I의 티올레이트의 S와 A의 N 사이의 탄소 원자 수는 2-8이다. 일부 구현예에서, 화학식 I의 티올레이트의 S와 A의 N 사이의 탄소 원자 수는 2-5이다. 일부 구현예에서, 화학식 I의 티올레이트의 S와 A의 N 사이의 탄소 원자 수는 2-4이다. 일부 구현예에서, 화학식 I의 티올레이트의 S와 A의 N 사이의 탄소 원자 수는 2이다. 일부 구현예에서, 화학식 I의 티올레이트의 S와 A의 N 사이의 탄소 원자 수는 3이다. 일부 구현예에서, 화학식 I의 티올레이트의 S와 A의 N 사이의 탄소 원자 수는 4이다.
일부 구현예에서, R1은 임의로 치환된 C1-C31 지방족 및 임의로 치환된 스테로이딜로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, R2는 임의로 치환된 C1-C31 지방족 및 임의로 치환된 스테로이딜로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, R1은 임의로 치환된 C1-C31 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 임의로 치환된 C1-C31 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 임의로 치환된 C5-C25 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 임의로 치환된 C5-C25 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 임의로 치환된 C10-C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 임의로 치환된 C10-C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 임의로 치환된 C10-C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 임의로 치환된 C10-C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 비치환된 C10-C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 비치환된 C10-C20 알킬이다.
일부 구현예에서, R1은 임의로 치환된 C14-C16 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 임의로 치환된 C14-C16 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 비치환된 C14-C16 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 비치환된 C14-C16 알킬이다.
일부 구현예에서, R1은 임의로 치환된 분지형 C3-C31 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 임의로 치환된 분지형 C3-C31 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 임의로 치환된 분지형 C10-C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 임의로 치환된 분지형 C10-C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 임의로 치환된 분지형 C14-C16 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 임의로 치환된 분지형 C14-C16 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 치환된 분지형 C3-C31 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 치환된 분지형 C3-C31 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 치환된 분지형 C10-C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 치환된 분지형 C10-C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 치환된 분지형 C14-C16 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 치환된 분지형 C14-C16 알킬이다.
일부 구현예에서, R1 및 R2는 동일하다.
일부 구현예에서, R1 및 R2는 상이하다. 일부 구현예에서, R1은 임의로 치환된 C6-C20 알케닐이고, R2는 임의로 치환된 C10-C20 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 C6-C20 알케닐이고, R2는 분지형 C10-C20 알킬이다.
일부 구현예에서, A는 적어도 하나의 N을 함유하고 0-6개의 R3으로 임의로 치환된 4-7원 헤테로사이클릴 환이다. 일부 구현예에서, R3은 임의로 치환된 C1-C6 지방족이다. 일부 구현예에서, R3은 임의로 치환된 C1-C3 지방족이다. 일부 구현예에서, R3은 임의로 치환된 C1-C6 알킬이다. 일부 구현예에서, R3은 임의로 치환된 C1-C3 알킬이다. 일부 구현예에서, R3은 비치환된 C1-C6 알킬이다. 일부 구현예에서, R3은 비치환된 C1-C3 알킬이다. 일부 구현예에서, R3은 임의로 치환된 C1-C6 알케닐이다. 일부 구현예에서, R3은 임의로 치환된 C1-C3 알케닐이다. 일부 구현예에서, R3은 비치환된 C1-C6 알케닐이다. 일부 구현예에서, R3은 비치환된 C1-C3 알케닐이다.
일부 구현예에서, R3은 1-3개의 C3-C6 사이클로알킬로 치환된다. 일부 구현예에서, R3은 1개의 C3-C6 사이클로알킬로 치환된다. 일부 구현예에서, R3은 사이크로프로파닐로 치환된다. 일부 구현예에서, R3은 1-3개의 -OH로 치환된다. 일부 구현예에서, R3은 1개의 -OH로 치환된다.
일부 구현예에서, m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다. 일부 구현예에서, m은 0 또는 1이다. 일부 구현예에서, m은 0이다. 일부 구현예에서, m은 1이다. 일부 구현예에서, m은 2이다. 일부 구현예에서, m은 3이다. 일부 구현예에서, m은 4이다. 일부 구현예에서, m은 5이다. 일부 구현예에서, m은 6이다.
일부 구현예에서, n은 0, 1, 2, 또는 3이다. 일부 구현예에서, n은 1 또는 2이다. 일부 구현예에서, n은 0이다. 일부 구현예에서, n은 1이다. 일부 구현예에서, n은 2이다. 일부 구현예에서, n은 3이다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 표 1로부터 선택된 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다.
[표 1]
화합물(A)의 화합물
다양한 구현예에서, 본원에서는 화학식 A의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 A
상기 식에서:
n은 10 내지 200의 정수이고, 모든 종점이 포함되고;
LP1은 -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
RP1은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이고;
RP2는 수소 또는 -CH3이다.
일부 구현예에서, 화학식 A는 HO-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)17CH3가 아니다.
일부 구현예에서, LP1은 -CH2C(O)O-, -CH2CH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2CH2OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 화학식 A-a, 화학식 A-b, 화학식 A-c, 화학식 A-d, 또는 화학식 A-e의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 A-a
화학식 A-b
화학식 A-c
화학식 A-d
화학식 A-e
일부 구현예에서, RP1은 C6-C24, C10-C20, C10-C18, C10-C16, C10-C14, C10-C12, C12-C20, C12-C18, C12-C16, C12-C14, C14-C20, C14-C18, C14-C16, C16-C20, C16-C18, 또는 C18-C20 알킬이다. 일부 구현예에서, RP1은 C14-C18 알킬이다. 일부 구현예에서, RP1은 C14-C16 알킬이다. 일부 구현예에서, RP1은 C15-C17 알킬이다. 일부 구현예에서, RP1은 C16-C18 알킬이다. 일부 구현예에서, RP1은 C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, 또는 C24 알킬이다. 일부 구현예에서, RP1은 C6-C24, C10-C20, C10-C18, C10-C16, C10-C14, C10-C12, C12-C20, C12-C18, C12-C16, C12-C14, C14-C20, C14-C18, C14-C16, C16-C20, C16-C18, 또는 C18-C20 알케닐이다. 일부 구현예에서, RP1은 C14-C18 알케닐이다. 일부 구현예에서, RP1은 C14-16 알케닐이다. 일부 구현예에서, RP1은 C15-C17 알케닐이다. 일부 구현예에서, RP1은 C16-18 알케닐이다. 일부 구현예에서, RP1은 C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, 또는 C24 알케닐이다.
일부 구현예에서, RP2는 수소이다. 일부 구현예에서, RP2는 -CH3이다.
일부 구현예에서, n은 평균적으로 10 내지 200, 10 내지 180, 10 내지 160, 10 내지 140, 10 내지 120, 10 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 60, 10 내지 40, 10 내지 20, 20 내지 200, 20 내지 180, 20 내지 160, 20 내지 140, 20 내지 120, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 60, 20 내지 40, 40 내지 200, 40 내지 180, 40 내지 160, 40 내지 140, 40 내지 120, 40 내지 100, 40 내지 80, 40 내지 60, 60 내지 200, 60 내지 180, 60 내지 160, 60 내지 140, 60 내지 120, 60 내지 100, 60 내지 80, 80 내지 200, 80 내지 180, 80 내지 160, 80 내지 140, 80 내지 120, 80 내지 100, 100 내지 200, 100 내지 180, 100 내지 160, 100 내지 140, 100 내지 120, 120 내지 200, 120 내지 180, 120 내지 160, 120 내지 140, 140 내지 200, 140 내지 180, 140 내지 160, 160 내지 200, 160 내지 180, 또는 180 내지 200이다. 일부 구현예에서, n은 평균적으로 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200이다. 일부 구현예에서, n은 평균 약 20이다. 일부 구현예에서, n은 평균 약 40이다. 일부 구현예에서, n은 평균 약 45이다. 일부 구현예에서, n은 평균 약 50이다. 일부 구현예에서, n은 평균 약 68이다. 일부 구현예에서, n은 평균 약 75이다. 일부 구현예에서, n은 평균 약 100이다.
일부 구현예에서, 화학식 A의 화합물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고;
H3CO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고;
HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)15CH3, n은 평균 약 45이고;
HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)13CH3, n은 평균 약 45이고;
HO-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이다.
대안적 구현예
대안적 구현예에서, 본원에 기재된 화합물은 또한 하나 이상의 동위원소 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 수소는 2H(D 또는 중수소) 또는 3H(T 또는 삼중수소)일 수 있고; 탄소는, 예를 들어 13C 또는 14C일 수 있고; 산소는, 예를 들어 18O일 수 있고; 질소는, 예를 들어 15N 등일 수 있다. 다른 구현예에서, 특정 동위원소(예를 들어, 3H, 13C, 14C, 18O, 또는 15N)는 화합물의 특정 부위를 차지하는 붕부한 총 요소의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.9%를 나타낼 수 있다.
지질 나노입자
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 화합물은 나노입자를 형성하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 나노입자는 지질 나노입자(LNP)이다. 일부 구현예에서, LNP는 PEG-지질, 이온화 가능한 지질, 헬퍼 지질, 및 구조적 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 LNP는 이를 필요로 하는 대상체에게 치료학적 제제를 전달하기 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 LNP는 이를 필요로 하는 대상체에게 핵산 분자를 전달하기 위해 제형화된다.
LNP에서 지질의 제형은 특정 LNP의 치료학적 용도 및 효능에 상당한 영향을 미친다. 예를 들어, SS-OC/콜레스테롤/DSPC/PEG2k-DPG와 같은 LNP 제형은 전형적으로, 예를 들어 마우스, 비사람 영장류(NHP) 및/또는 사람에서 정맥내(IV) 투여를 반복할 때 증가된 소거 및 첫 번째 투여 후보다 두 번째 투여 후 훨씬 짧은 생체 내 순환계를 나타낸다. 순환 시간이 단축되면 능히 LNP가 표적에 덜 노출되기 때문에 LNP 전달 효율에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 이러한 제형은 다중 투여를 필요로 하지 않는 제제를 전달하는 데 유용할 수 있지만, 후속 투여가 필요한 제제의 전달을 위한 이의 사용은 이러한 단축된 순환 시간으로 인해 제한될 수 있다.
반복 투여 시 생체 내에서 조정 가능한 순환 및 표적 세포에 대한 노출, 예를 들어 지속적인 순환 및 일관된 노출을 입증하는 LNP 제형에 대한 필요성이 남아 있다. 본원 개시내용은 본원 개시내용의 이온화 가능한 지질 및/또는 PEG-지질을 LNP의 지질 제형에 혼입시킴으로써 이러한 LNP 제형을 제공한다.
양이온성 지질
일부 구현예에서, 본원에 제공된 LNP는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. "양이온성 지질" 및 "이온화 가능한 지질"은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
양이온성 지질은 생리학적 pH와 같은 선택된 pH에서 순 양전하를 갖는 임의의 다수의 지질 종을 지칭한다. 이러한 지질은 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 디옥타데실디메틸암모늄(DODMA), 디스테아릴디메틸암모늄(DSDMA), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC); N-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB); N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP); 3-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일)콜레스테롤(DC-Chol) 및 N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 생리학적 pH 미만에서 양전하를 갖는 양이온성 지질은 DODAP, DODMA 및 DMDMA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 C18 알킬 쇄, 헤드 그룹과 알킬 쇄 사이의 에테르 결합, 및 0 내지 3개의 이중 결합을 포함한다. 상기 지질은, 예를 들어, DSDMA, DLinDMA, DLenDMA, 및 DODMA를 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 양성자화 가능한 3급 아민 헤드 그룹을 포함한다. 상기 지질은 본원에서 이온화 가능한 지질로서 지칭된다. 이온화 가능한 지질은 이온화 가능한 아민 헤드 그룹을 포함하고 일반적으로 약 7 미만의 pKa를 포함하는 지질 종을 지칭한다. 따라서, 산성 pH를 갖는 환경에서, 이온화 가능한 아민 헤드 그룹은 이온화 가능한 지질이 음으로 하전된 분자(예를 들어, 본원에 기재된 재조합 폴리뉴클레오타이드와 같은 핵산)와 우선적으로 상호작용하여 나노입자 어셈블리 및 캡슐화를 용이하게 하도록 양성자화된다. 따라서, 일부 구현예예에서, 이온화 가능한 지질은 지질 나노입자로의 핵산 부하를 증가시킬 수 있다. pH가 약 7보다 큰 환경(예를 들어, 생리학적 pH 약 7.4)에서 이온화 가능한 지질은 중성 전하를 포함한다. 이온화 가능한 지질을 포함하는 입자가 엔도좀의 낮은 pH 환경(예를 들어, pH < 7)에 흡수되면 이온화 가능한 지질은 다시 양성자화되어 음이온성 엔도좀 막과 연합하여 입자에 의해 캡슐화된 내용물의 방출을 촉진시킨다. 일부 구현예에서, LNP는 이온화 가능한 지질, 예를 들어, 7.SS-절단 가능하고 pH에 반응하는 지질 유사 물질(예를 들어, COATSOME® SS-시리즈)을 포함한다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA(MC3), COATSOME® SS-LC(이전 명칭: SS-18/4PE-13), COATSOME® SS-EC(이전 명칭: SS-33/4PE-15), COATSOME® SS-OC, COATSOME® SS-OP, 디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시) 헵타데칸디오에이트(L-319), N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다.
일부 구현예에서, LNP의 양이온성 지질은 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
화학식 I
상기 식에서, 변수는 본원에 정의되어 있다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 양이온성 지질은 표 1로부터 선택된 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
일부 구현예에서, LNP의 양이온성 지질은 화학식 II-1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
화학식 II-1
상기 식에서:
R1a 및 R1b는 각각 독립적으로 C1-C8 지방족 또는 -O(C1-C8 지방족)-이고, 여기서 O 원자는 존재하는 경우 피페리딘 환에 결합되고;
Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 -C(O)O-*, -OC(O)-*, -C(O)N(Rx 1)-*, -N(Rx 1)C(O)-*, -O(C=O)N(Rx 1)-*, -N(Rx 1)(C=O)O-*, 또는 -O-이고, 여기서 -*는 각각 R2a 또는 R2b에 대한 부착점을 나타내고, Rx 1의 각각의 경우에는 독립적으로 수소 및 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 스테롤 잔기, 지용성 비타민 잔기 또는 C13-C23 지방족이다.
일부 구현예에서, LNP의 양이온성 지질은 화학식 II-2의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
화학식 II-2
상기 식에서:
R1a' 및 R1b'는 각각 독립적으로 C1-C8 알킬렌 또는 -O(C1-C8 알킬렌)이고, 여기서 O 원자는 존재하는 경우 피페리딘 환에 결합되고;
Ya' 및 Yb'는 각각 독립적으로 -C(O)O-*, -OC(O)-*, -C(O)N(Rx 1)-*, -N(Rx 1)C(O)-*, -O(C=O)N(Rx 1)-*, -N(Rx 1)(C=O)O-*, -N(Rx 1)C(O)N(Rx 1)- 또는 -O-이고, 여기서 -*는 R2a 또는 R2b에 대한 부착점을 나타내고, 각각 존재하는 Rx 1은 독립적으로 수소 및 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
Za' 및 Zb'는 각각 독립적으로 임의로 치환된 아릴렌-C0-C8 알킬렌 또는 임의로 치환된 아릴렌-C0-C8 헤테로알킬렌이고, 여기서 알킬렌 또는 헤테로알킬렌 그룹은 각각 Ya' 및 Yb'에 결합되고;
R2a' 및 R2b'는 각각 독립적으로 스테롤 잔기, 지용성 비타민 잔기 또는 C12-C22 지방족이다.
일부 구현예에서, LNP의 양이온성 지질은 화학식 II-1a의 화합물(COATSOME® SS-OC) 또는 화학식 II-2a의 화합물(COATSOME® SS-OP)이다:
화학식 II-1a
화학식 II-2a
일부 구현예에서, LNP의 양이온성 지질은 화학식 II-1a의 화합물(COATSOME® SS-OC)이다: COATSOME® SS-OC는 또한 SS-18/4PE-16으로서 공지되어 있다.
일부 구현예에서, LNP의 양이온성 지질은 화학식 II-2a의 화합물(COATSOME® SS-OP)이다:
일부 구현예에서, LNP의 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)이다.
헬퍼 지질
일부 구현예에서, 본원에 기재된 LNP는 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함한다. "헬퍼 지질"이라는 용어는 LNP의 표적, 예를 들어 세포 내로의 전달을 증가시킬 수 있는 지질을 지칭한다. 임의의 특정 이론에 얽매이고자 하는 것 없이, 헬퍼 지질은 지질 나노입자의 안정성 및/또는 막 융합성을 증진시킬 수 있는 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 인지질이다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 인지질 대용물 또는 대체물이다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 알킬 레소르시놀이다.
일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 포스파티딜 콜린(PC)이다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 포스파티딜 콜린(PC)이 아니다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 인지질 또는 인지질 대용물이다. 일부 구현예에서, 인지질 또는 인지질 대용물은 예를 들어, 하나 이상의 포화되거나 (폴리) 불포화된 인지질 또는 인지질 대용물 또는 이의 조합일 수 있다. 일반적으로 인지질은 포스페이트 헤드 그룹과 하나 이상의 지방산 테일을 포함한다. 일부 구현예에서, 인지질은 하나 이상의 다중(예를 들어, 이중 또는 삼중)결합(즉, 하나 이상의 불포화)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 비-양이온성이다.
포스페이트 헤드 그룹은, 예를 들어 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 세린, 포스파티드산, 2-리소포스파티딜 콜린 및 스핑고미엘린으로 이루어진 비제한적인 그룹으로부터 선택될 수 있다.
지방산 테일은, 예를 들어 라우르산, 미리스트산, 미리스톨레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 에루크산, 피탄산, 아라키드산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 베헨산, 도코사펜타엔산 및 도코사헥사엔산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
인지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티디 글리세롤 및 포스파티드산과 같은 글리세로인지질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 인지질은 또한 포스포스핑고지질, 예를 들어, 스핑고미엘린을 포함한다.
일부 구현예에서, 비양이온성 헬퍼 지질은 DSPC 유사체, DSPC 대용물, 올레산 또는 올레산 유사체이다.
일부 구현예에서, 비양이온성 헬퍼 지질은 비-포스파티딜 콜린(PC) 양쪽이온성 지질, DSPC 유사체, 올레산, 올레산 유사체, 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC) 대용물이다.
일부 구현예에서, 인지질은 막으로의 융합을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 양이온성 인지질은 막(예를 들어, 세포막 또는 세포내 막)의 하나 이상의 음으로 하전된 인지질과 상호작용할 수 있다. 막에 대한 인지질의 융합은 지질-함유 조성물의 하나 이상의 요소가 막을 통과하여 예를 들어 하나 이상의 요소가 세포로 전달되도록 할 수 있다.
일부 구현예에서, 포스페이트 헤드 그룹은 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 세린, 포스파티드산, 2-리소포스파티딜 콜린 및 스핑고미엘린으로 이루어진 비제한적인 그룹으로부터 선택될 수 있다. 지방산 테일은, 예를 들어 라우르산, 미리스트산, 미리스톨레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 에루크산, 피탄산, 아라키드산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 베헨산, 도코사펜타엔산 및 도코사헥사엔산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, LNP는 하나 이상의 비-양이온성 헬퍼 지질(예를 들어, 중성 지질)을 포함한다. 예시적인 중성 헬퍼 지질은 (1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민)(DLPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DiPPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE), (1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(l'-rac-글리세롤)(DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 세라미드 및 스핑고미엘린을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 헬퍼 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC); 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, LNP의 헬프 지질은 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)을 포함하거나, 필수적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, LNP는 DSPC를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DOPC를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DLPE를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DOPE를 포함한다.
일부 구현예에서, 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린(DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1 ,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디운데카노일-sn-글리세로-포스포콜린(DUPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디-O-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:0 디에테르 PC), 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린(C16 Lyso PC), 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:3(시스) PC), 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC) , 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(22:6(시스) PC) 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(4ME 16.0 PE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(PE(18:2/18:2), 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(PE) 18:3(9Z,12Z, 15Z), 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DAPE 18:3(9Z,12Z, 15Z)), 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(22:6 (시스) PE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤) 나트륨 염(DOPG) 및 스핑고미엘린으로 이루어진 비제한적인 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜 -에탄올아민(DSPE) , 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 디메틸포스파티딜에탄올아민, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 에그 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스 토일 포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일로레이올포스파티딜글리세롤(POPG), 디에라이도일포스파티딜에탄올아민(DEPE), 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜 세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀, 포스파티디카산, 세레브로사이드, 디세틸포스페이트, 리소포스파티딜콜린, 및 딜리놀레오일포스파티딜콜린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 헬퍼 지질은 DSPC이다.
일부 구현예에서, LNP는 DSPC를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DOPE를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DMPE를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 DSPC 및 DOPE 둘 다를 포함한다.
일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 DSPC, DMPE, 및 DOPC 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원 개시내용의 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 816-94-4의 CAS 번호를 갖는 (DSPC)이고 선형 화학식은 C44H88NO8P.이다 DSPC는 또한 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린으로서 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 인지질은 변형된 테일을 포함한다. 일부 구현예에서, 인지질은 DSPC (1,2-디옥타데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 또는 변형된 테일을 갖는 이의 유사체이다. 본원에 기재된 바와 같이, "변형된 테일"은 보다 짧거나 보다 긴 지방족 쇄, 분지형이 도입된 지방족 쇄, 치환체가 도입된 지방족 쇄, 하나 이상의 메틸렌이 사이클릭 또는 헤테로원자 그룹으로 대체된 지방족 쇄, 또는 이의 임의의 조합을 갖는 테일일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 헬퍼 지질은 인지질이 아닌 대안적 지질이다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용에 유용한 인지질은 변형된 테일을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용에 유용한 인지질은 DSPC, 또는 변형된 테일을 갖는 이의 유사체이다. 본원에 기재된 바와 같이, "변형된 테일"은 보다 짧거나 보다 긴 지방족 쇄, 분지형이 도입된 지방족 쇄, 치환체가 도입된 지방족 쇄, 하나 이상의 메틸렌이 사이클릭 또는 헤테로원자 그룹으로 대체된 지방족 쇄, 또는 이의 임의의 조합을 갖는 테일일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용에 유용한 인지질은 변형된 포스포콜린 모이어티를 포함하고, 여기서 4급 아민을 포스포릴 그룹에 연결하는 알킬 쇄는 에틸렌이 아니다(예를 들어, n은 2가 아니다).
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 LNP는 헬퍼 지질로서 올레산 또는 올레산 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 올레산 유사체는 변형된 올레산 테일, 변형된 카복실산 모이어티, 또는 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 올레산 유사체는 올레산의 카복실산 모이어티가 다른 그룹으로 대체된 화합물이다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 LNP는 인지질 대신에 헬퍼 지질로서 상이한 양쪽이온성 그룹을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 헬퍼 지질은 천연적으로 존재하는 막 지질이다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 헬퍼 지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-O-4'-(N,N,N-트리메틸)-호모세린(DGTS), 모노갈락토실디아실글리세롤(MGDG), 디갈락토실디아실글리세롤(DGDG), 설포퀴노보실디아실글리세롤(SQDG), 1-팔미토일-2-시스-9,10-메틸렌헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(Cyclo PC) 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 LNP는 헬퍼 지질의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질의 조합은 DSPC를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질의 조합은 DSPC를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 천연적으로 존재하는 막 지질(예를 들어, DGTS)을 포함하는 LNP는 유일한 헬퍼 지질로서 DSPC를 포함하는 LNP와 비교하여 LNP에 캡슐화된 페이로드 분자의 개선된 간 형질감염/전달을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원의 개시내용의 헬퍼 지질은 5-헵타데실레조르시놀 또는 이의 유도체이다.
구조적 지질
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 LNP는 하나 이상의 구조적 지질을 포함한다. 지질 나노입자에 구조적 지질을 혼입시키면 입자 내 다른 지질의 응집을 완화하는 데 도움이 될 수 있다. 구조적 지질은 스테롤 또는 스테롤 모이어티를 함유하는 지질일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, LNP의 구조적 지질은 스테롤(예를 들어, 피토스테롤 또는 주스테롤)이다. 일부 구현예에서, 스테롤은 콜레스테롤, 또는 이의 유사체 또는 유도체이다. 일부 구현예에서, 스테롤은 콜레스테롤이다. 일부 구현예에서, 스테롤은 단독으로 또는 조합하여, 콜레스테롤, β-시토스테롤, 페코스테롤, 에르고스테롤, 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 에르고스테롤, 토마티딘, 토마틴, 우르솔산, 알파-토코페롤이고, 이의 유사체, 염 또는 에스테르를 포함한다 .
일부 구현예에서, LNP의 구조적 지질은 콜레스테롤, 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니솔론, 덱사메타손, 프레드니손 및 하이드로코르티손) 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, LNP의 구조적 지질은 피토스테롤이다. 일부 구현예에서, 피토스테롤은 단독으로 또는 조합하여, 시토스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤, 시토스타놀, 캄페스타놀, 브라시카스테롤, 푸코스테롤, 베타-시토스테롤, 스티그마스타놀, 베타-시토스타놀, 에르고스테롤, 루페올, 사이클로아르테놀, A5-아베나세롤, A7-아베나세롤 또는 A7-스티그마스테롤이고, 이의 유사체, 염 또는 에스테르를 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 하나 이상의 피토스테롤을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP의 피토스테롤 성분은 단일 피토스테롤이다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 LNP의 피토스테롤 성분은 상이한 피토스테롤의 혼합물(예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상이한 피토스테롤)이다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 LNP의 피토스테롤 성분은 하나 이상의 피토스테롤과 하나 이상의 주스테롤의 블렌드, 예를 들어 피토스테롤(예를 들어 베타-시토스테롤과 같은 시토스테롤)과 콜레스테롤의 블렌드이다.
본원 개시내용의 일부 구현예에서, LNP의 구조적 지질은 콜레스테롤이다:
57-88-5의 CAS 번호를 갖는 콜레스테롤, C27H46O의 선형 화학식.
PEG-지질
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 PEG-지질은 친수성 헤드 그룹 및 소수성 지질 테일을 포함한다. 일부 구현예에서, 친수성 헤드 그룹은 PEG 모이어티이다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 PEG-지질은 모노 지질 테일을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 PEG-지질은 모노 알킬 지질 테일, 모노 알케닐 지질 테일, 모노 알키닐 지질 테일 또는 모노 아실 지질 테일을 포함한다. 일부 구현예에서, 모노 지질 테일은 에테르 그룹, 카보닐 그룹, 또는 에스테르 그룹을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 PEG-지질은 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 알케닐 에테르, 또는 폴리옥시에틸렌 알키닐 에테르(이러한 분자는 BRIJ™ 분자로도 알려져 있음)를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 PEG-지질은 폴리옥시에틸렌 알킬 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알케닐 에스테르, 또는 폴리옥시에틸렌 알키닐 에스테르(이러한 분자는 MYRJ™ 분자로도 알려져 있음)를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 디-아실 지질 테일을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 화학식 A의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
화학식 A
상기 식에서, 변수는 본원에 정의되어 있다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 화학식 A'의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 A'
상기 식에서:
n은 10 내지 200의 정수이고, 모든 종점이 포함되고;
LP1'은 결합, -C(O)-, -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
RP1'은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이고;
RP2'는 수소 또는 -CH3이다.
일부 구현예에서, LP1'은 결합, -C(O)-, -CH2C(O)O-,-CH2CH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2CH2OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이다. 일부 구현예에서, RP1'은 RP1이다. 일부 구현예에서, RP2'는 RP2이다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 화학식 A''의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 A''
상기 식에서:
n은 10 내지 200의 정수이고, 모든 종점이 포함되고;
LP1''은 결합, -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
RP1''은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이고;
RP2''는 수소 또는 -CH3이다.
일부 구현예에서, LP1''은 결합, -CH2C(O)O-,-CH2CH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2CH2OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 화학식 A''-a, 화학식 A''-b, 화학식 A''-c, 화학식 A''-d, 화학식 A''-e, 또는 화학식 A''-f의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 A''-a
화학식 A''-b
화학식 A''-c
화학식 A''-d
화학식 A''-e
화학식 A''-f
.
일부 구현예에서, RP1"은 RP1이다. 일부 구현예에서, RP2"는 RP2이다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 화학식 A''-f1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 A''-f1
.
일부 구현예에서, PEG-지질은 화학식 A''-f2의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 A''-f2
..
일부 구현예에서, PEG-지질은 화학식 (A''-f3)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 A''-f3
.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 PEG-지질은 화학식 B의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 B
상기 식에서:
n은 10 내지 200의 정수이고, 모든 종점이 포함되고;
RB1은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이고;
일부 구현예에서, RB1은 RP1이다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 화학식 (B-a)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 B-a
.
일부 구현예에서, PEG-지질은 화학식 B-b의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
화학식 B-b
.
일부 구현예에서, n은 평균적으로 10 내지 200, 10 내지 180, 10 내지 160, 10 내지 140, 10 내지 120, 10 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 60, 10 내지 40, 10 내지 20, 20 내지 200, 20 내지 180, 20 내지 160, 20 내지 140, 20 내지 120, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 60, 20 내지 40, 40 내지 200, 40 내지 180, 40 내지 160, 40 내지 140, 40 내지 120, 40 내지 100, 40 내지 80, 40 내지 60, 60 내지 200, 60 내지 180, 60 내지 160, 60 내지 140, 60 내지 120, 60 내지 100, 60 내지 80, 80 내지 200, 80 내지 180, 80 내지 160, 80 내지 140, 80 내지 120, 80 내지 100, 100 내지 200, 100 내지 180, 100 내지 160, 100 내지 140, 100 내지 120, 120 내지 200, 120 내지 180, 120 내지 160, 120 내지 140, 140 내지 200, 140 내지 180, 140 내지 160, 160 내지 200, 160 내지 180, 또는 180 내지 200이다. 일부 구현예에서, n은 평균적으로 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200이다. 일부 구현예에서, n은 평균 약 20이다. 일부 구현예에서, n은 평균 약 40이다. 일부 구현예에서, n은 평균 약 45이다. 일부 구현예에서, n은 평균 약 50이다. 일부 구현예에서, n은 평균 약 68이다. 일부 구현예에서, n은 평균 약 75이다. 일부 구현예에서, n은 평균 약 100이다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 평균 분자량이 약 500 내지 약 10,000 달톤인 PEG 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 평균 분자량이 약 500 내지 약 5,000 달톤, 약 500 내지 약 4,000 달톤, 약 500 내지 약 3,000 달톤, 약 500 내지 약 2,000 달톤, 약 500 내지 약 1,000 달톤, 약 500 내지 약 800 달톤, 약 500 내지 약 600 달톤, 약 600 내지 약 5,000 달톤, 약 600 내지 약 4,000 달톤, 약 600 내지 약 3,000 달톤, 약 600 내지 약 2,000 달톤, 약 600 내지 약 1,000 달톤, 약 600 내지 약 800 달톤, 약 800 내지 약 5,000 달톤, 약 800 내지 약 4,000 달톤, 약 800 내지 약 3,000 달톤, 약 800 내지 약 2,000 달톤, 약 800 내지 약 1,000 달톤, 약 1,000 내지 약 5,000 달톤, 약 1,000 내지 약 4,000 달톤, 약 1,000 내지 약 3,000 달톤, 약 1,000 내지 약 2,000 달톤, 약 2,000 내지 약 5,000 달톤, 약 2,000 내지 약 4,000 달톤, 약 2,000 내지 약 3,000 달톤, 약 3,000 내지 약 5,000 달톤, 약 3,000 내지 약 4,000 달톤, 약 5,000 내지 약 10,000 달톤, 약 5,000 내지 약 7,500 달톤 또는 약 7,500 내지 약 10,000 달톤인 PEG 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-지질의 PEG 모이어티는 약 1,500 내지 약 2,500 달톤의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, PEG-지질의 PEG 모이어티는 약 1,000 내지 약 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 평균 분자량이 약 500, 약 600, 약 800, 약 1,000, 약 1,500, 약 2,000, 약 2,500, 약 3,000, 약 3,500, 약 4,000, 약 4,500, 약 5,000, 약 6,000, 약 7,000, 약 8,000, 약 9,000, 또는 약 10,000 달톤인 PEG 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 평균 분자량이 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 1,500, 적어도 2,000, 적어도 2,500, 적어도 3,000, 적어도 3,500, 적어도 4,000, 적어도 4,500, 적어도 5,000, 적어도 6,000, 적어도 7,000, 적어도 8,000, 적어도 9,000, 또는 적어도 10,000 달톤인 PEG 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 평균 분자량이 500 이하, 1,000 이하, 1,500 이하, 2,000 이하, 2,500 이하, 3,000 이하, 3,500 이하, 4,000 이하, 4,500 이하, 5,000 이하, 6,000 이하, 7,000 이하, 8,000 이하, 9,000 이하 또는 10,000 이하의 달톤인 PEG 모이어티를 포함한다. 모든 값은 모든 종점을 포함한다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 폴리옥시에틸렌(100) 스테아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌(20) 세틸 에테르, 폴리옥시에틸렌(20) 올레일 에테르, 폴리옥시에틸렌(20) 스테아릴 에테르, 또는 이들의 혼합물이다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 폴리옥시에틸렌 (100) 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 (50) 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌(40) 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 팔미테이트, 또는 이의 혼합물이다.
본원 개시내용의 일부 구현예에서, PEG-지질은 9005-00의 CAS 번호를 갖는 (BRIJ™ S100)이고, 선형 화학식은 C18H37(OCH2CH2)nOH이고, 여기서 n은 100이다. BRIJ™ S100은 또한 일반적으로 폴리옥시에틸렌(100) 스테아릴 에테르로서 공지되어 있다. 따라서, 일부 구현예에서, PEG-지질은 HO-PEG100-CH2(CH2)16CH3이다.
본원 개시내용의 일부 구현예에서, PEG-지질은 9004-95-9의 CAS 번호를 갖는 (BRIJ™ C20)이고, 선형 화학식은 C16H33(OCH2CH2)nOH이고, 여기서 n은 20이다. BRIJ™ C20은 또한 BRIJ™ 58로서 및 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜 헥사에틸렌 글리콜 헥사데실 에테르, 폴리옥시에틸렌(20) 세틸 에테르로서 공지되어 있다. 따라서, 일부 구현예에서, PEG-지질은 HO-PEG20-CH2(CH2)14CH3이다.
본원 개시내용의 일부 구현예에서, PEG-지질은 9004-98-2의 CAS 번호를 갖는 (BRIJ™ O20)이고, 선형 화학식은 C18H35(OCH2CH2)nOH이고, 여기서 n은 20이다. BRIJ™ O20은 또한 일반적으로 폴리옥시에틸렌(20) 올레일 에테르로서 공지되어 있다. 따라서 일부 구현예에서, PEG-지질은 HO-PEG20-C18H35이다.
본원 개시내용의 일부 구현예에서, PEG-지질은 9005-00-9의 CAS 번호를 갖는 (BRIJ™ S20)이고, 선형 화학식은 C18H37(OCH2CH2)nOH이고, 여기서 n은 20이다. BRIJ™ S20은 또한 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜 에테르 또는 폴리옥시에틸렌(20) 스테아릴 에테르로서 공지되어 있다. 따라서, 일부 구현예에서, PEG-지질은 HO-PEG20-CH2(CH2)16CH3이다.
본원 개시내용의 일부 구현예에서, PEG-지질은 9004-99-3의 CAS 번호를 갖는 (MYRJ™ S100)이고, 선형 화학식은 C17H35C(O)(OCH2CH2)nOH이고, 여기서 n은 100이다. MYRJ™ S100은 또한 일반적으로 폴리옥시에틸렌(100) 스테아레이트로서 공지되어 있다. 따라서, 일부 구현예에서, PEG-지질은 HO-PEG100-CH2(CH2)15CH3이다.
본원 개시내용의 일부 구현예에서, PEG-지질은 9004-99-3의 CAS 번호를 갖는 (MYRJ™ S50)이고, 선형 화학식은 C17H35C(O)(OCH2CH2)nOH이고, 여기서 n은 50이다. MYRJ™ S50은 또한 일반적으로 폴리옥시에틸렌 (50) 스테아레이트로서 공지되어 있다. 따라서, 일부 구현예에서, PEG-지질은 HO-PEG50-CH2(CH2)15CH3이다.
본원 개시내용의 일부 구현예에서, PEG-지질은 9004-99-3의 CAS 번호를 갖는 (MYRJ™ S40)이고, 선형 화학식은 C17H35C(O)(OCH2CH2)nOH이고, 여기서 n은 40이다. MYRJ™ S40은 또한 일반적으로 폴리옥시에틸렌(40) 스테아레이트로서 공지되어 있다. 따라서, 일부 구현예에서, PEG-지질은 HO-PEG40-CH2(CH2)15CH3이다.
본원 개시내용의 일부 구현예에서, PEG 지질은 1607430-62-04의 CAS 번호를 갖는 (PEG2k-DMG)이고 선형 화학식은 C122H242O50이다. PEG2k-DMG는 또한 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000으로서 공지되어 있다.
본원 개시내용의 일부 구현예에서, PEG 지질은 (PEG2k-DPG)이고, R1COO= C16:0, R2COO= C16:0의 알킬 조성을 갖는다. PEG2k-DPG는 또한 일반적으로 1,2-디팔미토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌으로서 공지되어 있다.
본원 개시내용의 일부 구현예에서, PEG-지질은 PEG-디라우로일글리세롤, PEG-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG), PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테아로일글리세롤(PEG-DSPE), PEG-디라우릴글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, PEG-디스테아로일글리카미드, PEG-콜레스테롤(1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌) 글리콜), PEG-DMB(3,4-디테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DMG), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DSPE), 1,2-디스테아로일-sn글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(PEG2k-DSG), 폴리(에틸렌 글리콜)-2000-디메타크릴레이트(PEG2k-DMA), 또는 1,2-디스테아릴옥시프로필-3-아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DSA)일 수 있다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 PEG2k-DMG일 수 있다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 PEG2k-DSG일 수 있다. 다른 구현예에서, PEG-지질은 PEG2k-DSPE일 수 있다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 PEG2k-DMA일 수 있다. 여전히 다른 구현예에서, PEG-지질은 PEG2k-C-DMA일 수 있다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 PEG2k-DSA일 수 있다. 다른 구현예에서, PEG-지질은 PEG2k-C11일 수 있다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 PEG2k-C14일 수 있다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 PEG2k-C16일 수 있다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 PEG2k-C18일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 단일 지질 테일을 갖는 PEG-지질(예를 들어, 화학식 A, A', A'' 또는 B의 PEG-지질)은 본원 개시내용의 LNP 조성물의 투여 및/또는 반복 투여 시 가속화된 혈액 소거율(ABC)을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 단일 지질 테일을 갖는 PEG-지질은 본원 개시내용의 LNP 조성물의 투여 및/또는 반복 투여 시 대상체의 면역계에 의해 생성된 PEG-특이적 항체(예를 들어, 항-PEG IgM)를 감소시키거나 고갈시킬 수 있다.
LNP 조성물에서 지질 몰 비율
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 LNP는 40 몰% 내지 70 몰%의 양이온성 지질, 최대 50 몰%의 헬퍼 지질, 10 몰% 내지 50 몰%의 구조적 지질, 및 0.001 몰% 내지 5 몰%의 PEG-지질을 포함하고, 모든 종점을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 구조적 지질 및 PEG-지질의 총 몰%는 100%이다.
일부 구현예에서, LNP에서 양이온성 지질의 몰%는 40-70 몰%, 40-55 몰%, 40-50 몰%, 40-45 몰%, 44-54 몰%, 45-60 몰%, 45-55 몰%, 45-50 몰%, 50-60 몰%, 49-64 몰%, 50-55 몰%, 또는 55-60 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 양이온성 지질의 몰%는 44-54 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 양이온성 지질의 몰%는 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 양이온성 지질의 몰%는 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 또는 약 60 몰%이다. 모든 값은 모든 종점을 포함한다.
일부 구현예에서, LNP에서 구조적 단백질의 몰%는 10-60 몰%, 10-30 몰%, 15-35 몰%, 20-40 몰%, 20-45 몰%, 25-33 몰%, 24-32 몰%, 25-45 몰%, 30-50 몰%, 35-43 몰%, 35-55 몰%, 또는 40-60 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 구조적 지질의 몰%는 20-45 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 구조적 지질의 몰%는 24-32 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 구조적 지질의 몰%는 25-33 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 구조적 지질의 몰%는 22-28 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 구조적 지질의 몰%는 35-45 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 구조적 지질의 몰%는 35-43 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 구조적 지질의 몰%는 10-60 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 구조적 지질의 몰%는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 구조적 지질의 몰%는 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 또는 60 몰%이다. 일부 구현예에서, 구조 지질은 콜레스테롤이다. 모든 값은 모든 종점을 포함한다.
일부 구현예에서, LNP에서 헬퍼 지질의 몰%는 1-50 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 헬퍼 지질의 몰%는 최대 29 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 헬퍼 단백질의 몰%는 1-10 몰%, 5-9 몰%, 5-15 몰%, 8-14 몰%, 18-22 몰%, 19-25 몰%, 10-20 몰%, 10-25 몰%, 15-25 몰%, 20-30 몰%, 25-35 몰%, 30-40 몰%, 또는 35-50 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 헬퍼 지질의 몰%는 10-25 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 헬퍼 지질의 몰%는 5-9 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 헬퍼 지질의 몰%는 8-14 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 헬퍼 지질의 몰%는 18-22 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 헬퍼 지질의 몰%는 19-25 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 헬퍼 지질의 몰%는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 몰%이다. 일부 구현예에서, LNP에서 헬퍼 지질의 몰%는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 또는 약 40 몰%이다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 DSPC이다. 모든 값은 모든 종점을 포함한다.
일부 구현예에서, LNP에서 PEG-지질의 몰%는 LNP에 존재하는 총 지질의 0 몰% 초과 및 최대 5 몰%이다. 일부 구현예에서, PEG-지질의 몰%는 LNP에 존재하는 총 지질의 0.1 몰%, 0.2 몰%, 0.25 몰%, 0.3 몰%, 0.4 몰%, 0.5 몰%, 0.6 몰%, 0.7 몰%, 0.8 몰%, 0.9 몰%, 1.0 몰%, 1.1 몰%, 1.2 몰%, 1.3 몰%, 1.4 몰%, 1.5 몰%, 1.6 몰%, 1.7 몰%, 1.8 몰%, 1.9 몰%, 2.0 몰%, 2.1 몰%, 2.2 몰%, 2.3 몰%, 2.4 몰%, 2.5 몰%, 2.6 몰%, 2.7 몰%, 2.8 몰%, 2.9 몰%, 3.0 몰%, 3.1 몰%, 3.2 몰%, 3.3 몰%, 3.4 몰%, 3.5 몰%, 4.0 몰%, 4.5 몰%, 또는 5 몰%이다. 일부 구현예에서, PEG-지질의 몰%는 LNP에 존재하는 총 지질의 약 0.1 몰%, 약 0.2 몰%, 약 0.25 몰%, 약 0.3 몰%, 약 0.4 몰%, 약 0.5 몰%, 약 0.6 몰%, 약 0.7 몰%, 약 0.8 몰%, 약 0.9 몰%, 약 1.0 몰%, 약 1.1 몰%, 약 1.2 몰%, 약 1.3 몰%, 약 1.4 몰%, 약 1.5 몰%, 약 1.6 몰%, 약 1.7 몰%, 약 1.8 몰%, 약 1.9 몰%, 약 2.0 몰%, 약 2.1 몰%, 약 2.2 몰%, 약 2.3 몰%, 약 2.4 몰%, 약 2.5 몰%, 약 2.6 몰%, 약 2.7 몰%, 약 2.8 몰%, 약 2.9 몰%, 약 3.0 몰%, 약 3.1 몰%, 약 3.2 몰%, 약 3.3 몰%, 약 3.4 몰%, 약 3.5 몰%, 약 4.0 몰%, 약 4.5 몰%, 또는 약 5 몰%이다. 일부 구현예에서, PEG-지질의 몰%는 LNP에 존재하는 총 지질의 적어도 0.1 몰%, 적어도 0.2 몰%, 적어도 0.25 몰%, 적어도 0.3 몰%, 적어도 0.4 몰%, 적어도 0.5 몰%, 적어도 0.6 몰%, 적어도 0.7 몰%, 적어도 0.8 몰%, 적어도 0.9 몰%, 적어도 1.0 몰%, 적어도 1.1 몰%, 적어도 1.2 몰%, 적어도 1.3 몰%, 적어도 1.4 몰%, 적어도 1.5 몰%, 적어도 1.6 몰%, 적어도 1.7 몰%, 적어도 1.8 몰%, 적어도 1.9 몰%, 적어도 2.0 몰%, 적어도 2.1 몰%, 적어도 2.2 몰%, 적어도 2.3 몰%, 적어도 2.4 몰%, 적어도 2.5 몰%, 적어도 2.6 몰%, 적어도 2.7 몰%, 적어도 2.8 몰%, 적어도 2.9 몰%, 적어도 3.0 몰%, 적어도 3.1 몰%, 적어도 3.2 몰%, 적어도 3.3 몰%, 적어도 3.4 몰%, 적어도 3.5 몰%, 적어도 4.0 몰%, 적어도 4.5 몰%, 또는 적어도 5 몰%이다. 일부 구현예에서, PEG-지질의 몰%는 LNP에 존재하는 총 지질의 최대 0.1 몰%, 최대 0.2 몰%, 최대 0.25 몰%, 최대 0.3 몰%, 최대 0.4 몰%, 최대 0.5 몰%, 최대 0.6 몰%, 최대 0.7 몰%, 최대 0.8 몰%, 최대 0.9 몰%, 최대 1.0 몰%, 최대 1.1 몰%, 최대 1.2 몰%, 최대 1.3 몰%, 최대 1.4 몰%, 최대 1.5 몰%, 최대 1.6 몰%, 최대 1.7 몰%, 최대 1.8 몰%, 최대 1.9 몰%, 최대 2.0 몰%, 최대 2.1 몰%, 최대 2.2 몰%, 최대 2.3 몰%, 최대 2.4 몰%, 최대 2.5 몰%, 최대 2.6 몰%, 최대 2.7 몰%, 최대 2.8 몰%, 최대 2.9 몰%, 최대 3.0 몰%, 최대 3.1 몰%, 최대 3.2 몰%, 최대 3.3 몰%, 최대 3.4 몰%, 최대 3.5 몰%, 최대 4.0 몰%, 최대 4.5 몰%, 또는 최대 5 몰%이다. 일부 구현예에서, PEG-지질의 몰%는 LNP에 존재하는 총 지질의 0.1-4 몰%이다. 일부 구현예에서, PEG-지질의 몰%는 LNP에 존재하는 총 지질의 0.1-2 몰%이다. 일부 구현예에서, PEG-지질의 몰%는 LNP에 존재하는 총 지질의 0.2-0.8 몰%, 0.4-0.6 몰%, 0.7-1.3 몰%, 1.2-1.8 몰%, 또는 1-3.5 몰%이다. 일부 구현예에서, PEG-지질의 몰%는 LNP에 존재하는 총 지질의 0.1-0.7 몰%, 0.2-0.8 몰%, 0.3-0.9 몰%, 0.4-0.8 몰%, 0.4-0.6 몰%, 0.4-1 몰%, 0.5-1.1 몰%, 0.6-1.2 몰%, 0.7-1.3 몰%, 0.8-1.4 몰%, 0.9-1.5 몰%, 1-3.5 몰% 1-1.6 몰%, 1.1-1.7 몰%, 1.2-1.8 몰%, 1.3-1.9 몰%, 1.4-2 몰%, 1.5-2.1 몰%, 1.6-2.2 몰%, 1.7-2.3 몰%, 1.8-2.4 몰%, 1.9-2.5 몰%, 2-2.6 몰%, 2.4-3.8 몰%, 또는 2.6-3.4 몰%이다. 모든 값은 모든 종점을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 LNP는 44-60 몰%의 양이온성 지질, 19-25 몰%의 헬퍼 지질, 25-33 몰%의 구조적 지질, 및 0.2-0.8 몰%의 PEG-지질을 포함하고, 종점을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 LNP는 44-54 몰%의 양이온성 지질, 19-25 몰%의 헬퍼 지질, 24-32 몰%의 구조적 지질, 및 1.2-1.8 몰%의 PEG-지질을 포함하고, 종점을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 LNP는 44-54 몰%의 양이온성 지질, 8-14 몰%의 헬퍼 지질, 35-43 몰%의 구조적 지질, 및 1.2-1.8 몰%의 PEG-지질을 포함하고, 종점을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 LNP는 45-55 몰%의 양이온성 지질, 5-9 몰%의 헬퍼 지질, 36-44 몰%의 구조적 지질, 및 2.5-3.5 몰%의 PEG-지질을 포함하고, 종점을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 LNP는 하기 표 2에 따른 LNP에서 총 지질의 몰%(또는 총 지질의 몰% 범위)로 본원 개시내용의 양이온성 지질 중 하나 이상, 본원 개시내용의 하나 이상의 헬퍼 지질, 본원 개시내용의 하나 이상의 구조적 지질, 및 본원 개시내용의 하나 이상의 PEG-지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 4개의 지질 성분의 총 몰%는 100%와 같다. 일부 구현예에서, 이들 4개의 지질 성분의 총 몰%는 100% 미만이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 화학식 I의 화합물 또는 표 1로부터 선택된 화합물이다. 일부 구현예에서, 구조 지질은 콜레스테롤이다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 DSPC이다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 화학식 A, 화학식 A', 또는 화학식 A''의 화합물이다:
[표 2] LNP에서 지질 성분들의 몰%
LNP 조성물의 성질
본원 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 다수의 LNP를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 제공한다. 또한 본원에는 본원에 기재된 바와 같은 LNP를 포함하고 페이로드 분자를 캡슐화하는 조성물이 제공된다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 LNP는 대조군 LNP와 비교하여 생체내 면역 반응을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 대조군 LNP는 화학식 A, 화학식 A', 또는 화학식 A''가 아닌 PEG-지질을 포함하는 LNP이다. 일부 구현예에서, 대조군 LNP의 PEG-지질은 PEG2k-DPG이다. 일부 구현예에서, 대조군 LNP의 PEG-지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 구현예에서, 대조군 LNP는 본원 개시내용의 LNP와 동일한 몰비의 PEG-지질을 갖는다. 일부 구현예에서, 대조군 LNP는 대조군 LNP가 화학식 A, 화학식 A' 또는 화학식 A''가 아닌 PEG-지질(예를 들어, 대조군 LNP는 PEG-지질로서 PEG2k-DPG 또는 PEG2k-DMG를 포함할 수 있다)을 포함하는 것을 제외하고 본원 개시내용의 LNP와 동일하다.
일부 구현예에서, 대조군 LNP는 화학식 I가 아닌 양이온성 지질을 포함하는 LNP이다. 일부 구현예에서, 대조군 LNP의 양이온성 지질은 SS-OC이다. 일부 구현예에서, 대조군 LNP는 본원 개시내용의 LNP와 동일한 몰비의 양이온성 지질을 갖는다. 일부 구현예에서, 대조군 LNP는 대조군 LNP가 화학식 I가 아닌 양이온성 지질(예를 들어, 대조군 LNP는 양이온성 지질로서 SS-OC를 포함할 수 있다)을 포함함을 제외하고 본원 개시내용의 LNP와 동일하다.
일부 구현예에서, 감소된 면역 반응은 가속화된 혈액 소거율(ABC)의 감소일 수 있다. 일부 구현예에서, ABC는 천연 IgM 및/또는 항-PEG IgM의 분비와 연관되어 있다. 본원에 사용된 용어 "천연 IgM"은 공지된 면역 노출(예를 들어, 본원 개시내용의 LNP에 대한 노출)과 무관하게 존재하는 혈청 내 순환 IgM을 지칭한다. "ABC의 감소"라는 용어는 대조군 LNP와 비교하여 ABC의 감소를 지칭한다. 일부 구현예에서, ABC의 감소는 대조군 LNP에 비해 두 번째 또는 후속 용량 시 LNP의 소거 감소일 수 있다. 일부 구현예에서, 감소는 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, 감소는 약 10% 내지 약 100%, 약 10 내지 약 50%, 약 20 내지 약 100%, 약 20 내지 약 50%, 약 30 내지 약 100%, 약 30 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 100%, 약 40 내지 약 80%, 약 50 내지 약 90%, 또는 약 50 내지 약 100%이다. 일부 구현예에서, ABC의 감소는 두 번째 또는 후속 투여 후 캡슐화된 페이로드의 증가 또는 지속적인 검출 가능한 수준에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, ABC의 감소는 대조군 LNP 투여 후 캡슐화된 페이로드 수준에 비해 캡슐화된 페이로드의 수준의 증가(예를 들어, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 이상의 배 증가)를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 감소된 ABC는 항-PEG IgM의 보다 낮은 혈청 수준과 연관되어 있다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 LNP는 페이로드 방출 전에 소거될 수 있는 대조 LNP와 비교하여 반복 투여 시 LNP 및 이의 성분의 소거를 지연시킬 수 있다. 따라서, 본원 개시내용의 LNP는 후속 용량에서 캡슐화된 페이로드(예를 들어, RNA)의 전달 효율을 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, LNP는 평균 크기(즉, 평균 외경)가 약 50 nm 내지 약 150 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료학적 조성물을 제공하고, 여기서 복수의 LNP는 약 60 nm 내지 약 130 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료학적 조성물을 제공하고, 여기서 복수의 LNP는 약 70 nm 내지 약 120 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료학적 조성물을 제공하고, 여기서 복수의 LNP는 약 70 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료학적 조성물을 제공하고, 여기서 복수의 LNP는 약 80 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료학적 조성물을 제공하고, 여기서 복수의 LNP는 약 90 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료학적 조성물을 제공하고, 여기서 복수의 LNP는 약 100 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 복수의 지질 나노입자를 포함하는 치료학적 조성물을 제공하고, 여기서 복수의 LNP는 약 110 nm의 평균 크기를 갖는다. 모든 값은 종점을 포함한다.
일부 구현예에서, LNP에 의한 페이로드 분자의 캡슐화 효율은 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100%이다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP의 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%가 캡슐화된 페이로드 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP에 의한 페이로드 분자의 캡슐화 효율은 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%이다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%,적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 캡슐화된 페이로드 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP의 약 70% 내지 100%, 약 75% 내지 100%, 약 80% 내지 100%, 약 85% 내지 100%, 약 90% 내지 100%, 약 91% 내지 100%, 약 92% 내지 100%, 약 93% 내지 100%, 약 94% 내지 100%, 약 95% 내지 100%, 약 96% 내지 100%, 약 97% 내지 100%, 약 98% 내지 100%, 약 99% 내지 100%는 캡슐화된 페이로드 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 중성 전하(예를 들어, 약 0 mV 내지 1 mV의 평균 제타 전위)를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 40 mV 내지 약 -40 mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 40 mV 내지 약 0 mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 35 mV 내지 약 0 mV, 약 30 mV 내지 약 0 mV, 약 25 mV 내지 약 0 mV, 약 20 mV 내지 약 0 mV, 약 15 mV 내지 약 0 mV, 약 10 mV 내지 약 0 mV, 또는 약 5 mV 내지 약 0 mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 20 mV 내지 약 -40 mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 20 mV 내지 약 -20 mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 10 mV 내지 약 -20 mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 10 mV 내지 약 -10 mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 10 mV, 약 9 mV, 약 8 mV, 약 7 mV, 약 6 mV, 약 5 mV, 약 4 mV, 약 3 mV, 약 2 mV, 약 1 mV, 약 0 mV, 약 -1 mV, 약 -2 mV, 약 -3 mV, 약 -4 mV, 약 -5 mV, 약 -6 mV, 약 -7 mV, 약 -8 mV, 약 -9 mV, 약 -9 mV 또는 약 -10 mV의 평균 제타 전위를 갖는다.
일부 구현예에서, LNP는 약 0 mV 내지 -20 mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 -20 mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, LNP는 약 -30 mV 미만, 약 35 mV 미만, 또는 약 -40 mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 -50 mV 내지 약 -20 mV, 약 -40 mV 내지 약 -20 mV, 또는 약 -30 mV 내지 약 -20 mV의 평균 제타 전위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 0 mV, 약 -1 mV, 약 -2 mV, 약 -3 mV, 약 -4 mV, 약 -5 mV, 약 -6 mV, 약 -7 mV, 약 -8 mV, 약 -9 mV, 약 -10 mV, 약 -11 mV, 약 -12 mV, 약 -13 mV, 약 -14 mV, 약 -15 mV, 약 -16 mV, 약 -17 mV, 약 -18 mV, 약 -19 mV, 약 -20 mV, 약 -21 mV, 약 -22 mV, 약 -23 mV, 약 -24 mV, 약 -25 mV, 약 -26 mV, 약 -27 mV, 약 -28 mV, 약 -29 mV, 약 -30 mV, 약 -31 mV, 약 -32 mV, 약 -33 mV, 약 -34 mV, 약 -35 mV, 약 -36 mV, 약 -37 mV, 약 -38 mV, 약 -39 mV 또는 약 -40 mV의 평균 제타 범위를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 -20 mV 미만, 약 -30 mV 미만, 약 35 mV 미만, 또는 약 -40 mV 미만의 평균 제타 전위를 갖는다.
일부 구현예에서, LNP는 종양 용해성 바이러스를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하고, 여기서 암호화된 종양 용해성 바이러스는 대상체에 대한 LNP 투여 부위로부터 멀리 떨어진 종양의 크기를 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 LNP의 정맥내 투여는 종양 조직에서 바이러스 복제 및 LNP 투여 부위로부터 멀리 떨어진 종양 또는 암성 조직에 대한 종양 크기의 감소를 초래한다. 이러한 효과는 용이하게 접근할 수 없고 따라서 종양내 치료 전달에 적합하지 않은 종양의 치료에서 본원에 기재된 LNP-캡슐화된 종양 용해 바이러스의 사용을 가능하게 한다.
페이로드
본원 개시내용의 LNP는 하나 이상의 페이로드 분자를 포함할 수 있다. 페이로드 분자는 표적 세포 또는 대상체에 전달하고자 하는 임의의 분자일 수 있다. 예를 들어, 페이로드 분자는 핵산, 폴리펩타이드, 소분자, 탄수화물, 효소, 염료, 형광색소 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 LNP는 LNP의 내부 및/또는 외부 표면에 연결된 하나 이상의 페이로드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 LNP는 하나 이상의 지질층, 소수성 구획, 친수성 구획, 또는 LNP의 캡슐화된 용적 내에 통합된 하나 이상의 페이로드 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 LNP는 하나 이상의 캡슐화된 페이로드 분자를 포함한다.
핵산 분자
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 핵산 페이로드 분자를 포함하는 LNP를 제공한다. 일부 구현예에서, LNP는 핵산 분자를 완전하게 캡슐화한다.
일부 구현예에서, LNP는 DNA, RNA, 잠긴 핵산, 단백질 핵산(PNA), 변형된 핵산, 핵산 유사체, 합성 핵산, 또는 DNA 또는 RNA를 발현할 수 있는 플라스미드를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 단일 가닥 RNA(ssRNA), siRNA, 마이크로RNA, mRNA, 또는 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 단일 가닥 RNA(ssRNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 또는 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 적어도 하나의 2’-O-메틸 (2’-OMe) 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 페이로드는 복제 적격 바이러스 게놈을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드이다. 하나의 양상에서, 본원 개시내용은 복제 적격 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하고, 여기서 복제 적격 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 오리진이 비바이러스이고, 폴리뉴클레오타이드는 비바이러스 전달 수단에 의해 세포 내로 도입되는 경우 복제 적격 바이러스를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산 페이로드는 복제 적격 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 DNA 또는 RNA 분자이고, 여기서 폴리뉴클레오타이드 서열은 포유동물 RNA 폴리머라제 II(Pol II)에 결합할 수 있는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되고, 3' 리보자임 암호화 서열 및 5' 리보자임 암호화 서열에 의해 플랭킹되어 있고, 여기서 복제 적격 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 오리진이 비바이러스성이다. 일부 구현예에서, 핵산 페이로드는 비바이러스 전달 비히클에 의해 세포 내로 도입되는 경우 감염성 용해성 바이러스를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드는 복제 적격 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 삽입된 하나 이상의 마이크로 RNA(miRNA) 표적 서열(miR-TS) 카세트를 추가로 포함하고, 여기서 miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 여기서 세포 내 하나 이상의 상응하는 miRNA의 발현은 세포 내에서 암호화된 바이러스의 복제를 억제한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 1,000 내지 20,000개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 1,000 내지 20,000개 뉴클레오타이드, 3,000 내지 20,000개 뉴클레오타이드, 5,000 내지 20,000개 뉴클레오타이드, 7,000 내지 20,000개 뉴클레오타이드, 10,000 내지 20,000개 뉴클레오타이드, 15,000 내지 20,000개 뉴클레오타이드, 1, 000 내지 15,000개 뉴클레오타이드, 3,000 내지 15,000개 뉴클레오타이드, 5,000 내지 15,000개 뉴클레오타이드, 7,000 내지 15,000개 뉴클레오타이드, 10,000 내지 15,000개 뉴클레오타이드, 1,000 내지 10,000개 뉴클레오타이드, 3,000 내지 10,000개 뉴클레오타이드, 5,000 내지 10,000개 뉴클레오타이드, 7,000 내지 10,000개 뉴클레오타이드, 1,000 내지 7,000개 뉴클레오타이드, 3,000 내지 7,000개 뉴클레오타이드, 5,000 내지 7,000개 뉴클레오타이드, 1,000 내지 5,000개 뉴클레오타이드, 3,000 내지 5,000개 뉴클레오타이드, 또는 1,000 내지 3,000개 뉴클레오타이드입 길이이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 6,000 내지 9,000개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 7,000 내지 8,000개 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 구현예에서, LNP는 10:1 내지 60:1, 20:1 내지 60:1, 30:1 내지 60:1, 40:1 내지 60:1, 50:1 내지 60:1, 10:1 내지 50:1, 20:1 내지 50:1, 30:1 내지 50:1, 40:1 내지 50:1, 10:1 내지 40:1, 20:1 내지 40:1, 30:1 내지 40:1, 10:1 내지 30:1, 20:1 내지 30:1, 또는 10:1 내지 20:1의 지질(L) 대 핵산 분자(N) 질량 비율을 갖고, 모든 종점을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 30:1 내지 40:1의 지질:핵산 분자 질량 비율을 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 30:1 내지 36:1의 지질:핵산 분자 질량 비율을 갖는다.
일부 구현예에서, LNP는 본원에 기재된 재조합 핵산 분자를 포함하고 약 10:1 내지 약 60:1의 지질(L) 대 핵산(N)의 질량 비율을 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 본원에 기재된 재조합 핵산 분자를 포함하고 약 20:1의 지질(L) 대 핵산(N)의 질량 비율을 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 본원에 기재된 재조합 핵산 분자를 포함하고 약 30:1의 지질(L) 대 핵산(N)의 질량 비율을 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 본원에 기재된 재조합 핵산 분자를 포함하고 약 40:1의 지질(L) 대 핵산(N)의 질량 비율을 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 본원에 기재된 재조합 핵산 분자를 포함하고 약 15:1, 약 16:1, 약 17:1, 약 18:1, 약 19:1, 약 20:1. 약 21:1, 약 22:1, 약 23:1, 약 24:1, 약 25:1, 약 26:1, 약 27:1, 약 28:1, 약 29:1, 약 30 :1, 약 31:1, 약 32:1, 약 33:1, 약 34:1, 약 35:1, 약 36:1, 약 237:1, 약 28:1, 약 39:1, 약 40 :1, 약 41:1, 약 42:1, 약 43:1, 약 44:1 또는 약 45:1의 L:N 질량 비율을 갖는다.
일부 구현예에서, LNP는 핵산 분자를 포함하고, 1 내지 25의 지질-질소 대 포스페이트 비율(N:P)을 갖는다. 일부 구현예에서, N:P는 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 5 내지 25, 5 내지 20, 5 내지 15, 5 내지 10, 10 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 15, 15 내지 25, 15 내지 20, 또는 20 내지 25이다. 일부 구현예에서, N:P는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 또는 약 25이다. 일부 구현예에서, N:P는 약 8.5이다. 일부 구현예에서, N:P는 약 9이다.
합성 RNA 바이러스 게놈
일부 구현예에서, 핵산 페이로드 분자는 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스의 부분 게놈을 포함한다. 일부 구현예에서, 복제 적격 바이러스 게놈은 DNA 바이러스의 게놈 또는 RNA 바이러스의 게놈이다. 일부 구현예에서, 복제 적격 바이러스 게놈은 아데노바이러스의 게놈이다. 일부 구현예에서, DNA 게놈 또는 RNA 게놈은 이중 가닥 또는 단일 가닥 바이러스이다. 일부 구현예에서, 복제 적격 바이러스는 아데노바이러스, 콕사키바이러스, 말 헤르페스 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 라사 바이러스, 마라바 바이러스, 홍역 바이러스, 뮤린 바이러스, 백혈병 바이러스, 믹소마 바이러스, 뉴캐슬 질환 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파보바이러스, 폴리오 바이러스(PVS-RIPO와 같은 키메라 폴리오 바이러스 포함), 레오바이러스, 세네카 밸리 바이러스(예를 들어, 세네카바이러스 A), 신드비스 바이러스, 키쿤구니야 바이러스, 베네주엘라 말 뇌염 바이러스 및 셈리키 포레스트 바이러스를 포함하는 알파바이러스 , 백시니아 바이러스 및 수포성 구내염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 암호화된 바이러스는 단일 가닥 RNA (ssRNA) 바이러스이다. 일부 구현예에서, ssRNA 바이러스는 양성 센스((+)-센스) 또는 음성 센스((-)-센스) ssRNA 바이러스이다. 일부 구현예에서, (+)-센스 ssRNA 바이러스는 피코나바이러스이다. 일부 구현예에서, 피코나바이러스는 세네카 밸리 바이러스(SVV) 또는 콕사키바이러스이다. 일부 구현예에서, 암호화된 바이러스는 콕사키바이러스 A21(CVA21)이다. 일부 구현예에서, 암호화된 바이러스는 하이브리드 바이러스(예를 들어, 슈도타입 바이러스), 알파바이러스(예를 들어, 신드비스 바이러스, 키쿤구니야 바이러스, 베네주엘라 말 뇌염 바이러스 및 셈리키 포레스트 바이러스) 및 피코나 및 알파바이러스의 레플리콘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 및/또는 염증 촉진 분자 분자(예를 들어, 사이토킨, 케모킨, 항체, 이중특이적, 바이러스 및 암 항원 암호화 뉴클레오타이드)를 암호화하는 변형된 바이러스 RNA이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 외인성 페이로드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 항원, 종양 항원, 사이토킨, 항체 또는 이중특이적 항체를 암호화하는 mRNA이다. 일부 구현예에서, 외인성 페이로드 단백질은 형광 단백질, 효소 단백질, 사이토킨, 케모킨, 세포 표면 수용체에 대한 리간드, 또는 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자이다.
일부 구현예에서, 핵산 페이로드 분자는 종양용해성 바이러스(예를 들어, RNA 게놈) 바이러스 게놈을 암호화하는 재조합 RNA 분자이다. 이러한 재조합 RNA 분자는 본원에서 "합성 바이러스 게놈" 또는 "합성 RNA 바이러스 게놈"으로 지칭된다. 이러한 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 비-바이러스 전달 비히클에 의해 세포 내로 도입될 때 감염성 용해성 바이러스를 생산할 수 있고 감염성 바이러스를 복제하고 생산하기 위해 세포에 존재하는 추가적인 외인성 유전자 또는 단백질을 필요로 하지 않는다. 오히려, 숙주 세포의 내인성 해독 기전은 합성 RNA 바이러스 게놈으로부터 바이러스 단백질의 발현을 중재한다. 발현된 바이러스 단백질은 이어서 바이러스 복제, 및 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 감염성 바이러스 입자(캡시드 단백질, 외피 단백질 및/또는 막 단백질을 포함할 수 있음)로의 어셈블리를 매개한다. 이와 같이, 본원에 기재된 RNA 폴리뉴클레오타이드(즉, 합성 RNA 바이러스 게놈)는 숙주 세포에 도입될 때 또 다른 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스를 생성한다. 일부 구현예에서, 종양 용해성 바이러스는 피코나바이러스(도 9에 도식으로 나타냄). 일부 구현예에서, 피코나바이러스는 CVA21이다. 일부 구현예에서, 피코나바이러스는 SVV이다.
일부 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 레플리콘, 전이유전자를 암호화하는 RNA 바이러스 게놈, mRNA 분자, 또는 환형 RNA 분자(circRNA)이다. 일부 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈은 단일 가닥 RNA(ssRNA) 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 게놈은 양성 센스 또는 음성 센스 게놈일 수 있다.
본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈은 종양 용해성 바이러스를 암호화한다. 종양 용해성 바이러스의 예는 피코나바이러스(예를 들어, 콕사키바이러스), 폴리오 바이러스, 홍역 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 오르토믹소바이러스 및 마라바 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 합성 RNA 바이러스 게놈에 의해 암호화된 종양 용해성 바이러스는 콕사키바이러스, 폴리오 바이러스(PVS-RIPO 및 기타 키메라 피코나바이러스와 같은 키메라 폴리오 바이러스 포함) 또는 세네카 밸리 바이러스, 또는 임의의 다수의 피코나바이러스로부터의 키메라 기원의 임의의 바이러스와 같은 피코나비리대과의 바이러스, 라사 바이러스와 같은 아레나비리대과의 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스와 같은 레트로비리대과의 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스와 같은 오르토믹소비리대과의 바이러스, 뉴캐슬 질환 바이러스 또는 홍역 바이러스와 같은 파라믹소비리대과의 바이러스, 포유동물 오르토레오바이러스와 같은 레오비리대과 바이러스, 신드비스 바이러스와 같은 토가비리대과의 바이러스 또는 수포성 구내염 바이러스 또는 마라바 바이러스와 같은 라브도바이러스과 바이러스(VSV)이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈은 단일 가닥 RNA(ssRNA) 바이러스 게놈을 암호화한다. 일부 구현예에서, ssRNA 바이러스는 양성 센스, ssRNA(+ 센스 ssRNA) 바이러스이다. 예시적인 + 센스 ssRNA 바이러스는 피코나비리대과(예를 들어, 콕사키바이러스, 폴리오 바이러스 및 세네카 밸리바이러스(SVV), SVV-A 포함), 코로나비리대과(예를 들어, HCoV-229E 및 HCoV-NL63과 같은 알파코로나바이러스, HCoV-HKU1, HCoV-OC3 및 MERS-CoV와 같은 베타코로노나바이러스), 레트로비리대과(예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스) 및 토가비리대과(예를 들어, 신드비스 바이러스)의 구성원을 포함한다. 양성 센스 ssRNA 바이러스의 추가적인 예시적인 속과 종은 하기 표 3에 나타낸다.
[표 3] 양성 센스 ssRNA 바이러스
일부 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 RNA 분자는 콕사키바이러스, 폴리오바이러스 및 세네카 밸리 바이러스(SVV)로부터 선택된 피코나바이러스를 암호화한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 RNA 분자는 콕사키바이러스를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈은 세네카 밸리 바이러스(SVV)를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 RNA 바이러스 게놈은 콕사키바이러스를 암호화한다. 일부 구현예에서, 콕사키바이러스는 CVB3, CVA21, 및 CVA9로부터 선택된다. 예시적인 콕사키바이러스의 핵산 서열은 GenBank 참조 번호 No. M33854.1(CVB3), GenBank 참조 번호 KT161266.1(CVA21), 및 GenBank 참조 번호 D00627.1(CVA9)에서 제공된다.
일부 구현예에서, 페이로드 분자는 종양 용해성 바이러스를 암호화한다. 일부 구현예에서, 종양 용해성 바이러스는 콕사키에바이러스, 세네카 밸리 바이러스, 토가비리대 또는 알파바이러스(예를 들어, 신드비스 바이러스, 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스, 로스 리버(Ross River) 바이러스 또는 키쿤구니야(Chikungunya) 바이러스))이거나 이로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 종양 용해성 바이러스는 콕사키바이러스 A21(CVA21)이거나 이로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 종양 용해성 바이러스는 세네카 밸리 바이러스(SVV)이거나 이로부터 유래한다.
기타 페이로드 분자
본원 개시내용의 LNP는 핵산, 폴리펩타이드, 소분자, 탄수화물, 효소, 염료, 형광색소 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 페이로드 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 LNP는 페이로드 분자의 조합을 포함한다. 페이로드 분자의 조합은 공유적으로 연결되거나, 비공유적으로 연합되거나, 연합이 없을 수 있다. 페이로드 분자 조합의 비제한적인 예는 항체-약물 접합체 및 Cas 단백질/gRNA 복합체를 포함한다.
일부 구현예에서, 페이로드 분자는 Cas 단백질/gRNA 복합체일 수 있다. CRISPR(클러스터링된 규치적 사이 공간의 짧은 팔린드롬 반복체(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats))/Cas(CRISPR 연합된) 뉴클레아제 시스템은 포유동물 게놈 가공에 사용할 수 있는 세균 시스템을 기반으로 하는 가공된 뉴클레아제 시스템이다. 일반적으로, 시스템은 Cas 단백질 (Cas 뉴클레아제) 및 가이드 RNA (gRNA)를 포함한다. gRNA는 2개의 부분; 표적 게놈 DNA 서열에 특이적인 crispr-RNA(crRNA), 및 Cas 결합을 촉진시키는 tracr RNA(trRNA)로 구성된다. crRNA 및 trRNA는 별도의 RNA 올리고뉴클레오타이드로서 존재할 수 있거나, 단일 가이드 RNA(sgRNA)로 지칭되는 동일한 RNA 올리고뉴클레오타이드에 존재할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 개별 trRNA 및 개별 crRNA 또는 sgRNA의 조합을 지칭한다. 예를 들어, 문헌(Jinek 등 (2012) Science 337:816-821; Cong 등 (2013) Science 339:819-823; 및 Ran 등 (2013) Nature Protocols 8(11):2281-2308; 미국 특허 공개 공보 2010-0093617, 2013-0011828, 2010-0257638, 2010-0076057, 2011-0217739, 2011-0300538, 2013-0288251, 및 2012-0277120; 및 미국 특허 제8,546,553호)을 참조하고, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 페이로드 분자는 염기 편집 효소(예를 들어, 시티딘 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제)일 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효소는 CRISPR 단백질에 융합된다. 일부 구현예에서, CRISPR 단백질은 가이드 RNA에 결합된다.
약제학적 조성물
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 화학식 I의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 비히클을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 표 1로부터 선택된 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 비히클을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 화학식 I의 화합물을 포함하는 지질 나노입자(LNP)를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 표 1로부터 선택된 화합물을 포함하는 LNP를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 화학식 A, A' 또는 A"의 화합물을 포함하는 지질 나노입자(LNP)를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 본원 개시내용의 LNP 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 다음을 포함할 수 있다: (i) 본원 개시내용의 LNP 및 임의로 페이로드 분자; 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제.
약제학적 조성물은 약제학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위한 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있고, 이에 의해 치료학적 분자는 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합물로 조합된다. 담체는 이의 투여가 수용자 대상체에 의해 용인될 수 있는 경우 "약제학적으로 허용되는 담체"라고 일컬어진다. 멸균 포스페이트 완충 식염수는 약제학적으로 허용되는 담체의 한 예이다. 다른 적합한 담체, 희석제 또는 부형제는 당업자에게 널리 공지되어 있다. (참조: 예를 들어, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995).) 제형은 하나 이상의 부형제, 보존제, 가용화제, 완충제, 바이알 표면 상의 단백질 손실을 방지하기 위한 알부민 등을 추가로 포함할 수 있다.
본원 개시내용의 LNP를 포함하는 약제학적 조성물은 경구 단위 투여 형태, 정맥내 단위 투여 형태, 비강내 단위 투여 형태, 좌제 단위 투여 형태, 피내 단위 투여 형태, 근육내 단위 투여 형태, 복강내 단위 투여 형태, 피하 단위 투여 형태, 경막외 단위 투여 형태, 설하 단위 투여 형태, 및 뇌내 단위 투여 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 투여 형태로 제형화될 수 있다. 경구 단위 투여 형태는 정제, 환제, 펠릿, 캡슐, 분말, 로젠지, 과립, 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 엘릭시르, 지연 방출 제형, 에어로졸 및 분무제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
약제학적 조성물은 치료학적 유효량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 예방학적 적용에서, LNP 및 임의로 본원 개시내용의 페이로드 분자를 포함하는 약제학적 조성물은 특정 장애에 걸리기 쉽거나 그렇지 않으면 그러한 위험이 있는 대상체에게 장애의 위험을 제거 또는 감소시키거나 발병을 지연시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료학적 적용에서, LNP 및 임의로 본원 개시내용의 페이로드 분자를 포함하는 조성물은 이러한 장애가 의심되거나 이미 앓고 있는 대상체에게 장애의 증상 및 이의 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이를 달성하기에 적절한 양은 치료학적 유효량 또는 양으로 지칭된다. 예방학적 및 치료학적 용법 둘 다에서, 페이로드 분자는 충분한 반응이 달성될 때까지 여러 용량으로 투여될 수 있다. 일반적으로 반응을 모니터링하고 목적하는 반응이 사라지기 시작하면 반복 투여된다.
본원 개시내용의 방법에 따르면, 조성물은, 예를 들어 근육내, 피하, 정맥내, 심방내, 관절내, 비경구, 비강내, 폐내, 경피, 흉막내, 척수강내, 종양내 및 경구 투여 경로에 의한 것을 포함하는 다양한 투여 방식에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 예방 및 치료 목적으로, 조성물은 단일 볼루스 전달, 장기간에 걸친 연속 전달(예를 들어, 연속 경피 전달)을 통해, 또는 반복 투여 프로토콜(예를 들어, 매시간, 매일, 매주 또는 매월 기준)로 대상체에게 투여될 수 있다.
투여는 주사, 관개, 흡입, 소비, 전기삼투, 혈액투석, 이온삼투 및 당업계에 공지된 기타 방법에 의해 수행될 수 있다. 투여 경로는 치료되는 질환의 위치와 특성에 따라 자연적으로 다양할 것이고, 예를 들어 귀의, 구강, 결막, 피부, 치과, 자궁경부, 굴내, 기관내, 장, 경막외, 간질, 관절내, 동맥내, 복부내, 귀내, 담도내, 기관지내, 활액낭내, 해면내, 뇌내, 수조내, 각막내, 크로날내(intracronal), 관상동맥내, 두개내, 피내, 추간판내, 관내, 십이지장내, 십이지장내, 경막내, 심외막내, 표피내, 식도내, 위내, 치은내, 간내, 회장내, 병변내, 설내, 관내, 림프내, 유방내, 골수내, 수막내, 근육내, 비강내, 결절내, 안내, 망막내, 난소내, 복강내, 심낭내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 관내, 창자내, 척수내, 윤활막내, 힘줄내, 고환내, 기관내, 척수강내, 흉강내, 관내, 종양내, 고막내, 자궁내, 복강내, 혈관내, 뇌실내, 방광내, 전정내, 정맥내, 유리체내, 후두, 비강, 비위, 경구, 안과, 구인두, 비경구, 경피, 관절주위, 경막외, 신경주위, 치주, 호흡기, 후관, 직장, 척추, 지주막하, 결막하, 피하, 피하, 치은하, 설하, 점막하, 망막하, 국소, 경피, 경심내막, 경점막, 태반통과, 기관내, 경고막, 요관, 요도, 및/또는 질 관류, 세척, 직접 주사 및 경구 투여를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 전신 투여를 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 전신 투여는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피내 투여, 피하 투여, 비강내 투여, 경구 투여 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 정맥내 투여를 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 국소 투여를 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 종양내 투여를 위해 제형화된다.
본원 개시내용의 조성물의 유효량은 투여 수단, 표적 부위, 대상체의 생리학적 상태, 대상체가 사람인지 동물인지 여부, 투여되는 다른 약물, 치료가 예방학적인지 치료학적인지 뿐만 아니라 조성물 자체의 특정 활성 및 개체에서 목적하는 반응을 유발하는 능력을 포함하는 많은 상이한 인자에 따라 다양하다. 일부 구현예에서, 대상체는 사람이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 비사람 포유류일 수 있다. 전형적으로, 투여 용법은 최적의 치료학적 반응을 제공하도록, 즉 안전성과 효능을 최적화하도록 조정된다.
이러한 맥락에서 유효 용량의 결정은 일반적으로 동물 모델 연구와 이어서 사람 임상 시험을 기반으로 하고, 모델 대상체에서 대상체 장애의 발생 또는 중증도를 유의적으로 감소시키는 유효 용량 및 투여 프로토콜을 결정함으로써 안내된다. 본원 개시내용의 조성물은 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에게 적합하게 투여될 수 있고, 진단 후 임의의 시점에 대상체에게 투여될 수 있다. 본원 개시내용의 조성물은 미지의 병태를 치료하는데 유용한 유일한 치료로서, 단독 치료요법으로서, 또는 조합 치료요법으로서, 다른 약물 또는 치료요법과 함께 투여될 수 있다.
약제학적 조성물의 용량은 담당 임상의에 의해 변경되어 표적 부위에서 목적하는 농도를 유지할 수 있다. 보다 높거나 보다 낮은 농도는 전달 방식을 기준으로 선택될 수 있다. 용량은 또한 투여되는 제형의 방출 속도를 기준으로 조정되어야 한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 대상체에게 여러 번 (예를 들어, 다중 용량) 투여된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상 등으로 투여된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 투여는 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 이상 반복될 수 있다. 약제학적 조성물은 의도된 목적에 따라 만성적으로 또는 급성적으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 조성물의 치료학적 유효량은 약 1 ng/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중이다. 일부 구현예에서, 투여되는 본원 개시내용의 조성물의 범위는 약 1 ng/kg 체중 내지 약 1 μg/kg 체중, 약 1 ng/kg 체중 내지 약 100 ng/kg 체중, 약 1 ng/kg 체중 내지 약 10 ng/kg 체중, 약 10 ng/kg 체중 내지 약 1 μg/kg 체중, 약 10 ng/kg 체중 내지 약 100 ng/kg 체중, 약 100 ng/kg 체중 내지 약 1 μg/kg 체중, 약 100 ng/kg 체중 내지 약 10 pg/kg 체중, 약 1 μg/kg 체중 내지 약 10 pg/kg 체중, 약 1 μg/kg 체중 내지 약 100 pg/kg 체중, 약 10 pg/kg 체중 내지 약 100 pg/kg 체중, 약 10 pg/kg 체중 내지 약 1 mg/kg 체중, 약 100 μg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중, 또는 약 10 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중이다. 상기 범위 내의 용량은 예를 들어 1일 다중 투여 또는 매일, 매주, 격주 또는 매월 투여를 포함하는 단일 또는 다중 투여에 의해 달성될 수 있다. 본원 개시내용의 조성물은 적절하거나 지시된 대로 볼루스 또는 연속 주입에 의한 단일 용량으로, 또는 볼루스 또는 연속 주입에 의한 다중 용량으로 투여될 수 있다. 다중 용량은 예를 들어 하루에 여러 번, 하루에 한 번, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다, 매주, 2, 3, 4, 5 또는 6주마다 또는 매월 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 조성물은 매주 투여된다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 조성물은 격주로 투여된다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 조성물은 3주마다 투여된다. 그러나, 다른 투여 용법이 유용할 수 있다. 상기 치료요법의 진행은 통상적인 기술에 의해 용이하게 모니터링된다.
사람 성인 대상체에게 투여하기 위해, 치료학적 유효량은 용량당 0.0006 mg, 용량당 0.001 mg, 용량당 0.003 mg, 용량당 0.006 mg, 용량당 0.01 mg, 용량당 0.03 mg, 용량당 0.06 mg, 용량당 0.1 mg, 용량당 0.3 mg, 용량당 0.6 mg, 용량당 1 mg, 용량당 3 mg, 용량당 6 mg, 용량당 10 mg, 용량당 30 mg, 용량당 60 mg, 용량당 100 mg, 용량당 300 mg, 용량당 600 mg 및 용량당 1000 mg을 포함하지만 이에 제한되지 않은 0.0006 mg 내지 1000 mg의 범위의 용량으로 투여될 수 있고, 치료 과정에서 일반적으로 연속 일일 용량을 여러 번 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 조성물은 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 0.6 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 0.3 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 0.1 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 0.06 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 0.03 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 0.01 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 0.006 mg/kg/용량, 약 0.001 mg/kg/용량 내지 약 0.003 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 0.6 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 0.3 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 0.1 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 0.06 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 0.03 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 0.01 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량 내지 약 0.006 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 0.6 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 0.3 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 0.1 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 0.06 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 0.03 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량 내지 약 0.01 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 0.6 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 0.3 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 0.1 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 0.06 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 0.03 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/kg/용량 내지 약 0.6 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/kg/용량 내지 약 0.3 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/kg/용량 내지 약 0.1 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/kg/용량 내지 약 0.06 mg/kg/용량, 약 0.06 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.06 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.06 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.06 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 0.06 mg/kg/용량 내지 약 0.6 mg/kg/용량, 약 0.06 mg/kg/용량 내지 약 0.3 mg/kg/용량, 약 0.06 mg/kg/용량 내지 약 0.1 mg/kg/용량, 약 0.1 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.1 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.1 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.1 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 0.1 mg/kg/용량 내지 약 0.6 mg/kg/용량, 약 0.1 mg/kg/용량 내지 약 0.3 mg/kg/용량, 약 0.3 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.3 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.3 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.3 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 0.3 mg/kg/용량 내지 약 0.6 mg/kg/용량, 약 0.6 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 0.6 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 0.6 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 0.6 mg/kg/용량 내지 약 1 mg/kg/용량, 약 1 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 1 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 약 1 mg/kg/용량 내지 약 3 mg/kg/용량, 약 3 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량, 약 3 mg/kg/용량 내지 약 6 mg/kg/용량, 또는 약 6 mg/kg/용량 내지 약 10 mg/kg/용량의 용량 수준으로 투여된다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 조성물은 약 0.001 mg/kg/용량, 약 0.003 mg/kg/용량, 약 0.006 mg/kg/용량, 약 0.01 mg/kg/용량, 약 0.03 mg/kg/용량, 약 0.06 mg/kg/용량, 약 0.1 mg/kg/용량, 약 0.3 mg/kg/용량, 약 0.6 mg/kg/용량, 약 1 mg/kg/용량, 약 3 mg/kg/용량, 약 6 mg/kg/용량 또는 약 10 mg/kg/용량의 용량 수준으로 투여된다. 본원 개시내용의 조성물은 하루 중 다양한 시간에 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 최적의 치료학적 용량은 저녁에 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 최적의 치료학적 용량은 아침에 투여될 수 있다. 예상된 바와 같이, 용량은 대상체의 병태, 크기, 연령 및 조건에 의존한다.
약제학적 조성물의 용량은 담당 임상의에 의해 변경되어 표적 부위에서 목적하는 농도를 유지할 수 있다. 보다 높거나 보다 낮은 농도는 전달 방식을 기준으로 선택될 수 있다. 용량은 또한 투여되는 제형의 방출 속도를 기준으로 조정되어야 한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 대상체에게 여러 번(예를 들어, 다중 용량) 투여된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상 등으로 투여된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 투여는 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 이상 반복될 수 있다. 약제학적 조성물은 의도된 목적에 따라 만성적으로 또는 급성적으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 2회 연속 투여 사이의 간격은 4주 미만, 3주 미만, 2주 미만, 또는 1주 미만이다. 일부 구현예에서, 2개의 연속 투여 사이의 간격은 3주 미만이다. 일부 구현예에서, 2개의 연속 투여 사이의 간격은 2주 미만이다. 일부 구현예에서, 2개의 연속 투여 사이의 간격은 1주 미만이다. 일부 구현예에서, 2개의 연속 투여 사이의 간격은 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1일 미만이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 2회 연속 투여 사이의 간격은 적어도 4주, 적어도 3주, 적어도 2주, 또는 적어도 1주이다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물의 2회 연속 투여 사이의 간격은 적어도 3주이다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물의 2회 연속 투여 사이의 간격은 적어도 2주이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 2회 연속 투여 사이의 간격은 적어도 1주이다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물의 2회 연속 투여 사이의 간격은 적어도 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1일이다. 일부 구현예에서, 대상체에 매일, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28일 마다 1회 본원 개시내용의 약제학적 조성물의 용량이 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에 본원 개시내용의 약제학적 조성물의 용량이 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12주 마다 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에 본원 개시내용의 약제학적 조성물의 용량이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 마다 1회 투여된다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 수회 투여되고, 여기서 두 번째 및/또는 후속 투여 후 대상체에서 LNP의 혈청 반감기는 첫번째 투여 후 LNP의 혈청 반감기의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다.
일부 구현예에서, 페이로드 분자를 포함하는 약제학적 조성물의 2차 및 후속 용량은 페이로드 분자의 활성을 1차 용량의 활성의 적어도 50%, 1차 용량의 적어도 60%, 또는 1차 용량의 적어도 70%, 1차 용량의 적어도 75%, 1차 용량의 적어도 80%, 1차 용량의 적어도 85%, 1차 용량의 적어도 90%, 또는 1차 용량의 적어도 95% 이상으로 2차 투여 또는 후속 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 동안 유지할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 약 1시간 이상, 약 2시간 이상, 약 3시간 이상, 약 4시간 이상, 약 5시간 이상, 약 6시간 이상, 약 7시간 이상, 약 8시간 이상, 약 9시간 이상, 약 10시간 이상, 약 12시간 이상, 약 14시간 이상, 약 16시간 이상, 약 18시간 이상, 약 20시간 이상, 약 25시간 이상, 약 30시간 이상, 약 35시간 이상, 약 40시간 이상, 약 45시간 이상 또는 약 50시간 이상의 생체내 치료학적 효과의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 적어도 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 1.5일, 2일, 3 일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일의 생체내 치료학적 효과의 지속 기간을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 미리 결정된 역치 값에 필적하는 생체내 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 미리 결정된 역치 값을 초과하는 생체내 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 미리 결정된 역치 값 미만의 생체내 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 미리 결정된 역치 값은 LNP가 (i) 화학식 A, A' 또는 A''가 아닌 PEG-지질(예를 들어, 대조군 조성물 중에 LNP의 PEG-지질은 PEG2k-DPG일 수 있음); 또는 (ii) 화학식 I이 아닌 양이온성 지질을 포함하는 것을 제외하고는 동일한 페이로드 분자 및 LNP를 포함하는 대조군 조성물의 반감기이다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 반복 투여 후 AUC(혈중 농도-시간 곡선 이하 면적)가 이전 투여 후 AUC의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 이전 투여 후 AUC의 적어도 60%인 AUC를 갖는다. 일부 구현예에서, 반복 투여 후, 약제학적 조성물의 AUC는 이전 투여 후 AUC와 비교하여 70% 미만, 60% 미만, 60% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만이다. 일부 구현예에서, 반복 투여 후, 약제학적 조성물의 AUC는 이전 투여 후 AUC와 비교하여 40% 미만으로 감소한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 종양 용해성 바이러스의 바이러스 게놈을 암호화하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 종양을 앓고 있는 대상체에게 제약 조성물을 투여하면 핵산 분자를 종양 세포 내로 전달한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 RNA 분자이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 투여는 종양 세포에서 종양 용해성 바이러스의복제를 초래한다. 일부 구현예에서, 종양을 앓고 있는 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하면 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 종양 용해성 바이러스의 선택적 복제를 초래한다.
일부 구현예에서, 종양을 앓고 있는 대상체에게 본원 개시내용의 약제학적 조성물을 투여하면 종양의 성장을 억제한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 투여는 적어도 1주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월, 적어도 12개월, 적어도 2년 또는 그 이상 동안 종양의 성장을 억제한다. 일부 구현예에서, 종양의 성장을 억제한다는 것은 특정 기간 동안 약제학적 조성물을 투여하기 직전의 종양 크기의 100% 이내로 종양의 크기를 제어한다하는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 종양의 성장을 억제한다는 것은 종양의 크기를 약제학적 조성물 투여 직전 종양 크기의 110% 이내, 120% 이내, 130% 이내, 140% 이내 또는 150% 이내로 제어한다는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 종양을 앓고 있는 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하면 종양 수축 또는 제거를 유도한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 투여는 적어도 1주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월, 적어도 12개월, 적어도 2년 또는 그 이상 동안 종양 수축 또는 제거를 유도한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 투여는 1주 이내, 2주 이내, 3주 이내, 4주 이내, 1개월 이내, 2개월 이내, 3개월 이내, 4개월 이내, 6개월 이내, 9개월 이내, 12개월 이내 또는 2년 이내에 종양 수축 또는 제거를 유도한다. 일부 구현예에서, 종양 수축은 종양 크기를 약제학적 조성물 투여 직전의 종양 크기와 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%까지 감소시키는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 종양 수축은 약제학적 조성물 투여 직전의 종양 크기와 비교하여 종양 크기가 적어도 30% 감소하는 것을 의미한다.
약제학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 포함하는 컨테이너를 포함하는 키트로서 공급될 수 있다. 약제학적 조성물은, 예를 들어 단일 또는 다중 용량을 위한 주사 가능한 용액의 형태로, 또는 주사 전에 재구성될 멸균 분말로 제공될 수 있다. 대안적으로, 상기 키트는 건조 분말 분배기, 액체 에어로졸 발생기, 또는 약제학적 조성물의 투여를 위한 분무기를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 약제학적 조성물의 적응증 및 사용법에 대한 서면 정보를 추가로 포함할 수 있다.
사용 방법
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 치료학적 유효량의 본원 개시내용의 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 본원에 기재된 지질 나노입자를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 암을 포함한다.
방법은 특히 페이로드 분자가 치료학적 제제인 경우 페이로드 분자로부터 이득을 얻는 병태태를 갖거나 가질 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법일 수 있다. 대안적으로, 방법은 대상체를 진단하는 방법일 수 있고, 이 경우 페이로드 분자는 진단제일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 본원에 기재된 지질 입자 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 세포에 페이로드를 전달하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 (i) 화학식 I의 화합물; (ii) 표 1로부터 선택되는 화합물, 또는 (iii) 화학식 A, A', 또는 A''의 화합물을 포함하는 나노 입자 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 세포에 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편의 발현이 증가되도록 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 면역치료제 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 암호화한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 면역치료제 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 암호화한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 바이러스 게놈 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 항원, 단백질, CAS9 단백질, 염기 편집 효소 또는 이의 융합 단백질(예를 들어, 가이드 RNA에 결합된 CRISPR 단백질에 융합된 염기 편집 효소)을 암호화한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 siRNA, saRNA, miRNA, 또는 가이드 RNA를 포함한다.
여전히 추가의 관련 구현예에서, 본원 개시내용은 대상체에게 본원 개시내용의 지질 입자 또는 약제학적 조성물을 제공하는 단계를 포함하는, 대상체에서 폴리펩타이드의 과발현을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 포함하고, 여기서 치료학적 제제는 폴리뉴클레오타이드이다.
또 다른 관련 구현예에서, 본원 개시내용은 대상체에서 폴리펩타이드의 과소 발현을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 구현예에서, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 고환암, 결장직장암, 결장암, 췌장암, 간암, 위암, 두경부암, 갑상선암, 악성 신경교종, 교모세포종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, B 세포 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 신장 세포 암종 및 신경모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다. 일부 구현예에서, 암은 폐암이다. 일부 구현예에서, 폐암은 소 세포 폐암 또는 비-소세포 폐암이다. 일부 구현예에서, 암은 간암이다. 일부 구현예에서, 간암은 간세포 암종(HCC)이다. 일부 구현예에서, 신장암은 신장 투명 세포암(RCC)이다. 일부 구현예에서, 신장 세포 암종은 투명 세포 신장 세포 암종, 유두상 신장 세포 암종 및 발색성 신장 세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 B 세포 림프종이다. 일부 구현예에서, B 세포 림프종은 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 변연부 림프종 및 맨틀 세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 백혈병이다. 일부 구현예에서, 백혈병은 B 세포 백혈병, T 세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 본원 개시내용은 바이러스, 세균 또는 진균 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체의 혈청에서 항체 생산을 유발하기에 충분한 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여되는 조성물의 양은 순환하는 항체를 생성하거나; 대상체에서 바이러스 특이적 CD8+ T 세포를 생산하거나; 항원 특이적 항체를 생산하기에 충분하다.
다른 구현예에서, 투여는 비경구적이다. 일부 구현예에서, 투여는 피하 주사, 피내 주사 또는 근육내 주사에 의한 것이거나; 약제학적 조성물은 적어도 2회 투여된다. 또 다른 구현예에서, 방법은 추가로 항체 역가 또는 CD8+ T 세포를 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 항체를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 세포 연합 또는 분비 단백질 또는 사람 단백질의 단편 또는 변이체에 결합할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 항체는 바이러스, 세균 또는 진균 입자에 결합할 수 있다. 본원 개시내용의 또 다른 양상은 대상체에게 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체의 혈청에서 항체 생산을 유발하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법이다.
다양한 구현예에서, 본원 개시내용은 치료학적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 페이로드 분자를 세포에 전달하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포를 LNP 또는 이의 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 LNP는 페이로드 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 페이로드 분자는 바이러스를 암호화하는 핵산 분자이고, 여기서 세포를 LNP와 접촉시키면 세포에 의해 바이러스 입자가 생성되고, 바이러스 입자는 감염성 및 용해성이다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 대상체에게 본원 개시내용의 LNP 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, LNP를 대상체에게 전달하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 다중 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 2회 연속 투여 사이의 간격은 4주 미만, 3주 미만, 2주 미만, 또는 1주 미만이다. 일부 구현예에서, 2회 연속 투여 사이의 간격은 2주 미만이다. 일부 구현예에서, 2회 연속 투여 사이의 간격은 1주 미만이다. 일부 구현예에서, 2회 연속 투여 사이의 간격은 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1일 미만이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 2회 연속 투여 사이의 간격은 적어도 4주, 적어도 3주, 적어도 2주, 또는 적어도 1주이다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물의 2회 연속 투여 사이의 간격은 적어도 2주이다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물의 2회 연속 투여 사이의 간격은 적어도 1주이다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물의 2회 연속 투여 사이의 간격은 적어도 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1일이다. 일부 구현예에서, 방법은 본원 개시내용의 약제학적 조성물을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28일 마다 대상체에게 투여함을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 본원 개시내용의 약제학적 조성물을 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12주 마다 1회 투여함을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 본원 개시내용의 약제학적 조성물을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 마다 1회 투여함을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 대상체에게 본원 개시내용의 LNP 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, LNP를 대상체에게 전달하는 방법을 제공하고, 여기서 방법은 다중 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법의 2차 및/또는 후속 투여 후 대상체에서 LNP의 혈청 반감기는 1차 투여 후 LNP의 혈청 반감기의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다.
일부 구현예에서, LNP는 이전 투여 후 AUC의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%인 반복 투여 후 AUC를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 이전 투여 후 AUC의 적어도 60%인 AUC를 갖는다. 일부 구현예에서, 반복 투여 후, LNP의 AUC는 이전 투여 후 AUC와 비교하여 70% 미만, 60% 미만, 60% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만으로 감소한다. 일부 구현예에서, 반복 투여 후, LNP의 AUC는 이전 투여 후 AUC와 비교하여 40% 미만으로 감소한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 대상체에게 본 개시내용의 LNP 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, LNP를 대상체에게 전달하는 방법을 제공하고, 여기서 LNP는 종양 용해성 바이러스의 바이러스 게놈을 암호화하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 대상체는 종양을 갖고 있고, 여기서 LNP의 투여는 핵산 분자를 종양 세포 내로 전달한다. 일부 구현예에서, LNP의 투여는 종양 세포에서 종양 용해성 바이러스의 복제를 초래한다. 일부 구현예에서, LNP의 투여는 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 종양 용해성 바이러스의 선택적 복제를 초래한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 대상체에게 본원 개시내용의 LNP 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, LNP를 대상체에게 전달하는 방법을 제공하고, 여기서 종양을 함유하는 대상체로의 LNP의 투여는 종양의 성장을 억제한다. 일부 구현예에서, 방법은 적어도 1주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월, 적어도 12개월, 적어도 2년 또는 그 이상 동안 종양의 성장을 억제한다. 일부 구현예에서, 종양의 성장을 억제한다는 것은 특정 기간 동안 약제학적 조성물을 투여하기 직전의 종양 크기의 100% 이내로 종양의 크기를 제어한다하는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 종양의 성장을 억제한다는 것은 종양의 크기를 약제학적 조성물 투여 직전 종양 크기의 110% 이내, 120% 이내, 130% 이내, 140% 이내 또는 150% 이내로 제어한다는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 대상체에게 본원 개시내용의 LNP 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, LNP를 대상체에게 전달하는 방법을 제공하고, 여기서 종양을 함유하는 대상체로의 LNP의 투여는 종양 수축 또는 제거를 유발한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 투여는 적어도 1주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월, 적어도 12개월, 적어도 2년 또는 그 이상 동안 종양 수축 또는 제거를 유도한다. 일부 구현예에서, 방법은 1주 이내, 2주 이내, 3주 이내, 4주 이내, 1개월 이내, 2개월 이내, 3개월 이내, 4개월 이내, 6개월 이내, 9개월 이내, 12개월 이내 또는 2년 이내에 종양 수축 또는 제거를 초래한다. 일부 구현예에서, 종양 수축은 종양 크기를 약제학적 조성물 투여 직전의 종양 크기와 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%까지 감소시키는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 종양 수축은 약제학적 조성물 투여 직전의 종양 크기와 비교하여 종양 크기가 적어도 30% 감소하는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 대상체에게 본원 개시내용의 LNP 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, LNP를 대상체에게 전달하는 방법을 제공하고, 여기서 종양을 함유하는 대상체로의 LNP의 투여는 암의 전이를 억제한다.
일부 구현예에서, 대상체는 포유류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 사람이다. 일부 구현예에서, 대상체는 암을 갖고, 여기서 방법은 암의 성장 및/또는 전이를 억제하거나 서행시킨다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 LNP 또는 이의 약제학적 조성물을 전신 투여하는 단계를 포함하는, LNP를 대상체에게 전달하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 투여는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피내, 피하, 비강내, 경구 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 LNP 또는 이의 약제학적 조성물을 국소 투여하는 단계를 포함하는, LNP를 대상체에게 전달하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 투여는 종양내 투여이다.
일부 구현예에서, 암은 폐암, 간암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 위암, 유방암, 신경모세포종, 횡문근육종, 수모세포종 또는 흑색종이다. 일부 구현예에서, 암은 신경내분비암이다.
암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종(지방육종, 골형성 육종, 혈관육종, 내피육종, 평활근육종, 척색종, 림프관육종, 림프관내피육종, 횡문근육종, 섬유육종, 점액육종, 연골육종 포함), 신경내분비 종양, 중피종, 윤활막종 , 신경초종, 수막종, 선암종, 흑색종, 백혈병 또는 림프성 악성종양을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예는 편평 세포암(예를 들어, 상피 편평 세포암), 소세포 폐암, 비소 세포 폐암, 폐 선암종 및 폐 편평 암종, 소세포 폐 암종을 포함한 폐암, 복막암, 간세포암, 위장암을 포함한 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막암 또는 위암 자궁 암종, 침샘암종, 콩팥 또는 신장 암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 항문암종, 음경암종, 고환암, 식도암, 담도종양, 유잉종양, 기저세포암종, 선암종 , 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지성 암종, 신장 세포 암종, 간종, 담관 암종, 융모막 암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 고환 종양, 폐암종, 방광암종, 상피암종, 신경아교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 골수이형성질환, 중쇄 질환, 신경내분비 종양, 신경초종, 기타 암종, 두경부암을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 소세포 폐암(SCLC), 소세포 방광암, 대세포 신경내분비 암종(LCNEC), 거세 내성 소세포 신경내분비 전립선암(CRPC-NE), 카르시노이드(예를 들어, 폐 카르시노이드) 및 다형성 교모세포종-IDH 돌연변이(GBM-IDH 돌연변이)로부터 선택된다.
LNP 제조 방법
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 다음 단계를 포함하는, 핵산 분자를 함유하는 지질 나노입자(LNP)의 조성물을 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 수용액에서 핵산 분자를 목적하는 농도로 희석하는 단계;
(b) LNP의 모든 지질 성분을 포함하는 유기 지질상을 미세유체 흐름을 사용하여 핵산 분자를 함유하는 수성상과 혼합하여 LNP를 형성하는 단계;
(c) LNP를 완충액에 대해 투석하여 유기 용매를 제거하는 단계;
(d) LNP를 표적 용적으로 농축시키는 단계; 및
(E) 임의로 멸균 필터를 통해 여과하는 단계.
일부 구현예에서, 유기 지질 상과 수성 상은 1:1 (v:v) 내지 1:10 (v:v)의 비율로 혼합된다. 일부 구현예에서, 유기 지질상 및 수성상은 1:1 (v:v), 1:2 (v:v), 1:3 (v:v), 1:4 (v:v), 1:5 (v:v), 1:6 (v:v), 1:7 (v:v), 1:8 (v:v), 1:9 (v:v), 또는 1:10 (v:v)의 비율로 혼합된다. 일부 구현예에서, 유기 지질상 및 수성상은 1:1 (v:v) 내지 1:3 (v:v), 1:2 (v:v) 내지 1:4 (v:v), 1:3 (v:v) 내지 1:5 (v:v), 1:4 (v:v) 내지 1:6 (v:v), 1:5 (v:v) 내지 1:7 (v:v), 1:6 (v:v) 내지 1:8 (v:v), 1:7 (v:v) 내지 1:9 (v:v), 또는 1:8 (v:v) 내지 1:10 (v:v)의 비율로 혼합된다. 일부 구현예에서, 유기 지질상과 수성상은 1:3(v:v) 내지 1:5(v:v)의 비율로 혼합된다. 일부 구현예에서, 유기 지질상과 수성상은 1:3(v:v)의 비율로 혼합된다. 일부 구현예에서, 유기 지질상과 수성상은 1:5(v:v)의 비율로 혼합된다.
일부 구현예에서, 미세유체 흐름의 총 유속은 5-20 mL/min이다. 일부 구현예에서, 미세유체 흐름의 총 유속은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 mL/min이다. 일부 구현예에서, 미세유체 흐름의 총 유속은 9-20 mL/min이다. 일부 구현예에서, 미세유체 흐름의 총 유속은 11-13 mL/min이다.
일부 구현예에서, 단계 (b)의 유기 지질상의 용매는 에탄올이다. 일부 구현예에서, 열은 단계 (b)에서 유기 지질상에 적용된다. 일부 구현예에서, 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80℃는 단계 (b)에서 유기 지질상에 적용된다. 일부 구현예에서, 60℃ 열은 단계 (b)에서 유기 지질상에 적용된다. 일부 구현예에서, 열은 단계 (b)에서 유기 지질상에 적용되지 않는다.
일부 구현예에서, 단계 (a)에서 수용액은 1 내지 7의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (a)의 수용액은 1 내지 3, 2 내지 4, 3 내지 5, 4 내지 6, 또는 5 내지 7의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (a)에서 수용액은 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 또는 7의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (a)의 수용액은 3의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (a)의 수용액은 5의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 총 지질 농도는 5 mM 내지 80 mM이다. 일부 구현예에서, 총 지질 농도는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80 mM이다. 일부 구현예에서, 총 지질 조성물은 약 20 mM이다. 일부 구현예에서, 총 지질 조성물은 약 40 mM이다.
일부 구현예에서, 상기 방법에 의해 생성된 LNP는 1 내지 25의 지질-질소-대-포스페이트 비율(N:P)을 갖는다. 일부 구현예에서, N:P는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25이다. 일부 구현예에서, N:P는 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 5 내지 25, 5 내지 20, 5 내지 15, 5 내지 10, 10 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 15, 15 내지 25, 15 내지 20, 또는 20 내지 25이다. 일부 구현예에서, LNP는 핵산 분자를 포함하고, 14의 지질-질소-대-포스페이트 비율(N:P)을 갖는다.
일부 구현예에서, 단계 (c)의 완충액은 중성 pH(예를 들어, 1x PBS, pH 7.2)를 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 농축을 위해 원심분리 여과를 사용한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 방법의 캡슐화 효율은 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%이다. 일부 구현예에서, 본원 개시 내용의 캡슐화 효율은 적어도 90%이다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 캡슐화 효율은 적어도 95%이다. 일부 구현예에서, 캡슐화 효율은 RiboGreen에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 방법에 의해 생성된 LNP는 약 50 nm 내지 약 500 nm의 평균 크기(즉, 평균 외부 직경)를 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 약 50 nm 내지 약 200 nm, 약 100 nm 내지 약 200 nm, 약 150 nm 내지 약 200 nm, 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 100 nm 내지 약 150 nm, 약 200 nm 내지 약 250 nm, 약 250 nm 내지 약 300 nm, 약 300 nm 내지 약 400 nm, 약 150 nm 내지 약 500 nm, 약 200 nm 내지 약 500 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 약 350 nm 내지 약 500 nm, 약 400 nm 내지 약 500 nm, 약 425 nm 내지 약 500 nm, 약 450 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 475 nm 내지 약 500 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 110 nm, 약 120, 또는 약 125 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 약 100 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 50 nm 내지 150 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 50 nm 내지 150 nm, 50 nm 내지 125 nm, 50 nm 내지 100 nm, 50 nm 내지 75 nm, 75 nm 내지 150 nm, 75 nm 내지 125 nm, 75 nm 내지 100 nm, 100 nm 내지 150 nm, 100 nm 내지 125 nm, 또는 125 nm 내지 150 nm의 평균 크기(평균 외부 직경)를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 70 nm 내지 90 nm, 80 nm 내지 100 nm, 90 nm 내지 110 nm, 100 nm 내지 120 nm, 110 nm 내지 130 nm, 120 nm 내지 140 nm, 또는 130 nm 내지 150 nm의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP는 90 nm 내지 110 nm의 평균 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, 복수의 LNP의 다분산 지수는 0.01 내지 0.3이다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP의 다분산 지수는 0.1 내지 0.15이다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP의 다분산 지수는 약 0.01, 약 0.02, 약 0.03, 약 0.04, 약 0.05, 약 0.06, 약 0.07, 약 0.08, 약 0.09, 약 0.10, 약 0.11, 약 0.12, 약 0.13, 약 0.14, 약 0.15, 약 016, 약 0.17, 약 0.18, 약 0.19, 약 0.20, 약 0.21, 약 0.22, 약 0.23, 약 0.24, 약 0.25, 약 0.26, 약 0.27, 약 0.28, 약 0.29, 또는 약 0.30이다. 일부 구현예에서, 복수의 LNP의 다분산 지수는 약 0.10, 약 0.11, 약 0.12, 약 0.13, 약 0.14, 또는 약 0.15이다. 일부 구현예에서, 평균 직경 및/또는 다분산도는 역학적 광 산란을 통해 결정된다.
예시
약어:
Bn: 벤질
DCM: 디클로로메탄
DMAP: 4-디메틸아미노피리딘
EtOAc: 에틸 아세테이트
EDCI: 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피
LCMS: 액체 크로마토그래피-질량 분광측정
Ns: 노실레이트
TBAI: 테트라부틸암모늄 요오다이드
TEA: 트리에틸아민(NEt3)
THF: 테트라하이드로푸란
TFA: 트리플루오로아세트산
Ts: 토실
약동학적 파라미터
AUC(곡선 이하 면적): 농도-시간 곡선의 적분
Cmax: 투여 후 약물의 피크 혈장 농도
C 0: 소정 용적의 혈장에서 약물의 양
CL(소거율): 유닛 시간 당 약물로부터 소거된 혈장의 용적
t 1/2(제거 반감기): 이의 본래 값의 절반에 도달하는 약물 농도를 위해 요구되는 시간
t max: Cmax에 도달하는 시간
V ss (분포의 정상 상태의 용적): 약물이 정상 상태에서 분배되는 겉보기 용적
실시예 1: 이온화 가능한 지질의 합성
중간체 A의 합성: 경로 1
단계 1: (2E,2'E)-디에틸 4,4'-(벤질아자네디일)비스(부-2-에노에이트) (2)
MeCN(300 mL) 중의 페닐메탄아민(6.94 g, 64.75 mmol, 0.5 당량) 용액에 K2CO3(19.69 g, 142.46 mmol, 1.1 당량) 및 에틸 (E)-4-브로모부트-2-에노에이트(25 g, 129.51 mmol, 1 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 16시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 필터 케이크를 EtOAc(20 mL*2)로 세척하였다. 여과물을 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(120 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc/석유 에테르(PE): 0~10%)로 정제하여 황색 오일로서 화합물 2(20.3 g, 56.17 mmol, 43.4% 수율)를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.39 - 7.31 (m, 4H), 7.30 - 7.23 (m, 1H), 6.99 - 6.93 (m, 2H), 6.07 - 6.03 (m, 2H), 4.22 (q, J = 7.2, 4H), 3.63 (s, 2H), 3.24 - 3.23 (m, 4H), 1.32 (t, J = 7.2, 6H).
단계 2: 디에틸 4,4'-((tert-부톡시카보닐)아자네디일)디부타노에이트(3)
EtOH(400 mL) 중의 에틸 (E)-4-[벤질-[(E)-4-에톡시-4-옥소-부트-2-에닐]아미노]부트-2-에노에이트(20 g, 60.35 mmol, 1 당량) 용액에 N2 하에 (Boc)2O(19.76 g, 90.52 mmol, 20.80 mL, 1.5 당량) 및 Pd/C(3 g, 60.35 mmol, 10% 순도)를 첨가하였다. 현탁액을 진공하에 탈기시키고 H2로 수회 세정하였다. 혼합물은 8시간 동안 H2(50 psi)하에 35℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 필터 케이크를 에탄올(80 mL*2)로 세척하였다. 여과물을 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(120 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc/석유 에테르(PE): 0~15%)로 정제하여 황색 오일로서 화합물 3(13.2 g, 38.21 mmol, 63.3% 수율)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.17 - 4.12 (m, 4H), 3.25 - 3.21 (m, 4H), 2.34 - 2.29 (m, 4H), 1.89 - 1.82 (m, 4H), 1.47 (s, 9H), 1.30 - 1.25 (m, 6H).
단계 3: 4,4'-((tert-부톡시카보닐)아자네디일)디부탄산(4)
THF(150 mL) 중의 에틸 4-[tert-부톡시카보닐-(4-에톡시-4-옥소-부틸)아미노]부타노에이트(12.7 g, 36.77 mmol, 1 당량) 용액에 H2O(20 mL) 중의 LiOHㆍH2O(5.40 g, 128.68 mmol, 3.5 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 16시간 동안 30℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 H2O(120 mL)로 희석시켰다. 상기 수성상을 EtOAc(50 mL*2)로 추출하였다. 이어서, 수성상을 수성 HCl(1 N)을 사용하여 pH = 4~5로 중화시키고 EtOAc(150 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(120 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 황색 오일로서 화합물 4(8.5 g, 29.38 mmol, 79.9% 수율)를 수득하였다. 조 생성물은 다음 단계를 위해 추가의 정제 없이 사용하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 11.88 - 9.58 (brs, 2H), 3.35 - 3.15 (m, 4H), 2.37 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 1.90 - 1.83 (m, 4H), 1.46 (s, 9H).
단계 4: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((tert-부톡시카보닐)아자네디일)디부타노에이트(5)
DCM(30 mL), EDCI(3.31 g, 17.28 mmol, 3 당량), TEA(2.91 g, 28.80 mmol, 4.01 mL, 5 당량) 및 DMAP(703.8 mg, 5.76 mmol, 1 당량) 중에 용해된 4-[tert-부톡시카보닐(3-카복시프로필)아미노]부탄산(2 g, 6.91 mmol, 1.2 당량) 용액을 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반한 후, DCM(20 mL) 중의 펜타데칸-8-올(2.63 g, 11.52 mmol, 2 당량)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 15시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc(100 mL)로 희석하고 연속적으로 포화 수성 NaHCO3(50 mL*2), 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(80 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc/PE: 0~10%)로 정제하여 무색 오일로서 화합물 5(1.5 g, 2.11 mmol, 36.7% 수율)를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.90 - 4.87 (m, 2H), 3.24 - 3.21 (m, 4H), 2.30 -2.26 (m, 4H), 1.88 - 1.81 (m, 4H), 1.54 - 1.18 (m, 8H), 1.46 (s, 9H), 1.34 - 1.21 (m, 40H), 0.92 - 0.85 (m, 12H).
단계 5: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-아자네디일디부타노에이트(A)
DCM(20 mL) 중의 1-헵틸옥틸 4-[tert-부톡시카보닐-[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(1.3 g, 1.83 mmol, 1 당량) 용액에 TFA(3.08 g, 27.01 mmol, 2 mL)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 첨가 후 혼합물은 4시간 동안 20℃에서 교반하였다. 이어서 빙수(20 mL)를 첨가하고 혼합물을 포화 수성 NaHCO3을 사용하여 pH = 8~9로 중화시켰다. 상기 수성상을 EtOAc(50 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(40 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 황색 오일로서 화합물 A(1.06 g, 조생성물)를 수득하였다. 조 생성물은 다음 단계를 위해 추가의 정제 없이 사용하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.89 - 4.83 (m, 2H), 2.86 - 2.82 (m, 4H), 2.42 - 2.38 (m, 4H), 1.96 - 1.90 (m, 4H), 1.52 - 1.50 (m, 8H), 1.32 - 1.20 (m, 40H), 0.90 - 0.86 (m, 12H).
중간체 A의 합성: 경로 2
단계 1: 디메틸 4,4'-(((4-니트로페닐)설포닐)아자네디일)디부타노에이트(7))
MeCN(500 mL) 중의 메틸 4-브로모부타노에이트(89.53 g, 494.59 mmol, 4 당량) 및 4-니트로벤젠설폰아미드(25 g, 123.65 mmol, 1 당량)의 용액에 Cs2CO3(80.57 g, 247.30 mmol, 2 당량), KI(10.26 g, 61.82 mmol, 0.5 당량) 및 TBAI(456.72 mg, 1.24 mmol, 0.01 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 90℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 NH4C1(1000 mL)로 켄칭시키고 이어서 EtOAc(500 mL)로 희석하였다. 수성상을 EtOAc(1000 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(600 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공에서 농축하여 잔류물을 수득하였고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피(PE/EtOAc = 10/1 내지 3/1)로 정제하여 화합물 메틸 4-[(4-메톡시-4-옥소-부틸)-(4-니트로페닐)설포닐-아미노]부타노에이트(48 g, 119.28 mmol, 96.47% 수율)를 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.34 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.98 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.67 (s, 6H), 3.21 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.34 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 1.89-1.82 (m, 4H).
단계 2: 4,4'-(((4-니트로페닐)설포닐)아자네디일)디부탄산(8)
THF(300 mL), MeOH(100 mL) 및 H2O(100 mL) 중의 메틸 4-[(4-메톡시-4-옥소-부틸)-(4-니트로페닐)설포닐-아미노]부타노에이트(48 g, 119.28 mmol, 1 당량) 용액에 LiOHㆍH2O(25.03 g, 596.39 mmol, 5 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 HCl(2N, 수성)로 pH = 6으로 조정한 다음, 고체를 여과하고 진공 농축하여 화합물 4-[3-카복시프로필-(4-니트로페닐)설포닐-아미노]부탄산(42 g, 112.19 mmol, 94.06% 수율)을 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 8.41-8.36 (m, 2H), 8.10-8.01 (m, 2H), 3.18-3.12 (m, 4H), 2.24-2.18 (m, 4H), 1.75-1.68 (m, 4H).
단계 3: 펜타데칸-8-올 (A1)
THF(300 mL) 및 MeOH(50 mL) 중의 펜타데칸-8-온(25 g, 110.43 mmol, 1 당량) 용액에 NaBH4(12.53 g, 331.28 mmol, 3 당량)를 0℃에서 서서히 첨가하였다. 혼합물은 2시간 동안 20℃에서 N2 하에 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 NH4C1(400 mL)로 켄칭시키고 이어서 EtOAc(500 mL)로 희석하였다. 수성상을 EtOAc(500 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(200 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공에서 농축하여 잔류물을 수득하였고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피(PE/EtOAc = 10/1 내지 3/1)로 정제하여 화합물 펜타데칸-8-올(23 g, 100.69 mmol, 91.19% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 3.65-3.56 (m, 1H), 1.55-1.36 (m, 8H), 1.33-1.26 (m, 16H), 0.95-0.82 (m, 6H).
단계 4: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'(((4-니트로페닐)설포닐)아자네디일)디부타노에이트(9)
CH2Cl2(100 mL) 중의 4-[3-카복시프로필-(4-니트로페닐)설포닐-아미노]부탄산(12 g, 32.05 mmol, 1 당량) 및 펜타데칸-8-올(14.64 g, 64.11 mmol, 2 당량) 용액에 EDCI(18.43 g, 96.16 mmol, 3 당량), DMAP(3.92 g, 32.05 mmol, 1 당량) 및 TEA(9.73 g, 96.16 mmol, 13.38 mL, 3 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 NH4Cl 용액(300 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 EtOAc(500 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(200 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시키고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피(PE/EtOAc = 10/1 내지 3/1)로 정제하여 화합물 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸)-(4-니트로페닐)설포닐-아미노]부타노에이트(9 g, 11.32 mmol, 35.31% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
단계 5: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-아자네디일디부타노에이트(A) (EC1090-45)
DMF(100 mL) 중의 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]-(4-니트로페닐)설포닐-아미노]부타노에이트(10 g, 12.58 mmol, 1 당량), 벤젠티올(1.52 g, 13.83 mmol, 1.41 mL, 1.1 당량), Cs2CO3(8.20 g, 25.15 mmol, 2 당량)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 세정하고, 이어서 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 N2 대기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 물(500 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 EtOAc(500 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(500 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(PE/EtOAc = 10/1 내지 3/1)로 정제하여 화합물 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(5.6 g, 9.18 mmol, 73.00% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.88 - 4.85 (m, 2H), 2.73 - 2.70 (m, 4H), 2.38 - 2.35 (m, 4H), 1.87 - 1.84 (m, 4H), 1.52 - 1.50 (m, 8H), 1.32 - 1.20 (m, 40H), 0.90 - 0.86 (m, 12H).
실시예 1.1: CAT1의 합성
단계 1: 3-(피페리딘-1-일)프로필 카밤이미도티오에이트 하이드로클로라이드( 1-2 ):
EtOH(120 mL) 중의 1-(3-클로로프로필)피페리딘(10 g, 50.47 mmol, 1 당량, HCl) 용액에 NaI(378.3 mg, 2.52 mmol, 0.05 당량) 및 티오우레아(3.84 g, 50.47 mmol, 1 당량))를 첨가하였다. 혼합물은 16시간 동안 75℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 10℃로 냉각시키고 침전물을 형성시켰다. 반응 혼합물을 여과하고 필터 케이크를 EtOAc(30 mL*2)로 세척하였다. 필터 케이크를 진공 농축시켜 화합물 1-2(10.4 g, 조생성물, HCl)를 백색 고체로서 수득하였다. 조 생성물은 다음 단계를 위해 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 2: 3-(피페리딘-1-일)프로판-1-티올( 1-3 ):
EtOH(40 mL) 중의 2-[3-(1-피페리딜)프로필]이소티오우레아(4 g, 16.82 mmol, 1 당량, HCl) 용액에 H2O(5 mL)중의 NaOH(1.01 g, 25.23 mmol, 1.5 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 2시간 동안 80℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 EtOAc(150 mL)로 희석하였다. 고체 Na2SO4(10 g)에 반응 혼합물을 첨가하였다. 반응 혼합물을 여과하고 필터 케이크를 EtOAc(30 mL*2)로 세척하였다. 여과물을 염수(30 mL*2)로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 황색 오일로서 화합물 1-3(2.1 g, 13.18 mmol, 78.4% 수율)을 수득하였다. 조 생성물은 다음 단계를 위해 추가의 정제 없이 사용하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 2.71 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.41 - 2.34 (m, 6H), 1.91 - 1.84 (m, 2H), 1.60 - 1.55 (m, 4H), 1.47 - 1.41 (m, 2H).
단계 3: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((3-(피페리딘-1-일)프로필)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트( CAT1 ):
무수 DCM(15 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(700 mg, 1.15 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(348.4 mg, 3.44 mmol, 0.48 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(204.3 mg, 0.69 mmol, 0.6 당량)을 0℃에서 질소 대기 하에 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 질소 대기 하에 20℃에서 교반하였다. 생성된 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고 질소 대기 하에 유지하였다. NaOH(321.29 mg, 8.03 mmol, 7 당량)를 무수 THF(12 mL)에 0℃에서 용해시키고, 이어서 3-(1-피페리딜)프로판-1-티올(913.9 mg, 5.74 mmol, 5 당량)을 질소 대기 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(10 mL) 중의 카바모일 클로라이드를 질소 대기 하에 0℃에서 서서히 주사기를 통해 첨가하였다. 생성된 용액은 15시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 0℃에서 NH4Cl(50 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(30 mL)로 희석시켰다. 상기 수성상을 EtOAc(40 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(40 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc/DCM: MeOH: 0~17.5%, MeOH 중의 2% NH3ㆍH2O)로 정제하여 황색 오일로서 화합물 CAT1(1.02 g, 조 생성물)을 수득하였다. 이어서 조 생성물은 다시 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(25 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, PE : EtOAc: 0~12.5%, EtOAc 중 5% NH3ㆍH2O)로 정제하여 황색 오일로서 순수 화합물 CAT1 (522 mg, 0.64 mmol, 50.2% 수율, 98% 순도)을 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 796.5;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.90 - 4.84 (m, 2H), 3.38 - 3.37 (m, 4H), 2.91 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.45 - 2.22 (m, 10H), 1.94 - 1.86 (m, 4H), 1.84 - 1.77 (m, 2H), 1.63 - 1.47 (m, 12H), 1.46 - 1.38 (m, 2H), 1.34 - 1.21 (m, 40H), 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 12H).
실시예 1.2: CAT6의 합성
단계 1: 1-(아제티딘-1-일)-3-(트리틸티오)프로판-1-온 ( 2-3 )
DMF(100 mL) 중의 3-트리틸설파닐프로판산(20 g, 57.40 mmol, 1.23 mL, 1 당량), EDCI(16.50 g, 86.09 mmol, 1.5 당량), HOBt(11.63 g, 86.09 mmol, 1.5 당량)의 혼합물을 탈기시키고 N2로 3회 세정하고, 이어서 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 N2 대기 하에 교반하고 이어서 DMF(5 mL) 중의 아제티딘 (3.93 g, 68.88 mmol, 4.65 mL, 1.2 당량)을 0℃에서 적가하였다. 생성된 혼합물을 15시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후 반응 혼합물은 H2O(150 mL)로 희석하고 EtOAc(200 mL × 3 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 포화 염수(100 mL × 2)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(120 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc/PE: 0~50%)로 정제하여 화합물 2-3(15.1 g, 38.96 mmol, 67.9% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.45 - 7.43 (m, 6H), 7.33 - 7.26 (m, 6H), 7.26 - 7.19 (m, 3H), 4.03 - 3.93 (m, 4H), 2.51 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.26 - 2.18 (m, 2H), 1.98 - 1.95 (m, 2H).
단계 2: 1-(3-(트리틸티오)프로필)아제티딘 ( 2-4 )
THF(120 mL) 중의 1-(아제티딘-1-일)-3-트리틸설파닐-프로판-1-온(7 g, 18.06 mmol, 1 당량) 용액에 LAH(822.67 mg, 21.68 mmol, 1.2 당량)를 분획으로 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 첨가 후, 생성된 혼합물을 3시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 THF(60 mL)로 희석시키고, 이어서 연속으로 H2O(0.82 mL), 수성 NaOH(0.82 mL, 4M), H2O(2.5 mL) 및 Na2SO4(25 g)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 반응 혼합물을 여과하고 여과물을 진공에서 농축시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물은 MTBE(50 mL)를 사용하여 20℃에서 30분 동안 연마하여 화합물 2-4(5.2 g, 13.92 mmol, 77.1% 수율)를 담황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ = 7.33 - 7.29 (m, 12H), 7.26 - 7.23 (m, 3H), 2.91 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.18 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.10 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.89 - 1.84 (m, 2H), 1.27 - 1.22 (m, 2H).
단계 3: 3-(아제티딘-1-일)프로판-1-티올( 2-5 )
DCM(30 mL) 중의 1-(3-트리틸설파닐프로필)아제티딘(4 g, 10.71 mmol, 1 당량) 용액에 TFA(23.10 g, 202.59 mmol, 15 mL, 18.92 당량) 및 TIPS(4.20 g, 21.42 mmol, 2 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 첨가 후, 생성된 혼합물을 3시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 TFA를 제거하였다. 잔류물을 MeOH(100 mL)로 희석시키고 PE(50 mL×5)로 추출하였다. MeOH 층은 감압 하에 농축시켜 화합물 2-5(2.4 g, 조 생성물, TFA)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ = 4.12 - 4.09 (m, 2H), 3.99 - 3.97 (m, 2H), 3.22 - 3.17 (m, 2H), 2.51 - 2.50 (m, 2H), 2.40 - 2.38 (m, 1H), 2.32 - 2.22 (m, 1H), 1.74 - 1.70 (m, 2H).
단계 4: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((3-(아제티딘-1-일)프로필)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트( CAT6 ):
무수 디클로로메탄(30.0 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(1.50 g, 2.46 mmol, 1 당량) 용액에 트리에틸아민(746.48 mg, 7.38 mmol, 1.03 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(437.83 mg, 1.48 mmol, 0.6 당량)을 0℃에서 질소 대기 하에 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 20℃에서 교반하였다. 그 후, 수득한 용액을 감압 하에 농축시켰다. 동시에, 무수 테트라하이드로푸란(30.0 mL)에 용해된 3-(아제티딘-1-일)프로판-1-티올(2.11 g, 8.61 mmol, 3.5 당량, TFA) 용액에 NaOH(688.52 mg, 17.22 mmol, 7 당량)를 0℃에서, 질소 대기 하에 첨가하였다. 이어서, 테트라하이드로푸란(15 mL)에 용해된 카바모일 클로라이드를 질소 대기 하에 0℃에서 주사기를 통해 상기 생성된 용액에 천천히 첨가하였다. 그 후, 생성된 용액을 질소 대기 하에 15시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 0℃에서 NH4Cl(60 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(50 mL)로 희석시켰다. 상기 수성상을 EtOAc(60 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 prep-HPLC(컬럼: Welch Ultimate XB-SiOH 250*50*10 um; 이동상: [헥산-EtOH];B%: 0%-30%, 10 min)로 정제하여 화합물 CAT6(322 mg, 419.69 umol, 49.54% 수율, 100% 순도)을 담황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+1]+ : 767.5;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.90 - 4.84 (m, 2H), 3.42 -3.31 (m, 4H), 3.19 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.90 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.47 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.36 - 2.26 (m, 4H), 2.08 - 2.05 (m, 2H), 1.95 - 1.85 (m, 4H), 1.67 - 1.65 (m, 2H), 1.52 - 1.50 (m, 8H), 1.30 - 1.26 (m, 40H), 0.90 - 0.86 (m, 12H).
실시예 1.3: CAT7의 합성
단계 1: 1-메틸피페리딘-4-일 카밤이미도티오에이트( 3-2 )
에탄올(100 mL) 중의 4-클로로-1-메틸피페리딘(20.0 g, 150 mmol, 1.00 당량) 및 티오우레아(28.5 g, 74.2 mmol, 2.50 당량) 용액에 요오드화 나트륨(2.24 g, 15.0 mmol, 0.10 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 탈기하고 질소로 3회 세정하고, 이어서 혼합물은 질소 대기 하에 80℃에서 24시간 동안 교반하여 화합물 3-2(60.0 g, 조 생성물, 염산염)를 황색 검으로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 3.06-3.02 (m, 1H), 2.70 (s, 3H), 2.67-2.54 (m, 4H), 1.91-1.73 (m, 4H)
단계 2: 1-메틸피페리딘-4-티올( 3-3 )
에탄올(80.0 mL) 중의 1-메틸피페리딘-4-일 카밤이미도티오에이트(16.0 g, 76.3 mmol, 1.00 당량, 염산염) 용액에 물(10.0 mL) 중에 용해된 수산화나트륨(18.3 g, 458 mmol, 6.00 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 탈기하고 질소로 3회 세정하고, 이어서 혼합물은 질소 대기 하에 3시간 동안 80℃에서 교반하였다. 완료 후, 혼합물은 농축시키고 이어서 에틸 아세테이트(200 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축시켜 황색 검으로서 화합물 3-3(4.20 g, 조 생성물)을 수득하였다.
단계 3: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((1-메틸피페리딘-4-일)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트( CAT7 ):
무수 디클로로메탄(30.0 mL) 중에 용해된 디(펜타데칸-8-일)4,4'-아자네디일디부타노에이트(2.00 g, 3.28 mmol, 1.00 당량) 용액에 트리에틸아민(995 mg, 9.84 mmol, 1.37 mL, 3.00 당량) 및 트리포스겐(584 mg, 1.97 mmol, 0.60 당량)을 0℃에서 질소 대기 하에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 수득한 용액을 감압 하에 농축시켰다. 동시에, 무수 테트라하이드로푸란(20.0 mL)에 용해된 1-메틸피페리딘-4-티올(2.15 g, 16.4 mmol, 5.00 당량, TFA) 용액에 수산화나트륨(918 mg, 23.0 mmol, 7.00 당량)을 0℃에서 질소 대기 하에 첨가하였다. 최종적으로, 테트라하이드로푸란(20.0 mL)에 용해된 카바모일 클로라이드를 질소 대기 하에 0℃에서 주사기를 통해 상기 생성된 용액에 천천히 첨가하였다. 생성된 용액을 질소 대기 하에 15시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 혼합물은 0℃에서 포화 염화암모늄 수용액(200 mL)으로 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(200 mL × 3)로 추출하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트/NH3ㆍH2O = 50/1/0.05 내지 2/1/0.05) 및 prep-HPLC(중화 조건; 컬럼: Welch Ultimate XB-CN 250 * 50 * 10 μm; 이동상: [헥산-EtOH]; B%: 0% - 10%, 12 min)으로 정제하여 -CAT7(350 mg, 452 umol, 51.7% 수율, 99.6% 순도)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+1] + : 768.4;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.91-4.84 (m, 2H), 3.46-3.33 (m, 4H), 2.93-2.81 (m, 2H), 2.36 (s, 3H), 2.34-2.28 (m, 5H), 2.14-2.04 (m, 2H), 1.93-1.79 (m, 6H), 1.55-1.49 (m, 8H), 1.31-1.24 (m, 42H), 0.91-0.86 (m, 12H).
실시예 1.4: CAT8의 합성
단계 1: 4,4'-(((4-니트로페닐)설포닐)아자네디일)비스(N,N-디옥틸부탄아미드) ( 4-2 )
DCM(50 mL) 중의 4-[3-카복시프로필-(4-니트로페닐)설포닐-아미노]부탄산(6.00 g, 16.0 mmol, 1 당량) 용액에 EDCI(9.22 g, 48.1 mmol, 3 당량), TEA(4.87 g, 48.1 mmol, 6.69 mL, 3 당량) 및 DMAP(979 mg, 8.01 mmol, 0.5 당량)을 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반한 후, DCM(10 mL) 중의 N-옥틸옥탄-1-아민(8.13 g, 33.7 mmol, 2.1 당량) 용액을 적가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(100 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 에틸 아세테이트(200 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(100 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(컬럼: Welch Ultimate XB-CN 250*50*10 um; 이동상: [헥산-EtOH];B%: 0%-15%,12 min)로 정제하여 화합물 4-2(9.00 g, 11.0 mmol, 68% 수율, 68% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 821.6.
단계 2: 4,4'-아자네디일비스(N,N-디옥틸부탄아미드) ( 4-3 )
DMF(100 mL) 중의 4-[[4-(디옥틸아미노)-4-옥소-부틸]-(4-니트로페닐)설포닐-아미노]-N,N-디옥틸-부탄아미드(8.00 g, 9.74 mmol, 1 당량) 및 벤젠티올(2.15 g, 19.5 mmol, 1.99 mL, 2 당량) 용액에 Cs2CO3 (6.35 g, 19.5 mmol, 2.0 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 20℃에서 N2 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 물(100 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 에틸 아세테이트(300 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(500 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(컬럼: Welch Ultimate XB-CN 250*50*10 um; 이동상: [헥산-EtOH];B%: 5%-50%,30 min)로 정제하여 화합물 4-3(2.90 g, 4.56 mmol, 47% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 637.4.
단계 3: S-(3-(디메틸아미노)프로필) 비스(4-(디옥틸아미노)-4-옥소부틸)카바모티오에이트( CAT8 )
무수 DCM(20 mL) 중에 용해된 4-[[4-(디옥틸아미노)-4-옥소-부틸]아미노]-N,N-디옥틸-부탄아미드(2.00 3.14 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(955 mg, 9.43 mmol, 1.31 mL, 3 당량) 및 비스(트리클로로메틸)카보네이트(467 mg, 1.57 mmol, 0.5 당량)을 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에 농축시키고 N2 하에 유지시켰다. 무수 THF(20 mL) 중의 3-(디메틸아미노)프로판-1-티올(1.87 g, 15.7 mmol, 5 당량) 용액에 NaOH(880 mg, 22.0 mmol, 7 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, 카바모일 클로라이드를 N2 하에 0℃에서 주사기를 통해 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 20℃에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 NH4C1(100 mL)로 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(100 mL)로 희석하였다. 수성 상은 에틸 아세테이트(100 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 디클로메탄/메탄올 = 50/1 내지 10/1)에 의해 정제하였다. 화합물 S-[3-(디메틸아미노)프로필]N,N-비스[4-(디옥틸아미노)-4-옥소-부틸]카바모티오에이트(4.10 g, 조 생성물)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 756.1;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 4.82 - 4.77 (m, 2H), 3.39 - 3.29 (m, 4H), 2.84 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.31 - 2.22 (m, 6H), 2.17 - 2.15 (m, 6H), 1.85 - 1.70 (m, 6H), 1.46-1.42 (m, 8H), 1.25 - 1.10 (m, 40H), 0.86 - 0.72 (m, 12H).
실시예 1.5: CAT3의 합성
단계 1: 3-(피롤리딘-1-일)프로필 카밤이미도티오에이트 하이드로클로라이드( 5-2 ):
EtOH(300 mL) 중의 1-(3-클로로프로필)피롤리딘(25 g, 169.32 mmol, 1 당량, HCl) 용액에 NaI(1.27 g, 8.47 mmol, 0.05 당량) 및 티오우레아(13.53 g, 177.79 mmol, 1.05 당량))를 첨가하였다. 혼합물은 16시간 동안 75℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 10℃로 냉각시키고 침전물을 형성시켰다. 반응 혼합물을 여과하고 필터 케이크는 EtOAc(50 mL*3)로 세척하였다. 필터 케이크를 진공 농축시켜 화합물 5-2(22.5 g, 100.55 mmol, 59.4% 수율, HCl)를 백색 고체로서 수득하였다. 조 생성물은 다음 단계를 위해 추가의 정제 없이 사용하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ = 11.24 (s, 1H), 9.37 (s, 3H), 3.52 - 3.44 (m, 2H), 3.33 - 3.31 (m, 2H), 3.22 - 3.14 (m, 2H), 3.02 - 2.92 (m, 2H), 2.09 - 2.00 (m, 2H), 2.00 - 1.92 (m, 2H), 1.91 - 1.82 (m, 2H).
단계 2: 3-(피롤리딘-1-일)프로판-1-티올( 5-3 ):
EtOH(80 mL) 중의 2-(3-피롤리딘-1-일프로필]이소티오우레아(5.2 g, 23.24 mmol, 1 당량, HCl) 용액에 H2O(10 mL)중의 NaOH(2.79 g, 69.72 mmol, 3 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 16시간 동안 80℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 EtOAc(150 mL)로 희석하였다. 이어서 혼합물을 염수(30 mL*2)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 황색 오일로서 화합물 5-3(2.8 g, 19.28 mmol, 82.9% 수율)을 수득하였다. 조 생성물은 다음 단계를 위해 추가의 정제 없이 사용하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 2.73 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 2.62 - 2.53 (m, 2H), 2.50 - 2.48 (m, 6H), 1.83 - 1.75 (m, 6H).
단계 3: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((3-(피롤리딘-1-일)프로필)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트( CAT3 ):
무수 DCM(15 mL) 중의 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(1.2 g, 1.97 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(597.2 mg, 5.90 mmol, 0.82 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(350.3 mg, 1.18 mmol, 0.6 당량)을 0℃에서 질소 대기 하에 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 질소 대기 하에 20℃에서 교반하였다. 생성된 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고 질소 대기 하에 유지하였다. 무수 THF(12 mL) 중의 3-피롤리딘-1-일프로판-1-티올(1.00 g, 6.89 mmol, 3.5 당량) 용액에 0℃에서 질소 대기 하에 NaOH(550.8 mg, 13.77 mmol, 7 당량)를 첨가하였다. THF(10 mL) 중의 카바모일 클로라이드 용액을 20℃에서 15시간 동안 교반된 생성된 용액에 0℃에서 질소 대기 하에 주사기를 통해 천천히 첨가하였다 . 반응 혼합물은 0℃에서 NH4Cl(60 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(40 mL)로 희석시켰다. 상기 수성상을 EtOAc(50 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(40 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc/PE: EtOAc: 0~15%, EtOAc 중의 5% NH3ㆍH2O)에 의해 정제하여 화합물 CAT3(1.1 g, 조 생성물)을 황색 오일로서 수득하였다. 이어서 조 생성물은 다시 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(25 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc: PE: 0~12%, EtOAc 중 5% NH3ㆍH2O)로 정제하여 황색 오일로서 순수 화합물 CAT3 (395 mg, 0.50 mmol, 30.0% 수율, 98.7% 순도)을 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 781.6;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.90 - 4.84 (m, 2H), 3.39 - 3.37 (m, 4H), 2.94 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.56 - 2.44 (m, 6H), 2.33 -2.28 (m, 4H), 1.97 - 1.81 (m, 6H), 1.80 - 1.74 (m, 4H), 1.56 - 1.46 (m, 8H), 1.35 -1.24 (m, 40H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 12H).
실시예 1.6: CAT4의 합성
단계 1: 2-(2-클로로에틸)-1-메틸피롤리딘 하이드로클로라이드( 6-2 )
디클로로메탄(20.0 mL) 중의 2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에탄올(2.00 g, 15.5 mmol, 2.10 mL, 1.00 당량)의 용액에 티오닐 클로라이드(5.52 g, 46.4 mmol, 3.37 mL, 3.00 당량)를 적가 방식으로 첨가하였다. 이어서 혼합물은 2시간 동안 40℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축시켜 화합물 6-2(2.20 g, 조 생성물)를 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.32 (s, 1H), 3.86-3.79 (m, 1H), 3.71-3.63 (m, 1H), 3.53-3.44 (m, 1H), 3.40-3.29 (m, 1H), 3.06-2.96 (m, 1H), 2.74 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.40-2.31 (m, 1H), 2.26-2.10 (m, 2H), 2.02-1.83 (m, 2H), 1.74-1.63 (m, 1H).
단계 2: 2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸 카밤이미도티오에이트 하이드로클로라이드( 6-3 )
에탄올(100 mL) 중의 2-(2-클로로에틸)-1-메틸피롤리딘 하이드로클로라이드(14.0 g, 76.0 mmol, 1.00 당량), 티오우레아(5.90 g, 77.6 mmol, 1.02 당량) 및 요오드화나트륨(2.28 g, 15.2 mmol, 0.20 당량)의 혼합물을 탈기하고 질소로 3회 세정한 다음, 혼합물을 질소 대기 하에 80℃에서 12시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 주위 온도로 냉각시켰다. 이어서, 영구 유백광이 검출될 때까지 에틸 아세테이트(100 mL)를 첨가하고 혼합물을 12시간 동안 4℃에서 유지하였다. 그 후, 반응 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축시켜 화합물 6-3(16.0 g, 71.5 mmol, 94.0% 수율)을 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 10.99 (s, 1H), 9.32 (s, 3H), 3.50-3.39 (m, 2H), 3.35-3.29 (m, 2H), 3.08-2.98 (m, 1H), 2.77 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.28-2.16 (m, 2H), 2.04-1.93 (m, 2H), 1.92-1.69 (m, 2H).
단계 3: 2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에탄티올( 6-4 )
에탄올(80.0 mL) 중의 2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸 카밤이미도티오에이트 하이드로클로라이드(10.0 g, 44.7 mmol, 1.00 당량) 용액에 물(20.0 mL) 중에 용해된 수산화나트륨(5.36 g, 134 mmol, 3.00 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 질소 대기 하에 3시간 동안 80℃에서 교반하였다. 완료 후, 혼합물은 농축시키고 이어서 에틸 아세테이트(200 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축시켜 황색 오일로서 화합물 6-4(2.40 g, 조 생성물)를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 3.08-3.01 (m, 2H), 2.50-2.45 (m, 1H), 2.31 (s, 3H), 2.18-2.09 (m, 4H), 1.79-1.65 (m, 4H).
단계 4: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트( CAT4 )
무수 디클로로메탄(30.0 mL) 중에 용해된 디(펜타데칸-8-일)4,4'-아자네디일디부타노에이트(2.00 g, 3.28 mmol, 1.00 당량) 용액에 트리에틸아민(995 mg, 9.84 mmol, 1.37 mL, 3.00 당량) 및 트리포스겐(584 mg, 1.97 mmol, 0.60 당량)을 0℃에서 질소 대기 하에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 수득한 용액을 감압 하에 농축시켰다. 동시에, 무수 테트라하이드로푸란(20.0 mL)에 용해된 2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에탄티올(2.38 g, 16.4 mmol, 5.00 당량) 용액에 수산화나트륨(918 mg, 22.9 mmol, 7.00 당량)을 0℃에서 질소 대기 하에 첨가하였다. 이어서, 테트라하이드로푸란(20.0 mL)에 용해된 카바모일 클로라이드를 질소 대기 하에 0℃에서 주사기를 통해 상기 생성된 용액에 천천히 첨가하였다. 그 후, 생성된 용액을 질소 대기 하에 15시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 혼합물은 0℃에서 염화암모늄(200 mL)으로 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(200 mL × 3)로 추출하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트/NH3ㆍH2O = 1/0/0.05 내지 10/1/0.05)로 정제하여 CAT4(451 mg, 576 umol, 17.6% 수율, 99.9% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+1]+: 781.5;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.91-4.84 (m, 2H), 3.43-3.33 (m, 4H), 3.14-3.03 (m, 1H), 3.00-2.92 (m, 1H), 2.89-2.80 (m, 1H), 2.33 (s, 3H), 2.32-2.29 (m, 2H), 2.23-2.09 (m, 2H), 2.03-1.86 (m, 6H), 1.80-1.67 (m, 2H), 1.58-1.47 (m, 10H), 1.33-1.22 (m, 42H), 0.92-0.85 (m, 12H).
실시예 1.7: 23 (CAT4)의 합성
단계 1: 2-(2-클로로에틸)-1-메틸피롤리딘 하이드로클로라이드(20)
CH2Cl2(20 mL) 중의 2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에탄올(2 g, 15.48 mmol, 2.10 mL, 1.00 당량)의 용액에 SOCI2(5.52 g, 46.44 mmol, 3.37 mL, 3 당량)를 적가 방식으로 서서히 첨가하였다. 혼합물은 2시간 동안 45℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 감압 하에 농축시켜 화합물 2-(2-클로로에틸)-1-메틸-피롤리딘(2.2 g, 11.95 mmol, 77.19% 수율, 하이드로클로라이드 염)을 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.32 (s, 1H), 3.88-3.80 (m, 1H), 3.75-3.66 (m, 1H), 3.55-3.45 (m, 1H), 3.43-3.35 (m, 1H),.3.08-2.97 (m, 1H), 2.75 (s, 3H), 2.48-2.31 (m, 1H), 2.28-2.10 (m, 2H), 2.04 -1.88 (m, 2H), 1.82-1.66 ppm (m, 1H).
단계 2: 2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸 카밤이미도티오에이트 하이드로클로라이드(21)
EtOH(100 mL) 중의 2-(2-클로로에틸)-1-메틸-피롤리딘(14g, 76.04 mmol, 1 당량, 하이드로클로라이드 염), 티오우레아(5.90 g, 77.56 mmol, 1.02 당량), NaI(2.28 g, 15.21 mmol, 0.2 당량)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 세정하고, 이어서, 혼합물을 N2 대기 하에 80℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 주위 온도로 냉각시켰다. 영구 유백광 때까지 EtOAc(100 mL)를 수득하였다. 이어서 반응 혼합물을 4℃에서 12시간 동안 방치하였다. 이어서, 혼합물을 여과하고 감압 하에 농축시켜 화합물 2-[2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸]이소티오우레아(16 g, 71.50 mmol, 94.03% 수율, 하이드로클로라이드 염)을 황색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 188.1.
단계 3: 2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에탄티올(22):
H2O(1 mL) 및 EtOH(8 mL) 중의 2-[2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸]이소티오우레아(3 g, 13.41 mmol, 1 당량, 하이드로클로라이드 염)의 용액에 NaOH(2.68 g, 67.03 mmol, 5 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 2시간 동안 90℃에서 교반하였다. 혼합물을 여과하고 감압 하에 농축시켜 화합물 2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에탄티올(1.8 g, 12.39 mmol, 92.42% 수율)을 황색 오일로서 수득하고 이는 다음 단계에서 정제 없이 사용하였다.
단계 4: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트( 23 )
무수 CH2Cl2(15 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(1.5 g, 2.46 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(746.47 mg, 7.38 mmol, 1.03 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(364.85 mg, 1.23 mmol, 0.5 당량)을 0℃에서 질소 대기 하에 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 질소 대기 하에 20℃에서 교반하였다. 반응물을 감압 하에 농축시키고 질소 대기 하에 유지하였다. NaOH(688.47 mg, 17.22 mmol, 7 당량)를 무수 THF(20 mL)에 0℃에서 질소 대기 하에 용해시키고, 이어서 2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에탄티올(1.79 g, 12.30 mmol, 5 당량)을 질소 대기 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(10 mL) 중의 카바모일 클로라이드를 질소 대기 하에 0℃에서 서서히 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물(50 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(50 mL)로 희석시키고 이어서 EtOAc(50 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(20 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(PE/EtOAc = 20/1 내지 0/1, EtOAc 중의 6% NH3 ㆍH2O)로 정제하여 화합물 CAT4(551 mg, 695.39 umol, 28.27% 수율, 98.6% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 781.9;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.95-4.78 (m, 2H), 3.51-3.40 (m, 4H), 3.12-3.03 (m, 1H), 3.01-2.94 (m, 1H), 2.91-2.83 (m, 1H), 2.32 (s, 3H), 2.31-2.26 (m, 2H), 2.22-2.10 (m, 2H), 2.04-1.94 (m, 6H), 1.85-1.62 (m, 4H), 1.59-1.52 (m, 8H), 1.37-1.18 (m, 42H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H).
실시예 1.8: CAT5의 합성
단계 1: 3-클로로-N-(사이클로프로필메틸)-N-메틸-프로판-1-아민( 8-6 )
디클로로메탄(200 mL) 중의 사이클로프로판카브알데히드(19.46 g, 277.70 mmol, 20.75 mL, 2 당량) 및 3-클로로-N-메틸-프로판-1-아민(20 g, 138.85 mmol, 1 당량, 하이드로클로라이드)의 용액에 NaBH3CN(13.09 g, 208.27 mmol, 1.5 당량) 및 KOAc(40.88 g, 416.54 mmol, 3 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 NH4C1(500 mL)로 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(300 mL)로 희석하였다. 수성 상은 에틸 아세테이트(500 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 3/1 및 에틸 아세테이트/메탄올 = 30/1 내지 10/1)로 정제하여 화합물 8-6(15 g, 92.78 mmol, 66.82% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 3.62-3.55 (m, 2H), 2.54-2.51 (m, 2H), 2.28-2.23 (m, 5H), 2.02-1.97 (m, 2H), 0.90-0.85 (m, 1H), 0.55-0.48 (m, 2H), 0.18-0.08 (m, 2H).
단계 2: 2-[3-[사이클로프로필메틸(메틸)아미노]프로필]이소티오우레아 하이드로클로라이드( 8-7 )
에탄올(15 mL) 중의 3-클로로-N-(사이클로프로필메틸)-N-메틸-프로판-1-아민(7 g, 43.30 mmol, 1 당량) 및 티오우레아(3.96 g, 51.96 mmol, 1.2 당량) 용액에 NaI(649.01 mg, 4.33 mmol, 0.1 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 90℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 감압 하에 농축시켜 화합물 8-7(8 g, 33.64 mmol, 77.70% 수율, 하이드로클로라이드)을 갈색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 7.03-6.95 (m, 4H), 3.28-3.24 (m, 1H), 2.91-2.85 (m, 2H), 2.70-2.66 (m, 2H), 2.53-2.48 (m, 3H), 2.38-2.32 (m, 2H), 1.72-1.58 (m, 2H), 0.98-0.90 (m, 1H), 0.48-0.41 (m, 2H), 0.26-0.12 (m, 2H).
단계 3: 3-[사이클로프로필메틸(메틸)아미노]프로판-1-티올( 8-8 )
에탄올(16 mL) 및 물(4 mL) 중의 2-[3-[사이클로프로필메틸(메틸)아미노]프로필]이소티오우레아(8 g, 39.74 mmol, 1 당량, 하이드로클로라이드)의 용액에 NaOH(9.54 g, 238.41 mmol, 6 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 90℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 감압 하에 농축시켜 화합물 8-8(2.4 g, 15.07 mmol, 37.92% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
단계 4: 1-헵틸옥틸 4-[3-[사이클로프로필메틸(메틸)아미노]프로필설파닐카보닐-[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트( CAT5 )
무수 디클로로메탄(20 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(2 g, 3.28 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(995.30 mg, 9.84 mmol, 1.37 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(486.47 mg, 1.64 mmol, 0.5 당량)을 0℃에서 질소 대기 하에 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 질소 대기 하에 20℃에서 교반하였다. 반응물을 감압 하에 농축시키고 질소 대기 하에 유지하였다. NaOH(917.96 mg, 22.95 mmol, 7 당량)를 무수 THF(20 mL)에 0℃에서 질소 대기 하에 용해시키고, 이어서 3-[사이클로프로필메틸(메틸)아미노]프로판-1-티올(2.61 g, 16.39 mmol, 5 당량)을 질소 대기 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(10 mL) 중의 카바모일 클로라이드를 질소 대기 하에 0℃에서 서서히 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 NH4C1 (100 mL)로 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(100 mL)로 희석하였다. 수성 상은 에틸 아세테이트(100 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 1/1 및 디클로로메탄/메탄올 = 30/1 내지 10/1)로 정제하여 화합물 CAT5(1.0 g, 1.26 mmol, 38.31% 수율, 99.9% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 796.2;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.87 - 4.85 (m, 2H), 3.49-3.35 (m, 4H), 2.92 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.47 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.42-2.30 (m, 7H), 2.24 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 1.98-1.94 (m, 4H), 1.80-1.74 (m, 2H), 1.53-1.48 (m, 8H), 1.28-1.20 (m, 40H), 0.98-0.90 (m, 13H), 0.51 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 0.11 - .010 (m, 2H).
실시예 1.9: CAT9의 합성
단계 1: (1-메틸피롤리딘-3-일)메탄올( 9-2 )
THF(600 mL) 중의 1-tert-부톡시카보닐피롤리딘-3-카복실산(30 g, 139.38 mmol, 1 당량) 용액에 LAH (15.87 g, 418.13 mmol, 3 당량)를 분획으로 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 첨가 후 혼합물은 3시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 THF(350 mL)로 희석시키고, 이어서 연속으로 H2O(16 mL), 수성 NaOH(16 mL, 4M), H2O(20 mL) 및 Na2SO4(100 g)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 반응 혼합물을 여과하고 여과물을 진공에서 농축시켜 화합물 9-2(11.2 g, 97.25 mmol, 69.8% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 3.67 - 3.63 (m, 1H), 3.54 - 3.50 (m, 1H), 2.95 - 2.68 (m, 2H), 2.58 - 2.52 (m, 1H), 2.51 - 2.44 (m, 1H), 2.40 - 2.33 (m, 1H), 2.32 (s, 3H), 2.02 - 1.97 (m, 1H), 1.66 - 1.63 (m, 1H).
단계 2: (1-메틸피롤리딘-3-일)메틸 4-메틸벤젠설포네이트( 9-3 )
DCM(200 mL) 중의 (1-메틸피롤리딘-3-일)메탄올(10 g, 86.83 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(17.57 g, 173.65 mmol, 24.17 mL, 2 당량), DMAP(1.06 g, 8.68 mmol, 0.1 당량) 및 TosCl(19.86 g, 104.19 mmol, 1.2 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 혼합물은 16시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 DCM(150 mL)으로 희석시키고 염수(100 mL * 2)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(120g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 메탄올:디클로로메탄:0~15%)로 정제하여 화합물 9-3(10.8g, 40.10 mmol, 46.2% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.79 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.93 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 2.60 - 2.46 (m, 4H), 2.45 (s, 3H), 2.31 (s, 3H), 2.30 - 2.28 (m, 1H), 1.97 - 1.95 (m, 1H), 1.45 - 1.31 (m, 1H).
단계 3: S-((1-메틸피롤리딘-3-일)메틸)에탄티오에이트( 9-4 )
DMF(100 mL) 중의 (1-메틸피롤리딘-3-일)메틸-4-메틸벤젠설포네이트(10.7 g, 39.72 mmol, 1 당량) 용액에 아세틸설파닐칼륨(5.44 g, 47.67 mmol, 1.2 당량)를 N2 하에 첨가하였다. 혼합물은 16시간 동안 25℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 0℃로 냉각시키고 H2O (150 mL)를 첨가하여 켄칭시켰다. 이어서, 반응물을 EtOAc(100 mL)로 희석시키고 EtOAc(150 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(150 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(40 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 디클로로메탄올:메탄올:0~10%)로 정제하여 화합물 9-4(4.8 g, 27.70 mmol, 69.7% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 2.97 - 2.94 (m, 2H), 2.72 - 2.71 (m, 1H), 2.59 - 2.51 (m, 2H), 2.45 - 2.41 (m, 1H), 2.34 - 2.33 (m, 6H), 2.24 - 2.22 (m, 1H), 2.21 - 2.03 (m, 1H), 1.52 - 1.48 (m, 1H).
단계 4: (1-메틸피롤리딘-3-일)메탄티올( 9-5 )
MeOH(10 mL) 중의 S-[(1-메틸피롤리딘-3-일)메틸]에탄티오에이트(1.7 g, 9.81 mmol, 1 당량) 용액에 NH3(MeOH 중 7 M, 4.20 mL, 3 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 3시간 동안 20℃에서 N2 하에 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 감압(공기조, 물 펌프) 하에 농축하여 용매를 제거하여 화합물 9-5(1.2 g, 조 생성물)를 황색 오일로서 수득하였다. 조 생성물은 다음 단계에서 추가의 정제 없이 사용하였다.
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ = 2.86 - 2.81 (m, 1H), 2.69 - 2.64 (m, 1H), 2.59 - 2.56 (m, 3H), 2.48 - 2.41 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 2.34 - 2.32 (m, 1H), 2.11 - 2.07 (m, 1H), 1.60 - 1.57 (m, 1H).
단계 5: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((1-메틸피롤리딘-3-일)메틸)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트( CAT9 )
무수 DCM(25 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(1.5 g, 2.46 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(746.48 mg, 7.38 mmol, 1.03 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(437.83 mg, 1.48 mmol, 0.6 당량)을 0℃에서 N2 대기 하에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에 농축시키고 N2 하에 유지시켰다. 무수 THF(30 mL) 중의 (1-메틸피롤리딘-3-일)메탄에티올(1.13 g, 8.61 mmol, 3.5 당량) 용액에 NaOH(688.52 mg, 17.21 mmol, 7 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(25 mL)에 용해된 카바모일 클로라이드를 N2 대기 하에 0℃에서 서서히 주사기를 통해 첨가하였다. 생성된 용액을 2시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 0℃에서 NH4Cl(60 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(50 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(50 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(60 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(20 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 에틸 아세테이트: 석유 에테르: 0~13%, 에틸 아세테이트 중의 5% NH3ㆍH2O)로 정제하여 620 mg의 화합물을 수득하고 이어서 화합물은 prep-HPLC(컬럼: Welch Ultimate XB-SiOH 250*50*10 um;이동상: [헥산-EtOH];B%: 0%-30%, 13min)로 정제하여 화합물 CAT9(325 mg, 0.42 mmol, 17.9% 수율, 99.1% 순도)를 담황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+1] + : 767.9;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.91 - 4.84 (m, 2H), 3.41 - 3.36 (m, 4H), 3.05 - 2.98 (m, 2H), 2.81 -2.77 (m, 1H), 2.63 - 2.59 (m, 2H), 2.51 - 2.46 (m, 1H), 2.37 (s, 3H), 2.34 - 2.26 (m, 4H), 2.13 - 2.04 (m, 1H), 1.95 - 1.86 (m, 4H), 1.61 - 1.58 (m, 2H), 1.55 - 1.46 (m, 8H), 1.32 - 1.26 (m, 40H), 0.90 - 0.86 (m, 12H).
실시예 1.10: CAT10의 합성
단계 1: 3-클로로-N-(사이클로부틸메틸)-N-메틸-프로판-1-아민( 10-2 )
디클로로메탄(100 mL) 및 MeOH(100 mL) 중의 사이클로부탄카브알데히드(29.20 g, 347.12 mmol, 2 당량) 및 3-클로로-N-메틸-프로판-1-아민; 하이드로클로라이드(25 g, 173.56 mmol, 1 당량)의 용액에 NaBH3CN(16.36 g, 260.34 mmol, 1.5 당량) 및 KOAc(51.10 g, 520.68 mmol, 3 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 35℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물(100 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 에틸 아세테이트(200 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(100 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 30/1 내지 1/1 및 디클로로메탄/메탄올 = 30/1 내지 5/1)로 정제하여 화합물 10-2(27 g, 153.67 mmol, 88.54% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 3.67 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.26-3.20 (m, 2H), 3.12 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 2.78-2.70 (m, 3H), 2.28-2.18 (m, 4H), 2.10-.2.05 (m, 1H), 1.90-1.80 (m, 4H).
단계 2: 2-[3-[사이클로부틸메틸(메틸)아미노]프로필]이소티오우레아( 10-3 )
EtOH(100 mL) 중의 3-클로로-N-(사이클로프로필메틸)-N-메틸-프로판-1-아민(10 g, 56.92 mmol, 1 당량) 및 티오우레아(4.77 g, 62.61 mmol, 1.1 당량) 용액에 NaI(4.27 g, 28.46 mmol, 0.5 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 90℃에서 N2 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 감압 하에 농축시켜 화합물 10-3(12 g, 47.65 mmol, 83.73% 수율, 하이드로클로라이드)을 갈색 오일로서 수득하였다.
단계 3: 3-[사이클로부틸메틸(메틸)아미노]프로판-1-티올( 10-4 )
EtOH(30 mL) 및 물(5 mL) 중의 2-[3-[사이클로부틸메틸(메틸)아미노]프로필]이소티오우레아(6 g, 27.86 mmol, 1 당량)의 용액에 NaOH(6.69 g, 167.16 mmol, 6 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 6시간 동안 90℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 감압 하에 농축시켜 화합물 10-4(2.8 g, 16.16 mmol, 57.99% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
단계 4: 1-헵틸옥틸 4-[3-[사이클로부틸메틸(메틸)아미노]프로필설파닐카보닐-[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트( CAT10 )
무수 디클로로메탄(20 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(1.8 g, 2.95 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(895.77 mg, 8.85 mmol, 1.23 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(437.82 mg, 1.48 mmol, 0.5 당량)을 0℃에서 질소 대기 하에 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 질소 대기 하에 25℃에서 교반하였다. 반응물을 감압 하에 농축시키고 질소 대기 하에 유지하였다. NaOH(826.17 mg, 20.66 mmol, 7 당량)를 무수 THF(60 mL)에 0℃에서 질소 대기 하에 용해시키고, 이어서 3-[사이클로부틸메틸(메틸)아미노]프로판-1-티올(2.56 g, 14.75 mmol, 5 당량)을 질소 대기 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(10 mL) 중의 카바모일 클로라이드를 질소 대기 하에 0℃에서 서서히 첨가하였다. 혼합물을 반응이 완료될때까지 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(100 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 에틸 아세테이트(200 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(100 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시키고 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 1/1 및 디클로로메탄/메탄올 = 30/1 내지 5/1) 및 MPLC(Welch Ultimate XB-SiOH 250*50*10 um; 이동상: [헥산-EtOH]; B%: 0%-30%, 13min)으로 정제하여 화합물 CAT10(238 mg, 292.02 umol, 11.82% 수율, 99.3% 순도)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 810.0;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.85-4.76 (m, 2H), 3.30-3.25 (m, 4H), 2.84 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.52-2.32 (m, 4H), 2.28-2.12 (m, 7H), 2.05-1.98 (m, 2H), 1.88-1.60 (m, 8H), 1.60-1.52 (m, 3H), 1.48-1.32 (m, 8H), 1.25-1.10 (m, 40H), 0.85-0.78 (m, 12H).
실시예 1.11: CAT11의 합성
단계 1: (1-메틸-3-피페리딜)메틸 4-메틸벤젠설포네이트( 11-2 )
디클로로메탄(100 mL) 중의 (1-메틸-3-피페리딜)메탄올(10 g, 77.40 mmol, 1 당량) 용액에 TosCl(14.76 g, 77.40 mmol, 1 당량), DMAP(945.58 mg, 7.74 mmol, 0.1 당량) 및 TEA(15.66 g, 154.80 mmol, 21.55 mL, 2 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물(100 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 에틸 아세테이트(200 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(100 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시키고 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 1/1 및 디클로로메탄/메탄올 = 30/1 내지 10/1)로 정제하여 화합물 11-2를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.77 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.96-3.90 (m, 2H), 2.75-2.65 (m, 2H), 2.44 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 1.98-1.90 (m, 2H), 1.70-1.48 (m, 4H), 1.03-0.90 (m, 1H).
단계 2: 1-메틸-3-(트리틸설파닐메틸)피페리딘( 11-3 )
DMF(80 mL) 중의 (1-메틸-3-피페리딜)메틸 4-메틸벤젠설포네이트(7.5 g, 26.47 mmol, 1 당량) 및 트리페닐메탄티올(8.78 g, 31.76 mmol, 1.2 당량) 용액에 K2CO3(10.97 g, 79.40 mmol, 3 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 80℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물(200 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 에틸 아세테이트(200 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(100 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시키고 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 1/1 및 디클로로메탄/메탄올 = 30/1 내지 10/1)로 정제하여 화합물 11-3(7.5 g, 19.35 mmol, 73.12% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.49-7.45 (m, 5H), 7.38-7.25 (m, 10H), 2.83-2.80 (m, 2H), 2.32-2.28 (m, 3H), 2.18-2.11 (m, 2H), 1.93-1.90 (m, 1H), 1.77-1.62 (m, 5H), 0.95-0.88 (m, 1H).
단계 3: (1-메틸-3-피페리딜)메탄티올( 11-4 )
디클로로메탄(50 mL) 중의 1-메틸-3-(트리틸설파닐메틸)피페리딘(6.5 g, 16.77 mmol, 1 당량) 용액에 TFA(37.06 g, 325.00 mmol, 30 mL, 19.38 당량) 및 트리이소프로필실란(5.31 g, 33.54 mmol, 6.89 mL, 2 당량)을 0℃에서 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 TFA를 제거하고, 이를 MeOH(100 mL)로 희석시키고 석유 에테르(50 mL × 5)로 추출하였다. MeOH 층은 감압 하에 농축시켜 화합물 11-4(2.2 g, 15.14 mmol, 90.30% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 3.58-3.52 (m, 2H), 2.79 (s, 3H), 2.60-2.51 (m, 3H), 2.26-2.24 (m, 1H), 2.10-1.75 (m, 4H), 1.40-1.37 (m, 1H), 1.25-1.15 (m, 1H).
단계 4: 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]-[(1-메틸-3-피페리딜)메틸설파닐카보닐]아미노]부타노에이트( CAT11 )
무수 디클로로메탄(20 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(1.8 g, 2.95 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(895.77 mg, 8.85 mmol, 1.23 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(437.82 mg, 1.48 mmol, 0.5 당량)을 0℃에서 질소 대기 하에 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 질소 대기 하에 25℃에서 교반하였다. 반응물을 감압 하에 농축시키고 질소 대기 하에 유지하였다. NaOH(826.17 mg, 20.66 mmol, 7 당량)를 무수 THF(30 mL)에 0℃에서 질소 대기 하에 용해시키고, 이어서 (1-메틸-3-피페리딜)메탄티올(2.14 g, 14.75 mmol, 5 당량)을 질소 대기 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(10 mL) 중의 카바모일 클로라이드를 질소 대기 하에 0℃에서 서서히 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 NH4C1 (100 mL)로 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(100 mL)로 희석하였다. 수성 상은 에틸 아세테이트(100 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 1/1 및 디클로로메탄/메탄올 = 30/1 내지 10/1)로 정제하고 컬럼 Welch Ultimate XB-SiOH 250*50*10 um; 이동상: [헥산-EtOH]; B%: 0%-25%, 20 min으로 정제하여 화합물 CAT11(300 mg, 383.61 umol, 16.65% 수율, 99.9% 순도)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 782.1;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.90-4.85 (m, 2H), 3.48-3.40 (m, 4H), 3.10-2.82 (m, 4H), 2.40-2.28 (m, 6H), 2.10-1.70 (m, 8H), 1.60-1.48 (m, 12H), 1.33-1.20 (m, 40H), 0.90- 0.86 (m, 12H).
실시예 1.12: CAT12의 합성
단계 1: 3-(트리틸티오)프로파날( 12-2 )
DCM(100 mL) 중의 트리페닐메탄티올(10.0 g, 36.2 mmol, 1 당량)의 혼합물에 TEA(5.13 g, 50.7 mmol, 7.05 mL, 1.4 당량) 및 프로프-2-엔알(2.84 g, 50.7 mmol, 3.39 mL, 1.4 당량)을 연속으로 첨가하고, 반응 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 회색 고체로서 화합물 12-2(12.4 g, 조 생성물)를 수득하였다. 반응 잔류물을 다음 단계에서 직접 사용하였다.
단계 2: 4-(3-(트리틸티오)프로필)티오모르폴린( 12-4 )
MeOH(40 mL) 및 DCE(40 mL) 중 3-트리틸설파닐프로판알(7.40 g, 22.3 mmol, 1 당량) 및 티오모르폴린(2.53 g, 24.5 mmol, 2.32 mL, 1.1 당량)의 혼합물에 AcOH(134 mg, 2.23 mmol, 0.127 mL, 0.1 당량) 및 NaBH3CN(2.80 g, 44.5 mmol, 2 당량)을 연속으로 첨가하고, 반응 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 포화 NH4Cl 용액(50 mL)을 첨가하여 반응 혼합물을 켄칭하고 디클로로메탄(40 mL × 3)으로 추출한 후, 합한 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 조 생성물은 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1을 사용하여 20℃에서 10분동안 연마하여 화합물 12-4(9.00 g, 21.5 mmol, 96% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 420.0;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 7.44 - 7.28 (m, 12H), 7.24 - 7.20 (m, 3H), 2.68 - 2.53 (m, 8H), 2.37 - 2.25 (m, 2H), 2.19 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.60 - 1.51 (m, 2H).
단계 3: 3-티오모르폴리노프로판-1-티올( 12-5 )
DCM(10 mL) 중의 4-(3-트리틸설파닐프로필)티오모르폴린(8.00 g, 19.1 mmol, 1 당량) 용액에 TFA(30.8 g, 270 mmol, 20.0 mL, 14.2 당량) 및 트리이소프로필실란(6.04 g, 38.1 mmol, 7.83 mL, 2 당량)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물은 2시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하여 잔류물을 수득한 다음, 반응 잔류물을 MeOH(20 mL)에 첨가하고 석유 에테르(3 × 10 mL)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시키고 여과하고 진공 하에 농축하여 화합물 12-5를 황색 오일로서 수득하였다. 반응 잔류물을 다음 단계에서 직접 사용하였다.
단계 4: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((3-티오모르폴리노프로필)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트( CAT12 ):
무수 DCM(30 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(2.00 g, 3.28 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(995 mg, 9.84 mmol, 1.37 mL, 3 당량) 및 비스(트리클로로메틸)카보네이트(486 mg, 1.64 mmol, 0.5 당량)를 0℃에서 N2 대기 하에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에 농축시키고 N2 하에 유지시켰다. 무수 THF(30 mL) 중의 3-티오모르폴리노프로판-1-티올(2.33 g, 13.1 mmol, 4 당량) 용액에 NaOH(918 mg, 23.0 mmol, 7 당량)를 0℃에서 N2 대기 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, 카바모일 클로라이드를 N2 하에 0℃에서 주사기를 통해 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 20℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 NH4C1 (60 mL)로 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(50 mL)로 희석하였다. 수성 상은 에틸 아세테이트(50 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 50/1 내지 3/1)에 의해 정제하였다. 화합물 CAT12(1.50 g, 1.84 mmol, 56% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 813.6;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 4.89 - 4.86 (m, 2H), 3.40 - 3.36 (m, 4H), 2.91 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.72 - 2.68 (m, 6H), 2.48 - 2.44 (m, 2H), 2.31 (m, 4H), 1.98 - 1.76 (m, 6H), 1.64 - 1.45 (m, 10H), 1.32 - 1.22 (m, 40H), 0.92 - 0.83 (m, 12H).
실시예 1.13: CAT13의 합성
단계 1: 운데카-1,10-디엔-6-올( 13-2 )
무수 THF(1500 mL)(2 mL/브롬화물 mmol) 중의 Mg(24.61 g, 1.01 mol, 2.5 당량) 및 I2(2.06 g, 8.10 mmol, 1.63 mL, 0.02 당량)의 현탁액을 질소 대기 하에 제조하였다. 상기 혼합물에,　5-브로모펜트-1-엔(150.88 g, 1.01 mol, 2.5 당량)을 20℃에서 서서히 첨가하였다. 첨가하는 동안, 반응 혼합물의 온도가 증가하여 그리냐드 형성이 개시되었음을 확인하였다. 브롬화물 첨가가 완료되면 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반한 후 에틸 포르메이트(30 g, 404.98 mmol, 32.6 mL, 1 당량)를 천천히 첨가하기 위해 0℃로 냉각하였다. 첨가 후, 냉욕조를 제거하고 혼합물을 20℃에서 15시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응물을 포화 용액 NH4Cl(1000 mL)을 첨가함에 의한 켄칭을 위해 0℃로 냉각시키고 30분동안 교반하였다. 상기 수성상을 EtOAc(800 mL*3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(400 mL*2)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 MPLC(EtOAc:PE: 0~5%)로 정제하여 화합물　13-2(53.2 g, 316.15 mmol, 81.9% 수율)를 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 5.85 - 5.77 (m, 2H), 5.04 - 4.95 (m, 4H), 3.62 - 3.60 (m, 1H), 2.08 - 2.07 (m, 4H), 1.50 - 1.42 (m, 8H).
단계 2: N-메틸-4-니트로-N-(운데카-1,10-디엔-6-일)벤젠설폰아미드( 13-3 )
운데카-1,10-디엔-6-올(20 g, 118.85 mmol, 1 당량), N-메틸-4-니트로-벤젠설폰아미드(28.27 g, 130.74 mmol, 1.1 당량) 및 PPh3(37.41g, 142.62 mmol, 1.2 당량)을 무수 THF(200 mL)에서 N2 하에 0℃에서 교반하였다. 상기 혼합물에 0.5시간의 기간동안 THF(30 mL) 중의　DIAD(36.05 g, 178.28 mmol, 34.7 mL, 1.5 당량)를 적가하였다. 첨가 후, 수득한 혼합물을 20℃에서 15.5시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 H2O(150 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(100 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(150 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(330 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc:PE:0~10%)로 정제하여 화합물 13-3(33.2 g, 90.59 mmol, 76.2% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.36 - 8.33 (m, 2H), 8.01 - 7.98 (m, 2H), 5.74 - 5.65 (m, 2H), 4.97 - 4.92 (m, 4H), 3.92 - 3.87 (m, 1H), 2.70 (s, 3H), 2.01 - 1.97 (m, 4H), 1.30 - 1.28 (m, 2H), 1.27 - 1.23 (m, 6H).
단계 3: 5-(N-메틸-4-니트로페닐설폰아미도)노난디오산( 13-4 )
MeCN(150 mL) 및 CH2Cl2(150 mL) 중의 N-메틸-4-니트로-N-(1-펜트-4-에닐헥스-5-에닐)벤젠설폰아미드(12.5 g, 34.11 mmol, 1 당량) 용액에 RuCl3(1.42 g, 6.82 mmol, 0.2 당량)을 20℃에서 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 0.5시간 동안 상기 온도에서 교반한 후, H2O(200 mL) 중의 NaIO4(36.48 g, 170.54 mmol, 5 당량)을 0℃에서 적가하였다. 생성된 혼합물을 2.5시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 수성 HCl(4 M)을 사용하여 pH =　2~3으로 중화시켰다. 수성상을 EtOAc(600 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 포화 수성 Na2S2O3(350 mL * 3) 및 포화 염수(350 mL * 2)로 연속적으로 세척하고 Na2SO4로 건조시킨 후 여과하고 진공에서 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(120 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼,　EtOAc:PE: 0~50%, EtOAc 중의 2% AcOH) 및　prep-HPLC(컬럼: YMC Triart C18 250 * 50 mM * 7 um; 이동상: [물(0.05% HCl)-ACN]; B%: 25%-55%, 18 min)로 정제하여 화합물　13-4(5.2 g, 12.92 mmol, 20.8% 수율)를 담황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ = 11.98 (s, 2H), 8.41 - 8.38 (m, 2H), 8.07 - 8.05 (m, 2H), 3.76 - 3.74 (m, 1H), 2.67 (s, 3H), 2.16 - 2.11 (m, 4H), 1.35 - 1.22 (m, 8H).
단계 4: 디(펜타데칸-8-일) 5-(N-메틸-4-니트로페닐설폰아미도)노난디오에이트( 13-5 )
CH2Cl2(80 mL) 중에 용해된 5-[메틸-(4-니트로페닐)설포닐-아미노]노난디오산(5 g, 12.42 mmol, 1 당량) 용액에 EDCI(7.15 g, 37.27 mmol, 3 당량), TEA(3.77 g, 37.27 mmol, 5.2 mL, 3 당량) 및 DMAP(1.52 g, 12.42 mmol, 1 당량)을 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하고 이어서, CH2Cl2(50 mL) 중의 펜타데칸-8-올(5.96 g, 26.09 mmol, 2.1 당량)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 15시간 동안 25℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 H2O(100 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(50 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(80 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(60 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다.잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(40 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc:PE: 0~10%)로 정제하여 화합물 13-5(4.9 g, 5.89 mmol, 47.4% 수율, 99% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+Na] + : 845.5;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.36 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.01 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.86 - 4.80 (m, 2H), 3.96 - 3.91 (m, 1H), 2.72 (s, 3H), 2.31 - 2.19 (m, 4H), 1.50 - 1.45 (m, 14H), 1.28 - 1.26 (m, 42H), 0.90 - 0.87 (m, 12H).
단계 5: 디(펜타데칸-8-일) 5-(메틸아미노)노난디오에이트( 13-6 )
DMF(40 mL) 중의 비스(1-헵틸옥틸) 5-[메틸-(4-니트로페닐)설포닐-아미노]노난디오에이트(4.9 g, 5.95 mmol, 1 당량)의 용액에　Cs2CO3(3.88 g, 11.90 mmol, 2 당량)　및 벤젠티올(1.94 g, 17.61 mmol, 1.8 mL, 2.96 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 5시간 동안 25℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 물(80 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 EtOAc(100 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(60 mL*3)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(20 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc:PE:0~60%)로 정제하여 화합물 13-6(2.6 g, 4.07 mmol, 68.5% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.90 - 4.84 (m, 2H), 2.47 - 2.45 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.32 - 2.29 (m, 4H), 1.67 - 1.63 (m, 4H), 1.51 - 1.45 (m, 12H), 1.43 - 1.27 (m, 40H), 0.90 - 0.87 (m, 12H).
단계 6: 디(펜타데칸-8-일) 5-((((3-(디메틸아미노)프로필)티오)카보닐)(메틸)아미노)노난디오에이트( CAT13 )
무수 CH2Cl2(30 mL) 중에 용해된 비스(1-헵틸옥틸) 5-(메틸아미노)노난디오에이트(1.5 g, 2.35 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(713.7 mg, 7.05 mmol, 0.98 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(418.6 mg, 1.41 mmol, 0.6 당량)을 0℃에서 N2 대기 하에 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 20℃에서 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에 농축시키고 N2 하에 유지시켰다. 무수 THF(30 mL) 중의 3-(디메틸아미노)프로판-1-티올(981.0 mg, 8.23 mmol, 3.5 당량) 용액에 NaOH(658.3 mg, 16.46 mmol, 7 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(20 mL) 에 용해된 카바모일 클로라이드를 N2 대기 하에 0℃에서 서서히 주사기를 통해 첨가하였다. 생성된 용액을 2시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 0℃에서 NH4Cl(60 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(50 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(60 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(20 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼,　 EtOAc:PE:0~12%, 에틸 아세테이트 중 5% NH3·H2O)에 의해 정제하여 화합물 CAT13(1.05 g, 1.32 mmol, 56.2% 수율, 98.5% 순도)을 담황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+H] + : 783.6
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.86 - 4.82 (m, 2H), 4.55 - 3.84 (m, 1H), 2.93 - 2.92 (m, 2H), 2.80 - 2.78 (m, 3H), 2.36 - 2.30 (m, 6H), 2.23 (s, 6H), 1.81 - 1.77 (m, 3H), 1.50 - 1.45 (m, 16H), 1.32 - 1.26 (m, 40H), 0.90 - 0.87 (m, 12H).
실시예 1.14: CAT14의 합성
단계 1: N,N-비스(부트-3-에닐)-4-니트로-벤젠설폰아미드( 14-2 )
ACN(50 mL) 중의 4-니트로벤젠설폰아미드(25 g, 123.65 mmol, 1 당량) 및 4-브로모부트-1-엔(83.46 g, 618.24 mmol, 62.75 mL, 5 당량)의 용액에 Cs2CO3(80.57 g, 247.30 mmol, 2 당량), TBAI(456.71 mg, 1.24 mmol, 0.01 당량) 및 KI(10.26 g, 61.82 mmol, 0.5 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 90℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물(300 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 EtOAc(500 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(200 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시키고 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 1/1)로 정제하여 화합물 14-2(37 g, 119.21 mmol, 96.4% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.37-8.34 (m, 2H), 8.03-7.99 (m, 2H), 5.73-5.64 (m, 2H), 5.10-5.04 (m, 4H), 3.30-3.25 (m, 4H), 2.35-2.30 (m, 4H)
단계 2: N-부트-3-에닐부트-3-엔-1-아민: ( 14-3 )
DMF(200 mL) 중의 N,N-비스(부트-3-에닐)-4-니트로-벤젠설폰아미드(74 g, 238.43 mmol, 1 당량) 및 벤젠티올(52.54 g, 476.85 mmol, 48.65 mL, 2 당량) 용액에 Cs2CO3(155.37 g, 476.85 mmol, 2 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 N2 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 물(1000 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 EtOAc(1000 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(2000 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시키고 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 1/1)로 정제하여 화합물 14-3(44 g, 조 생성물)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ =5.81-5.73 (m, 2H), 5.08-4.99 (m, 4H), 2.66 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.26-2.20 (m, 4H), 1.39-1.36 (m, 1H)
단계 3: 3-(트리틸티오)프로파날: ( 14-4 )
CH2Cl2(300 mL) 중의 트리페닐메탄티올(50 g, 180.90 mmol, 1 당량)의 용액에 TEA(27.46 g, 271.35 mmol, 37.77 mL, 1.5 당량) 및 프로프-2-에날(15.21 g, 271.35 mmol, 18.0 mL, 1.5 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 화합물 3-트리틸설파닐프로파날(60 g, 180.47 mmol, 99.76% 수율)을 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 9.46 (s, 1H), 7.40-7.20 (m, 15H), 2.46-2.41 (m, 2H), 2.35-2.29 (m, 2H)
단계 4: N-부트-3-에닐-N-(3-트리틸설파닐프로필)부트-3-엔-1-아민: （ 14-5 ）
CH2Cl2(100 mL) 및 MeOH(100 mL) 중의 N-부트-3-에닐부트-3-아민(30 g, 239.60 mmol, 1 당량) 및 3-트리틸설파닐프로파날(79.66 g, 239.60 mmol, 1 당량)의 용액에 NaBH3CN(30.11 g, 479.19 mmol, 2 당량) 및 AcOH(1.44 g, 23.96 mmol, 1.37 mL, 0.1 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물(300 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 EtOAc(500 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(200 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시키고 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 1/1)로 정제하여 화합물 N-부트-3-에닐-N-(3-트리틸설파닐프로필)부트-3-엔-1-아민(46 g, 104.15 mmol, 43.47% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.51-7.29 (m,15H), 5.86-5.79 (m, 2H), 5.12-5.03 (m, 4H), 2.53-2.45 (m, 6H), 2.28-2.20 (m, 6H), 1.63-1.57 (m, 2H)
단계 5: N-부트-3-에닐-N-(3-트리틸설파닐프로필)부트-3-엔-1-아민: (14-6)
CH2Cl2(100 mL) 중의 N-부트-3-에닐-N-(3-트리틸설파닐프로필)부트-3-엔-1-아민(30 g, 67.92 mmol, 1 당량) 용액에 TFA(231.00 g, 2.03 mol, 150.00 mL, 29.83 당량) 및 트리이소프로필실란(21.51 g, 135.85 mmol, 27.90 mL, 2 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 6시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 TFA를 제거하였다. 잔류물을 MeOH(100 mL)로 희석시키고 PE(50 mL × 5)로 추출하였다. MeOH 층은 감압 하에 농축시켜 생성물 14-6 (9.8 g, 49.16 mmol, 72.37% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
단계 6: 1-헵틸옥틸 4-[3-[비스(부트-3-에닐)아미노]프로필설파닐카보닐-[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트: ( CAT 14 )
무수 CH2Cl2(50 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(6 g, 9.84 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(2.99 g, 29.51 mmol, 4.11 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(1.46 g, 4.92 mmol, 0.5 당량)을 0℃에서 질소 대기 하에 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 질소 대기 하에 20℃에서 교반하였다. 반응물을 감압 하에 농축시키고 질소 대기 하에 유지하였다. NaOH(2.75 g, 68.85 mmol, 7 당량)를 무수 THF(100 mL)에 0℃에서 질소 대기 하에 용해시키고, 이어서 3-[비스(부트-3-에닐)아미노]프로판-1-티올(9.80 g, 49.18 mmol, 5 당량)을 질소 대기 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(50 mL)에 용해된 카바모일 클로라이드를 질소 대기 하에 0℃에서 서서히 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 NH4C1 (200 mL)로 켄칭시키고 이어서 EtOAc(300 mL)로 희석하였다. 수성상을 EtOAc(200 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켜 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 1/1) 및 Phenomenex Luna C8 250*50 mM*10 um; 이동상: [물(HCl)-MeOH]; B%: 80%-100%, 10min으로 정제하여 화합물 CAT14(240 mg, 284.46 umol, 23.76% 수율, 99.01% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 836.2;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 5.83-5.76 (m, 2H), 5.09-5.02 (m, 4H), 4.99-4.86 (m, 2H), 3.40-3.38 (m, 4H), 2.92 ( t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.53-2.31 (m, 6H), 2.30-2.21 (m, 6H), 1.90-1.78 (m, 6H), 1.58-1.51 (m, 10H), 1.32-1.27 (m, 40H), 0.90-0.87 (m, 12H).
실시예 1.15: CAT15의 합성
단계 1: 1-헵틸옥틸 4-[3-[비스(3-하이드록시프로필)아미노]프로필설파닐카보닐-[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트: ( CAT15 )
CH2Cl2(50 mL) 및 MeOH(50 mL) 중의 1-헵틸옥틸 4-[3-[비스(부트-3-에닐)아미노]프로필설파닐카보닐-[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트 용액(2.8 g, 3.35 mmol, 1 당량)를 -78℃로 냉각하고 O3(15 psi) 스트림을 연한 청색이 분명해질 때까지 반응 혼합물에 버블링하였다. 이어서, 산소를 청색이 사라질때까지 반응 혼합물을 통해 버블링시키고, 0.5시간 후, NaBH4(253.60 mg, 6.70 mmol, 2 당량)를 0℃에서 첨가하였다. 이어서 혼합물은 2시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 NH4C1(100 mL)로 켄칭시키고 이어서 EtOAc(50 mL)로 희석하였다. 수성상을 EtOAc(50 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(20 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에 건조시키고, 여과하고 진공하에 농축시켜 잔류물을 수득하고 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 1/1)로 정제하고 컬럼: Welch Ultimate XB-SiOH 250*50*10 um; 이동상:[헥산-EtOH]; B%: 0%-20%, 20 min으로 정제하여 화합물 CAT15 (141 mg, 166.19 umol, 77.86% 수율, 99.4% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 843.7;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.90-4.65 (m, 2H), 3.82-3.65 (m, 4H), 3.45-3.25 (m, 4H), 3.00-2.90 (m, 6H), 2.38-2.20 (m, 4H), 2.00-1.75 (m, 10H), 1.70-1.55 (m, 10H), 1.30-1.15 (m, 40H), 0.96-0.86 (m, 12H).
실시예 1.16: CAT16의 합성
단계 1: 메틸 3-(토실옥시)사이클로부탄카복실레이트( 16-2 )
DCM(250 mL) 중의 메틸 3-하이드록시사이클로부탄카복실레이트(15.0 g, 115 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(23.3 g, 231 mmol, 32.1 mL, 2 당량), DMAP(704 mg, 5.76 mmol, 0.05 당량) 및 TosCl(26.4 g, 138 mmol, 1.2 당량)을 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 혼합물은 16시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM(100 mL)으로 희석시키고 염수(80 mL × 3)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(80 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 에틸 아세테이트: 석유 에테르: 0 ~ 25%). 화합물 16-2(22.3 g, 78.4 mmol, 68% 수율)를 담황색 오일로서 수득하였다.
단계 2: 메틸 3-(트리틸티오)사이클로부탄카복실레이트( 16-3 )
DMF(300 mL) 중의 메틸 3-(p-톨릴설포닐옥시)사이클로부탄카복실레이트(26.0 g, 91.4 mmol, 1 당량) 용액에 트리페닐메탄티올(37.9 g, 137 mmol, 1.5 당량) 및 CS2CO3(59.6 g, 183 mmol, 2 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 H2O(100 mL)로 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(200 mL)로 희석하였다. 수성 상은 에틸 아세테이트(200 mL × 2)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(200 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 조 생성물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 220 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 40 mL/min에서 0~15% 에틸 아세테이트/석유 에테르 구배의 용출)로 정제하였다. 화합물 16-3(35.0 g, 90.1 mmol, 98% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 7.28 - 7.17 (m, 15H), 3.59 (s, 3H), 3.35 - 3.30 (m, 1H), 3.00 - 2.93 (m, 1H), 2.19 - 2.13 (m, 2H), 2.04 - 1.99 (m, 2H).
단계 3: 3-(트리틸티오)사이클로부탄카복실산( 16-4 )
THF(200 mL) 중의 메틸 3-트리틸설파닐사이클로부탄카복실레이트(25.0 g, 64.4 mmol, 1 당량)의 혼합물에 LiOHㆍH2O(8.10 g, 193.1 mmol, 3 당량)를 첨가하고, 반응 혼합물을 40℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 4 M HCl을 사용하여 pH 5로 조정한 다음, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(200 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(200 mL × 2)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 20 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 40 mL/min에서 0~50% 에틸 아세테이트/석유 에테르 구배의 용출)로 정제하였다. 화합물 16-4(17.8 g, 47.5 mmol, 74% 수율)를 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 12.07 (s, 1H), 7.38 - 7.27 (m, 12H), 7.26 - 7.19 (m, 3H), 3.21 - 3.13 (m, 1H), 2.87 - 2.80 (m, 1H), 2.02 - 1.81 (m, 4H).
단계 4: 1,3-비스(3-(트리틸티오)사이클로부틸)우레아( 16-5 )
톨루엔(100 mL) 중의 3-트리틸설파닐사이클로부탄카복실산(10.0 g, 26.7 mmol, 1 당량) 및 TEA(4.05 g, 40.1 mmol, 5.57 mL, 1.5 당량)의 혼합물에 DPPA(8.82 g, 32.0 mmol, 6.94 mL, 1.2 당량)을 20℃에서 첨가하고, 이어서 반응 혼합물을 100℃로 가열하고 4시간 동안 교반하였다. 10% NaOH 용액을 첨가하여 반응 혼합물을 켄칭한 다음, 반응 혼합물을 여과하고 케이크 필터를 진공 하에 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 반응 잔류물을 다음 단계에서 직접 사용하였다. 화합물 16-5(14.0 g, 조 생성물)를 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 717.3
단계 5: 3-(트리틸티오)사이클로부탄아민( 16-6 )
1,3-비스(3-트리틸설파닐사이클로부틸)우레아(2.00 g, 2.79 mmol, 1 당량), KOH(313 mg, 5.58 mmol, 2 당량)를 에틸렌 글리콜(10 mL) 중 마이크로파 튜브에 넣었다. 밀봉된 튜브는 마이크로파 하에 1시간 동안 150℃에서 가열하였다. 반응 혼합물은 H2O(30 mL)로 켄칭시키고 에틸 아세테이트(30 mL × 2)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 조 생성물을 수득하였다. 반응 잔류물을 다음 단계에서 직접 사용하였다. 화합물 16-6(10.0 g, 조 생성물)을 갈색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 346.1
단계 6: N,N-디메틸-3-(트리틸티오)사이클로부탄아민( 16-7 )
MeOH(10 mL) 중의 3-트리틸설파닐사이클로부탄아민(10.0 g, 28.9 mmol, 1 당량)의 혼합물에 (HCHO)n(10.0 g, 145 mmol, 5 당량), AcOH(3.48 g, 57.9 mmol, 3.31 mL, 2 당량), NaBH3CN(3.64 g, 57.9 mmol, 2 당량)을 0℃에서 연속적으로 첨가하고 이어서 반응 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. 포화 NH4Cl 용액(20 mL)을 첨가하여 반응 혼합물을 켄칭하고 에틸 아세테이트(30 mL × 3)로 추출하고 이어서 합한 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 반응 잔류물을 다음 단계에서 직접 사용하였다. 화합물 16-7(6.00 g, 조 생성물)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 374.3
단계 7: 3-(디메틸아미노)사이클로부탄티올( 16-8 )
DCM(20 mL) 중의 N,N-디메틸-3-트리틸설파닐-사이클로부탄아민(6.00 g, 16.1 mmol, 1 당량) 용액에 트리이소프로필실란(5.09 g, 32.1 mmol, 6.60 mL, 2 당량) 및 TFA(4.62 g, 40.5 mmol, 3 mL, 2.52 당량)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하여 잔류물을 수득한 다음, 반응 잔류물을 MeOH(20 mL)에 첨가하고 석유 에테르(3 × 10 mL)로 세척하고 진공 농축시켰다. 반응 잔류물을 다음 단계에서 직접 사용하였다. 화합물 16-8 (1.40 g, 조 생성물)을 황색 오일로서 수득하였다.
단계 8: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((3-디메틸아미노)사이클로부틸)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트( CAT16 ):
무수 DCM(30 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(2.00 g, 3.28 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(995 mg, 9.84 mmol, 1.37 mL, 3 당량) 및 비스(트리클로로메틸)카보네이트(486 mg, 1.64 mmol, 0.5 당량)를 0℃에서 N2 대기 하에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고 N2 하에 유지시켰다. 무수 THF(30 mL) 중의 3-(디메틸아미노)사이클로부탄티올(1.72 g, 13.1 mmol, 4 당량) 용액에 NaOH(918 mg, 22.9 mmol, 7 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, 카바모일 클로라이드를 0℃에서 N2 하에 주사기를 통해 서서히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 NH4C1(100 mL)로 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(100 mL)로 희석하였다. 수성 상은 에틸 아세테이트(100 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 50/1 내지 3/1)에 의해 정제하였다. 화합물 CAT16(1.60 g, 2.09 mmol, 64% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 767.6
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 4.93 - 4.83 (m, 2H), 3.86 - 3.82 (m, 1H), 3.34 - 3.32 (m, 4H), 3.00 -2.90 (m, 1H), 2.54 - 2.42 (m, 2H), 2.33 - 2.30 (m, 4H), 2.13 (s, 6H), 1.93 - 1.80 (m, 6H), 1.60 - 1.44 (m, 8H), 1.30 - 1.20 (m, 40H), 0.98 - 0.78 (m, 12H).
실시예 1.17: CAT17의 합성
단계 1: (1-메틸피롤리딘-3-일) 4-메틸벤젠설포네이트( 17-2 )
CH2Cl2(300 mL) 중의 1-메틸피롤리딘-3-올(20 g, 197.73 mmol, 1 당량) 용액에 TosCl(45.24 g, 237.28 mmol, 1.2 당량), TEA(60.03 g, 593.20 mmol, 82.57 mL, 3 당량) 및 DMAP(12.08 g, 98.87 mmol, 0.5 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 물(300 mL)로 켄칭시키고 이어서 CH2Cl2(100 mL)로 희석하였다. 수성상을 CH2Cl2(100 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 1/1)로 정제하여 화합물 17-2(39 g, 152.74 mmol, 77.25% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.79 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.10-4.96 (m, 1H), 2.70-2.58 (m, 2H), 2.44 (s, 3H), 2.38-2.32 (m, 2H), 2.31 (s, 3H), 2.18-2.12 (m, 1H), 1.95-1.90 (m, 1H)
단계 2: 1-메틸-3-트리틸설파닐-피롤리딘: ( 17-3 )
DMF(100 mL) 중의 (1-메틸피롤리딘-3-일) 4-메틸벤젠설포네이트(15 g, 58.75 mmol, 1 당량) 및 트리페닐메탄티올(19.48 g, 70.50 mmol, 1.2 당량) 용액에 K2CO3(24.36 g, 176.24 mmol, 3 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 6시간 동안 80℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 NH4C1(100 mL)로 켄칭시키고 이어서 EtOAc(300 mL)로 희석하였다. 수성상을 EtOAc(100 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(200 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 0/1)로 정제하여 화합물 17-3(20 g, 55.63 mmol, 94.69% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.60-7.30 (m, 15H), 2.65-2.48 (m, 4H), 2.40-2.35 (m, 3H), 2.28-1.60 (m, 3H)
단계 3: 1-메틸피롤리딘-3-티올: ( 17-4 )
CH2Cl2(300 mL) 중의 1-메틸-3-트리틸설파닐-피롤리딘(20 g, 55.63 mmol, 1 당량) 용액에 TFA(46.20 g, 405.18 mmol, 30.00 mL, 7.28 당량) 및 트리이소프로필실란(26.43 g, 166.89 mmol, 34.28 mL, 3 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 TFA를 제거하였다. 잔류물을 MeOH(100 mL)로 희석시키고 PE(50 mL × 5)로 추출하였다. MeOH 층은 감압 하에 농축시켜 화합물 17-4(5.4 g, 46.07 mmol, 82.82% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
단계 4: 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]-(1-메틸피롤리딘-3-일)설파닐카보닐-아미노]부타노에이트: ( CAT17 )
무수 CH2Cl2(40 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(1.5 g, 2.46 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(746.47 mg, 7.38 mmol, 1.03 mL, 3 당량) 및 비스(트리클로로메틸)카보네이트(364.85 mg, 1.23 mmol, 0.5 당량)를 0℃에서 질소 대기 하에 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 질소 대기 하에 20℃에서 교반하였다. 반응물을 감압 하에 농축시키고 질소 대기 하에 유지하였다. NaOH(688.47 mg, 17.21 mmol, 7 당량)를 THF(50 mL)에 0℃에서 질소 대기 하에 용해시키고, 이어서 1-메틸피롤리돈-3-티올(1.44 g, 12.30 mmol, 5 당량)을 질소 대기 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(10 mL) 중의 카바모일 클로라이드를 질소 대기 하에 0℃에서 서서히 첨가하였다. 혼합물은 0.5시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 NH4C1 (100 mL)로 켄칭시키고 이어서 EtOAc(200 mL)로 희석하였다. 수성상을 EtOAc(100 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 0/1)로 정제하고 컬럼 Welch Ultimate XB-SiOH 250*50*10 μm; 이동상: [헥산-EtOH]; B%: 0%-13%, 10 min으로 정제하여 화합물 CAT17(395 mg, 516.03 μmol, 64.78% 수율, 98.4% 순도)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 753.8
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.90-4.80 (m, 2H), 4.00-3.90 (m, 1H), 3.50-3.38 (m, 4H), 3.05-2.90 (m, 1H), 2.82-2.75 (m, 1H), 2.68-2.60 (m, 1H), 2.48-2.40 (m, 2H), 2.37 (s, 3H), 2.30 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 1.98-1.70 (m, 5H), 1.52-1.48 (m, 8H), 1.32-1.24 (m, 40H), 0.92-0.86 (m, 12H)
실시예 1.18: CAT18의 합성
단계 1: 4-(4-니트로-N-(4-옥소-4-(펜타데칸-8-일옥시)부틸)페닐설폰아미도)부탄산( 18-2 )
CH2Cl2(200 mL) 중 4-[3-카복시프로필-(4-니트로페닐)술포닐-아미노]부탄산(25 g, 66.78 mmol, 1.04 당량), 펜타데칸-8-올(8.09 g, 35.40 mmol, 0.55 당량), EDCI(6.79 g, 35.40 mmol, 0.55 당량), DMAP(786.38 mg, 6.44 mmol, 0.1 당량) 및 DIPEA(4.99 g, 38.62 mmol, 6.7 mL, 0.6 당량)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 세정하고, 이어서 혼합물을 N2 대기 하에 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 H2O(150 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(150 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(150 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(200 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다.　잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(80 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc/PE: 0~10%)로 정제하여 화합물 18-2(12.8 g, 21.89 mmol, 34.0% 수율)를 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.37 - 8.35 (m, 2H), 8.02 - 7.99 (m, 2H), 4.90 - 4.84 (m, 1H), 3.27 - 3.23 (m, 4H), 2.43 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.35 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.91 - 1.86 (m, 4H), 1.52 - 1.50 (m, 4H), 1.27 - 1.25 (m, 20H), 0.89 - 0.86 (m, 6H).
단계 2: tert-부틸-4-(4-니트로-N-(4-옥소-4-(펜타데칸-8-일옥시)부틸)페닐설폰아미도)부타노에이트( 18-3 )
THF(150 mL) 중의 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]-(4-니트로페닐)설포닐-아미노]부탄산(12.5 g, 21.38 mmol, 1 당량) 용액에 2-tert-부틸-1,3-디이소프로필-이소우레아(12.85 g, 64.13 mmol, 3 당량)를 25℃에서 N2 하에 적가하였다. 첨가 후, 혼합물은 16시간 동안 50℃에서 교반하였다. 첨가 후, 반응 혼합물은 감압 하에 농축시켜 용매를 제거하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(80 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc:PE:0~10%)로 정제하여 화합물 3(11.6 g, 18.10 mmol, 84.7% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.37 - 8.34 (m, 2H), 8.02 - 7.99 (m, 2H), 4.88 - 4.85 (m, 1H), 3.26 - 3.21 (m, 4H), 2.32 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.26 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.91 - 1.79 (m, 4H), 1.52 - 1.50 (m, 4H), 1.45 (s, 9H), 1.30 - 1.25 (m, 20H), 0.90 - 0.86 (m, 6H).
단계 3: tert-부틸 4-((4-옥소-4-(펜타데칸-8-일옥시)부틸)아미노)부타노에이트( 18-4 )
DMF(50 mL) 중의 1-헵틸옥틸-4-[(4-tert-부톡시-4-옥소-부틸)-(4-니트로페닐)설포닐-아미노]부타노에이트(8 g, 12.48 mmol, 1 당량)의 용액에　Cs2CO3(8.13 g, 24.97 mmol, 2 당량)　및 벤젠티올(3.73 g, 33.85 mmol, 3.45 mL, 2.71 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 16시간 동안 25℃에서 N2 하에 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 H2O(120 mL)를 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 EtOAc(150 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(60 mL*3)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켰다.　잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(40 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc/PE: 0~35%)로 정제하여 황색 오일로서 화합물 18-4(4.1 g, 9.00 mmol, 72.1% 수율)를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.90 - 4.84 (m, 1H), 2.65 - 2.61 (m, 4H), 2.35 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.27 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.80 - 1.76 (m, 4H), 1.52 - 1.48 (m, 4H), 1.44 (s, 9H), 1.30 - 1.26 (m, 20H), 0.90 - 0.86 (m, 6H).
단계 4: tert-부틸 4-((4-옥소-4-(펜타데칸-8-일옥시)부틸)(((3-(피롤리딘-1-일)프로필)티오)카보닐)아미노)부타노에이트( 18-5 )
무수 CH2Cl2(30 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[(4-tert-부톡시-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(1.5 g, 3.29 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(999.2 mg, 9.87 mmol, 1.4 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(586.1 mg, 1.97 mmol, 0.6 당량)을 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에 농축시키고 N2 하에 유지시켰다. 무수 THF(30 mL)에 용해된 3-피롤리딘-1-일프로판-1-티올(2.99 g, 11.52 mmol, 3.5 당량, TFA)용액에 NaOH(921.63 mg, 23.04 mmol, 7 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(20 mL)에 용해된 카바모일 클로라이드를 N2 하에 0℃에서 서서히 주사기를 통해 첨가하였다. 생성된 용액을 15시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 0℃에서 NH4Cl(60 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(50 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(60 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(20 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc:PE: 0~13%, EtOAc 중 5% NH3ㆍH2O)로 정제하여 무색 오일로서 화합물 18-5 (1.05 g, 1.26 mmol, 41.5% 수율, 75% 순도)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.89 - 4.86 (m, 1H), 2.96 - 2.92 (m, 2H), 2.55 - 2.51 (m, 8H), 2.32 -2.30 (m, 2H), 2.26 - 2.23 (m, 2H), 1.86 - 1.82 (m, 6H), 1.80 - 1.78 (m, 4H), 1.53 - 1.50 (m, 4H), 1.45 (s, 9H), 1.30 - 1.26 (m, 20H), 1.18 - 1.16 (m, 2H), 0.90 - 0.86 (m, 6H).
단계 5: 4-((4-옥소-4-(펜타데칸-8-일옥시)부틸)(((3-(피롤리딘-1-일)프로필)티오)카보닐)아미노)부탄산( 18-6 )
CH2Cl2(10 mL) 중의 1-헵틸옥틸 4-[(4-tert-부톡시-4-옥소-부틸)-(3-피롤리딘-1-일프로필설파닐카보닐)아미노]부타노에이트(950 mg, 1.52 mmol, 1 당량) 용액에 TFA(3.44 g, 30.19 mmol, 2.5 mL)를 N2 하에 첨가하였다. 혼합물은 16시간 동안 25℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 감압 하에 농축하여 용매를 제거하여 화합물 18-6(1.02 g, 조 생성물, TFA)을 황색 오일로서 수득하였다. 조 생성물은 다음 단계에서 추가의 정제 없이 사용하였다.　
단계 6: (Z)-논-2-엔-1-일 4-((4-옥소-4-(펜타데칸-8-일옥시)부틸)(((3-(피롤리딘-1-일)프로필)티오)카보닐)아미노)부타노에이트( CAT18 )
CH2Cl2(20 mL) 중의 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]-(3-피롤리딘-1-일프로필설파닐)아미노]부탄산(1.0 g, 1.46 mmol, 1 당량, TFA), (Z)-논-2-엔-1-올(415.4 mg, 2.92 mmol, 2 당량), EDCI(419.9 mg, 2.19 mmol, 1.5 당량), DMAP(17.8 mg, 0.15 mmol, 0.1 당량) 및 DIPEA(566.1 mg, 4.38 mmol, 0.76 mL, 3 당량)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 세정하고, 이어서 혼합물을 N2 대기 하에 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 H2O(60 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(50 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(50 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(60 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다.　잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(20 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc:PE: 0~13%, EtOAc 중 5% NH3ㆍH2O)로 정제하여 담황색 오일로서 화합물 CAT18(413 mg, 0.58 mmol, 40.5% 수율, 98.1% 순도)을 수득하였다.
LCMS [M+H] + : 695.5
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 5.68 - 5.62 (m, 1H), 5.54 - 5.51 (m, 1H), 4.89 - 4.86 (m, 1H), 4.64 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 3.39 - 3.37 (m, 4H), 2.94 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.52 - 2.50 (m, 6H), 2.36 - 2.34 (m, 4H), 2.12- 2.09 (m, 2H), 1.84 - 1.79 (m, 6H), 1.78 - 1.76 (m, 4H), 1.52 - 1.50 (m, 4H), 1.40 - 1.35 (m, 2H), 1.30 - 1.25 (m, 26H), 0.90 - 0.87 (m, 9H).
실시예 1.19: CAT19의 합성
단계 1: tert-부틸 4-하이드록시아제판-1-카복실레이트( 19-2 )
THF(300 mL) 중의 tert-부틸 4-옥소아제판-1-카복실레이트(30.0 g, 141 mmol, 1 당량)의 혼합물에 0℃에서 LiAlH4(5.87 g, 155 mmol, 1.1 당량)를 첨가하고, 이어서 반응 혼합물을 동일한 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 연속으로 0℃에서 H2O(5.8 mL), 수성 NaOH(17.4 mL, 4M), H2O(5.8 mL)로 켄칭하였다. 이어서, 무수 Na2SO4 (20.0 g)을 혼합물에 첨가하고 이는 동일한 온도에서 0.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 여과물을 진공하에 농축시켜 조 생성물을 수득하였다. 반응 잔류물을 다음 단계에서 직접 사용하였다. 화합물 19-2(30.0 g, 조 생성물)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ : 4.50 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 3.69 - 3.55 (m, 1H), 3.31 - 3.05 (m, 4H), 1.84 - 1.70 (m, 2H), 1.70 - 1.41 (m, 2H), 1.39 (s, 9H).
단계 2: tert-부틸 4-(토실옥시)아자판-1-카복실레이트( 19-3 )
DCM(500 mL) 중의 tert-부틸 4-하이드록시아제판-1-카복실레이트(30.0 g, 139 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(42.3 g, 418 mmol, 58.2 mL, 3 당량), DMAP(8.51 g, 69.7 mmol, 0.5 당량) 및 TosCl(39.9 g, 209 mmol, 1.5 당량)을 연속으로 첨가하고 혼합물을 25℃에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(100 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, DCM(100 mL × 3)으로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 220 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 100 mL/min에서 0~20% 에틸 아세테이트/석유 에테르 구배의 용출)로 정제하였다. 화합물 19-3(43.0 g, 116 mmol, 84% 수율)을 갈색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M-Boc]+: 270.0;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 7.80 - 7.75 (m, 2H), 7.35 - 7.32 (m, 2H), 4.75 - 4.59 (m, 1H), 3.60 - 3.36 (m, 2H), 3.31 - 3.23 (m, 2H), 2.45 (s, 3H), 1.93 - 1.81 (m, 4H), 1.78 - 1.65 (m, 2H), 1.43 (s, 9H).
단계 3: tert-부틸 4-(트리틸티오)아자판-1-카복실레이트( 19-4 )
DMF(200 mL) 중의 tert-부틸 4-(p-톨릴설포닐옥시)아제판-1-카복실레이트(21.0 g, 56.8 mmol, 1 당량) 및 트리페닐메탄티올(20.4 g, 73.9 mmol, 1.3 당량) 용액에 Cs2CO3(37.0 g, 114 mmol, 2 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 6시간 동안 80℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물(100 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 에틸 아세테이트(150 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(200 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 330 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 100 mL/min에서 0~30% 에틸 아세테이트/석유 에테르 구배의 용출)로 정제하였다. 화합물 19-4(21.0 g, 44.3 mmol, 39% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+Na]+: 496.2
단계 4: 4-(트리틸티오)아제판( 19-5 )
DCM(200 mL) 중의 tert-부틸 4-트리틸설파닐아제판-1-카복실레이트(20.0 g, 42.2 mmol, 1 당량)의 용액에 TFA(61.6 g, 540 mmol, 40.0 mL, 12.8 당량)를 첨가하고, 반응 혼합물을 20℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공하에 농축시켜 갈색 오일을 수득하였다. 반응 잔류물을 다음 단계에서 직접 사용하였다. 화합물 19-5(27.0 g, 조 생성물, TFA)를 갈색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 374.1;
단계 5: 3-(트리틸티오)사이클로부탄아민( 19-6 )
MeOH(60 mL) 중의 4-트리틸설파닐아제판(10.0 g, 20.5 mmol, 1 당량, TFA)의 혼합물에 (HCHO)n(10.0 g, 20.5 mmol, 1 당량), KOAc(3.02 g, 30.8 mmol, 1.5 당량) 및 NaBH3CN(2.58 g, 41.0 mmol, 2 당량)을 0℃에서 연속적으로 첨가하고 이어서 반응 혼합물을 20℃에서 3시간 동안 교반하였다. 포화 NH4Cl 용액(20 mL)을 첨가하여 반응 혼합물을 켄칭하고 에틸 아세테이트(30 mL × 3)로 추출하고 이어서 합한 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 80 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 80 mL/min에서 0~20% 디클로로메탄:메탄올 구배의 용출)로 정제하였다. 화합물 19-6(4.30 g, 11.1 mmol, 54% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 388.2;
단계 6: 1-메틸아제판-4-티올( 19-7 )
DCM(40 mL) 중의 1-메틸-4-트리틸설파닐-아제판(4.30 g, 11.1 mmol, 1 당량) 용액에 트리이소프로필실란(3.51 g, 22.2 mmol, 4.56 mL, 2 당량) 및 TFA(9.93 g, 87.1 mmol,6.45 mL, 7.85 당량)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물은 5시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하여 잔류물을 수득한 다음, 반응 잔류물을 MeOH(20 mL)에 첨가하고 석유 에테르(3 × 10 mL)로 3회 세척하고 진공 농축시켰다. 반응 잔류물을 다음 단계에서 직접 사용하였다. 화합물 19-7(2.10 g, 조 생성물)을 갈색 오일로서 수득하였다.
단계 7: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((1-메틸아제판-4-일)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트( CAT19 ):
무수 DCM(30 mL)에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(1.50 g, 2.46 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(746 mg, 7.38 mmol, 1.03 mL, 3 당량) 및 비스(트리클로로메틸)카보네이트(320 mg, 1.08 mmol, 4.39e-1 당량)를 0℃에서 N2 대기 하에 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 20℃에서 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에 농축시키고 N2 하에 유지시켰다. 무수 THF(30 mL) 중의 1-메틸아제판-4-티올(1.43 g, 9.84 mmol, 4 당량) 용액에 NaOH(688 mg, 17.2 mmol, 7 당량)를 0℃에서 N2 대기 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, 카바모일 클로라이드를 N2 하에 0℃에서 주사기를 통해 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 NH4C1(100 mL)로 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(100 mL)로 희석하였다. 수성 상은 에틸 아세테이트(100 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 2/1)에 의해 정제하였다. 화합물 CAT19(700 mg, 0.896 mmol, 36% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 781.5;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 4.90 - 4.84 (m, 2H), 3.79 - 3.62 (m, 1H), 3.46 - 3.27 (m, 4H), 2.77 - 2.48 (m, 4H), 2.36 (s, 3H), 2.33 - 2.29 (m, 4H), 2.20 - 2.06 (m, 2H), 1.94 - 1.86 (m, 4H), 1.82 - 1.74 (m, 2H), 1.68 - 1.63 (m, 2H), 1.53 - 1.50 (m, 8H), 1.33 - 1.22 (m, 40H), 0.95 - 0.86 (m, 12H).
실시예 1.20: CAT20의 합성
단계 1: 1-에틸-4-(트리틸티오)아제판( 20-2 )
MeOH(10 mL) 중의 4-트리틸설파닐아제판(10.0 g, 20.5 mmol, 1 당량, TFA)의 혼합물에 KOAc(3.02 g, 30.8 mmol, 1.5 당량), MeCHO(4.52 g, 41.0 mmol, 5.75 mL, 40% 순도, 2 당량) 및 NaBH3CN(2.58 g, 41.0 mmol, 2 당량)을 연속적으로 첨가하고 이어서 반응 혼합물을 20℃에서 3시간 동안 교반하였다. 포화 NH4Cl 용액(20 mL)을 첨가하여 반응 혼합물을 켄칭하고 에틸 아세테이트(30 mL × 3)로 추출하고 이어서 합한 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 2/1)에 의해 정제하였다. 화합물 20-2(8.00 g, 조 생성물)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 402.2
단계 2: 1-에틸아제판-4-티올( 20-3 )
DCM(40 mL) 중의 1-에틸-4-트리틸설파닐-아제판(8.00 g, 19.9 mmol, 1 당량) 용액에 트리이소프로필실란(6.31 g, 39.8 mmol, 8.18 mL, 2 당량) 및 TFA(17.8 g, 156 mmol, 11.6 mL, 7.85 당량)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하여 잔류물을 수득한 다음, 반응 잔류물을 MeOH(20 mL)에 첨가하고 석유 에테르(3 × 10 mL)로 3회 세척하고 진공 농축시켰다. 반응 잔류물을 다음 단계에서 직접 사용하였다. 화합물 20-3(2.30 g, 조 생성물)을 갈색 오일로서 수득하였다.
단계 3: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((1-에틸아제판-4-일)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트( CAT20 ):
무수 DCM(30 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(2.00 g, 3.28 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(995 mg, 9.84 mmol, 1.37 mL, 3 당량) 및 비스(트리클로로메틸)카보네이트(300 mg, 1.01 mmol, 3.08e-1 당량)을 0℃에서 N2 대기 하에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에 농축시키고 N2 하에 유지시켰다. 무수 THF(30 mL) 중의 1-에틸아제판-4-티올(2.09 g, 13.1 mmol, 4 당량) 용액에 NaOH(918 mg, 23.0 mmol, 7 당량)를 0℃에서 N2 대기 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, 카바모일 클로라이드를 N2 하에 0℃에서 주사기를 통해 서서히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 NH4C1(100 mL)로 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(100 mL)로 희석하였다. 수성 상은 에틸 아세테이트(100 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 2/1)에 의해 정제하였다. 화합물 CAT20(1.80 g, 2.26 mmol, 69% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 796.4;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 4.90 - 4.84 (m, 2H), 3.70 - 3.63 (m, 1H), 3.44 - 3.29 (m, 4H), 2.84 - 2.70 (m, 2H), 2.62 - 2.52 (m, 2H), 2.34 - 2.27 (m, 4H), 2.18 - 2.07 (m, 2H), 1.96 - 1.73 (m, 10H), 1.53 - 1.50 (m, 8H), 1.32 - 1.25 (m, 40H), 1.08 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.91 - 0.86 (m, 12H).
실시예 1.21: CAT21의 합성
단계 1: tert-부틸 4-(토실옥시)피페리딘-1-카복실레이트( 21-2 )
CH2Cl2(500 mL) 중의 tert-부틸 4-하이드록시피페리딘-1-카복실레이트(50 g, 248.43 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(50.28 g, 496.86 mmol, 69.2 mL, 2 당량), DMAP(1.52 g, 12.42 mmol, 0.05 당량) 및 TosCl(71.04 g, 372.65 mmol, 1.5 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다.　혼합물은 16시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 CH2Cl2(300 mL)로 희석시키고 염수(300 mL * 3)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다.　잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(220 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc:PE: 0~25%)로 정제하여 화합물 21-2(82.6 g, 232.38 mmol, 91.8% 수율)를 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.80 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.70 - 4.65 (m, 1H), 3.59 - 3.57 (m, 2H), 3.28 - 3.23 (m, 2H), 2.45 (s, 3H), 1.77 - 1.74 (m, 2H), 1.70 - 1.67 (m, 2H), 1.43 (s, 9H).
단계 2: tert-부틸 4-(트리틸티오)피페리딘-1-카복실레이트( 21-3 )
DMF(300 mL) 중의 tert-부틸 4-(p-톨릴설포닐옥시)피페리딘-1-카복실레이트(40 g, 112.53 mmol, 1 당량), 트리페닐메탄티올(37.32 g, 135.04 mmol, 1.2 당량), NaI(843.39 mg, 5.63 mmol, 0.05 당량), Cs2CO3(55.00 g, 168.80 mmol, 1.5 당량)을 탈기하고 N2로 3회 세정한 다음, 혼합물을 N2 대기 하에 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 첨가 후, 반응 혼합물은 H2O(600 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(500 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(500 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(500 mL*3)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물은 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(330 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc/PE: 0~5%)로 정제하여 황색 오일로서 화합물 21-3(75.8 g, 164.91 mmol, 75.1% 수율)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CD3OD-d 4 ) δ = 7.33 - 7.31 (m, 5H), 7.29 - 7.26 (m, 10H), 3.70 - 3.67 (m, 2H), 2.69 - 2.64 (m, 2H), 2.40 - 2.35 (m, 1H), 1.57 - 1.48 (m, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.42 -1.34 (m, 2H).
단계 3: 4-(트리틸티오)피페리딘( 21-4 )
DCM(500 mL) 중의 tert-부틸-4-트리틸설파닐피페리딘-1-카복실레이트(75 g, 163.17 mmol, 1 당량) 용액에 TFA(154.00 g, 1.35 mol, 100 mL, 8.28 당량)를 25℃에서 N2 대기 하에 첨가하였다. 첨가 후 혼합물은 5시간 동안 25℃에서 교반하였다. 완료 후, 혼합물은 진공 농축시켰다. 대부분의 TFA는 회전 증발로 제거하였고, 잔류 TFA는 MeOH와 함께 증발시켰다.　잔류물을 25℃에서 0.5시간 동안 PE(500 mL)로 연마하였다. 잔류 혼합물을 여과하고 필터 케이크를 PE(100 mL*2)로 세척하였다. 필터 케이크를 진공 농축시켜 화합물 21-4(56.8 g, 조 생성물, TFA)를 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 9.00 - 8.85 (m, 1H), 7.41 - 7.38 (m, 6H), 7.23 - 7.20 (m, 6H), 7.19 - 7.13 (m, 3H), 3.05 - 3.03 (m, 2H), 2.64 - 2.63 (m, 2H), 2.36 - 2.32 (m, 1H), 1.54 - 1.42 (m, 4H).
단계 4: 1-이소프로필-4-(트리틸티오)피페리딘( 21-5 )
MeCN(150 mL) 중의 4-트리틸설파닐피페리딘(15 g, 31.68 mmol, 1 당량, TFA)의 용액에　K2CO3(13.13 g, 95.03 mmol, 3 당량)　및 2-요오도프로판(5.92 g, 34.84 mmol, 3.48 mL, 1.1 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 16시간 동안 60℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 여과하고 여과물을 진공에서 농축시켜 잔류물을 수득하였다.　잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(80 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, MeOH/EtOAc: 0~5%)로 정제하여 황색 오일로서 화합물 21-5(8.2 g, 20.42 mmol, 64.46% 수율)를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.55 - 7.50 (m, 6H), 7.32 - 7.27 (m, 6H), 7.24 - 7.18 (m, 3H), 2.67 - 2.61 (m, 2H), 2.61 - 2.53 (m, 1H), 2.25 - 2.15 (m, 1H), 1.94 (t, J = 9.0 Hz, 2H), 1.50 - 1.40 (m, 4H), 0.96 (d, J = 6.4 Hz, 6H).
단계 5: 1-이소프로필피페리딘-4-티올( 21-6 )
CH2Cl2(80 mL) 중의 1-이소프로필-4-트리틸설파닐-피페리딘(8.1 g, 20.17 mmol, 1 당량) 용액에 TFA(30.80 g, 270.13 mmol, 20 mL, 13.39 당량) 및 TIPS(7.91 g, 40.34 mmol, 2 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 첨가 후, 생성된 혼합물을 16시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 TFA를 제거하고 여과하였다. 여과물을 MeOH(150 mL)로 희석시키고 PE(50 mL * 5)로 추출하였다. MeOH 층은 감압 하에 농축시켜 화합물 21-6(5.6 g, 조 생성물, TFA)을 황색 오일로서 수득하였다. 조 생성물은 다음 단계에서 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 6: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((1-이소프로필피페리딘-4-일)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트( CAT21 ):
무수 CH2Cl2(25 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(2 g, 3.28 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(995.31 mg, 9.84 mmol, 1.37 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(583.8 mg, 1.97 mmol, 0.6 당량)을 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 20℃에서 교반하였다. 생성된 반응물은 감압 하에 농축시켰다. 무수 THF(30 mL)에 용해된 1-이소프로필피페리딘-4-티올(3.14 g, 11.48 mmol, 3.5 당량, TFA)의 용액에 NaOH(918.03 mg, 22.95 mmol, 7 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(20 mL)에 용해된 카바모일 클로라이드를 N2 대기 하에 0℃에서 서서히 주사기를 통해 첨가하였다. 생성된 용액을 15시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 0℃에서 NH4Cl(60 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(50 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(60 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(20 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc:PE: 0~12%, 에틸 아세테이트 중 5% NH3ㆍH2O)로 정제하고 양성 prep-HPLC(컬럼: Welch Ultimate XB-NH2 250*50*10 um;이동상: [헥산-EtOH];B%: 0%-20%, 15Min)로 정제하여 CAT21(428 mg, 0.52 mmol, 57.7% 수율, 97% 순도)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+H] + : 795.6;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.90 - 4.84 (m, 2H), 3.40 - 3.37 (m, 4H), 2.82 - 2.79 (m, 2H), 2.70 - 2.67 (m, 1H), 2.35 - 2.30 (m, 6H), 2.04 - 2.01 (m, 2H), 1.95 - 1.85 (m, 4H), 1.72 - 1.66 (m, 3H), 1.52- 1.50 (m, 8H), 1.32 - 1.26 (m, 40H), 1.03 (d, J = 6.4 Hz 6H), 0.90 - 0.86 (m, 12H).
실시예 1.22: CAT22의 합성
단계 1: 1-에틸-4-(트리틸티오)피페리딘( 22-5 )
DMF(100 mL) 중의 4-트리틸설파닐피페리딘(15.0 g, 31.9 mmol, 1.00 당량, TFA)의 용액에　K2CO3(13.1 g, 95.0 mmol, 3.00 당량)　및 요오도에탄(4.45 g, 28.5 mmol, 2.28 mL, 0.90 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 16시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 물(150 mL)로 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(100 mL)로 희석하였다. 수성 상은 에틸 아세테이트(150 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(100 mL × 3)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(80 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 에틸 아세테이트: 석유 에테르: 0 ~ 40%)로 정제하고, 이어서 잔류물을 역위 MPLC(MeCN : H2O: 0 ~ 40%)로 정제하여 화합물 22-5(8.60 g, 22.0 mmol, 78.8% 수율, 99% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, MeOD-d 4) δ = 7.53-7.50 (m, 6H), 7.35-7.31 (m, 6H), 7.28-7.23 (m, 3H), 3.39-3.32 (m, 2H), 3.16-3.00 (m, 3H), 2.70-2.63 (m, 2H), 2.48-2.40 (m, 1H), 1.87-1.63 (m, 2H), 1.57-1.47 (m, 2H), 1.33-1.24 (m, 3H).
단계 2: 1-에틸피페리딘-4-티올( 22-6 )
TFA(15.0 mL) 및 디클로로메탄(50.0 mL) 중의 1-에틸-4-트리틸설파닐-피페리딘(4.50 g, 11.6 mmol, 1.00 당량)의 혼합물을 탈기하고 질소 대기로 3회 세정하고, 이어서 트리이소프로필실란(3.68 g, 23.2 mmol, 4.77 mL, 2.00 당량)을 0℃에서 서서히 첨가하고, 이어서 혼합물은 질소 대기 하에 3시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 TFA를 제거하고 여과하였다. 여과물을 메틸 알코올(50.0 mL)로 희석시키고 석유 에테르(50.0 mL × 5)로 추출하였다. 메틸 알코올 층을 감압 하에 농축시켜 조 생성물을 수득하여 화합물 22-6(3.01 g, 조 생성물, TFA 염)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 3.43-3.40 (m, 2H), 3.18-3.10 (m, 1H), 3.08-2.97 (m, 2H), 2.94-2.87 (m, 2H), 2.08 (d, J = 14 Hz, 2H), 1.84-1.73 (m, 2H), 1.24-1.18 (m, 3H).
단계 3: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((1-메틸피페리딘-4-일)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트( CAT22 ):
무수 디클로로메탄(25.0 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(2.00 g, 3.30 mmol, 1.00 당량) 용액에 TEA(995 mg, 9.80 mmol, 1.37 mL, 3.00 당량) 및 트리포스겐(540 mg, 1.80 mmol, 0.50 당량)을 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물은 감압 하에 농축시켰다. 무수 THF(30.0 mL)에 용해된 1-에틸피페리딘-4-티올(2.98 g, 11.5 mmol, 3.50 당량, TFA 염)에 NaOH(918 mg, 23.0 mmol, 7.00 당량)를 0℃에서 질소 대기 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(25.0 mL) 에 용해된 카바모일 클로라이드를 N2 대기 하에 0℃에서 서서히 주사기를 통해 첨가하였다. 생성된 용액을 20℃에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 0℃에서 NH4Cl(60.0 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(60.0 mL)로 희석시켰다. 수성 상은 에틸 아세테이트(60.0 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 120 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 100 mL/min에서 0 ~ 50% 에틸 아세테이트/석유 에테르 구배의 용출)로 정제하여 화합물 CAT22(268 mg, 0.34 mmol, 10.3% 수율, 98.8% 순도)를 담황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+1] + : 781.7;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.92-4.86 (m, 2H), 3.46-3.32 (m, 4H), 2.87-2.84 (m, 2H), 2.45-2.40 (m, 2H), 2.36-2.31 (m, 4H), 2.16 ( t, J = 9.6 Hz, 2H), 2.07-2.04 (m, 2H), 1.91 (s, 4H), 1.77-1.68 (m, 2H), 1.63-1.62 (m, 1H), 1.54-1.53 (m, 8H), 1.34-1.28 (m, 40H), 1.10 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.92-0.88 (m, 12H).
실시예 1.22: CAT23의 합성
단계 1: tert-부틸 4-(토실옥시)피페리딘-1-카복실레이트( 23-8 )
CH2Cl2(750 mL) 중의 tert-부틸 4-하이드록시피페리딘-1-카복실레이트(70 g, 347.81 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(70.39 g, 695.61 mmol, 96.82 mL, 2 당량) 및 DMAP(2.12 g, 17.39 mmol, 0.05 당량)를 20℃에서 N2 하에 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 20℃에서 0.5시간 동안 교반하였고 이어서 TosCl(79.57 g, 417.37 mmol, 1.2 당량)를 분획으로 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 16시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 CH2Cl2(800 mL)로 희석시키고, H2O(500 mL * 3), 염수(500 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 조 생성물을 수득하였다.　조 생성물은 25℃에서 1시간 동안 (PE/EtOAc = 10/1, 500 mL * 2)로 연마하여 담황색 고체로서 화합물　23-8 (230.6 g, 648.76 mmol, 93.3% 수율)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.82 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.72 - 4.66 (m, 1H), 3.64 - 3.57 (m, 2H), 3.32 - 3.24 (m, 2H), 2.47 (s, 3H), 1.82 - 1.75 (m, 2H), 1.74 - 1.68 (m, 2H), 1.45 (s, 9H).
단계 2: tert-부틸 4-(트리틸티오)피페리딘-1-카복실레이트( 23-9 )
DMF(700 mL) 중의 tert-부틸 4-(p-톨릴설포닐옥시)피페리딘-1-카복실레이트(115 g, 323.54 mmol, 1 당량), 트리페닐메탄티올(107.31 g, 388.24 mmol, 1.2 당량), NaI(2.42 g, 16.18 mmol, 0.05 당량), Cs2CO3(158.12 g, 485.30 mmol, 1.5 당량)를 탈기하고 N2로 3회 세정한 다음, 혼합물을 N2 대기 하에 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 H2O(1000 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(800 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(800 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(600 mL * 3)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, PE/EtOAc=20/1 내지 5/1)로 정제하여 화합물 23-9(178.8 g, 389.00 mmol, 66.7% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.43 - 7.40 (m, 6H), 7.21 - 7.17 (m, 6H), 7.13 - 7.11 (m, 3H), 3.62 -3.60 (m, 2H), 2.60 - 2.53 (m, 2H), 2.42 - 2.31 (m, 1H), 2.26 - 2.14 (m, 1H), 2.10 - 2.01 (m, 1H), 1.48 - 1.43 (m, 2H), 1.32 (s, 9H).
단계 3: 1-메틸-4-(트리틸티오)피페리딘(23-10)
THF(1000 mL) 중의 tert-부틸-4-트리틸설파닐피페리딘-1-카복실레이트(75 g, 163.17 mmol, 1 당량) 용액에 LAH (9.29 g, 244.76 mmol, 1.5 당량)를 0℃에서 N2 하에 분획으로 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물은 16시간 동안 70℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 THF(500 mL)로 희석시키고, 이어서 연속으로 H2O(9.3 mL), 수성 NaOH(9.3 mL, 4M), H2O(28 mL) 및 Na2SO4(100 g)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다.　반응 혼합물을 여과하고 여과물을 진공에서 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(330 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, MeOH/CH2Cl2: MeOH 중의 0~5%, 1% NH3)로 정제하여 화합물 23-10(47.8 g, 120.28 mmol, 44.1% 수율, 94% 순도)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.43 - 7.41 (m, 6H), 7.21 - 7.17 (m, 6H), 7.13 - 7.09 (m, 3H), 2.49 - 2.45 (m, 2H), 2.12 - 2.07 (m, 1H), 2.05 (s, 3H), 1.76 - 1.71 (m, 2H), 1.41 - 1.33 (m, 4H).
단계 4: 1-메틸피페리딘-4-티올( 23-3 )
CH2Cl2(60 mL) 중의 1-메틸-4-트리틸설파닐-피페리딘(7 g, 18.74 mmol, 1 당량) 용액에 TFA(30.80 g, 270.13 mmol, 20 mL, 14.42 당량) 및 TIPS(7.34 g, 37.48 mmol, 2 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 첨가 후, 생성된 혼합물을 16시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 TFA를 제거하고 여과하였다. 여과물을 MeOH(100 mL)로 희석시키고 PE(50 mL * 5)로 추출하였다. MeOH 층은 감압 하에 농축시켜 화합물 23-3 (4.5 g, 조 생성물, TFA)를 황색 오일로서 수득하였다. 조 생성물은 다음 단계에서 추가의 정제 없이 사용하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 3.74 - 3.71 (m, 2H), 3.51 - 3.48 (m, 1H), 3.33 - 3.27 (m, 1H), 2.89 - 2.85 (m, 3H), 2.01 - 2.76 (m, 1H), 2.51 - 2.39 (m, 1H), 2.28 - 2.25 (m, 1H), 2.08 - 1.96 (m, 1H), 1.91 - 1.87 (m, 1H).
단계 5: tert-부틸 4-((4-옥소-4-(펜타데칸-8-일옥시)부틸)아미노)부타노에이트( 23-2 )
DMF(100 mL) 중의 1-헵틸옥틸-4-[(4-tert-부톡시-4-옥소-부틸)-(4-니트로페닐)설포닐-아미노]부타노에이트(15.6 g, 24.34 mmol, 1 당량)의 용액에　Cs2CO3(15.86 g, 48.68 mmol, 2 당량)　및 벤젠티올(6.18 g, 56.09 mmol, 5.72 mL, 2.30 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 16시간 동안 25℃에서 N2 하에 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 NaOH(150 mL, 1M)의 용액을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 EtOAc(150 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(60 mL*3)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켰다.　잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(40 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc:PE: 0~35%)로 정제하여 황색 오일로서 화합물 23-2(8.7 g, 19.09 mmol, 78.4% 수율)를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.90 - 4.84 (m, 1H), 2.64 - 2.61 (m, 4H), 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.25 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.80 - 1.76 (m, 4H), 1.53 - 1.48 (m, 4H), 1.45 (s, 9H), 1.30 - 1.26 (m, 20H), 0.90 - 0.86 (m, 6H).
단계 6: tert-부틸 4-((((1-메틸피페리딘-4-일)티오)카보닐)(4-옥소-4-(펜타데칸-8-일옥시)부틸)아미노)부타노에이트( 23-4 )
무수 CH2Cl2(30 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[(4-tert-부톡시-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(2 g, 4.39 mmol, 1 당량) 용액에 Et3N(1.33 g, 13.17 mmol, 1.8 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(781.41 mg, 2.63 mmol, 0.6 당량)을 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 20℃에서 교반하였다. 생성된 반응물을 감압 하에 농축시키고 N2 하에 유지시켰다. 무수 THF(40 mL)에 용해된 1-메틸피페리딘-4-티올(3.77 g, 15.36 mmol, 3.5 당량, TFA)의 용액에 NaOH(1.23 g, 30.72 mmol, 7 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(20 mL) 에 용해된 카바모일 클로라이드를 N2 대기 하에 0℃에서 서서히 주사기를 통해 첨가하였다. 생성된 용액을 15시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 0℃에서 NH4Cl(60 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(50 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(60 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(40 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc:PE: 0 ~ 25%)로 정제하여 화합물 23-4(1.5 g, 1.81 mmol, 42.7% 수율, 74% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+H] + : 613.3
단계 7: 4-((((1-메틸피페리딘-4-일)티오)카보닐)(4-옥소-4-(테트라데칸-7-일옥시)부틸)아미노)부탄산( 23-5 )
CH2Cl2(15 mL) 중의 1-헵틸옥틸 4-[(4-tert-부톡시-4-옥소-부틸)-[(1-메틸-4-피페리딜)설파닐카보닐]아미노]부타노에이트(1.5 g, 2.45 mmol, 1 당량) 용액에 TFA(7.70 g, 67.53 mmol, 5 mL)를 N2 하에 첨가하였다. 혼합물은 3시간 동안 25℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 감압 하에 농축하여 용매를 제거하여 화합물 23-5(1.6 g, 조 생성물, TFA)를 황색 오일로서 수득하였다. 조 생성물은 다음 단계에서 추가의 정제 없이 직접 사용하였다.
단계 8: (Z)-논-2-엔-1-일 4-((((1-메틸피페리딘-4-일)티오)카보닐)(4-옥소-4-(펜타데칸-8-일옥시)부틸)아미노)부타노에이트( CAT23 )
CH2Cl2(20 mL) 중의 4-[[4-(1-헵틸옥톡시-4-옥소-부틸]-[(1-메틸-4-피페리딜)설파닐카보닐]아미노]부탄산(1.4 g, 2.09 mmol, 1 당량, TFA) 용액에 EDCI(1.20 g, 6.26 mmol, 3 당량), HOBt(845.9 mg, 6.26 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(809.1 mg, 6.26 mmol, 1.1 mL, 3 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 상기 온도에서 0.5시간 동안 교반하고, 이어서 (Z)-논-2-엔-1-올(890.5 mg, 6.26 mmol, 3 당량)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 15.5시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 H2O(60 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(50 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(50 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(60 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다.　잔류물을 양성 prep-HPLC(컬럼: Welch Ultimate XB-CN 250*50*10 um; 이동상: [헥산-EtOH];B%: 0%-15%, 8 min)로 정제하여 화합물 CAT23(682 mg, 0.98 mmol, 47.7% 수율, 98% 순도)을 담황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+H] + : 682.3
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 5.66 - 5.61 (m, 1H), 5.55 - 5.50 (m, 1H), 4.88 - 4.85 (m, 1H), 4.63 (br d, J = 6.4 Hz, 2H), 3.45 - 3.32 (m, 5H), 2.78 -2.72 (m, 2H), 2.33 - 2.30 (m, 4H), 2.26 (s, 3H), 2.16 - 2.08 (m, 4H), 2.03 - 1.99 (m, 2H), 1.92 - 1.85 (m, 4H), 1.73 - 1.65 (m, 2H), 1.55 - 1.48 (m, 4H), 1.37 - 1.34 (m, 2H), 1.30 - 1.22 (m, 26H), 0.89 - 0.86 (m, 9H).
실시예 1.24: CAT24의 합성
단계 1: 1-(2-클로로에틸)피페리딘(2) (EC2098-19)
디클로로메탄(50.0 mL) 중의 2-(1-피페리딜)에탄올(5.00 g, 38.7 mmol, 5.14 mL, 1 당량)의 용액에 SOCl2(13.8 g, 116 mmol, 8.42 mL, 3.00 당량)를 적가 방식으로 0℃에서 서서히 첨가하였다. 이어서, 혼합물은 2시간 동안 40℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 백색 고체로서 화합물 24-2 (7.17 g, 조 생성물, HCl 염)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.0 (s, 1H), 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.42-3.40 (m, 4H), 2.95 -2.89 (m, 2H), 1.86 - 1.78 (m, 4H), 1.70 - 1.67 (m, 1H), 1.41-1.31 (m, 1H).
단계 2: 1-(2-(트리틸티오)에틸)피페리딘( 24-3 )
DMF(50.0 mL) 중의 1-(2-클로로에틸)피페리딘(5.00 g, 33.9 mmol, 1.00 당량), 트리페닐메탄티올(11.2 g, 40.6 mmol, 1.20 당량), 탄산칼륨(18.7 g, 135 mmol, 4.00 당량), 요오드화칼륨(562 mg, 3.39 mmol, 0.10 당량)를 탈기하고 N2로 3회 세정한 다음, 혼합물을 N2 대기 하에 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(100 mL)와 물(100 mL) 사이에서 분배시켰다. 유기상을 분리하고, 염수(60.0 mL × 3)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 80 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 100 mL/min에서 0 ~ 10% 에틸 아세테이트/석유 에테르 구배의 용출)로 정제하여 화합물 24-3(5.70 g, 13.7 mmol, 40.6% 수율, 93.4% 순도) 및 (2.20 g, 4.92 mmol, 14.5% 수율, 86.7% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS [M+1] + : 388.2
1H NMR (400 MHz, CDCl3-d) δ = 7.44 - 7.42 (m, 6H), 7.31 - 7.27 (m, 6H), 7.25 - 7.20 (m, 3H), 2.39 - 2.34 (m, 2H), 2.31 - 2.26 (m, 2H), 2.22 (s, 4H), 1.54 - 1.49 (m, 4H), 1.40 - 1.37 (m, 2H).
단계 3: 2-(피페리딘-1-일)에탄티올( 24-4 )
TFA(20.0 mL) 및 디클로로메탄(60.0 mL) 중의 1-(2-트리틸설파닐에틸)피페리딘(6.50 g, 16.8 mmol, 1.00 당량)와 디클로로메탄(60.0 mL)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 세정하고, 이어서 트리이소프로필실란(5.31 g, 33.5 mmol, 6.89 mL, 2 당량)을 0℃에서 서서히 첨가하고, 이어서 혼합물은 N2 대기 하에 3시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 TFA를 제거하고 여과하였다. 여과물을 메탄올(150 mL)로 희석시키고 석유 에테르(50.0 mL × 5)로 추출하였다. 메탄올 층은 감압 하에 농축시켜 화합물 24-4(4.30 g, 16.6 mmol, 98.9% 수율, TFA 염)를 담황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 3.45-3.42 (m, 2H), 3.19 - 3.12 (m, 2H), 2.89 - 2.80 (m, 5H), 1.80 - 1.77 (m, 2H), 1.66 - 1.63 (m, 3H), 1.38 - 1.35 (m, 1H).
단계 4: 2-(피페리딘-1-일)에탄티올( CAT24 )
무수 디클로로메탄(20.0 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(2.00 g, 3.28 mmol, 1.00 당량) 용액에 TEA(995 mg, 9.84 mmol, 1.37 mL, 3.00 당량) 및 트리포스겐(876 mg, 2.95 mmol, 0.90 당량)을 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물은 감압 하에 농축시켰다. 무수 THF(25.0 mL)에 용해된 2-(1-피페리딜)에탄티올(2.98 g, 11.5 mmol, 3.50 당량, TFA 염)에 NaOH(1.97 g, 49.2 mmol, 15.0 당량)를 0℃에서 질소 대기 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(20.0 mL)에 용해된 카바모일 클로라이드를 N2 하에 0℃에서 서서히 주사기를 통해 첨가하였다. 생성된 용액을 20℃에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 0℃에서 염화암모늄(20.0 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(60.0 mL)로 희석시켰다. 수성 상은 에틸 아세테이트(50.0 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(60.0 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 120 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 100 mL/min에서 0 ~ 50% 에틸 아세테이트/석유 에테르 구배의 용출)로 정제하여 화합물 CAT24(1.09 g, 1.38 mmol, 43.3% 수율, 99.2% 순도)를 담황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+1] + : 782.4
1H NMR (400 MHz, CDCl3-d) δ = 4.90 - 4.84 (m, 2H), 3.38 (s, 4H), 3.05 - 3.01 (m, 2H), 2.57 - 2.53 (m, 2H), 2.46 (s, 4H), 2.31 (s, 4H), 1.90 (s, 4H), 1.61 - 1.56 (m, 4H), 1.52 - 1.51 (m, 8H), 1.46 - 1.43 (m, 2H), 1.32 - 1.27 (m, 40H), 0.90 - 0.87 (m, 12H).
실시예 1.25: CAT25의 합성
단계 1: tert-부틸 4-(토실옥시)피페리딘-1-카복실레이트( 25-2 )
CH2Cl2(1000 mL) 중의 tert-부틸 4-하이드록시피페리딘-1-카복실레이트(50.0 g, 248 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(50.3 g, 497 mmol, 69.2 mL, 3 당량), DMAP(1.52 g, 12.4 mmol, 0.05 당량) 및 4-메틸벤젠설포닐 클로라이드(71.0 g, 373 mmol, 1.5 당량)를 N2 하에 0℃에서 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2(500 mL)로 희석시키고, 물(500 mL × 3) 및 염수(500 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 감압 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 생성물은 석유 에테르:에틸 아세테이트(10:1, 500 mL)를 사용하여 25℃에서 10분동안 연마하여 화합물 25-2(320 g, 900 mmol, 91% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.79 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.75 - 4.60 (m, 1H), 3.65 - 3.52 (m, 2H), 3.32 - 3.19 (m, 2H), 2.45 (s, 3H), 1.83 - 1.72 (m, 2H), 1.71 - 1.62 (m, 2H), 1.43 (s, 9H)
단계 2: tert-부틸 4-(트리틸티오)피페리딘-1-카복실레이트( 25-3 )
DMF(1600 mL) 중의 tert-부틸 4-(토실옥시)피페리딘-1-카복실레이트(160 g, 450 mmol, 1 당량), 트리페닐메탄티올(149 g, 540 mmol, 1.2 당량), NaI(3.37 g, 22.5 mmol, 0.05 당량), Cs2CO3(219 g, 675 mmol, 1.5 당량)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 세정한 다음, 혼합물을 N2 대기 하에 50℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 에틸 아세테이트(1000 mL × 3) 및 물(1000 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(1000 mL × 3)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 농축시켜 화합물 25-3(410 g, 조 생성물)을 수득하였다.
단계 3: 4-(트리틸티오)피페리딘( 25-4 )
CH2Cl2(1000 mL) 중의 tert-부틸-4-(트리틸티오)피페리딘-1-카복실레이트(100 g, 218 mmol, 1 당량) 용액에 TFA(308 g, 2.70 mol, 200 mL, 12.4 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 3시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응물을 세척하고 CH2Cl2(500 mL)로 4회 동안 농축시켰다. 잔류물을 25℃에서 1시간 동안 MTBE로 연마하여 화합물 25-4(75.0 g, 121 mmol, 48.2% 수율, 57.8% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 9.06 - 8.93 (m, 1H), 7.45 - 7.34 (m, 6H), 7.26 - 7.17 (m, 7H), 7.16 -7.09 (m, 2H), 3.05 (s, 2H), 2.63 (s, 2H), 2.51 - 2.39 (m, 1H), 2.38 - 2.28 (m, 1H), 1.71 - 1.61 (m, 1H), 1.49 - 1.33 (m, 2H).
단계 4: 1-프로필-4-(트리틸티오)피페리딘( 25-5 )
DMF(150 mL) 중의 4-(트리틸티오)피페리딘(15 g, 41.7 mmol, 1 당량) 및 1-브로모프로판(4.62 g, 37.6 mmol, 3.42 mL, 0.9 당량)의 용액에 K2CO3 (28.83g, 209 mmol, 5 당량) 및 KI(693 mg, 4.17 mmol, 0.1 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 10시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 25℃ 에서 300 mL을 첨가하여 켄칭시키고, 에틸 아세테이트(100 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 330 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 100 mL/min에서 0~30% 에틸 아세테이트/석유 에테르 구배의 용출)로 정제하였다. 잔류물을 MPLC0(컬럼 I.D.100 mM * H300 mm Welch Ultimate XB_C18 20-40 μm; 120 A; 유속 200 ml/min; 이동상 H2O + ACN; 구배 B% 10-45% 20 min; 45% 5 min)으로 정제하여 화합물 25-5(6.58 g, 12.5 mmol, 29.9% 수율, 98% 순도, TFA)를 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS [M+1] + : 402.3
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 12.69 - 11.85 (m, 1H), 7.60 - 7.35 (m, 6H), 7.27 - 7.18 (m, 6H), 7.16 - 7.03 (m, 3H), 3.41 - 3.13 (m, 2H), 2.88 - 2.60 (m, 4H), 2.24 - 1.82 (m, 3H), 1.77 - 1.53 (m, 2H), 1.42 - 1.14 (m, 2H), 0.94 - 0.74 (m, 3H).
단계 5: 1-프로필피페리딘-4-티올( 25-6 )
TFA(20.0 mL) 및 CH2Cl2(60.0 mL) 중의 1-프로필-4-(트리틸티오)피페리딘(6.50 g, 16.2 mmol, 1 당량) 용액에 트리이소프로필실란(5.13 g, 32.4 mmol, 6.65 mL, 2 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 3시간 동안 25℃에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 메탄올(10.0 mL) 중에 용해시키고 석유 에테르(10.0 mL × 5)로 추출하였다. 배합된 메탄올 층은 감압 하에 농축시켜 1-프로필피페리딘-4-티올(4.42 g, 조 생성물, TFA)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 3.50 - 3.13 (m, 3H), 3.10 - 2.83 (m, 5H), 2.20 - 2.03 (m, 2H), 1.86 - 1.55 (m, 4H), 0.95 - 0.85 (m, 3H).
단계 6: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((1-프로필피페리딘-4-일)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트( CAT25 ):
무수 CH2Cl2(40.0 mL) 중에 용해된 디(펜타데칸-8-일) 4,4’-아자네디일디부타노에이트(2.80 g, 4.59 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(1.39 g, 13.8 mmol, 1.92 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(1.24 g, 4.18 mmol, 0.91 당량)을 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 무수 THF(40.0 mL) 중의 1-프로필피페리딘-4-티올(4.39 g, 16.1 mmol, 3.50 당량, TFA) 용액에 0℃에서 질소 대기 하에 NaOH(1.84 g, 45.9 mmol, 10.0 당량)를 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(10.0 mL) 에 용해된 카바모일 클로라이드를 N2 대기 하에 0℃에서 서서히 주사기를 통해 첨가하였다. 생성된 용액을 20℃에서 11시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 0℃에서 NH4Cl(50.0 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(50.0 mL)로 희석시켰다. 수성 상은 에틸 아세테이트(50.0 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(30.0 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 220 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 100 mL/min에서 0 ~ 35% 에틸 아세테이트/석유 에테르 구배의 용출)로 정제하여 CAT25(0.85 g, 1.06 mmol, 23.1% 수율, 99.1% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+1] + : 796.4
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.90 - 4.80 (m, 2H), 3.37 (s, 5H), 2.83 (d, J = 9.2, 2H), 2.40 - 2.23 (m, 6H), 2.21 - 2.08 (m, 2H), 2.06 - 1.97 (m, 2H), 1.90 (s, 4H), 1.76 - 1.67 (m, 2H), 1.52 (s, 10H), 1.27 (s, 40H), 0.98 - 0.76 (m, 15H).
실시예 1.26: CAT26의 합성
단계 1: tert-부틸 2-(2-하이드록시에틸)피롤리딘-1-카복실레이트( 26-2 )
THF(600 mL) 중의 2-(1-tert-부톡시카보닐피롤리딘-2-일)아세트산(50.0 g, 218 mmol, 1.00 당량)의 용액에 BH3-Me2S(10.0 M, 32.7 mL, 1.50 당량)를 질소 대기 하에 30분에 걸쳐 주사기를 통해 0℃에서 적가한 다음, 혼합물을 질소 대기 하에 20℃에서 9.5시간 동안 교반하였다. 반응물을 메탄올(100 mL)에 의해 켄칭시키고 농축시킴에 이어서 잔류물을 에틸 아세테이트(300 mL) 및 H2O(350 mL)로 희석시키고, 에틸 아세테이트(200 mL × 3)로 추출하고, 염수(500 mL)에 의해 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 차아염소산나트륨 용액으로 수성상을 켄칭시키고 폐기하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 50/1 내지 3/1)로 정제하여 화합물 2(30.0 g, 132 mmol, 60.7% 수율, 95.0% 순도)를 무색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+23] + : 238.1
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ = 4.37 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 3.73 (s, 1H), 3.42 - 3.38 (m, 2H), 3.23 - 3.19 (m, 2H), 1.83 - 1.66 (m, 6H), 1.39 (s, 9H).
단계 2: tert-부틸 2-[2-(p-톨릴설포닐옥시)에틸]피롤리딘-1-카복실레이트( 26-3 )
디클로로메탄(450 mL) 중 tert-부틸 2-(2-하이드록시에틸)피롤리딘-1-카복실레이트(27.0 g, 125 mmol, 1.00 당량), TEA(25.4g, 251 mmol, 34.9 mL, 2.00 당량) 및 DMAP(766 mg, 6.27 mmol, 0.05 당량)의 혼합물을 탈기하고, N2로 3회 퍼징하고 이어서 TosCl(35.9 g, 188 mmol, 1.50 당량)을 0℃에서 서서히 첨가하고 혼합물을 25℃에서 N2 대기 하에 3시간 동안 교반하였다. 잔류물을 디클로로메탄(200 mL)으로 희석하고, 합배한 유기층을 H2O(450 mL) 및 염수(450 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 50/1 내지 3/1)로 정제하여 화합물 26-3(23.2 g, 49.5 mmol, 39.5% 수율, 78.9% 순도)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M-100+1] + : 270.1
1H NMR (400 MHz, MeOD-d 4) δ = 7.80 (d, J = 2.0 Hz, 1H) 7.81 - 7.79 (m, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 4.09 - 4.03 (m, 2H), 3.79 - 3.77 (m, 1H), 3.49-3.43 (m, 2H), 2.37 (s, 3H), 2.00 - 1.95 (m, 2H), 1.66 - 1.49 (m, 4H), 1.42 (s, 9H).
단계 3: tert-부틸 2-(2-트리틸설파닐에틸)피롤리딘-1-카복실레이트( 26-4 )
DMF(200 mL) 중의 tert-부틸 2-[2-(p-톨릴설포닐옥시)에틸]피롤리딘-1-카복실레이트(23.0 g, 62.3 mmol, 1 당량), 트리페닐메탄티올(20.7 g, 74.7 mmol, 1.2 당량), Cs2CO3(30.4 g, 93.4 mmol, 1.5 당량), NaI(933 mg, 6.23 mmol, 0.10 당량)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 세정한 다음, 혼합물을 N2 대기 하에 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(1500 mL)와 H2O (1000 mL) 사이에서 분배시켰다. 유기상을 분리하고, 염수(300 mL × 2)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 5/1)로 정제하여 화합물 26-4(20.6 g, 39.3 mmol, 63.2% 수율, 90.6% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3-d) δ = 7.46 - 7.41 (m, 6H), 7.33 - 7.27 (m, 6H), 7.25 - 7.20 (m, 3H), 3.68 (s, 1H), 3.31 (s, 1H), 3.20 (s, 1H), 2.15 (s, 2H), 1.76 - 1.65 (m, 4H), 1.43 (s, 9H), 1.39 - 1.34 (m, 2H)
단계 4: 2-(2-트리틸설파닐에틸)피롤리딘( 26-5 )
디클로로메탄(200 mL) 중의 tert-부틸-2-(2-트리틸설파닐에틸)피롤리딘-1-카복실레이트(20.6 g, 43.4 mmol, 1 당량) 용액에 TFA(61.6 g, 540 mmol, 40.0 mL, 12.5 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 10시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 디클로로메탄 및 TFA를 제거하였다. 잔류물을 prep-MPLC(MeCN:H2O: 0~45%)로 정제하여 화합물 26-5(16.2 g, 32.2 mmol, 74.3% 수율, 97.0% 순도, TFA 염)를 황색 고체로서 수득하였다.
LCMS [M+1] + : 374.1
1H NMR (400 MHz, CDCl3-d) δ = 7.32 - 7.30 (m, 6H), 7.21 - 7.17 (m, 6H), 7.14 - 7.13 (m, 3H), 3.31 (s, 1H), 3.11 (s, 2H), 2.20 - 2.12 (m, 2H), 1.84 - 1.79 (m, 3H), 1.50 - 1.43 (m, 1H), 1.33 - 1.31 (m, 1H), 1.20 - 1.16 (m, 1H).
단계 5: 1-이소프로필-2-(2-트리틸설파닐에틸)피롤리딘( 26-6 )
MeCN(80.0 mL) 중의 2-(2-트리틸설파닐에틸)피롤리딘(8.00 g, 16.4 mmol, 1.00 당량, TFA) 및 2-요오도프로판(3.07 g, 18.1 mmol, 1.80 mL, 1.10 당량) 용액에 K2CO3(6.80 g, 49.2 mmol, 3.00 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 10시간 동안 70℃에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®;220 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 100 mL/min에서 0 ~ 10% 메탄올/디클로로메탄 구배)로 정제하여 화합물 26-6(4.60 g, 11.1 mmol, 67.7% 수율)을 갈적색 고체로서 수득하였다.
LCMS [M+1] + : 416.5
1H NMR (400 MHz, CDCl3-d) δ = 7.40 - 7.37 (m, 6H), 7.27 - 7.22 (m, 6H), 7.20 - 7.16 (m, 3H), 3.01 - 2.92 (m, 2H), 2.79 - 2.75 (m, 1H), 2.53 - 2.47 (m, 1H), 2.29 - 2.23 (m, 1H), 2.12 - 2.05 (m, 1H), 1.75 - 1.61 (m, 4H), 1.56 - 1.49 (m, 1H), 1.38 - 1.30 (m, 1H), 1.14 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.97 (d, J = 6.4 Hz, 3H)
단계 6: 2-(1-이소프로필피롤리딘-2-일)에탄티올( 26-9 )
TFA(14.0 mL) 및 디클로로메탄(42.0 mL) 중의 1-이소프로필-2-(2-트리틸설파닐에틸)피롤리딘(4.10 g, 9.86 mmol, 1.00 당량)과 디클로로메탄(42.0 mL)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 세정하고, 이어서 트리이소프로필실란(3.12 g, 19.7 mmol, 4.05 mL, 2 당량)을 0℃에서 서서히 첨가하고, 이어서 혼합물은 N2 대기 하에 3시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 TFA를 제거하고 여과하였다. 여과물을 메탄올(70.0 mL)로 희석시키고 석유 에테르(50.0 mL × 5)로 추출하였다. 메탄올 층은 감압 하에 농축시켜 화합물 26-9(2.69 g, 조 생성물, TFA)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3-d) δ = 3.76 - 3.69 (m, 3H), 3.09 - 3.00 (m, 1H), 2.92 - 2.84 (m, 1H), 2.46 - 2.41 (m, 1H), 2.27 - 2.12 (m, 5H), 2.04 - 1.88 (m, 2H), 1.47 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.36 (d, J = 6.8 Hz, 3H)
단계 7: 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]-[2-(1-이소프로필피롤리딘-2-일)에틸설파닐카보닐]아미노]부타노에이트(ONC-SM-027-NX-1) (EC1092-33/34)
무수 디클로로메탄(20.0 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(1.90 g, 3.11 mmol, 1.00 당량) 용액에 TEA(946 mg, 9.34 mmol, 1.30 mL, 3.00 당량) 및 트리포스겐(760 mg, 2.56 mmol, 0.82 당량)을 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물은 감압 하에 농축시켰다. 무수 THF(25.0 mL)에 용해된 2-(1-이소프로필피롤리딘-2-일)에탄티올(2.68 g, 9.34 mmol, 3.00 당량, TFA)에 NaOH(1.87 g, 46.7 mmol, 15.0 당량)를 0℃에서 질소 대기 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(20.0 mL) 에 용해된 카바모일 클로라이드를 N2 하에 0℃에서 서서히 주사기를 통해 첨가하였다. 생성된 용액을 20℃에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 0℃에서 NH4Cl(50.0 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(60.0 mL)로 희석시켰다. 수성 상은 에틸 아세테이트(60.0 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(50.0 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 120 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 100 mL/min에서 0 ~ 50% 에틸 아세테이트/석유 에테르 구배의 용출)로 정제하여 화합물 CAT26(610 mg, 0.742 mmol, 21.3% 수율, 98.4% 순도)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+1] + : 810.6
1H NMR (400 MHz, CDCl3-d) δ = 4.90 - 4.84 (m, 2H), 3.38 (s, 4H), 2.99 - 2.92 (m, 2H), 2.90 - 2.80 (m, 2H), 2.79 - 2.75 (m, 1H), 2.52 - 2.46 (m, 1H), 2.31 (s, 4H), 1.89 (d, J = 4.8 Hz, 6H), 1.79 - 1.67 (m, 4H), 1.52 (d, J = 5.2 Hz, 8H), 1.27 (s, 40H), 1.12 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.97 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H).
실시예 1.27: CAT27의 합성
단계 1: 1-(부트-3-엔-1-일)-4-(트리틸티오)피페리딘(27-2)
DMF(120 mL) 중의 4-트리틸설파닐피페리딘(20 g, 42.23 mmol, 1 당량, TFA)의 용액에　K2CO3(17.51 g, 126.70 mmol, 3 당량)　및 4-브로모부트-1-엔(5.13 g, 38.01 mmol, 3.86 mL, 0.9 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 16시간 동안 25℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 H2O(150 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(100 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(150 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(100 mL * 3)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(80 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc:PE: 0~20%, EtOAc 중 1% NH3·H2O) 및 역위　MPLC(MeCN:H2O: 0~45%)로 정제하여 화합물 27-2(9.6 g, 22.51 mmol, 65.6% 수율, 97% 순도)를 황색 고체로서 수득하였다.
LCMS [M+H] + : 414.6
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 12.27 - 12.21 (m, 1H), 7.42 - 7.36 (m, 6H), 7.23 - 7.18 (m, 6H), 7.16 - 7.10 (m, 3H), 5.64 - 5.55 (m, 1H), 5.09 - 5.00 (m, 2H), 3.40 - 3.25 (m, 3H), 2.87 - 2.79 (m, 4H), 2.42 - 2.36 (m, 2H), 2.21 - 2.16 (m, 1H), 2.07 - 1.99 (m, 2H), 1.25 - 1.18 (m, 1H).
단계 2: 1-(부트-3-엔-1-일)피페리딘-4-티올( 27-3 )
CH2Cl2(80 mL) 중의 1-부트-3-에닐-4-트리틸설파닐-피페리딘(9.5 g, 22.97 mmol, 1 당량) 용액에 TFA(36.58 g, 320.78 mmol, 23.8 mL, 13.97 당량) 및 TIPS(9.00 g, 45.94 mmol, 2 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 첨가 후, 생성된 혼합물을 4시간 동안 20℃에서 교반하였다.　완료 후, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 TFA를 제거하고 여과하였다. 여과물을 MeOH(150 mL)로 희석시키고 PE(50 mL * 5)로 추출하였다. MeOH 층은 감압 하에 농축시켜 화합물 27-3(6.4 g, 조 생성물, TFA)을 황색 오일로서 수득하였다. 조 생성물은 다음 단계에서 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 6: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((1-(부트-3-엔-1-일)피페리딘-4-일)티오)카보닐)디부타노에이트( CAT27 ):
무수 CH2Cl2(50 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(4.5 g, 7.38 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(2.24 g, 22.13 mmol, 3.1 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(1.31 g, 4.43 mmol, 0.6 당량)을 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 20℃에서 교반하였다. 생성된 반응물은 감압 하에 농축시켰다. 무수 THF(35 mL)에 용해된 1-부트-3-에닐피페리딘-4-티올(6.31 g, 22.13 mmol, 3 당량, TFA)의 용액에 NaOH(2.07 g, 51.64 mmol, 7 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(30 mL) 에 용해된 카바모일 클로라이드를 N2 대기 하에 0℃에서 서서히 주사기를 통해 첨가하였다. 생성된 용액을 15시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 0℃에서 NH4Cl(100 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(100 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(100 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(120 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다.　　잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(40 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc:PE: 0-40%) 및 양성 prep-HPLC(컬럼: Welch Ultimate XB-CN 250*50*10 um; 이동상: [Neu-EtOH];B%: 0%-10%, 8 min)로 정제하여 CAT27(488 mg, 0.59 mmol, 59.9% 수율, 98.2% 순도)을 담황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+H] + : 808.3
1H NMR (400 MHz, CD3OD-d 4) δ = 5.86 - 5.79 (m, 1H), 5.13 - 5.01(m, 2H), 4.93 - 4.89 (m, 2H), 3.48 - 3.38 (m, 5H), 2.89 -2.86 (m, 2H), 2.48 - 2.43 (m, 2H), 2.35 - 2.23 (m, 8H), 2.08 - 2.03 (m, 2H), 1.93 - 1.88 (m, 4H), 1.76 - 1.67 (m, 2H), 1.61 - 1.56 (m, 8H), 1.35 - 1.25 (m, 40H), 0.94 - 0.90 (m, 12H).
실시예 1.28: CAT28의 합성
단계 1: 4-((비스(4-옥소-4-(펜타데칸-8-일옥시)부틸)카바모일)티오)-1-(3-하이드록시프로필)피페리딘 1-옥사이드( 28-2 )
CH2Cl2(20 mL) 및 MeOH(10 mL) 중의 1-헵틸옥틸 4-[(1-부트-3-에닐-4-피페리딜)설파닐카보닐-[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트 용액(1.2 g, 1.49 mmol, 1 당량)를 -78℃로 냉각하고 오존 스트림(71.35 mg, 1.49 mmol, 1 당량)(15 psi)을 담청색이 분명해질 때까지 반응 혼합물에 버블링하였다.　이어서, 청색이 사라질 때까지 반응 혼합물을 통해 O2를 버블링시킨 후 NaBH4(112.47 mg, 2.97 mmol, 2 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물로 화합물 28-2(1.23g, 조 생성물)를 황색 액체로서 수득하였다. 반응 혼합물은 다음 단계에서 추가의 정제 없이 직접 사용하였다.　　
단계 2: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((1-(3-하이드록시프로필)피페리딘-4-일)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트( CAT28 ):
CH2Cl2(10 mL) 중의 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]-[1-(3-하이드록시프로필)-1-옥시도-1-이움-4-일]설파닐카보닐-아미노]부타노에이트(1.23 g, 1.49 mmol, 1 당량) 용액에 BPD(755.11 mg, 2.97 mmol, 2 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 1시간 동안 25℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 H2O(60 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(50 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(50 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(60 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다.　　잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(40 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 에틸 아세테이트:석유 에테르: 0~20%)　및 양성 prep-HPLC(컬럼: Welch Ultimate XB-CN 250 * 50 * 10 um; 이동상:[헥산-EtOH]; B%: 0%-30%, 10 min)으로 정제하여 CAT28(248 mg, 296.82 umol, 20.07% 수율, 97.1% 순도)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+H] + : 811.6
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.90 - 4.84 m, 2H), 3.80 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.38 - 3.34 (m, 5H), 2.95 - 2.90 (m, 2H), 2.60 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.33 - 2.27 (m, 4H), 2.23 - 2.16 (m, 2H), 2.08 - 2.01 (m, 2H), 1.93 - 1.85 (m, 4H), 1.74 - 1.62 (m, 4H), 1.55 - 1.48 (br s, 8H), 1.33 - 1.25 (m, 40H), 0.91 - 0.86 (m, 12H).
실시예 1.29: CAT29의 합성
단계 1: 운데카-1,10-디엔-6-올( 29-2 )
무수 THF(1500 mL) 중의 I2(3.43 g, 13.50 mmol, 2.72 mL, 0.02 당량) 및 Mg(41.83 g, 1.72 mmol, 2.55 당량)의 현탁액을 질소 대기 하에 제조하였다. 상기 혼합물에,　5-브로모펜트-1-엔(251.47 g, 1.69 mol, 2.5 당량)을 25℃에서 서서히 첨가하였다. 첨가하는 동안, 반응 혼합물의 온도가 증가하여 그리냐드 형성이 개시되었음을 확인하였다. 브롬화물 첨가가 완료되면 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반한 후 에틸 포르메이트(50 g, 674.96 mmol, 54.29 mL, 1 당량)를 천천히 첨가하기 위해 0℃로 냉각하였다. 첨가 후, 냉욕조를 제거하고 혼합물을 25℃에서 15 시간 동안 교반하였다. 반응물을 포화 용액 NH4Cl(1000 mL)을 첨가함에 의한 켄칭을 위해 0℃로 냉각시키고 30분동안 교반하였다. 수성상을 EtOAc(1000 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(400 × 2 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물은 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 30/1 내지 5/1)로 정제하여 화합물 29-2(105 g, 623.98 mmol, 92.45% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 5.82-5.76 (m, 2H), 5.01-4.92 (m, 4H), 3.58 - 3.57 (m, 1H), 2.06-2.02 (m, 4H), 1.53-1.50 (m, 1H), 1.48-1.41 (m, 8H).
단계 2: 2-(1-펜트-4-에닐헥스-5-에닐)이소인돌린-1,3-디온( 29-3 )
THF(800 mL) 중의 운데카-1,10-디엔-6-올(66 g, 392.21 mmol, 1 당량) 및 이소인돌린-1,3-디온(69.25 g, 470.66 mmol, 1.2 당량)의 용액에 PPh3(154.31 g, 588.32 mmol, 1.5 당량)을 첨가함에 이어서 DIAD(237.93 g, 1.18 mol, 228.78 mL, 3 당량)를 0℃에서 적가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응물을 포화 용액 NH4Cl(1000 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 수성상을 EtOAc(1000 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(500 × 2 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물은 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 30/1 내지 5/1)로 정제하여 화합물 29-3 (100 g, 336.26 mmol, 85.73% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.84-7.82 (m, 2H), 7.73-7.71 (m, 2H), 5.78-5.71 (m, 2H), 5.31-5.23 (m, 4H), 4.24-4.14 (m, 1H), 2.15-2.05 (m, 4H), 1.76-1.70 (m, 2H), 1.33-1.28 (m, 6H).
단계 3: 운데카-1,10-디엔-6-아민( 29-4 )
EtOH(1000 mL) 중의 2-(1-펜트-4-에닐헥스-5-에닐)이소인돌린-1,3-디온(250 g, 840.65 mmol, 1 당량) 용액에 N2H4ㆍH2O(85.88 g, 1.68 mol, 83.38 mL, 98% 순도, 2 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 2시간 동안 95℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 3회 여과하고, 여과물을 농축하였다. 조 생성물을 EtOAc(500 mL)에 용해시키고 유기상을 물(500 mL × 3)로 세척하고 Na2SO4 상에서 건조시키고 여과하고 진공에서 농축하여 화합물 29-4(130 g, 777.09 mmol, 92.44% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 5.83-5.76 (m, 2H), 5.01-4.92 (m, 4H), 2.71-2.68 (m, 1H), 2.05-2.02 (m, 4H), 1.45-1.27 (m, 8H).
단계 4: 4-니트로-N-(1-펜트-4-에닐헥스-5-에닐)벤젠설폰아미드( 29-5 )
CH2Cl2(500 mL) 중의 운데카-1,10-디엔-6-아민(60 g, 358.66 mmol, 1 당량) 및 4-니트로벤젠설포닐 클로라이드(87.43 g, 394.52 mmol, 1.1 당량)의 용액에 TEA(72.58 g, 717.32 mmol, 99.84mL, 2 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물(500 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 CH2Cl2(1000 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(500 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 20/1 내지 3/1)로 정제하여 화합물 29-5(60 g, 170.24 mmol, 47.47% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.37 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.08 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.71-5.62 (m, 2H), 4.93-4.89 (m, 4H), 3.35-3.30 (m, 1H), 1.97-1.91 (m, 4H), 1.33-1.25 (m, 8H).
단계 5: 5-[(4-니트로페닐)설포닐아미노]노난디오산( 29-6 )
먼저, CH2Cl2(200 mL) 및 MeOH(200 mL) 중의 4-니트로-N-(1-펜트-4-에닐헥스-5-에닐)벤젠설폰아미드(20 g, 56.75 mmol, 1 당량)의 용액을 -70℃로 냉각시키고, 오존(136.19 mg, 2.84 mmol)을 담청색이 명백해질 때까지 반응 혼합물에 버블링하였다. 이어서, 청색이 사라질 때까지 반응 혼합물을 통해 N2를 버블링시켰다. 이어서, PPh3(44.65 g, 170.24 mmol, 3 당량)을 첨가하고 반응물을 12시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 20/1 내지 1/1)로 정제하여 화합물 4-니트로-N-[5-옥소-1-(4-옥소부틸)펜틸]벤젠설폰아미드(12.6 g, 35.35 mmol, 62.30% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
두번째로, ACN(150 mL) 중의 4-니트로-N-[5-옥소-1-(4-옥소부틸)펜틸]벤젠설폰아미드(12 g, 33.67 mmol, 1 당량)의 용액에 벤젠-1,3-디올(18.54 g, 168.35 mmol, 28.09 mL, 5 당량) 및 나트륨; 인산이수소(1 M, 101.01 mL, 3 당량), 이어서 물(150 mL) 중 아염소산나트륨(1 M, 168.35 mL, 5 당량)을 0℃에서 적가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 수성 HCl(4 M)을 사용하여 pH =　2~3으로 중화시켰다. 수성상을 EtOAc(500 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 포화 수성 Na2SO3(200 mL × 3) 및 염수(100 mL × 2)로 연속적으로 세척하고 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 20/1 내지 0/1)로 정제하여 화합물 29-6(5.8 g, 14.93 mmol, 44.35% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ = 11.94 (s, 2H), 8.39 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.04 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.95 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.15 - 3.14 (m, 1H), 2.03 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 1.33-1.23 (m, 8H).
단계 6: 비스(1-헵틸옥틸) 5-[(4-니트로페닐)설포닐아미노]노난디오에이트( 29-7 )
먼저, CH2Cl2(20 mL) 중의 5-[(4-니트로페닐)설포닐아미노]노난디오산(2 g, 5.15 mmol, 1 당량)의 용액에 옥살릴 디클로라이드(1.96 g, 15.45 mmol, 1.35 mL, 3 당량) 및 DMF(3.76 mg, 51.49 umol, 3.96 uL, 0.01 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 2시간 동안 0℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 화합물 5-[(4-니트로페닐)설포닐아미노]노난디올 디클로라이드(2 g, 4.70 mmol, 91.33% 수율)을 황색 고체로서 수득하였다. 둘째로, CH2Cl2(30 mL) 중의 펜타데칸-8-올(2.15 g, 9.41 mmol, 2 당량)의 용액에 5-[(4-니트로페닐)설포닐아미노]노난디오일 디클로라이드(2 g, 4.70 mmol, 1 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 20/1 내지 1/1)로 정제하여 화합물 29-7(2.5 g, 3.09 mmol, 65.70% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.36 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.08 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.87-4.82 (m, 2H), 3.31 - 3.30 (m, 1H), 2.21 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 1.50-1.41 (m, 16H), 1.32-1.26 (m, 40H), 0.90-0.87(m, 12H).
단계 7: 비스(1-헵틸옥틸) 5-[(4-니트로페닐)설포닐-프로필-아미노]노난디오에이트( 29-8 )
DMF(80 mL) 중의 비스(1-헵틸옥틸) 5-[(4-니트로페닐)설포닐아미노]노난디오에이트(5 g, 6.18 mmol, 1 당량) 및 1-요오도프로판(3.15 g, 18.54 mmol, 1.81 mL, 3 당량)의 용액에 Cs2CO3(6.04 g, 18.54 mmol, 3 당량), KI(512.86 mg, 3.09 mmol, 0.5 당량) 및 TBAI(1.14 g, 3.09 mmol, 0.5 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 120℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 물(200 mL)로 켄칭시키고 이어서 EtOAc(200 mL)로 희석하였다. 수성상을 EtOAc(200 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(300 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트=40/1 내지 5/1)로 정제하여 화합물 29-8(5 g, 5.87 mmol, 95.06% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+Na]+: 873.6;
단계 8: 비스(1-헵틸옥틸) 5-(프로필아미노)노난디오에이트( 29-9 )
DMF(100 mL) 중의 비스(1-헵틸옥틸) 5-[(4-니트로페닐)설포닐-프로필-아미노]노난디오에이트(5 g, 5.87 mmol, 1 당량)의 용액에　Cs2CO3(3.83 g, 11.74 mmol, 2 당량)에 이어서 벤젠티올(1.86 g, 16.88 mmol, 1.72 mL, 2.88 당량)을 적가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 N2 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 물(400 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 EtOAc(500 mL × 2)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(300 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트= 10/1 내지 0/1)로 정제하여 화합물 29-9(1.7 g, 2.55 mmol, 43.48% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.91-4.84 (m, 2H), 2.56-2.54 (m, 2H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.66-1.51 (m, 4H), 1.48-1.46 (m, 16H), 1.30-1.26 (m, 40H), 0.94-0.87 (m, 15H).
단계 9: 비스(1-헵틸옥틸) 5-[2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸설파닐카보닐-프로필-아미노]노난디오에이트( CAT29 )
무수 CH2Cl2(20 mL) 중의 비스(1-헵틸옥틸) 5-(프로필아미노)노난디오에이트(1.5 g, 2.25 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(683.60 mg, 6.76 mmol, 940.30 uL, 3 당량) 및 비스(트리클로로메틸)카보네이트(334.12 mg, 1.13 mmol, 0.5 당량)을 0℃에서 N2 대기 하에 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 20℃에서 교반하였다. 반응물을 감압 하에 농축시키고 N2 대기 하에 유지하였다. NaOH(630.48 mg, 15.76 mmol, 7 당량)를 무수 THF(50 mL)에 0℃에서 용해시키고, 이어서 2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에탄티올(1.64 g, 11.26 mmol, 5 당량)을 N2 대기 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(50 mL) 중의 카바모일 클로라이드를 0℃에서 서서히 첨가하였다. 혼합물은 2시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 NH4C1 (100 mL)로 켄칭시키고 이어서 EtOAc(100 mL)로 희석하였다. 수성상을 EtOAc(100 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 1/2)로 정제하여 화합물 CAT29(530 mg, 630.40 umol, 35.19% 수율, 99.6% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 838.3;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.88-4.83 (m, 2H), 4.25-3.81 (m, 1H), 3.11-2.86 (m, 5H), 2.33-2.30 (m, 6H), 2.10-1.97 (m, 4H), 1.58-1.50 (m, 23H), 1.32-1.22 (m, 40 H), 0.90-0.87 (m, 15H).
실시예 1.30: CAT30의 합성
단계 1: 1-(사이클로프로필메틸)-4-(트리틸티오)피페리딘( 30-2 )
MeOH(50 mL) 중의 4-트리티설파닐피페리딘(15 g, 31.68 mmol, 1 당량, TFA), 사이클로프로판카브알데하이드(16.65 g, 95.03 mmol, 17.8 mL, 40% 순도, 3 당량), HOAc(3.80 g, 63.35 mmol, 3.6 mL, 2 당량), KOAc(6.22 g, 63.35 mmol, 2 당량)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 세정한 다음, 혼합물을 N2 대기 하에 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, NaBH(OAc)3(13.43 g, 63.35 mmol, 2 당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 14시간 동안 20℃에서 교반하였다.　완료 후 빙수(50 mL)을 첨가하고 혼합물을 포화 NaHCO3 용액을 사용하여 pH가 8~9로 중화시켰다. 수성상을 EtOAc(150 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 조 생성물을 수득하였다.　잔류물을 역위 MPLC(MeCN:H2O: 0~45%)로 정제하여 화합물 29-2(7.2 g, 15.67 mmol, 50.1% 수율, 90% 순도)를 황색 고체로서 수득하였다.
LCMS [M+H] + : 414.5
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.56 - 7.39 (m, 6H), 7.38 - 7.30 (m, 9H), 3.65 - 3.48 (m, 2H), 3.02 - 2.79 (m, 4H), 2.47 - 2.31 (m, 3H), 2.28 - 2.17 (m, 2H), 1.43 - 1.37 (m, 1H), 1.25 - 1.01 (m, 1H), 0.83 - 0.76 (m, 2H), 0.45 - 0.35 (m, 2H).
단계 2: 1-(사이클로프로필메틸)피페리딘-4-티올( 29-3 )
DCM(80 mL) 중의 1-(사이클로프로필메틸)-4-트리틸설파닐-피페리딘(6 g, 14.51 mmol, 1 당량) 용액에 TFA(30.80 g, 270.13 mmol, 20 mL, 18.62 당량) 및 TIPS(5.69 g, 29.01 mmol, 2 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 첨가 후, 생성된 혼합물을 4시간 동안 20℃에서 교반하였다.　완료 후, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 TFA를 제거하고 여과하였다. 여과물을 MeOH(150 mL)로 희석시키고 PE(50 mL * 5)로 추출하였다. MeOH 층은 감압 하에 농축시켜 화합물 30-3(4.1 g, 조 생성물, TFA)을 황색 오일로서 수득하였다. 조 생성물은 다음 단계에서 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 3: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((1-(사이클로프로필메틸)피페리딘-4-일)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트( CAT30 ):
무수 CH2Cl2(30 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(1.8 g, 2.95 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(895.78 mg, 8.85 mmol, 1.23 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(525.39 mg, 1.77 mmol, 0.6 당량)을 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 20℃에서 교반하였다. 생성된 반응물은 감압 하에 농축시켰다. 무수 THF(25 mL)에 용해된 1-(사이클로프로필메틸)피페리딘-4-티올(2.53 g, 8.85 mmol, 3 당량, TFA)의 용액에 NaOH(826.22 mg, 20.66 mmol, 7 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(20 mL) 에 용해된 카바모일 클로라이드를 N2 대기 하에 0℃에서 서서히 주사기를 통해 첨가하였다. 생성된 용액을 15시간 동안 20℃에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물은 0℃에서 NH4Cl(80 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(50 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(60 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다.　　잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(20 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, EtOAc:PE: 0~20%)　및 양성 prep-HPLC(컬럼: Welch Ultimate XB-SiOH 250 * 50 * 10 um; 이동상:[헥산-EtOH]; B%: 0%-20%, 10 min)으로 정제하여 CAT30(235 mg, 0.28 mmol, 44.3% 수율, 98% 순도)을 담황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+H] + : 808.4
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.89 - 4.85 (m, 2H), 3.48 - 3.31 (m, 5H), 2.97 - 2.93 (m, 2H), 2.33 - 2.28 (m, 4H), 2.25 - 2.18 (m, 4H), 2.08 - 2.01 (m, 2H), 1.91 - 1.87 (m, 4H), 1.77 - 1.68 (m, 3H), 1.55 - 1.18 (m, 8H), 1.32 - 1.26 (m, 40H), 0.91 - 0.86 (m, 12H), 0.53 - 0.50 (m, 2H), 0.11 - 0.08 (m, 2H).
실시예 1.31: CAT31의 합성
단계 1: 4-클로로-1-(피롤리딘-1-일)부탄-1-온 ( 31-3 )
THF(120 mL)에 중의 피롤리딘(5.00 g, 70.3 mmol, 5.87 mL, 1.00 당량) 용액에 TEA(14.2 g, 141 mmol, 19.6 mL, 2.00 당량)를 첨가한 다음, 4-클로로부타노일 클로라이드(11.9 g, 84.4 mmol, 9.44 mL, 1.20 당량)을 서서히 첨가하였다. 혼합물은 5시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물(100 mL)을 25℃에서 첨가함에 의해 켄칭시키고, 이어서 EtOAc(100 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(100 mL × 2)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/EtOAc = 1/0 내지 3/1)에 의해 정제하였다. 화합물 31-3(5.60 g, 28.3 mmol, 40.2% 수율, 88.8% 순도)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+1] + : 175.9.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 3.64 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.46 -3.40 (m, 4H), 2.43 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.115 -2.09 (m, 2H), 1.98 - 1.91 (m, 2H), 1.88 - 1.81 (m, 2H).
단계 2: 1-(피롤리딘-1-일)-4-(트리틸티오)부탄-1-온 ( 31-4 )
DMF(50 mL) 중의 4-클로로-1-피롤리딘-1-일-부탄-1-온(5.00 g, 28.5 mmol, 1.00 당량), 트리페닐메탄티올(9.44 g, 34.2 mmol, 1.20 당량), K2CO3(15.7 g, 114 mmol, 4.00 당량), KI(473 mg, 2.85 mmol, 0.10 당량)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 세정한 다음, 혼합물을 N2 대기 하에 50℃에서 10시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc(100 mL)와 H2O(100 mL) 사이에서 분배시켰다. 유기상을 분리하고, 염수(60 mL × 3)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 80 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 100 mL/min에서 0~10% EtOAc/석유 에테르 구배)로 정제하였다. 화합물 31-4(9.32 g, 17.7 mmol, 62.2% 수율, 79.0% 순도)를 백색 오일로서 수득하였다.
LCMS [2M+1] + : 831.4.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.37 - 7.32 (m, 6H), 7.23 - 7.18 (m, 6H), 7.16 - 7.11 (m, 3H), 3.33 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.25 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.18 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.13 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.87 - 1.81 (m, 2H), 1.78 - 1.73 (m, 2H), 1.67 (t, J = 7.6 Hz, 2H).
단계 3: 1-(4-(트리틸티오)부틸)피롤리딘( 31-5 )
THF(120 mL) 중의 1-피롤리딘-1-일-4-트리틸설파닐-부탄-1-온(9.00 g, 21.7 mmol, 1.00 당량)의 용액에 BH3-Me2S(10.0 M, 10.8 mL, 5.00 당량)를 N2 대기 하에 주사기를 통해 0℃에서 적가한 다음, 혼합물을 N2 대기 하에 20℃에서 10시간 동안 교반하였다. 반응물을 메탄올(100 mL)로 켄칭하고 농축하였다. 이어서 잔류물을 EtOAc(100 mL) 및 H2O(100 mL)로 희석하고 EtOAc(100 mL × 3)로 추출하고 염수(200 mL)로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 차아염소산나트륨 용액으로 수성상을 켄칭시키고 폐기하였다. 화합물 31-5(7.60 g, 12.5 mmol, 57.7% 수율, 66.0% 순도)를 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.39 - 7.37 (m, 6H), 7.27 - 7.23 (m, 6H), 7.20 - 7.16 (m, 3H), 3.13- 3.08 (m, 2H), 2.63 - 2.51 (m, 4H), 2.17 - 2.10 (m, 4H), 1.82 - 1.79 (m, 2H), 1.75 - 1.69 (m, 2H), 1.33 - 1.25 (m, 2H).
단계 4: 4-(피롤리딘-1-일)부탄-1-티올( 31-6 )
TFA(16.0 mL) 중의 1-(4-트리틸설파닐부틸)피롤리딘(5.00 g, 12.5 mmol, 1.00 당량)과 DCM(52.0 mL)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 세정하고, 이어서 트리이소프로필실란(3.94 g, 24.9 mmol, 5.11 mL, 2 당량)을 0℃에서 서서히 첨가하였다. 혼합물은 3시간 동안 20℃에서 N2 대기 하에 교반하였다. 반응 혼합물은 감압 하에 농축시켰다. 혼합물을 메탄올(50 mL)로 희석시키고 석유 에테르(60 mL × 5)로 세척하였다. 메탄올 층은 감압 하에 농축시켜 화합물 31-6 (3.40 g, 조 생성물, TFA 염)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 3.34 - 3.28 (m, 1H), 3.15 - 3.10 (m, 1H), 2.95 - 2.82 (m, 4H), 2.60 - 2.54 (m, 2H), 2.13 - 2.08 (m, 2H), 1.94 - 1.78 (m, 3H), 1.72 - 1.62 (m, 2H), 1.41 - 1.35 (m, 1H).
단계 5: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((4-(피롤리딘-1-일)부틸)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트( CAT31 )
무수 디클로로메탄(25.0 mL) 중에 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(2.00 g, 3.28 mmol, 1.00 당량) 용액에 TEA(995 mg, 9.84 mmol, 1.37 mL, 3.00 당량) 및 트리포스겐(920 mg, 3.10 mmol, 0.90 당량)을 0℃에서 N2 대기 하에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물은 감압 하에 농축시켰다. 무수 THF(25.0 mL) 중의 4-피롤리딘-1-일부탄-1-티올(3.14 g, 11.5 mmol, 3.50 당량, TFA 염) 용액에 NaOH(1.31 g, 32.8 mmol, 10.0 당량)를 0℃에서 N2 대기 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(15.0 mL) 중 카바모일 클로라이드를 N2 대기 하에 0℃에서 첨가하였다. 생성된 용액을 20℃에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 0℃에서 NH4Cl(60.0 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(60.0 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(60.0 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(70.0 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 120g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 100 mL/min 에서 0 ~ 50% EtOAc/석유 에테르 구배)로 정제한 후 양성 prep-HPLC(컬럼: Welch Ultimate XB - CN 250 * 50 * 10 um, 이동상: [헥산 - EtOH], B%: 0% - 35%, 20 min)로 정제하였다. 화합물 CAT31(260 mg, 0.322 mmol, 10.2% 수율, 98.5% 순도)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+1] + : 796.1.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.90 - 4.84 (m, 2H), 3.58 - 3.53 (m, 1H), 3.38 - 3.34 (m, 4H), 3.26 - 3.20 (m, 1H), 2.95 - 2.89 (m, 2H), 2.53 - 2.52 (m, 2H), 2.49 - 2.46 (m, 2H), 2.33 - 2.29 (m, 4H), 2.14 - 2.07 (m, 1H), 2.00 - 1.97 (m, 1H), 1.89 - 1.87 (m, 4H), 1.80 - 1.77 (m, 2H), 1.65 - 1.63 (m, 2H), 1.52 - 1.51 (m, 8H), 1.32 - 1.27 (m, 42H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 12H).
실시예 1.32: CAT32의 합성
단계 1: 디(펜타데칸-8-일) 5-(N-에틸-4-니트로페닐설폰아미도)노난디오에이트( 32-10 )
MeCN(50 mL) 중의 디(펜타데칸-8-일) 5-(4-니트로페닐설폰아미도]노난디오에이트(5.00 g, 6.18 mmol, 1 당량) 및 요오도에탄(1.16 g, 7.41 mmol, 0.593 mL, 1.2 당량)의 용액에 Cs2CO3(6.04 g, 18.54 mmol, 3 당량), TBAI(22.8 mg, 61.8 umol, 0.01 당량) 및 KI(513 mg, 3.09 mmol, 0.5 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 10시간 동안 90℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하였다. 여과물을 물(50 mL)로 희석시키고, 에틸 아세테이트(30 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(30 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 120 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 100 mL/min에서 0 ~ 10% 에틸 아세테이트/석유 에테르 구배의 용출)로 정제하여 디(펜타데칸-8-일) 5-(N-에틸-4-니트로페닐설폰아미도)노난디오에이트(4.20 g, 4.67 mmol, 75.5% 수율, 93% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+23] + : 859.5
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.35 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.03 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.86 - 4.80 (m, 2H), 3.23 - 3.18 (m, 2H), 2.28 - 2.19 (m, 4H), 1.54 - 1.44 (m, 17H), 1.26 - 1.23 (s, 40H), 0.90 - 0.87 (m, 15H).
단계 2: 디(펜타데칸-8-일) 5-(에틸아미노)노난디오에이트( 31-11 )
DMF(50 mL) 중의 디(펜타데칸-8-일) 5-(N-에틸-4-니트로페닐설폰아미도)노난디오에이트(4.20 g, 5.02 mmol, 1 당량) 및 Cs2CO3(3.27 g, 10.0 mmol, 2 당량)의 용액에 벤젠티올(1.67 g, 15.2 mmol, 1.55 mL, 3.02 당량)을 첨가하고 이어서, 혼합물을 N2 대기 하에 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(100 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 에틸 아세테이트(200 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(100 mL)로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 120 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 100 mL/min에서 0 ~ 50% 에틸 아세테이트/석유 에테르 구배의 용출)로 정제하여 디(펜타데칸-8-일) 5-(에틸아미노)노난디오에이트(2.50 g, 3.83 mmol, 76.4% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.90 - 4.84 (m, 2H), 2.65 - 2.60 (m, 2H), 2.54 - 2.52 (m, 1H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.61 - 1.40 (m, 16H), 1.27 - 1.24 (m, 40H), 1.11 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.95 - 0.87 (m, 12H).
단계 3: 2-(2-클로로에틸)-1-메틸피롤리딘( 32-2A )
CH2Cl2(500 mL) 중의 2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에탄올(45.0 g, 348 mmol, 47.3 mL, 1 당량)의 용액에 SOCl2(124 g, 1.04 mol, 75.8 mL, 3 당량)를 0℃에서 서서히 적가하였다. 이어서, 혼합물은 2시간 동안 40℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축시켜 화합물 32-2A(53.0 g, 조 생성물, HCl)를 갈색 고체로서 수득하였다. 화합물은 다음 단계를 위해 직접 사용하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.13 (s, 1H), 3.84 - 3.80 (m, 1H), 3.71 - 3.64 (m, 1H), 3.52 - 3.48 (m, 1H), 3.39 - 3.30 (m, 1H), 3.06 - 2.97 (m, 1H), 2.75 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.37 - 2.33 (m, 1H), 2.24 - 2.11 (m, 2H), 1.99 - 1.84 (m, 2H), 1.74 - 1.64 (m, 1H).
단계 4: 1-메틸-2-(2-(트리틸티오)에틸)피롤리딘( 32-3A )
DMF(500 mL) 중의 2-(2-클로로에틸)-1-메틸피롤리딘(53.0 g, 359 mmol, 1 당량) 및 트리페닐메탄티올(119 g, 431 mmol, 1.2 당량)의 용액에 K2CO3(198 g, 1.44 mol, 4 당량) 및 KI(5.96 g, 35.9 mmol, 0.1 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 2시간 동안 80℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 물(1000 mL) 및 EtOAc(300 × 3 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 330 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 100 mL/min에서 0 ~ 50% 에틸 아세테이트/석유 에테르 구배의 용출)로 정제하여 화합물 32-3A(12.0 g, 30.7 mmol, 18.3% 수율, 99% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+1] + : 388.2.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.44 - 7.41 (m, 6H), 7.31 - 7.27 (m, 6H), 7.23 - 7.20 (m, 3H), 2.20 (s, 3H), 2.18 - 2.08 (m, 2H), 1.98 - 1.92 (m, 1H), 1.78 - 1.71 (m, 3H), 1.65 - 1.56 (m, 2H), 1.35 - 1.30 (M, , 1H), 1.23 - 1.15 (m, 1H).
단계 5: 2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에탄티올( 32-4A )
TFA(10 mL) 및 CH2Cl2(30 mL) 중의 1-메틸-2-(2-(트리틸티오)에틸)피롤리딘(5.50 g, 14.2 mmol, 1 당량) 용액에 트리이소프로필실란(4.49 g, 28.4 mmol, 5.83 mL, 2 당량)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물은 3시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하고, 잔류물을 메탄올(10 mL) 중에 용해시키고 석유 에테르(10 mL × 5)로 추출하였다. 배합된 메탄올 층을 감압 하에 농축시켜 화합물 32-4A(3.68 g, 조 생성물, TFA)를 황색 오일로서 수득하였다. 화합물은 다음 단계를 위해 직접 사용하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 3.57 (m, 1H), 3.33 (m, 1H), 3.06 (m, 1H), 2.82 (s, 3H), 2.64 (d, J = 15.8 Hz, 2H), 2.24 (m, 1H), 2.16 - 2.04 (m, 1H), 1.98 (m, 1H), 1.93 - 1.71 (m, 2H), 1.62 (m, 1H).
단계 6: 디(펜타데칸-8-일) 5(에틸(((2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸)티오)카보닐)아미노)노난디오에이트( CAT32 )
무수 CH2Cl2(20 mL) 중에 용해된 디(펜타데칸-8-일) 5-(에틸아미노)노난디오에이트(2.50 g, 3.83 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(1.16 g, 11.5 mmol, 1.60 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(1.07 g, 3.61 mmol, 0.94 당량)을 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 반응물은 감압 하에 농축시켰다. 0℃에서 무수 THF(30 mL)에 용해된 2-(1-이소프로필피롤리딘-2-일)에탄티올(3.48 g, 13.4 mmol, 3.5 당량, TFA)에 NaOH(1.53 g, 38.34 mmol, 10 당량)를 질소 대기 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(10 mL) 중 카바모일 클로라이드를 N2 대기 하에 0℃에서 주사기를 통해 첨가하였다. 생성된 용액을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 0℃에서 NH4Cl(50 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(50 mL)로 희석시켰다. 수성 상은 에틸 아세테이트(50 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(30 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 120 g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 100 mL/min에서 0~50% 에틸 아세테이트/석유 에테르 구배의 용출) 및 prep-HPLC(컬럼: Welch Ultimate C18 150 * 25 mm * 5 um;이동상: [물(HCl)-MeOH];B%: 70%-100%, 10 min)으로 정제하여 CAT32(400 mg, 480.48 umol, 73.26% 수율, 98.9% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+1] + : 824.4.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.88-4.85 (m, 2H), 4.30 - 3.82 (m, 1H), 3.27 - 3.26 (m, 2H), 3.05 - 3.03 (m, 1H), 2.89-3.00 (m, 1H), 2.78-2.89 (m, 1H), 2.32 (s, 3H), 2.31-2.25 (m, 3H), 2.16-2.12 (m, 2H), 2.00-1.97 (m, 2H), 1.59-1.50 (m, 21H), 1.27 - 1.25 (m, 43H), 0.90 - 0.87 (m, 12H).
실시예 1.33: CAT33의 합성
단계 1: 4-(클로로메틸)-1-메틸-피페리딘( 33-2 )
CH2Cl2(200 mL) 중의 (1-메틸-4-피페리딜)메탄올(20 g, 154.80 mmol, 1 당량)의 용액에 SOCl2(22.10 g, 185.76 mmol, 13.48mL, 1.2 당량)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 40℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 화합물 33-2(20 g, 108.63 mmol, 70.18% 수율)를 갈색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ = 10.96 (s, 1H), 3.56 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.67-3.33 (m, 2H), 2.97-2.94 (m, 2H), 2.68 (s, 3H), 1.97-1.62 (m, 5H).
단계 2: 1-메틸-4-(트리틸설파닐메틸)피페리딘( 33-3 )
DMF(200 mL) 중의 4-(클로로에틸)-1-메틸-피페리딘(20 g, 108.63 mmol, 1 당량) 및 트리페닐메탄티올(45.04 g, 162.95 mmol, 1.5 당량)의 용액에 Ca2CO3(70.79 g, 217.27 mmol, 2 당량) 및 KI(9.02 g, 54.32 mmol, 0.5 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 60℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 물(300 mL × 3)로 희석하고 EtOAc(400 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(PE/EtOAc=20/1 내지 0/1)로 정제하여 화합물 33-3(17 g, 43.86 mmol, 40.38% 수율)을 갈색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ =7.50 - 7.47 (m, 6H), 7.33 - 7.27 (m, 9H), 2.64 - 2.58 (m, 2H), 2.32 (s, 3H), 1.91 - 1.88 (m, 2H), 1.66 - 1.61 (m, 3H), 1.44-1.28 (m, 4H).
단계 3: (1-메틸-4-피페리딜)메탄티올: ( 33-4 )
CH2Cl2(200 mL) 중의 1-메틸-4-(트리틸설파닐메틸)피페리딘(17 g, 43.86 mmol, 1 당량) 및 트리이소프로필실란 (20.84 g, 131.59 mmol, 27.03 mL, 3 당량) 용액에 TFA(32.73 g, 287.00 mmol, 21.25 mL, 6.54 당량)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 TFA를 제거하고, 이를 메탄올(300 mL × 3)로 희석시키고 PE(200 mL × 3)로 세척하였다. 합한 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 메탄올 층은 감압 하에 농축시켜 화합물 33-4(4 g, 27.54 mmol, 62.78% 수율)를 갈색 오일로서 수득하였다.
단계 4: 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]-[(1-메틸-4-피페리딜)메틸설파닐카보닐]아미노]부타노에이트 ( CAT33 )
무수 CH2Cl2(30 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(3 g, 4.92 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(1.49 g, 14.75 mmol, 2.05 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(729.70 mg, 2.46 mmol, 0.5 당량)을 0℃에서 N2 대기 하에 첨가하였다. 수득한 용액을 1시간 동안 N2 하에 20℃에서 교반하였다. 반응물을 감압 하에 농축시키고 N2 하에 유지시켰다. NaOH(1.38 g, 34.43 mmol, 7 당량)를 무수 THF(50 mL)에 0℃에서 N2 하에 용해시키고, 이어서 (1-메틸-4-피페리딜)메탄티올(3.57 g, 24.59 mmol, 5 당량)을 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(50 mL) 중에 용해된 카바모일 클로라이드를 N2 하에 0℃에서 서서히 첨가하였다. 혼합물은 2시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 NH4C1(100 mL)로 켄칭시키고 이어서 EtOAc(100 mL)로 희석하였다. 수성상을 EtOAc(100 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(PE/EtOAc = 10/1 내지 1/2)에 의해 정제하고 prep-HPLC(컬럼 Welch Ultimate C18 150*25 mm*5 um; 이동상: [물(HCl)-MeOH]; B%: 70%-100%, 10 min)로 정제하여 화합물 CAT33(137.8 mg, 184.39 umol, 62.63% 수율, 98% 순도)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 781.6
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.88 - 4.86 (m, 2H), 3.54 - 3.51 (m, 2H), 3.46-3.38 (m, 5H), 2.83 - 2.85 (m, 2H), 2.75 (s, 3H), 2.67 - 2.62 (m, 2H), 2.40-2.32 (m, 4H), 2.01 - 1.89 (m, 8H), 1.55-1.51 (m, 8H), 1.35-1.27 (m, 40H), 0.90-0.84 (m, 12H).
실시예 1.34: CAT34의 합성
단계 1: (1-메틸피롤리딘-3-일)메탄올 ( 34-2 )
THF(350 mL) 중의 O1-tert-부틸 O3-메틸 피롤리딘-1,3-디카복실레이트 (20.0 g, 87.2 mmol, 1.00 당량) 용액에 LiAlH4(8.28 g, 218 mmol, 2.50 당량)를 0℃에서 N2 하에 분획으로 첨가하였다. 혼합물은 5시간 동안 60℃에서 N2 하에 교반하였다. 0℃에서 물(8 mL) 및 15% NaOH 용액(8 mL)을 첨가하여 반응 혼합물을 켄칭시키고 이어서 물(24 mL)을 서서히 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과된 케이크를 EtOAc(100 mL × 3)로 세척하고, 여과물을 감압 하에 농축하여 화합물 34-2(18.3 g, 조 생성물)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 4.51 (s, 1H), 3.30 - 3.22 (m, 2H), 2.44 - 2.29 (m, 3H), 2.25 - 2.21 (m, 1H), 2.19 (s, 3H), 2.17 - 2.10 (m, 1H), 1.82 - 1.73 (m, 1H), 1.37 - 1.29 (m, 1H).
단계 2: (1-메틸피롤리딘-3-일)메틸 4-메틸벤젠설포네이트 ( 34-7 )
CH2Cl2(250 mL) 중의 (1-메틸피롤리딘-3-일)메탄올(18.0 g, 156 mmol, 1.00 당량), TEA(31.6g, 313mmol, 43.5 mL, 2.00 당량) 및 DMAP(1.91 g, 15.6 mmol, 0.10 당량)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 세정한 후 TosCl(44.7 g, 234 mmol, 1.50 당량)을 0℃에서 서서히 첨가하고 이어서 혼합물을 N2 하에 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 잔류물을 CH2Cl2(100 mL)로 희석하였다. 합한 유기층을 물(350 mL) 및 염수(250 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®;330 g SepaFlash® Silica Flash Column, 100 mL/min에서 0 ~ 100% EtOAc/PE 농도구배의 용출)로 정제하여 화합물 34-7(12.7 g, 47.2 mmol, 30.2% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+1] + : 270.1.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.79 - 7.77 (m, 2H), 7.34 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.93 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 2.55 - 2.47 (m, 4H), 2.45 (s, 3H), 2.42 - 2.38 (m, 1H), 2.28 (s, 3H), 1.98 - 1.89 (m, 1H), 1.44 - 1.35 (m, 1H).
단계 3: 1-메틸-3-((트리틸티오)메틸)피롤리딘 ( 34-5 )
DMF(90 mL) 중의 (1-메틸피롤리딘-3-일)메틸 4-메틸벤젠설포네이트(12.7 g, 47.2 mmol, 1.00 당량), 트리페닐메탄티올(15.6 g, 56.6 mmol, 1.2 당량), CS2CO3(23.0 g, 70.7 mmol, 1.50 당량), NaI(707 mg, 4.71 mmol, 0.10 당량)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 세정한 다음, 혼합물을 N2 대기 하에 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc(500 mL × 2)와 물(500 mL × 3) 사이에서 분배시켰다. 유기상을 분리하고, 염수(500 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, PE/EtOAc=3/1 내지 CH2Cl2 / MeOH = 10/1)로 정제하여 화합물 34-5(16.9 g, 37.1 mmol, 81.5% 수율, 82.0% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.40 - 7.37 (m, 6H), 7.27 - 7.22 (m, 6H), 7.21 - 7.16 (m, 3H), 2.68 - 2.64 (m, 1H), 2.54 - 2.48 (m, 1H), 2.39 - 2.33 (m, 1H), 2.26 (s, 3H), 2.22 - 2.12 (m, 3H), 2.08 - 2.04 (m, 1H), 1.97 - 1.89 (m, 1H), 1.39 - 1.31 (m, 1H).
단계 4: (1-메틸피롤리딘-3-일)메탄티올( 34-6 )
TFA(27 mL) 및 CH2Cl2(80 mL) 중의 1-메틸-3-(트리틸설파닐메틸)피롤리딘(8.00 g, 21.4 mmol, 1.00 당량)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 세정하고 이어서 트리이소프로필실란(6.78 g, 42.8 mmol, 8.80 mL, 2.00 당량)을 0℃에서 서서히 첨가하고, 이어서 혼합물을 N2 대기 하에 3시간동안 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 감압 하에 농축시켰다. 여과물을 MeOH (20 mL)로 희석시키고 PE (30 mL × 5)로 추출하였다. MeOH 층은 감압 하에 농축시켜 화합물 34-6(5.00 g, 조 생성물, TFA 염)을 담황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 3.95 - 3.91 (m, 1H), 3.82 - 3.69 (m, 1H), 3.15 - 2.99 (m, 2H), 2.93 (s, 3H), 2.76 - 2.64 (m, 4H), 2.39 - 2.31 (m, 1H), 1.97 - 1.88 (m, 1H)
단계 5: 디(펜타데칸-8-일) 4,4'-((((1-메틸피롤리딘-3-일)메틸)티오)카보닐)아자네디일)디부타노에이트 ( CAT34 )
무수 CH2Cl2(30 mL) 중에 용해된 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(2.50 g, 4.10 mmol, 1.00 당량) 용액에 TEA(1.24 g, 12.3 mmol, 1.71 mL, 3.00 당량) 및 트리포스겐(1.09 g, 3.69 mmol, 0.90 당량)을 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 수득한 혼합물은 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 수득한 반응물은 감압 하에 농축시켰다. 무수 THF(35 mL) 중의 (1-메틸피롤리딘-3-일)메탄티올(3.02 g, 12.30 mmol, 3 당량, TFA 염) 용액에 NaOH(2.46 g, 61.48 mmol, 15 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(35.0 mL) 중 카바모일 클로라이드를 N2 하에 0℃에서 첨가하였다. 생성된 용액을 20℃에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 0℃에서 NH4Cl(100 mL)에 의해 켄칭시키고 이어서 EtOAc(100 mL)로 희석시켰다. 수성상을 EtOAc(100 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(200 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 120g SepaFlash® 실리카 플래쉬 컬럼, 100 mL/min에서 0 ~ 37% EtOAc/PE 농도구배의 용출)로 정제한 다음, prep-HPLC(HCl 조건; 컬럼: Welch Ultimate C18 150 * 25 mm * 5 um; 이동상: [물(HCl) - MeOH]; B%: 70% - 100%, 10 min) 화합물 CAT34(179 mg, 0.227 mmol, 5.8% 수율, 97.2% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS [M+1] + : 767.6
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.90 - 4.84 (m, 2H), 3.26 - 3.48 (m, 4H), 3.03 - 2.92 (m, 2H), 2.78 - 2.74 (m, 1H), 2.60 - 2.51 (m, 2H), 2.50 - 2.44 (m, 1H), 2.35 (s, 3H), 2.32 - 2.25 (m, 4H), 2.12 - 2.03 (m, 1H), 1.96 - 1.84 (m, 4H), 1.78 - 1.67 (m, 2H), 1.48 - 1.55 (m, 8H), 1.32 - 1.22 (m, 40H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H).
실시예 1.35: CAT35의 합성
단계 1: 중간체 2 (N-헵틸헵탄-1-아민)의 합성 (35-2)
DMF(100 mL) 중 헵탄-1-아민(30 g, 260.38 mmol, 38.81 mL, 1 당량) 및 1-브로모헵탄(46.63 g, 260.38 mmol, 40.91 mL, 1 당량)의 용액에 K2CO3(35.99 g, 260.38 mmol, 1 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 80℃에서 N2 하에 교반하였다. 반응 혼합물에 물(500 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 에틸 아세테이트(500 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(200 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 1/1)로 정제하여 화합물 35-2(15 g, 70.29 mmol, 27.00% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 2.38-2.34 (m, 4H), 1.48-1.42 (m, 4H), 1.38-1.22 (m, 16H), 0.90-0.84 (m, 6H).
단계 2: 4-[[4-(디헵틸아미노)-4-옥소-부틸]-(4-니트로페닐)설포닐-아미노]-N,N-디헵틸-부탄아미드( 35-4 )
디클로로메탄(30 mL) 중의 4-[3-카복시프로필-(4-니트로페닐)설포닐-아미노]부탄산(3 g, 8.01 mmol, 1 당량) 용액에 EDCI (4.61 g, 24.04 mmol, 3 당량), 이어서 DMAP(489.50 mg, 4.01 mmol, 0.5 당량) 및 TEA(2.43 g, 24.04 mmol, 3.35 mL, 3 당량)를 첨가하였다. 30분 후, N-헵틸헵탄-1-아민(3.59 g, 16.83 mmol, 2.1 당량)을 첨가하였다. 이어서 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물(100 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 에틸 아세테이트(200 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(100 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트=30/1 내지 1/1)로 정제하여 화합물 35-4(2.4 g, 3.14 mmol, 39.14% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.27 - 8.24 (m, 2H), 8.08-7.80 (m, 2H), 3.23-3.17 (m, 4H), 3.12 -3.06 (m, 3H), 2.58-2.52 (m, 1H), 2.27-2.18 (m, 3H), 1.84-1.48 (m, 4H), 1.53-1.28 (m, 8H), 1.20-1.05 (m, 32H), 0.88-0.75 (m, 12H).
단계 3: 4-[[4-(디헵틸아미노)-4-옥소-부틸]아미노]-N,N-디헵틸-부탄아미드( 35-5 )
DMF(20 mL) 중의 4-[[4-(디헵틸아미노)-4-옥소-부틸]-(4-니트로페닐)설포닐-아미노]-N,N-디옥틸-부탄아미드(1.8 g, 2.35 mmol, 1 당량) 및 벤젠티올(518.38 mg, 4.71 mmol, 479.99 uL, 2 당량) 용액에 Cs2CO3(1.53 g, 4.71 mmol, 2 당량)을 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 25℃에서 N2 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 물(100 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 에틸 아세테이트(300 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(500 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 1/1 및 디클로로메탄/메탄올 = 30/1 내지 5/1)로 정제하여 화합물 35-5(1 g, 1.72 mmol, 73.29% 수율)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 3.32-3.21 (m, 8H), 2.80-2.68 (m, 4H), 2.48-2.25 (m, 4H), 1.96-1.81 (m, 4H), 1.56-1.46 (m, 8H), 1.28-1.10 (m, 32H), 0.93-0.85 (m, 12H).
단계 4: S-[3-(디메틸아미노)프로필] N,N-비스[4-(디헵틸아미노)-4-옥소-부틸]카바모티오에이트( CAT35 )
무수 디클로로메탄(20 mL) 중에 용해된 4-[[4-(디헵틸아미노)-4-옥소-부틸]아미노]-N,N-디헵틸-부탄아미드(1.5 g, 2.59 mmol, 1 당량) 용액에 TEA(785.11 mg, 7.76 mmol, 1.08 mL, 3 당량) 및 트리포스겐(383.74 mg, 1.29 mmol, 0.5 당량)을 0℃에서 질소 대기 하에 첨가하였다. 수득한 용액을 1시간 동안 질소 대기 하에 25℃에서 교반하였다. 반응물을 감압 하에 농축시키고 질소 대기 하에 유지하였다. NaOH(724.11 mg, 18.10 mmol, 7 당량)를 무수 THF(50 mL)에 0℃에서 질소 대기 하에 용해시키고, 이어서 3-(디메틸아미노)프로판-1-티올(1.54 g, 12.93 mmol, 5 당량)을 질소 대기 하에 첨가하였다. 상기 생성된 용액에, THF(10 mL) 중의 카바모일 클로라이드를 질소 대기 하에 0℃에서 서서히 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 35℃에서 교반하였다.반응 혼합물을 물(100 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 에틸 아세테이트(200 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(100 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 1/1 및 디클로로메탄/메탄올 = 30/1 내지 5/1) 및 MPLC(컬럼 Welch Ultimate XB-SiOH 250*50*10 um; 이동상: [헥산-EtOH]; B%: 0%-28%, 15 min)로 정제하여 화합물 CAT35(181 mg, 247.84 umol, 17.97% 수율, 99.3% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 725.6
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 3.48-3.41 (m, 4H), 3.28-3.20 (m, 4H), 3.18-3.10 (m, 4H), 2.50-2.10 (m , 4H), 1.96-1.60 (m, 6H), 1.53-1.46 (m, 8H), 1.26-1.10 (m, 32H), 0.95-0.81 (m, 12H).
실시예 1.36: CAT2의 합성
단계 1: 2-[3-(디메틸아미노)프로필]이소티오우레아 하이드로클로라이드( 36-2 ):
EtOH(500 mL) 중의 3-클로로-N,N-디메틸-프로판-1-아민(25 g, 158.16 mmol, 1 당량, HCl) 용액에 NaI(474.13 mg, 3.16 mmol, 0.02 당량) 및 티오우레아(13.24 g, 173.97 mmol, 1.1 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 16시간 동안 80℃에서 교반하였다. TLC(디클로로메탄:메탄올 = 10:1, PMA)는 출발 물질이 완전히 소모되고 하나의 새로운 주요 스팟이 형성됨을 나타내었다. 반응 혼합물을 10℃로 냉각시키고 결정 침전물을 형성시켰다. 반응 혼합물을 여과하고 필터 케이크를 에틸 아세테이트(100 mL × 2)로 세척하였다. 필터 케이크를 진공 농축시켜 화합물 36-2(29.1 g, 147.17 mmol, HCl)를 백색 고체로서 수득하였다. 조 생성물은 다음 단계를 위해 추가의 정제 없이 사용하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 9.40 - 9.37 (m, 4H), 3.35 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.12 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.72 (s, 6H), 2.08 - 2.01 (m, 2H).
단계 2: 3-( 디메틸아미노)프로판-1-티올( 36-3 )
H2O(10 mL) 및 EtOH(40 mL) 중의 2-[3-( 디메틸아미노)프로필]이소티오우레아(10.0 g, 62.0 mmol, 1 당량)의 용액에 NaOH(14.9 g, 372 mmol, 6 당량)를 첨가하였다. 혼합물은 3시간 동안 90℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 25℃로 냉각시키고, 물(20 mL)을 첨가하여 켄칭시키고, 이어서 에틸 아세테이트(20 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(20 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 농축시켜 화합물 36-3(2.10 g, 조 생성물)을 황색 오일로서 수득하였다. 반응 잔류물은 다음 단계에서 직접 사용하였다.
단계 3: 1-헵틸옥틸 4-[3-(디메틸아미노)프로필설파닐카보닐-[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트( CAT2 )
DCM(20 mL) 중의 1-헵틸옥틸 4-[[4-(1-헵틸옥톡시)-4-옥소-부틸]아미노]부타노에이트(2.00 g, 3.28 mmol, 1 당량)의 용액에 비스(트리클로로메틸) 카보네이트(486 mg, 1.64 mmol, 0.5 당량) 및 TEA(995 mg, 9.84mmol, 1.37 mL, 3 당량)를 첨가하였다. 첨가 후, 생성된 용액을 1시간 동안 20℃에서 교반하였다. 수득한 반응물은 감압 하에 농축시켰다. 무수 THF(20 mL) 중의 3-(디메틸아미노)프로판-1-티올(1.95 g, 16.4 mmol, 5 당량) 용액에 NaOH(918 mg, 23.0 mmol, 7 당량)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. THF(5 mL)에 용해된 카바모일 클로라이드를 N2 하에 0℃에서 첨가하였다. 생성된 용액을 20℃에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 수성 NH4C1(100 mL)로 켄칭시키고 이어서 에틸 아세테이트(100 mL)로 희석하였다. 수성 상은 에틸 아세테이트(100 mL × 3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10:1 내지 1:1)로 정제하여 CAT2(260 mg, 0.340 mmol, 65% 수율, 99% 순도)를 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M+H]+: 756.1;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 4.82 - 4.77 (m, 2H), 3.39 - 3.29 (m, 4H), 2.84 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.31 - 2.22 (m, 6H), 2.17 - 2.15 (m, 6H), 1.85 - 1.70 (m, 6H), 1.46-1.42 (m, 8H), 1.25 - 1.10 (m, 40H), 0.86 - 0.72 (m, 12H).
실시예 2: PEG-지질의 합성
실시예 2.1: CHM-001의 합성
단계 1: 벤질-폴리(에틸렌 글리콜)2000(1.1-2)의 합성
THF(100 mL) 중의 PEG2000(20 g, 10.00 mmol, 1 당량)의 용액에 0℃에서 NaH (599.83 mg, 15.00 mmol, 60% 순도, 1.5 당량)를 첨가하고 0℃에서 40 min 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 브로모메틸 벤젠(2.57 g, 15.00 mmol, 1.78 mL, 1.5 당량)으로 처리하였다. 이어서, 반응 혼합물은 18시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 포화 NH4C1 용액(100 mL)으로 켄칭시키고 DCM(150 mL)로 희석하였다. 유기 층을 H2O(70 mL × 2) 및 염수(70 mL × 2)로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 생성된 용액을 저압에서 농축시켜 조 생성물을 백색 고체로서 수득하였다. 조 생성물을 플래쉬 실리카겔 크로마토그래피(0~5%, MeOH/DCM)로 정제하여 화합물 1.1-2(2.80g, 1.34mmol, 13.4% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) δ 7.34-7.29 (m, 5H, PhCH2-), 4.57 (s, 2H, PhCH2-), 3.82-3.46 (m, 180H, 폴리(에틸렌 글리콜) 2000).
단계 2: tert-부틸 2-(벤질-폴리(에틸렌 글리콜) 2000)-아세테이트(1.1-3)의 합성
THF(25 mL) 중의 벤질-폴리(에틸렌 글리콜)2000(1.1-2, 2.8 g, 544.6 μmol, 1 당량)의 혼합물에 NaH(535.8 mg, 13.39 mmol, 60% 순도, 10 당량)를 N2 하에 0℃에서 분획으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고, tert-부틸 2-브로모아세테이트(1.83 g, 9.38 mmol, 1.39 mL, 7 당량)를 상기 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물은 18시간 동안 26℃에서 교반하였다. 혼합물은 H2O (20 mL)로 켄칭시키고 DCM(50 mL)으로 희석하였다. 유기 층을 분리하고 수성상을 DCM(20 mL × 2)으로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(20 mL × 2)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 조 생성물을 백색 고체로서 수득하였다. 조 생성물을 플래쉬 크로마토그래피(0-5%, DCM/MeOH)로 정제하여 화합물 1.1-3(3.94 g, 1.79 mmol, 74.7% 수율)을 백색 왁스형 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400MHz, CHLOROFORM-d) δ 7.43-7.30, 5H, PhCH2-), 4.58(s, 2H, PhCH2-), 4.03, 2H, -O-CH2-CO2-), 3.82-3.46 (m, 180H, 폴리(에틸렌 글리콜)2000), 1.49 (s, 9H, tBu).
단계 3. 2-(벤질-폴리(에틸렌 글리콜)2000-아세트산(1.1-4)의 합성
DCM(10 mL) 중의 tert-부틸-2-(벤질-폴리(에틸렌 글리콜)2000-아세테이트(1.20 g, 1.79 mmol, 1 당량) 용액에 TFA(7.70 g, 67.53 mmol, 5 mL, 37.79 당량)를 26℃에서 분획으로 첨가하였다. 혼합물은 18시간 동안 26℃에서 교반하였다. 상기 혼합물을 진공 하에 농축시켜 황색 오일로서 조 생성물 1.1-4 (1.5 g, 조 생성물)을 수득하였고, 이를 추가의 정제없이 다음 단계에서 사용하였다.
단계 4. 옥타데실 2-(벤질-폴리(에틸렌 글리콜) 2000)-아세테이트(1.1-5)의 합성
DCM(10 mL) 중의 2-(벤질-폴리(에틸렌 글리콜)2000)-아세트산(1.17 g, 조 생성물), 옥타데칸-1-올(2.95 g, 10.89 mmol, 3.63 mL, 20 당량) 및 DMAP(133.06 mg, 1.09 mmol, 2 당량)의 용액에 EDCI(2.09 g, 10.89 mmol, 20 당량)를 N2 하에 26℃에서 하나의 분획으로 첨가하였다. 혼합물은 18시간 동안 26℃에서 교반하였다. TLC(DCM/MeOH = 10:1)는 극성이 약간 낮은 새로운 스팟이 생성되었음을 지적하였다. 혼합물은 H2O(20 mL)로 켄칭시키고 DCM(50 mL)로 희석하였다. 유기 층을 분리하고 수성상을 DCM(30 mL × 2)으로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(30 mL × 2)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 진공 농축시켜 조 생성물을 백색 고체로서 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(0-5%, DCM/MeOH)로 정제하여 목적하는 생성물 옥타데실 2-(벤질-폴리(에틸렌 글리콜)2000)-아세테이트(1.01 g, ~76% 수율)를 백색 왁스형 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) δ 7.34-7.25 (m, 5H, PhCH2-), 4.54 (s, 2H, PhCH2-), 4.14-4.09 (4H, -O-CH2-CO2-CH2-), 3.82-3.46 (m, 180H, 폴리(에틸렌 글리콜)2000), 1.66 - 1.55 (m, 2H, Me(CH2)15-CH2-), 1.23 (s, 22H, Me(CH2)15-), 0.85 (t, J=6.8 Hz, 3H, Me(CH2)15-).
단계 5. 옥타데실 2-(폴리(에틸렌 글리콜) 2000)-아세테이트(CHM-001)의 합성
EtOH(60 mL) 중의 옥타데실 2-(벤질-폴리(에틸렌 글리콜)2000)-아세테이트(1.01 g, 420.66 μmol, 1 당량) 용액에 Pd(OH)2/C(3.01 g, 10% 순도)를 H2(15 psi) 대기 하에 26℃에서 첨가하였다. 혼합물은 18시간 동안 26℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 여과물을 저압에서 농축시켜 조 생성물을 백색 고체로서 수득하였다. 조 생성물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(0~6%, MeOH/DCM)로 정제하여 목적하는 화합물 CHM-001(0.29 g, 123.60 μmol, 29.38% 수율)을 백색 왁스형 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) δ 4.18-4.12 (m, 4H, -CH2-(CO)O-CH2-), 3.75-3.56 (m, 180H, 폴리에틸렌 글리콜 2000), 1.69-1.60 (m, 2H, -(CO)O-CH2-CH2-), 1.27 (s, 30H, Me-(CH2)15-), 0.89 (t, J=6.8 Hz, 3H, Me-). 13C NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) δ 170.59, 72.75, 70.89, 70.55, 70.21, 68.66, 65.00, 61.67, 31.93, 29.70, 29.66, 29.52, 29.37, 25.85, 22.69, 14.13. HPLC (ELSD), RT=3.36 min, 98.49% 순도. IR(υ max /cm1), 3491, 2887, 1968, 1752, 1467, 1360, 1343, 1280, 1149, 1112, 963, 842, 720. 용융 범위, 50.7-51.7℃.
실시예 2.2: CHM-004의 합성
1.4-1(500 mg, 241.26 μmol, 1 당량)을 무수 DCM(10 mL) 중에 용해시켰다. 이어서ㅡ DMAP(58.95 mg, 482.52 μmol, 2 당량) 및 EDCI(277.50 mg, 1.45 mmol, 6 당량)를 연속적으로 첨가한 후 옥타데칸-1-올(391.56 mg, 1.45 mmol, 482.21 μL, 6 당량)을 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물은 18시간 동안 25℃에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 진공에서 농축시켜 조 생성물을 백색 고체로서 수득하였다. 조 생성물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(0~5% MeOH/DCM)로 정제하여 목적하는 생성물 옥타데실 2-(메틸-폴리(에틸렌 글리콜)2000)-아세테이트를 왁스형 고체(CHM-004, 430 mg, 76.6% 수율)로서 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) 4.19 - 4.09 (m, 4H, -O-CH2-CO2-CH2-), 3.74 - 3.60 (m, 180H, 폴리(에틸렌 글리콜)2000), 3.38 (s, 3H, MeO-),1.68 - 1.58 (m, 2H, Me(CH2)15-CH2-), 1.25 (s, 30H, Me(CH2)15-), 0.88 (t, J=6.8 Hz, 3H, Me(CH2)15-). 1HPLC (ELSD), RT=7.88, 99.93% 순도. IR ( max/cm-1), 3479, 2887, 1750, 1467, 1360, 1343, 1148, 1112, 963, 842.　용융 범위, 50.6-51.3℃.
실시예 2.3: CHM-005의 합성
단계 1: 헥사데실 2-(벤질-폴리(에틸렌 글리콜) 2000)-아세테이트 (1.5-2)의 합성
2-(벤질-폴리(에틸렌 글리콜)2000)-아세트산(1.5-1, 800 mg, 372.35 μmol, 1.00 당량)을 DCM(10 mL)에 용해시키고 이어서 DMAP(90.98 mg, 744.70 μmol, 2.00 당량) 및 EDCI(713.80 mg, 3.72 mmol, 10 당량)를 첨가하고, 이어서 헥사데칸-1-올(902.72 mg, 3.72 mmol, 10 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 18시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 진공 농축시켜 조 생성물을 백색 고체로서 수득하였다. 조 생성물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(0~8%, MeOH/DCM)로 정제하여 화합물 1.5-2(110 mg, 38.01 μmol, 10.21% 수율, 82% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다.
단계 2. 헥사데실 2-(폴리(에틸렌 글리콜) 2000)-아세테이트(CHM-005)의 합성
헥사데실 2-(벤질-폴리(에틸렌 글리콜)2000)-아세테이트(1.5-2, 100 mg, 42.14 μmol, 1 당량)를 EtOH(5 mL)에 용해시키고 Pd(OH)2(50 mg, 71.21 μmol, 20% 순도)를 첨가하였다. 반응 혼합물은 18시간 동안 H2 대기 하에 20℃에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 여과하고 여과물을 저압에서 농축시켜 조 생성물을 백색 고체로서 수득하였다. 조 생성물을 n-헥산으로 20℃에서 30분 동안 연마하고 여과하고, 필터 케이크를 수거하고 감압 하에 건조시켜 화합물 CHM-005(60 mg, 26.13μmol, 61.99% 수율, 99.4% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다.
1H-NMR (400MHz, CHLOROFORM-d) δ 4.19-4.10 (m, 4H, - CH2-(CO)O-CH2-), 3.77-3.57 (m, 180H, 폴리에틸렌 글리콜 2000), 1.70-1.59 (m, 2H, -(CO)O-CH2-CH2-), 1.26 (s, 26H, Me-(CH2)13-), 0.93-0.81 (m, 3H, Me-). HPLC (ELSD), RT=5.93 min, 99.44% 순도. IR(υ max/cm1), 3474, 2887, 1749, 1740, 1467, 1359, 1343, 1148, 1114, 963, 842. 용융 범위, 50.6-51.1 oC.
실시예 2.4: CHM-006의 합성
단계 1: 테트라데실 2-(벤질-폴리(에틸렌 글리콜) 2000)-아세테이트(1.6-2)의 합성
2-(벤질-폴리(에틸렌 글리콜)2000)-아세트산(1.6-1)(800 mg, 372.35 μmol, 1.00 당량)을 DCM(10 mL)에 용해시키고 이어서 DMAP(90.98 mg, 744.69 μmol, 2 당량) 및 EDCI(713.80 mg, 3.72 mmol, 10 당량)을 첨가하고, 이어서 테트라데칸-1-올(798.26 mg, 3.72 mmol, 10 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 18시간 동안 20℃에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 진공에서 농축시켜 조 생성물을 백색 고체로서 수득하였다. 조 생성물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피(0~5%, MeOH/DCM)로 정제하여 화합물 1.6-2(130 mg, 23.28 μmol, 14.9% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
단계 2. 테트라데실 2-(폴리(에틸렌 글리콜) 2000)-아세테이트(CHM-006)의 합성
테트라데실 2-(벤질-폴리(에틸렌 글리콜)2000)-아세테이트(1.6-2)(120 mg, 51.2 μmol, 1.00 당량)를 EtOH(5 mL)에 용해시키고 이어서 Pd(OH)2(100 mg, 10% 순도)를 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물은 18시간 동안 H2 대기 하에 20℃에서 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 여과하고 여과물을 저압에서 농축시켜 조 생성물을 백색 고체로서 수득하였다. 조 생성물을 n-헥산으로 20℃에서 30분 동안 연마하였다. 고체를 수거하고 진공 하에 건조시켜 화합물 CHM-006(102mg, 44.69μmol, 87.33% 수율, 98.79% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) δ 4.20-4.09 (m, 4H, -CH2-(CO)O-CH2-), 3.71-3.57 (m, 180H, 폴리에틸렌 글리콜 2000), 1.64 (q, J=6.8 Hz, 2H, -(CO)O-CH2-CH2-), 1.26 (s, 22H, Me-(CH2)11-), 0.92-0.81 (m, 3H, Me-). HPLC (ELSD), RT=4.20 min, 98.79% 순도. IR(υ max/cm1), 3447, 2889, 1749, 1740, 1653, 1466, 1358, 1343, 1148, 1113, 963, 843. 용융 범위, 49.7-50.1℃.
실시예 2.5: CHM-012의 합성
단계 1: (벤질 폴리(에틸렌 글리콜)2000) N-옥타데실카바메이트(1.10-2)
벤질-폴리(에틸렌 글리콜)2000(BnPEG2000, 1.00 g, 685.26 μmol, 1.00 당량)을 피리딘(10 mL)에 용해시키고 이어서 1-이소시아나토 헵타데칸(1.93 g, 6.85 mmol, 10.0 당량)을 첨가하였다. 이어서 반응 혼합물은 18시간 동안 80℃에서 환류시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 진공에서 농축시켜 조 생성물을 백색 고체로서 수득하였다. 조 생성물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피(0~5%, MeOH/DCM)로 정제하여 화합물 1.10-2(850 mg, 326.94 μmol, 47.71% 수율, 89% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H-NMR (400MHz, CHLOROFORM-d) δ 7.34 (d, J=4.3 Hz, 5H, PhCH2-), 4.57 (s, 2H, PhCH2-), 4.21 (br s, 2H，-CH2-O(CO)-), 3.65 (s, 167H, 폴리(에틸렌 글리콜)2000), 3.15 (br d, J=5.7 Hz, 2H，-CH2-O(CO)NH-CH2-), 1.48 (br s, 2H, -O(CO)NH-CH2-CH2-), 1.26 (s, 30H，Me(CH2)15-), 0.88 (br s, 3H，Me(CH2)15-).
단계 2. 폴리(에틸렌 글리콜)2000 N-옥타데실카바메이트 (CHM-012)
(벤질-폴리(에틸렌 글리콜)2000) N-옥타데실카바메이트(490 mg, 206.6 μmol, 1.00 당량)를 EtOH(10 mL)에 용해시키고 이어서 Pd(OH)2/C(20 mg, 10 % 순도)를 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물은 18시간 동안 H2 대기 하에 20℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 여과물을 진공에서 농축시켜 조 생성물을 백색 고체로서 수득하였다. 조 생성물을 역상 HPLC(컬럼: Boston Prime C18 150*30 mm*5 um; 이동상: [H2O-MeOH]; B%: 60%-95%, 9min)로 정제하여 화합물 CHM-012(144 mg, 62.61 μmol, 30.31% 수율, 99.82% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) δ 4.22 (br s, 2H, -CH2-O(CO)-), 3.65 (s, 180H, 폴리(에틸렌 글리콜)2000), 3.16 (q, J=6.5 Hz, 2H, -CH2-O(CO)NH-CH2-), 2.77 (br s, 1H, HO- 또는 -NH-), 1.48 (br s, 2H, -O(CO)NH-CH2-CH2-), 1.26 (s, 30H, Me(CH2)15-), 0.90-0.87 (m, 3H, Me(CH2)15-). HPLC (ELSD), RT=6.40, 99.82 % 순도. IR (υmax/cm-1): 3307, 2916, 2887, 1963, 1694, 1548, 1467, 1360, 1344, 1149, 1113, 963, 842. 용융 범위, 45.5-46.3℃.
실시예 3: BRIJ™ S100은 -20℃에서 동결/해동 주기 후 지질 나노입자의 크기와 캡슐화를 모두 안정화시킨다.
본 실시예에서 LNP는 49:28.5:22:0.5 몰%의 SS-OC:Chol:DSPC:PEG2k-DPG의 지질 조성물을 포함하고 지질-질소-대 포스페이트 비율(N:P)이 14인 야생형 세네카 밸리(Seneca Valley) 바이러스(SVV)를 암호화하는 RNA 분자를 캡슐화한다. 총 지질 농도는 40 mM로 설정하였다. RNA 산성화 완충액은 말산 pH 3이었다. LNP를 밤새 적절한 완충액(25 mM Tris, 50 mM 슈크로스, 113 mM NaCl, pH 7.4)으로 투석하고 투석 후 0.2 μm 필터를 통과시켰다. 다양한 농도로 희석하는 동안 각 동결 보호제(프로필렌 글리콜(PG), BRIJ™ S100(폴리에틸렌 글리콜), Tween 80(T80))을 LNP에 첨가하였다. 부형제가 없는 대조군과 비교하여 각 동결-보호제의 3개 농도를 조사하였다.
동결/해동 실험을 위해, 0.5 mL 바이알을 2mL 유리 바이알에 0.5 mg/mL RNA 농도의 LNP로 충전하였다. 바이알을 밤새 -20℃에서 동결시킨 후 25℃ 수조에서 신속하게 해동시켰다. 모든 샘플에 대해 시간 0 특징 분석을 수행하였다. 0.5 mL의 샘플 용적을 -20℃에서 적어도 18시간 동안 동결한 후 25℃ 수조에서 30분 동안 해동하였다. 해동이 완료되면 바이알을 뒤집어 혼합하고 1차 동결/해동(F/T) 후 특징 분석을 수행하였다. 크기는 동적 광산란(DLS)으로 측정하였고(도 1a), 캡슐화 효율은 RiboGreen RNA 정량 시약을 사용하여 형광 기반 용액 검정으로 측정하였다(도 1b).
이들 조건 중에서 완충액(25 mM Tris, 50 mM 슈크로스, 113 mM NaCl, pH 7.4)에 0.25 mM Brij S100을 첨가하면 -20℃에서 단일 동결/해동 주기 후 입자 크기와 캡슐화 둘 다를 유지하는 데 가장 효과적으로 작용하였다.
실시예 4: LNP 제형 중에 PEG-지질 성분으로서 PEG2k-DPG, PEG2k-DMG 및 BRIJ™ S100의 비교
비-복제 SVV RNA(SVV-neg)를 캡슐화하는 SS-OC:콜레스테롤:DSPC:PEG-지질(49:28.5:22:0.5 몰%) LNP은 실시예 1에서와 같이 유사한 절차 후 제조하였다. PEG-지질은 PEG2k-DPG, PEG2k-DMG 또는 Brij S100이었다. N:P 비율은 14로 설정하였다. 총 지질 농도는 40 mM로 설정하였다. 유기상 주사기에 60℃ 열을 가하면서 제형을 12 mL/min에서 3:1 수성:유기 용적 비율로 혼합하였다. 제형을 1X PBS pH 7.2에 대해 적어도 18시간 동안 투석하였다. 특징 분석은 투석 후 수행하였다. 제형은 100 kD Amicon 원심분리 여과 유닛을 사용하여 농축시켰다. 특징 분석은 농축 후 수행하였고 투석 후 특징 분석과 비교하였다. 크기는 동적 광 산란에 의해 측정하였고(도 2a) 캡슐화 효율은 RiboGreen 에 의해 측정하였다(도 2b).
결과는 Brij S100이 LNP 제형을 위해 PEG2k-DPG 또는 PEG2k-DMG를 대체하여 사용될 수 있음을 보여주었다. 본 특정 실시예에서, 입자 크기는 Brij S100을 포함하는 LNP에 대해 보다 컸다.
실시예 5: Brij를 포함하는 LNP는 반복체 투여 시 변경된 생체내 약동학적 특징을 나타냈다.
SVV-neg/SS-OC:콜레스테롤:DSPC:PEG-지질 (49:28.5:22:0.5 몰%) LNP는 하기 표 4에 따라 제조하였다. PEG-지질은 PEG2k-DPG 또는 Brij S100이었다.
[표 4]
제형은 반복 투여 (2주 동안 주당 투여 스케줄, Q7x2) 정맥내 (IV) 마우스 PK 연구. 투여 후 혈청에서 RNA의 카피수는 각각의 시점에서 측정하였다. 결과는 도 3a (PEG2k-DPG에 대해) 및 도 3b(Brij S100에 대해)에 나타낸다.
PEG2k-DPG를 포함하는 LNP는 제1 투여 후 연장된 순환을 나타냈고 제2 투여 시 4시간 이내에 신속하게 제거되었다. Brij S100을 포함하는 LNP는 제1 투여 후 노출에서 중간 변화를 나타냈지만 제2 투여시 유사한 순환 특징 및 제거 기울기를 유지하였다.
실시예 6: 보다 낮은 지질 농도 및 RNA 완충액 변화로 Brij 분자로 제형화된 LNP의 크기 감소 및 캡슐화 효율성 증가
SVV-neg/SS-OC:콜레스테롤:DSPC:Brij를 포함하는 LNP는 4가지 상이한 지질 몰% 비율: 49:28.5:22:0.5, 49:27.5:22:1.5, 49:39.5:11:0.5 및 49:38.5:11:1.5로 제조되었다. Brij 분자는 Brij C20, Brij O20, Brij S20 또는 Brij S100이었다. N:P 비율은 SS-OC에 2개의 이온화 가능한 아민이 있음을 나타내는 14로 설정되었다. LNP 제조는 이전 실시예와 유사한 절차를 따랐다. 그러나 총 지질 농도는 40 mM에서 20 mM로 변화되었고, RNA 산성화 완충액은 20 mM 말산 pH 3에서 25 mM 아세테이트 pH 5로 변화시켰다. 혼합하는 동안 어떠한 열도 없이 제형을 3:1 수성:유기 용적비로 12 mL/min으로 혼합하였다. 제형을 1X PBS pH 7.2에 대해 적어도 18시간 동안 투석하였다. 제형은 100 kD Amicon 원심분리 여과 유닛을 사용하여 농축시켰다. 특징 분석을 수행하였다. 크기는 동적 광 산란에 의해 측정하였고(도 4a) 캡슐화 효율은 RiboGreen에 의해 측정하였다(도 4b). 재현성을 보장하기 위해 각각의 고유한 조성을 별도의 날에 적어도 2회 제형화하였다.
결과는 지질 농도를 감소시키고 RNA 산성화 완충액을 변화시키면 반복 투여 마우스 PK 연구 동안에 실시예 3에 사용되었던 이전 OC/Brij S100 제형(40 mM 총 지질, 20 mM 말산 pH 3)과 비교하여 모든 Brij 분자에 걸쳐 및 각각의 몰 조성에서 보다 작은 입자 크기 및 보다 높은 캡슐화를 초래하였음을 보여주었다.
실시예 7: Brij 및 종양용해 바이러스 RNA를 포함하는 LNP는 동물 모델에서 높은 항종양 효능을 입증한다.
SVV-wt/SS-OC:콜레스테롤:DSPC:PEG-지질 LNP는 하기 표 5에 따라 제조하고 특징 분석하였다. PEG-지질은 PEG2k-DPG, Brij S100, Brij C20 또는 Brij S20이다. PDI: 다분산 지수; %EE: 캡슐화 효율; ZP: 제타 전위.
[표 5]
H446 종양 모델에서 반복 투여 IV 마우스 효능 스크리닝에 제형을 사용하였다. 종양 용적(도 5a) 및 체중(도 5b)은 각각의 시점에서 측정하였다. 결과는 모든 제형이 높은 항종양 효능을 나타냈고 내약성이 양호함을 보여주었다. SS-OC/Brij LNP는 SS-OC/PEG2k-DPG와 비교하여 효능 및 내약성이 유사하였다.
또 다른 연구에서, SVV-wt/이온화 가능한 지질:콜레스테롤:DSPC:Brij S100(49:28.5:22:0.5 또는 49:38.5:11:1.5 몰%) LNP를 하기 표 6에 따라 제조하였다. 이온화 가능한 지질은 COATSOME® SS-OC 또는 COATSOME® SS-OP이었다.
[표 6]
H446 종양 모델에서 반복 투여 IV 마우스 효능 스크리닝에 제형을 사용하였다. 종양 용적(도 6a) 및 체중(도 6b)는 각각의 시점에서 측정하였다. 결과는 모든 제형이 높은 항종양 효능을 나타냈고 내약성이 양호함을 보여주었다. SS-OC/Brij 및 SS-OP/Brij LNP는 효능 및 내약성이 유사하였다.
실시예 8: Myrj를 포함하는 LNP의 특징분석
SVV-neg/OC:콜레스테롤:DSPC:Myrj S40(49:28.5:22:0.5 또는 49:27.5:22:1.5 또는 49:39.5:11:0.5 또는 49:38.5:11:1.5 몰%) LNP를 제조하였다. Brij S100 대조군도 포함되었다(OC:Chol:DSPC:Brij S100의 49:28.5:22:0.5 몰%). N:P 비율은 SS-OC에 2개의 이온화 가능한 아민이 있음을 나타내는 14로 설정되었다. 총 지질 농도는 20 mM이었고 RNA 산성화 완충액은 25 mM 아세테이트 pH 5였다. 혼합하는 동안 어떠한 열도 없이 제형을 3:1 수성:유기 용적비로 12 mL/min으로 혼합하였다. 제형을 1X PBS pH 7.2 또는 25 mM Tris, 50 mM 슈크로스, 113 mM NaCl, pH 7.4 완충액에 대해 적어도 18시간 동안 투석하였다. 제형은 100 kD Amicon 원심분리 여과 유닛을 사용하여 농축시켰다. LNP 크기는 동적 광 산란에 의해 측정하였고(도 7a) 캡슐화 효율은 RiboGreen에 의해 측정하였다(도 7b). 재현성을 보장하기 위해 각각의 고유한 조성을 별도의 날에 적어도 3회 제형화하였다.
결과는 PEG-지질로서 Myrj S40을 사용하여 제형화된 LNP가 시험된 4개의 몰 조성에 걸쳐 PEG-지질로서 Brij S100과 비교하여 유사한 크기 및 캡슐화 효율을 나타냄을 보여주었다.
실시예 9: CVA21 암호화 RNA의 정맥내 전달을 위한 지질 나노입자의 제형화
CVA21 게놈을 포함하는 재조합 RNA 분자는 생체 내에서 RNA를 전달하기 위해 지질 나노입자로 제형화하였다.
지질 나노입자 생성: 지질 나노입자의 제형에 사용되는 지질(예를 들어, 양이온성 지질, PEG-지질, 헬퍼 지질)은 다음 중에서 선택된다:
D-Lin-MC3-DMA (MC3);
N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP)
COATSOME® SS-LC (이전 명칭: SS-18/4PE-13);
COATSOME® SS-EC (이전 명칭: SS-33/4PE-15);
COATSOME® SS-OC;
COATSOME® SS-OP;
디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L-319) 콜레스테롤;
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC);
1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE);
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC);
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE);
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-5000](DSPE-PEG5K);
1,2-디팔미토일-rac-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(PEG2k-DPG);
1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DSG-PEG2K);
1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌-2000(DMG-PEG2K);
폴리옥시에틸렌 (100) 스테아릴 에테르(BRIJ S100; CAS 번호: 9005-00-9);
폴리옥시에틸렌 (20) 스테아릴 에테르(BRIJ S20; CAS 번호: 9005-00-9);
폴리옥시에틸렌 (20) 올레일 에테르(BRIJ O20; CAS 번호: 9004-98-2);
폴리옥시에틸렌 (20) 세틸 에테르(BRIJ C20; CAS 번호: 9004-95-9);
폴리옥시에틸렌 (40) 스테아레이트 (MYRJ S40, CAS 번호: 9004-99-3).
지질은 에탄올에서 다양한 비율로 제조하였다. 이어서, 2 mL/min(에탄올, 지질 혼합물의 경우 0.5 mL/min, 수성 완충액, RNA의 경우 1.5 mL/min)의 결합 유속으로 미세유체 미세혼합물(Precision NanoSystems, Vancouver, BC)을 사용하여 RNA 지질 나노입자를 생성하였다. 수득한 입자를 Ca 및 Mg를 함유하는 PBS를 사용하여 접선 유동 여과로 세척하였다.
지질 나노입자의 물리적 특징 분석: 접선유동여과 전과 후에 지질나노입자의 물리적 특징을 평가하였다. 입자 크기 분포 및 제타 전위 측정은 Malvern Nano-ZS Zetasizer(Malvern Instruments Ltd, Worcestershire, UK)를 사용하여 광 산란에 의해 결정되었다. 크기 측정은 pH 7.4의 HBS에서 수행되었고 제타 전위 측정은 pH 7.4의 0.01M HBS에서 수행되었다. RNA 포획 퍼센트는 Ribogreen 검정으로 측정하였다. 80% 초과의 RNA 포획을 보여주는 지질 나노입자를 생체 내에서 시험하였다.
실시예 10: CVA21-RNA를 포함하는 LNP의 생체내 연구
LNP에 캡슐화된 콕사키바이러스 A21(CVA21)-RNA의 항종양 효능을 뮤린 SK-MEL-28 흑색종 모델을 사용하여 생체 내에서 평가하였다. 이들 실험을 위해, CVA21-RNA 바이러스 게놈을 49:22:28.5:0.5 몰%의 SS-OC:DSPC:Chol:BRIJ S100의 몰비를 포함하는 LNP에 캡슐화하였다. 일부 구현예에서, LNP의 크기는 94 nm였고; PDI는 0.19였고; %EE는 91%였다.
간략하게, 흉선이 없는 누드 마우스에 SK-MEL-28 사람 흑색종 종양을 피하 이식하고, 1일차와 8일차에 CVA21-RNA(0.2 mg/kg 또는 0.05 mg/kg)를 포함하는 2가지 용량의 LNP 중 하나를 IV 투여하여 치료하였다. 종양 성장(도 8a 및 도 8c) 및 체중 변화(도 8b 및 도 8d)를 모니터링하였다. PBS 완충액을 대조군으로서 사용하였다.
0.05 mg/kg 정도의 낮은 용량 수준에서 완전한 종양 퇴행이 관찰되었다(도 8b). 안정적인 체중(도 8b 및 도 8d)에 의해 지적된 바와 같이 용량 둘 다는 내약성이 양호하였고 불리한 임상 징후는 없었다. 낮은 수준의 CVA21 복제는 CVA21 마이너스 가닥에 대한 RT-qPCR과 주사 후 2일에 비장, 간, 폐, 심장 및 콩팥에서 플라크 역가 검정에 의해 검출되었다. 그러나 이는 7일째에는 검출할 수 없었고(도 8e), 이는 마우스가 감염을 제거했음을 나타낸다. 결과는 Brij S100을 포함하는 LNP에 캡슐화된 CVA21이 높은 항종양 효능을 나타냈고 내약성이 양호하다는 것을 보여주었다.
실시예 11: 상이한 이온화 가능한 지질을 포함하는 LNP의 제형
상기 실시예는 LNP 제형에서 비-복제 세네카 밸리 바이러스(SVV) RNA(SVV-Neg)의 캡슐화를 설명한다. 본 실시예에서 LNP는 이온화 가능한 지질(CAT):DSPC:콜레스테롤:PEG2k-DMG의 지질 조성을 50:7:40:3 몰%로 포함한다. 미세유체 장치(Precision NanoSystems Inc.)를 사용하여 에탄올의 지질 혼합물을 지질-질소-대-포스페이트 비율(N:P) 9로 RNA 산성화 완충액(50 mM 시트레이트, pH 4)에서 SVV-Neg와 혼합하였다. 총 지질 농도는 20 mM로 설정하였다.
LNP를 12-16시간 동안 50 mM 포스페이트, pH 6.0에 대해 투석하였고, 실온에서 4-24시간 동안 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 263 mM 슈크로스, pH 7.3에 대해 2차 투석을 수행하였다. 투석 후 LNP를 100 kDa AMICON® ULTRA CENTRIFUGAL 필터(MilliporeSigma)를 사용하여 농축하고 0.2 μm 주사기 필터를 사용하여 멸균 여과하였다. 이어서 샘플을 특징 분석하고 필요에 따라 희석하였다. 샘플을 -20℃에서 보관하는 경우 희석 시 5 w/v% 글리세롤 스파이크를 첨가하였다.
LNP의 입자 크기는 동적 광 산란(DLS)(도 10a) 및 다분산 지수(PDI)(도 10b)에 의해 특징 분석되었다. 캡슐화 효능은 형광 기반 RiboGreen 검정을 사용하여 측정되었다(도 10c). 간략하게, 적절한 RNA를 사용하여 표준 곡선을 생성하였고; 시험 LNP 샘플을 TE 완충액으로 40X 희석하고 캡슐화되지 않은 RNA(Rf)의 양을 산출하기 위해 평가하고 Triton-X로 희석하여 총 RNA(Rt)의 양을 생성하였다. 전체 RNA(Rt)에 대한 Rt와 Rf의 차이는 캡슐화 효율(%EE)이다.
[표 7] LNP 제형 및 특징 분석
실시예 12: 정제된 RNA는 LNP 생물물리학적 성질을 개선시킨다.
SVV-Neg RNA를 캡슐화하는 LNP 제형을 실시예 11에 기재된 바와 같이 제조하고 특징 분석하였다. SVV-Neg RNA는 접선 유동 여과(TFF)를 사용하거나 올리고-dT 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 올리고-dT 및 역상 크로마토그래피 정제된 SVV-Neg RNA를 캡슐화하는 시험된 LNP 제제는 비교적 높거나 추가로 향상된 캡슐화 효율(도 11c)과 함께 입자 크기 및 PDI가 감소되었다(도 11a 및 11b).
실시예 13: RNA 산성화 완충액의 변형은 LNP 생물물리학적 성질을 개선시킨다.
SVV-Neg RNA를 캡슐화하는 LNP 제형을 실시예 11에 기재된 대로 제조하고 특징 분석하였지만, 시트레이트 농도와 pH를 변화시키는 효과가 LNP 생물리학적 성질에 미치는 영향을 결정하기 위해 RNA 산성화 완충액을 변화시켰다.
CAT4 및 CAT5 제형은 RNA 산성화 완충액과 함께 시험하였다: (1) 50 nM 시트레이트 pH4; (2) 5 mM 시트레이트 pH 3.5; (3) 15 mM 시트레이트 pH 3.5; (4) 30 mM 시트레이트 pH 3.5; 및 (5) 50 mM 시트레이트 pH 3.5. 도 12a, 12b 및 13c는 LNP의 입자 크기, PDI 및 캡슐화 효율을 도시 한다. 추가로, CAT1 내지 CAT3, CAT6 내지 CAT10 및 CAT35 LNP 제형을 5 mM 시트레이트 pH 3.5 완충액을 사용하여 제조하였다(도 13a, 13b 및 13c).
결과는 RNA 산성화 완충액을 변화(예를 들어, 염 농도를 저하시키는)하면 입자 크기와 PDI가 보다 작아짐을 시사하였다.
실시예 14: LNP 제형은 -20℃ 및 -80℃ 둘 다에서 안정하다
SVV-neg RNA를 캡슐화하는 CAT:DSPC:콜레스테롤:PEG2k-DMG(50:7:40:3 몰%) LNP를 실시예 11에서와 유사한 절차에 따라 제조하였다. 시험된 이온화 가능한 지질은 CAT3, CAT4, 및 CAT5였다. 사용된 RNA 산성화 완충액은 5 mM 시트레이트, pH 3.5였다. 냉동-보호제(5 w/v% 글리세롤)는 LNP 희석액에 첨가하였다. 이어서 생물물리학적 파라미터를 측정하기 전에 LNP 제형을 -20℃ 또는 -80℃에서 1주 또는 1개월 동안 저장하였다.
결과는 도 14a(-20℃) 및 도 14b(-80℃)에 나타낸다. 입자 크기와 캡슐화 효율은 시험된 시점에 -20℃에서 모든 제형에 대해 동일하게 유지되었다. 입자 크기는 감소하였고, 캡슐화 효율은 시험된 시점에 -80℃에서 모든 제형에 대해 동일하게 유지되었다.
실시예 15: 상이한 이온화 가능한 지질을 포함하는 LNP의 생체내 연구
LNP에 캡슐화된 세네카 밸리 바이러스(SVV)-RNA의 생체내 약력학 및 항종양 효능을 소세포폐암(SCLC)에 대한 마우스 모델에서 평가하였다.
본 실시예에서는 SVV 바이러스 게놈과 NanoLuc 루시퍼라제(NLuc)를 암호화하는 RNA 분자를 하기 표 8에 따라 제조된 LNP에 캡슐화하였다. NLuc는 기질 퓨리마진과 함께 제공될 때 발광 신호를 생성하는 루시퍼라제 효소이다. LNP는 5℃에서 100 mM tris 300 mM 슈크로스 113 mM NaCl pH 7.4에서 밤새 투석하였다. 대안적으로, LNP를 12-16시간 동안 50 mM 포스페이트, pH 6.0에 대해 투석하였고, 실온에서 4-24시간 동안 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 263 mM 슈크로스, pH 7.3에 대해 2차 투석을 수행하였다. 투석 후 LNP 제형을 농축시키고, 여과하고, 특징 분석하고, 선택적으로 희석하였다.
[표 8] 생체내 연구를 위한 LNP 제형
NCI-H446 사람 SCLC 세포(무혈청 PBS 및 Matrigel®의 1:1 혼합물 중 5x106개 세포/0.1 mL)를 8주령 암컷 무흉선 누드 마우스(Charles River Laboratories)의 우측 옆구리에 피하 접종하였다. 중앙 종양 크기가 대략 150 mm3(120-180 mm3 범위)에 도달했을 때, 1일째 또는 1일과 8일째에 마우스에게 0.2 mg/kg의 PBS 또는 SVV-RNA를 포함하는 LNP를 정맥내 투여하였다. 생물발광(BLI)은 투여 후 96시간에 광학적 imagine IVIS Lumina(PerkinElmer)를 사용하여 평가하였고, 신호는 Molecular Imaging 소프트웨어를 이용하여 정량화하였다(도 16a-16f). 종양 용적 및 체중은 주당 3회 평가하였다(도 17a-17e).
2회 0.2mg/kg 용량 후 종양 퇴행은 CAT1 내지 CAT5 제형에 대해 관찰되었고(도 17a, 좌측), 모든 제형은 내약성이 양호하였다(도 17a, 우측). 단일 0.2 mg/kg 용량에서 종양 퇴행은 CAT6-CAT9, CAT11, CAT16-CAT17, CAT19-CAT24, CAT26, CAT29, CAT32 및 CAT34 제형(도 17b-17e, 좌측) 및 모든 제형에 대해 내약성이 양호하였다(도 17b-17e, 우측). 단일 0.2 mg/kg 용량에서 종양 퇴행은 CAT12-CAT13, CAT15, CAT18, 및 CAT28 제형(도 17b-17e, 좌측) 및 모든 제형에 대해 내약성이 양호하였다(도 17b-17e, 우측).
실시예 16: CAT7 및 다양한 PEG-지질을 포함하는 LNP의 생체내 연구
다양한 지질 조성을 갖는 LNP에 캡슐화된 SVV-RNA의 생체 내 약력학 및 항종양 효능을 소세포 폐암(SCLC)에 대한 마우스 모델에서 평가하였다. SVV 바이러스 게놈 및 NLuc를 암호화하는 RNA 분자는 실시예 11에 기재된 유사한 절차에 따라 하기 표 9에 따라 제조된 LNP에 캡슐화하였다. 총 지질 농도는 20 mM로 설정되었으며 지질-질소-포스페이트 비율(N:P)은 9였다.
[표 9] 생체내 연구를 위한 LNP 제형
SVV-NanoLuc-캡슐화된 LNP의 약력학(생물발광 검정을 통해 평가됨) 및 종양 성장 억제 능력을 실시예 15에 기재된 바와 같이 평가하였다.
나노루시퍼라제는 주사 후 72시간에 검출 가능하며, 이는 지속적인 SVV를 나타낸다(도 18a). 단일 0.2 mg/kg 용량에서 완전한 종양 퇴행이 모든 시험된 제형에 대해 관찰되었고, 모든 제형은 내약성이 양호하였다(도 18b).
실시예 17: LNP 제형의 약동학적 평가
콕사키바이러스 A21(CVA21)-RNA-캡슐화 LNP 제형의 약동학(PK)을 래트에서 평가하였다.
본 실시예에서, CVA-21 바이러스 게놈을 암호화하는 RNA 분자는 실시예 11에 기재된 것과 유사한 절차에 따라 하기 표 10에 따라 제조된 LNP에 캡슐화하였다.
[표 10] 약동학 연구를 위한 LNP 제형
나이브 암컷 스프라그 돌리(Sprague Dawley), JVC 래트(연령: 12주)에게 1일과 15일째(Q2W2) 또는 1일과 8일째(Q1W2)에 LNP에 포함된 바이러스 게놈 1 또는 0.3 mg/kg을 정맥 내 투여하였다. 혈장 샘플은 소정의 시간에 수거하였다. 혈장 중 LNP (SS-OC, CAT7, 또는 CAT11)에 포함된 이온화 가능한 지질의 농도는 LC-MS (도 19a-19e, 20a-20d, 21a-21f, 및 22a-22e)에 의해 측정하고 약동학적 파라미터를 계산하고 표 11에 요약하였다. IgM 및 IgG 수준은 효소 연결된 면역검정(ELISA)에 의해 분석하였다(도 23a-23b 및 도 24a-24b).
[표 11-1] 약동학적 파라미터
[표 11-2] 약동학적 파라미터
다양한 비율 및/또는 유형의 PEG-지질을 함유한 LNP 제형은 다중 투여 후 다양한 T1/2, 노출 및 소거율을 나타낸다. 이러한 데이터는 LNP 조성물이 장기간 노출 또는 단기 노출에 대한 다양한 치료학적 페이로드의 요구를 충족하도록 조정될 수 있음을 지적한다.
LNP 제형 투여 후 항-PEG IgM 수준은 낮았고 7일부터 21일까지 감소하였다(도 23a 및 도 23b). 항-PEG IgG는 또한 낮았고 다중 용량으로 유의적으로 증가하지 않았고, 이는 면역원성에 대한 낮은 잠재력을 나타낸다(도 24a 및 도 24b). 시험된 제형 중에서 이온화 가능한 지질로서 CAT7을 포함하고 PEG-지질로 CHM-006을 포함하는 LNP가 가장 낮은 IgM 및 IgG 수준으로 관찰되었다.
실시예 18: mRNA를 캡슐화하는 LNP의 제형화
약 8:1 내지 20:1의 N:P 비율로 mRNA를 캡슐화하는 SS-OC:콜레스테롤:DSPC:PEG-지질 LNP를 제조하였다. PEG-지질은 PEG2k-DPG, PEG2k-DMG 또는 Brij S100이다. 총 지질 농도는 약 10 내지 약 60 mM이다. 제형은 혼합하고 투석하고 농축시켰다. 크기는 동적 광 산란으로 측정하고 캡슐화 효율은 RiboGreen으로 측정한다. 결과는 Brij S100이 mRNA LNP 제형을 위해 PEG2k-DPG 또는 PEG2k-DMG를 대체하여 사용될 수 있음을 보여준다.
본 실시예에서 mRNA LNP 제형은 마우스에서 정맥내 투여를 통해 반복 투여 시 약동학적 특징에 대해 시험된다. 투여 후 혈청에서 RNA의 카피수는 소정의 시점에서 측정한다. 결과는 Brij S100을 사용하여 제형화된 LNP가 PEG-2k DPG 또는 PEG2k-DMG를 사용하여 제형화된 LNP와 비교하여 제2 투여 시 감소된 소거율을 나타냄을 보여준다.
실시예 19: mRNA를 캡슐화하는 LNP의 제형
본 실시예는 지질 나노입자(LNP) 제형에서 mRNA의 캡슐화를 설명한다. 본 실시예에서 LNP는 54.5 : 20 : 25 : 0.5 몰%의 CAT7 : DSPC : 콜레스테롤 : CHM-006의 지질 조성물을 포함한다. 에탄올 중의 지질 혼합물을 RNA 산성화 완충액(5 mM 시트레이트, pH 3.5) 중의 사람 에리트로포이에틴(hEPO) mRNA 또는 이중특이적 T 세포 인게이져(BiTE) 암호화 mRNA와 혼합하였다. 총 지질 농도는 20 mM로 설정되었으며 지질-질소-포스페이트 비율(N:P)은 9였다.
LNP를 12-16시간 동안 50 mM 포스페이트, pH 6.0에 대해 투석하였고, 실온에서 4-24시간 동안 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 263 mM 슈크로스, pH 7.3에 대해 2차 투석을 수행하였다. 투석 후 LNP를 100 kDa AMICON® ULTRA CENTRIFUGAL 필터(MilliporeSigma)를 사용하여 농축하고 0.2 μm 주사기 필터를 사용하여 멸균 농축하였다. 이어서 샘플을 특징 분석하고 필요에 따라 희석하였다. 투석 시, 5 w/v% 글리세롤 스파이크는 샘플이 -20℃에서 저장한 경우 첨가하였다.
LNP 크기는 DLS로 측정하였고, 캡슐화 효능은 형광 기반 RiboGreen 검정을 사용하여 측정하였다(표 12).
[표 12] LNP-제형화된 mRNA
실시예 20: LNP 제형화된 mRNA의 약동학
mRNA-캡슐화 LNP 제형(표 12)의 PK를 마우스에서 평가하였다.
나이브 암컷 Balb/c 마우스에 1 mg/kg의 LNP를 투여하였다. 3마리의 마우스를 각각의 소정의 시점에서 채혈하고 이후 분석을 위해 혈장을 -80℃에서 동결시켰다. hEPO 및 BiTE의 혈장 수준은 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery(MSA)) 전기화학발광(ECL) 검정에 의해 측정하였다(도 25a 및 도 25b). 고수준의 단백질 발현 및 연장된 노출이 관찰되었다.
실시예 21: 다양한 길이를 갖는 LNP-제형화된 RNA
다양한 길이의 RNA를 캡슐화하는 LNP 제형은 실시예 11에 기재된 것과 유사한 절차에 따라 하기 표 13에 따라 제조하였다.
[표 13] LNP 제형
데이터는 LNP가 캡슐화된 RNA의 다양한 길이에도 불구하고 우수한 생물리학적 성질(예를 들어, 작은 크기 및 PDI, 높은 %EE)을 유지했음을 보여준다.
실시예 22: CAT7을 포함하는 LNP의 제형 연구 및 모델링
A-최적 기준(Jones 등 2021)을 사용하여 CAT7을 포함하는 LNP의 제형 연구를 디자인하고(도 26) 20개의 실험 디자인(DOE) 실행을 산출하였다(표 14). 총 지질 농도는 20 mM로 설정하였고 N:P 비율은 9로 설정하였다. 디자인 공간에서는 CAT7의 이온화 가능한 지질 40~60몰%, DSPC의 보조 지질 5~20몰%, 콜레스테롤의 구조적 지질 25~50 몰%, DMG-PEG2000 또는 CHM-001의 PEG 지질 0.25~3%를 포함하는 LNP를 시험하였다.
[표 14] CAT7 LNP에 대한 실험 디자인
신뢰할 수 있는 디자인 공간의 파라미터 내에서 DOE 최적 조성은 54.5:20:25:0.5의 몰% 비율을 갖는 CAT7:DSPC:콜레스테롤:PEG-지질로 결정되었다.
자가 인증 앙상블 모델링(Self-Validated Ensemble Modeling(SVEM)) 방법(Lemkus 등 2021)을 사용하여 다양한 조성으로 LNP의 생물물리학적 특징을 예측하고 다양한 목적하는 결과를 위해 LNP 시스템을 동정하고 미세 조정하기 위한 모델을 제형화하는 데 사용되었다. 모델을 개발하는데 있어서, 목표는 PDI(가중치 1)와 크기(가중치 0.1)를 최소화하는 것이었다.
수득한 예측 프로파일러는 도 27에 나타낸다. CAT7, DSPC 및 콜레스테롤에 대해 2차(곡률 또는 비선형) 관계가 나타난다. CAT7 조성은 처음에는 40몰%에서 시작하여 증가 추세를 보인 후 ~55 몰%에서 안정화되는 하향 추세로 PDI에 큰 영향을 미치는 것으로 보인다. DSPC가 높을수록 PDI와 크기 둘 다 감소하는 것으로 보인다. 콜레스테롤은 PDI와 크기 둘 다에서 CAT7과 매우 유사한 패턴을 따르지만 모델은 보다 낮은 몰 조성을 선택한다. PEG 지질 조성의 증가는 관찰된 PDI의 급격한 증가와 연관되어 있다.
등가물 및 범위
청구범위에서 "a", "an" 및 "the"와 같은 관사는 반대로 언급되지 않거나 달리 문맥에서 분명하지 않은 경우 하나 초과를 의미할 수 있다.　 그룹의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는" 을 포함하는 특허청구범위 또는 상세한 설명은 그룹 구성원의 1개, 1개 이상 또는 모두가 존재하거나 사용되거나 달리 주어진 물건 또는 방법과 관련되지 않거나 달리 이와 반대로 명시되지 않거나 달리 문맥으로부터 명백하지 않다면, 만족스로운 것으로 간주된다. 본원 개시내용은 그룹의 정확히 하나의 구성원이 존재하거나 사용되거나 달리 주어진 물건 또는 방법과 관련되지 않는 실시형태를 포함한다. 본원 개시내용은 그룹의 정확히 하나 이상 또는 모든 구성원이 존재하거나 사용되거나 달리 주어진 물건 또는 방법과 관련되지 않는 실시형태를 포함한다.
추가로, 본원 개시내용은 나열된 청구범위 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 조항 및 설명 용어가 다른 청구범위에 도입되는 모든 변형, 조합 및 순열을 포함한다. 예를 들어, 다른 청구항에 종속된 모든 청구항은 동일한 기본 청구항에 종속된 다른 청구항에서 발견된 하나 이상의 제한 사항을 포함하도록 변형될 수 있다. 요소가 목록으로 예를 들어, 마쿠시(Markush) 그룹 형식으로 제공되는 경우, 요소의 각 서브 그룹도 기재되며 그룹에서 모든 요소를 제거할 수 있다. 일반적으로, 본원 개시내용 또는 본원 개시내용의 양상이 특정 요소 및/또는 특성을 포함하는 것으로 언급되는 경우, 본원 개시내용의 특정 실시예 또는 본원 개시내용의 양상은 그러한 요소 및/또는 특성으로 이루어지거나 필수적으로 이루어진 것으로 이해되어야 한다.　 단순화를 위해, 이들 구현예는 본원에서 구체적으로 설명되지 않았다.　 또한 "포함하는" 및 "함유하는"이라는 용어는 개방적인 것으로 의도되고 추가 요소 또는 단계의 포함을 허용한다는 점에 주지한다. 범위가 주어지는 경우, 종점은 포함된다.　 또한, 달리 나타내지 않거나 당업자의 문맥 및 이해로부터 달리 명백하지 않는 한, 범위로 표현된 값은 본원 개시내용의 상이한 구현예에서 명시된 범위 내의 임의의 특정 값 또는 하위 범위를 달리 명시하지 않는 한 범위의 하한치의 10분의 1까지추정할 수 있다.
본 출원은 다양한 발행된 특허, 공개된 특허 출원, 저널 기사 및 기타 간행물을 언급하며, 이들 모두는 참조로 본원에 포함된다. 인용된 참고문헌과 현재 명세서 사이에 상충되는 내용이 있는 경우에는 본 명세서가 우선한다. 또한, 종래 기술 내에 속하는 본원 개시내용의 임의의 특정 구현예는 임의의 하나 이상의 특허청구범위로부터 명시적으로 배제될 수 있다. 이러한 구현예는 통상의 기술자에게 알려져 있는 것으로 간주되기 때문에, 배제가 본원에서 명시적으로 설명되지 않을 지라도, 이들은 배제될 수 있다. 본원 개시내용의 임의의 특정 구현예는 선행 기술의 존재 여부와 관계없이 임의의 이유로 인해 임의의 청구범위에서 제외될 수 있다.
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 특정 구현예에 대한 많은 등가물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다.　 본원에 기재된 본 구현예의 범위는 상기로 제한되는 것으로 의도되지 않지고 차라리 첨부된 특허청구범위에 제시된 바와 같다. 당업자는 다음의 청구범위에 정의된 바와 같이 본원 개시내용의 취지 또는 범위를 벗어나지 않고 본원 개시내용에 대한 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

Claims (175)

  1. 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물:
    화학식 I

    상기 식에서:
    A는 -N(CH2RN1)(CH2RN2) 또는 적어도 하나의 N을 함유하는 4-7원 헤테로사이클릴 환이고, 여기서 4-7원 헤테로사이클릴 환은 0-6개의 R3으로 임의로 치환되고;
    각각의 X는 독립적으로 -O-, -N(R1)-, 또는 -N(R2)-이고;
    R1은 임의로 치환된 C1-C31 지방족 및 스테로이딜로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2는 임의로 치환된 C1-C31 지방족 및 스테로이딜로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R3은 임의로 치환된 C1-C6 지방족이고;
    RN1 및 RN2는 각각 독립적으로 수소, 하이드록시-C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 또는 C3-C7 사이클로알킬이고;
    L1은 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 쇄 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L2는 임의로 치환된 C1-C20 알킬렌 쇄 및 임의로 치환된 2가의 C2-C20 알케닐렌 쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L3은 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌 쇄, 또는 임의로 치환된 2가 C3-C7 사이클로알킬렌이고;
    단, A가 -N(CH3)(CH3)이고 X가 O인 경우, L3은 C1-C6 알킬렌 쇄임.
  2. 청구항 1에 있어서, R1 및 R2가 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1-C31 알킬 또는 임의로 치환된 C2-C31 알케닐인, 화합물.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, R1 및 R2가 동일한, 화합물.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2가 각각 독립적으로 임의로 치환된 C10-C20 알킬인, 화합물.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2가 각각 독립적으로 분지된 C10-C20 알킬인, 화합물.
  6. 청구항 1 또는 2에 있어서, R1 및 R2가 상이한, 화합물.
  7. 청구항 1, 2 및 6 중 어느 한 항에 있어서, R1이 임의로 치환된 C6-C20 알케닐이고, R2가 임의로 치환된 C10-C20 알킬인, 화합물.
  8. 청구항 1, 2, 6 및 7 중 어느 한 항에 있어서, R1이 C6-C20 알케닐이고, R2가 분지된 C10-C20 알킬인, 화합물.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, L1이 임의로 치환된 C1-C10 알킬렌 쇄이고, L2가 임의로 치환된 C1-C10 알킬렌 쇄인, 화합물.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, L1이 임의로 치환된 C1-C5 알킬렌 쇄이고, L2가 임의로 치환된 C1-C5 알킬렌 쇄인, 화합물.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, L1이 임의로 치환된 C1-C3 알킬렌 쇄이고, L2가 임의로 치환된 C1-C3 알킬렌 쇄인, 화합물.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, L1 및 L2가 각각 -CH2CH2CH2-인, 화합물.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, L3이 C1-C3 알킬렌 쇄인, 화합물.
  14. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, L3이 결합인, 화합물.
  15. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, L3이 2가 C3-C7 사이클로알킬렌인, 화합물.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 티올레이트의 S와 A에 포함된 가장 가까운 N 사이의 탄소 원자의 수가 2-10인, 화합물.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 티올레이트의 S와 A에 포함된 가장 가까운 N 사이의 탄소 원자의 수가 2-8인, 화합물.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 티올레이트의 S와 A에 포함된 가장 가까운 N 사이의 탄소 원자의 수가 2-5인, 화합물.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 티올레이트의 S와 A에 포함된 가장 가까운 N 사이의 탄소 원자의 수가 2-4인, 화합물.
  20. 청구항 1 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 티올레이트의 S와 A에 포함된 가장 가까운 N 사이의 탄소 원자의 수가 3인, 화합물
  21. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 화학식 I-a의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인, 화합물:
    화학식 I-a

    상기 식에서:
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6임.
  22. 청구항 21에 있어서, A가 하나 이상의 S를 함유하는, 화합물.
  23. 청구항 21 또는 22에 있어서, A가 정확하게 하나의 N을 함유하는 임의로 치환된 4-7원 헤테로사이클릴 환인, 화합물.
  24. 청구항 21 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, A가 임의로 치환된 5-6-원 헤테로사이클릴 환인, 화합물.
  25. 청구항 21 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, A가 정확하게 하나의 N을 함유하는 임의로 치환된 6-원 헤테로사이클릴 환인, 화합물.
  26. 청구항 21 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 화학식 I-b의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인, 화합물:
    화학식 I-b

    상기 식에서:
    n은 0, 1, 2, 또는 3이고;
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6임.
  27. 청구항 21 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, A가 3급 아민인, 화합물.
  28. 청구항 21 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 화학식 I-bii의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인, 화합물:
    화학식 I-bii

    상기 식에서:
    m은 0, 1, 2, 또는 3이고;
    p 및 q는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 또는 3이고, 여기서 q + p는 3이하임.
  29. 청구항 21 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, L3이 결합인, 화합물.
  30. 청구항 21 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, L3이 -CH2-인, 화합물.
  31. 청구항 21 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, n이 1인, 화합물.
  32. 청구항 21 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, n이 2인, 화합물.
  33. 청구항 21 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, n이 3인, 화합물.
  34. 청구항 21 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, m이 0 또는 1인, 화합물.
  35. 청구항 21 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, R3이 C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알케닐이고, 여기서, 각각의 C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알케닐은 임의로 1-3개의 C3-C6 사이클로알킬 또는 -OH로 치환되는, 화합물.
  36. 청구항 21 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, R3이 C1-C3 알킬인, 화합물.
  37. 청구항 21 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, R3이 -CH3-인, 화합물.
  38. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 화학식 I-c의 화합물인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물:
    화학식 I-c
    .
  39. 청구항 38에 있어서, X가 0인, 화합물.
  40. 청구항 38에 있어서, X가 NR1 또는 NR2인, 화합물.
  41. 청구항 38 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, RN1 및 RN2가 각각 독립적으로 수소, 하이드록시-C1-C3 알킬, C2-C4 알케닐, 또는 C3-C4 사이클로알킬로부터 선택되는, 화합물.
  42. 청구항 38 내지 41 중 어느 한 항에 있어서, RN1 및 RN2가 각각 독립적으로 수소, -CH2CH=CH2, -CH2CH2OH, , 또는 로부터 선택되는, 화합물.
  43. 청구항 38 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, RN1 및 RN2가 동일한, 화합물.
  44. 청구항 38 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, RN1 및 RN2가 상이한, 화합물.
  45. 청구항 38 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, RN1 및 RN2 중 하나가 수소이고 다른 하나가 인, 화합물.
  46. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물:


  47. 청구항 46에 있어서, 상기 화합물이
    인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물.
  48. 청구항 46에 있어서, 상기 화합물이
    인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물.
  49. 청구항 46에 있어서, 상기 화합물이
    인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물.
  50. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물:
    , 및
    .
  51. 화학식 A의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    화학식 A

    상기 식에서:
    n은 10 내지 200의 정수이고, 모든 종점이 포함되고;
    LP1은 -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
    RP1은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이고;
    RP2는 수소 또는 -CH3이고,
    단, 화학식 (A)는 HO-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)17CH3가 아님.
  52. 청구항 51에 있어서, LP1이 -CH2C(O)O-, -CH2CH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2CH2OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-인, 화합물.
  53. 청구항 51 또는 52에 있어서, 상기 화합물이 화학식 A-a, 화학식 A-b, 화학식 A-c, 화학식 A-d, 또는 화학식 A-e의 화합물인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    화학식 A-a

    화학식 A-b

    화학식 A-c

    화학식 A-d

    화학식 A-e
    .
  54. 청구항 51 내지 53 중 어느 한 항에 있어서, RP1이 C14-C18 알킬 또는 C14-C18 알케닐인, 화합물.
  55. 청구항 51 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, RP1이 C14 알킬, C16 알킬, 또는 C18 알킬인, 화합물.
  56. 청구항 51 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, n이 평균 약 20, 약 40, 약 45, 약 50, 약 68, 약 75, 또는 약 100인, 화합물.
  57. 청구항 46 내지 56 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고;
    H3CO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고;
    HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)15CH3, n은 평균 약 45이고;
    HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)13CH3, n은 평균 약 45이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45임.
  58. 청구항 1 내지 50 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 지질 나노입자(LNP).
  59. 청구항 58에 있어서, 헬퍼 지질, 구조적 지질, 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG)-지질을 추가로 포함하는 LNP.
  60. 청구항 59에 있어서, 상기 PEG-지질이 화학식 A'의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, LNP:
    화학식 A'

    상기 식에서:
    n은 10 내지 200의 정수이고, 모든 종점이 포함되고;
    LP1'은 결합, -C(O)-, -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
    RP1'은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이고;
    RP2'는 수소 또는 -CH3임.
  61. 청구항 59에 있어서, 상기 PEG-지질이 청구항 51 내지 57 중 어느 한 항의 화합물인, LNP.
  62. 청구항 59 내지 61 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, LNP:
    HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고;
    H3CO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고;
    HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)15CH3, n은 평균 약 45이고;
    HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)13CH3, n은 평균 약 45이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45임.
  63. 청구항 59 또는 60에 있어서, 상기 PEG-지질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, LNP:
    HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 100이고;
    HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 20이고;
    HO-(CH2CH2O)n-(CH2)15CH3, n은 평균 약 20이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C18H35, n은 평균 약 20임.
  64. 청구항 59 또는 60에 있어서, 상기 PEG-지질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, LNP:
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 100이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 50이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 40이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 100이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 50이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 40임.
  65. 청구항 59에 있어서, 상기 PEG-지질이 DMG-PEG(2000) 또는 DPG-PEG(2000)인, LNP.
  66. 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질, 이온화 가능한 지질, 헬퍼 지질, 및 구조적 지질을 포함하는 지질 나노입자(LNP)로서, LNP가 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖고, PEG-지질이 화학식 A''의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 지질 나노입자(LNP):
    화학식 A''

    상기 식에서:
    n은 10 내지 200의 정수이고, 모든 종점이 포함되고;
    LP1''은 결합, -[(CH2)0-3-C(O)O]1-3-, -(CH2)0-3-C(O)O-(CH2)1-3-OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-이고;
    RP1''은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐이고;
    RP2''는 수소 또는 -CH3임.
  67. 청구항 66에 있어서, LP1''이 결합, -CH2C(O)O-,-CH2CH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2C(O)O-, -CH2C(O)OCH2CH2OC(O)-, 또는 -C(O)N(H)-인, LNP.
  68. 청구항 66 또는 67에 있어서, 상기 PEG-지질이 화학식 A''-a, 화학식 A''-b, 화학식 A''-c, 화학식 A''-cd, 화학식 A''-e, 또는 화학식 A''-f의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, LNP:
    화학식 A''-a

    화학식 A''-b

    화학식 A''-c

    화학식 A''-d

    화학식 A''-e

    화학식 A''-f
    .
  69. 청구항 66 내지 68 중 어느 한 항에 있어서, RP1''이 C14-C18 알킬 또는 C14-C18 알케닐인, LNP.
  70. 청구항 66 내지 69 중 어느 한 항에 있어서, RP1''이 C14 알킬, C16 알킬, 또는 C18 알킬인, LNP.
  71. 청구항 66 내지 68 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질이 화학식 A''-f1, 화학식 A''-f2, 또는 화학식 A''-f3의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, LNP:
    화학식 A''-f1

    화학식 A''-f2

    화학식 A''-f3
    .
  72. 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질, 이온화 가능한 지질, 헬퍼 지질, 구조 지질, 및 바이러스 게놈을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 지질 나노입자(LNP)로서, 상기 LNP가 약 0.001% 내지 약 5% PEG-지질의 몰비를 갖고, 상기 PEG-지질이 화학식 (B)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 지질 나노입자(LNP):
    화학식 B

    상기 식에서:
    n은 10 내지 200의 정수이고, 모든 종점이 포함되고;
    RB1은 C5-C25 알킬 또는 C5-C25 알케닐임.
  73. 청구항 72에 있어서, RB1이 C15-C17 알킬 또는 C15-C17 알케닐인, LNP.
  74. 청구항 72 또는 73에 있어서, 상기 PEG-지질이 화학식 B-a 또는 화학식 B-b의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, LNP:
    화학식 B-a

    화학식 B-b
    .
  75. 청구항 66 내지 74 중 어느 한 항에 있어서, n이 평균 약 20, 약 40, 약 45, 약 50, 약 68, 약 75, 또는 약 100인, LNP.
  76. 청구항 66 내지 75 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질이 약 200 달톤 내지 약 10,000 달톤, 약 500 달톤 내지 약 7,000 달톤, 약 800 달톤 내지 약 6,000 달톤, 약 1,000 달톤 내지 약 5,000 달톤 또는 약 1,500 내지 약 3,500 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG 모이어티를 포함하는, LNP.
  77. 청구항 66 내지 76 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질이 약 800, 약 900, 약 1,000, 약 1,500, 약 1,750, 약 2,000, 약 2,250, 약 2,500, 약 2,750, 약 3,000, 약 3,250, 약 3,500, 약 3,750, 약 4,000, 약 4,500, 또는 약 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG 모이어티를 포함하는, LNP.
  78. 청구항 66 내지 77 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질이 약 800, 약 900, 약 1,000 달톤, 약 1,500, 약 2,000, 약 2,500, 약 3,000, 약 3,500, 약 4,000, 약 4,500, 또는 약 5,000달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG 모이어티를 포함하는, LNP.
  79. 청구항 66 내지 71 및 75 내지 78 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, LNP:
    HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 100이고;
    HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 20이고;
    HO-(CH2CH2O)n-(CH2)15CH3, n은 평균 약 20이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C18H35, n은 평균 약 20임.
  80. 청구항 66 내지 71 및 75 내지 78 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, LNP:
    HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고;
    H3CO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고;
    HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)15CH3, n은 평균 약 45이고;
    HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)13CH3, n은 평균 약 45이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45임.
  81. 청구항 72 내지 78 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-지질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, LNP:
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 100이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 50이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 40이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 100이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 50이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 40임.
  82. 청구항 66 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질이 DLinDMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA(MC3), COATSOME® SS-LC(이전 명칭: SS-18/4PE-13), COATSOME® SS-EC(이전 명칭: SS-33/4PE-15), COATSOME® SS-OC, COATSOME® SS-OP, 디((Z)-논-2-엔-1-일)9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L-319), N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는, LNP.
  83. 청구항 66 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질이 화학식 II-1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인, LNP:
    화학식 II-1

    상기 식에서:
    R1a 및 R1b는 각각 독립적으로 C1-C8 지방족 또는 -O(C1-C8 지방족)-이고, 여기서 O 원자는 존재하는 경우 피페리딘 환에 결합되고;
    Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 -C(O)O-*, -OC(O)-*, -C(O)N(Rx 1)-*, -N(Rx 1)C(O)-*, -O(C=O)N(Rx 1)-*, -N(Rx 1)(C=O)O-*, 또는 -O-이고, 여기서 -*는 각각 R2a 또는 R2b에 대한 부착점을 나타내고, Rx 1의 각각의 경우는 독립적으로 수소 및 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 스테롤 잔기, 지용성 비타민 잔기 또는 C13-C23 지방족임.
  84. 청구항 66 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질이 화학식 II-2의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인, LNP:
    화학식 II-2

    상기 식에서:
    R1a' 및 R1b'는 각각 독립적으로 C1-C8 알킬렌 또는 -O(C1-C8 알킬렌)이고, 여기서 O 원자는 존재하는 경우 피페리딘 환에 결합되고;
    Ya' 및 Yb'는 각각 독립적으로 -C(O)O-*, -OC(O)-*, -C(O)N(Rx 1)-*, -N(Rx 1)C(O)-*, -O(C=O)N(Rx 1)-*, -N(Rx 1)(C=O)O-*, -N(Rx 1)C(O)N(Rx 1)- 또는 -O-이고, 여기서 -*는 R2a 또는 R2b에 대한 부착점을 나타내고, Rx 1의 각각의 경우에는 독립적으로 수소 및 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    Za' 및 Zb'는 각각 독립적으로 임의로 치환된 아릴렌-C0-C8 알킬렌 또는 임의로 치환된 아릴렌-C0-C8 헤테로알킬렌이고, 여기서 알킬렌 또는 헤테로알킬렌 그룹은 각각 Ya' 및 Yb'에 결합되고;
    R2a' 및 R2b'는 각각 독립적으로 스테롤 잔기, 지용성 비타민 잔기 또는 C12-C22 지방족임.
  85. 청구항 83에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질이 화학식 II-1a의 화합물인, LNP:
    화학식 II-1a
    .
  86. 청구항 84에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질이 화학식 II-2a의 화합물인, LNP:
    화학식 II-2a
    .
  87. 청구항 66 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질이 청구항 1 내지 50 중 어느 한 항의 화합물인, LNP.
  88. 청구항 59 내지 87 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 지질이 디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-l-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜 -에탄올아민(DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 디메틸포스파티딜에탄올아민, 18-1-트랜스 PE, l-스테아로일-2-올레오일포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 에그 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일 포스파티딜콜린 (DMPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일로레이올포스파티딜글리세롤(POPG), 디에라이도일포스파티딜에탄올아민(DEPE), 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜 세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린( ESM), 세팔린, 카디오리핀, 포스파티디카산, 세레브로사이드, 디세틸포스페이트, 리소포스파티딜콜린, 딜리놀레오일포스파티딜콜린 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는, LNP.
  89. 청구항 59 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 지질이 DSPC인, LNP.
  90. 청구항 59 내지 89 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구조적 지질이 스테로이드인, LNP.
  91. 청구항 59 내지 90 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구조적 지질이 콜레스테롤인, LNP.
  92. 청구항 58 내지 91 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 청구항 1 내지 50 중 어느 한 항의 화학식 (A'')의 PEG-지질 또는 이온화 가능한 지질이 결여된 대조군 LNP와 비교하여 생체내 감소된 면역 반응을 유도하는, LNP.
  93. 청구항 92에 있어서, 상기 면역 반응이 LNP의 가속화된 혈액 소거율(ABC)인, LNP.
  94. 청구항 92 또는 93에 있어서, 상기 면역 반응이 IgM 반응인, LNP.
  95. 청구항 66 내지 71 및 75 내지 94 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I의 화합물, 콜레스테롤인 구조적 지질, DSPC인 헬퍼 지질, 및 화학식 (A'')의 화합물인 PEG-지질을 추가로 포함하는, LNP.
  96. 청구항 95에 있어서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, LNP:
    및 .
  97. 청구항 95 또는 96에 있어서, 상기 PEG-지질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물인, LNP:
    HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 100이고;
    HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)13CH3, n은 평균 약 45이고;
    HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45임.
  98. 청구항 66 내지 71 및 75 내지 94 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 II-1a의 화합물, 콜레스테롤인 구조적 지질, DSPC인 헬퍼 지질, 및 화학식 A''의 화합물인 PEG-지질을 포함하는 LNP.
  99. 청구항 99에 있어서, 상기 PEG-지질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, LNP:
    HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고;
    H3CO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고;
    HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)15CH3, n은 평균 약 45이고;
    HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)13CH3, n은 평균 약 45이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45임.
  100. 청구항 99에 있어서, 상기 PEG-지질이 HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3이고, n이 평균 약 100인, LNP.
  101. 청구항 72 내지 94 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 II-1a의 화합물, 콜레스테롤인 구조적 지질, DSPC인 헬퍼 지질, 및 화학식 (B)의 화합물인 PEG-지질을 포함하는 LNP.
  102. 청구항 101에 있어서, 상기 PEG-지질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, LNP:
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 100이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 50이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 40임.
  103. 청구항 58 내지 81 및 88 내지 97 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 청구항 1 내지 50 중 어느 한 항의 화합물의 약 40% 내지 약 70%, 예컨대, 약 45% 내지 약 55%, 또는 약 49% 내지 약 64%의 몰비를 포함하는, LNP.
  104. 청구항 58 내지 81, 88 내지 97 및 103 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 청구항 1 내지 50 중 어느 한 항의 화합물의 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 58% 또는 약 60%의 몰비를 포함하는, LNP.
  105. 청구항 58 내지 104 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 이온화 가능한 지질의 약 40% 내지 약 70%, 예컨대, 약 45% 내지 약 55%, 또는 약 49% 내지 약 64%의 몰비를 포함하는, LNP.
  106. 청구항 58 내지 105 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 이온화 가능한 지질의 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 58% 또는 약 60%의 몰비를 포함하는, LNP.
  107. 청구항 58 내지 106 중 어느 한 항에 있어서, LNP가 PEG-지질의 약 0.1% 내지 약 4%, 예컨대, 약 0.2% 내지 약 0.8 몰%, 약 0.4% 내지 약 0.6 몰%, 약 0.7% 내지 약 1.3%, 약 1.2% 내지 약 1.8%, 또는 약 1% 내지 약 3.5 몰%의 몰비를 포함하는, LNP.
  108. 청구항 58 내지 107 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 PEG-지질의 약 0.25%, 약 0.5%, 약 1.5% 또는 약 3%의 몰비를 포함하는, LNP.
  109. 청구항 58 내지 108 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 구조적 지질의 약 5% 내지 약 50%, 예컨대, 약 5% 내지 약 10%, 약 25% 내지 약 35%, 또는 약 35% 내지 약 50%의 몰비를 포함하는, LNP.
  110. 청구항 58 내지 109 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 구조적 지질의 약 20%, 약 22.5%, 약 25%, 약 27.5%, 약 30%, 약 32.5%, 약 35%, 약 37.5%, 약 40%, 약 42.5%, 약 45% 또는 약 50%의 몰비를 포함하는, LNP.
  111. 청구항 58 내지 110 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 헬퍼 지질의 약 5% 내지 약 50%, 예컨대 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 25% 또는 약 25% 내지 약 50%의 몰비를 포함하는, LNP.
  112. 청구항 58 내지 111 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 헬퍼 지질의 약 5%, 약 7%, 약 9%, 약 12%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 또는 약 30%의 몰비를 포함하는, LNP.
  113. 청구항 58 내지 112 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 약 45% 내지 약 55%의 이온화 가능한 지질, 약 5% 내지 약 9%의 헬퍼 지질, 약 36% 내지 약 44%의 구조적 지질, 및 약 2.5% 내지 약 3.5%의 PEG-지질의 몰비를 포함하는, LNP.
  114. 청구항 113에 있어서, 상기 LNP가 약 45% 내지 약 55%의 청구항 1 내지 50 중 어느 한 항의 화합물, 약 5% 내지 약 9%의 DSPC, 약 36% 내지 약 44%의 콜레스테롤, 및 약 2.5% 내지 약 3.5%의 DMG-PEG(2000)의 몰비를 포함하는, LNP.
  115. 청구항 58 내지 112 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 약 49% 내지 약 60%의 이온화 가능한 지질, 약 18% 내지 약 22%의 헬퍼 지질, 약 22% 내지 약 28%의 구조적 지질, 및 약 0.2% 내지 약 0.8%의 PEG-지질의 몰비를 포함하는, LNP.
  116. 청구항 115에 있어서, 상기 LNP가 약 49% 내지 약 60%의 청구항 1 내지 50 중 어느 한 항의 화합물, 약 18% 내지 약 22%의 헬퍼 지질, 약 22% 내지 약 28%의 구조적 지질, 및 약 0.2% 내지 약 0.8%의 PEG 지질의 몰비를 포함하고, 상기 PEG-지질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, LNP:
    HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고;
    H3CO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45이고;
    HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)15CH3, n은 평균 약 45이고;
    HO-(CH2CH2O)n-CH2C(O)O-(CH2)13CH3, n은 평균 약 45이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)17CH3, n은 평균 약 45임.
  117. 청구항 58 내지 112 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 약 44% 내지 약 54%의 이온화 가능한 지질, 약 19% 내지 약 25%의 헬퍼 지질, 약 25% 내지 약 33%의 구조적 지질 및 약 0.2% 내지 약 0.8%의 PEG-지질의 몰비를 포함하는, LNP.
  118. 청구항 117에 있어서, 상기 LNP가 약 44% 내지 약 54%의 화학식 (II-1a)의 화합물, 약 19% 내지 약 25%의 DSPC, 약 25% 내지 약 33%의 콜레스테롤, 및 약 0.2% 내지 약 0.8%의 PEG-지질의 몰비를 포함하고, 상기 PEG-지질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, LNP:
    HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 100이고;
    HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 20이고;
    HO-(CH2CH2O)n-(CH2)15CH3, n은 평균 약 20이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C18H35, n은 약 20이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 100이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 50이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 40이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 100이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 50이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 40임.
  119. 청구항 58 내지 112 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 약 44% 내지 약 54%의 이온화 가능한 지질, 약 19% 내지 약 25%의 헬퍼 지질, 약 24% 내지 약 32%의 구조적 지질 및 약 1.2% 내지 약 1.8%의 PEG-지질의 몰비를 포함하는, LNP.
  120. 청구항 119에 있어서, 상기 LNP가 약 44% 내지 약 54%의 화학식 (II-1a)의 화합물, 약 19% 내지 약 25%의 DSPC, 약 24% 내지 약 32%의 콜레스테롤, 및 약 1.2% 내지 약 1.8%의 PEG-지질의 몰비를 포함하고, 상기 PEG-지질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, LNP:
    HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 100이고;
    HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 20이고;
    HO-(CH2CH2O)n-(CH2)15CH3, n은 평균 약 20이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C18H35, n은 약 20이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 100이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 50이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 40이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 100이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 50이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 40임.
  121. 청구항 58 내지 112 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 약 44% 내지 약 54%의 이온화 가능한 지질, 약 8% 내지 약 14%의 헬퍼 지질, 약 35% 내지 약 43%의 구조적 지질 및 약 1.2% 내지 약 1.8%의 PEG-지질의 몰비를 포함하는, LNP.
  122. 청구항 121에 있어서, 상기 LNP가 약 44% 내지 약 54%의 화학식 (II-1a)의 화합물, 약 8% 내지 약 14%의 DSPC, 약 35% 내지 약 43%의 콜레스테롤, 및 약 1.2% 내지 약 1.8%의 PEG-지질의 몰비를 포함하고, 상기 PEG-지질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, LNP:
    HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 100이고;
    HO-(CH2CH2O)n-(CH2)17CH3, n은 평균 약 20이고;
    HO-(CH2CH2O)n-(CH2)15CH3, n은 평균 약 20이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C18H35, n은 평균 약 20이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 100이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 50이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)14CH3, n은 평균 약 40이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 100이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 50이고;
    HO-(CH2CH2O)n-C(O)-(CH2)16CH3, n은 평균 약 40임.
  123. 청구항 58 내지 71 및 75 내지 122 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 나노입자가 페이로드 분자를 캡슐화하는, LNP.
  124. 청구항 123에 있어서, 상기 페이로드 분자가 핵산, 음이온성 단백질, 음이온성 펩타이드, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는, LNP.
  125. 청구항 124에 있어서, 상기 페이로드 분자가 핵산 분자를 포함하는, LNP.
  126. 청구항 125에 있어서, 상기 핵산 분자가 단일 가닥 RNA(ssRNA), siRNA, 마이크로RNA, mRNA, 원형 RNA, 작은 활성화 RNA, CRISPR용 가이드 RNA, 자가 증폭 RNA, 바이러스 RNA(vRNA), 단일 가닥 DNA(ssDNA), 이중 가닥 DNA(dsDNA), 상보적 DNA(cDNA), 폐환 DNA(ccDNA), 레플리콘 또는 이들의 조합을 포함하는, LNP.
  127. 청구항 125 또는 126에 있어서, 상기 핵산 분자가 하나 이상의 치료학적 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, LNP.
  128. 청구항 127에 있어서, 상기 치료학적 단백질이 사이토킨(예컨대, 에리트로포이에틴), 응고 인자, 항체, 이중특이적 T 세포 인게이저 또는 이들의 조합인, LNP.
  129. 청구항 125 내지 128 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 바이러스 게놈으로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, LNP.
  130. 청구항 129에 있어서, 상기 바이러스 게놈이 양성 단일 가닥의 RNA 바이러스 게놈 양성 단일 가닥의 RNA 바이러스 게놈인, LNP.
  131. 청구항 129에 있어서, 상기 바이러스 게놈이 종양 용해 바이러스(예를 들어, 콕사키에바이러스(Coxsackievirus) A21(CVA21), 세네카 밸리(Seneca Valley) 바이러스(SVV), 토가비리대(Togaviridae) 또는 알파바이러스(Alphavirus)(예를 들어, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스, 로스 리버(Ross River) 바이러스 또는 키쿤구니야(Chikungunya) 바이러스))를 암호화하는, LNP.
  132. 청구항 124에 있어서, 상기 페이로드 분자가 콕사키에바이러스를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하고, 임의로 상기 콕사키에바이러스가 CVA21 균주인, LNP.
  133. 청구항 124에 있어서, 상기 페이로드 분자가 SVV를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는, LNP.
  134. 청구항 132 또는 133에 있어서, 상기 페이로드 분자가 외인성 단백질을 추가로 암호화하고, 상기 외인성 단백질이 형광 단백질, 효소 단백질, 사이토킨, 케모킨, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자 또는 세포 표면 수용체에 대한 리간드인, LNP.
  135. 청구항 72 내지 122 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 게놈이 양성 단일 가닥의 RNA 바이러스 게놈인, LNP.
  136. 청구항 135에 있어서, 상기 바이러스 게놈이 종양 용해 바이러스(예를 들어, 콕사키에바이러스 A21(CVA21) 또는 세네카 밸리 바이러스(SVV), 토가비리대 또는 알파바이러스(예를 들어, 신드비스 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 로스 리버 바이러스 또는 키쿤구니야 바이러스))를 암호화하는, LNP.
  137. 청구항 135에 있어서, 상기 바이러스 게놈이 콕사키에바이러스를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈이고, 임의로 상기 콕사키에바이러스가 CVA21 균주인, LNP.
  138. 청구항 135에 있어서, 상기 바이러스 게놈이 SVV를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈인, LNP.
  139. 청구항 72 내지 122 및 135 내지 138 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 게놈이 외인성 단백질을 추가로 암호화하고, 상기 외인성 단백질이 형광 단백질, 효소 단백질, 사이토킨, 케모킨, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자 또는 세포 표면 수용체에 대한 리간드인, LNP.
  140. 청구항 72 내지 122 및 125 내지 139 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 약 1 내지 약 25의 지질-질소-대-포스페이트(N:P) 비율을 갖는, LNP.
  141. 청구항 72 내지 122 및 125 내지 140 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 약 14의 N:P 비율을 갖는, LNP.
  142. 청구항 72 내지 122 및 125 내지 140 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 약 9의 N:P 비율을 갖는, LNP.
  143. 청구항 1 내지 57 중 어느 한 항의 화합물 또는 청구항 58 내지 142 중 어느 한 항의 LNP 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
  144. (1) 페이로드 분자; 및 (2) 청구항 66 내지 71 및 75 내지 142 중 어느 한 항의 LNP를 포함하는 약제학적 조성물.
  145. 청구항 143 또는 144에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 소정의 역치 값의 반감기에 상응하는 생체내 반감기를 갖는, 약제학적 조성물.
  146. 청구항 143 또는 144에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 소정의 역치 값의 반감기를 초과하는 생체내 반감기를 갖는, 약제학적 조성물.
  147. 청구항 143 또는 144에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 소정의 역치 값의 반감기보다 짧은 생체내 반감기를 갖는, 약제학적 조성물.
  148. 청구항 143 또는 144에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 소정의 역치 값의 AUC에 상응하는 생체내 AUC를 갖는, 약제학적 조성물.
  149. 청구항 143 또는 144에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 소정의 역치값의 AUC를 초과하는 생체내 AUC를 갖는, 약제학적 조성물.
  150. 청구항 143 또는 144에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 소정의 역치 값의 AUC 미만의 생체내 AUC를 갖는, 약제학적 조성물.
  151. 청구항 145 내지 150 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소정의 역치 값은, LNP에 화학식 A'의 PEG-지질 또는 청구항 1 내지 50 중 어느 한 항의 이온화 가능한 지질이 결여되어 있다는 점을 제외하고는 LNP 및 동일한 페이로드 분자를 포함하는 대조군 조성물에서 결정되는, 약제학적 조성물.
  152. 청구항 143 내지 151 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 약 50 nm, 약 60 nm, 약 70 nm, 약 80 nm, 약 90 nm, 약 100 nm, 약 110 nm, 약 120 nm, 또는 약 125 nm의 평균 직경을 갖는, 약제학적 조성물.
  153. 청구항 143 내지 152 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP에 의한 페이로드 분자의 캡슐화 효율이 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100%인, 약제학적 조성물.
  154. 청구항 143 내지 153 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 약 10 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 또는 약 50 mM의 총 지질 농도를 갖는, 약제학적 조성물.
  155. 청구항 143 내지 154 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 또는 약 6의 pH에서 제형화되는, 약제학적 조성물.
  156. 청구항 143 내지 155 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 다중 투여용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
  157. 청구항 156에 있어서, 후속 투여가 제1 투여 후 적어도 3일, 적어도 5일, 적어도 7일, 적어도 9일, 적어도 11일, 적어도 14일 또는 적어도 21일에 투여되는, 약제학적 조성물.
  158. 청구항 144 내지 157 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페이로드 분자가 핵산 분자를 포함하는, 약제학적 조성물.
  159. 청구항 144 내지 158 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페이로드 분자가 콕사키바이러스 또는 SVV를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈을 포함하는, 약제학적 조성물.
  160. 청구항 144 내지 157 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP에 포함된 바이러스 게놈이 콕사키에바이러스 또는 SVV를 암호화하는 합성 RNA 바이러스 게놈인, 약제학적 조성물.
  161. 제144항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  162. 청구항 58 내지 142 중 어느 한 항의 지질 나노입자 또는 청구항 143 내지 161 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  163. 청구항 162에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 암인, 방법.
  164. 청구항 163에 있어서, 상기 암이 폐암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 고환암, 결장직장암, 결장암, 췌장암, 간암, 신장 세포 암종, 위암, 두경부암, 갑상선암, 악성 신경교종, 교모세포종, 흑색종, B세포 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, 결정되지 않은 유의성의 모노클로날 감마글로불린병증(MGUS: monoclonal gammopathy of undetermined significance), 메르켈 세포 암종, 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL: diffuse large B-cell lymphoma), 육종, 신경모세포종, 신경내분비암, 횡문근육종, 수모세포종, 방광암 및 변연부 림프종(MZL: marginal zone lymphoma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  165. 청구항 163에 있어서, 상기 암이 폐암, 유방암, 결장암, 췌장암, 방광암, 신장 세포 암종, 난소암, 위암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  166. 청구항 163에 있어서, 상기 암이 신장 세포 암종, 폐암, 또는 간암인, 방법.
  167. 청구항 164 내지 166 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폐암이 소세포 폐암 또는 비-소세포 폐암(예를 들어, 편평 세포 폐암 또는 폐 선암종)인, 방법.
  168. 청구항 164 내지 166 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간암이 간세포 암종(HCC)(예를 들어, B형 간염 바이러스 관련 HCC)인, 방법.
  169. 청구항 164에 있어서, 상기 전립선 암이 치료-응급 신경내분비 전립선 암인, 방법.
  170. 청구항 163에 있어서, 상기 암이 폐암, 간암, 전립선암(예를 들어, CRPC-NE), 방광암, 췌장암, 결장암, 위암, 유방암, 신경모세포종, 신장 세포 암종, 난소암, 횡문근육종, 수모세포종, 신경내분비암, 메르켈 세포 암종 또는 흑색종인, 방법.
  171. 청구항 163에 있어서, 상기 암이 소세포 폐암(SCLC) 또는 신경모세포종인, 방법.
  172. 청구항 163 내지 171 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 투여가 페이로드를 종양 세포로 전달하는, 방법.
  173. 청구항 163 내지 172 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 투여가 종양 성장을 억제하는, 방법.
  174. 청구항 162 내지 173 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP 또는 약제학적 조성물이 경구적으로 투여되는, 방법.
  175. 청구항 162 내지 174 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP 또는 약제학적 조성물이 종양내 및/또는 정맥내 투여되는, 방법.
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