KR20230155271A - 홍삼 다당체를 이용하여 제조된 히알루론산을 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물 - Google Patents

홍삼 다당체를 이용하여 제조된 히알루론산을 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일 양태는 홍삼 다당체가 포함된 배지에서 히알루론산 생산 균주를 배양한 배양물에서 수득된 히알루론산을 포함하는 피부 각질 경화도 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 일 양태는 홍삼 다당체가 포함된 배지에서, 히알루론산 생산 균주를 배양하는 단계;를 포함하는 히알루론산의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따르면

Description

홍삼 다당체를 이용하여 제조된 히알루론산을 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물{Cosmetic composition containing hyaluronic acid for skin moisturizing　, prepared using red ginseng polysaccharide}
본 발명은 보습 효능이 강화된 히알루론산을 포함하는 화장료 조성물 및 홍삼 다당체를 이용하여 상기 히알루론산을 제조하는 방법을 제공한다.
히알루론산(Hyaluronic acid)은 β-D-N-아세틸글루코사민과 β-D-글루쿠론산이 교대로 반복 결합된 직쇄상의 고분자 다당이다. 히알루론산은 당사슬의 길이에 따라서 1KDa 내지 10MDa의 넓은 분자량 범위를 가지며, 분자량에 따라 고분자, 저분자 및 초저분자 히알루론산으로 분류된다.
히알루론산은 포유동물의 피하조직과 연골조직 같은 결합조직 외에도, 특히 동물 피부에 많이 존재하는 생체 합성 천연 물질로서, 피부에서 보습 작용의 역할을 하여 피부 주름 개선 화장료 등의 유효성분으로 사용되고 있다. 이와 같은 히알루론산의 보습 작용 기능이 널리 알려지면서, 보습 효능이 개선된 히알루론산 및 이를 포함하는 화장료 조성물 개발에 대한 필요성이 대두되고 있다.
한편, 홍삼에 포함된 사포닌 등의 성분은 피부 기능을 개선시키고, 피부 탄력, 노화 방지, 보습 작용, 피부 트러블 해결, 지친 피부 개선, 유해한 환경으로부터 건강한 피부를 유지할 수 있게 도와주는 역할을 한다. 최근에는 홍삼 추출물, 인삼 추출물, 산삼 및 장뇌삼 추출물 등이 화장료 조성물의 원료 등으로서 화장료 조성물의 제조에 많이 사용되고 있다.
이에 본 발명자들은 홍삼 추출물을 다당체로 제조하여, 홍삼 다당체가 첨가된 배지에서 히알루론산 생산 균주를 배양함으로써, 피부 보습 강화 효능이 우수한 히알루론산의 제조방법과 상기 히알루론산을 포함하는 화장료 조성물을 개발하였다.
본 발명은 피부 보습 효능이 강화된 히알루론산을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 피부 보습 효능이 강화된 상기 히알루론산의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 일 양태는, 홍삼 다당체가 포함된 배지에서 히알루론산 생산 균주를 배양한 배양물에서 수득된 히알루론산을 포함하는, 피부 각질층 경화도 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태는, 홍삼 다당체가 포함된 배지에서 히알루론산 생산 균주를 배양하는 단계;를 포함하는 히알루론산의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 피부에 대한 보습 효능이 강화된 히알루론산을 제공할 수 있다.
또한 상기한 제조방법에 따라 제조한 히알루론산을 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은, 피부 각질층 경화도 개선에 도움을 주어 피부에 대한 보습 효능이 우수하다는 효과를 갖는다.
도 1은 수분 함량에 따른 케라틴의 알파-베타 전이와, 알파-헬릭스와 베타-시트의 적외선 흡광 스펙트럼을 도식화하고 있다.
도 2는 제조예 및 비교 제조예 1 내지 3에서 제조된 시료를 처리한 후 획득된 시그널의 흡광도-파장 가우시안 핏 그래프이다.
도 3은 제조예 및 비교 제조예 1 내지 3에서 제조된 시료를 처리한 후 케라틴의 베타-시트 대비 알파-헬릭스의 비율을 도식화한 그래프이다.
도 4는 비교 제조예 3, 비교 제조예 3의 히알루론산에 홍삼 다당체를 첨가한 샘플 및 제조예의 시료를 각각 처리한 후 획득된 시그널의 흡광도-파장 가우시안 핏 그래프이다.
도 5는 비교 제조예 3, 비교 제조예 3의 히알루론산에 홍삼 다당체를 첨가한 샘플 및 제조예의 시료를 각각 처리한 후 케라틴의 베타-시트 대비 알파-헬릭스의 비율을 도식화한 그래프이다.
이하, 본 발명에 대한 이해를 돕기 위하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
1. 피부 보습 효능이 강화된 히알루론산의 제조방법
본 발명의 한 양태는 홍삼 다당체가 포함된 배지에서, 히알루론산 생산 균주를 배양하는 단계;를 포함하는, 히알루론산의 제조방법을 제공한다.
상기 "홍삼"은 채굴되어 가공되지 않은 인삼을 증숙하여 건조 가공한 것을 의미한다. 홍삼은 그 제조 과정에서 사포닌 변형과 아미노산 변화 등 여러 화학적인 변화가 수반되며, 특히 제조 과정에서 가해지는 열에 의해 인삼에 존재하지 않는 진세노사이드 Rg2, Rg3, Rh1, Rh2 등의 사포닌 성분이 생성될 수 있다.
본 발명에서 상기 "다당체"는 당이 여러개 붙어있는 화합 물질인 중합체 탄수화물 분자이며, 상기 홍삼 다당체는 홍삼의 몸통 및 뿌리로부터 추출 및 농축될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 홍삼 다당체는 고온의 정제수로 온수 추출되어, 감압 농축될 수 있다.
상기 "배지"는 균, 세포 또는 식물체 배양에 필요한 영양소를 함유한 임의의 증식 환경을 의미하며, 본 발명에서는 히알루론산 생산 균주를 배양할 수 있는 배지라면 제한 없이 사용될 수 있다. 본 발명의 배지는 홍삼 다당체가 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 배지에는, 상기 배지 총 중량에 대하여 홍삼 다당체가 0.01중량%, 0.03중량%, 0.05중량%, 0.07중량%, 0.1중량%, 0.3중량%, 0.5중량%, 0.7중량%, 1중량%, 1.5중량%, 2중량%, 2.5중량%, 3중량%, 3.5중량%, 4중량%, 4.5중량%, 5중량%, 8중량% 및 10중량%로부터 선택된 하한치 중 하나, 및 30중량%, 27중량%, 25중량%, 23중량%, 20중량%, 17중량%, 15중량%, 13중량% 및 10중량%로부터 선택된 상한치 중 하나를 조합한 범위의 함량으로 포함된 것일 수 있다. 예를 들어서, 본 발명의 배지에는 배지 총 중량에 대하여 홍삼 다당체가 0.03중량% 내지 27중량%, 0.1중량% 내지 27중량%, 1중량% 내지 25중량%, 5중량% 내지 25중량%, 5중량% 내지 20중량%, 5중량% 내지 15중량%, 5중량% 내지 10중량% 또는 8중량% 내지 10중량% 의 함량으로 포함된 것일 수 있다.
또한 본 발명의 배지에는 상기 홍삼 다당체 이외에 탄소원, 질소원 및 무기염류로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나가 더 포함될 수 있으며, 히알루론산 생산 균주의 생장에 도움이 되는 물질이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 배지는 탄소원으로서 글루코스, 덱스트로스, 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의 당류를 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 배지는 질소원으로서 효모농축액, 맥아농축액, 카제인 다이제스트, 폴리펩톤, 트립톤, 소이펩톤, 글루타민, 글루탐산을 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 배지는 무기염류로서 인산마그네슘, 인산칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 더 포함할 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 배지는 포도당, 효모농축액, 인삼칼륨, 황산마그네슘 및 폴리펩톤을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 포도당은 1 내지 10 중량%, 3 내지 9중량%, 4 내지 9중량%, 6 내지 9중량%, 또는 8중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 또한, 상기 효모 농축액은 0.1 내지 1 중량%, 0.3 내지0.7중량%, 0.4 내지 0.6중량% 또는 0.5중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 또한, 상기 인삼칼륨은 0.05 내지 1 중량%, 0.07 내지 0.5중량%, 0.1 내지 0.3중량% 또는 0.2중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 또한, 상기 황산마그네슘은 0.01 내지 0.1 중량%, 0.03 내지 0.07중량%, 0.04 내지 0.06중량%, 또는 0.05중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 마지막으로, 폴리펩톤은 0.3 내지 7중량%, 0.5 내지 5중량%, 1 내지 3중량% 또는 1.5중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
또한 본 발명의 배지에는 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜 등의 임의의 항생물질이 더 첨가될 수도 있다.
본 발명에서 "히알루론산 생산 균주"란 대사 과정에서 주산물 또는 부산물로 히알루론산을 생성할 수 있는 생성능이 있는 것으로 알려진 임의의 균주를 의미한다. 상기 히알루론산 생산 균주는 예컨대 스트렙토코커스 속, 락토바실루스 속, 비피도박테리움 속, 락토코커스 속, 엔테로코커스 속, 페디오코커스 속, 류코노스톡 속, 바이셀라 속의 미생물일 수 있고, 구체적으로 스트렙토코커스 속 미생물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 스트렙토코커스 속 미생물은 예컨대 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus Thermophilus), 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus penumoneae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)등으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 히알루론산 생산 균주는, 상기 배지에 포함된 홍삼 다당체를 대사할 수 있다. 상기 히알루론산 생산 균주에 의해 상기 홍삼 다당체가 대사되는 과정에서, 균주에 의해 생성된 히알루론산의 보습 효능이 강화되는 효과가 있다. 본 발명에서 "히알루론산 생산 균주를 배양하는 단계"는 pH 6 내지 8, 바람직하게는 pH 7에서 수행될 수 있다. 히알루론산 생산 균주의 배양에 따라 젖산이 생성되어 pH가 낮아지므로, 염기성 시약을 사용하여 pH가 6 내지 8로 유지되도록 할 수 있으며, 예를 들어서 NaOH를 염기성 시약으로 사용할 수 있다.
또한 상기 "히알루론산 생산 균주를 배양하는 단계"는 온도 20℃ 내지 40℃, 25℃ 내지 35℃, 또는 30℃에서 수행될 수 있고, 5시간 내지 30시간, 10시간 내지 20시간, 또는 15시간 내지 20시간동안 수행될 수 있으며, 100rpm 내지 250rpm, 150rpm 내지 200rpm에서 수행될 수 있다.
본 발명의 히알루론산 생산 균주를 배양하는 방법으로는, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등 통상적으로 알려진 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다.
본 발명의 히알루론산의 제조방법은 히알루론산 생산 균주의 배양물을 여과하여, 상기 균주를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 여과하는 단계는 복수회에 거쳐 수행될 수 있으며 순차적으로 더 작은 크기로 여과하여 최종적으로 0.3μm 내지 0.05μm의 크기로까지 여과할 수 있다. 예를 들어서, 최종 여과 크기는 0.3μm, 2μm 또는 0.1μm일 수 있다. 상기 여과의 방법으로는 한외여과, 급속여과, 가압여과 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상적으로 알려진 균주 제거 여과 방법이 모두 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 히알루론산의 제조방법은 히알루론산을 농축 수득하기 위하여 상기 균주가 제거된 여과액에 알코올을 첨가하여 침전물을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 알코올은 에탄올일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 핵산을 침전시킬 수 있는 용액이라면 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 알코올은 여과액에 최종 알코올 함량 60중량% 내지 90중량%의 함량으로 첨가될 수 있으며, 예를 들어서 65중량%, 70중량%, 75중량%, 80중량% 또는 85중량%의 함량으로 첨가될 수 있다.
본 발명에서 "히알루론산(Hyaluronic acid)"은 아미노산과 우론산(uronic acid)으로 이루어지는 복잡한 다당류의 일종으로, β-D-N-아세틸글루코사민과 β-D-글루쿠론산으로 이루어진 고분자 화합물을 의미한다. 수산화기(-OH)가 많기 때문에 친수성 물질이며, 동물 등의 피부에서 보습 작용의 역할을 하고, 세균의 침입이나 독물의 침투를 막는 역할을 한다고 알려져 있다. 본 발명에 따라 제조된 히알루론산은 상기 히알루론산 생산 균주가 홍삼 다당체를 대사하는 과정에서 유발되는 복합적인 작용에 의해, 피부에 처리될 경우 탁월한 각질층 경화도 개선능 및 피부 보습 효능을 갖는다.
본 발명의 방법 의해 수득된 히알루론산의 분자량은 0.3MDa, 0.4MDa, 0.5MDa, 0.6MDa 및 0.7MDa로부터 선택된 하한치 중 하나 및 1.3MDa, 1.2MDa, 1.1MDa, 1.0MDa 및 0.9MDa로부터 선택된 상한치 중 하나를 조합한 범위일 수 있다. 예를 들어서, 본 발명의 히알루론산의 분자량은 0.4MDa 내지 1.2MDa일 수 있으며, 바람직하게는 0.5MDa 내지 1.1MDa, 보다 바람직하게는 0.6MDa 내지 1.0MDa일 수 있다.
2. 피부 보습 효능이 강화된 히알루론산을 포함하는 화장료 조성물
본 발명의 또 다른 양태는 상기 방법으로 제조된 히알루론산을 포함하는, 피부 각질층 경화도 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 히알루론산은 '1. 피부 보습 효능이 강화된 히알루론산의 제조방법' 항목에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 상기 "피부 각질층 경화도 개선"이란, 피부 각질층의 케라틴을 구성하는 단백질 2차 구조의 알파-헬릭스 구조가 베타-시트 구조로 전이되는 것을 의미한다. 각질층의 케라틴은 수분의 양에 따라 알파-헬릭스 및 베타-시트 구조가 상호 전이되는 특징을 가진다. 수분이 부족할수록 알파-헬릭스의 비율이 높아지고, 반대로 수분이 충분할수록 베타-시트의 비율이 높아지는 알파-베타 전이(alpha-beta transition) 현상이 나타난다. 수분이 부족하여 알파-헬릭스의 비율이 높아지는 경우, 피부 각질층은 더 높은 경화도(stiffness)를 갖는다. 베타-시트는 알파-헬릭스에 비하여 피부 내 수분 보유력이 우수한바, 케라틴 내에 베타-시트 구조의 함량이 높아지면 피부 내 수분 보유력이 증가되어 피부의 보습력이 개선되는 효과가 있다.
알파-헬릭스는 베타-시트에 비하여 더 긴 파장의 적외선(IR, infrared)을 흡수한다. 따라서 푸리에변환적외선분광법(FT-IR, fourier transform infrared spectroscopy)을 이용하여 적외선 흡광도를 측정함으로써, 케라틴의 베타-시트 구조 대비 알파-헬릭스의 구조의 비율을 구하여 피부 각질층의 경화도를 파악할 수 있다.
상기와 같이 피부 각질층 케라틴을 구성하는 알파-헬릭스 구조가 베타-시트 구조로 전이됨에 따라, 베타-시트 구조 대비 알파-헬릭스 구조의 비율은 0.7, 0.8, 0.9 및 1.0 로부터 선택된 하한치 중 하나 및 1.3, 1.2, 1.1 및 1.0으로부터 선택된 상한치 중 하나를 조합한 범위이거나, 이들 수치 중 하나일 수 있다. 예를 들어서, 피부 각질층 케라틴의 베타-시트 구조 대비 알파-헬릭스 구조의 비율은 0.8 내지 1.2일 수 있으며, 바람직하게는 0.9 내지 1.1, 보다 바람직하게는 1.0일 수 있다.
본 발명에서 케라틴의 베타-시트 구조 대비 알파-헬릭스 구조의 비율이 상기한 수치를 가짐에 따라, 피부 각질층의 경화도가 개선된다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 방법에 따라 제조된 히알루론산을 처리한 경우 베타-시트 구조 대비 알파-헬릭스 구조의 비율이 1.02 및 1.07인 것을 확인하였다. 이는 고분자, 중분자, 저분자 히알루론산을 처리한 경우나, 아무런 처리를 하지 않은 경우보다도 낮은 비율로서, 본 발명에 따라 제조된 히알루론산은 피부 각질층 경화도 개선 효과가 우수함을 확인하였다.
본 발명에서 상기 "화장료 조성물"은 당 업계에서 통상적으로 피부에 도포되는 것으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징폼, 클렌징 워터, 마스크팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
이때, 제형에 따라 담체 성분으로 당업계에 공지된 담체가 제한 없이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분,트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 등이 포함될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄, 디메틸 에테르 등의 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로 용매, 용해화제, 유탁화제 등이 포함될 수 있고, 구체적으로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로 물, 에탄올, 프로필렌글리콜 등의 액상 희석제; 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 등의 현탁제; 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 포함될 수 있다.
또한 상기 화장료 조성물에는 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 향료 등과 같은 통상적인 보조제가 더 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물에는 글리세린, 부틸렌 글라이콜, 폴리옥시에칠렌 경화피마자유, 토코페릴 아세테이트, 시트릭산, 펜테놀, 스쿠알란, 소듐 시트레이트, 알란토인 등의 보조성분이 추가로 더 포함될 수 있다.
이하, 본 발명을 제조예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 제조예, 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[제조예] 홍삼 다당체가 첨가된 배지를 이용한 히알루론산의 제조
홍삼 1kg에 10배의 정제수를 넣고 80℃에서 12시간동안 추출을 수행하였다. 추출액을 상온으로 식힌 후에 순차적으로 여과하여, 최종적으로 0.5μm의 크기까지 여과하였다. 여과액을 고형분 함량 10%(w/w)가 되도록 감압 농축하고, 최종 에탄올 함량 80%(w/w)가 되도록 에탄올을 첨가하였다. 그 이후 1시간동안 방치하여 검갈색 시럽 형태의 홍삼 다당체 124g을 수득하였다.
스트렙토코커스 쥬에피데이쿠스(Streptococcus zooepidemicus)를 pH 7의 토드-휴잇(Todd-Hewitt) 멸균 액체배지(미국 BD사)에 도말하여 30℃에서 17시간동안 배양하였다. 배양이 끝난 종균액을 멸균된 생산배지(물 1L를 기준으로 포도당 5%(w/w), 효모농축액 0.5%(w/w), 인산칼륨 0.2%(w/w), 황산마그네슘0.05%(w/w), 폴리펩톤 1.5%(w/w)으로 구성)에 접종한 후, pH 7, 35℃에서 6시간동안 200rpm으로 배양하였다.
그 이후 상기 홍삼 다당체를 정제수에 20%(w/w)의 농도로 희석하고 멸균한 뒤에, 4시간에 걸쳐 종균액이 도말된 생산배지에 첨가하였고, 다시 24시간동안 배양하였다. 24시간동안 배양한 후에, 균체를 제거하기 위해 순차적으로 여과를 하여 최종적으로 0.1μm의 크기까지 여과하였다. 여과액에 최종 에탄올 함량 80%(w/w)가 되도록 에탄올을 첨가하였다. 그 이후, 원심탈수를 통하여 엷은 황색의 침전물을 회수하였고, 고형분 함량 10%(w/w)가 되도록 정제수에 해당 침전물을 용해하였다. 히알루론산 분자 사이에 잔존하는 배지의 성분 및 기타 불순물을 정제하기 위하여, 상기 침전물의 회수 및 용해 과정을 총 3회 반복하였다.
최종적으로 수득된 침전물을 건조하였고 카바졸 확인법(Carbazole Assay)으로 분석하여 히알루론산의 함량이 99중량% 이상임을 확인하였다. 수득된 히알루론산의 분자량은 0.6 내지 1.0Mda으로 확인되었다.
[비교 제조예] 고분자, 저분자 및 초저분자 히알루론산의 제조
상기 제조예 2와 동일한 방식으로 스트렙토코커스 쥬에피데이쿠스를 준비하였다. 이후 홍삼 다당체를 첨가하는 공정을 제외한 여과, 에탄올 첨가 및 침전물 수득 과정을 동일하게 진행하여 최종 건조물을 수득하였고, 카바졸 확인법으로 분석하여 히알루론산의 함량이 99중량% 이상임을 확인하였다.
수득된 히알루론산을 분자량 크기에 따라 고분자, 저분자 및 초저분자 히알루론산으로 분리하였고 이들을 각각 비교 제조예 1 내지 3으로 하였으며, 각각의 분자량은 1.8 내지 2.5Mda, 0.6 내지 1.0Mda 및 0.5 내지 10.1Kda으로 확인되었다.
[실시예 1] 히알루론산 처리시 피부 각질층 케라틴의 경화도 분석
1mm 두께의 돼지 피부(메디키네틱 사)의 피부 전체(whole skin)에서 5개의 부위를 임의로 선택하여 50개의 신호를 획득하였다. 상기 돼지 피부를 상온(32℃)에서 프란츠 셀(Franz cell)의 멤브레인에 위치시키고, 수용 챔버(receptor chamber)에는 식염수를 두었으며, 공여 챔버(donor chamber)는 공기에 노출시켜 3시간동안 건조하였다.
프란츠 셀의 공여 챔버에 상기 제조예 및 비교 제조예 1 내지 3에서 제조된 시료를 각각 300μl씩 도포하고 3시간이 지난 후에 증류수로 세정하였다. 이처럼 시료 처리를 한 후에 돼지 피부의 5개의 부위에서 다시 50개의 시그널을 획득하였다. 획득된 시그널을 이용하여 흡광도-파장 그래프를 생성하고 가우시안 핏을 이용하여 피크(peak)의 높이를 구하였다(도 2).
제조예 및 비교 제조예 1 내지 3에서 제조된 시료를 처리한 샘들에서 측정된 베타-시트 대비 알파-헬릭스 구조의 비율은 아래 표에 기재된 바와 같다(도 3). 대조군으로는 일반적으로 보습 효능이 우수한 것으로 알려진 글리세린 10%를 사용하였다.
알파-헬릭스/베타-시트 비율 대조군 비교
제조예 1
(고분자
히알루론산) 		비교
제조예 2
(저분자
히알루론산) 		비교
제조예 3
(초저분자
히알루론산) 		제조예
평균 1.27 1.24 1.27 1.13 1.02
편차 0.04 0.02 0.06 0.03 0.06
상기한 바와 같이, 고분자 및 저분자 히알루론산인 비교 제조예 1 및 2를 처리한 경우 케라틴 각질층 내에 베타-시트 대비 알파-헬릭스 구조의 비율이 시료를 처리하지 않은 대조군과 비슷한 수준으로 나타나, 각질층 경화도의 개선이 확인되지 않았다.
제조예를 처리한 경우와 초저분자 히알루론산인 비교 제조예 3을 처리한 경우에는 단백질 구조 내 베타-시트의 함량이 더 증가함에 따라, 베타-시트 대비 알파-헬릭스의 비율이 대조군에 비하여 감소하였다. 특히 제조예의 히알루론산을 처리한 경우에 감소의 정도가 더 두드러짐으로써 가장 우수한 각질층 경화도 개선 효과를 보였다.
상기한 바와 같이, 고분자 및 저분자 히알루론산(비교 제조예 1 및 2)을 처리한 경우보다 분자량이 작은 초저분자 히알루론산(비교 제조예 3)을 처리한 경우 우수한 경화도 개선 효과를 나타내었다. 그러나 비교 제조예 3보다는 분자량이 크며, 비교 제조예 1 및 2보다는 분자량이 작은 제조예의 히알루론산을 처리한 경우에 가장 우수한 경화도 개선의 효과가 확인되었다.
제조예에서 제조된 히알루론산은, 상기 히알루론산 생산 균주가 홍삼 다당체를 대사하는 과정에서 유발되는 복합적인 작용에 의해, 우수한 피부 각질층 경화도 개선의 효과를 갖는 것으로 판단되었다.
[실시예 2] 저분자 히알루론산과 홍삼 다당체를 함께 처리시 피부 각질층 케라틴의 경화도 분석
상기 실시예 1에서 제조예의 히알루론산을 처리한 경우 경화도 개선이 가장 우수한 경화도 개선의 효과가 나타난 원인이, 배지에서 미처 여과되지 않은 홍삼 성분인 것인지 또는 홍삼 성분이 균체의 배양 중에 히알루론산 합성 경로에 영향을 미친 것인지 확인하고자 하였다. 이에 비교 제조예 3의 저분자 히알루론산을 홍삼 다당체와 배합하여 시료 처리하였다.
비교 제조예 2, 비교 제조예 2의 저분자 히알루론산 0.5중량%에 홍삼 다당체 1중량%를 첨가한 샘플 및 제조예의 샘플을 각각 300μl씩 상기 실시예 1에서와 동일한 방식으로 돼지 피부를 tape strip하여 처리하였다. 흡광도-파장 그래프를 생성하고 가우시안 핏을 이용하여 피크의 높이를 구한 뒤, 베타-시트 대비 알파-헬릭스의 비율을 계산한 결과는 아래 표 2와 같다(도 4 및 5).
알파-헬릭스/베타-시트 비율 대조군 비교 제조예 2
저분자
히알루론산 		비교 제조예 2
+ 홍삼 다당체 		제조예
평균 1.25 1.29 1.17 1.07
편차 0.12 0.09 0.06 0.05
상기한 바와 같이, 저분자 히알루론산과 홍삼 다당체를 함께 처리한 경우(비교 제조예 2 + 홍삼 다당체), 저분자 히알루론산만을 처리한 경우나 아무 처리를 하지 않은 대조군에 비하여 피부 각질층 케라틴의 경화도 개선 효과가 우수하였다. 그러나 제조예의 히알루론산을 처리한 경우보다는 우수하지 않았다.
이러한 결과로부터 케라틴의 경화도 개선에 있어서, 히알루론산 본연의 수분 유지 기능과 히알루론산의 발효 과정중에 첨가된 홍삼 다당체 성분이 복합적으로 작용하여, 케라틴 구조 내의 베타-시트가 알파-헬릭스로 전환되는 것을 최소화한 것으로 유추할 수 있다.

Claims (14)

  1. 홍삼 다당체가 포함된 배지에서 히알루론산 생산 균주를 배양한 배양물에서 수득된 히알루론산을 포함하는, 피부 각질 경화도 개선용 화장료 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 히알루론산 생산 균주는 스트렙토코커스 속 균주인 것인, 피부 각질 경화도 개선용 화장료 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 스트렙토코커스 속 균주는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 (Streptococcus zooepidemicus), 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus Thermophilus) 및 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 피부 각질 경화도 개선용 화장료 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 히알루론산은 분자량이 0.4MDa 내지 1.2MDa인 것인, 피부 각질 경화도 개선용 화장료 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 피부 각질 경화도 개선은, 상기 피부 각질 내의 케라틴을 구성하는 알파-헬릭스 구조가 베타-시트 구조로 전이되는 것인, 피부 각질 경화도 개선용 화장료 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 베타-시트 구조 대비 알파-헬릭스 구조의 비율은 0.8 내지 1.2인 것인, 피부 각질 경화도 개선용 화장료 조성물.
  7. 홍삼 다당체가 포함된 배지에서, 히알루론산 생산 균주를 배양하는 단계;를 포함하는, 히알루론산의 제조방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 히알루론산 생산 균주는 스트렙토코커스 속 균주인 것인, 히알루론산의 제조방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 스트렙토코커스 속 균주는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 (Streptococcus zooepidemicus), 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus Thermophilus) 및 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 히알루론산의 제조방법.
  10. 청구항 7에 있어서,
    상기 배지에는 상기 배지 총 중량에 대하여 홍삼 다당체가 0.1중량% 내지 30중량%의 함량으로 포함된 것인, 히알루론산의 제조방법.
  11. 청구항 7에 있어서,
    상기 배지는 탄소원, 질소원 및 무기염류로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 더 포함하는 것인, 히알루론산의 제조방법.
  12. 청구항 7에 있어서,
    히알루론산 생산 균주의 배양물을 여과하여, 상기 균주를 제거하는 단계;를 더 포함하는 것인, 히알루론산의 제조방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 균주가 제거된 여과액에 알코올을 첨가하여 침전물을 수득하는 단계;를 더 포함하는 것인, 히알루론산의 제조방법.
  14. 청구항 7에 있어서,
    상기 히알루론산은 분자량이 0.4MDa 내지 1.2MDa인 것인, 히알루론산의 제조방법.
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