KR20230147675A - 다중 도메인 융합 단백질 및 이의 응용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 융합 단백질을 제공하고, 상기 융합 단백질은 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편, 길항 VEGF 단편, TGF-β 결합 단편을 포함한다. 본 발명에서 제공되는 항암 활성을 갖는 다중 도메인 융합 단백질은 하나의 항체 융합 단백질 분자에서 항-PD-L1 단클론 항체에 의한 PD-L1/PD-1 상호작용 차단, 항-VEGF 단클론 항체에 의한 미세혈관 성장 감소와 전이성 질환 억제, 및 TGF-β 수용체에 의한 TGF-β 신호에 대한 암 세포의 내성 해제와 면역 반응 증강의 기능과 유기적으로 결합하여 종양 치료에 사용될 수 있다.

Description

다중 도메인 융합 단백질 및 이의 응용
본 발명은 생명공학 분야에 관한 것으로, 특히 항암 활성을 갖는 다중 도메인 융합 단백질 및 이의 제조 방법과 용도에 관한 것이다.
종양 세포와 정상 세포의 차이점 중 하나는 성장에 필요한 높은 대사의 요구사항이다. 종양 세포는 혈관에 의존하여 영양분과 산소를 공급하고 대사산물을 처리하며 기존 혈관에서 신생혈관의 생성을 촉진한다. 종양에서 분비되는 혈관신생촉진인자에서, 인간 혈관내피성장인자(VEGF), 특히 VEGF-A는 종양의 혈관신생을 일으키는 중요한 요인이다(Josep Garcia 등, 2020, Cancer Treatment Reviews 86: 1-2). 따라서, VEGF 신호 전달 경로에 대한 억제는 다양한 종양의 진행을 제한할 수 있다. 예를 들어 베바시주맙(Bevacizumab, 상품명 )은 인간화 항-VEGF 단클론 항체로, VEGF에 결합하여 VEGF와 내피 세포 표면 VEGF 수용체(Flt-1 및 KDR)의 상호작용을 차단할 수 있다. 현재 베바시주맙은 전이성 결직장암, 진행성, 전이성 또는 재발성 비소세포폐암 및 재발성 교모세포종 등 치료에 사용되도록 FDA에서 승인을 받았다.
형질전환성장인자 TGF-β는 세포의 성장, 분화, 증식 및 생존을 조절하여 조직 항상성을 유지할 수 있는 사이토카인이다. TGF-β 경로는 종양의 초기 단계에서 세포 주기 정지 및 세포 사멸을 촉진하여 종양을 제어할 수 있지만; 종양의 후기 단계에서 TGF-β는 세포 독성 T 세포를 억제하고 암 세포의 증식, 침습 및 전이를 촉진하여 최종적으로 종양 탈출을 허용할 수도 있으며, 이러한 기능적 전환을 “TGF-β 패러독스”라고 한다. TGFβ 신호 전달 경로는 TH1 세포의 Tregs로의 분화를 유도하고 CD8+ 이펙터 T 세포의 활성화를 약화시키며 중앙 기억 T 세포의 발달을 제한하여 근본적으로 종양 침윤 T 세포 기능에 영향을 미친다. 포유동물에서, TGF-β는 주로 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3의 세 가지 서브타입이 있다. TGF-β를 높은 수준으로 발현함으로써 종양은 면역 감시로부터 보호를 받는다. 이와 일치하게, TGF-β를 고발현하는 비소세포폐암(NSCLC), 신세포암(CRC), 위암 및 전립선암은 모두 종양 진행 및 불량한 예후와 관련이 있다(Marin-Acevedo 등, Journal of Hematology & Oncology, 11:39, 2018). 이는 TGF-β 길항이 종양 치료의 잠재적인 새로운 방향이 될 것임을 보여준다.
현재, 면역 관문 억제제로서의 항-PD-1/PD-L1 단클론 항체는 종양 치료에 널리 사용되고 있다. 항-PD-L1 단클론 항체 Avelumab과 TGF-β 수용체 II(TGF-βTrap)의 융합체인 M7824는 임상 단계에 진입하였다. 그러나 항-PD-1/PD-L1 단클론 항체, TGF-β 길항제 및 항-VEGF 단클론 항체의 조합은 아직까지 보고된 바가 없다.
상술한 선행기술의 단점을 감안하여, 본 발명의 목적은 선행기술의 기술적 과제를 해결하기 위한 항암 활성을 갖는 다중 도메인 융합 단백질 및 이의 제조 방법과 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적 및 다른 관련 목적을 구현하기 위해, 본 발명의 일 양태는 융합 단백질을 제공하고, 상기 융합 단백질은 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편, 길항 VEGF 단편, TGF-β 결합 단편을 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 상기 융합 단백질을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 작제물 또는 게놈에 통합된 외인성의 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 시스템을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 적합한 조건에서 상기 융합 단백질을 발현하도록 상기 발현 시스템을 배양하고 분리 및 정제하여 상기 융합 단백질을 제공하는 단계를 포함하는 상기 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 약물의 제조에서 상기 융합 단백질, 또는 상기 발현 시스템의 배양물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 융합 단백질, 또는 상기 발현 시스템의 배양물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
도 1은 TAF-6과 Avastin의 혈중 농도-시간 곡선 하면적 그래프이다.
도 2는 PBMC 면역 시스템 인간화 MDA-MB-231 유방암 피하 이식 종양 모델에서 다중 도메인 융합 단백질의 항종양 효능을 보여준다.
도 3은 PBMC 면역 시스템 인간화 MDA-MB-231 유방암 피하 이식 종양 모델에서 다중 도메인 융합 단백질의 항종양 효능을 보여준다.
도 4는 PBMC 면역 시스템 인간화 MDA-MB-231 유방암 피하 이식 종양 모델에서 다중 도메인 융합 단백질 TAF-6, M7824 유사체, Avastin의 항종양 효능을 보여준다.
도 5는 PBMC 면역 시스템 인간화 Calu-6 폐암 피하 이식 종양 모델에서 다중 도메인 융합 단백질의 항종양 효능을 보여준다.
도 6은 PBMC 면역 시스템 인간화 Calu-6 폐암 피하 이식 종양 모델에서 다중 도메인 융합 단백질 TAF-6, M7824 유사체, Avastin의 항종양 효능을 보여준다.
도 7은 PBMC 면역 시스템 인간화 HCT116 결장암 피하 이식 종양 모델에서 다중 도메인 융합 단백질의 항종양 효능을 보여준다.
도 8은 PBMC 면역 시스템 인간화 Huh-7 간암 피하 이식 종양 모델에서 다중 도메인 융합 단백질의 항종양 효능을 보여준다.
도 9는 PBMC 면역 시스템 인간화 Huh-7 간암 피하 이식 종양 모델에서 다중 도메인 융합 단백질 TAF-6, M7824 유사체, Avastin의 항종양 효능을 보여준다.
도 10은 PBMC 면역 시스템 인간화 HT1080 육종 피하 이식 종양 모델에서 다중 도메인 융합 단백질의 항종양 효능을 보여준다.
본 발명의 발명자들은 많은 탐색과 연구 끝에 융합 단백질 분자를 예기치 않게 발견하였고, 상기 융합 단백질 분자는 항-PD-L1 단클론 항체에 의한 PD-L1/PD-1 상호작용 차단, 길항 VEGF 단클론 항체에 의한 미세혈관 성장 감소와 전이성 질환 억제, 및 TGF-β 수용체에 의한 종양 미세환경의 TGF-β로 인한 T 세포 기능 이상 개선과 면역 반응 증강의 기능과 결합하여 우수한 종양 억제 효과를 가질 수 있으며, 이 기초상에서 본 발명을 완료하였다.
본 발명의 제1 양태는 융합 단백질을 제공하고, 상기 융합 단백질은 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편, 길항 VEGF 단편, TGF-β 결합 단편을 포함한다. 상기 융합 단백질에서, 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편은 통상적으로 PD-L1/PD-1 상호작용을 차단하고 T 림프구의 IFN-γ 및/또는 IL-2 발현을 향상시켜 종양 성장을 억제할 수 있다. 길항 VEGF 단편은 통상적으로 FcRn 수용체에 결합할 수 있는 Fc 부분을 포함하여 체내 반감기를 연장하는 동시에 Fc 수용체를 발현하는 이펙터 세포에 결합하여 암 세포를 살상하는 작용을 일으킬 수 있다. TGF-β 결합 단편은 종양 미세환경의 과발현된 TGF-β를 제거하여 종양 세포에 대한 종양 침윤 T 세포의 살상 능력을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서 제공되는 융합 단백질에는 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편이 포함될 수 있다. 상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편은 통상적으로 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질 단편일 수 있다. 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편에는 통상적으로 대응되는 항체 경쇄가 결실되고 중쇄 가변 영역에 대응되는 단편만 있다. 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편의 결합 특성은 통상적으로 이에 포함되는 3개의 상보성 결정 영역(CDR, complementarity determining region)에 의해 결정될 수 있고, CDR 영역은 프레임워크 영역(FR, framework region)과 질서있게 배열될 수 있으며, FR 영역은 결합 반응에 직접 관여하지 않는다. 이러한 CDR는 고리형 구조를 형성할 수 있고, 이들 간의 FR에 의해 형성된 β 시트는 공간 구조에서 서로 근접하여 항체의 항원 결합 부위를 구성한다. 예를 들어, 상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편의 상보성 결정 영역(CDR)은 아미노산 서열의 서열번호 1~5 중 하나로 표시되는 CDR1, 서열번호 6~9 중 하나로 표시되는 CDR2, 서열번호 10~15 중 하나로 표시되는 CDR3을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체적인 실시예에서, 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편의 상보성 결정 영역은 아미노산 서열의 서열번호 1로 표시되는 CDR1, 서열번호 6으로 표시되는 CDR2, 서열번호 10으로 표시되는 CDR3을 포함한다.
본 발명의 다른 구체적인 실시예에서, 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편의 상보성 결정 영역은 아미노산 서열의 서열번호 2로 표시되는 CDR1, 서열번호 7로 표시되는 CDR2, 서열번호 11로 표시되는 CDR3을 포함한다.
본 발명의 다른 구체적인 실시예에서, 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편의 상보성 결정 영역은 아미노산 서열의 서열번호 3으로 표시되는 CDR1, 서열번호 7로 표시되는 CDR2, 서열번호 12로 표시되는 CDR3을 포함한다.
본 발명의 다른 구체적인 실시예에서, 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편의 상보성 결정 영역은 아미노산 서열의 서열번호 4로 표시되는 CDR1, 서열번호 8로 표시되는 CDR2, 서열번호 13으로 표시되는 CDR3을 포함한다.
본 발명의 다른 구체적인 실시예에서, 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편의 상보성 결정 영역은 아미노산 서열의 서열번호 2로 표시되는 CDR1, 서열번호 7로 표시되는 CDR2, 서열번호 14로 표시되는 CDR3을 포함한다.
본 발명의 다른 구체적인 실시예에서, 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편의 상보성 결정 영역은 아미노산 서열의 서열번호 5로 표시되는 CDR1, 서열번호 9로 표시되는 CDR2, 서열번호 15로 표시되는 CDR3을 포함한다.
상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편에는 프레임워크 영역(FR, framework region)이 더 포함될 수 있다. 상술한 바와 같이, CDR 영역은 FR 영역과 질서있게 배열될 수 있고, 예를 들어 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편은 N-말단에서 C-말단까지 순차적으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4를 포함할 수 있다. 프레임워크 영역(FR)은 아미노산 서열의 서열번호 49로 표시되는 FR1, 아미노산 서열의 서열번호 50~52 중 하나로 표시되는 FR2, 아미노산 서열의 서열번호 53~55 중 하나로 표시되는 FR3, 및 아미노산 서열의 서열번호 56으로 표시되는 FR4를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체적인 실시예에서, 상기 프레임워크 영역(FR)은,
아미노산 서열의 서열번호 49로 표시되는 FR1, 서열번호 50으로 표시되는 FR2, 서열번호 53으로 표시되는 FR3; 서열번호 56으로 표시되는 FR4, 또는
아미노산 서열의 서열번호 49로 표시되는 FR1, 서열번호 51로 표시되는 FR2, 서열번호 54로 표시되는 FR3; 서열번호 56으로 표시되는 FR4, 또는
아미노산 서열의 서열번호 49로 표시되는 FR1, 서열번호 52로 표시되는 FR2, 서열번호 54로 표시되는 FR3; 서열번호 56으로 표시되는 FR4, 또는
아미노산 서열의 서열번호 49로 표시되는 FR1, 서열번호 52로 표시되는 FR2, 서열번호 55로 표시되는 FR3; 서열번호 56으로 표시되는 FR4를 포함한다.
본 발명의 다른 구체적인 실시예에서, 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편은 a) 아미노산 서열의 서열번호 16~21 중 하나로 표시되는 폴리펩티드 단편; 또는, b) 아미노산 서열의 서열번호 16~21 중 하나와 80% 이상의 서열 동일성을 갖고 a)에서 한정된 폴리펩티드 단편의 기능을 갖는 폴리펩티드 단편을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 b)의 폴리펩티드 단편은 구체적으로 아미노산 서열의 서열번호 16~21 중 하나로 표시되는 아미노산 서열에 하나 이상(구체적으로 1-50, 1-30개, 1-20개, 1-10개, 1-5개, 또는 1-3개일 수 있음)의 아미노산이 치환, 결실 또는 추가되어 획득되거나, 또는 N-말단 및/또는 C-말단에 하나 이상(구체적으로 1-50개, 1-30개, 1-20개, 1-10개, 1-5개, 또는 1-3개일 수 있음)의 아미노산이 추가되어 획득되고, 아미노산 서열의 서열번호 16~21 중 하나로 표시되는 폴리펩티드 단편의 기능을 갖는 폴리펩티드 단편을 의미하며, 예를 들어 PD-L1에 특이적으로 결합하는 능력일 수 있고, PD-L1/PD-1 상호작용을 차단하여 PD-L1/PD1 경로를 차단하는 기능일 수도 있으며, T 림프구의 IFN-γ 및/또는 IL-2 발현을 향상시키는 기능일 수도 있고, 종양 성장을 억제하는 기능일 수도 있다. 상기 b)의 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편의 아미노산 서열은 서열번호 16~21 중 하나와 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 또는 99% 이상의 동일성을 가질 수 있다. 상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편은 통상적으로 알파카(Vicugna pacos)에서 유래될 수 있고, 예를 들어 이의 CDR 영역은 알파카에서 유래될 수 있다. 상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편은 통상적으로 인간화된 것일 수 있고, 예를 들어 이의 프레임워크 영역은 인간에서 유래될 수 있다.
본문에서, 서열 동일성(sequence identity)은 비교에 관여하는 서열의 동일한 잔기의 백분율을 의미한다. 본 분야에 공지된 컴퓨팅 소프트웨어를 사용하여 2개 이상의 서열의 서열 동일성을 계산할 수 있고, 이러한 소프트웨어를 NCBI에서 획득할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 융합 단백질에는 길항 VEGF 단편이 포함될 수 있다. 상기 길항 VEGF 단편은 통상적으로 VEGF를 길항할 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질 단편일 수 있다. 예를 들어, 상기 길항 VEGF 단편은 단클론 항체 등일 수 있다. 다른 예를 들어, 상기 길항 VEGF 단편은 베바시주맙 등일 수 있다.
본 발명의 일 구체적인 실시예에서, 길항 VEGF 단편은,
c) 아미노산 서열의 서열번호 22~23 중 하나로 표시되는 폴리펩티드 단편;
d) 아미노산 서열의 서열번호 22~23 중 하나와 80% 이상의 서열 동일성을 갖고 c)에서 한정된 폴리펩티드 단편의 기능을 갖는 폴리펩티드 단편을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 d)의 아미노산 서열은 구체적으로 서열번호 22~23 중 하나로 표시되는 아미노산 서열에 하나 이상(구체적으로 1-50, 1-30개, 1-20개, 1-10개, 1-5개, 1-3개, 1개, 2개, 또는 3개일 수 있음)의 아미노산이 치환, 결실 또는 추가되어 획득되거나, 또는 N-말단 및/또는 C-말단에 하나 이상(구체적으로 1-50개, 1-30개, 1-20개, 1-10개, 1-5개, 1-3개, 1개, 2개, 또는 3개일 수 있음)의 아미노산이 추가되어 획득되고, 아미노산의 서열번호 22~23 중 하나로 표시되는 폴리펩티드 단편의 기능을 갖는 폴리펩티드 단편을 의미하며, 예를 들어 VEGF를 길항하는 기능일 수 있고, FcRn 수용체에 결합하는 Fc 부분의 기능일 수도 있으며, 이로써 체내 반감기를 연장하는 동시에 Fc 수용체를 발현하는 이펙터 세포에 결합하여 암 세포를 살상하는 작용을 일으킬 수 있다. 상기 d)의 아미노산 서열은 서열번호 22~23 중 하나와 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 또는 99% 이상의 동일성을 가질 수 있다. 상기 길항 VEGF 단편은 통상적으로 마우스(Mus musculus)에서 유래될 수 있고, 예를 들어 이의 CDR 영역은 마우스에서 유래될 수 있다. 상기 길항 VEGF 단편은 통상적으로 인간화된 것일 수 있고, 예를 들어 이의 프레임워크 영역은 인간에서 유래될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 융합 단백질에는 TGF-β 결합 단편이 포함될 수 있다. 상기 TGF-β 결합 단편은 통상적으로 각 TGF-β 이성질체(예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3 등)에 특이적으로 결합할 수 있고, TGF-β 이성질체는 통상적으로 다양한 악성 종양에서 고발현되며, 임상 치료 효과가 좋지 않은 중요한 요인 중 하나일 수 있다. 예를 들어, TGF-β 결합 단편은 TGF-βRⅡ(TGF-β 수용체 II) 세포외 도메인 단편일 수 있다.
본 발명의 일 구체적인 실시예에서, TGF-β 결합 단편은,
e) 아미노산 서열의 서열번호 24로 표시되는 폴리펩티드 단편;
f) 아미노산 서열의 서열번호 24와 80% 이상의 서열 동일성을 갖고 e)에서 한정된 폴리펩티드 단편의 기능을 갖는 폴리펩티드 단편을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 f)의 아미노산 서열은 구체적으로 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열에 하나 이상(구체적으로 1-50, 1-30개, 1-20개, 1-10개, 1-5개, 1-3개, 1개, 2개, 또는 3개일 수 있음)의 아미노산이 치환, 결실 또는 추가되어 획득되거나, 또는 N-말단 및/또는 C-말단에 하나 이상(구체적으로 1-50개, 1-30개, 1-20개, 1-10개, 1-5개, 1-3개, 1개, 2개, 또는 3개일 수 있음)의 아미노산이 추가되어 획득되고, 아미노산의 서열번호 24로 표시되는 폴리펩티드 단편의 기능을 갖는 폴리펩티드 단편을 의미하며, 예를 들어 각 TGF-β 이성질체(예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3 등)에 결합하여 종양 미세환경의 과발현된 TGF-β를 제거할 수 있고 종양 세포에 대한 종양 침윤 T 세포의 살상 기능을 향상시킬 수도 있다. 상기 f)의 아미노산 서열은 서열번호 24와 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 또는 99% 이상의 동일성을 가질 수 있다. 상기 TGF-β 결합 단편은 통상적으로 인간(homo sapiens)에서 유래될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 융합 단백질에는 연결 펩티드(connecting peptide) 단편이 더 포함될 수 있다. 상기 융합 단백질에는 통상적으로 다수의 연결 펩티드 단편이 포함될 수 있고, 적어도 일부 도메인 또는 각 도메인 사이에는 모두 연결 펩티드 단편이 구비될 수 있다. 예를 들어, 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편, 길항 VEGF 단편 사이에는 연결 펩티드가 구비될 수 있다. 다른 예를 들어, 길항 VEGF 단편, TGF-β 결합 단편 사이에는 연결 펩티드가 구비될 수 있다. 상기 연결 펩티드 단편은 통상적으로 G, S 및/또는 A(주로 글리신(G), 세린(S) 및/또는 알라닌(A)으로 구성)가 풍부한 적합한 길이의 연성 폴리펩티드일 수 있고, 이로써 인접한 단백질 도메인은 서로에 대해 자유롭게 이동할 수 있다. 예를 들어, 상기 연결 펩티드 단편의 아미노산 서열은 예를 들어 (GS)n, (GGS)n, (GGSG)n, (GGGS)nA, (GGGGS)nA, (GGGGS)nG, (GGGGA)nA, (GGGGG)nA 등 서열을 포함할 수 있고, 여기서 n은 1-10 사이의 정수로부터 선택된다. 본 발명의 일 구체적인 실시예에서, 상기 연결 펩티드 단편의 아미노산 서열의 길이는 3-30, 3-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-12, 12-14, 14-16, 16-18, 18-20, 20-22, 22-24, 24-26, 26-28, 또는 28-30일 수 있다. 본 발명의 보다 바람직한 구체적인 실시예에서, 상기 연결 펩티드 단편은 아미노산 서열의 서열번호 34~36 중 하나로 표시되는 폴리펩티드 단편을 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 융합 단백질에서, 융합 단백질은 선형일 수 있고, 예를 들어 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지 순차적으로 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편, 길항 VEGF 단편, TGF-β 결합 단편을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 또한 단클론 항체와 유사한 구조를 가질 수 있고, 예를 들어 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편은 길항 VEGF 단편의 중쇄의 N-말단에 위치할 수 있으며, 다른 예를 들어 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편은 길항 VEGF 단편의 경쇄의 N-말단에 위치할 수 있고, 다른 예를 들어 TGF-β 결합 단편은 길항 VEGF 단편의 중쇄의 C-말단에 위치할 수 있다. 본 발명의 일 구체적인 실시예에서, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 23, 서열번호 25~33 중 하나로 표시되는 서열을 포함할 수 있고, 예를 들어 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 25 및 서열번호 26으로 표시되는 서열, 서열번호 25 및 서열번호 27로 표시되는 서열, 서열번호 25 및 서열번호 28로 표시되는 서열, 서열번호 25 및 서열번호 29로 표시되는 서열, 서열번호 30 및 서열번호 27로 표시되는 서열, 서열번호 30 및 서열번호 29로 표시되는 서열, 서열번호 31 및 서열번호 23으로 표시되는 서열, 서열번호 32 및 서열번호 23으로 표시되는 서열, 서열번호 33 및 서열번호 23으로 표시되는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 제2 양태는 본 발명의 제1 양태에서 제공되는 융합 단백질을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA 또는 cDNA 등일 수 있다. 상기 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 자동 DNA 합성 및/또는 재조합 DNA 기술 등 방법에 의해 제조될 수 있고, 적절한 천연 공급원에서 분리될 수도 있다.
본 발명의 제3 양태는 본 발명의 제2 양태에서 제공되는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물(construct)을 제공한다. 상기 작제물을 구축하는 적합한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 작제물은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술, 체내 재조합 기술 등 방법에 의해 구축될 수 있고, 보다 구체적으로 상기 분리된 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터의 다중 클로닝 부위에 삽입되어 구축될수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 통상적으로 분 분야에 공지된 다양한 시판 발현 벡터 등을 의미하고, 예를 들어 박테리아 플라스미드, 파지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 아데노바이러스 및 레트로바이러스와 같은 포유동물 세포 바이러스 또는 다른 벡터일 수 있다. 통상적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 작용하는 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 효소 부위 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 프로모터는 대장균의 lac 또는 trp 프로모터; λ 파지 PL 프로모터; CMV 즉시 초기 프로모터, HSV 티미딘 키나아제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 피키아 파스토리스의 메탄올 옥시다아제 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이의 바이러스에서 제어 가능한 유전자가 발현되는 일부 공지된 다른 프로모터를 포함하는 진핵 프로모터를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 마커 유전자는 형질전환된 숙주 세포를 선택하기 위한 표현형 특성을 제공하기 위해 사용될 수 있고, 예를 들어 진핵 세포 배양을 위한 디히드로엽산환원효소, 네오마이신 내성 및 녹색 형광 단백질(GFP), 또는 대장균을 위한 테트라사이클린 또는 암피실린 내성 등을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드가 발현되는 경우, 발현 벡터에는 인핸서 서열이 더 포함될 수 있고, 벡터에 인핸서 서열이 삽입되면 전사가 증강되며, 인핸서는 DNA의 시스 작용 인자이고, 통상적으로 약 10개 내지 300개의 염기쌍이 있으며, 프로모터에 작용하여 유전자의 전사를 증강시킨다.
본 발명의 제4 양태는 본 발명의 제3 양태에서 제공되는 작제물 또는 게놈에 통합된 외인성의 본 발명의 제2 양태에서 제공되는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 상기 융합 단백질을 발현할 수 있는 발현 시스템을 제공한다. 상기 발현 시스템은 숙주 세포일 수 있고, 발현 벡터의 발현에 적용되는 임의의 세포는 모두 숙주 세포로 사용될 수 있으며, 예를 들어 숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포; 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포; 사상균 세포, 또는 포유동물 세포와 같은 고등 진핵 세포일 수 있다. 대표적인 예로는 대장균, 스트렙토미세스과; 쥐티푸스균의 박테리아 세포; 효모, 사상균, 식물 세포와 같은 진균 세포; 초파리 S2 또는 Sf9의 곤충 세포; CHO, COS, 293 세포, 또는 Bowes 흑색종 세포의 동물 세포 등이 있다. 작제물을 숙주 세포에 도입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 미량주사법, 유전자총법, 전기천공법, 바이러스 매개 형질전환법, 전자충격법, 인산칼슘 침전법 등 방법일 수 있다.
본 발명의 제5 양태는 본 발명의 제1 양태에서 제공되는 융합 단백질의 제조 방법을 제공하고, 당업자는 적합한 방법을 선택하여 상기 융합 단백질을 제조할 수 있으며, 예를 들어 상기 제조 방법은 적합한 조건에서 상기 융합 단백질을 발현하도록 본 발명의 제4 양태에서 제공되는 발현 시스템을 배양하고 상기 융합 단백질을 포함하는 배양물을 수집한 다음 분리 및 정제하여 상기 융합 단백질을 제공하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 제6 양태는 약물의 제조에서 본 발명의 제1 양태에서 제공되는 융합 단백질, 본 발명의 제4 양태에서 제공되는 발현 시스템의 배양물의 용도를 제공한다. 상기 약물은 종양 치료를 위한 약물일 수 있고, 예를 들어 암 또는 고형 종양일 수 있으며, 구체적으로 폐암, 흑색종, 위암, 난소암, 결장암, 간암, 신장암, 방광암, 유방암, 고전적 호지킨 림프종, 혈액 악성 종양, 육종, 두경부암 및 비인두암 등일 수 있고, 이러한 암은 초기, 중기 또는 후기, 예를 들어 전이암 등일 수 있다.
본 발명의 제7 양태는 본 발명의 제1 양태에서 제공되는 융합 단백질 또는 본 발명의 제4 양태에서 제공되는 발현 시스템의 배양물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물에서, 융합 단백질 또는 배양물의 함량은 통상적으로 치료 유효량이다. 본 발명에서, “치료 유효량”은 통상적으로 적절한 투여 기간 후에 질환 증상의 중증도를 감소시키거나, 질환 무증상 단계의 빈도 및 지속 시간을 증가시키거나, 질환 통증으로 인한 손상 또는 장애를 방지할 수 있는 용량을 의미한다. 종양 성장을 억제하는 능력은 인간 종양에 대한 치료 효과를 예측하는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 또는, 세포 성장을 억제하는 능력의 검사를 통해 평가될 수도 있고, 이러한 억제는 당업자에게 공지된 시험을 통해 시험관내에서 측정될 수 있다. 치료 유효량의 융합 단백질, 약학적 조성물은 통상적으로 종양의 크기를 감소시키거나, 다른 방식으로 대상체의 증상을 완화할 수 있다. 당업자는 실제 상황에 따라 적합한 치료 유효량을 선택할 수 있고, 예를 들어 대상체의 크기, 대상체 증상의 중증도 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로일 수 있다. 치료의 처방(예를 들어, 용량에 대한 결정 등)은 의사에 의해 결정될 수 있고, 통상적으로 고려되는 요인은 치료되는 질환, 환자 개체의 상황, 전달 부위, 투여 방법 및 다른 요인 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 제공되는 약학적 조성물에는 약학적으로 허용 가능한 담체가 더 포함될 수 있다. 상기 담체는 다양한 부형제 및 희석제를 포함할 수 있고, 이러한 담체 자체는 필수 활성 성분이 아니며, 투여 후 과도한 독성을 유발하지 않는다. 적합한 담체는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co., N.J., 1991)에서 약학적으로 허용 가능한 담체에 관한 철저한 논의를 찾아볼 수 있다.
본 발명의 제8 양태는 개체에게 치료 유효량의 본 발명의 제1 양태에서 제공되는 융합 단백질, 본 발명의 제4 양태에서 제공되는 발현 시스템의 배양물, 또는 본 발명의 제7 양태에서 제공되는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서, “치료”라는 용어는 원하는 약학적 및/또는 생리학적 효과를 일으킬 수 있는 예방적, 치료적 또는 완화적 조작을 포함한다. 바람직한 치료 효과는 의학적으로 질환의 하나 이상의 증상이 감소되거나 질환이 완전히 제거되거나, 또는 질환의 발생이 차단 또는 지연되거나 및/또는 질환의 발달 또는 악화의 위험이 감소될 수 있음을 의미한다.
본 발명에서, “개체”는 통상적으로 인간, 비인간의 영장류, 또는 다른 포유동물(예를 들어 개, 고양이, 말, 양, 돼지, 소 등)을 포함하고, 상기 제제, 키트 또는 병용 제제로 치료하면 도움이 될 수 있다.
본 발명에서, 상기 융합 단백질, 발현 시스템의 배양물, 또는 약학적 조성물은 단일 유효 성분으로 사용될 수 있고, 다른 약제와 병용될 수도 있으며, 이로써 병용 치료에서 투여될 수 있다. 예를 들어, 항암 활성을 갖는 상기 다중 도메인 융합 단백질, 발현 시스템의 배양물, 또는 약학적 조성물은 적어도 하나의 다른 항종양 약물과 조합될 수 있다. 다른 예를 들어, 항암 활성을 갖는 상기 다중 도메인 융합 단백질, 발현 시스템의 배양물, 또는 약학적 조성물은 다른 종양 특이적 항원을 표적으로 하는 항체와 병용될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항암 활성을 갖는 다중 도메인 융합 단백질은 하나의 항체 융합 단백질 분자에서 항-PD-L1 단클론 항체에 의한 PD-L1/PD-1 상호작용 차단, 항-VEGF 단클론 항체에 의한 미세혈관 성장 감소와 전이성 질환 억제, 및 TGF-β 수용체에 의한 TGF-β 신호에 대한 암 세포의 내성 해제와 면역 반응 증강의 기능과 유기적으로 결합하여 종양 치료에 사용될 수 있고, 산업화 전망이 우수하다.
이하, 특정된 구체적인 실시예를 통해 본 발명의 실시형태를 설명하고, 당업자는 본 명세서에 공개된 내용으로부터 본 발명의 다른 장점 및 효과를 용이하게 이해할 수 있다. 본 발명은 또한 다른 상이한 구체적인 실시형태를 통해 구현 또는 응용될 수 있고, 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 한 본 명세서의 각 세부사항도 상이한 관점 및 응용에 기반하여 다양한 수정 또는 변경을 이룰 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시형태를 추가로 설명하기 전에, 본 발명의 보호범위는 하기 특정된 구체적인 실시형태에 한정되지 않음을 이해해야 하며; 또한, 본 발명의 실시예에 사용된 용어는 특정된 구체적인 실시형태를 설명하기 위한 것이고, 본 발명의 보호범위를 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다.
실시예에서 수치 범위가 주어질 때, 본 발명에서 달리 명시되지 않는 한 각 수치 범위의 2개의 끝점 및 2개의 끝점 사이의 임의의 수치는 모두 선택될 수 있음을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일하다. 실시예에 사용된 구체적인 방법, 기기, 재료외에도, 선행기술에 대한 당업자의 이해 및 본 발명의 기재에 따라, 본 발명의 실시예에 따른 방법, 기기 재료와 유사하거나 동일한 선행기술의 임의의 방법, 기기 및 재료를 사용하여 본 발명을 구현할 수도 있다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명에 공개된 실험 방법, 검출 방법, 제조 방법은 모두 본 기술분야의 일반적인 분자생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 분석 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 기술 및 관련 분야의 일반적인 기술을 사용한다. 이러한 기술은 기존 문헌에 충분히 설명되어 있고, 구체적으로 Sambrook 등 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel 등, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol.304, Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119, Chromatin Protocols(P.B.Becker, ed.)Humana Press, Totowa, 1999 등을 참조할 수 있다.
실시예 1 융합 단백질의 구축 및 재조합 발현 제조
CHO 세포 코돈의 선호도에 따라 표 1의 다중 도메인 융합 단백질의 아미노산 서열, PD-L1-Fc 융합 단백질(서열번호 47) 및 Fc-TGFβRII 융합 단백질(서열번호 48)을 각각 염기 서열로 변환하고, 중쇄 및 경쇄 코딩 서열의 5' 말단에 각각 HindIII 제한 부위 및 Kozak 서열(GCCACC)을 도입하며, 3' 말단에 정지 코돈 및 EcoRI 제한 부위를 도입하여 유전자 합성(General Biosystems (Anhui) Co., Ltd.)을 통해 전장 DNA를 얻었다. 합성된 중쇄 및 경쇄 코딩 유전자에 대해 각각 HindIII-HF(NEB에서 구입, R3104V) 및 EcoRI-HF(NEB에서 구입, R3101V) 이중 효소 절단을 수행하고, 아가로스 겔 DNA/PCR 산물 소량 회수 키트(Biomiga에서 구입)로 겔 절단 회수를 수행하며, 마찬가지로 HindIII 및 EcoRI 이중 효소 절단을 수행한 pCDNA3.1(+) 벡터를 T4 리가아제(NEB에서 구입, M0202V)로 연결하여 Top10 컴피턴트를 형질전환시키고, LB 암피실린 내성 플레이트에 코팅하여 배양하였다. 클론을 선택하여 동정하고 시퀀싱하여 확인하며, pCDNA3.1(+) 기반의 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드를 각각 구축하였다. 내독소가 없는 플라스미드 대량 추출 키트(Biomiga에서 구입, BW-PD3511-02)를 사용하여 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드를 각각 추출하고, 양자를 1:1로 혼합하였다. 1.0mg의 혼합 플라스미드를 취하고, Wayne293 발현 배지(Zhongshan Kangsheng에서 구입, A21501)를 사용하여 25mL로 희석하며; 3.0mg의 PEI(선형, 25KD, Polysciences, Inc.)를 취하고, Wayne293 발현 배지를 사용하여 25mL로 희석한 다음 플라스미드 용액에 첨가하며, 균일하게 혼합하고, 실온에서 30분 동안 배양하였다. 대수성장기의 Hek293F 세포(생존율>95% )를 취하여 계수하고; 1100rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 버리며, 450mL의 Wayne293 발현 배지로 세포를 재현탁하였다. 상기 플라스미드-PEI 혼합물을 세포 현탁액에 첨가하고, 37℃, 5% CO2의 진탕 배양기에서 7일 동안 배양한 후, 후속 단백질 정제를 위해 원심분리를 통해 상층액을 얻었다.
표 1 다중 도메인 융합 단백질의 아미노산 서열 및 코딩 서열
실시예 2 다중 도메인 융합 단백질의 정제
2.1 항-VEGF 단클론 항체의 중쇄 N-말단에 위치하는 항-PD-L1 단일 도메인 항체
세포 발효 상층액을 pH 7.0으로 조절한 후 Protein A 친화성 크로마토그래피 컬럼(Bestchrom Biosciences Co., Ltd)에 로딩하고, 평형액은 20mM PB, 0.15M NaCl(pH＝7.0)이며, 100% 0.1M Gly-HCl(pH＝3.0)로 용리하고; 용리액은 사전에 10% 1M Tris-HCl(pH＝8.5)을 첨가하였다. 100% 용리액을 전도도 <3ms/cm로 희석하고, 상층액을 pH 7.0으로 조절하여 DSP 크로마토그래피 컬럼(Bestchrom Biosciences Co., Ltd)에 로딩하며, 각각 15% 및 100%로 용리(20mM PB, 0.5M NaCl, pH7.0)하였다. 15% 용리 성분을 얻고, 즉 목적 단백질이다. UV280 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다.
2.2 항-VEGF 단클론 항체의 경쇄 N-말단에 위치하는 항-PD-L1 단일 도메인 항체
세포 발효 상층액을 pH 7.0으로 조절한 후 Protein A친화성 크로마토그래피 컬럼(Bestchrom Biosciences Co., Ltd)에 로딩하고, 평형액은 20mM PB,0.15M NaCl(pH＝7.0)이며, 100% 0.1M Gly-HCl(pH＝3.0)로 용리하고; 용리액은 사전에 10% 1M Tris-HCl(pH＝8.5)을 첨가하였다. 100% 용리액을 전도도 4ms/cm로 희석하고, Super Q(TOSOH) 크로마토그래피 컬럼에 로딩하며, 평형액은 20mM Tris, pH8이고, 용리액은 500mM NaCl+20mM Tris(pH＝8.0)이며, 각각 35% 및 100%로 용리하고, 플로우스루를 통해 과량의 경쇄를 제거하여, 35% 용리 성분을 얻으며, 즉 목적 단백질이다. UV280 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다.
순도 검출은 SEC-HPLC-UV 분석을 사용하였다. 검출기: Agilent 1100LC; 검출 파장: 214nm; 이동상: 150mM pH7.0PB+5% 이소프로판올; 크로마토그래피 컬럼: Superdex 200 Increase 5/150 GL; 실행 시간: 15분; 컬럼 온도 25℃. 검출 결과는 순도가 모두 95% 초과임을 보여주었다.
PD-L1-Fc 융합 단백질(서열번호 47) 및 Fc-TGFβRII 융합 단백질(서열번호 48)의 정제: 세포 발효 상층액을 pH 7.0으로 조절한 후 Protein A친화성 크로마토그래피 컬럼(Bestchrom Biosciences Co., Ltd)에 로딩하고, 평형액은 20mM PB,0.15M NaCl(pH＝7.0)이며, 100% 0.1M Gly-HCl(pH＝3.0)로 용리하고; 용리액은 중화를 위해 사전에 10% 1M Tris-HCl(pH＝8.5)을 첨가하였다.
실시예 3 시험관내에서 다중 도메인 융합 단백질의 기능 동정
3.1 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편의 시험관내 활성 검출:
CD5L-OKT3scFv-CD14 유전자 서열(GenBank: ADN42857.1)을 합성하고, HindIII-EcoRI(Takara)로 효소 절단하며, 벡터 pCDNA3.1을 삽입하여, pCDNA3.1-antiCD3TM을 구축하였다. 인간 PD-L1 유전자(GenBank: NM_014143.2)를 주형으로 하고, 고충실도 증폭에 의해 얻은 PD-L1 단편을 재조합 연결하고 pCDNA3.1-antiCD3TM을 삽입하여, pCDNA3.1-antiCD3TM-PDL1을 구축하였다. CHO 세포(Thermo)를 형질감염시킨 후, G418로 10-14d를 선택하여 안정적인 세포주 CHO-antiCD3TM-PDL1을 생성하였다.
인간 PD1 유전자(GenBank: NP_005009.2)를 주형으로 하고 증폭에 의해 얻은 단편을 HindIII-BamHI(Takara) 효소 절단된 PB513B1-dual-puro 벡터(UNIBIO)에 재조합 연결하여, 플라스미드 pB-PD1을 구축하였다. pGL4.30(UNIBIO)을 주형으로 하고 고충실도 증폭을 수행하며, 회수에 의해 얻은 단편을 SfiI-XbaI(Takara) 효소 절단된 pB-PD1 벡터에 재조합 연결하여, pB-NFAT-Luc2p-PD1 플라스미드를 구축하였다. 플라스미드를 성공적으로 구축한 후 내독소가 없는 플라스미드 대량 추출 키트(Biomiga)로 플라스미드를 추출하여 Jurkat 세포(중국과학원 줄기세포은행)를 형질감염시켰다. 특허 CN 107022571A의 방법을 참조바라고, 0.1mg/ml의 폴리-D-라이신을 사용하여 Jurkat 세포를 상대적으로 부착 상태로 처리한 다음, 리포솜 형질감염 키트(Lipofectamine 3000; invitrogen)의 형질감염 지침에 따라 Jurkat 세포를 형질감염시키며; 3일차에 10% FBS 및 2.5μg/ml 퓨로마이신을 함유하는 RPMI1640 배지(Thermo)로 가압 스크리닝을 수행하고; 이후 일정한 간격으로 배지를 보충하며, 세포 생존율이 회복된 후 퓨로마이신의 함량을 4μg/ml로 점차 증가시켰다. 최종적으로 단클론 Jurkat-NFAT-Luc2p-PD1 세포주를 얻었다.
CHO-antiCD3TM-PDL1, Jurkat-NFAT-Luc2p-PD1 세포를 취하여 계수하고, 세포 밀도를 4×106/ml로 조정하며, 96웰 플레이트의 각 웰에 각 세포를 25μl씩 첨가하고; 실시예 2에서 제조된 융합 단백질 샘플을 각각 1% BSA로 구배 희석하여 50μl를 세포에 첨가하며; 37℃, 5% CO2에서 6시간 동안 공동 배양한 후, 각 웰에 10μl의 루시퍼라제 기질(Promega, E2620)을 첨가하고, 진탕기에서 2분 동안 진탕한 후 판독하였다. 조작은 키트 지침에 따라 수행되었다.
3.2 길항 VEGF 단편의 시험관내 활성 검출:
6웰 세포 배양 플레이트에 HEK293 세포를 웰당 1.0×106 세포로 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 형질감염 시약의 지침에 따라 형질감염 시스템을 조제하고, 여기서 pcDNA-KDR 플라스미드 1.0μg, pGL4.30 플라스미드 4μg이다. 형질감염 48시간 후, 10cm 세포 배양 접시에 세포를 확장시키고, 200μg/ml의 G418, 100μg/ml의 히그로마이신(Hygromycin)을 첨가하였다. 명백한 클론 집락이 자랄 때까지 3일마다 신선합 가압 배지를 교체하였다. 세포를 소화하고, 96웰 세포 배양 플레이트에 플레이팅하며, 단클론 성장 후 0.1μg/ml의 VEGF를 사용하여 6시간 자극하고 화학 발광 상황을 검출하며, 신호 반응이 명백한 클론을 선택하여 계속 확장 배양하였다. 최종적으로 단클론 HEK293-NFAT-KDR를 얻었다. HEK293-NFAT-KDR 세포를 40,000개/웰의 밀도로 플레이팅하고, Accutase를 사용하여 소화하며; 소화된 세포를 수집하고, 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하며; 상층액을 버리고, 분석 배양액(DMEM+5% FBS)을 첨가하여 세포를 재현탁하며; 세포를 계수하고, 세포 밀도를 1.6×106/ml로 조정하며; 96웰 세포 배양 플레이트에 웰당 25ul로 플레이팅하고; 분석 배양액을 사용하여 VEGF 용액을 조제하고, 농도는 60ng/ml이며; 세포 배양 플레이트에 웰당 25ul로 첨가하고; 분석 배양액을 사용하여 실시예 2에서 제조된 융합 단백질을 조제하고, 세포 배양 플레이트에 웰당 25ul로 첨가하며; 37℃, 5% CO2에서 6시간 동안 배양하고; 각 웰에 10ul의 Bright-Glo 루시퍼라제 검출 시약(Promega, E2620)을 첨가하며, 2분 동안 진탕한 후 80ul의 용해액을 ELISA 백색 플레이트에 옮기고, 마이크로플레이트 리더로 판독하였다.
3.3 TGF-β 결합 단편의 시험관내 세포 활성 검출:
마우스 유방암 세포 4T1 세포를 약 90%(10cm 원형 접시)까지 자라도록 배양하고, 트립신으로 소화하며, 세포를 4×105개/웰로 6웰 플레이트에 플레이팅하고, 밤새 배양하였다. 흡인 추출된 pGL4.48[luc2P SBE Hygro] 플라스미드 샘플을 으로 4T1 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 얻은 TGFβ-4T1 세포를 트립신으로 소화하고 10cm 배양 접시에 옮기며, 10% FBS 및 150ug/ml 히그로마이신(InvivoGen, Cat no.: ant-hg-1)을 함유하는 RPMI 1640 배지를 사용하여 세포를 가압 스크리닝하였다. 가압 스크리닝 10~15일 후 TGFβ-4T1 세포를 2개/웰로 플레이팅하여 단클론 스크리닝을 수행하고, TGFβ1(Novoprotein, 10ug, Cat no.: CA59)을 사용하여 단클론 세포를 자극하여 단클론의 형질감염 효과를 검증하며, 최종적으로 TGFβ-4T1 단클론 세포를 얻었다.
TGFβ-4T1 세포가 약 90%까지 자란 후, 약 2.5ml의 0.25% 트립신을 첨가하여 소화하고, 실온에서 2분 동안 소화하며; 배양 접시에 부착된 세포를 불어내고, 트립신 용액에 불어 분산시키며, 전체 소화 과정에서 ~5분 동안 사용하고, 완전 배지(RPMI 1640+10% FBS)를 첨가하여 소화를 종료하며, 세포가 균일하게 분산될 때까지 세포를 불어내고; 세포를 50m 원심분리관에 옮긴 후, 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하며; 상층액을 버리고, 2ml의 완전 배지를 첨가하여 세포를 재현탁하며, 세포 계수기를 사용하여 세포 밀도를 측정하고; 완전 배지(RPMI 1640+10% FBS)를 사용하여 세포를 희석하여 세포 밀도가 2×105개/ml 되도록 하며; 희석된 세포(밀도 2×105개/ml)를 웰당 100ul로 플레이팅(96웰 플레이트)하고, 세포 밀도는 2×104개/웰이며, 96웰 플레이트를 37℃ 인큐베이터에 넣고 밤새 배양하며; 실시예 2에서 제조된 융합 단백질 샘플을 RPMI 1640+0.2% FBS 배지(2ng/ml TGFβ1 함유)로 지정된 농도(각 단백질 샘플을 희석한 후 실온에서 1시간 동안 배치함)로 희석하고; 37℃ 인큐베이터에서 밤새 배양된 TGFβ-4T1 세포의 상층액을 버리고, 50ul RPMI 1640+0.2% FBS 배지를 첨가한 후 상이한 농도의 단백질 용액을 50μl 첨가하며; 96웰 플레이트를 37℃ 인큐베이터에 넣고 3시간 동안 계속 배양한 후 10ul의 Bright-Glo 루시퍼라제 검출 시약(Promega, E2620)을 첨가하여 3분 동안 진탕하며; 마이크로플레이트 리더로 판독하였다.
각 다중 도메인 융합 단백질의 항-PD-L1 활성, 항-VEGF 활성, 항-TGFβ 활성의 측정 결과는 표 2에 나타내어 있다. 표 2로부터 알 수 있다시피, 각 다중 도메인 융합 단백질은 모두 우수한 시험관내 세포 활성을 갖는다.
표 2 다중 도메인 융합 단백질의 시험관내 세포 활성
실시예 4 C57BL /6 마우스 체내에서 다중 도메인 융합 단백질의 약동학
C57BL/6 마우스를 4 그룹으로 나눈 바, 각각 Avastin(Roche) 저용량(1mg/kg) 및 고용량(10mg/kg), TAF-6 저용량(1mg/kg) 및 고용량군(10mg/kg)이고, 각 군은 8마리이며, 절반은 암컷이고 절반은 수컷이다. 마우스에 꼬리 정맥 주사로 약물을 단일 투여하고, 상이한 시점에서 약동학적 샘플을 교차 수집하였다. 수집 시간은 투여 전, 투여 후 1h, 6h, 24h, 48h, 78h, 120h, 144h, 168h, 192h, 216h이다. ELISA 방법을 통해 약동학적 샘플의 혈청 약물 농도를 정량적으로 검출하였다. VEGF 코팅 플레이트, 2차 항체 Goat anti-Human IgG Fc, HRP 결합 약물, TMB 방법을 사용하여 검출하고, 표준 곡선의 신호와 농도값의 관계에 따라 회귀 분석하여 농도값으로 변환하며, PK Solver 소프트웨어의 비구획 모델을 사용하여 주요 약동학적 파라미터를 계산하였다.
결과는 도 1에 도시된 바와 같고, C57BL/6 마우스 투여에서 Avastin 및 TAF-6 고용량 및 저용량군은 약동학적 파라미터가 유사하다. Avastin 저용량, 고용량군의 투여량 비율은 1:10이고, Cmax의 비율은 1:9.3이며, AUClast의 비율은 1:8.9이고, Tmax는 모두 1시간이며, 노출량(Cmax 및 AUClast)의 증가는 용량에 비례하여 증가한다. TAF-6 저용량, 고용량군의 투여량 비율은 1:10이고, Cmax의 비율은 1:8.6이며, AUClast의 비율은 1:8.5이고, Tmax는 모두 1시간이며, 노출량(Cmax 및 AUClast)의 증가는 용량에 비례하여 증가한다. 따라서, Avastin 및 TAF-6군의 고용량과 저용량 간에 AUC 및 Cmax는 모두 용량 선형 상관관계를 나타낸다. Avastin 및 TAF-6의 AUC 차이는 PD-L1 표적 매개 제거 효과(TMDD)로 추정된다.
실시예 5 PBMC 인간화 유방암 MDA -MB-231 마우스 체내에서 다중 도메인 융합 단백질의 종양 억제 활성
MDA-MB-231(인간 유방암) 세포를 이용하여 인간 PBMC 면역 시스템 인간화 마우스(M-NSG 마우스) 체내에서 모델링하여 본 발명의 다중 도메인 융합 단백질의 체내 약효를 측정하였다. 6-8주령 암컷 M-NSG 마우스를 스크리닝하고, 마우스에 MDA-MB-231 세포(10×10E6+매트리겔(matrigel) 25%)를 접종하며, 7일차에 PBMC(5×10E6/0.2ml)를 꼬리 정맥 주사하고, 그 후 종양 부피 및 체중을 관찰하며, 종양 부피가 140-260mm3 사이인 마우스를 선택하고, 종양 부피 및 체중에 따라 6 그룹으로 무작위로 나누며, 각 그룹은 7마리이고, 그룹화 당일 투여를 시작하였다. 종양 보유 마우스의 종양 부피가 너무 크거나 너무 작으면 탈락시켰다. 매주 2회 복강내 주사: PBS, 동형 대조 IgG1, 양성 대조 Tecentriq(Roche), TAF-6, TAF-7 및 병용 투여(구체적인 방안은 표 3과 같음), 약 3주 동안 투여하였다. PD-L1-Fc 융합 단백질(서열번호 47)은 항-PD-L1 단일 도메인 항체와 인간 IgG Fc의 융합 단백질(항-PD-L1 단일 도메인 항체는 Fc의 N-말단에 위치함)이고, Fc-TGFβRII 융합 단백질(서열번호 48)은 인간 IgG Fc와 TGFβRII의 융합 단백질(TGFβRII는 Fc의 C-말단에 위치함)이다.
그룹화 전 및 실험 종료 전에 마우스의 안와 정맥에서 혈액을 채취하고, FACS 검출 결과는 각 군의 마우스 말초혈액에 인간 CD45 양성 세포가 존재하고 CD45 비율이 시간에 따라 증가함을 보여주며, 이는 마우스 면역 시스템의 인간화가 성공적임을 나타낸다. 실험 과정에 그룹 3과 그룹 4의 동물 체중(매주 2회 측정)은 대체적으로 안정적이고, 실험 동물의 사망 상황은 없으며, 그룹 3과 그룹 4의 종양 부피(매주 2회 측정)는 그룹 6의 병용 투여보다 작고, 그룹 2의 상응한 단일 약제 Tecentriq보다 현저히 작으며, 결과는 도 2에 도시된 바와 같다.
표 3
실시예 6 PBMC 인간화 유방암 MDA -MB-231 마우스 체내에서 다중 도메인 융합 단백질의 종양 억제 활성
인간 유래 유방암 MDA-MB-231 종양 덩어리를 암컷 NCG 마우스 우측 옆구리에 피하 접종하고, 종양 덩어리 접종 1일 후 PBMC 세포를 마우스 체내에 접종하며, 종양이 약 53mm3로 자랐을 때 그룹화 투여하고, 그룹당 10마리씩 총 6 그룹이며, 각각 Vehicle군, TAF-6 저용량(2mg/kg, i.p., tiw×9)군, TAF-6 중간용량(6mg/kg, i.p., tiw×9)군, TAF-6 고용량(18mg/kg, i.p., tiw×9)군, Tecentriq(4mg/kg, i.p., tiw×9)군, Avastin(4mg/kg, i.p., tiw×9)군이다. 매주 종양 부피 및 체중을 측정하고, 종양 보유 마우스의 체중 및 종양 부피의 변화와 투여 시간의 관계를 기록하였다.
그룹화 2일 전 및 실험 종료 시 안와 정맥총에서 혈액을 채취하고, FACS 검출에서는 각 군의 마우스 말초혈액에 인간 CD45 양성 세포가 존재하고 CD45 비율이 시간에 따라 증가함을 보여준다. 실험 종료 시, 종양 보유 마우스를 안락사시키고, 종양을 박리하여 무게를 측정한 후 촬영하며, 혈청 및 종양을 수집하고 고정시켰다. 종양 성장 억제율 TGITV(%)를 계산하고 통계학적으로 분석하였는 바, TAF-6 저용량군, TAF-6 중간용량군, TAF-6 고용량군, Tecentriq군, Avastin군의 종양 성장 억제율은 각각 41%, 34%, 60%, 23%, 32%이고, Tecentriq군 이외에 각 군의 종양 부피는 모두 Vehicle군보다 현저히 작으며(p<0.05), TAF-6 고용량군의 종양 부피는 Tecentriq군보다 현저히 작고(p<0.01), Tecentriq, Avastin군 간에는 종양 부피의 유의한 차이가 없었다(p>0.05). 결과는 도 3에 도시된 바와 같다.
요약하면, 시험 약물 TAF-6은 PBMC 인간화 유방암 MDA-MB-231 피하 이식 종양 모델에서 현저한 항종양 작용을 가지고, 종양 성장을 효과적으로 억제하며, 항종양 작용은 Tecentriq보다 현저히 우수하고, 종양 억제 작용은 용량 증가에 따라 향상되었다.
동일한 종양 모델의 다른 독립 실험에서, 시험 약물 및 양성 약물 M7824 유사체(본 실험실에서 M7824 특허 US9676863B2에 따라 제조)의 종양 억제 활성 비교를 조사하였다. 그룹당 6마리씩 4 그룹을 설정하고, 각각 Vehicle군, TAF-6(4.2mg/kg, i.p., tiw×8회; 그 후 용량을 8.4mg/kg으로 조정, i.p., tiw×4회)군, M7824 유사체(3.6mg/kg, i.p., tiw×8회; 그 후 용량을 7.2mg/kg으로 조정, i.p., tiw×4회)군, Avastin(3mg/kg, i.p., tiw×8회; 그 후 용량을 6mg/kg으로 조정, i.p., tiw×4회)군이다. 결과는 도 4에 도시된 바와 같고, 등몰 농도 용량에서 TAF-6의 항종양 작용은 M7824 유사체보다 현저히 우수하였다.
실시예 7 PBMC 인간화 폐암 Calu -6 마우스 체내에서 다중 도메인 융합 단백질의 종양 억제 활성
인간 유래 폐암 Calu-6 세포를 수컷 NCG 마우스 우측 옆구리에 피하 접종하고, 종양 세포 접종 4일 전에 PBMC 세포를 마우스 체내에 접종하며, 종양이 약 50mm3로 자랐을 때 그룹화 투여하고, 그룹당 8마리씩 총 7 그룹이며, 각각 Vehicle군, TAF-6 저용량(2mg/kg, i.p., tiw×10)군, TAF-6 중간용량(7mg/kg, i.p., tiw×10)군, TAF-6 고용량(25mg/kg, i.p., tiw×10)군, Tecentriq(5mg/kg, i.p., tiw×10)군, Avastin(5mg/kg, i.p., tiw×10)군, Tecentriq+Avastin(5+5mg/kg, i.p., tiw×10)군이다. 매주 종양 부피 및 체중을 측정하고, 종양 보유 마우스의 체중 및 종양 부피의 변화와 투여 시간의 관계를 기록하였다. 실험 종료 시, 종양 보유 마우스를 안락사시키고, 종양을 박리하여 무게를 측정한 후 촬영하며, 혈청 및 종양을 수집하였다. 종양 성장 억제율 TGITV(%)를 계산하고 통계학적으로 분석하였다.
그룹화 3일 전 및 실험 종료 시(PG-D23), 마우스의 안와 정맥총에서 혈액을 채취하고, FACS 검출 결과는 각 군의 마우스 말초혈액에 인간 CD45 양성 세포가 존재하고 CD45 비율이 시간에 따라 증가함을 보여주며, 이는 마우스 면역 시스템의 인간화가 성공적임을 나타낸다.
치료 기간에 각 군의 마우스는 정상적으로 식이하고, 체중은 대체적으로 안정적이며, 실험 동물의 사망 상황이 없었다.
실험 종료 시(PG-D23), TAF-6 저용량군, TAF-6 중간용량군, TAF-6 고용량군, Tecentriq군, Avastin군, Tecentriq+Avastin군의 종양 성장 억제율은 각각 62%, 62%, 75%, 13%, 34%, 32%이고, Tecentriq군 이외에 각 군의 종양 부피는 모두 Vehicle군보다 현저히 작으며(p<0.01), TAF-6 저용량, 중간용량, 고용량군의 종양 부피는 모두 Tecentriq군, Avastin군 및 Tecentriq+Avastin군보다 현저히 작았다(p<0.01). 결과는 표 4 및 도 5에 나타낸 바와 같다.
요약하면, 시험 약물 TAF-6은 PBMC 인간화 폐암 Calu-6 피하 이식 종양 모델에서 현저한 항종양 작용을 가지고, 종양 성장을 효과적으로 억제하며, 종양 억제 작용은 Tecentriq, Avastin 및 Tecentriq과 Avastin의 병용보다 현저히 우수하고, 종양 억제 작용은 용량 증가에 따라 향상되었다.
표 4 인간 폐암 Calu-6에 대한 시험물의 종양 억제 작용(종양 부피)
참고: a.평균±표준오차.
동일한 종양 모델의 다른 독립 실험에서, 시험 약물과 양성 약물 M7824 유사체의 종양 억제 활성 비교를 조사하였다. 그룹당 6마리씩 4 그룹을 설정하고, 각각 Vehicle군, TAF-6(7mg/kg, i.p., tiw×8회)군, M7824 유사체(6mg/kg, i.p., tiw×8회)군, Avastin(5mg/kg, i.p., tiw×8회)군이다. 결과는 도 6에 도시된 바와 같고, 등몰 농도 용량에서 TAF-6의 항종양 작용은 M7824 유사체 및 Avastin보다 현저히 우수하였다.
실시예 8 PBMC 인간화 결장암 HCT116 마우스 체내에서 다중 도메인 융합 단백질의 종양 억제 활성
HCT-116(인간 결장암) 세포를 이용하여 인간 PBMC 면역 시스템 인간화 마우스(NOG마우스) 체내에서 모델링하여 본 발명의 다중 도메인 융합 단백질의 체내 약효를 측정하였다. 7-9주령 암컷 NOG마우스를 스크리닝하고, 마우스에 HCT-116 세포(3×10E6+매트리겔)를 접종하며, 종양 세포 접종 3일차에 PBMC(5×10E6/0.2ml)를 꼬리 정맥 주사하고, 그 후 종양 부피 및 체중을 관찰하며, 종양 부피가 60-100mm3 사이인 마우스를 선택하고, 종양 부피 및 체중에 따라 6 그룹으로 무작위로 나누며, 각 그룹은 8마리이고, 그룹화 당일 투여를 시작하며, Vehicle군, TAF-6 저용량(2mg/kg, i.p., tiw×3)군, TAF-6 중간용량(7mg/kg, i.p., tiw×3)군, TAF-6 고용량(25mg/kg, i.p., tiw×3)군, Tecentriq(5mg/kg, i.p., tiw×3)군, Tecentriq+Avastin(5+5mg/kg, i.p., tiw×3)군이 있다. 매주 2회 종양 부피 및 체중을 측정하고, 종양 보유 마우스의 체중 및 종양 부피의 변화와 투여 시간의 관계를 기록하였다. 실험 종료 시, 종양 보유 마우스를 안락사시키고, 종양을 박리하여 무게를 측정한 후 촬영하며, 혈청 및 종양을 수집하였다. 종양 성장 억제율 TGITV(%)를 계산하고 통계학적으로 분석하였다.
그룹화 전 및 실험 종료 전에 마우스의 안와 정맥에서 혈액을 채취하고, FACS 검출 결과는 각 군의 마우스 말초혈액에 인간 CD45 양성 세포가 존재하고 CD45 비율이 시간에 따라 증가함을 보여주며, 이는 마우스 면역 시스템의 인간화가 성공적임을 나타낸다.
종양 억제 활성은 도 7에 도시된 바와 같다. 시험 약물 TAF-6은 PBMC 인간화 결장암 HCT116 피하 이식 종양 모델에서 현저한 항종양 작용을 가지고, 종양 성장을 효과적으로 억제하며, 고용량 및 중간용량군의 종양 억제 작용은 Tecentriq보다 현저히 우수하였다. 등몰 농도 용량에서, 즉 TAF-6 중간용량(7mg/kg, i.p., tiw×3)군과 Tecentriq+Avastin(5+5mg/kg, i.p., tiw×3)군을 비교하면, TAF-6은 여전히 Tecentriq+Avastin군보다 나은, 심지어 우수한 치료 효과를 관찰할 수 있었다.
실시예 9 PBMC 인간화 간암 Huh-7 마우스 체내에서 다중 도메인 융합 단백질의 종양 억제 활성
인간 유래 간암 Huh-7 세포를 수컷 NCG 마우스 우측 옆구리에 피하 접종하고, 종양 세포 접종 45일 전에 PBMC 세포를 마우스 체내에 접종하며, 종양이 약 50mm3로 자랐을 때 그룹화 투여하고, 그룹당 10마리씩 총 5 그룹이며, 각각 Isotype군, TAF-6 저용량(2mg/kg, i.p., tiw×8)군, TAF-6 고용량(7mg/kg, i.p., tiw×8)군, Tecentriq(5mg/kg, i.p., tiw×8)군, Avastin(5mg/kg, i.p., tiw×8)군이다. 매주 2회 종양 부피 및 체중을 측정하고, 종양 보유 마우스의 체중 및 종양 부피의 변화와 투여 시간의 관계를 기록하였다. 실험 종료 시, 종양 보유 마우스를 안락사시키고, 종양을 박리하여 무게를 측정한 후 촬영하며, 혈청 및 종양을 수집하였다. 종양 성장 억제율 TGITV(%)를 계산하고 통계학적으로 분석하였다.
그룹화 전 및 실험 종료 시(PG-D23), 마우스의 안와 정맥총에서 혈액을 채취하고, FACS 검출 결과는 각 군의 마우스 말초혈액에 인간 CD45 양성 세포가 존재하고 CD45 비율이 시간에 따라 증가함을 보여주며, 이는 마우스 면역 시스템의 인간화가 성공적임을 나타낸다.
치료 기간에 각 군의 마우스는 정상적으로 식이하고, 체중은 대체적으로 안정적이었다.
실험 종료 전(PG-D18), TAF-6 저용량군, TAF-6 고용량군, Tecentriq군, Avastin군의 종양 성장 억제율은 각각 57%, 74%, 18%, 67%이고, Tecentriq군 이외에 각 군의 종양 부피는 모두 Isotype군보다 현저히 작으며(p<0.01), TAF-6 고용량군의 종양 부피는 모두 Tecentriq군(p<0.01)보다 현저히 작고, Avastin군의 종양 부피는 Tecentriq군보다 현저히 작았다(p<0.05). 결과는 도 8에 도시된 바와 같다.
요약하면, 시험 약물 TAF-6은 PBMC 인간화 간암 Huh-7 피하 이식 종양 모델에서 현저한 항종양 작용을 가지고, 종양 성장을 효과적으로 억제하며, 항종양 작용은 Tecentriq보다 현저히 우수하고, 종양 억제 작용은 용량 증가에 따라 향상되었다.
동일한 종양 모델의 다른 독립 실험에서, 시험 약물과 양성 약물 M7824 유사체의 종양 억제 활성 비교를 조사하였다. 그룹당 6마리씩 4 그룹을 설정하고, 각각 Vehicle군, TAF-6(7mg/kg, i.p., tiw×9; 그 후 용량을 14mg/kg으로 조정, i.p., tiw×2)군, M7824 유사체(6mg/kg, i.p., tiw×9; 그 후 용량을 12mg/kg으로 조정, i.p., tiw×2)군, Avastin(5mg/kg, i.p., tiw×9; 그 후 용량을 10mg/kg으로 조정, i.p., tiw×2)군이다. 결과는 도 9에 도시된 바와 같고, TAF-6의 항종양 작용은 M7824 유사체보다 현저히 우수하였다.
실시예 10 PBMC 인간화 육종 HT1080 마우스 체내에서 다중 도메인 융합 단백질의 종양 억제 활성
인간 유래 육종 HT1080 세포를 수컷 NCG 마우스 우측 옆구리에 피하 접종하고, 종양 세포 접종 7일 전에 PBMC 세포를 마우스 체내에 접종하며, 종양이 약 56mm3로 자랐을 때 그룹화 투여하고, 그룹당 8마리씩 총 5 그룹이며, 각각 Vehicle군, TAF-6 저용량(2mg/kg, i.p., tiw×9)군, TAF-6 중간용량(7mg/kg, i.p., tiw×9)군, TAF-6 고용량(25mg/kg, i.p., tiw×9)군, Tecentriq(5mg/kg, i.p., tiw×9)군이다. 매주 종양 부피 및 체중을 측정하고, 종양 보유 마우스의 체중 및 종양 부피의 변화와 투여 시간의 관계를 기록하였다.
실험 종료 시, 종양 보유 마우스를 안락사시키고, 종양을 박리하여 무게를 측정한 후 촬영하며, 혈청 및 종양을 수집하였다. 종양 성장 억제율 TGITV(%)를 계산하고 통계학적으로 분석하였다.
그룹화 전 및 실험 종료 시, 마우스의 안와 정맥총에서 혈액을 채취하고, FACS 검출 결과는 각 군의 마우스 말초혈액에 인간 CD45 양성 세포가 존재하고 CD45 비율이 시간에 따라 증가함을 보여주며, 이는 마우스 면역 시스템의 인간화가 성공적임을 나타낸다.
실험 종료 전(PG-D19), TAF-6 저용량군, TAF-6 중간용량군, TAF-6 고용량군, Tecentriq군의 종양 성장 억제율은 각각 19%, 33%, 41%, 28%이고, TAF-6 중간용량군 및 Tecentriq군의 종양 부피는 Vehicle군(p<0.05)보다 현저히 작으며, 각 군 간의 종양 부피는 현저한 차이가 없고(p>0.05), 결과는 도 10에 도시된 바와 같다.
요약하면, 본 발명은 선행기술의 여러 단점을 효과적으로 극복하고 산업적 이용 가치가 높다.
상기 실시예는 본 발명의 원리 및 효과를 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니다. 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 상기 실시예에 대해 변형 또는 변경을 이룰 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 사상 및 기술적 사상을 벗어나지 않는 한 당업자에 의해 이루어진 모든 등가 변형 또는 변경은 본 발명의 청구범위에 포함되어야 한다.

Claims (19)

  1. 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편, 길항 VEGF 단편, TGF-β 결합 단편을 포함하는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편의 상보성 결정 영역은 아미노산 서열의 서열번호 1~5 중 하나로 표시되는 CDR1, 서열번호 6~9 중 하나로 표시되는 CDR2, 서열번호 10~15 중 하나로 표시되는 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편의 상보성 결정 영역은,
    아미노산 서열의 서열번호 1로 표시되는 CDR1, 서열번호 6으로 표시되는 CDR2, 서열번호 10으로 표시되는 CDR3; 또는
    아미노산 서열의 서열번호 2로 표시되는 CDR1, 서열번호 7로 표시되는 CDR2, 서열번호 11로 표시되는 CDR3; 또는
    아미노산 서열의 서열번호 3으로 표시되는 CDR1, 서열번호 7로 표시되는 CDR2, 서열번호 12로 표시되는 CDR3; 또는
    아미노산 서열의 서열번호 4로 표시되는 CDR1, 서열번호 8로 표시되는 CDR2, 서열번호 13으로 표시되는 CDR3; 또는
    아미노산 서열의 서열번호 2로 표시되는 CDR1, 서열번호 7로 표시되는 CDR2, 서열번호 14로 표시되는 CDR3; 또는
    아미노산 서열의 서열번호 5로 표시되는 CDR1, 서열번호 9로 표시되는 CDR2, 서열번호 15로 표시되는 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편은 프레임워크 영역을 더 포함하고, 상기 프레임워크 영역(FR)은 아미노산 서열의 서열번호 49로 표시되는 FR1, 아미노산 서열의 서열번호 50~52 중 하나로 표시되는 FR2, 아미노산 서열의 서열번호 53~55 중 하나로 표시되는 FR3, 및 아미노산 서열의 서열번호 56으로 표시되는 FR4를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 프레임워크 영역(FR)은,
    아미노산 서열의 서열번호 49로 표시되는 FR1, 서열번호 50으로 표시되는 FR2, 서열번호 53으로 표시되는 FR3; 서열번호 56으로 표시되는 FR4, 또는
    아미노산 서열의 서열번호 49로 표시되는 FR1, 서열번호 51로 표시되는 FR2, 서열번호 54로 표시되는 FR3; 서열번호 56으로 표시되는 FR4, 또는
    아미노산 서열의 서열번호 49로 표시되는 FR1, 서열번호 52로 표시되는 FR2, 서열번호 54로 표시되는 FR3; 서열번호 56으로 표시되는 FR4, 또는
    아미노산 서열의 서열번호 49로 표시되는 FR1, 서열번호 52로 표시되는 FR2, 서열번호 55로 표시되는 FR3; 서열번호 56으로 표시되는 FR4를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편은,
    a) 아미노산 서열의 서열번호 16~21 중 하나로 표시되는 폴리펩티드 단편;
    또는, b) 아미노산 서열의 서열번호 16~21 중 하나와 90% 이상의 서열 동일성을 갖고 a)에서 한정된 폴리펩티드 단편의 기능을 갖는 폴리펩티드 단편을 포함하고;
    및/또는, 상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편은 알파카에서 유래되며;
    및/또는, 상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편은 인간화된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 길항 VEGF 단편은 베바시주맙이고, 바람직하게는, 상기 길항 VEGF 단편은,
    c) 아미노산 서열의 서열번호 22~23 중 하나로 표시되는 폴리펩티드 단편; 또는,
    d) 아미노산 서열의 서열번호 22~23 중 하나와 90% 이상의 서열 동일성을 갖고 c)에서 한정된 폴리펩티드 단편의 기능을 갖는 폴리펩티드 단편을 포함하며;
    및/또는, 상기 길항 VEGF 단편은 마우스에서 유래되고;
    및/또는, 상기 길항 VEGF 단편은 인간화된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 TGF-β 결합 단편은 TGF-βRⅡ 세포외 도메인 단편이고, 바람직하게는, 상기 TGF-β 결합 단편은,
    e) 아미노산 서열의 서열번호 24로 표시되는 폴리펩티드 단편; 또는,
    f) 아미노산 서열의 서열번호 24와 90% 이상의 서열 동일성을 갖고 e)에서 한정된 폴리펩티드 단편의 기능을 갖는 폴리펩티드 단편을 포함하며;
    및/또는, 상기 TGF-β 결합 단편은 인간에서 유래된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 연결 펩티드 단편을 더 포함하고, 바람직하게는, 상기 연결 펩티드 단편은 G, S 및/또는 A가 풍부하며, 보다 바람직하게는, 상기 연결 펩티드는 G 글리신 및/또는 S 세린 및/또는 A 알라닌으로 구성된 연성 폴리펩티드 사슬로부터 선택되고, 상기 연결 펩티드의 길이는 3~30개의 아미노산인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 연결 펩티드 단편은 아미노산 서열의 서열번호 34~36 중 하나로 표시되는 폴리펩티드 단편을 포함하고;
    및/또는, 상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편, 길항 VEGF 단편 사이에는 연결 펩티드가 구비되며;
    및/또는, 상기 길항 VEGF 단편, TGF-β 결합 단편 사이에는 연결 펩티드가 구비되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지 순차적으로 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편, 길항 VEGF 단편, TGF-β 결합 단편을 포함하고;
    및/또는, 상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편은 길항 VEGF 단편의 중쇄의 N-말단에 위치하며;
    및/또는, 상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체 단편은 길항 VEGF 단편의 경쇄의 N-말단에 위치하고;
    및/또는, 상기 TGF-β 결합 단편은 길항 VEGF 단편의 중쇄의 C-말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 23, 서열번호 25~33 중 하나로 표시되는 서열을 포함하고;
    또는, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 25 및 서열번호 26으로 표시되는 서열, 서열번호 25 및 서열번호 27로 표시되는 서열, 서열번호 25 및 서열번호 28로 표시되는 서열, 서열번호 25 및 서열번호 29로 표시되는 서열, 서열번호 30 및 서열번호 27로 표시되는 서열, 서열번호 30 및 서열번호 29로 표시되는 서열, 서열번호 31 및 서열번호 23으로 표시되는 서열, 서열번호 32 및 서열번호 23으로 표시되는 서열, 서열번호 33 및 서열번호 23으로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  14. 제13항에 따른 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물.
  15. 제14항에 따른 작제물 또는 게놈에 통합된 외인성의 제13항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 시스템.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질의 제조 방법으로서,
    상기 융합 단백질을 발현하도록 적합한 조건에서 제15항에 따른 발현 시스템을 배양하고 분리 및 정제하여 상기 융합 단백질을 제공하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  17. 약물의 제조에서 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 제15항에 따른 발현 시스템의 배양물의 용도.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 약물은 종양 치료를 위한 약물로부터 선택되고; 바람직하게는, 상기 종양은 폐암, 흑색종, 위암, 난소암, 결장암, 간암, 신장암, 방광암, 유방암, 고전적 호지킨 림프종, 혈액 악성 종양, 육종, 두경부암 및 비인두암으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 제15항에 따른 발현 시스템의 배양물을 포함하는 약학적 조성물.










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