KR20220087466A - 항-케모킨(anti-chemokin) 유사 수용체 1 사람화된 항체 및 이의 치료학적 적용 - Google Patents

항-케모킨(anti-chemokin) 유사 수용체 1 사람화된 항체 및 이의 치료학적 적용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 레졸빈 E1과 CMKLR1의 상호작용에 대한 작용제 능력을 갖는 사람화된 항-CMKLR1 화합물, 및 특히 염증의 분해가 지연되거나 중지되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 이들의 용도를 제공한다.

Description

항-케모킨(anti-chemokin) 유사 수용체 1 사람화된 항체 및 이의 치료학적 적용
본 발명은 면역치료요법의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 케모킨 유사 수용체-1(CMKLR1)에서 레졸빈 E1-유사 작용제 활성(Resolvin E1-like agonist activity)을 갖는 신규한 사람화된 항-케메린(Chemerin) 수용체 항체를 제공한다. 본 발명은 특히 자가면역 질환(autoimmune disease) 및 만성 염증 질환(chronic inflammatory disease), 감염성 질환(infectious disease), 암(cancer), 및 염증의 분해 상(resolution phase)이 파괴되거나 지연되는 임의의 상태를 치료하기 위한, 치료요법에서 이러한 항체의 용도를 또한 제공한다.
건강과 질환에서 염증 과정의 중요한 역할은 오랫동안 인식되어 왔다. 염증의 진행과 분해를 조절하는 세부적인 분자 메커니즘과 생물학적 사건은 중요한 관심사로 남아 있다. 최근의 조사는 염증의 분해가 이전이 믿었던 바와 같은, 수동적인 과정이 아니라는 강력한 증거를 제공하였다. 염증의 분해는 대신에 생화학적 매개인자와 수용체 신호전달 경로(receptors-signaling pathways)에 의해 조절되는 생합성 활성 공정이다. 따라서 분해는 구체화된 프로-분해 매개인자(pro-resolving mediator)에 의해 추진된다. 염증은 감염, 부상 또는 외상시 발생하는 자발적 메커니즘이다. 염증은 불가피하고 일반적으로 유익하며, 이의 반응은 양성 피드백 루프(positive feedback loop)와 음성 피드백 루프(negative feedback loop) 사이의 섬세한 균형에 의해 조정된다. 염증은 보통 세 단계로 나뉜다: 개시, 증폭 및 분해.
염증 반응의 종료를 허용하는 분해 공정은 세포(예컨대, 과립구 또는 대식구)와 화학물질(예컨대, 사이토킨 또는 구체화된 프로-용해 매개인자(pro-solving mediator) 또는 인자) 효과의 순차적이고 연대순인 결합을 포함하는 복잡한 공정이다.
ChemR23로도 알려진 케모킨-유사 수용체 1(CMKLR1), 및 케모킨 수용체-유사 2(CCRL2)는 알려진 G-단백질-결합 수용체(AJ Kennedy and AP Davenport, 2018)에 대한 이의 상동성에 의해 확인된 7-막관통 수용체(transmembrane receptor)이다. 케모킨-유사 수용체 1(CMKLR1; 쥐과(murine) 동물에서 Dez로도 명명됨)은 GPR-1(38% 전체 아미노산 동일성), C3a 수용체(38%), C5a 아나필라톡신 수용체(anaphylatoxin receptor)(36%), 포르밀 Met-Leu-Phe 수용체(35%)와 관련된 오르판 G 단백질-커플링된 수용체(orphan G protein-coupled receptor)이다. ChemR23은 케모킨 수용체 아계열(subfamily)과 더 멀리 관련이 있다(Samson et al., 1998). CMKLR1은 단핵구, 대식구, 수지 세포, 및 NK 세포 뿐만 아니라, 지방세포 및 내피 세포에서 발현된다. 최근의 연구는 이러한 수용체에 대한 리간드 및 이의 기능들이 밝혀지기 시작했음을 확인하였다. 따라서, 케메린(Chemerin)으로 명명된 최초의 혈장 단백질-유래 화학 유인제(chemoattractant)는 CMKLR1에 대한 리간드로 확인되었다.
CMKLR1의 두 번째 리간드는 레졸빈 계열에 속하는 지질 매개인자 레졸빈 E1(RvE1)이다. 소염성 지질 매개인자 레졸빈 E1은 백혈구의 침윤과 전-염증성 유전자 발현을 억제한다.
초기에, 케메린 시스템(즉, 케메린과 레졸빈과 같은 리간드에 의해 케메린 수용체로 활성화되거나 활성화되지 않는 신호전달 경로)에서의 관심은 건선 질환에서 이의 발견 이후 면역 세포의 염증과 화학작용에 대한 이의 역할에 집중되었다. 가장 최근에는, 염증, 비만, 대사 증후군에서 이의 역할과 관련하여, 심혈관 기능과 관련된 이의 잠재적 역할 뿐만 아니라 생식 생물학에서의 역할이 고려되고 있다. 따라서, 케메린 시스템은 염증 공정에서 이의 역할, 특히 염증 분해에 대한 역할로 큰 관심을 가지고 있다. 다수의 질환이 분해 공정의 지연 또는 중단과 관련되어 있다. 현재 알려진 전문화된 프로-분해 인자(pro-resolving factor) 중 대부분은 리폭신을 포함한 다가불포화 지방산, E-시리즈 레졸빈 및 D-시리즈 레졸빈을 포함한 분해 계열, 프로텍틴 및 마레신으로부터 유도된다. 그럼에도 불구하고, 프로-분해 분자는 이의 지질 특성 때문에 합성하기 어렵다. 예를 들어, 임상 실험을 위해 충분한 양의 프로-분해 분자를 생산하는 것은 부담이 되며, 효율적인 생산을 통과한 SPM은 거의 없다. 그 외에도, G-단백질-커플링된 수용체를 구체적으로 표적화하는 항체는 생산하기 어렵다. 따라서, 분자가 참여할 수 있는, 특히 프로-분해 인자와 같이 염증 반응의 분해 단계를 개시하거나 향상시키는 능력을 가진 분자가 요구되고 있다.
제 1 양태에서, 본 발명은 사람화된 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체(mimetic) 또는 변형된 항체에 관한 것이다.
본 발명자들은 선행기술에 알려진 야생형 항-CMKLR1 항체와 비교하여 개선된 사람화된 항체를 얻기 위해 노력해 왔다. 버니어 구역(Vernier zone)의 잔기, 표준 잔기(canonical residue), 가변 중쇄 및 가변 경쇄 인터페이스에서의 잔사 등을 포함하는 가변 도메인 CDR 및 골격(FR) 서열의 일부 잔사는 항체의 구조에서 중요하며 항체의 생화학적 및 생물학적 활성을 보존하기 위해 돌연변이를 해서는 안 된다는 것이 알려져 있지만, 본 발명자들은 놀랍게도 이러한 중요한 잔류사 중 일부를 포함하는, 야생형 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인 서열 내의 일부 돌연변이가 사람 잔사 함량의 증가를 허용(사람화의 최대 99%)하는 반면 기능적 특징들이 이러한 사람화된 항체와 연관되어 있고, 이는 특히 개선된 야생형 항-CMKLR1에 의해 공유되지 않고, 동시에 이러한 사람화된 항체의 생산은 덜 또는 뚜렷하게 사람화된 항-CMKLR1 항체와 비교하여 개선될 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 사람화된 항체는 후보 약물 개발을 위해 대규모로 생산될 수 있는, 염증이 수반되는 질환을 포함한, 질환의 치료에 유용한 기능적 특징을 나타내는 화합물의 제공을 이끈다. 이러한 2개의 특징의 조합은 선행기술의 항체에 비해 향상된 능력을 나타내는 항-CMKLR1 항체의 제공을 이끈다.
사람화되지 않은 항-CMKLR1 항체로부터 출발하여 사람 생식선 서열을 선택하는데 있어서, 본 발명자들은 특수한 사람화된 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인을 설계하였다. 비사람화된 항체로부터 유도된 사람화된 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인은 야생형 항체의 결합 활성과 관련하여 심지어 증가될 수 있는 활성으로 이의 표적에 결합하는 항체의 유의적인 수율을 회복할 수 있도록 하는 조건에서 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포주, 형질전환된 아프리카 녹색 원숭이 신장 섬유아세포(COS-7) 세포주 및 사람 배아 신장 세포주(HEK293)와 유사하지만 이에 제한되지 않는 상이한 세포주에서 기능적 항체의 생산을 가능하게 한다. 수득된 사람화된 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인 중 일부는 특히 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 골격 영역에서 수행된 첫 번째 사람화 단계와 관련하여 추가로 사람화되었고, 이는 감소된 면역원성을 지니고, 적어도 이의 모 항체의 기능적 특징을 갖는, 상이한 세포주에서 고 수율 생산에 적합한 항체의 제공을 이끈다. 숙련가는 특히 CDR 도메인과 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 골격 영역내 이러한 위치에서 상기 돌연변이가 어느 정도 상이한 사람화된 항체와 비교하여 본 발명에 따른 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 이러한 항체의 생산 규모를 개선시킬 수 있으면서, 보존된 결합능, 특히 보존된 친화력, 보존된 안정성을 지니고, 낮은 면역원성 지수로 CMKLR1에서 이러한 항체의 레졸빈-유사 작용제 능력을 보존하는 항-CMKLR1 항체를 제공할 수 있음을 예측할 수 없었다. 특히 중쇄의 CDR2에서 개시된 돌연변이의 도입이 여전히 결합 특징과 유리하게는 선행기술의 항-CMKLR1 항체의 다른 기능적 특징을 보존하면서, 개선된 생산성을 야기할 수 있음은 예상할 수 없었다. 나열된 특징 (CMKLR1, 특히 CMKLR1의 제3의 루프-외(extra-loop)에 대한 결합능, 특히 친화성, 낮은 면역원성, 양호한 생산 규모 및 CMKLR1에 대한 레졸빈 유사 작용제 능력)을 나타내는 항-CMKLR1 항체는 염증이 관련된 질환 및 보다 특히 염증 질환을 포함한 여러 질환의 강력한 치료에 유용하다.
또한, 본 출원에서 이후에 설명하는 바와 같이, 특히 호중구의 세포자멸사(apoptosis) 및 호중구 및/또는 대식구의 이동 및/또는 이행(transmigration)의 감소와 관련하여, 몇 가지 매우 유리한 생물학적 효과가 이루어져, 염증 분해에서 강력하게 유익한 작용을 이끌었다. 따라서, 새로운 화합물은 생산 능력과 생물학적 활성을 조합하도록 한다.
따라서, 본 발명의 제 1 양태에서, 다음을 포함하는 케모킨 유사 수용체 1(Chemokin Like Receptor 1; CMKLR1), 특히 사람 CMKLR1에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 개시된다:
a) 3개의 CDR들 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인으로서:
- VHCDR1은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VHCDR2는 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12 및 서열 번호: 61로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VHCDR3은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 이루어진 그룹에서 선택되는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및
b) 3개의 CDR들 VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인으로서:
- VLCDR1은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR2는 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR3은 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택되는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인.
특정 구현예에서, 케모킨 유사 수용체 1(CMKLR1), 특히 사람 CMKLR1에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
a) 3개의 CDR들 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인으로서:
- VHCDR1은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VHCDR2는 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 및 서열 번호: 61로 이루어진 그룹에서 선택되거나; 또는 VHCDR2는 서열 번호: 12 또는 서열 번호 63의 아미노산 잔기에 상응하며, 단, VHCDR1은 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4가 아니며;
- VHCDR3은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 이루어진 그룹에서 선택되는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및
b) 3개의 CDR들 VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인으로서:
- VLCDR1은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR2는 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR3은 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택되는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인.
다른 특정 구현예에서, 케모킨 유사 수용체 1(CMKLR1), 특히 사람 CMKLR1에 결합하는 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
a) 3개의 CDR들 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인으로서:
- VHCDR1은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VHCDR2는 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11 및 서열 번호: 61로 이루어진 그룹에서 선택되는데,
ㆍ VHCDR1이 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4이고 VHCDR2가 서열 번호: 12의 아미노 서열에 상응하는 경우, 상기 중쇄 가변(VH) 도메인은 서열 번호: 70의 골격 VHFR3를 포함하지 않고, 바람직하게는 단 상기 중쇄 가변(VH) 도메인은 서열 번호: 69의 골격 FR3을 포함하며;
- VHCDR3는 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
b) 3개의 CDR VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인으로서:
- VLCDR1은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR2는 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR3는 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
특히 유리하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CMKLR1의 제3의 세포외 루프(EL3), 특히 CMKLR1의 제3의 세포외 루프(EL3)내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합하고; 보다 특히, 항체 또는 항원-결합 단편은 아미노산 서열 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 59를 포함하는 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열 서열 번호: 60 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합한다.
당해 구현예에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 포유 동물 세포주를 포함하나, 이에 한정되지 않는 상이한 세포주에서의 생산에 적합하며, 생산 수율은 CMKLR1의 세포 외 제3 루프에 대한 특이적인 결합 능력 및 CMKLR1에서 이의 레졸빈 E1-유사 작용제 능력을 유지하면서, 약물 후보를 개발하는 목적을 위해 적합하다. 따라서 본원에 개시된 사람화된 항체는 효율적으로 생산될 수 있고 이의 모 항체의 기능적 능력을 공유할 수 있다.
이의 CDR 도메인에 의해서만 발명의 항체의 정의와 구별될 수 있지만, 특정의 구현예에서 이러한 정의와 조합될 수 있는, 본 발명의 특수한 양태에서, 케모킨-유사 수용체 1(CMKLR1), 특히 사람 CMKLR1에 결합하고, COS, CHO 또는 HEK 세포와 같은 포유동물 세포에서, 특히 0.1mg/ml 초과의 수율, 특히 1mg/ml 초과의 수율, 보다 특히 적어도 10mg/ml의 수율, 및 다시 보다 특히 100 mg/ml 초과의 수율로 생산하기에 적합한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 개시되어 있고, 여기서:
a) 가변 중쇄(VH) 도메인은 중쇄 가변 도메인의 골격(FR1, FR2, FR3, FR4)의 아미노산 서열을 포함하고 여기서 각각의 골격은 서열 번호: 41의 서열내 동일한 순위의 골격과 각각 FR1의 경우 100%, FR2의 경우 적어도 60%, FR3의 경우 적어도 78% 및 FR4의 경우 적어도 80%이고; 보다 특히 FR1의 경우 100%, FR2의 경우 적어도 80%, FR3의 경우 적어도 85%, FR4의 경우 적어도 90%인 서열 동일성을 지니고;
b) 가변 경쇄(VL) 도메인은 경쇄 가변 도메인의 골격(FR1, FR2, FR3 및 FR4)의 아미노산 서열을 포함하고 여기서 각각의 골격은 서열 번호: 50의 서열에서 동일한 순위의 골격과 각각 FR1의 경우 적어도 60%, FR2의 경우 적어도 70%, FR3의 경우 적어도 75%, FR4의 경우 적어도 80%, 및 보다 특히 FR1의 경우 100%, FR2의 경우 적어도 90%, FR3의 경우 적어도 90%, FR4의 경우 100%인 서열 동일성을 지닌다.
특히, 상기 사람화된 항-CMKLR1 항체 또는 상기 이의 항원-결합 단편은 CMKLR1의 제3의 세포외 루프(EL3)에 특이적으로 결합하는데, 특히, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 59를 포함하는 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열 서열 번호: 60 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본 발명자들은 항-CMKLR1 항체 2G1로부터 출발하여, 다양한 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인을 합성하였다. 서열 번호: 41의 사람화된 중쇄 가변 도메인과 서열 번호: 50의 사람화된 경쇄 가변 도메인은 CHO 세포 또는 COS 세포 또는 HEK 세포와 같은 포유 동물 세포를 포함한, 세포 또는 세포주에서 사람화된 항-CMKLR1 항체의 생산에 특히 적합하였다. 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 설계를 위해 특정 사람 생식선 서열을 선택함으로써, 골격 영역에서 본원에 정의된 실체를 지닌 사람화된 항체를 또한 약물 후보를 발생시킬 수 있는 항체를 개발하기 위한 목적으로 세포 또는 세포주에서 상당한 양으로 생산할 수 있었다. 치료학적 항체를 개발하기 위해, 세포 또는 세포주, 특히 포유 동물 세포주 또는 세포주에서 다량 생산할 수 있는 사람화된 항체의 제공에 대한 관심이 높다. 본원에 제공된 특수한 항-CMKLR1 항체는 서열 번호: 41의 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호: 50의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 모 항체와 매우 유사한 구조를 공유하고, 항-CMKLR1 항체의 정확한 생성, 구조 및 분비를 허용하므로, 케메린-유사 수용체 1의 특수한 에피토프에 결합하고 이러한 수용체에 대한 레졸빈 E1-유사 작용제 능력을 가진 항체를 치료학적 목적을 위해 충분한 양으로 제공할 수 있다.
본 발명의 특수한 구현예에서, COS 또는 CHO 세포와 같은 포유 동물 세포에서 생산하기에 적합한 사람화된 항-케메린 유사 수용체 1(CMKLR1) 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 항체가, 특히 0.1 mg/ml 초과의 수율, 보다 특히 1 mg/ml 초과의 수율, 보다 특히 10 mg/ml 초과의 수율, 다시 보다 특히 100 mg/ml 이상의 수율로 제공되며 여기서:
a) 가변 중쇄(VH) 도메인은 중쇄 가변 도메인의 골격(FR1, FR2, FR3 및 R4)의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 각 골격은 서열 번호: 41의 서열에서 동일한 순위의 골격과 FR1의 경우 적어도 90%, FR2의 경우 적어도 70%, FR3의 경우 적어도 80% 및 FR4의 경우 적어도 80%인 서열 동일성을 지니고;
b) 가변 경쇄(VL) 도메인은 경쇄 가변 도메인의 골격(FR1, FR2, FR3 및 R4)의 아미노산 서열을 포함하고 여기서 각각의 골격은 서열 번호: 50 서열내 동일한 등급의 골격과 각각 FR1의 경우 적어도 60%, FR2의 경우 적어도 80%, FR3의 경우 적어도 75% 및 FR4의 경우 적어도 70%인 서열 동일성을 갖는다.
특히, 상기 사람화된 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CMKLR1의 제3의 세포외 루프(EL3)에 특이적으로 결합하고; 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 특히 아미노산 서열 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 59를 포함하거나 아미노산 서열 서열 번호: 60 내에 위치한 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다.
상기 정의된 사람화 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 특정 구현예에서, 그러한 사람화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
a) 3개의 CDR들 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인으로서:
- VHCDR1은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VHCDR2는 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12 및 서열 번호: 61로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VHCDR3은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 이루어진 그룹에서 선택되는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및
b) 3개의 CDR들 VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인으로서:
- VLCDR1은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR2는 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR3은 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택되는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인.
상기 정의된 사람화 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 특정 구현예에서, 그러한 사람화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
a) 3개의 CDR들 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인으로서:
- VHCDR1은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VHCDR2는 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 및 서열 번호: 61로 이루어진 그룹에서 선택되거나; 또는 VHCDR2는 서열 번호: 12 또는 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 단, VHCDR1은 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4가 아니며;
- VHCDR3은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 이루어진 그룹에서 선택되는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및
b) 3개의 CDR들 VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인으로서:
- VLCDR1은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR2는 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR3은 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택되는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인.
상기 정의된 사람화 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 다른 특정 구현예에서, 그러한 사람화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
a) 3개의 CDR들 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인으로서:
- VHCDR1은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VHCDR2는 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11 및 서열 번호: 61로 이루어진 그룹에서 선택되는데,
VHCDR1이 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4이고 VHCDR2가 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경우, 상기 중쇄 가변(VH) 도메인은 서열 번호: 70의 골격 VHFR3를 포함하지 않고, 바람직하게는 단, 상기 중쇄 가변(VH) 도메인은 서열 번호: 69의 VHFR3을 포함하며;
- VHCDR3는 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
b) 3개의 CDR VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인으로서:
- VLCDR1은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR2는 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR3는 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
이러한 항체는 본 발명의 제1 양태 및 제2 양태에 따라 정의된 항체와 동일하게 유리한 특징, 즉, 높은 수율 생산, 레졸빈 E1-유사 작용제 능력인, 케메린-유사 수용체 1의 제3의 추가 루프 외에 위치한 에피토프에 대한 특이적인 결합을 나타낸다.
개시된 항체는 염증의 분해가 지연되거나 중지된 상태의 치료에 사용하기에 적합하다. 본원에 기술된 모든 항체는 염증의 분해를 유도하고/하거나 염증의 분해를 향상시키고/시키거나 염증의 분해를 개시하는데 적합하다.
다음의 개시내용에서, 사람화된 항-CMKLR1 화합물은 사람화된 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원 결합 항체 모사체 또는 변형된 항체인 것으로 고려된다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 상기 화합물은 이의 CDR의 서열에 의해 정의된다. 본 발명의 보다 특수한 구현예에서, 상기 항-CMKLR1 화합물은 이의 CDR 및 이의 골격 영역(FR)의 서열에 의해 정의되는 항체이다. 항-CMKLR1 화합물은 케모킨-유사 수용체 1(CMKLR1)에 특이적으로 결합하는 화합물이다. 다음 개시내용에서 용어 케모킨-유사 수용체 1, CMKLR1 및 ChemR23은 상호 교환적으로 사용되며, 모두 사람에서 유전자 CMKLR1 또는 비-사람 동물에서 cmklr1에 의해 암호화된 수용체를 지정한다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 화합물은 사람 CMKLR1에 특이적으로 결합하거나, 다시 말해서, 본 발명은 항-사람 CMKLR1 화합물에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "CMKLR1"은 포유 동물 종으로부터의 G-단백질 커플링된 수용체 계열의 구성원인 케모킨-유사 수용체 1 단백질(chemR23으로도 지정됨)을 지칭한다. 본 출원의 실시예에서 사용된, 사람 CMKLR1 단백질의 참고 서열은 Uniprot 수탁 번호 Q99788(서열 번호: 1)과 관련된 서열에 상응한다.
특별한 양태에서, 본 발명은 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 적어도 하나의 기능적 특징에 의해 정의된 항원-결합 항체 모사체 또는 변형된 항체에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 상기 항-CMKLR1 화합물은 전-염증성 사이토킨, 특히 IL12의 분비를 억제하는 능력 및/또는 염증성 사이토킨, 특히 IL10의 분비를 향상시키는 이의 능력에 의해 정의된다. 보다 구체적인 구현예에서, 항-CMKLR1 화합물은 대식구, 특히 전-염증성 대식구 및/또는 염증 대식구의 프로-분해에 의한 사이토킨 분비를 억제하거나 향상시킨다. 특수한 실시예에서, 본 발명의 항-CMKLR1 화합물은 대식구가 소염성 대식구, 특히 프로-분해성 대식구로 분극화되는 것을 향상시킨다. 특수한 실시예에서, 본 발명의 항-CMKLR1 화합물은 대조군 항체와 비교하여 호중구의 세포자멸사를 향상시킨다.
특수한 양태에서, 본 발명은 레졸빈 E1(RvE1)/CMKLR1 상호작용에 대한 작용제 특성을 가짐으로써, CMKLR1-양성 세포에서 RvE1과 CMKLR1에 대한 RvE1의 결합에 의해 유도된 효과 중 적어도 하나를 모사하는 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다. "RvE1-CMKLR1 상호작용에 대한 작용제 특성(Agonist properties towards RvE1-CMKLR1 interaction)"은 CMKLR1을 표적화하는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체 또는 변형된 항체가 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명의 항원-결합 항체 모사체 또는 변형 항체가 CMKLR1에 대한 RvE1의 결합에 의해 제공되는 효과 중 적어도 하나를 모사함으로써, RvE1에 의해 정상적으로 활성화된 수용체 신호전달 경로, 특히 수지상 세포, 호중구, 단핵구 및 대식구에서 CMKLR1에 대한 사람 RvE1의 결합을 활성화시키는 효과를 말한다. 생물학적 반응을 생성하기 위해 수용체를 결합 및 활성화한 결과, 본 발명의 화합물은 β-아레스틴 경로를 활성화하지 않고, G 단백질 신호전달 경로, 특히 Gαi 신호전달 경로 및/또는 Gαo의 활성화를 초래할 수 있다. 특히, 본 발명의 화합물은 β-아레스틴 경로의 억제를 초래할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 화합물의 결합은 시험관 내(in vitro) 및/또는 생체 내(in vivo)에서 Akt 및/또는 Erk 단백질(들)의 활성화를 유도한다. 특수한 구현예에서, 화합물은 G-단백질 신호전달 경로가 본 발명의 화합물로 자극된 CMKLR1-양성 세포내에서 활성화될 때, 보다 특수한 구현예에서, 또한 B-아레스틴 경로가 활성화되지 않을 때, 및 특수한 조건에서, B-아레스틴 경로가 억제될때, 레졸빈 E1-유사 능력을 갖는 항-CMKLR1 작용제로 간주될 수 있다. 다시 말해서, 레졸빈-E1-유사 작용제 항체는 CMKLR1을 결합시킬 수 있고 이에 의해 대조군 항체와 비교하여, Akt 및/또는 Erk 단백질의 인산화를 유도할 수 있다. 대조군 항체는 CMKLR1에 특이적으로 결합하지 않는 항체일 수 있다. 단백질의 인산화는 숙련가에 의해 잘 알려진 방법, 예를 들어, 본 설명의 예에 개시된 방법에 따라 측정될 수 있다. 특수한 구현예에서, 본 발명의 화합물은 CMKLR1에 의해 유도되는 G 단백질 경로의 활성화를 향상시킨다. 다른 구현예에서, 본 발명의 화합물은 CMKLR1에 의해 유도되는 β-아레스틴 경로의 활성화를 유도하지 않는다. 다른 구현예에서, 본 발명의 화합물은 CMKLR1에 의해 유도되는 β-아레스틴 경로를 억제한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 화합물은 CMKLR1에 대한 RvE1의 결합의 적어도 하나의 작용제 효과를 유도하고, RvE1은 프로-분해 인자 또는 프로-분해 매개인자이므로, 본 발명의 화합물은 프로-분해 인자 또는 프로-분해 매개인자인데; 예컨대, 프로-분해 인자는 CMKLR1과 특이적으로 상호작용하지 않는 것으로 알려진 대조군 화합물과 비교하여, CMKLR1에 의해 유도된 β-아레스틴 경로를 억제하고/하거나 CMKLR1-양성 세포에서 CMKLR1에 의해 유도된 G 단백질 경로의 활성화를 향상시키는 화합물로 정의될 수 있다. 이러한 경로의 활성화/억제는 본 발명의 작업 실시예에 개시된 방법에 따라 평가될 수 있다. 특수한 구현예에서, 작용제 화합물의 효과는 사람 세포에서 평가된다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 화합물은 CMKLR1에 대한 케메린의 결합을 방해하지 않는다. 케메린은 CMKLR1의 천연 리간드 중 하나이다. 다시 말해서, 본 발명에 따른 화합물은 케메린과 CMKLR1 사이의 상호작용의 작용제 및/또는 길항제가 아니다. 이러한 작용제 및/또는 길항제 능력의 부재는 본 발명의 실시예에 따라 평가할 수 있으며, 여기서 본 발명의 항-CMKLR1 항체의 존재하에서 CMKLR1 수용체에 의한 케메린-의존성 베타-아레스틴 보충을 측정하기 위한 경쟁 분석이 개시되어 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항-CMKLR1 화합물은 CMKLR1과의 결합에 대해 케메린과 경쟁하지 않는다. 본 발명의 항-CMKLR1 화합물과 케메린 사이의 경쟁의 부재는, 본 발명의 CMKLR1 화합물이 존재하는 경우, 동일한 실험 조건이나 발명의 항-CMKLR1의 존재 없이, CMKLR1에 대한 케메린의 결합의 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 이와 유사할 때, 결정될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항-CMKLR1 화합물과 케메린 사이의 경쟁의 부재는 실시예 9에 나타낸 방법에 따라 측정할 수 있다.
특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 화합물은 시험관 내 및/또는 생체 내에서 Akt 신호전달 경로 단백질(PI3K-Akt 경로로 또한 공지됨) 및/또는 Erk 신호전달 경로 단백질, 바람직하게는 Akt 단백질 및/또는 Erk 단백질, 바람직하게는 Akt 단백질과 Erk 단백질 모두를 활성화하는 능력을 갖는다. 경로의 활성화는 당해 분야에 공지된 방법, 특히 본 발명의 실시예에서 개시된 방법에 따라 평가할 수 있다.
본 발명은 환자, 특히 염증의 분해 상이 지연되거나 중지된 염증 상태, 특히 만성 염증의 치료학적 치료에서 사용하기 위한 레졸빈 E1-유사 능력을 갖는 CMKLR1의 작용제에 관한 것이며, 특히 상기 작용제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다음의 설명에서, 임의의 반대되는 언급 없이, 레졸빈 E1-유사 능력을 갖는 CMKLR1의 작용제는 또한 "작용제"로 확인될 수 있고; 용어 둘 다는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(항-CMKLR1 항체 참조), 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함하고; 용어 화합물 또는 항-CMKLR1 화합물은 또한 (발명의) "작용제"의 동의어로서 다음의 설명에서 사용될 수 있고, 이에 의해 항체 또는 이의 항원-결합 단편(항-CMKLR1 항체라고도 지칭됨), 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 작용제의 사용에 의해 제공되는 효과 중에는 다음의 특수 효과가 입증되었다:
- 레졸빈 E-유사 능력을 가진 CMKLR1의 작용제는 특히, 본원의 말기에 기술된 바와 같이 내피를 통해 염증 부위로의 이주 능력의 억제를 통해, 다형 핵 호중구(본원에서 또한 단순히 호중구, PMN 또는 PMN으로 지칭함)의 세포자멸사 및/또는 이러한 세포의 이행 능력의 감소 또는 억제를 유도하며;
- 레졸빈 E1-유사 능력을 가진 CMKLR1의 작용제는 다양한 골수 세포, 특히 대식구 및/또는 수지 세포에서 세포 표면에 발현된 상이한 수용체의 내재화(internalization)을 유도함으로써, 본 출원에서 후에 기술된 바와 같이 염증의 분해를 유도하거나 유지하는 공정을 향상시키고;
- 특히 레졸빈 E1-유사 능력을 가진 CMKLR1의 작용제는 다양한 골수 세포, 특히 대식구 및/또는 수지 세포의 세포 표면에서 발현된 상이한 수용체 CMKLR1 및 CXCR4 및/또는 CCR7의 내재화를 유도하고, 이러한 내재화는 염증 부위로의 방향으로 세포의 이주를 유도하는 것으로 알려진 사이토킨에 의한 CXCR4, CCR7 수용체의 훨씬 낮은 표적화와 인식을 이끌며, 그 결과 대식구 및/또는 수지 세포가 염증 부위로부터 2차 림프 기관으로 및/또는 염증 부위를 향해 이동하는 것을 감소 또는 억제하고;
- 레졸빈 E1-유사 능력을 가진 CMKLR1의 작용제는 호중구 및 대식구 및/또는 수지 세포의 이주 능력을 감소시키거나 억제하고; 특히, 이는 CD62L의 내재화 및/또는 세포 표면 발현 감소로 인해 이러한 세포의 롤링 능력(rolling capability))을 저하시킴으로써, 내피를 통한 이의 이주 능력을 감소시키고;
- 본 발명의 특수한 양태에서, 본 발명자들은 IgG 불변 도메인, 특히 IgG1 불변 도메인과 같이, Fc 수용체와의 상호작용에 적합한 도메인을 포함하는 레졸빈 E1-유사 능력을 갖는 CMKLR1의 작용제가 특히 효율적이라는 것을 입증하였다. 대식구 또는 호중구의 Fc 수용체는 특히 항-CMKLR1 IgG 불변 도메인 또는 IgG1 불변 도메인의 Fc 단편을 매우 효율적으로 인식하여, 항-CMKLR1 IgG1 항체에 의해 인식되는 호중구의 세포자멸사를 이끌거나 이에 기여한다;
- 본원의 발명자들은 염증 공정에 관여하고(즉, 염증을 지속시키고) CMKLR1, 및 CXCR4 및/또는 CCR7을 발현하는 골수 세포가 병리학적 염증 과정의 치료에 있어서, 레졸빈 E1-유사 능력을 갖는 CMKLR1의 작용제에 대해 특히 적합한 표적임을 입증한다.
본 발명은 염증 상태, 특히 염증의 분해가 지연되거나 중지된 염증 상태로 고통 받는 환자의 치료에 사용하기 위해, 레졸빈 E1-유사 능력을 갖는 항-케메린 유사 수용체 1(CMKLR1)의 작용제에 관한 것이고, 레졸빈 E1-유사 능력을 갖는 CMKLR1의 작용제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 여기서 작용제는:
- 염증 부위에서 호중구의 세포자멸사를 유도하고/하거나
- 내피를 통해 호중구의 염증 부위로의 이주 능력을 억제 또는 감소하고/하거나,
- 대식구 및/또는 수지 세포의 염증 부위로부터 2차 림프 기관 및/또는 염증 부위로의 이주를 억제한다.
- 본 발명은 염증 상태, 특히 염증의 분해가 지연되거나 중단된 염증 상태의 치료시, 호중구의 세포자멸사를 유도 또는 향상시키기 위한 항체, 특히 사람화된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편과 같이, 레졸빈 E1-유사 능력을 갖는 CMKLR1의 작용제의 용도에 관한 것이다.
특수한 실시예에서, 본 발명은 사람화된 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체 또는 변형된 항체에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 재조합 항체를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, "모노클로날 항체"는 상이한 아미노산 서열의 항체의 혼합물을 함유하는 "폴리클로날" 항체 제제와는 대조적으로, 일반적인 중쇄 및 일반적인 경쇄 아미노산 서열을 공유하는 항체를 수득하기 위한 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체는 파아지, 세균, 효모 또는 리보솜 디스플레이(ribosomal display)와 같은 알려진 몇 가지 기술 뿐만 아니라, 하이브리도마-유래된 항원에 의해 예시된 전통적인 방법에 의해 생성될 수 있다. 이들은 또한, 참고로서 개시된 아미노산 서열들을 사용하여 합성할 수 있다. 따라서, 용어 "모노클로날"은 하나의 핵산 클론으로부터 유래된 모든 항체를 지칭하는 데 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 야생형 항체와 비교하여 변형된 항체를 추가로 포함하고; 키메라 항체, 사람화된 항체, 변형된 항체, 및 항원-결합 항체 모사체를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 참조되는 특수한 야생형 항체는 항체 2G1이다.
본 발명의 항체는 재조합 항체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 생성, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 지칭하며, 예를 들면, 숙주 세포로 형질전달된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체; 재조합 조합 항체 라이브러리에서 분리된 항체; 사람 면역 글로불린 유전자로 인해 유전자이식된(transgenic)인 동물(예컨대, 마우스)에서 분리된 항체; 또는 특수한 면역글로불린 유전자 서열(예컨대, 사람 면역글로불린 유전자 서열)이 다른 DNA 서열과 조립되는 임의의 다른 방식으로 생성, 발현, 생성 또는 단리된 항체이다. 재조합 항체는 예를 들면, 키메라 항체와 사람화된 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "키메라 항체"는 마우스와 같은 포유 동물 종의 생식선으로부터 유도된 가변 영역의 서열이 사람과 같은 다른 포유 동물 종의 생식선으로부터 유도된 불변 도메인의 서열에 이식된 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "사람화된 항체"는 마우스와 같은 다른 포유 동물 종의 생식선에서 유래된 CDR 서열이 사람 또는 특히 사람화된 골격 서열에 이식된 항체를 지칭한다. 추가 구현예에서, "사람화된 항체"는 적어도 하나의 CDR 및 골격 서열의 전부 또는 일부가 사람화된 항체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용 바와 같은, "항체의 항원-결합 단편"은 가능한 한 이의 천연 형태에서 CMKLR1에 대한 항원-결합 능력을 나타내는, 항체의 일부, 즉, 본 발명의 항체 구조의 일부에 상응하는 분자를 의미하고; 이러한 단편은 특히 상응하는 4-쇄 항체의 항원-결합 특이성과 비교하여 상기 항원에 대해 동일하거나 실질적으로 동일한 항원-결합 특이성을 나타낸다. 유리하게, 항원-결합 단편은 상응하는 4-쇄 항체와 유사한 결합 친화성을 갖는다. 그러나, 상응하는 4-쇄 항체와 관련하여 감소된 항원-결합 친화성을 갖는 항원-결합 단편 또한 본 발명에 포함된다. 항원-결합 능력은 항체와 표적 단편 사이의 친화력을 측정함으로써 측정할 수 있다. 이러한 항원-결합 단편은 또한 항체의 "기능성 단편"으로 지정될 수 있다.
항체의 항원-결합 단편은 항원에 대한 인식 부위, 즉, CMKLR1의 세포외 도메인, 특히 CMKLR1의 세포외 도메인(EL3로 지정됨)의 제3의 루프를 포함함으로써, 항원 인식 특이성을 정의하는 CDR(상보성 결정 영역) 또는 이의 부분(들)로 지정된 이의 초가변 도메인을 포함하는 단편이다. EL3은 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 283번과 아미노산 잔기 300번 사이에 위치한다. EL3 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호: 2의 아미노산 서열이다. 또한 EL3는 서열 번호: 52의 폴리펩타이드 내에 포함된다. 4-쇄 면역글로불린의 각각의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인(각각 VL 및 VH)은 경쇄 가변 도메인의 경우 VLCDR1, VLCDR2, VLCDR3; 및 중쇄 가변 도메인의 경우 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3으로 지정된 3개의 CDR을 갖는다. 4-쇄 면역글로불린의 각각의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인의 경우 LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4; 및 중쇄 가변 도메인에 대해 HFR1, HFR2, HFR3, HFR4로 지정된 4개의 골격 영역(FR)을 갖는다. CDR 도메인과 골격 도메인을 정의하는 데 사용된 명명법은 카밧(kabat) 시스템이다.
숙련가는 다음에 명시된 표준 정의, 예를 들면, 카밧(KABAT)의 번호매김 시스템을 참고함에 의해 또는 IMGT "콜리어 드 퍼(collier de perle)" 알고리즘의 적용에 의해 항체의 다양한 영역/도메인의 위치를 측정할 수 있다. 이와 관련하여, 발명의 서열의 정의를 위해, 영역/도메인의 구분은 참조 시스템마다 다를 수 있다는 점에 주목한다. 따라서, 본 발명에서 정의된 영역/도메인은 대략 +/- 10%의 항체의 가변 영역 전체-길이 서열 내에서 상응 서열의 길이 또는 국재화에서의 변화를 보여주는 서열을 포함한다.
4-쇄 면역 글로불린의 구조를 기반으로 하여, 항원-결합 단편은 따라서 이용 가능한 데이터베이스 및 선행기술의 항체 서열과의 비교에 의해, 특히 이러한 서열내 기능성 도메인의 위치를 비교함에 의해 정의될 수 있으며, 골격과 불변 도메인의 위치는 다양한 부류의 항체, 특히 IgG, 특히 포유 동물 IgG의 경우 잘 정의되어 있다는 점에 주목한다. 이러한 비교는 항체의 3-차원 구조와 관련된 데이터를 포함한다.
발명의 특정 구현예의 나열 목적을 위해, 상기 항체의 CDR을 포함하는 가변 도메인을 함유하는 항체의 항원-결합 단편은 Fv, dsFv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2를 포함한다. Fv 단편은 소수성 상호작용에 의해 함께 연합된 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지고; dsFv 단편에서 VH:VL 이종이량체는 이황화물 결합에 의해 안정화되고; scFv 단편에서, VL과 VH 도메인은 가요성 펩타이드 링커를 통해 서로 연결되어 단일-쇄 단백질을 형성한다. Fab 단편은 항체의 파파인 소화에 의해 수득가능한 단량체성 단편이고; 이들은 전체 L 쇄, 및 이황화물 결합을 통해 함께 결합된, H 쇄의 VH-CH1 단편을 포함한다. F(ab')2 단편은 힌지(hinge) 이황화물 아래의 항체의 펩신 소화에 의해 생산될 수 있고; 이는 2개의 Fab' 단편과 추가로 면역글로불린 분자의 힌지 영역의 부위를 포함한다. Fab' 단편은 힌지 영역내 이황화물 결합을 절단함으로써 F(ab')2 단편에서 수득할 수 있다. F(ab')2 단편은 2가인데, 즉, 이들은 천연의 면역글로불린 분자와 같이, 2개의 항원 결합 부위를 포함하고; 한편, Fv(Fab의 가변 부분을 구성하는 VHVL 이량체), dsFv, scFv, Fab, 및 Fab' 단편은 1가인데, 즉, 이들은 단일 항원-결합 부위를 포함한다. 본 발명의 이러한 기본적인 항원-결합 단편들은 함께 결합되어 디아바디(diabody), 트리바디(tribody) 또는 테트라바디(tetrabody)와 같은, 다가의 항원-결합 단편을 수득할 수 있다. 이러한 다가의 항원-결합 단편들은 또한 본 발명의 일부이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 변형된 항체는 "이특이적(bispecific)" 항체를 포함하며 제1 항원에 대해 특이적인 적어도 하나의 영역(예컨대, 제1 항체의 가변 영역으로부터 유래됨)과 제2 항원에 대해 특이적인 적어도 제2 영역(예컨대, 제2 항체의 가변 영역으로부터 유래됨)함을 보유함으로써 2개의 상이한 항원을 인식하는 항체를 지칭한다. 이특이적 항체는 2개의 표적 항원에 특이적으로 결합하므로, 다중특이적 항체의 한 유형이다. 2개 이상의 상이한 항원을 인식하는 다중특이적 항체는 재조합 DNA 방법에 의해 생산될 수 있고, 임의의 편리한 방법에 의해 화학적으로 생성된 항체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이중특이적 항체는 모든 항체 또는 항체의 접합체, 또는 2개의 상이한 항원을 인식할 수 있는 항체의 다량체 형태를 포함한다. 이중특이적 항체는 이의 2가의 특성을 유지하기 위해 환원 및 개질된 항체와 Z와 같은 각 항원에 대해 여러 개의 항원 인식 부위를 가질 수 있도록 화학적으로 결합된 항체가 포함된다. 이중특이적 항체에는 2가의 특성을 유지하기 위해 환원 및 재형성된 항체 및 화학적으로 커플링됨으로써 이들이 BiME(이특이적 대식구 향상 항체), BiTE(이특이적 T 세포 인게이저(bispecific T cell engager), DART(이중 친화성 재표적화)와 같은 각각의 항원에 대해 수개의 항원 인식 부위를 가질 수 있는 항체; DNL(독-앤-록(dock-and-lock), DVD-Ig(이중 가변 도메인 면역글로불린), HAS(사람 혈청 알부민), kih(놉스 인투 홀스(knobs into holes)를 포함한다.
항원-결합 항체 모사체(Antigen-binding antibody mimetic)는 항원에 특이적으로 결합하는 유기 화합물이지만, 구조적으로 항체와 관련이 없다. 이들은 보통 약 3~20 kDa의 몰 질량을 가진 인공 펩타이드 또는 작은 단백질이다. 핵산 및 작은 분자는 때때로 항체 모사체로 간주되기도 하지만, 인공 항체, 항체 단편, 이로부터 구성된 융합 단백질이 아니다. 항체에 비해 일반적인 장점은 용해도, 조직 침투성, 열과 효소에 대한 안정성, 상대적으로 낮은 생산 비용이다. 항체 모사체는 치료제와 진단제로 개발되고 있다. 항원-결합 항체 모사체는 또한 아피바디(affibody), 아필린(affilin), 아피머(affimer), 아피틴(affitin), DARPin, 및 모노바디(monobody)를 포함하는 그룹 중에서 선택될 수 있다.
항원-결합 항체 모사체는 아피틴(affitin)과 안티칼린(anticalin)을 포함하는 그룹으로부터 보다 우선적으로 선택된다. 아피틴은 항원을 선택적으로 결합시키는 능력을 가진 인공 단백질이다. 이들은 구조적으로 DNA 결합 단백질인 Sac7d에서 유래되었으며, 이는 고고학적 영역에 속하는 미생물인 술폴로부스 아시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius)에서 발견된다. Sac7d의 결합 표면에 아미노산을 무작위처리함으로써, 예컨대, Sac7d의 결합 계면 11개 잔기의 무작위 치환에 상응하는 변이체를 생성함으로써, 아피틴 라이브러리가 생성될 수 있고, 수득되는 단백질 라이브러리는 리보솜 디스플레이의 라운드에 적용시킴으로써, 친화력을 펩타이드, 단백질, 바이러스 및 세균과 같은 다양한 표적으로 지시할 수 있다. 아피틴은 항체 모사체이며 생명공학에서 도구로 개발되고 있다. 또한 이들은 다양한 효소에 대한 특이적인 억제제로도 사용되어 왔다(Krehenbrink et al., J. mol. Biol., 383:5, 2008). 숙련가는 당해 분야에 알려진, 특히 특허 출원 WO2008068637 및 상기 인용된 공보에 개시된 바와 같은 방법을 사용하여 필요한 결합 특성을 갖는 아피틴을 용이하게 개발할 수 있고, 특히 본원에 개시된 항원을 사용하여 파아지 디스플레이 및/또는 리보솜 디스플레이 라이브러리를 생성하고 이를 스크리닝할 수 있다. 안티칼린은 항원, 단백질 또는 작은 분자에 결합할 수 있는 인공 단백질이다. 이들은 자연적으로 결합하는 단백질 계열인 사람 리포칼린으로부터 유래된 항체 모사체이다. 안티칼린은 약 180개의 아미노산이 크기와 약 20 kDa의 질량으로 약 8배 더 작다(Skerra, Febs J., 275:11, 2008). 특히 특이적인 결합 특성을 지닌 안티칼린을 스크리닝하고 선택하도록 하는 안티칼라 파아지 디스플레이 라이브러리가 생성되었다. 숙련가는 당해 분야에 공지된, 특히 EP 특허, EP1270725 B1, 미국 특허 US8536307 B2, 문헌: Schlehuber and Skerra, Biophys, Chem., 96:2-3, 2002 및 상기 인용된 공보에 개시된 바와 같은 방법을 사용하여 요구된 결합 특성을 지닌 안티칼린을 용이하게 개발할 수 있고, 특히, 본원에 개시된 바와 같은 항원을 사용하여 파아지 디스플레이 및/또는 리보소옴 디스플레이 라이브러리을 생성하고 이를 스크리닝할 수 있다. 안티칼린 및 아피틴은 둘 다 세균 발현 시스템을 포함하는 다수의 발현 시스템에서 생산될 수 있다. 따라서, 본 발명은 특히 CMKLR1에 대한 결합 능력, RvE1과 CMKLR1 사이의 결합에 대한 이의 작용제 능력, 본원에 기술된 바와 같은 특수한 사이토킨의 분비를 유도하거나 억제하는 능력과 관련하여, 본원에 기술된 항체의 특징을 지닌 아피틴, 안티칼린 및 기타 유사한 항체 모사체의 용도, 본원에 기술된 바와 같은 질환의 치료 또는 예방에서 이의 용도를 포함하고, 이들 모두는 본 발명에 따른 모사체로서 고려된다.
본원에 사용된 바와 같은, "변형된 항체"는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 돌연변이에 의해 변형된 아미노 서열을 가진 항체를 의미한다. 따라서, "변형된 항체"는 본 명세서에서 정의된 키메라 항체 또는 사람화된 항체를 지칭하며, "변형된 항체"는 또한 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 분자에 상응할 수 있고, 여기서 상기 모노클로날 항체 또는 이의 기능성 단편은 기능적으로 상이한 분자와 연합된다. 본 발명의 변형된 항체는 공유결합 부착, 그라프팅(grafting), 화학적 또는 생물학적 그룹 또는 PEG 중합체 또는 생체 내에서 프로테아제 절단에 대한 보호하고 항체 또는 기능성 단편의 안정성 및/또는 반감기의 개선에 적합한 분자와의 화학 결합을 포함하는 임의의 적합한 부착 형태로부터 생성된 융합 키메라 단백질 또는 접합체일 수 있다.
비-사람(예컨대, 쥐과) 항체의 "사람화된" 형태는 키메라성 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 표적-결합 서열)이며, 이는 비사람 면역글로불린에서 유래된 최소의 서열을 함유한다. 일반적으로, 사람화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기서 모든 CDR 영역은 비-사람 면역 글로불린 및/또는 이의 사람화된 버전의 영역에 상응하고; FR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 사람 면역글로불린 주형 서열의 영역이거나 상응 위치에서 사람 면역 글로불린 주형 속에 존재하는 아미노산 잔기에 대한 비-사람 잔기(예를 들면, 설치류 잔기)의 치환을 지닌다. 사람화된 항체는 면역 글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 선택된 사람 면역글로불린 주형의 것을 포함할 수 있다. 특수한 구현예에서, 본 발명은 본원에서 개시된 중쇄 가변 도메인 및 본원에 개시된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 불변 영역, 특히 Fc 영역을 추가로 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 관한 것이다.
용어 "특이적으로 결합하는" 및 "에 특이적으로 결합한다"는 적어도 1 X 10-6 M, 1 X 10-7 M, 1 X 10-8 M, 1 X 10-9 M, 1 X 10-10 M, 1 X 10-11 M, 1 X 10-12 M 이상의 친화력으로 CMKLR1에 결합하고/하거나, 비특이적 표적(예컨대, CMKLR1 이외의 다른 단백질)에 대해 이의 친화성보다 적어도 2배 더 큰 친화성으로 CMKLR1에 결합하는 본 발명에 따른 항체, 이의 항원-결합 단편, 항원-결합 항체 모사체 또는 변형된 항체의 능력을 지칭한다. 친화성은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려진 다양한 방법에 따라 평가될 수 있다. 이러한 방법은 비아코어 분석(Biacore analysis), 블리츠 분석(Blitz analysis) 및 스캐챠드 플롯(Scatchard plot)과 같은 바이오센서를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용어 "치료학적 유효량"은 적어도 치료된 환자의 임상적 또는 생리적 상태의 개선을 위해 충분한 본 명세서에 정의된 바와 같은 임의의 주어진 화합물의 양을 지칭한다. 투여될 할 본 발명에 따른 항체, 이의 항원-결합 단편, 항원-결합 항체 모사체 또는 변형된 항체의 치료학적 유효량은 치료 중인 장애, 치료 중인 특정 포유 동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 약제 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의료 종사자에게 알려진 기타 요인과 같은 고려사항에 의해 지배된다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대하여 본원에 개시된 모든 구현예는 본 발명의 거대분자, 특히 항원-결합 항체 모사체 및 변형된 항체로 수송된 무타티스 무탄디스(mutatis mutandis)이다.
본 발명의 특수한 구현예에서, CMKLR1은 사람 CMKLR1이고, 이는 NCBI 단백질 수탁 번호 Q99788.2에 상응한다.
중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 둘 다는 3개의 CDR(각각 5' 말단부터 3' 말단까지 CDR1, CDR2 및 CDR3)과 4개의 골격 영역(각각 5' 말단부터 3' 말단까지의 FR1, FR2, FR3, FR4)을 포함한다. 뮤린 항체의 사람화는 경쇄 가변 영역 내에서 및/또는 중쇄 가변 도메인 내에서 또는 둘 다에서 적어도 하나의 골격 영역을 사람화하는 것으로 이루어질 수 있다. 특수한 구현예에서, 몇몇 골격 영역은 특히 중쇄 가변 영역 내 및 경쇄 가변 영역 내에서 사람화될 수 있다. 야생형 CDR은 보존될 수 있지만, CDR은 본원에 기술되는 CDR로 대체될 수 있다. 이에, 본 발명에 따른 항-CMKLR1 화합물은 골격 영역을 사람화하는 경우 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 6개의 야생형 CDR을 포함할 수 있다. 다시 말해서, 항-CMKLR1 화합물은 모 키메라 항체 2G1(서열 번호: 37의 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호: 49의 경쇄 가변 도메인을 포함함)의 사람화된 버전이며, 여기서 적어도 1개의 골격 영역이 사람화되며, 특히 여기서 적어도 하나의 골격 영역과 적어도 하나의 CDR이 사람화된다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 항체의 가변 영역은 IGg1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 영역, 특히 IgG1 불변 영역과 같은 항체 불변 영역과 연합될 수 있다. 이러한 불변 영역은 Fc 수용체에 대한 이의 결합 능력을 변형하기 위해, 당해 분야에 공지된 방법에 의해 추가로 돌연변이시키거나 변형시킬 수 있다. 특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 사람화된 모노클로날 항체이며, 특히 여기서 항체 경쇄 불변 도메인은 사람 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유래되고, 특히 여기서 경쇄 불변 도메인은 서열 번호: 79의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 항체 중쇄 불변 도메인은 사람 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 도메인, 특히 IgG1 중쇄 불변 도메인으로부터 유래되고, 특히 여기서 항체 중쇄 불변 도메인은 특히 사람 IgG1 중쇄 불변 영역으로부터 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 82, 서열 번호: 83 또는 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 특히 여기서 항체 중쇄 불변 도메인은 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 83의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
서열 서열 번호: 2 및/또는 서열 번호: 59의 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 이루어지고/지거나 아미노산 서열 서열 번호: 60 내에 위치하고/하거나 CMKLR1의 제3의 추가-루프(extra-loop)에 대한 결합을 위한 폴리펩타이드에 대한 결합은 본 발명의 실시예에 개시된 실시예에 의해 ELISA 분석에 의한 결합 친화성 분석으로 평가될 수 있다. 시험 항체가 동일한 항원 또는 제3의 루프 또는 2G1 항체에 의해 결합된 동일한 에피토프(또는 서열 번호: 37에 상응하는 중쇄 가변 도메인과 서열 번호: 49에 상응하는 경쇄 도메인을 포함하는 항원-결합 단편)에 대해 경쟁할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 교차-차단 검정(예컨대, 경쟁적 ELISA 검정)을 수행할 수 있다. 예시적인 경쟁적 ELISA 검사에서, 상기 에피토프 또는 제3 루프를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드를 미세역가 플레이트의 웰에 코팅하고, 후보 경쟁 항체를 포함하거나 포함하지 않고 예비-항온처리한 다음, 본 발명의 비오틴-표지된된 2G1 항체를 가할 수 있다. 서열 번호: 2 및/또는 서열 번호: 59의 폴리펩타이드를 포함하거나 이로 이루어지고/지거나 아미노산 서열 서열 번호: 60 및/또는 웰 내 CMKLR1의 제3의 루프 내에 위치한 폴리펩타이드에 결합된 표지된 항-2G1 항체의 양을 아비딘-퍼옥시다제 복합체 및 적절한 시약을 사용하여 측정한다. 항체는 방사활성 또는 형광성 표지 또는 다른 검출가능하고 측정가능한 표지로 표지할 수 있다. 서열 번호: 2 및/또는 서열 번호: 58의 폴리펩타이드에 결합되고/되거나 아미노산 서열 서열 번호: 60 및/또는 제3의 루프에 결합된 표지된 항-2G1 항체의 양은 동일한 에피토프 또는 동일한 루프에 대한 결합에 대해 경쟁하는 후보물 경쟁 항체(시험 항체)의 능력과 간접적인 상관관계를 가질 것인데, 즉, 동일한 에피토프에 대한 시험 항체의 친화성이 클수록, 표지된 2G1 항체는 항원-코팅된 웰에 결합하지 않을 것이다. 후보물 경쟁 항체가 후보물 경쟁 항체의 부재하에서(그러나 공지된 비-경쟁 항체는 존재할 수 있다) 평행하게 수행된 대조군과 비교하여 2G1 항체의 결합을 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 20 내지 50%까지, 심지어 보다 바람직하게는, 적어도 50%까지 차단할 수 있는 경우, 후보물 경쟁 항체는 본 발명의 2G1 항체와 동일한 폴리펩타이드 또는 제3의 루프에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체로 고려된다. 이러한 검정의 변형은 동일한 정량적 값에 도달하기 위해 수행될 수 있음이 이해될 것이다.
항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 염증의 분해 인자의 효과를 가지며, 특히 골수 세포 계통과 상호 작용함으로써 이러한 효과를 가진다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 특수한 VHCDR2는 사람의 감소된 면역원성을 나타낼 수 있는 항체에 존재함으로써, 치료 목적으로 더 강력할 수 있는 항체를 제공하도록 하는데, 이는 감소된-면역원성 항체가 환자에게 투여되는 경우 부작용이 거의 없을 것으로 예상되기 때문이다.
본 발명의 특정 양상에서, CMKLR1, 특히 사람 CMKLR1에 결합하는 항-케모킨 유사 수용체 1(CMKLR1) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 개시되며, 이의 항원-결합 단편의 상기 항체가 다음을 포함한다:
a. 3개의 CDR들 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인으로서:
- VHCDR1은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VHCDR2는 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12 및 서열 번호: 61로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VHCDR3은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 이루어진 그룹에서 선택되는, 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및
b. 3개의 CDR들 VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인으로서:
- VLCDR1은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR2는 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR3은 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택되는, 항체 경쇄 가변(VL) 도메인.
특히, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 특히 CMKLR1의 제3의 세포외 루프(EL3) 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합하며, 보다 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 59를 포함하는 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열 서열 번호: 60 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 다른 특정 양상에서, CMKLR1, 특히 사람 CMKLR1에 결합하는 항-케모킨 유사 수용체 1(CMKLR1) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 개시되며, 이의 항원-결합 단편의 상기 항체가 다음을 포함한다:
a. 3개의 CDR들 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인으로서:
- VHCDR1은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VHCDR2는 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 및 서열 번호: 61로 이루어진 그룹에서 선택되거나; 또는 VHCDR2는 서열 번호: 12 또는 서열 번호 63의 아미노산 잔기에 상응하며, 단, VHCDR1은 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4가 아니며;
- VHCDR3은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 이루어진 그룹에서 선택되는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및
b. 3개의 CDR들 VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인으로서:
- VLCDR1은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR2는 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR3은 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택되는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인.
특히, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 특히 CMKLR1의 제3의 세포외 루프(EL3) 내에 위치한 에피토프에 결합하며, 보다 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 59를 포함하는 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열 서열 번호: 60 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 다른 특정 양상에서, CMKLR1, 특히 사람 CMKLR1에 결합하는 항-케모킨 유사 수용체 1(CMKLR1) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 개시되며, 이의 항원-결합 단편의 상기 항체가 다음을 포함한다:
a. 3개의 CDR들 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인으로서:
- VHCDR1은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VHCDR2는 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11 및 서열 번호: 61로 이루어진 그룹에서 선택되는데,
VHCDR1이 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4이고 VHCDR2가 서열 번호: 12의 아미노 서열에 상응하는 경우, 상기 중쇄 가변(VH) 도메인은 서열 번호: 70의 골격 VHFR3를 포함하지 않고, 바람직하게는 단 상기 중쇄 가변(VH) 도메인은 서열 번호: 69의 골격 FR3을 포함하며;
- VHCDR3는 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
b. 3개의 CDR들 VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인으로서:
- VLCDR1은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR2는 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR3는 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
특히, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 특히 CMKLR1의 제3의 세포외 루프(EL3) 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합하며, 보다 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 59를 포함하는 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열 서열 번호: 60 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합한다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편이 아미노산 서열 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 59를 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호: 60의 아미노산 서열 내에 위치하는 에피토프에 특이적으로 결합하는, CMKLR1의 제3의 세포외 루프(EL3) 내에 위치한 에피토프에 대한 결합은 본원의 상기에 개시된 방법에 따라 평가될 수 있다. VHCDR2의 특수한 선택은 다른 VHCDR2를 갖는 항체에 비해 면역원성이 감소된 항체를 제공할 수 있다.
이러한 항체는 레졸빈 E1과 CMKLR1의 결합 효과를 모사하는, 즉, 본원에 상기 정의한 바와 같은 레졸빈 E1-유사 능력을 갖는 CMKLR1의 작용제이다. 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 염증의 프로-분해 인자의 효과를 가지며, 특히 골수 세포 계통과 상호 작용함으로써 이러한 효과를 갖는다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
- 서열 번호: 3과 서열 번호: 4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VHCDR1.
본 발명의 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
- 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11 및 서열 번호: 61로 이루어진 그룹에서 선택되는 VHCDR2.
본 발명의 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
- 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 및 서열 번호: 15 로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VHCDR3.
본 발명의 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
- 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택된 VLCDR1.
본 발명의 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
- 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택된 VLCDR2.
본 발명의 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
- 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택된 VLCDR3.
본 발명의 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
- 서열 번호: 3과 서열 번호: 4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VHCDR1; 및/또는,
- 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11 및 서열 번호: 61로 이루어진 그룹에서 선택된 VHCDR2; 및/또는,
- 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 및 서열 번호: 15 로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VHCDR3.
- 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택된 VLCDR1; 및/또는,
- 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택된 VLCDR2; 및/또는,
- 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택된 VLCDR3.
특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원- 결합 단편은 다음의 CDR을 포함한다: 서열 번호: 4의 VHCDR1, 서열 번호: 12의 VHCDR2, 서열 번호: 13의 VHCDR3, 서열 번호: 19의 VLCDR1, 서열 번호: 26의 VLCDR2 및 서열 번호: 35의 VLCDR3.
본 발명의 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 62, 서열 번호: 89, 서열 번호: 90 및 서열 번호: 91로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
보다 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 92 및 서열 번호: 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 보다 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
- 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 62, 서열 번호: 89, 서열 번호: 90 그리고 서열 번호: 91로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인; 및
- 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 92 그리고 서열 번호: 93으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인.
본원에 개시된 바와 같은 특수한 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 임의의 조합은 본 개시내용에 포함된다.
보다 특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 항-CMKLR1 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 그리고 서열 번호: 62로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인; 및 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 보다 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 서열 번호: 38 및 서열 번호: 49의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 보다 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
또한, 상기 항체는 Fc 단편이 IgG1의 특성을 갖는다는 점에서 유리하게 특성화된다.
본 발명의 제2 양태에서, CMKLR1, 특히 사람 CMKLR1에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 키메라, 변형되거나 사람화된 항체의 그룹에서 선택된 화합물이 개시되어 있고, 상기 화합물은 (i) 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12 및 서열 번호: 61에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VHCDR2, 및 (ii) 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16에 나타낸 아미노산 서열 또는 이의 돌연변이된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VHCDR3이며, 여기서, 아미노산 잔기(들)은 치환되고 단, 돌연변이된 서열의 1 및 2번 위치에서의 아미노산 잔기는 각각 L 및 I이고;
여기서 항-CMKLR1 화합물은 CMKLR1의 제3의 세포외 루프(EL3) 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합되고, 특히 여기서 화합물은 아미노산 서열 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 59를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열 서열 번호: 60 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합하고;
여기서 상기 화합물은 서열 번호: 37에 상응하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호: 49에 상응하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체와, 서열 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 59 또는 서열 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 CMKLR1의 세포외 영역의 제3의 루프(EL3)를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
서열 번호: 37의 중쇄 가변 도메인과 서열 번호: 49의 경쇄 가변 도메인의 조합은 모 항체 2G1에 상응한다. 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나 서열 번호: 60 내에 위치한 폴리펩타이드 또는 CMKLR1의 세포 외 도메인의 제3 루프(EL3)를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드에 대한 화합물의 결합은 본원의 상기에 개시되고 본 발명의 실시예에 나타낸 방법에 따라 평가될 수 있다.
보다 특수한 구현예에서 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 보다 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 보다 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
또한, 상기 항체는 Fc 단편이 IgG1의 특성을 갖는다는 점에서 유리하다.
본 발명은 염증의 분해가 지연되거나 중지된 질환 및/또는 다음의 그룹으로부터 선택된 질환의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 정의된 본 발명의 화합물 중 어느 하나에 관한 것이다: 염증 질환, 특히 급성 염증 질환(acute inflammatory diseases), 만성 염증성 폐질환(chronic inflammatory pulmonary diseases)(예컨대, 천식(asthma))과 같은 만성 염증 질환(chronic inflammatory diseases), 각결막염(keratoconjunctivitis), 치주질환(periodontal disease), 습진(eczema), 염증성 창자 질환(inflammatory bowel disease), 특히 크론 질환(Crohn’s disease) 또는 결장염(colitis), 특히 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 또는 자발성 대장염(spontaneous colitis), 낭성 섬유증(cystic fibrosis), 피부염(cutaneous inflammation); 자가면역 질환(autoimmune diseases), 예를 들면, 당뇨병(diabetes), NASH, 특히 I형 당뇨병(type I diabetes), 건선(psoriasis), 루푸스(lupus), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 소그렌 증후군(Sjogren’s syndrome), 셀리악 질환(celiac disease), 혈관염(vasculitis), 중증 근무력증(myasthenia gravis); 패혈증(sepsis)과 같은 감염 질환(infection diseases), 코로나바이러스(coronavirus)(예컨대, COVID-19)와 같은 중증 염증 상태를 지닌 중증 바이러스 징후, 복막염(peritonitis); 퇴행성 질환(degenerative diseases); 상처 치유 장애(wound healing disorder), 안구 건조증(dry eye syndrome); 암 질환, 특히 고형 및 액체 암(solid and liquid cancers), 전이성 암(metastatic cancers), 특히 암종(carcinoma), 특히 유선 암종(mammary carcinoma) 또는 결장 암종(colon carcinoma), 결장직장 암(colorectal cancer) 또는 폐 암(lung cancer) 또는 중피종(mesothelioma), 또는 골수암(myeloid cancer), 특히 백혈병(leukemia), 특히 암세포가 CMKLR1을 발현하거나 CMKLR1을 발현하거나 종양의 미세환경이 CMKLR1을 발현하거나 과발현하는 세포에 의해 침입된 암.
섬유증(fibrosis)(특히 폐 및 간 섬유증(lung and hepatic fibrosis)), ANCA(항 호중구 세포질 자가항체(Anti neutrophil Cytoplasmic Autoantibodies)) 병리(pathologies)(혈관염(vasculitis)), ChermR23과 연결된 뉴우런의 세포자멸사로 인한 병리 등이 특히 관련되어 있다.
특수한 구현예에서, 본 발명은 염증의 분해가 지연되거나 중지된 질환, 및/또는 다음의 그룹으로부터 선택된 질환의 예방 및/또는 치료시 사용하기 위한, 임의의 본 발명의 상기 정의된 화합물에 관한 것이다: 염증 질환, 특히 급성 염증 질환, 만성 염증 질환, 예를 들면, 천식, 각결막염, 치주질환, 습진, 염증성 창자 질환, 특히 크론 질환 또는 대장염; 궤양성 대장염 또는 자발성 대장염; 낭성 섬유증, 자가면역질환, 예를 들면, 당뇨병, 특히 제1형 당뇨병, 건선, 루푸스, 류머티스 관절염, 다발 경화증, 소그렌 증후군, 셀리악 질환, 혈관염, 중증 근무력증; 패혈증, 복막염과 같은 감염성 질환; 심각한 염증성 상태를 지닌 심각한 바이러스 징후, 예를 들어 코로나바이러스(예컨대, COVID-19), 퇴행성 질환; 상처 치유 장애, NASH(비알코올성 지질간염), 경피증, 안구 건조증. 본 발명의 또 다른 특수한 구현예에서, 본 발명은 암, 특히 고형 및 액체 암, 전이성 암, 특히 암종, 특히 유선 암종 또는 결장 암, 또는 대장직장 암 또는 폐 암 또는 골수암, 특히 백혈병, 특히 암 세포가 CMKLR1을 발현하거나 CMKLR1을 발현하거나 종양의 미세환경이 CMKLR1을 발현하거나 과발현하는 세포에 의해 침입되는 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한, 본 발명의 상기 정의된 임의의 화합물에 관한 것이다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 항체는 시험관 내 및/또는 생체 내에서 분해능에 유리한 다음 효과 중 적어도 하나를 유도한다:
- 염증 부위에서 PMN 또는 PMN의 약어로 본원에 참조되는, 다형 핵 호중구의 세포자멸사를 증가시킨다; 이러한 효과는 발명의 실시예에서 설명된다. 호중구의 세포자멸의 조절은 염증 관련 질환에 대한 치료적 개입에 중요하다. 본 발명의 실시예에서 나타낸 바와 같이, PMN에 레졸빈 E1-유사 능력 항체를 갖는 CMKLR1의 작용제를 사용하면 염증유도 동안, 대조군 항체와 비교하여, 호중구의 강력한 세포자멸사를 유도한다.
- 호중구에서의 카스파제-3 발현을 향상시킴으로써, 카스파제-3 의존성 세포자멸사를 초래한다; 이는 음성 대조군과 비교하여 레졸빈 E1-유사 능력 항체를 갖는 CMKLR1의 작용제로 11시간 동안 치료한 후, 카스파제-3의 발현이 1-log 이상, 보다 바람직하게는 2-log, 가장 바람직하게는 3-log일 때 세포자멸사가 향상되거나 유도되는 것으로 고려될 수 있다; 방법은 본 발명의 실시예에 개시된다;
- PMN(호중구)의 내피를 통한 염증 부위로의 이행(transmigration)을 감소시키거나 억제한다; 염증 부위로 재국재화되는 것을 방지하고, 전-염증 효과를 발휘한다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 레졸빈 E1-유사 능력 IgG1 항체를 가진 CMKLR1의 작용제의 투여에 의해 호중구의 이주 및 이행이 방지되거나 감소된다. 따라서, 특수한 구현예에서, 레졸빈 E1-유사 능력을 가진 CMKLR1의 작용제는 사람 IgG1에서 유래되거나 생성된 사람 불변 영역을 가진 사람화된 항체이다. 특수한 구현예에서, 레졸빈 E1 유사 능력 항체를 가진 CMKLR1의 작용제는 사람 IgG1 동형인데, 즉 중쇄 및 경쇄의 불변 단편은 사람 IgG1 항체 불변 중쇄 및 경쇄 단편에서 유래되거나 생성된다. 따라서, 본 발명의 레졸빈 E1-유사 능력 항체를 갖는 CMKLR1의 작용제는 IgG1 동형의 Fc 도메인을 포함한다. 호중구의 이행은 본 발명의 실시예에 개시된 방법에 의해 평가될 수 있고; 호중구는 음성 대조군과 비교하여, 염색 실험에서 CD62L의 세포 표면 발현이 적어도 1-log까지 감소하였을 때 이동 및/또는 이행 능력이 감소한다고 볼 수 있다. 발명자들은 본 발명의 레졸빈 E1-유사 능력을 사람화된 IgG1 항체를 갖는 CMKLR1의 작용제가 생체 내에서 세포독성을 나타내지 않음을 발견하였다; 다시 말해서, CMKLR1의 작용제의 사용은 생체 내에서 CMKLR1-양성 세포의 유의적인 고갈을 나타내지 않는다. 특수한 구현예에서, 본 발명의 작용제의 사용은 CMKLR1-양성 세포에서 세포독성 활성을 나타내지 않는다;
- CMKLR1 및 CXCR4 및/또는 CCR7의 세포 표면 발현을 감소시킨다. 특수한 구현예에서, 세포 표면 발현은 대식구 및/또는 수지 세포에서 고려된다. 레졸빈 E1 능력을 갖는 CMKLR1의 작용제가 이의 표적, CMKLR1에 결합하면, CXCR4 및/또는 CCR7 손은 헤테로 이량체화 및 내부화된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 CMKLR1-양성 세포의 세포 표면에서 CMLKLR1 및/또는 CXCR4 및/또는 CCR7의 발현을 유도 및/또는 억제한다. 따라서, 항체의 존재 하에 항온처리된 세포에서 CMLKLR1, CXCR4 및/또는 CCR7의 세포 표면 발현은 다른 방식으로 동일한 조건에서 항온처리된 세포에서 세포 표면 발현과 비교하여, 상대적으로 감소하거나 현저하게 감소하지만, 레졸빈 E1-유사 기능을 가진 CMKLR1의 작용제의 부재하에서는 그렇지 않다.
특수한 양태에서, 본 발명은 COS 또는 CHO 세포와 같은 포유동물 세포내에서 0.1 mg/ml 초과, 특히 1 mg/ml 초과, 특히 10 mg/ml 초과, 그리고 보다 특히 100 mg/ml 초과의 수율로 생산하기에 적합한 사람화된 항-케메린-유사 수용체 1(CMKLR1) 항체 이의 항원-결합 단편에 관한 것이고; 여기서
a) 가변 중쇄(VH) 도메인은 중쇄 가변 도메인의 골격(FR1, FR2, FR3, FR4)의 아미노산 서열을 포함하고 여기서 각각의 골격은 FR1에 대해 100%, FR2에 대해 적어도 60%, FR3에 대해 적어도 78% 및 FR4에 대해 적어도 80%; 보다 특히 FR1에 대해 100%, FR2에 대해 적어도 80%, FR3에 대해 적어도 85% 그리고 FR4에 대해 적어도 90%인 각 골격이 서열 번호: 41의 서열에서 동일한 순위의 골격과 각각 서열 동일성을 갖는다;
b) 가변 경쇄 도메인은 경쇄 가변 도메인의 골격(FR1, FR2, FR3 및 FR4)의 아미노산 서열을 포함하고 여기서 각각의 골격은 FR1에 대해 적어도 60%, FR2에 대해 적어도 70%, FR3에 대해 적어도 75% 및 FR4에 대해 적어도 80%; 보다 특히 FR1에 대해 100%, FR2에 대해 적어도 90%, FR3에 대해 적어도 90% 그리고 FR4에 대해 100%인 서열 번호: 50의 서열에서 동일한 순위의 골격과 각각 서열 동일성을 갖는다.
특수한 구현예에서, 사람화된 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CMKLR1의 제3의 세포외 루프(EL3)에 특이적으로 결합하며, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 59를 포함하거나 아미노산 서열 서열 번호 60 내에 위치한 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 이러한 구현예는 시험관 내에서 항체(또는 이의 항원-결합 단편)의 생산을 용이하게 할 수 있다. 항체의 이러한 정의는 CDR 도메인에 의한 항체의 정의를 포함하여 본 발명의 항-CMKLR1 항체의 임의의 다른 정의와는 독립적이라는 점에 유의해야 한다. 본 발명의 특수한 양태에서, FR 서열에 의한 본 발명의 항체의 정의는 CDR 도메인 및/또는 기능적 특징과의 정의에 의해 조합될 수 있다. 이를 위해, FR 도메인에 의해 정의되고 특정 그룹에서 선택된 이의 CDR 도메인에 의해 특징화된 항체가 본 발명에 포함되는 것으로 고려된다. 이를 위해, 본원에 개시된 바와 같은 골격 영역에 대한 동일성을 나타내거나 나타내지 않을 수 있는 이러한 항체는 다음의 CDR 중 적어도 하나, 특히 6개를 포함한다:
- 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7로 이루어진 그룹에서 선택된 VHCDR1; 및/또는
- 서열 번호 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 61, 서열 번호: 63 및 서열 번호: 64으로 이루어진 그룹에서 선택된 VHCDR2; 및/또는
- 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 이루어진 그룹에서 선택된 VHCDR3; 및/또는
및 여기서 가변 경쇄(VL) 도메인은 다음을 포함한다:
- 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택된 VLCDR1; 및/또는
- 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택된 VLCDR2; 및/또는
- 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택된 VLCDR3.
보다 특수한 양태에서, 골격 도메인 HFR1, HFR2, HFR3, HFR4, LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4 중 적어도 하나는 다음 그룹에서 선택된다:
서열 번호: 65의 VHFR1에 대하여;
서열 번호: 66, 서열 번호: 67 또는 서열 번호: 68의 VHFR2에 대하여;
서열 번호: 69 또는 서열 번호: 70의 VHFR3에 대하여;
서열 번호: 71의 VHFR4에 대하여;
서열 번호: 72의 VLFR1에 대하여;
서열 번호: 73 또는 서열 번호: 74의 VLFR2에 대하여;
서열 번호: 75 또는 서열 번호: 76의 VLFR3에 대하여;
서열 번호: 77의 VLFR4에 대하여.
본원에서 상기 언급한 그룹 중에서 복수의 골격 도메인 또는 모두를 선택할 수 있음이 이해되어야 한다.
보다 특수한 구현예에서, 앞의 2개의 절에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 41, 서열 번호: 38 서열 번호: 42, 서열 번호: 43의 그룹에서 선택된 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 가지며, 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호: 50의 서열을 갖는다.
보다 특수한 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음의 골격 도메인을 포함한다:
- 서열 번호: 65의 VHFR1,
- 서열 번호: 67의 VHFR2,
- 서열 번호: 69의 VHFR3,
- 서열 번호: 71의 VHFR4,
- 서열 번호: 72의 VLFR1,
- 서열 번호: 73의 VLFR2,
- 서열 번호: 76의 VLFR3, 및
- 서열 번호: 77의 VLFR4.
보다 특수한 구현예에서, 상기 항체는 다음의 골격 도메인을 포함하고:
- 서열 번호: 65의 VHFR1,
- 서열 번호: 67의 VHFR2,
- 서열 번호: 69의 VHFR3,
- 서열 번호: 71의 VHFR4,
- 서열 번호: 72의 VLFR1,
- 서열 번호: 73의 VLFR2,
- 서열 번호: 76의 VLFR3, 및
- 서열 번호: 77의 VLFR4,
및, 다음의 CDR을 포함하고:
- 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7로 이루어진 그룹에서 선택된 VHCDR1; 및/또는,
- 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 61, 서열 번호: 63, 및 서열 번호: 64로 이루어진 그룹에서 선택된 VHCDR2; 및/또는,
- 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 이루어진 그룹에서 선택된 VHCDR3; 및/또는,
및, 여기서 가변 경쇄(VL) 도메인은 다음을 포함한다:
- 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택된 VLCDR1;
- 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택된 VLCDR2;
- 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택된 VLCDR3.
이러한 구현예는 시험관 내에서 항체(또는 이의 항원-결합 단편)의 생산을 용이하게 할 수 있다.
본 발명은 특히 높은 결합 활성 및 안정성 및 생물학적 기능을 유지하면서, 면역원성을 감소시키도록 최적화된 사람화된 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음과 같은 CDR을 포함한다:
- 서열 번호: 4의 VHCDR1,
- 서열 번호: 12의 VHCDR2,
- 서열 번호: 13의 VHCDR3,
- 서열 번호: 19의 VLCDR1,
- 서열 번호: 26의 VLCDR2, 및
- 서열 번호: 35의 VLCDR3.
특수한 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 CDR 서열이 서열 번호: 4, 12, 13, 19, 26 및 35인 이의 항원-결합 단편은 다음과 같은 골격 도메인을 구성한다:
- 서열 번호: 65의 VHFR1,
- 서열 번호: 67의 VHFR2,
- 서열 번호: 69의 VHFR3,
- 서열 번호: 71의 VHFR4,
- 서열 번호: 72의 VLFR1,
- 서열 번호: 73의 VLFR2,
- 서열 번호: 76의 VLFR3,
- 서열 번호: 77의 VLFR4.
본 개시내용은 특히 시험관 내 생산에 적합한 높은 결합 활성 및 안정성 및 생체 기능을 유지하며, 면역원성을 감소시키기 위해 최적화된 항체 항-CMKLR1 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 앞서의 절에 따른 항체 항-CMKLR1 또는 이의 항원-결합은 서열 번호: 91의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호: 93의 서열을 가진다.
또한, 상기 항체는 Fc 단편이 IgG1의 특성을 가짐을 유리하게 특징화한다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 항체는 상기 개시된 바와 같은 골격 도메인의 아미노산 서열로 특징지을 수 있으며, CDR 도메인 중 적어도 하나의 아미노산 서열로 더욱 특징지을 수 있다. 특히, 당해 구현예에 따른 사람화된 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 61, 서열 번호: 63 및 서열 번호: 64로 이루어진 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인 VHCDR2를 지닌다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 다음의 예방학적 또는 치료학적 치료를 위해,
a) 3개의 CDR VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인으로서, 여기서:
- VHCDR1은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VHCDR2는 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11 및 서열 번호: 61로 이루어진 그룹에서 선택되거나; VHCDR2는 서열 번호: 12의 아미노산 잔기에 상응하며, 단, VHCDR1은 서열 번호: 4가 아니다;
- VHCDR3는 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
b) 3개의 CDR VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3을 포함하는 항체 경쇄(VL) 도메인으로서, 여기서;
- VLCDR1은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR2는 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR3는 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택된다:
- 염증 질환, 특히 급성 염증 질환, 만성 염증성 폐 질환(예컨대, 천식)과 같은 만성 염증 질환, 각결막염, 치주질환, 습진, 염증성 창자 질환, 특히 크론 질환이나 대장염, 특히 궤양성 대장염 또는 자발성 대장염, 낭성 섬유증, NASH, 비알콜성 간염), 간 섬유증, 폐섬유증, 항-호중구 세포질 항체 관련 질환(ANCA), 혈관염, 특히 ANCA 매개 혈관염, 경피증, 특히 여기서, 치료의 결과로서, 염증의 분해능은 향상된다;
- 당뇨병과 같은 자가면역질환, 특히 제1형 당뇨병, 건선, 루푸스, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 소그렌 증후군, 셀리악 질환, 혈관염, 중증 근무력증, 또는 패혈증, 복막염, 퇴행성 질환, 상처 치유 장애 또는 심각한 염증 질환이 따르는 심각한 바이러스 징후, 예를 들어 코로나바이러스(예컨대, COVID-19)와 같은 감염성 질환, 또는 안구 건조증, 특히 여기서, 치료의 결과로서, 염증의 분해능이 향상된다;
- 암, 특히 전이성 암, 암종과 같은 고형 또는 액체 암, 보다 특히 간 암종, 특히 유선 암종 또는 결장 암종, 또는 폐암 또는 골수암, 예를 들어 백혈병, 특히 암세포가 CMKLR1을 발현하거나 CMKLR1을 과도하게 발현하는 세포에 의해 종양의 미세 환경이 침범되는 암, 특히 여기서, 치료의 결과로서, 염증의 분해능이 향상된다.
본 발명의 또 다른 특수한 실시예에서, 상술한 바와 같은 질환의 예방학적 또는 치료학적 치료를 위한, 다음을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다:
a) 3개의 CDR들 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인으로서, 여기서:
- VHCDR1은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VHCDR2는 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11 및 서열 번호: 61으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
VHCDR1이 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4이고 VHCDR2가 서열 번호: 12의 아미노 서열에 상응하는 경우, 상기 중쇄 가변(VH) 도메인은 서열 번호: 70의 골격 VHFR3를 포함하지 않으며, 바람직하게는 단 상기 중쇄 가변(VH) 도메인은 서열 번호: 69의 골격 FR3을 포함하고,
- VHCDR3는 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
b) 3개의 CDR들 VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인으로서, 여기서;
- VLCDR1은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VLCDR2는 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
VLCDR3는 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
본 발명의 특수한 구현예에서,
특히, 치료 투여의 결과로서, 염증의 분해가 향상된, 염증 질환, 특히 급성 염증 질환, 만성 염증성 폐질환(예컨대, 천식)과 같은 만성 염증 질환, 각결막염, 치주질환, 습진, 염증성 장차 질환, 특히 크론 질환, 대장염, 특히 궤양성 대장염 또는 자발성 대장염, 낭성 섬유증, NASH(비알코올성 간염), 간 섬유증, 폐 섬유증, 항-호중구 세포질 항체-관련 질환(ANCA), 혈관염, 특히 ANCA 매개 혈관염, 경피증;
- 특히, 치료 투여의 결과로서, 염증의 분해능이 향상된, 당뇨병과 같은 자가면역질환, 특히 I형 당뇨병, 건선, 루푸스, 류머티스 관절염, 다발 경화증, 소그렌 증후군, 셀리악 질환(celiac disease), 혈관염, 중증 근무력증, 또는 패혈증, 복막염, 퇴행성 질환, 상처 치유 장애와 같은 감염성 질환, 심한 염증을 동반한 심각한 바이러스 징후, 예를 들어 코로나바이러스(예컨대, COVID-19), 또는 안구 건조증;
- 특히 치료 투여의 결과로서, 염증의 분해능이 향상된, 암, 특히 전이성 암, 암종과 같은 고형 또는 액체 암, 보다 특히 간 암종, 특히 유선 암종 또는 결장 암종, 또는 폐암 또는 백혈병과 같은 골수암, 특히 암세포가 CMKLR1을 발현하거나 CMKLR1을 과도하게 발현하는 세포에 의해 종양의 미세 환경이 침범되는 암의 예방학적 또는 치료학적 치료를 위한, 사람화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항원-결합 항체 모사체 또는 변형된 항체는 다음을 포함한다:
a) 가변 중쇄(VH) 도메인은 중쇄 가변 도메인의 골격(FR1, FR2, FR3 및 FR4)의 아미노산 서열을 포함하고 여기서 각각의 골격은 FR1의 경우 100%, FR2의 경우 적어도 60%, FR3의 경우 적어도 78%, FR4의 경우 적어도 80%; 보다 특히 FR1의 경우 100%, FR2의 경우 적어도 80%, FR3의 경우 적어도 85%, FR4의 경우 적어도 90%인 서열 번호: 41의 서열에서 동일한 등급의 골격과 각각 서열 동일성을 지니고;
b) 가변 경쇄(VL) 도메인은 경쇄 가변 도메인의 골격(FR1, FR2, FR3 및 FR4)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 각각의 골격은 FR1의 경우 적어도 60%, FR2의 경우 적어도 70%, FR3의 경우 적어도 75%, FR4의 경우 적어도 80%; 보다 특히 FR1의 경우 100%, FR2의 경우 적어도 90%, FR3의 경우 적어도 90%, FR4의 경우 적어도 100%인, 서열 번호: 50의 서열 내 동일한 순위의 골격과 각각 서열 동일성을 지닌다.
특수한 구현예에서, 항체는 다음의 골격 도메인을 포함하고:
- 서열 번호: 65의 VHFR1
- 서열 번호: 67의 VHFR2
- 서열 번호: 69의 VHFR3
- 서열 번호: 71의 VHFR4
- 서열 번호: 72의 VLFR1
- 서열 번호: 73의 VLFR2
- 서열 번호: 76의 VLFR3
- 서열 번호: 77의 VLFR4,
및 다음의 CDR을 포함하고:
- VHCDR1은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7로 이루어진 그룹에서 선택되고; 및/또는,
- VHCDR2는 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12 및 서열 번호: 61으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- VHCDR3는 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
및 여기서 가변 경쇄(VL) 도메인은 다음을 포함하고:
- VLCDR1은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택되고; 및/또는,
- VLCDR2는 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 and 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택되고; 및/또는,
- VLCDR3은 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
- 특히, 치료 투여의 결과로서, 염증의 분해능은 향상된, 염증 질환, 특히 급성 염증 질환, 만성 염증성 폐 질환(예컨대, 천식)과 같은 만성 염증 질환, 각결막염, 치주질환, 습진, 염증성 창자 질환, 특히 크론 질환 또는 대장염, 특히 궤양성 대장염 또는 자발성 대장염, 낭성 섬유증, NASH(비알콜성 간염), 간 섬유증, 폐 섬유증, 항-호중구 세포질 항체 관련 질환(ANCA), 혈관염, 특히 ANCA 매개 혈관염, 경피증;
- 특히, 치료 투여의 결과로서, 염증의 분해능은 향상된, 당뇨병과 같은 자가면역질환, 특히 제1형 당뇨병, 건선, 루푸스, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 소그렌 증후군, 셀리악 질환, 혈관염, 중증 근무력증, 또는 패혈증, 복막염, 퇴행성 질환, 상처 치유 장애와 같은 감염 질환, 심각한 염증 상태를 지닌 중증 바이러스 징후, 예를 들면, 코로나바이러스(예컨대, COVID-19), 또는 안구 건조 증후군;
- 특히, 치료 투여의 결과로서, 염증의 분해능은 향상된, 암, 특히 전이성 암, 암종과 같은 고형 또는 액체 암, 보다 특히 간 암종, 특히 유선 암종 또는 결장 암종, 또는 폐암 또는 골수 암, 예를 들어 백혈병, 특히 암세포가 CMKLR1을 발현하거나 CMKLR1을 과도하게 발현하는 세포에 의해 종양의 미세 환경이 침범되는 암.
상기 개시된 상태 중 하나의 예방학적 또는 치료학적 치료를 위한 이러한 특정 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 특히 다음의 CDR을 포함하는 것을 특징으로 한다: 서열 번호: 4의 VHCDR1, 서열 번호: 12의 VHCDR2, 서열 번호: 13의 VHCDR3 및 서열 번호: 19의 VLCDR1, 서열 번호: 26의 VLCDR2, 서열 번호: 35의 VLCDR3 그리고 다음 골격 서열 번호: 65의 VHFR1, 서열 번호: 67의 VHFR2, 서열 번호: 69의 VHFR3, 서열 번호: 71의 VHFR4, 서열 번호: 72의 VLFR1, 서열 번호: 73의 VLFR2, 서열 번호: 76의 VLFR3, 서열 번호: 77의 VLFR4. 특히, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 상기 개시된 예방학적 또는 치료학적 용도를 위해서, 항체의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호: 91을 포함하거나 이로 이루어지고, 항체의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호: 93을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 항-CMKLR1 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 특히 본 발명에 따른 항-CMKLR1 화합물 및 추가 치료제, 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 특수한 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항-CMKLR1 화합물과 면역조절제, 면역체크포인트 차단제, 면역 체크포인트 활성화제, 항체 또는 항-SIRPa 항체(Merck Millipore의 P84-항-마우스 SIRPA)로 이루어진 그룹에서 선택되는 치료제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 항-CMKLR1 화합물을 포함하는 화합물의 조합, 특히 본 발명에 따른 항-CMKLR1 화합물과 항-PDL1 또는 항-PDL1 화합물, 특히 항-PDL1 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이고; 이러한 화합물은 특히 항체, 항원-결합 항체 단편, 항원 결합 항체 모사체, 압타머 또는 펩타이드와 같은 작은 분자, PDL1 또는 PDL1에 결합할 수 있는 사람화된 또는 키메라 항체와 유사하지만 제한되지 않는, 변형된 항체로 이루어진 그룹에서 선택된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항-CMKLR1 화합물을 포함하는 화합물의 조합, 특히 본 발명에 따른 항-CMKLR1 화합물 및 항-SIRPa 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이고; 이러한 화합물은 특히 항체, 항원 결합 항체 단편, 항원 결합 항체 모사체, 압타머 또는 펩타이드와 같은 작은 분자, SIRPa, 특히 사람 SIRPa에 결합할 수 있는, 사람화된 또는 키메라 항체와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 변형된 항체로 이루어진 그룹에서 선택된다.
본 발명은 또한, 사이토킨이거나 또는 사이토킨이 아니고, 프로-분해 대식구를 자극하는 치료학적 화합물을 포함하는, 예를 들면, 섬유증 치료용 조합에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 특히 염증의 분해를 유도하고/하거나 향상시키기 위한, 특히 상기 분해가 지연되거나 중지되는 경우, 염증의 분해를 유도하고/하거나 향상시키기 위한, 본 발명의 항-CMKLR1 화합물의 치료학적 용도에 관한 것이고, 질환을 치료하는 측면에서 여기서 염증의 연장은 병리학적이거나, 여기서 염증의 분해의 기간은 병리학적이다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 화합물은 CMKLR1에 적어도 10E-8M의 친화성(KD 값), 보다 바람직하게는 적어도 10E-9M의 친화성으로 결합한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항원-결합 항체 모사체 또는 변형된 항체와 CMKLR1(또는 제3의 세포외 루프를 포함하고, 서열 번호: 2 및 59에 나타낸 아미노산 서열 또는 서열 번호: 60의 아미노산 서열 내에 위치하는 CMKLR1의 영역) 사이의 특이적인 결합은 항체가 CMKLR1에 대해 상당한 친화성을 보인다는 것을 암시한다. "상당한 친화성(Appreciable affinity)"은 약 10-8 M(KD) 이상의 친화력으로 결합하는 것을 포함한다. 바람직하게는 결합은 결합 친화성이 10-8 M 내지 10-12 M, 임의로 10-9 M 내지 10-10 M, 특히 적어도 10-9 M인 경우에 특이적인 것으로 고려된다. 결합 도메인이 표적과 구체적으로 반응하는지 또는 결합하는지의 여부는 측히, 상기 결합 도메인과 표적 단백질 또는 항원의 반응을 상기 결합 도메인과 표적 단백질 이외의 단백질 또는 항원과의 반응과 비교함으로써 용이하게 시험할 수 있다. 이러한 본 발명의 항체는 CMKLR1과 특이적으로 결합하고, RvE1과 CMKLR1 사이의 상호작용을 향해 작용제 효과를 가진다. 경쟁적 억제에 의한 항체 특이성 및 친화성을 결정하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다(예를 들면, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Colligan et al., Current Protocols in Immunology, Green Publishing Assoc., NY (1992; 1993); Muller, Meth. Enzym, 92:589-601 (1983) 참조). 이러한 방법에는 비아코어 분석, 블리츠 분석 및 유동 세포분석법 및 ELISA 검정을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 항-CMKLR1 화합물은 특히 CMKLR1의 제3의 루프-외 내에 국재화된 에피토프, 특히, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 59 또는 서열 번호: 60, 특히 서열 번호: 2에 나타낸 아미노산 잔기 서열 내에 국재화된 에피토프에 특이적으로 결합한다. CMKLR1의 이러한 특수한 영역 내에 결합하는 항-CMKLR1 화합물은 CMKLR1에서 작용제 특성을 가짐으로써 CMKLR1에 대한 RvE1의 결합을 모사한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원의 위에서 정의바와 같은 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체 또는 변형된 항체에 관한 것이며, 이는 의약으로 사용하기 위해, RvE1과 CMKLR1 사이의 상호작용에 대한 작용제 능력을 가지고 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원의 위에서 정의한 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체 또는 변형된 항체에 관한 것이고, 이는 시험관 내 및/또는 생체 내에서 Akt 및/또는 Erk 단백질(들)의 활성화를 유도할 수 있는 능력을 갖는다. 이러한 단백질의 활성화는 본 발명의 실시예에서 설명하는 방법에 의해 평가될 수 있다. 특히, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원 결합 항체 모사체 또는 변형된 항체는 대식구, 특히 사람 대식구에서 Akt 및/또는 Erk 단백질 또는 둘다를 활성화하는 능력을 가지고 있다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원 결합 항체 모사체의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 치료 방법에 관한 것이며, 이는 RvE1과 CMKLR1 사이의 상호작용에 대한 작용제 능력을 갖거나, 다시 말해서 이는 RvE1-작용제 유사 인자 또는 조절제이다.
대식구의 분극화를 변형시켜 소염 세포를 선호하도록 하는 것은 많은 병리학 또는 상황에서 유용할 수 있다. 상술한 바와 같이, 변형은 특히 염증 질환, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 급성 염증 질환 및 만성 염증 질환, 염증성 창자 질환, 크론 질환, 천식, 각결막염, 치주 질환, 습진, 대장염, 특히 궤양성 대장염 또는 자발성 대장염, 낭성 섬유증; 당뇨병, 특히 제1형 당뇨병, 복막염, 건선, 상피성 암, 특히 유선암 또는 결장암, 암, 전이암, 폐암, 퇴행성 질환, 감염병, 특히 코르티코스테로이드 및/또는 면역억제 치료에 내성이 있는 대상체의 패혈증, 자가면역질환, NASH, 경피증, 대장염 또는 크론 질환의 그룹으로부터 선택된 질환의 문맥에서 유용하다.
본 발명은 또한, 의약의 제조시의, 레졸빈 E1 유사 작용제 능력을 갖는, 상기 정의된 바와 같은, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원 결합 항체의 용도에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 만성 염증 질환의 치료, 특히 만성 대장염의 치료시 이의 사용을 위한, 본원의 상기 정의된 바와 같은, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체 또는 변형된 항체에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 염증 상태, 특히 이의 분해가 지연되거나 중지된 염증 질환의 지연되거나 중지된 분해의 치료시, 및/또는 염증 질환, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 급성 염증 질환 및 만성 염증 질환, 염증성 창자 질환, 크론 질환, 천식, 각결막염, 치주 질환, 습진, 대장염, 특히 궤양성 대장염 또는 자발적 대장염, 낭성 섬유증, 당뇨병, 특히 I형 당뇨병, 복막염, 건선, 암종, 특히 유선암이나 대장암, 암, 퇴행성 질환, 감염 질환, 특히 패혈증, 자가면역 질환의 그룹에서 선택된 질환의 치료 또는 예방시 사용하기 위한, CMKLR1의 상호작용에 대한 작용제 활성을 갖는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체에 관한 것이다.
본원에 정의된 바와 같이, "염증 상태의 분해에서 지연 또는 중지"는 염증의 분해가 정상적인 분해(즉, 염증 발생 후 생리학적 분해을 경험하는 환자에게서 발생하는 분해)에 비해 지연되거나 중지될 때 발생한다. 분해 지연 또는 결함은 염증 부위에 과립구의 증가된 침투를 야기할 수 있다. 따라서, 분해 지연 또는 결함은 염증 부위에서의 과립구 정량화에 의해 평가될 수 있다. 과립구 집단은 예를 들어 조직학, 세포측정학 또는 효소 면역검정에 의한 엘라스타제 정량화 또는 과립구 수용체 1)의 PCR에 의한 분자 정량화와 같은 간접적인 생화학적 기술에 의해 측정될 수 있다. 분해 지연 또는 결함은 과립구의 세포자멸사에서의 지연을 측정함으로써 평가하고, 예를 들면 아넥신 5에 대한 특정 항체를 사용하여 세포학에 의해 측정될 수 있다. 염증의 분해시 결함 또는 지연은 또한 TNF-알파, IL8 또는 IL12와 같은 전-염증성 사이토킨과 IL-10과 같은 소염성 사이토킨의 합성을 정량화함으로써 측정할 수 있다. 사이토킨 분비는 효소 면역검정 또는 PCR에 의해 측정할 수 있다. 염증의 분해의 결함 또는 지연은 예를 들면, 핵 전좌에 의해 또는 웨스턴 블롯(Wesern blot)에 의해 및/또는 I카파b)의 분해 수준의 정량에 의해 측정될 수 있는 NF-카파B와 같은, 염증성 사이토킨의 합성에 포함된 전사 인자의 활성화를 평가함으로써 또한 측정할 수 있다. 염증 분해의 결함 또는 지연은 또한 질량 분광법 또는 효소 면역검정에 의해 전문화된 분해 촉진 매개인자(예를 들어, 리폭신, 레졸빈, 프로텍틴 또는 마레진) 또는 이의 전구체(17-HDOHE 또는 14-HDOHE와 같은)를 정량화함으로써 결정될 수 있다. 해상도의 결함 또는 지연은 이후 이러한 매개체 중 하나 이상의 합성의 결함을 초래한다. 분해 결함 또는 지연은 분해 분자의 수용체의 발현이 감소될 때 측정할 수 있다. 이러한 수용체는 ALX, CMK1R1, GPR32 또는 GPR18을 포함하는 그룹에서 선택될 수 있다. 대안적 또는 보완적으로, 세포질내로 이러한 수용체 내재화 및 가공을 또한 평가할 수 있다. 대체적으로 또는 보완적으로, 염증성 사이토킨 또는 지질의 일부 수용체의 발현을 또한 평가할 수 있는데, 정상 상태와 비교하여 과발현은 염증의 분해에서의 유의적인 지연 또는 결함이다. 이러한 상태는 조직학, 세포학 또는 PCR로 측정할 수 있다. 분해 결함은 또한 프로-분해성 대식구에 대한 전-염증성의 감소되거나 억제된 스위치(switch), 동일한 세포의 식세포작용 또는 세포손상(efferocytosis)에서의 손상을 야기할 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시예에서 예시된 바와 같이, 분해의 지연 또는 결함은 정상 상태와 비교하여 특수한 상태에서 프로-분해성 대식구에 대한 전-염증성의 스위치를 분석함으로써 평가할 수 있다.
특수한 구현예에 따라서, 항-CMKLR1 화합물은 유선 암, 특히 유선 암종 암, 흑색종, 결장 암, 특히 대장암, 백혈병, 특히 급성 골수성 백혈병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암을 가진 개체, 특히 암 세포가 CMKLR1을 과-발현하는 경우를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 이의 사용을 위해, 상기에서 정의된 바와 같은 항-사람 CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체 또는 변형된 항체에 관한 것이며, 여기서 본 발명의 상기 항-사람 CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체 또는 변형된 항체는 CMKLR1 양성 종양을 나타내는 환자에게 투여된다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다양한 적합한 경로로 투여할 수 있으며, 예를 들어, 대상체에게 정맥내(IV), 피하(SC) 또는 근육내(IM) 투여될 수 있다. 항-CMKLR1 화합물은 단독으로 또는 다른 치료제, 예를 들면, 제2의 사람 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 함께 투여할 수 있다. 다른 예에서, 항체는 예를 들면, 면역억제제, 적혈구-자극제(ESA)와 함께, 치료학적 세포 조성물 등과 함께 투여될 수 있다. 구현예에서, 본 발명은 위에서 정의된 바와 같이 사용하기 위한 항-CMKLR1 화합물 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이며, 여기서 항-CMKLR1 항체 또는 항원-결합 단편은 제2의 치료제와 조합된다.
제2 치료제의 투여는 항-CMKLR1 화합물의 투여와 동시에 이루어질 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 제2의 제의 성질에 따라, "콤보(combo)"라고 또한 알려진 조합 약물(제품)의 형태로 동시-투여를 제조할 수 있다. 콤보는 2개 이상의 활성 약제학적 성분을 단일 용량 형태로 조합하여, 고정된 용량으로 제조 및 유통하는 고정-용량 조합이다. 그러나 용량 요법 및/또는 투여 경로는 또한 상이할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 이러한 제2의 치료제는 화학치료제, 방사선치료요법제, 면역치료제, 세포 치료요법제(예컨대, CAR-T 세포), 항생제 및 프로바이오틱스로 이루어진 그룹에서 선택된다.
특히, 본 발명의 맥락에서 유용한 면역치료제는 치료학적 백신(DNA, RNA 또는 펩타이드 백신), 면역 체크포인트 차단제 또는 활성화제, 특히 적응 면역 세포(T 또는 B 림프구) 또는 항체-약물 접합체와 같은 면역접합제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역치료제"는 특히 흥미로운 생물학적 현상으로부터 다음을 포함하는 유효 치료제까지 암 백신을 취할 수 있는 제제를 지칭한다: 나이브(naive) T 세포의 수와 레퍼토리를 증가시키기 위한 T-세포 성장인자, 수지상 세포(DCs)의 수를 증가시키기 위한 성장 인자, DC 및 기타 항원-제시 세포(APC)를 활성화하는 작용제, 암 백신을 허용하고 증강시키기 위한 보조제, T 세포를 활성화하고 자극하는 작용제, T-세포 체크포인트 차단 억제제, 면역 T 세포의 성장과 생존을 증가시키는 T-세포 성장 인자, 암 세포와 면역 세포-유래된 면역 억제성 사이토킨을 억제, 차단 또는 중화시키는 제제.
다수의 면역 체크포인트 차단제 또는 활성화제가 당업계에 알려져 있다. 본 발명의 문맥에서, 유용할 수 있는 적응 면역 세포(B 또는 T 림프구)의 면역 체크 포인트 차단제 또는 활성화제의 예는 항-PDL1, 항-PD1, 항-CTLA4, 항-SIRPa; 항-CD137, 항-CD2, 항-CD28, 항-CD40, 항-HVEM, 항-BTLA, 항-CD160, 항-TIGIT, 항-TIM-1/3, 항-LAG-3, 항-2B4, 그리고 항-OX40, 항-CD40 CD40 작용제, CD40-L, TLR 작용제, 항-ICOS, ICOS-L 그리고 B세포 수용체 작용제, 특히 항-CD137 및 항-SIRPa이다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 제2의 치료제는 항-PDL1 또는 항-PD1 화합물이며, 특히 항-PD1 화합물이고, 보다 특히 항-PD1 항체이다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 제2의 치료제는 항-SIRPa 화합물, 특히 항-SIRPa 항체이다.
상기 면역치료제는 또한 종양 항원을 표적화하는 항체일 수 있으며, 특히 항-Her2, 항-EGFR, 항-CD20, 항-CD19, 항-CD52로 이루어진 그룹에서 선택된다.
항체는 약 1 ng/kg 체중 내지 약 30 mg/kg 체중 이상의 유효 용량으로 제공될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 투여량은 1 μg/kg 내지 약 20 mg/kg, 임의로 10 μg/kg 내지 10 mg/kg 또는 100 mg/kg 내지 5 mg/kg이다.
"유효 용량" 또는 "유효 투여량"은 목적한 효과를 달성하거나 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양으로 정의된다. 용어 "유효 용량"은 질환을 이미 앓고 있는 환자에서 질환 및 이의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지하거나 질환의 증상을 경감시키는 데 충분한 양을 포함함을 의미한다. 이러한 사용에 효과적인 양 또는 용량은 치료해야 할 상태, 전달된 항체 구조, 치료 내용과 대상, 질환의 중증도, 이전 치료요법, 환자의 임상 기록 및 치료제에 대한 반응, 투여 경로, 환자의 체격(체중, 체 표면적 또는 기관 크기) 및/또는 상태(나이 및 일반 건강) 및 환자 자신의 면역체계의 일반적인 상태에 의존한다. 적절한 용량은 환자에게 한 번 또는 일련의 투여에 걸쳐 투여할 수 있고 최적의 치료 효과를 얻을 수 있도록 조절될 수 있다.
이러한 목적을 위한 투여는 필요한 경우, 예컨대, 매일, 반주마다, 매주, 반월마다, 매월, 또는 재발 시 필요에 따라 반복할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기와 같이 정의된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, "약제학적 조성물"은 포유 동물, 특히 사람과 같은 대상체 또는 환자에게 투여하기에 적합한 조성물을 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로 "약제학적 조성물"은 멸균 상태이며 일반적으로 대상체 내에서 바람직하지 않은 반응을 유발할 수 있는 오염물이 없다(예컨대, 약제학적 조성물의 화합물(들)은 약제학적 등급이다). 약제학적 조성물은 경구, 협측(buccal), 직장, 비경구, 복강내, 피내, 기관내 등을 포함한 다양한 투여 경로를 통해 이를 필요로 하는 대상체 또는 환자에게 투여할 수 있도록 설계될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는 일반적으로 안전하고, 독성이 없으며, 생물학적으로도 또는 기타 바람직하지 않은 약제학적 조성물을 제조하는 데 유용한 부형제, 희석제, 담체 및 보조제를 포함하는 것을 의미하며, 수의학적 용도 뿐만 아니라 사람 약제학적 용도에 허용되는 부형제, 희석제, 담체 및 보조제를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "약학적으로 허용되는 담체"는 이러한 부형제, 희석제, 담체 및 보조제 중 하나 및 하나 이상 둘 다를 포함한다.
특히, 본 발명은 활성 성분으로서 상기 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 치료 수단, 특히 활성 성분으로서 다음을 포함하는 조합 생성물 수단에 관한 것이다: 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체 및 제2의 치료제, 여기서 상기 활성 성분은 특히 조합된 또는 순차적 사용을 위해 분리, 순차적 또는 조합된 치료요법용으로 제형화된다.
특히, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 항-CMKLR1 화합물 및 의약의 동시, 별도 또는 순차적 사용을 위한 제2 치료제를 포함하는 조합 생성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의된 조합 생성물에 관한 것이고, 여기서 제2의 치료제는 화학치료제, 방사선치료요법제, 세포 치료요법제, 면역치료제, 항생제 및 프로바이오틱스로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 조합 생성물에 관한 것이고, 여기서 상기 면역치료제는 특히 적응 면역 세포(T 및 B 림프구)와 항체-약물 복합체의 치료학적 백신, 면역 체크포인트 차단제 또는 활성화제로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 조합 생성물에 관한 것이고, 여기서 상응하는 면역 체크 포인트 차단제 또는 적응 면역 세포(T 및 B 림프구)의 활성화제는 항-PDL1, 항-PD1, 항-SIRPA, 항-CTLA4, 항-CD137, 항-CD2, 항-CD28, 항-CD40, 항-HVEM, 항-BTLA, 항-CD160, 항-TIGIT, 항-TIM-1/3, 항-LAG-3, 항-2B4, 그리고 항-OX40, 항-CD40 작용제, CD40-L, TLR 작용제, 항-ICOS, ICOS-L 및 B-세포 수용체 작용제로 이루어진 그룹에서 선택되며, 특히 항-PDL1, 항-PD1 및 항-CD137로 이루어진 그룹에서 선택된다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 제2의 치료제는 항-PDL1 또는 항-PD1 화합물, 특히 항-PD1 화합물, 및 보다 특히 항-PD1 항체이다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 제2의 치료제는 항-SIRPa 화합물, 특히 항-SIRPa 항체이다.
일 구현예에서, 상기 면역치료제는 종양 항원을 표적화 하는 항체이며, 특히 항-Her2, 항-EGFR, 항-CD20, 항-CD19, 항-CD52로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 대식구 분극을 프로분해성 대식구로 변형함으로써 개선 또는 방지될 수 있는 임의의 상태의 치료에서 동시, 별도 또는 순차적으로 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 조합 생성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 유효량의 조합 생성물을 상기 대상체에게 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여함을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 프로분해성 대식구로 대식구 분극화를 변형함으로써 개선되거나 예방될 수 있는 임의의 상태의 치료 방법에 관한 것이다 .
일 구현예에서, 본 발명은 프로분해성-염증성 대식구를 유도할 수 있는 임의의 상태의 치료를 위한 의약의 제조시 상기 정의된 바와 같은 조합 생성물의 용도에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는 염증 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 병리학의 치료시 동시, 별도 또는 순차적 사용을 위한, 또는 예방접종에서 사용하기 위한 상기 정의한 바와 같은 조합 생성물에 관한 것이다: 급성 염증 질환 및 만성 염증 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 염증 질환, 염증성 창자 질환, 크론 질환, 내쉬, 경피증, 천식, 각결막염, 치주질환, 습진, 대장염, 특히 궤양성 대장염 또는 자발적 대장염, 낭성 섬유증, 당뇨병, 특히 I형 당뇨병, 복막염, 건선, 암종, 특히 유선 암 또는 대장 암, 암, 전이암, 폐암, 퇴행성 질환, 감염병, 특히 패혈증, 자가면역 질환.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 조합 생성물의 유효량을 상기 대상체에게 동시, 별도 또는 순차적으로 투여함을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는 염증 질환의 그룹에서 선택된 병리학의 치료 방법에 관한 것이다: 급성 염증 질환 및 만성 염증 질환, 염증성 장차 질환, 크론 질환, NASH, 경피증, 천식, 각결막염, 치주 질환, 습진, 대장염, 특히 궤양성 대장염 또는 자연성 대장염, 낭성 섬유증, 당뇨병, 특히 제1형 당뇨병, 복막염, 건선, 암종, 특히 유선 암 또는 대장 암, 암, 전이성 암, 폐암, 퇴행성 질환, 감염병, 특히 패혈증, 자가면역 질환.
본 발명은 또한 본원에서 정의된 바와 같은 항-CMKLR1 화합물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 이를 위해, 본 발명은 또한 핵산 분자 또는 핵산 분자의 그룹, 보다 특히 단리된 핵산 분자(들) 및/또는 재조합체 핵산 분자(들)에 관한 것이며, 이는 본 개시내용에 따른 임의의 항-CMKLR1 화합물을 암호화하고, 보다 특히 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40 및 서열 번호: 62에 나타낸 서열의 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인; 및 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57 및 서열 번호: 58에 나타낸 서열의 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 암호화한다. 특수한 구현예에서, 본 발명은 핵산 분자, 또는 핵산 분자, 보다 특히 단리된 핵산 분자(들) 및/또는 재조합 핵산 분자(들)의 그룹에 관한 것이며, 이는 서열 번호: 91로 이루어진 항체의 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호: 93으로 이루어진 항체의 경쇄 가변 도메인을 암호화한다.
상기 핵산 분자(들)는 암호화된 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인의 전사 및 발현을 위한, 조절 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 인핸서, 사일런서(silencer), 프로모터, 특히 발현 프로모터, 신호 펩타이드와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본원에 개시된 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 본원에 개시된 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은, 벡터는 유전 물질을 세포로 전달하기 위한 비히클로서 사용된 핵산 분자이고, 바람직한 구현예에서 벡터 내에 삽입된 폴리뉴클레오타이드의 발현을 허용한다. 용어 벡터는 플라스미드, 바이러스, 코스미드(cosmid) 및 인공 염색체를 포함한다. 벡터는 일반적으로 복제 오리진, 다중클로닝 부위 및 선택 가능한 마커를 포함한다. 벡터 자체는 일반적으로 삽입(이식유전자) 및 벡터의 "골격(backbone)"으로서 제공되는 보다 큰 서열을 포함하는, 뉴클레오타이드 서열, 일반적으로 DNA 서열이다. 현대의 벡터는 이식유전자 십입물 및 골격 외에 추가의 특징을 포함할 수 있다: 프로모터, 유전 마커, 항생제 내성, 리포터 유전자, 표적화 서열, 단백질 정제 태그. 발현 벡터(발현 구조체)라고 불리는 벡터는 특히 표적 세포에서 전이유전자의 발현을 위한 것이며, 일반적으로 제어 서열을 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같이 벡터를 포함하는 세포, 숙주 세포, 단리된 숙주 세포, 또는 세포주에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은, 세포와 관련된 이러한 용어들은 본 발명의 항체 구조를 암호화하는 벡터, 외인성 핵산 분자, 폴리뉴클레오타이드의 수용체; 및/또는 항체 구조 자체의 수용체일 수 있거나 이었다. 각각의 물질의 세포 내로의 도입은 형질전환, 형질감염 등의 방식으로 수행될 수 있다. 이러한 용어들은 또한 단일 세포의 후대세포 또는 잠재적 후대세포를 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포를 포함하며, 또한 세균, 효모 세포, 진균 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들면, 곤충 세포 및 포유 동물 세포, 예컨대, 쥐(murine), 래트, 래빗, 마카크(macaque) 또는 사람을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 세포 또는 세포주는 CHO, COS 및 HEK 세포로 이루어진 그룹에서 선택되며, 본 발명의 항체 작제물을 암호화하는 벡터, 외인성 핵산 분자, 및 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및/또는 항체 구조 자체의 수용체로 유전적으로 가공되는 경우, 적어도 0.1 mg/ml, 보다 특히 적어도 1 mg/ml의 항체를 생산하며, 특히 적어도 10 mg/ml, 보다 특히 적어도 100 mg/ml를 생산한다.
다음의 도면 및 실시예는 당해 분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 제조 및 사용방법에 대한 완전한 개시내용 및 설명을 제공하기 위해 제시되며, 발명자가 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하거나 이들이 하기 실험이 수행된 실험 모두 또는 유일한 실험 만을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명을 그 구체적인 실시예들을 참조하여 설명하였으나, 본 발명의 진정한 취지와 영역을 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있고 등가물이 치환될 수 있음은 당해 분야의 기술자에 의해 이해될 수 있다. 또한, 본 발명의 목적, 취지 및 영역을 채택하기 위해 특수 상황, 물질, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 채택하기 위한 많은 변형이 이루어질 수 있음은 당해 분야의 기술자에 의해 이해될 수 있다. 이러한 모든 변형은 본 문서에 첨부된 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
특수한 구현예에서, 본 발명은 의약의 제조를 위한 본원에 개시된 구현예 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다. 특수한 구현예에서, 본 발명은 염증이 수반되는 상태를 치료하는데 유용한 의약의 제조를 위한, 본원에 개시된 구현예 중 임의의 하나에서 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다. 특수한 구현예에서, 본 발명은 다음의 예방학적 또는 치료학적 치료에 유용한 의약의 제조를 위한, 본원에 개시된 구현예 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다:
- 염증 질환, 특히 급성 염증 질환, 만성 염증 질환, 예를 들면, 만성 염증성 폐 질환(예컨대, 천식), 각결막염, 치주질환, 습진, 염증성 창자 질환, 특히 크론 질환이나 대장염, 특히 궤양성 대장염 또는 자발성 대장염, 낭성 섬유증, NASH, 비알콜성 간염), 간 섬유증, 폐 섬유증, 항-호중구 세포질 항체 관련 질환 ANCA , 혈관염, 특히 여기서 ANCA 매개 혈관염, 경피증, 특히 여기서, 치료의 결과로서, 염증의 분해능은 향상된다;
- 당뇨병과 같은 자가 면역질환, 특히 제1형 당뇨병, 건선, 루푸스, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 소그렌 증후군, 셀리악 질환, 혈관염, 중증 근무력증, 또는 패혈증, 복막염, 퇴행성 질환, 상처 치유 장애 또는 심각한 염증 질환이 따르는 심각한 바이러스 징후, 예를 들어 코로나바이러스(예컨대, COVID-19)와 같은 감염성 질환, 또는 안구 건조 증후군, 특히 여기서, 치료의 결과로서, 염증의 분해능이 향상된다;
- 암, 특히 전이성 암, 암종과 같은 고형 또는 액체 암, 보다 특히 간 암종, 특히 유선 암종 또는 결장 암종, 또는 폐암 또는 골수암, 예를 들어 백혈병, 특히 암 세포가 CMKLR1을 발현하거나 종양의 미세환경이 CMKLR1을 과발현하는 세포에 의해 침범되는 암, 특히 여기서, 치료의 투여 결과로서, 염증의 분해능이 향상된다.
- NASH(비알코올성 지질간염), 경피증, 낭성 섬유증 또는 항-호중구 세포질 항체-관련 질환(ANCA).
도 1. DC 성숙 및 분화에 있어서 항-CMKLR1 변이체 1G1, 2G1, 3G1 및 4G1 키메라 항체의 효과. 마우스 수지 세포를 성숙 단계(24시간 또는 48시간) 동안 항온처리한 후, 부형제 또는 RvE1 또는 VH-CDR3에 상응하는 항-CMKLR1 항체 변이체(서열 번호: 8의 1 및 2번 위치에서 돌연변이)와 함께 분화 상을 거쳤다: 1G1 (LL), 2G1(LI), 3G1(IL) 또는 4G1(II) 또는 동형 대조군(hIgG1 또는 mIgG)). 이후에, 세포를 세포 마커 항체와 함께 FACS 분석을 위해 염색하였다: A. CD80-PE; B. CD86-FITC; C. CD103-PerCPCy5.5; D. I/Ab-APC. 형광의 평균을 각각의 조건에서 측정하였다. E 및 F는 각각 24시간 또는 48시간의 성숙 후 각 조건에서 Life Technologies의 LIVE/DEAD® 키트를 사용하여 FACS에 의해 측정된 세포의 생존능을 나타낸다.
도 2. DSS에 의해 유도된 마우스 급성 염증 대장염 모델에서 항-CMKLR1 항체의 효과. 마우스를 동형 대조군 hIgG1(마우스당 10μg)(x), RvE1(마우스당 1μg)로 매일(●), 또는 2G1 항체(마우스당 10μg)를 5일 동안 3회() 주사하였다. 처리되지 않은 야생형 마우스는 ▼로 나타낸다. A. 동물 체중 감소 B. 동물의 대변 점수 C. 대장 길이. D. 해상도 지수.
도 3. TNBS에 의해 유도된 마우스 급성 염증 대장염 모델에서 항-CMKLR1 항체의 효과. 마우스에게 0일째에 50% 에탄올 중 5%에서 합텐화제 TNBS 200μL를 제공한 다음 동형 대조군 hIgG1(마우스당 10μg)(x), RvE1(마우스당 1μg) 매일(●), 2G1 항체(마우스당 10μg)를 5일간 3회() 주사하거나, 비-처리(야생형 동물)(▲)하였다. 마우스를 희생시키고 결장 길이를 각각의 조건에서 측정하였다.
도 4. IL10 KO 마우스 만성 염증 대장염 모델에서 항-CMKLR1 항체의 효과. IL10에 대한 마우스 KO는 자발적 염증 대장염을 일으킨다. 이들은 항-CMKLR1 항체(2G1)() 또는 동형 대조군(hIgG1)(x)로 복강내(25μg/주사, 주 3회)로 처리하였다. A. 치료 중 및 치료 후 동물 체중 감소. B. 동물 대변 점수.
도 5. 마우스 제1형 비-비만 당뇨병 모델에서 항-CMKLR1 항체의 효과. 마우스는 자발적인 당뇨병으로 진행한다. 당혈증이 180 내지 234 mg/dL인 경우, 이를 항-CMKLR1 항체(A와 B에서 , C에서 ■) 또는 동형 대조군 항체(X와 B에서 x; C에서 )를 복강내로 20μg/dL에서 2주 동안 주당 3회 처리하였다. A. 생존율, B. 혈당 농도의 개별 표시(mg/dL). C. 혈당 농도의 혼주된 표시(mg/dL).
도 6. 마우스 건선 모델과 같은 자가면역 질환에 대한 항-CMKLR1 작용제의 효과. 4일 내지 6일의 연속일 동안 알다라 처리한 마우스를 2G1(●) 또는 동형 대조항체(x)로 복강 내 주사하였다. A. 두께 및 B 체중.
도 7. 마우스 복막염 모델에서 항-CMKLR1 항체의 효과. 항-CMKLR1의 예방 주사는 자이모산(Zymosan) A 주사(1mL로 마우스당 1mg) 전에 수행하였다: RvE1(마우스당 1μg)(●), 2G1 항체(마우스당 10μg)() 또는 동형 대조군 항체(x). A. PMN은 자이모산 A 주사 후 첫 50시간 동안 번호매김하였다. B. 대식구는 자이모산 A 주사 후 첫 50시간 동안 번호매김하였다. C. 분해 지수.
도 8. 4T1 유방 종양 모델에서 항-CMKLR1 항체의 효과. 마우스에게 유선내 4T1 세포(25만 개)를 접종하였다. 이후에 항-CMKLR1 항체(2G1)(A.  B. ●) 또는 항-41BB 항체(3H3)(●) 또는 항체 둘 다(▲)를 4일째 및 7일째(10μg/la)에 2회 주사하거나 대조군 항체(IgG1 동형 항체 클론 3G8)(xA. 및 B.)를 3주 동안 주당 3회 주사하였다. A. 종양 부위는 종양 주사 후 8일째에 및 이후에 2일마다 측정하였다. B. 종양 폐 전이는 동형 대조군 및 항-CMKLR1 항체(n=4)로 처리된 동물에서 생물 발광성 영상(BLI)에 의해 측정하였다.
도 9. 2개의 상이한 결장 암 마우스 모델에서 항-CMKLR1 항체의 효과. 2개의 마우스 모델을 연구하였고, 동물에게 3주 동안 동형 대조군 항체(3G8)(x) 또는 항-CMKLR1(2G1)()을 20μg/주사로 3주 동안 복강내 제공하였다. A-C. p84(A) 및 2G1(B)의 단일 치료와 항체 둘 다를 사용한 조합 치료요법(C)을 비교한 CT26 대장 암종 모델에서의 결과. D: MC38 결장 암종 모델에서의 결과.
도 10. 항-TNFa 치료 전후 궤양성 대장염(UC) 또는 크론 질환 환자 생검에서 CMKLR1의 발현. x는 대조군을 나타낸다; 는 인플릭시맙 치료 전 코르티코스테로이드 치료 및/또는 면역억제 치료에 반응하는 환자의 CMKLR1 발현을 나타낸다; ■는 코르티코스테로이드 치료 및/또는 면역억제 치료에 반응하지 않는 환자에서 CMKLR1 발현을 나타낸다; △는 인플릭시맙 치료 후 코르티코스테로이드 치료 및/또는 면역억제 치료에 반응하는 환자의 CMKLR1 발현을 나타낸다; ▲는 인플릭시맙 치료 후 코르티코스테로이드 치료 및/또는 면역억제 치료에 반응하지 않는 환자의 CMKLR1 발현을 나타낸다. A. 인플릭시맙 치료 전 및 후 궤양성 대장염 환자의 CMKLR1 전사 발현. B. 염증성 결장 생검에서 인플릭시맙 치료 전 및 후 크론 질환 환자에서 CMKLR1 전사체 발현.
도 11. 항 α4β7(VDZ) 치료 전 및 후에 UC 환자 생검에서 CMKLR1의 발현의 효과. A. 염증이 있는 결장 생검에서 베돌리주맙 치료 전 및 후에 궤양성 대장염 환자에서 CMKLR1(CMKLR1) 전사체 발현을 나타낸다. R은 VDZ 치료에 반응하는 환자에 상응하고, NR은 VDZ 치료에 반응하지 않는 환자에 상응한다.
도 12. ELISA에 의한 CMKLR1 펩타이드에 대한 항-CMKLR1 항체의 결합 분석. CMKLR1 EL3 루프(서열 번호: 18)에서 2G1 항체()의 결합을 ELISA에 의해 450nm에서 OD를 측정하여 동형 대조군 항체(3G8)(x)와 비교하였다.
도 13. FACS와 웨스턴 블롯에 의한 상이한 세포주에서의 CMKLR1 발현에 관한 연구. A. CMKLR1의 세포 표면에서의 단백질 발현을 2명의 사람의 상이한 T 세포주 Thp1과 U937에서 상이한 농도(ng/ml)의 2G1 항체를 사용하여 측정하였다. B. CMKLR1 단백질 발현은 T 세포주(Thp1 및 U937), 섬유아세포주 MRC5, NK 세포주 NKL 및 CMKLR1에 대한 음성 및 형질도입된 CHO 세포에서 웨스턴 블롯에 의해 시험하였다.
도 14. FACS에 의한 마우스 골수세포에서 CMKLR1의 발현. 분화 후, 마우스 골수 계통 세포를 세포 표면에서의 이의 CMKLR1 발현에 대해 분석하였다. A. 대식구 단핵세포에서의 발현(M0). B 및 C. 대식구(전염증성 mM1 및 전-해상도 mM2 대식구)의 발현. D 및 E. 수지상 세포(mDC 및 iDC)에서의 발현.
도 15. 전-염증성 자극으로 자극된 사람 단핵세포 및 마우스 골수 세포에서 CMKLR1의 발현.
LPS, TNFa 또는 IL6로 16시간 또는 48시간 동안 세포를 자극한 후, FACS에 의해 CMKLR1(ChemR23)의 발현을 측정하였다. A. 사람 혈액 단핵세포에서의 결과, B. 및 C. 마우스의 골수로부터의 골수 및 호중구에서의 결과.
도 16. CMKLR1 경로 활성화 후 골수 세포 활성화 마커의 연구. 부형제, RvE1, 2G1 또는 동형 대조군(hIgG1) 속에서 항온처리된 수지 세포는 마커 항체로 FACS 분석을 위해 염색하였다: A. CD80-PE. B. CD86-FITC. C. CD103-PerCPCy5.5. D. CD40-PeCy7. E. I/Ab-APC. 형광성 평균은 각 조건에서 측정하였다.
도 17. CMKLR1 경로 활성화 연구: Akt 및 Erk 인산화. 마우스 전-염증성(M1) 대식구를 2G1 또는 RvE1와 함께 항온처리한지 5, 10, 30분 후 ERK 및 AKT 활성화 경로의 웨스턴 블롯 분석. 인산화된 단백질 Akt 또는 Erk를 P-Akt 항체 또는 P-Erk 항체(p44/42)를 사용하여 평가하였다. A. RvE1을 사용한 Erk 및 Akt 활성화. B. 2G1을 사용한 Erk와 Akt 활성화.
도 18. 항-CMKLR1 항체와의 케메린-CMLKR1 상호작용에 대한 경쟁 연구.
A. 2명의 상이한 제공자의 케메린에 의한 cAMP 억제는 DiscoverX(●) 또는 R&D 시스템(▲)에서 시험하거나 항-CMKLR1 항체(2G1) 단독(◇)과 조합하거나 DiscoverX()의 케메린과 조합하였다.
B. 1μM 내지 1nM 및 케메린 2nM(◇) 또는 6nM(●)의 상이한 농도에서 항-CMKLR1 항체가 존재하는 경우의 베타 아레스틴 활성화
도 19. CD45Rb high T-세포 전달 만성 대장염 마우스 모델에서 항-CMKLR1 항체의 효과. A. 치료한 동물의 체중 변화는 60일까지 이어졌다. 동물을 동형 대조군 hIgG1(x) 또는 항-CMKLR1 항체(■)로 처리하였다. B. 대조군(좌측)과 비교하여 항-CMKLR1(우측)로 처리된 마우스에서 대장 조직의 조직학적 염색. C. 병리 및 염증의 중증도를 계산하는 데 사용된 해부학적 병리학 점수(염증 점수, 혈관 조영 점수, 대장 두께 및 섬유성 결장 벽). D. CD3와 Ly6G의 침투.
도 20. 간암 마우스 모델(HCC 모델)에서 항-CMKLR1 항체의 효과. 항-PD1 mAb(RMP1-14 클론, 8mg/kg)의 4일째 및 8일째에 2회 주사 또는 항-PD-1 항체 단독 주사(주 2회)와 조합(▲)되거나 조합되지 않은(●) 항-CMKLR1 항체(2G1, 0.8mg/kg)의 2주 동안 복강내 투여의 항-종양 효과. 마우스는 쥐과 간 종양의 직교성 모델(0일째에 간문맥을 통해 주사된 헤파 1.6 세포의 2.5.10^6)에서 2주 동안 치료하였다. 동형 대조군 항체는 0.8mg/kg으로 2주간 주 3회 사용하였다. 마우스의 반응은 마우스가 치료를 중단한 후 수일 내지 1개월 동안 생존하는 경우 부분(PR), 마우스가 1개월 이상 생존하는 경우 완전(CR) 또는 모든 대조군 마우스가 죽을때까지 필요한 시간보다 3배 더 길게 생존하는 경우 치유로 고려하였다.
도 21. 상이한 세포주에서 항-CMKLR1 항체의 생성.
2G1 중쇄의 CDR을 IGHV3-23*04, IGHV1-46*01 및 IGHV7-4-1(IMGT 명명법)으로 명명된, 3개의 사람 생식선 골격에 이식하였다. 2G1 경쇄의 CDR은 IGKV1-13*02, IGKV6-21*01 및 IGKV3-11*01(IMGT 명명법)로 명명된 3개의 사람 생식선 골격에 이식하였다. 각각의 서열을 사람 면역글로불린의 불변 단편에 융합시키고 포유동물 세포에서 동시-형질감염시켜 COS와 CHO 세포에서 사람화된 항체를 생산하였다. 생산은 상층액 속에서 평가하였다. VHWT와 VLWT는 각각 2G1 항체의 중쇄와 경쇄에 상응한다.
도 22. 2G1에서 유래된 사람화된 항체의 생산.
CHO 세포에서 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 상이한 조합의 농도 및 수율. VH WT 및 VL WT는 2G1 항체의 가변 영역에 상응한다. 생식선은 2G1의 가변 영역의 사람화된 버전에서 발행되며, 하기 실시예에 개시되어 있다.
도 23. 2G1에서 유래된 사람화된 항-CMKLR1에 의한 C7 펩타이드 결합 인식. 중쇄와 경쇄의 상이한 조합(VHWT+VLWT: 서열 번호: 37 및 서열 번호: 49의 조합; HCLC: 서열 번호: 42 및 서열 번호: 52의 조합; HDLC: 서열 번호: 43 및 서열 번호: 52의 조합; HCLD: 서열 번호: 42 및 서열 번호: 53의 조합; HDLD: 서열 번호: 43 및 서열 번호: 53의 조합)으로 형질감염된 CHO 세포의 상층액에서 C7biot의 결합.
도 24. 2G1 항체에서 유래된 항-CMKLR1의 ED50. 2G1wt: HALA: 서열 번호: 41 및 서열 번호: 50의 조합; 서열 번호: 37 및 서열 번호: 49의 조합; HCLC: 서열 번호: 42 및 서열 번호: 52의 조합; HDLC: 서열 번호: 43 및 서열 번호: 52의 조합; HCLD: 서열 번호: 42 및 서열 번호: 53의 조합; HDLD: 서열 번호: 43 및 서열 번호:53의 조합.
도 25. 항-ChemR23 항체가 코팅된 시험관내 M1 대식구 세포에 대한 CCR7 발현의 억제. 2G1 및 모든 사람화된 2G1 변이체(HALA, HCLC, HCLD, HDLC 및 HDLD)를 플레이트에 고정시켰다. 동형 대조군을 대조군으로서 가하였다. FcRγ 결합을 방지하기 위한 2개의 동형, 즉, 2G1-N297A(FcγR 결합을 줄이기 위해 N297A에서 돌연변이된 2G1wt), 및 2G4(힌지 영역을 안정화시키기 위해 S228P에서 돌연변이된 동형 IgG4를 지닌 야생형)를 또한 가하였다. 코팅 플레이트에 48시간 동안 전-염증성 대식구 M1을 가하고, 대식구 표면에서 CCR7 발현을 유동 세포분석법으로 측정하였다.
도 26 - 호중구 세포자멸사. A) 호중구의 생존/사망률 B) 카스파제-3 발현 C) ROS 생산.
호중구를 건강한 지원자의 혈액에서 단리하고 24시간(사망 분석), 또는 4시간, 6시간, 11시간(카스파제-3 분석), 5 시간(ROS 분석)을 위해 코팅된 Iso ctrl(교차), 키메라 항-ChemR23 2G1(사각형) 또는 상이한 사람화된 버전의 2G1(다이아몬드)에서 배양하였다. PMN의 사망률을 사망률과 생존성의 특정 마커와 함께 PMN을 항온처리함으로써 분석한 다음 사진 분석을 통해 계산하였다. 카스파제-3은 웨스턴 블랏으로 나타내고 신호 강도는 소프트웨어로 측정하였다. ROS 생산을 특이적인 마커로 나타내고 사진으로 분석하였다.
도 27 - 생체 내 호중구 세포자멸사 - A) 실험 진행 - B) ChemR23 발현 C) 삼출물 속의 호중구 빈도 D) 삼출물 속의 대식구 빈도 E) 호중구 사망률 F) 죽은/살아있는 호중구 비율.
멸균 공기를 d3와 d6에서 2회 주사하고 카라기난 주사로 염증을 개시하였다. 삼출물을 상이한 시간에 수집하고 유동세포 분석을 위해 염색하였다.
도 28 - 호중구 이행 비율- A) 건강한 환자에서 PMN의 이행 비율 - B) ANCA를 앓고 있는 염증 환자의 PMN 비율
내피세포를 코팅하고 밤새 TNFa 100U/mL로 +/- 활성화하였다. 그 후, PMN을 100U/mL에서의 TNFa 및 Ab의 존재 또는 부재하에 2시간 동안 가하였다. 이주된 PMN을 수집하고 유동 세포분석법으로 분석하였다.
도 29 - CD62L 발현. 건강한 지원자의 PMN을 10 μg/mL에서 코팅한 Ab가 들어있는 배양 배지 속에서 상이한 시간 항온처리하고 유동 세포분석법(좌측 패널)으로 분석된 CD62L 염색을 위해 수집하였다. 쉐딩(shedding)에 의해 방출된 CD62L의 가용성 형태를 코팅된 Ab(우측 패널)와 함께 항온처리된 PMN 상층액에서 ELISA로 검출한다.
도 30 - 중피종 모델 생존
AK-7 세포(3M)를 흉강 내에 주입하고 마우스에게 1mg/kg에서 d4에서 시작하여 3주 동안 Iso ctrl 또는 2G1 중 하나를 주당 3회 제공하였다.
도 31 - CRC 모델 A) CRC의 종양 세포 접종 모델 : 종양 발달 및 생존 B) 화학적으로 및 염증 유도된 CRC.
종양 접종을 MC38 CRC 세포주 0.5M을 피하 투여하여 수행하였다. 마우스를 종양유도 후 d4부터 3주간 2G1 또는 CtrlAb 1mg/kg으로 주 3회 주사하였다. 사이클로포스파미드는 100 mg/kg으로 1회 IP를 주입하였다. 종양 발달을 주당 3회 평가하고 마우스에서 >1000mm3의 종양이 발달하였을 때 생존 곡선을 확립하였다.
AOM-DSS 모델에서, 마우스에게 7,5 mg/kg에서 아족시메탄의 IP 주사를 제공하고 5일 후, 5일-DSS, 14일-물의 3개 주기를 시작하였다. 치료 또는 위약을 제1 주기 이후 투여하고 말기까지 주당 2회 유지시켰다. 마우스를 칭량하고 대변을 주당 3회 분석하였다. 대장 및 종양은 화학물질 주사 후 80일쨍에 측정하고 번호매김하였다.
도 32 - 자가면역 뇌수막염 실험 모델. - A) 시간 경과에 따른 중량 변화 B) 병 점수
중추신경계의 병변은 보조제와 조합된 면역원성 MOG 펩타이드를 주사함으로써 유도하였다. 치료(2G1) 또는 동형 대조군은 실험이 끝날 때까지, 중추 신경계가 이미 T 세포 활성에 의해 영향받고 있음을 의미하는 임상 점수 2를 동물이 갖는 경우 1mg/kg으로 투여하였다.
도 33- ED50 농도(ng/ml)(B)를 사용하여 ELISA 검정(A)에 의한 사람 ChemR23 펩타이드에서 정제된 항체의 결합. 활성 ELISA 검정을 위해, Fc 특이적인, 당나귀 항-사람 IgG(Jackson Immunoresearch; 미국; 참고 번호 709-005-098)을 붕산염 완충제(pH 9) 중 1.3μg/ml에서 플라스틱에 고정하고 야생형 2G1과 비교하여, 정제된 항체를 가하여 BSA 1% 완충제에서 결합을 측정하였다. 배양 및 세척 후, 비오틴화된 항원-특이적인 펩타이드(Biot-C7 펩타이드), 퍼옥시다제-스트렙타비딘(Jackson Immunoresearch; 미국; 참고 번호 016-030-084)을 가하고 통상의 방법으로 나타내었다.
도 34- A. 사람 ChemR23 ELISA 검정 시 4℃ 또는 37℃에서 7일 동안 항온처리된 정제된 항체의 결합. B. 37℃에서 7일간 항온처리된 정제된 항체의 젤 여과 크로마토그래피에 의한 SEC 프로파일. 각각의 정제된 사람화 항-ChemR23 항체(HALA, HDLD, HD-LDT52S, HEF-LDT52S, HEF-LEF)를 각각 4℃ 또는 37℃에서 7일간 배양하였다. 7일 후, ELISA 검정으로 정제된 항체의 결합을 분석하였고, 겔 여과법(Superdex 200 10/300GL, GeHealthcare)으로 응집물 형성을 분석하였다.
도 35 - 항-ChemR23 항체가 코팅된 시험관 내에서 M1 대식구 세포에서 CCR7 발현의 억제. 사람화된 2G1 변이체 HEF-LD-T52S를 플레이트에 고정되었다. 동형 대조군을 대조군으로서 가하였다. 코팅된 플레이트에 전-염증성 대식구 M1을 가하고, 대식구 표면에서 CCR7 발현을 유동 세포분석법으로 측정하였다.
도 36- 항-ChemR23 항체가 코팅된 시험관 내에서 죽은 PMN 호중구 증가. 건강한 지원자의 PMN을 코팅된 HEF-LDT52S, HEF-LEF 및 HDLD 항체 변이체가 10μg/mL에서 들어있는 배양 배지 속에서 24시간 동안 배양하고 사멸/생존능 키트(LIVE/DEAD(Invitrogen))로 염색하였다. 양성 세포의 비율은 Fiji 소프트웨어를 사용하여 사진을 분석함으로써 수득하였다. 동형 대조군을 대조군으로서 가하였다. FcR 수용체(FcR)(HEF-LDT52S N297A)에 결합하지 않는 HEF-LDT52S 항체의 돌연변이된 버전을 또한 가하였다.
실시예
항-CMKLR1 항체의 생산 및 선택
중쇄 및 경쇄 가변 도메인 내에서 상이한 CDR 서열을 갖는 여러 항체를 합성하였다. 뚜렷한 항체를 전-염증 경로 또는 소염 경로로 수지 세포의 성숙과 분화를유도하는 능력에 대해 시험하였다. 이는 항체 2G1(서열 번호: 37, 서열 번호: 49)을 선택하여 염분해 상에서 상기 상태에 적어도 영향을 미치는 염증 상태를 분해하고, 시험관 내에서 항체 생성을 평가하기 위한 3개의 생식선을 생성하는데 있어서 이의 특성을 평가하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 2G1과 1G1(다른 합성된 항체) 항체는 CD103 및 2G1로 처리된 IAb를 발현하는 DC의 검출 수준이 C7 항체로 처리된 DC 세포보다 더 낮았기 때문에 전-염증 경로에 대해 다른 합성된 항체(3G1 및 4G1) 세포보다 더 강력한 방식으로 DC 활성화 및/또는 성숙을 억제할 수 있었다(본 검정에 사용된 방법은 실시예의 10.2에 설명되어 있다). 도 1e 및 1f에 나타낸 바와 같이, C7 또는 레졸빈 E1을 포함한 다른 항체로 처리된 세포와 비교하여 1G1 또는 2G1 항체로 처리한 후 세포의 생존능은 향상되었다.
2G1을 인 실리코(in silico) CDR 이식 방법, 사람화 방법을 사용하여 사람화하였다. CDR 및 FR 영역 뿐만 아니라 가변 중쇄 및 경쇄로부터 수득되는 사람화된 서열은 다음 표에 기술되어 있다.
Figure pct00001
표 1. 중쇄 가변 도메인 생식선(germlines)
Figure pct00002
표 2. 경쇄 가변 도메인 생식선
자가면역 및 염증 질환의 전임상 모델에서 항-CMKLR1 항체 치료의 치료학적 효능의 실시예
실시예 1. DSS에 의한 대장염 유발
대장염은 생후 8-10주-C57Bl/6 마리의 수컷 마우스에서 DSS 2%(wt/vol)를 6일 동안 무균 음용 나트륨 물에 첨가하여 유발시켰다. 치료는 복강내 주사되었다: 동형 대조군 hIgG1(마우스당 10μg), RvE1(마우스당 1μg), 2G1 항체(마우스당 10μg)를 5일간 3회 사용. 체중과 대변 점수(0: 정상변, 4: 대변 내 혈액) 매개변수로 이루어진 대장염 추적 관찰이 매일 수행되었다. 마우스를 안락사시켰을 때, 병리학적 중증도를 나타내는 대장 길이를 측정하였다. 분해 지수는 Bannenberg et al., 2005에 기술된 다양한 조건에서 결정되었다.
결과: 도 2에 제시된 DSS 동물 모델은 급성 염증 모델이다. 도 1은 대조군 항체 또는 레졸빈 RvE1을 받는 동물의 상태보다 항-CMKLR1 항체로 처리된 동물의 전반적인 상태가 더 나은 것을 보여준다. 항-CMKLR1을 치료한 마우스는 몸무게가 현저하게 적게 감소하였고(도 2a), 대변 점수(도 2b)는 현저하게 우수하였다. 대장 길이 및 분해 지수(도 2c 및 도 2d)와 관련하여, 항-CMKLR1 또는 RvE1을 받은 동물들도 유사한 결과를 보였다.
실시예 2. TNBS에 의한 대장염 유발
대장염은 생후 8-10주-C57Bl/6마리의 수컷 마우스에서 50% 에탄올에 5%로 합텐화제 TNBS 200μL를 장내 주사하여 유발시켰다. 치료는 봉각내 주사하였다; RvE1(마우스당 1μg)을 매일 3일 동안, 또는 2G1 항체(마우스당 10μg)를 3일 동안 2회. 체중과 대변 점수(0: 정상 대변, 4: 대변 내 혈액) 매개변수로 이루어진 대장염 추적 관찰이 매일 수행되었다(데이터는 표시되지 않음). 마우스를 안락사시켰을 때, 병리학적 중증도를 나타내는 대장 길이가 측정되었다.
결과: TNBS에 의해 유발된 대장염은 급성 염증의 또 다른 모델이다. 도 3은 항-CMKLR1 또는 RvE1로 처리된 동물의 대장 길이가 정상 동물(wt)과 동일함을 보여준다. 그러나 동형 대조군으로 치료한 사람들은 짧은 대장 길이를 보였다. 이러한 결과는 급성 염증 마우스 모델에서 RvE1과 같은 역할을 하는 항-CMKLR1 항체의 치료학적 잠재능을 입증하였다.
실시예 3. IL10-KO 모델 - 자발적 대장염 모델
IL-10KO 마우스는 생후 20주부터 자발적인 대장염을 일으키는데, 이는 주로 장에서 IL-10 분비를 통한 조절성 T 세포의 기능 부재로 인한 것이다. IL-10KO 마우스는 이러한 병리학의 임상 특성인 체중 감소와 변의 일관성을 위해 18주부터 일주일에 3회 추적 관찰되었다. 체중 감소가 5% 이상이고 대변 점수가 2주(25μg/주사, 주 3회) 동안 1 이상일 때 항-CMKLR1 항체(2G1) 또는 동형 대조군(hIgG1)을 복강내 주사하였다.
결과: 항-CMKLR1 항체 치료의 효과를 연구하기 위해 만성 염증 모델이 사용되었다. 도 4는 동물을 동형 대조군 또는 항-CMKLR1 항체로 치료했을 때의 체중 감소 비율(도 4a)과 대변 점수(도 4b)를 분석한 것이다. 결과는 동물들이 항-CMKLR1 항체로 치료했을 때 몸무게가 덜 줄었고 동형 대조군을 받은 동물들보다 대변 점수가 더 우수하다는 것을 보여준다. 따라서 항-CMKLR1 항체는 만성 염증 질환에 대한 치료 잠재력을 나타내는 것으로 보인다.
실시예 4. 제1형 당뇨병의 전임상 모델: 마우스 NOD 모델
생후 8주 된 NOD 암컷 마우스는 찰스 리버 실험실(Charles River laboratory)에서 얻었다. 이 마우스들은 12주에서 20주 사이에 자연적으로 제1형 당뇨병이 생긴다. 당뇨병의 시작은 높은 당혈증으로 측정할 수 있다. 당혈증이 180 ~ 234 mg/dL 사이일 때, 항-CMKLR1과 동형 대조군을 2주 동안 주 3회 20 μg/주사로 복강내 투여하였다. 당혈증이 비가역 당뇨병에 상응하는 600mg/dL 이상일 때 마우스를 안락사시켰다.
결과: 이러한 유형의 제1형 당뇨병 모델은 마우스 자가면역질환 모델로도 간주된다. 결과는 도 5a 내지 5c가 항-CMKLR1 항체로 처리된 동물들이 혈당 농도 측정으로 나타난 바와 같이 더 나은 생존율과 거의 정상적인 당혈증을 나타냈음을 보여준다. 이 회복은 시간이 지남에 따라 안정적이고 이전에 병에 걸렸던 동물들의 잠재적인 완전한 회복을 보여주는 것으로 여겨진다. 항-CMKLR1 항체는 글루코스에 대한 허용 상태를 회복하였다.
실시예 5. 이미퀴모드-유도된 건선-유사 피부 염증
마우스에서 건선을 유발하는 것으로 알려진 Aldara®크림을 수컷 C57Bl/6마리(8-10주령)에게 사용하였다. 마우스는 알다라의 국소 투여량을 매일 받았다. 치료제(항-CMKLR1 작용제 또는 제어 화합물)가 복강내 주사되었다:
결과: 알다라 투여 후 항-CMKLR1 작용제(2G1)는 피부 두께를 감소시켰지만(도 6a)(예를 들어 15일째), 동물의 체중은 작용제 투여에 의해 영향을 받지 않았다(도 6b). 이러한 결과는 자가면역질환을 예시한 건선 마우스 모델에 작용제 항-CMKLR1 복합 치료요법을 적용하는 것을 시사한다.
실시예 6. 패혈증의 전임상 모델에 대한 항-CMKLR1 항체의 치료 효능: 마우스 복막염 모델
일반적인 복막염은 Zymosan A®(1mL당 마우스 1mg)의 복강내 주사에 의해 유발된다. 항-CMKLR1 예방주사는 Zymosan A주사 5분 전에 수행하였다: RvE1(마우스당 1μg), 2G1 항체(마우스당 10μg). 쥐과 복막 다형핵 호중구(PMN)와 대식구를 자이모산 A 주사 후 2-4-8-16-24 및 48h에서 수집하고 유동 세포분석법으로 번호를 매겨 분해 지수를 측정하였다(Bannenberg et al., 2005).
결과: PMN(7a) 및 대식구(7b) 숫자와 분해 지수(7c)에 대한 도 7에 나타낸 결과는 RvE1 또는 항-CMKLR1 항체로 처리된 동물들이 동일한 결과 및 동형 대조군과 비교하여 더 나은 분해능 지수와 함께 약간 더 적은 PMN과 대식구를 나타냈음을 보여준다. 패혈증에서는 약간의 차이도 치료요법에 중요할 수 있다. 따라서 이러한 결과는 패혈증에서 항-CMKLR1 항체의 잠재적 적용에 매우 긍정적이다.
실시예 7. 암의 전임상 모델에 대한 항-CMKLR1 항체 치료의 치료 효능:
실시예 7.1. 항-CMKLR1 항체가 종양의 성장과 종양의 폐 전이 발달에 미치는 영향.
마우스를 3%의 이소플루란으로 마취하였다. 마우스를 복부 면도시켰고, 4T1 세포(25만 개)는 PBS 50μL의 인슐린 주사기(30 게이지)로 유선에 주사하였다. 항-CMKLR1 항체(2G1) 또는 항-41BB 항체(3H3) 또는 항체 둘 다를 4일차 및 7일차(10μg/주사)에 2회 주사하였다; 대조군 항체는 PBS(100μg/주사)에서 복강 내에서 3주 동안 주 3회 주입되었다. 유선암 발생에 따른 폐 전이를 측정하기 위한 2차 연구에서 동물을 0.8mg/kg의 항-CMKLR1 항체 또는 대조항체(100μg/주사)로 주 3회 치료하였다.
결과: 도 8a에 나타낸 같이, 단일 화합물(2G1 또는 3H3)로 처리된 동물은 동형 대조군 항체를 투여받은 동물에 비해 종양 성장이 개선되지 않았다. 그러나 항-CMKLR1 항체와 항-41BB 항체의 조합으로 처리된 동물들은 유선 암종 모델에서 종양의 성장이 유의미하게(p<0.01) 감소하였다. 이 유선 암종 모델은 상당히 공격적인 모델이기 때문에, 결과는 긍정적인 것으로 간주된다. 도 8b에 나타낸 바와 같이, 이는 생체발광 영상에 의한 폐 전이에 대한 항-CMKLR1 화합물의 영향을 보여주는데, 항-CMKLR1 치료는 대조군 항체로 치료되는 동물에 비해 폐 전이를 감소시킨다는 것을 알 수 있다. 림프절 전이를 분석한 결과, 대조군 내 2마리의 동물은 전이되었지만 항-CMKLR1 화합물로 처리된 어떤 동물도 전이를 가지지 않는 것으로 나타났다(데이터는 표시되지 않음). 이러한 결과는 RvE1을 모사체한 작용제 활성을 가진 항-CMLKR1 항체가 항-전이 효과를 가지고 있음을 나타낸다. 이 모델에서, 본 발명의 항체는 1차 종양 발생에 어떠한 유의적인 효능도 나타내지 않는다. 그러나 결과는 동물들이 항-CMKLR1과 항41BB 항체의 조합에 의해 치료될 때 개선되는 것을 보여준다.
실시예 7.2. 대장암 모델에서 종양 성장에 대한 치료 효과
생후 8주된 C57bl/6J 수컷 마우스를 3%의 이소플루란으로 마취하였다. 마우스를 옆구리에 면도하고 MC38 세포(0,5.10^6 세포/마우스) 세포주를 PBS 50μL로 인슐린 주사기(30 게이지)로 피하 주사하였다. 또 다른 모델을 사용하였고, 여기서 생후 8주 된 Balb/c 수컷 마우스를 3%의 이소플루란으로 마취하였다. PBS 50μL에 CT26 세포(1.10^6 세포/마우스)를 인슐린 주사기(30 게이지)로 피하 주사하였다.
작용성 항-CMKLR1 항체(2G1) 또는 항-SIRPa 항체(Merck Millipore의 p84-항-마우스 SIRPa)(SIRPa는 새로운 체크 포인트 억제제이다)를 단독으로 또는 조합하여 종양 접종 후 d4에 출발하여 3주 동안 복강 내 주사하였다.
결과: 도 9a 내지 9c에 나타낸 바와 같이, CT26 암종 모델에서 항-CMKLR1 항체 자체(도 9b)는 대조군에 비해 종양 발달에 대한 임상적 효과를 나타내지 않았으며 항-SIRPA 단독(도 9a)도 나타내지 않았다. 그러나, 놀랍게도, 두 화합물의 조합은 적시의 방식으로 종양 성장을 억제할 수 있었다(도 9c). 도 9d에 제시된 또 다른 마우스 결장 암 모델에서, 항-CMKLR1은 동형 대조군에 비해 종양 성장 억제에 효과가 있었다. 두 가지 다른 대장암 모델에 대한 이러한 결과는 작용제 항-CMKLR1 항체가 자체적으로 또는 다른 치료제와 함께 종양 발생을 예방할 수 있음을 나타낸다.
실시예 8. 항-TNFa 또는 항-α4β7 항체 치료요법으로 처리된 UC 또는 CD 사람 환자 생검에서 CMKLR1 발현의 메타 분석.
염증성 창자 질환(IBD)의 두 가지 주요 형태인 크론 질환(CD)과 궤양성 대장염(UC)에서 만성 위장 염증을 영구화하는 신호 네트워크는 사람에게 여전히 불분명하다. IBD 환자 500명, 대조군 100명을 대상으로 한 분석에 따르면, 발명가들은 CMKLR1 전사체가 면역억제/코르티코스테로이드 및 항-TNFα(인플릭시맙) 또는 항-α4β7 인테그린(베돌리주맙) 치료요법과 같은 면역요법에 반응하지 않는 중증 IBD 환자의 염증 대장 조직에 축적된다고 보고한다.
본 발명자들은 먼저 UC 환자 GSE16879(Arijs et al., 2009a)와 GSE12251(Arijs et al., 2009b), 및 GSE73661의 3개 코호트의 공개적으로 사용 가능한 전사 데이터 세트의 메타-분석을 수행하여 점막 CMKLR1 전사체 발현을 분석하였으며, 코르티코스테로이드 및/또는 면역 억제에 대해 재발성인 환자에게 항-TNF 치료 전(일주일 이내) 대장 점막 생검을 수행하였다. 이러한 3개의 코호트에서, 항-TNF 반응은 첫 항-TNF 주입 후 4 내지 6주째에 분석시 조직학적 치유로 정의되었다(모두: n=18명의 비-IBD 대조군, n=41명의 UC 비-반응자 및 n=28명의 UC 응답자).
결과: 분석은 CMKLR1 전사체 발현이 비-IBD 대조군 또는 항-TNF 전 UC를 지니고 항-TNF 치료요법에 반응하지 않을 환자와 비교하여 항-TNF 치료요법으로 치료하기 전 및 후 1차 UC 비-반응자 환자의 결장 생검에서 유의적으로 증가하였음을 나타내었다(도 10a). 점막 CMKLR1 발현은 비-IBD 대조군 또는 미래의 반응자와 비교하여 항-TNF에 반응하지 않을 환자에서 항-TNF 치료요법의 전 및 후에 크론 질환 환자의 결장 또는 회장 생검에서 유의적으로 증가하였다(n=24명의 비-IBD 대조군, n=17명의 CD 비-반응자 및 n=20명의 CD 반응자; GSE16879(Arijs et al., 2009a))(도 10b). 마지막으로, 항-α4β7(베돌리주맙) 치료요법으로 치료된 UC 환자 코호트(GSE7366146)의 결장 점막 유전자 발현 분석은 베돌리주맙으로 치료하기 전 및 후에 비반응자에서도 CMKLR1 발현이 유의적으로 증가함을 입증하였다(도 11). 전체적으로, 메타-분석은 CMKLR1이 IBD 환자, 특히 심지어 치료 개시 전에 현재의 면역 억제 또는 면역 치료요법에 반응하지 않는 환자의 염증 조직에서 과-발현된다. 본 발명자의 메타-분석은 치료 난치성인 UC 또는 CD 환자로부터의 결장, 또는 CD의 경우 오히려 회장에서 대조적으로 CMKLR1 발현이 이러한 환자를 본 발명의 항체와 같은 작용제 항-CMKLR1 항체 치료에 반응하는 것으로 자격을 부여할 수 있다는 증거를 제공한다.
실시예 9. CMKLR1 발현 및 항체 결합 연구
- ELISA 결합 CMKLR1(도 12)
CMKLR1 펩타이드(273NH2-PYHTLNLLELHHTAMPGSVFSLGLPLATALAIA-COOH305)(서열 번호: 60)(5μg/ml)를 붕산염 완충제로 밤새 코팅하였다. 포화는 PBS-트윈 0.1%-젤라틴 0,25%로 37℃에서 2시간 동안 수행하였다. 그 후, 37℃에서 2시간 동안 상이한 농도로 2G1 또는 hIgG1 항체를 가하였다. 그 후, 37℃에서 1시간 동안 퍼옥시다아제 결합 2차 항체(0,8μg/ml)를 첨가하고 TMB 기질로 나타내었다. 색상 반응은 TECAN으로 판독하였다.
- FACS에 의한 CMKLR1 발현(도 13a)
세포를 PBS-FBS-EDTA 속에 재현탁시키고 얼음 위에서 Fc 블록(1/50)으로 30분 동안 항온처리하였다. 단핵세포, 대식구 및 수지상 세포에 대한 염색은 A488-표지된 2G1(5μg) 또는 A488-표지된 hIgG1(5μg)을 사용하여 수행하였다.
웨스턴 블랏 분석 CMKLR1(도 13b)
앞서 설명한 대로 단백질의 이주 및 전달 후, 2G1 항체(10μg/막)를 4℃에서 밤새 항온처리하여 퍼옥시다제 결합된 2차 항체(1:2000)로 나타내었다. 그런 다음 화학 발광과 영상 판독기를 사용하여 CMKLR1 발현을 검출하였다. 웨스턴 블랏 영상은 멀티 게이지 소프트웨어로 정량화하였다.
결과: 도 12에 도시된 결과는 항-CMKLR1 항체 클론 2G1이 CMKLR1의 루프 EL3를 형성하는 폴리펩타이드를 결합할 수 있음을 확인하였다. FACS와 웨스턴 블롯에 의해 2G1 항체를 사용하여 평가된 상이한 세포주에서 CMKLR1의 발현은 사람 종양 T 세포주 Trp1과 U937이 CMKLR1 뿐만 아니라 형질도입된 CMKLR1 CHO 세포 및 사람 폐 섬유아세포 주 MRC5 및 사람 NK 세포주 NKL을 발현함을 나타내었다(도 13).
실시예 10. 골수계통에서의 CMKLR1 발현에 관한 연구
실시예 10.1. 사람 단핵세포 분화 및 분극
단핵세포는 건강한 지원자들의 버피코트(buffy coat)의 PBMC에서 수집되었고 자기 분리 또는 용출에 의해 단리되었다. 그 후, 단핵세포는 분화된 비분극 대식구 또는 분극 대식구를 생성하기 위해 사이토킨의 다른 칵테일로 배양되었다. 이 프로토콜은 상이한 웰에서 염증 대식구의 전-염증(M1) 또는 전-분해(M2)를 가지기 위해 분극화된 분화된 대식구를 생성할 수 있게 하였다. 단핵세포는 완전 RPMI(10% FBS, 1% 글루타민, 1% 항생제를 지닌 RPMI)에서 0.5.106개의 세포/mL로 플레이팅하였으며, 세포 현탁액 500μL는 24-웰 플레이트에서 웰당 플레이팅하였다. M-CSF 100ng/mL를 세포 분화를 위한 배지와 함께 첨가하였다. 세포는 5일 동안 항온처리하고 배지는 3일째에 M-CSF 100ng/mL를 보완한 신선한 배지로 교체하였다. 분극 단계의 경우, LPS 100ng/mL 및 IFNg 20ng/mL에서 LPS-IFNg 용액에 동형 대조군(mIgG1 또는 hIgG4)(2μg/ml) 또는 항-CMKLR1 항체(2μg/ml)(2G1 또는 2G4, H6, BZ332 또는 84937) 또는 C15 펩타이드(10 nM) 또는 RvE1(10ng/ml)를 3일 동안 보충하여 전-염증성 대식구를 생성하였다. 전-염증성 -IFNG 대식구는 배양 배지에서 IFNG(20ng/mL)만을 가하여 생성시킬 수 있다. 프로-분해 대식구 분극을 위해, 세포를 IL-4 20ng/mL와 함께 항온처리하였다. 분화 및/또는 분극에 이어 FACS 분석, ELISA 및 웨스턴 블롯에 의해 표현형 및 기능성 사이토킨/케모킨 방출을 연구하였다.
실시예 10.2. 마우스 대식구와 DC의 분리 및 분화
-쥐과 골수 유래된 대식구의 단리
골수세포를 수거하고 10% FBS, 글루타민, 대식구 콜로니 자극인자(M-CSF)가 포함된 항생제가 100 ng/mL에서 5일 동안 보충된 RPMI 배지 속에서 배양하여 대식구 분화를 유도하였다. 대식구를 수거하고 2일 동안 IFNg(20ng/ml) 및 LPS(100ng/ml)와 함께 배양하여 전-염증 분극을 유도하거나 IL-4(20ng/ml)와 함께 배양하여 전-분해 분극을 유도하였다. 치료는 2μg/ml에서 대식구 분극 동안 가하였다.
골수 유래된 수지 세포 생성
골수 세포를 수거하고 10% FBS, 글루타민, 항생제를 보충한 RPMI 배지에서 배양하고 수지 세포 분화를 GM-CSF에 의해 7일 동안 20ng/ml로 유도하였다. 이어서, 미성숙 수지 세포(iDC)를 수집하고 LPS(100ng/ml)와 함께 24시간 배양하여 iDC에서 mDC로의 성숙을 유도하였다. 2μg/ml에서 분화 및 성숙하는 동안 치료제를 가하였다.
위에서 설명한 마우스의 전-염증성 대식구 또는 프로-분해 대식구 분화 후, 세포를 배지, 동형 대조군, 항-CMKLR1 항체: 클론 H6 및 BZ194의 존재하에서 항온처리하였고, C15 펩타이드, 목적한 항-CMKLR1 항체인 2G1 또는 RvE1을 사용하였다. 그런 다음 ELISA에 의해 IL10, CCL17 및 IL12p40의 분비를 평가하였다. 사이토킨 분비는 BD로부터의 ELISA 키트를 사용하여 상층액 속에서 측정하였다. 상층액는 IL10 사이토킨의 경우 1/10, CCL17 사이토킨의 경우 1/50, IL12p40 사이토킨의 경우 1/100으로 희석되었다.
- ELISA 사이토킨 분비 연구
사이토킨 분비는 BD 제조사의 설명서에 따라 ELISA에 의해 검출되었다. 간단히, 상층액을 적절한 완충액에서 희석하고 포획 항체로 밤새 코팅하고 포화시킨 후 2시간 동안 항온처리하였다. 그 후, 사이토킨은 검출 바이오틴-결합된 항체로 나타내고 신호는 바이오틴-스트렙타비딘-커플링된 퍼옥시다제 시스템으로 증폭시켰다. BD Bioscience가 공급한 TMB를 기질로서 사용하고 색상 반응을 TECAN으로 판독하였다.
- FACS에 의해 분석된 활성화 세포 마커
수지 세포는 PBS-FBS-EDTA에 현탁시키고 빙상에서 30분 동안 살아있는 및 죽은(LIVE/DEAD®Fixable Dead Cell Stines Yellow-Life Technologies)로 배양하였다. CD11c-BV711, CD11b-APCCy7, I/Ab-APC, CD103-PerCPCy5.5, CCR7-V450, CD40-PeCy7, CD80-PE, CD86-FITC(모두 BDPharmingen에서 제공)의 염색을 수행하였다.
- 웨스턴 블랏 분석 ERK/Akt
마우스의 전-염증성 대식구(M1)를 골수에서 M-CSF로 생성시켰으며 IFN-감마와 LPS로 분극되었다. 요약하면, 골수 세포는 대퇴골 뼈를 플러싱하여 mM-CSF 100ng/mL로 5일간 배양하여 수집한 다음 IFNg 20ng/mL, LPS 100ng/mL로 24시간 분극하였다. 이후에, 이를 RPMI FBS 2% 배지로 24시간 동안 FBS를 고갈시켰다. 최종적으로, 마우스 전-염증성 대식구를 2G1 항체의 2μg/mL로 상이한 시간: 5분, 10분, 30분 간격으로 처리하였다. 세포를 RIPA 완충액 속에서 수집하였다. 단백질 농도를 BCA 단백질 키트 검사로 측정하였다. 단백질은 95℃에서 5분 동안 가열하여 변성시키고 DTT 및 Laemli 용액 속에서 희석하였다. 이주 및 전달 후, TBS-T에서 5% BSA로 니트로셀룰로스 막을 2시간 동안 차단하였다. 항-포스포-ERK 항체와 항-포스포-Akt 항체(1:1000)를 4℃에서 막과 함께 밤새 배양하고 퍼옥시다제-접합된 2차 항체(1:2000)로 나타내었다. 웨스턴 블랏 영상은 Multi Gauge 소프트웨어에 의해 정량화하였다.
실시예 10.3: 사람의 혈액 단핵세포와 마우스 골수 골수세포 및 호중구 세포에서 염증 자극 후 CMLKR1 발현.
사람 단핵세포는 건강한 지원자들의 버피 코트(buffy coat)의 PBMC로부터 수집하였고 자기 분리 또는 용출에 의해 분리되었다. 그런 다음 단핵세포(CD14 양성 세포)를 배지에서 배양하고 16시간 또는 48시간 동안 상이한 전-염증성 자극(LPS(100 ng/ml) 또는 TNFa(100 U/ml) 또는 IL6(20 ng/ml)으로 처리하였다.
마우스 단핵세포(CD11b+Ly6G-SSClow)와 호중구(CD11b+Ly6G-SSClow)를 수거하고 10% FBS, 글루타민 및 항생제로 보충된 RPMI 배지에서 배양하였다. 이후에 세포를 배양하고 16시간 또는 48시간 동안 상이한 염증 유발 자극으로 처리하였다: LPS (100 ng/ml) 또는 TNFa(100 U/ml) 또는 IL6(20 ng/ml).
CMLKR1의 발현은 시판되는 항-CMKLR1 항체(사람 항-ChemR23: 클론 84939 및 마우스 항-ChemR23: 클론 477806)를 사용하여 FACS로 측정하였다.
결과: 도 14에 나타낸 마우스 골수 계통에서 CMKLR1의 발현의 분석은, 수지 세포 뿐만 아니라 단핵세포와 대식구에서도 단백질의 양호한 발현을 나타내었다. 도 15에서, 사람 단핵세포와 마우스 골수 및 호중구 세포에 대한 CMKLR1의 발현이 나타나 있다. 이러한 발현은 LPS, TNFa 또는 IL6와 같은 염증성 자극에 의해 명확하게 증가하며(48시간 이후 대조군과 비교했을 때 적어도 2배), 골수세포 계통에 대한 CMKLR1 발현과 염증 중 과발현이 하향조절(downregulate) 및/또는 염증의 해결을 유도하는 치료학적 접근법을 나타낼 수 있음을 확인하였다. DC 활성화 마커는 FACS에 의해 분석되었으며, 도 16에 도시된 결과는 세포들을 RvE1 지질 또는 2G1 항체로 처리했을 때 부형제 또는 동형 대조군과 비교하여 CD80, CD86, CD103, CD40 및 IAb의 발현의 강력한 감소를 나타내었다. 이러한 결과는 2G1 항체가 DC의 CMKLR1 경로에서 RVE1만큼 활성화됨을 나타낸다. 이후 발명가들은 웨스턴 블롯에 의해 마우스 대식구의 CMKLR1 활성화 경로를 분석하였다. 도 17은 항-CMKLR1 항체 2G1이 Akt 단백질과 Erk 단백질의 활성화를 10 내지 30분 배양 후 유도할 수 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 2G1 항체가 RvE1 지질과 마찬가지로 CMKLR1 수용체에 대해 작용제 특성을 나타낼 수 있음을 나타낸다.
실시예 11. 항-CMKLR1 항체를 이용한 케메린-유도된 CMKLR1 활성화의 경쟁 연구
방법.
항-CMKLR1 항체의 존재 하에 CMKLR1 수용체에 의한 케메린 의존성 B-아레스틴 충원 측정을 위한 경쟁 분석:
분석 전날, CHO-K1 CMKLR1 세포(Discover'X 참고번호 93-0313E2)를 사전 가열된 세포 시약에 플레이팅한 후, 96-웰 플레이트에 (Discover'X 참고번호 15-103)로서 100μl/웰에서 플레이팅하고 37℃, 5% 습윤화된 항온처리기 속에서 48시간 배양하였다. 항-CMLKR1 항체를 희석(1μM에서 1nM까지 3배 희석 7점 시리즈로 22X)하고, 항체와 함께 37℃에서 30분간 세포를 항온처리하였다. 그런 다음 37℃에서 제공자 프로토콜(Discover'x 참고번호 92-1036)에 따라 케메린(2 또는 6nM)으로 세포를 자극하였다. 발광은 작업 검출 용액을 세포에 첨가한 후 플레이트 판독기로 0.5s 적분으로 측정하였다.
CMKLR1 수용체에 의한 AMPC 생성에 있어서 케메린과 항-CMKLR1 항체의 경쟁 측정:
실험 전날 CHO-K1 CMKLR1 Gi 세포(Discover'X 참고번호 95-0080C2)를 예열된 세포 시약에 플레이팅한 후 96-웰 플레이트에 플레이팅하여(Discover'X 참고번호 15-103) 37℃에서 24시간, 습윤된 5% 인큐베이터에서 배양하였다.
케메린 작용제(10-7μM으로부터 10-10M까지 3배 희석의 7-점 시리즈로 6X)(Discover'x 참고번호 92-1036 또는 2324-CM-025)와 포르스콜린(40μM)(CAMP 활성제)(Discover'x 참고번호 92000-5)의 혼합물을 37℃에서 30분 동안 세포에 가하거나; 세포를 항-CMKLR1 항체로 37℃에서 30분 동안 예비-항온처리하였다(일련 희석: 1μM에서 1nM까지 3배 희석의 7점 시리즈로 6X). 그런 다음 37℃에서 30분 동안 케메린(2nM) + 포르스콜린(60nM)의 혼합물을 세포에 가하였다. 검출 cAMP의 경우, 실온에서 1시간 동안 항체 시약과 cAMP 작업 검출 용액을 플레이트에 가한 다음, cAMP 용액 A를 가하고, 세포를 암실에서 실온에서 3시간 동안 항온처리하였다. 생물발광은 0.5s 적분으로 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다.
결과: 본 발명의 항체가 케메린-유도된 CMKLR1 활성화의 길항제인지의 여부를 시험하기 위하여, 2개의 검정을 수행하고 결과를 도 18에 나타내었다. 포르스콜린-의존성 cAMP 생성을 위한 케메린-유도된 억제는 도 18a(검은 원 또는 흰색 정사각형)에 나타내고; 본 발명의 항-CMLKR1 항체는 대조군(회색 다이아몬드)과 비교하여 이러한 생산의 억제를 역전시킬 수 없었다(검은 원 또는 흰색 정사각형). 도 18b에 나타낸 베타-아레스틴의 케메린-유도된 활성화는 본 발명의 항-CMKLR1 항체가 베타-아레스틴의 케메린 의존적 활성화(검은 다이아몬드에 비해 흰 원)를 유의적으로 변경시키지 않았음을 나타낸다. 본 발명의 항체는 CMLKR1-케메린 상호작용의 길항제 활성을 갖지 않는다. 또한, 본 발명의 항체는 케메린-유도된 CMKLR1 신호전달 경로를 유도할 수 없으므로, 이러한 항체가 CMLKR1 경로의 케메린의 작용제가 아님을 입증한다.
실시예 12. CD45Rbhigh T-세포 전이 만성 결장염 마우스 모델
방법: CD45Rbhigh CD4 T 세포를 나이브 마우스의 비장에서 분리하여 자기 분류에 의한 CD4T 세포의 음성 선택 후 ARIA FACS로 분류한 다음, 6주 된 암컷 Rag1 녹-아웃(knock-out) 마우스에게 PBS 100μL 중 0.5.106개의 세포로 복강내 주사하였다. 항-CMKLR1 항체(2G1) 또는 동형 대조군을 CD45Rbhigh CD4 T 세포 전달 후 32일부터 1mg/kg에서 3주 동안 주 3회 투여하였다. 체중 추적은 일주일에 3회 평가하였고 체중 변화는 초기 체중 이상으로 측정되었다. *p < 0.05, **p < 0.01.
결과: 도 19는 항-CMLKR1 항체 또는 동형 대조군으로 처리된 동물의 시간에 따른 체중 변동 비율을 나타낸다. 처음 30일에 걸쳐 동일한 초기 체중 진화를 나타낸 두 그룹을 항-CMLKR1 항체 또는 동형 대조군으로 치료하였다. 항-CMKLR1로 치료한 마우스는 체중이 계속 증가하는 반면 대조군 마우스는 이러한 대조군 그룹에서 예상한 대로 만성 결장염의 발생을 나타내는 체중 감소를 시작한다(도 19a). 항-CMKLR1로 처리된 마우스에서 결장 수복에 상응하는 조직 두께의 감소가 관찰되었다. 섬유조직의 감소도 관찰되었다(도 19b). 상이한 점수는 병리의 중증도를 계산하는 데 사용되는 해부학적 병리학 점수를 나타낸다. 염증 점수를 포함한 점수는 항-CMKLR1로 처리된 마우스에서 더 낮았다(도 19c). 본 발명자들은 염증의 만성 모델인, 결장염의 제3의 모델에서 본 발명의 항-CMKLR1 항체가 결장염과 같은 만성 염증 및 자가면역 질환을 치료하는데 관심이 있을 수 있음을 입증한다.
실시예 13. 마우스 간암종 종양 모델의 전반적인 생존에 대한 항-종양 효과
방법: 마우스를 자일라진/케타민 칵테일로 마취시켰다. 개복 수술 후, 종양 Hepa 1.6 세포를 PBS 속에서 간 문맥(2,5.106개의 세포/100 μL)을 통해 PBS로 주사하였다. 종양 주사를 맞은 지 4일 만에 치료를 시작하였다. 항-CMKLR1 항체(2G1 클론)와 hIgG1 동형 대조군은 2주 동안 주 3회 0.8mg/kg으로 주사하였다. 항-PD1 모노클로날 항체는 PBS(8mg/kg)에서 복강 내 2주 동안 주 2회 주사하였다. 항-CMKLR1 및 항-PD1 항체 조합도 또한 시험하였다(각각 0.8mg/kg, 8mg/kg). 전체 생존율은 60일 동안 추적되었고 각 조건의 생존 비율은 도 22에 보고하였다.
결과: 도 20에 나타낸 바와 같이, 항-CMKLR1 또는 항-PD1 항체로 치료된 동물들은 부분 반응(PR)을 나타내는 치료를 받은 7마리 중 1마리(치료된 동물의 15%)에 대해서만 생존율이 연장되었다. 그러나, 항-PD1 항체와 항-CMKLR1 항체의 조합으로 치료된 동물은 치료 후 60일간 동물이 살아있어 생존율(15%에서 45%)을 유의적으로 증가시킬 수 있었으며, 이는 완전한 반응(CR)을 나타낸다. 이 결과는 HCC 종양 모델에서 치료 조합(항-PD1/항-CMKLR1 항체)의 예상치 못한 효능을 나타낸다.
실시예 14. 다른 세포주에서의 항체 생산.
2G1 중쇄의 CDR은 IGHV3-23*04(서열 번호: 41에 상응), IGHV1-46*01 및 IGHV7-4-1이라는 세 가지 사람 생식선 골격에 이식하였다. 2G1 경쇄의 CDR은 IGKV1-13*02(서열 번호: 50에 상응), IGKV6-21*01 및 IGKV3-11*01(IMGT 명명법)이라는 3개의 사람 생식선 골격에 이식시켰다. 각각의 서열은 사람 면역 글로불린의 일정한 단편에 융합시키고, 사람화된 항체를 생산하기 위해 포유 동물 세포에서 동시 형질감염시켰다. 보다 상세하게는, 항-ChemR23 A의 중쇄를 만들기 위해, 항체 가변 도메인 VH 서열을 합성하고 사람 IgG1의 Fc(Invivogen, Toulouse의 pFUSE-CHG-hG1 벡터)를 포함하는 pFUSE-CHG-hG1 발현 플라스미드에서 EcoRV에 의해 클로닝하였다. 항-ChemR23 항체의 경쇄 구성을 위해, 가변 도메인 VL을 합성하고 사람 CLkappa를 포함하는 pFuse2CLIg-hk 발현 플라스미드의 BsiWI(툴루즈 소재의 Invivogen으로부터의 pFuse2CLIg-hk)에 의해 클로닝하였다. 포유 동물 HEK 또는 CHO 세포에서, 본 발명자는 리포펙타민 방법을 통해 VH-hFcG1을 포함하는 플라스미드와 VL-CLkappa를 포함하는 플라스미드를 동시-형질감염시켰다. 3 내지 7일 동안 항온처리한 후 샌드위치 ELISA 검정으로 상층액을 회수하고 정량하였다. 상층액은 시트르산 0.1M pH3 용출 완충제를 사용하여 단백질 A 크로마토그래피(HiTrap, GeHeHealthcare)에서 친화성으로 정제할 수 있다. 정제된 항체는 PBS 속에서 투석하고 농축시켰다. 이들을 UV(A280nm)에 의해 정량화하여 C7 항원-특이적인 펩타이드에 대한 활성 분석에서 시험하였다.
결과. 도 21에 나타낸 바와 같이, 중쇄를 위한 사람 생식선 IGHV3-23*04는 포유 동물 세포에서 항체를 생산하는 데 더 효율적이었다. 다른 골격과 관련된 돌연변이는 덜 생산적인 쇄를 유도하였다. 경쇄의 경우, 사람 생식선 IGKV1-13*02가 사람화된 항체를 생산하는 데 가장 우수하였고, 다른 생식선은 1-log 생산성을 감소시켰다. 사람화된 IGHV3-23*04와 IGKV1-13*02의 조합은 사람화된 항-CMKLR1 항체의 높은 수율의 생산에 적합하다. 도 22에 나타낸 바와 같이, 이 조합은 만족스러운 수율로, 충분한 양의 항체를 생산할 수 있도록 한다.
따라서 항체의 추가적인 사람화를 위해 생식선 IGHV3-23*04와 생식선 IGKV1-13*02를 선택하였다.
중쇄 또는 경쇄에는 돌연변이가 거의 추가되지 않았다. 중쇄에서 돌연변이 G33A(CDR1에서), P60A(CDR2에서), R94K(FR3)가 사람화를 증가시키기 위해 치환되었으며, 항체의 탈아미노화 위험을 줄이기 위해 아미노산 D61(CDR2 내)을 아미노산 E 또는 A로 대체할 수 있다. 경쇄에서, 돌연변이 S24R, S27Q, M33L(CDR1 내), T51A(CDR2 내), Y71F(FR3)는 사람화를 증가시키기 위해 치환되었고, 아미노산 N92는 항체의 글리코실화 위험을 줄이기 위해 아미노산 Q로 치환될 수 있었다. 각각의 서열은 사람 면역글로불린의 불변 단편에 융합되었고, 사람화된 항체를 생산하기 위해 포유동물 세포에서 함께 동시-전달되었다. 결과는 모든 중쇄와 경쇄의 조합이 항체를 생성함을 나타내었다. 생산성은 포유 동물의 세포 속에서 중쇄와 경쇄의 조합에 따라 영향을 받는 것 같지만, 항체의 치료학적 적용을 고려하여 효율적인 생산을 위해 충분한 양이어야 한다.
실시예 15. 시험관 내에서 생성되고 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인의 특정 생식선에서 발행되는 항-CMKLR1 항체의 인식 능력.
정량화 ELISA 분석을 위해, 당나귀 항-사람 IgG, 특이적 Fc(Jackson Immunore research; 미국; 참고번호 709-005-098)을 붕산염 완충제(pH 9) 속에서 1.3μg/ml로 플라스틱에 고정하고 표준 항체와 비교하여, 항체를 포함한 상층액을 가하여 결합을 측정하였다. 배양 및 세척 후, 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항 IgG 항체로 마우스 항-사람 카파 항체(Ose Immuntherapeutics, 참고 번호 NaM76-5F3)를 가하여 검출하였다(Jackson Immunoresearch; 미국; 참고번호 715-036-151). ELISA는 통상의 방법으로 나타내었다.
활성 ELISA 검정의 경우, 당나귀 항-사람 IgG, 특이적 Fc(Jackson Immunore research; 미국; 참고번호 709-005-098)를 1.3μg/ml에서 붕산염 완충액(pH 9) 속에서 플라스틱에 고정시키고 정제된 항체를 가하여 야생형 2G1과 비교하여, BSA1% 완충액 속에서의 결합을 측정하였다. 배양 및 세척 후, 비오틴화된 항원-특이적인 펩타이드(Biot-C7 펩타이드: 바이오티닐화된 NH2 -PYHTLNLLELHHTAMPGSVFSLGLPLATALAIA-COOH, 신펩타이드(synpeptide)에 의해 합성됨, 서열 번호: 60)에 이어, 퍼옥시다제-스트렙타비딘(Jackson Immunoresearch; 미국; 참고번호 016-030-084)를 가하고 통상의 방법으로 나타내었다.
VHvAv3-23*04(서열 번호: 41 - 89.8% 사람화)와 VLvAv1-13*01(서열 번호: 50 - 82.1%)에서 발급된 중쇄와 경쇄의 조합은 항원-특이적 펩타이드(C7 펩타이드) 유사 야생형 항체에 대해 양호한 결합 활성을 지닌 사람화된 항체를 생성하였다. 도 23에 나타낸 바와 같이, 사람화된 항체 가변 도메인 쇄의 조합은 2G1에서 유래되었다(중쇄 가변 도메인의 경우: HA는 VHvAv3-23*04 및 서열 번호: 4에 상응; HC는 서열 번호: 42에 상응; HD는 서열 번호: 43에 상응; 경쇄 가변 쇄의 경우: LA는 서열 번호: 번호 50에 상응 ; LC는 서열 번호: 52에 상응 ;LD는 서열 번호: 번호 53에 상응).
모든 조합은 적어도 야생형 항체 2G1과 동일한 활성으로 항원-특이적인 펩타이드(C7 펩타이드)에 결합하였다. 일부 경우(HCLC, HCLD, HDLC 및 HDLD의 조합), 결합은 생식선 항체 HALA와 야생형 항체 2G1보다 훨씬 더 우수하다(도 23). 도 24에 도시된 바와 같이, 사람화된 항체의 ED50(ng/ml)은 적어도 2G1 항체의 ED50과 동등하며, 대부분의 경우 더 우수하다.
실시예 16. CCR7 내부화에 대한 생물학적 영향
물질 및 방법. 대식구를 건강한 지원자의 단핵세포에서 5일 동안 M-CSF 100ng/mL를 사용하여 생성하였다. 이후에, 대식구를 수집하고 IFNα 20ng/mL의 존재 하에 10mg/mL에서 코팅된 mAb와 함께 항온처리하여 M1 염증성 대식구를 수득하였다. 이후에, 유동 세포분석법에 의해 CXCR4에 대해 M1을 표현형화하였고, 상층액에서 방출된 사이토킨을 ELISA로 투여하였다. 수지 세포는 건강한 지원자의 단핵세포에서 GM-CSF 50ng/mL와 IL-4 20ng/mL를 6일 동안 사용하여 생성시켰다. 그런 다음 DCR을 유동 세포측정법에 의해 CCR7에 대해 표현형화하였다.
결과. 2G1과 모든 사람화된 2G1 변이체(HALA, HCLC, HCLD, HDLC, HDLD)를 플레이트에 고정시켰다. 동형 대조군을 대조군으로 가하였다. FcRγ 결합을 방지하기 위한 2개의 동형, 즉, 2G1-N297A(FcγR 결합을 줄이기 위해 N297A에서 돌연변이된 2G1wt)와 2G4(힌지 영역을 안정화시키기 위해 S228P에서 2G4-돌연변이된 동형 IgG4)을 또한 가하였다. 코팅된 플레이트에 48시간 동안 전-염증성 대식구 M1을 가하고, 대식구 표면에 CCR7 발현을 유동 세포분석법으로 측정하였다.
도 25에 나타낸 바와 같이, 2G1 및 모든 사람화된 2G1 변이체는 전-염증성 대식구(M1)의 표면에서 CCR7의 발현을 감소시킬 수 있었다. 그러나, CCR7의 내부화는 동형 IgG1-N297A 또는 IgG4에서는 관찰되지 않으며, 이는 FcRγ 결합을 방해하는데 이는 동형 IgG1이 생물학적 활성을 수득하기 위해 바람직함을 나타낸다.
실시예 17. 호중구의 세포자멸사 및 사망률
호중구는 보통 염증 부위에 위치하며, 이의 존재는 염증 공정을 지속함으로써 만성 염증으로 이어질 수 있는 개시되거나 활성적으로 지속될 염증의 분해를 방지한다. 호중구 세포자멸사는 호중구 조직독성 물질의 방출을 방지하고 항-염증 효과를 발휘한다. 도 26a에 도시된 바와 같이, 호중구 수명/사망 비율은 본 발명의 항체로 처리된 세포에서 더 높으므로, 이러한 세포에서 본 발명의 작용제의 효과를 나타낸다.
카스파제-3 발현
물질 및 방법:
건강한 지원자의 PMN을 10μg/mL에서 코팅한 Ab가 들어있는 배양 배지 속에서 상이한 시간 동안 배양하고 웨스턴 블롯에 의해 분석된 카스파제-3 염색을 위해 수집하였다. 카스파제-3 발현의 강도는 WB에서 계산되었다.
결과: 도 26b에 도시된 바와 같이, 항-CMKLR1 작용제의 투여는 대조군 항체로 처리된 세포와 비교하여, 카스파제-3 활성을 향상시킨다. 항체 HALA는 2G1 항체와 비교하여, 카스파제 3 활성에서 더 높은 효과를 나타낸다. 2G1 WT와 HALA는 카스파제 3의 절단을 증가시키며, 이는 ChemR23의 트리거링(triggering)이 카스파제-3-의존성 세포자멸사를 초래함을 의미한다.
PMN 및 ROS 시험의 사망률( 도 26c ):
건강한 지원자의 PMN을 10μg/mL의 코팅된 Ab가 들어있는 배양 배지 속에서 24시간 또는 5시간 동안 항온처리한 후 각각 사멸/생존성 키트(LIVE/DEAD(Invitrogen)) 또는 반응성 산소종(ROS)의 특정 마커로 염색하였다. 양성 세포의 비율은 ImageJ 소프트웨어로 사진을 분석하여 얻었다.
결과: 2G1 및 2G1의 모든 사람화된 변이체는 24시간 후 PMN의 사망률을 증가시킨다. 48 시간에서 IgG1 대조군 및 HALA 변이체과 함께 항온처리된 죽은 세포의 퍼센트는 유사하며, 이는 CMKLR1 신호전달을 개시함으로써 항체가 PMN에서 프로그램된 세포 사멸 만을 가속화함을 나타낸다. 2G1 및 2G1의 모든 사람화된 변이체는 PMN의 사멸을 가속화하므로 사람화된 변이체는 프로-분해 특성을 보존한다. 2G1과 HALA 변이체는 5시간 후 PMN에 의한 ROS 생산을 증가시킨다.
도 27b에 도시된 바와 같이, 염증이 유발되면 ChemR23-양성 세포(대식구 및 호중구)의 비율이 증가한다. 그러나, 삼출액에서 호중구의 비율은 항-CMKLR1 항체로 처리된 동물(도 27c; 검은 정사각형)에서 유의하게 감소하지 않는 반면, 삼출액에서 대식구의 전체 퍼센트는 약간 향상되었다(도 27d). 이는 CMKLR1 작용제의 투여가 삼출액 내 골수 세포의 전체 수를 감소시키지 않으며, 주로 염증 부위에서 호중구의 세포자멸사에 영향을 미침을 나타낸다. 도 27e 및 도 27f에 나타낸 바와 같이, CMKLR1의 작용제를 투여하는 경우 죽은 호중구의 퍼센트 뿐만 아니라 이의 사멸은 증가하였다. 이러한 결과는 호중구 집단이 삼출물이 아닌 염증 부위에 영향을 미치기 때문에, CMKLR1의 작용제가 염증 분해시 지연을 치료하는데 있어 긍정적인 효과를 나타낸다.
결론적으로, 염증 부위에서 호중구의 사포자멸사를 유도하는 경우를 제외하고는, 본 발명의 항체를 사용한 치료는 모든 호중구 집단의 세포자멸사를 초래하지 않는다. 이러한 특징은 부작용(들)을 줄이는 데 유리할 수 있다.
실시예 18. 호중구의 이행
호중구는 모집 후 염증 부위로 이주하여, 염증 공정을 개시, 향상 및/또는 지속시킨다.
물질 및 방법
사람 내피세포(HDMEC)를 젤라틴으로 코팅된 트랜스웰에서 24시간 동안 항온처리하고 100U/mL에서 TNF-알파의 존재 또는 염증성 조건의 부재하에 하룻밤 동안 활성화시켰다. 이후에, 건강한 자원자 또는 ANCA 환자들의 PMN을 HDMEC의 단층을 함유하는 트랜스웰에서 4시간 동안 항온처리하였다. 항체(Iso Ctrl 및 2G1)는 이주 검정 4시간 동안 10μg/mL에서 +/-TNF-알파 100U/mL로 가하였다. 트랜스웰의 하부 이주된 부분을 수집하고 계수 비드를 사용하여 유동 세포분석법으로 이주된 PMN을 계수하였다.
결과
2G1로 처리된 호중구는 대조군 화합물로 처리된 세포에 비해 이행 능력이 낮다(도 28a). 2G1은 특히 건강한 자원자와 AIDS 환자에서 PMN과 내피 세포가 TNFa로 활성화되었을 때 염증 조건 하에서 내피 단층을 통한 PMN 이행을 피한다(도 28b). 본 발명의 항체는 호중구의 이행 능력을 감소시키는 능력을 갖는다.
실시예 19 - CD62L 발현
물질 및 방법. 건강한 지원자로부터의 PMN을 10 μg/mL로 코팅한 Ab가 들어있는 배양 배지속에서 상이한 시간 동안 항온처리하고 유동 세포측정법으로 분석한 CD62L 염색을 위해 수집하였다(도 29, 좌측 패널). 본 발명의 항체와 함께 항온처리한 세포에서 CD62L의 세포 표면 발현은 항체의 부재하에서 배양된 세포에 비해 감소된다. 쉐딩에 의해 방출된 CD62L의 가용성 형태는 코팅된 Ab와 함께 항온처리된 PMN의 상층액에서 ELISA에 의해 검출된다. 항-ChemR23 항체로 PMN을 처리하면 동형 대조군 조건에 비해 가용성 CD62L의 농도가 증가한다(도 29, 우측 패널).
실시예 20 - 중피종 모델 생존
CMKLR1의 작용제로 도면의 설명에서 설명한 방법에 따라 처리된 마우스는 대조군 항체로 처리된 마우스보다 더 높은 생존율을 가지므로, 중피종 치료를 위한 본 발명에 따른 화합물의 긍정적 효과를 나타낸다(도 30).
실시예 21 - CRC 모델
도 31a에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항-CMKLR1 항체로 처리된 동물에서 종양 용적은 대조군 항체에 비하여 감소하였다. 일부 경우에, 완전한 차도 또한 관찰되어, CRC 치료용 본 발명에 따른 화합물의 긍정적 효과를 나타낸다. 더욱이, 도 31b에 예시된 바와 같이, 항-CMKLR1 모노클로날 항체(OSE-230)를 사용한 치료는 대변 점수의 감소, 및 종양 수의 감소를 이끈다.
실시예 22 - 자가면역성 뇌수막염 실험 모델
본 모델에서, EAE 모델에서 본 발명의 항체의 치유적 투여는 대조군 항체로 처리된 동물에 비해 중량의 감소를 초래하지 않는다(도 32a). 그러나, 항-CMKLR1 항체로 치료를 수행하면, 질병 점수가 유의적으로 감소한다(도 32b). 항-CMKLR1 항체는, 작용제 화합물로 처리된 동물에서 점수가 약 30% 낮기 때문에, 대조군에 비해 가능한 치료 후 10째에 질병 점수의 큰 개선을 초래한다. 따라서 항-CMKLR1 화합물을 사용한 치료는 자가면역성 뇌수막염 치료에 효과적임이 입증되었다.
실시예 23: CDR 아미노산 잔기의 최적화
IEDB 소프트웨어 및 HLA-II 예측 소프트웨어로 인 실리콘에서 예측된 면역원성에 관련된 아미노산을 대체하기 위해 HDLD 변이체의 중쇄 또는 경쇄에 돌연변이를 거의 추가하지 않았다(NetMHCpanII 방법).
또한, 아미노산의 가능한 많은 돌연변이들 중에서, 발명자들은 생성물의 생물학적 활성에 실질적으로 그리고 부적절하게 영향을 미치지 않는 것 보다 일부 매우 유리한 것을 연구하고 확인하였음이 추가로 강조된다. 전문성은 다음에 설명하는 선택으로 이어진다.
중쇄에서, 아미노산 치환 CDR2 내 D61E(HD-61E, 서열 번호: 89), CDR2 내 R52G(HD-R52G, 서열 번호: 90), 또는 CDR2 내 R52aG, A49S, N52S, Y53S(HEF, 서열 번호: 91)을 달성하여 면역성을 감소시켰다. 경쇄에서, CDR3 내 아미노산 N92를 아미노산 S(LD-N92S, 서열 번호: 92) 또는 Q(LD-T52S, 서열 번호: 93)로 치환하여 해독 후 변형을 방지하였다. CDR2 내 T52S를 또한 치환하여 LD-N92S 변이체에서 면역원성을 감소시켰다. CDR3 내 N92Q 및 CDR2 내 T52S, T55E, 및 골격 2 내 W47L을 치환시켜 LEF 변이체(서열 번호: 55)의 면역원성을 감소시켰다. 서열은 하기 표에 나타낸다:
Figure pct00003
표 3. HDLD 변이체 서열의 최적화된 중쇄 및 경쇄.
다음 예에서 자세히 설명되는 바와 같이, 모든 가능한 조합 중에서, 경쇄 LDT52S, 및 특히 HEF-LDT52S 변이체를 포함하는 항체가 특히 유리하다. 시험한 다른 항체와 비교하여, 면역원성을 낮추기 위해 최적화된 HEF-LDT52S는 생물학적 기능을 유지하면서 높은 결합 활성과 안정성을 나타낸다.
각각의 서열을 사람 면역글로불린의 불변 단편에 융합시키고 포유동물 세포 내에서 동시-형질감염시켜 사람화된 항체를 생산하였다. 결과는 중쇄 및 경쇄의 모든 조합이 항체를 생산함을 나타내었다. 생산성은 포유동물 세포에서 중쇄 및 경쇄의 조합에 따라 상이하게 영향을 받는 것으로 여겨지지만, 항체의 치료학적 적용의 측면에서 항상 효율적인 생산에 적합한 양이다.
실시예 24: 시험관 내에서 생산된 항-CMKLR1 항체의 인식 능력
활성 ELISA 검정을 위해, 당나귀 항-사람 IgG, 특이적인 Fc(Jackson Immunore research; 미국; 참고번호 709-005-098)를 붕산염 완충액(pH 9) 중 1.3μg/ml에서 플라스틱에 고정하고 정제 항체를 가하여 야생형 2G1과 비교하여, BSA 1% 완충액에서의 결합을 측정하였다. 항온처리 및 세척 후, 비오틴화된 항원-특이적인 펩타이드(Biot-C7 펩타이드: 비오틴화된 NH2-PYHTLNLLELHHTAMPGSVFSLGLPLATALAIA-COOH, 신펩타이드에 의해 합성됨, 서열 번호: 60으로 합성)에 이어, 퍼옥시다제-스트렙타비딘(Jackson Immunore research; 미국; 참고번호 016-030-084)을 가하고 통상의 방법으로 나타내었다.
도 33에 나타낸 바와 같이, 2G1에서 유래된 사람화된 항체 가변 도메인 쇄의 조합(중 가변 쇄의 경우: HD는 서열 번호: 43에 상응하며 HEF는 서열 번호: 91에 상응한다; 경 가변 쇄의 경우: LD는 서열 번호: 53에 상응하고; LD-T52S는 서열 번호: 93에 상응하고; LEF는 서열 번호; 55에 상응한다)은 항원-특이적인 펩타이드(C7 펩타이드)에 대한 생식선 항체 HALA 및 야생형 항체 2G1보다 더 우수한 결합 활성을 지닌 사람화된 항체를 생성하였다.
실시예 25: 안정성 검사
각각의 정제된 사람화된 항-ChemR23 항체(HALA, HDLD, HD-LDT52S, HEF-LDT52S, HEF-LEF)를 각각 4℃ 또는 37℃에서 7일간 항온처리하였다. 7일 후, ELISA 검정으로 정제된 항체의 결합을 분석하였고, 겔 여과(Superdex 200 10/300GL, GeHealthcare)로 응집체 형성을 분석하였다.
도 34a에 도시된 바와 같이, 정제된 모든 항체는 37℃, 4℃ 또는 -80℃에서 유사한 결합 활성을 나타내었다. 도 34b에 나타낸 바와 같이, HDLD 및 HEF-LDT52S의 경우 37℃에서 7일 후에도 응집체의 퍼센트는 변하지 않았다.
실시예 26: CCR7 내재화에 대한 생물학적 효과
사람화된 2G1 변이체 HEF-LD-T52S를 플레이트에 고정하였다. 동형 대조군을 대조군으로서 가하였다. 코팅된 플레이트에 48시간 동안 전-염증성 대식구 M1을 가하고, 대식구 표면에서 CCR7 발현을 유량 세포분석법으로 측정하였다.
도 35에 나타낸 바와 같이, 사람화된 2G1 변이체 HEF-LD-T52S는 동형 대조군과 비교하여 전-염증성 대식구(M1) 표면에서 CCR7의 발현을 감소시킬 수 있었다. 사람화된 2G1 변이체 HEF-LD-T52S를 최적화하여 2G1 항체의 면역원성 보존된 기능적 특성을 감소시켰다.
실시예 27: PMN 생존능에 대한 생물학적 효과
건강한 지원자의 PMN을 코팅된 HEF-LDT52S, HEF-LEF 및 HDLD 항체 변이체가 10μg/mL로 들어있는 배양 배지 속에서 24시간 동안 항온처리하고 사멸/생존능 키트(LIVE/DEAD(Invitrogen))로 염색하였다. 양성 세포의 퍼센트는 도를 Fiji 소프트웨어로 사진을 분석함으로써 수득하였다. 동형 대조군을 대조군으로서 가하였다. FcR 수용체(FcR)(HEF-LDT52S N297A)에 결합하지 않는 HEF-LDT52S 항체의 돌연변이된 버전을 또한 가하였다. 도 36에 도시된 바와 같이, 2G1 및 2G1의 모든 HEF-LDT52S, HEF-LEF 및 HDLD 사람화된 변이체는 PMN의 사멸을 가속화하므로 사람화된 변이체는 프로-분해 특성을 보존한다.
사람화된 HEF-LDT52S 변이체를 최적화하여 면역원성을 감소시켰다. 이러한 최적화된 변이체는 생물학적 기능을 유지하면서 높은 결합 활성과 안정성을 유지한다.
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SEQUENCE LISTING <110> OSE IMMUNOTHERAPEUTICS <120> ANTI-CHEMOKIN LIKE RECEPTOR 1 HUMANIZED ANTIBODIES AND THEIR THERAPEUTIC APPLICATIONS <130> IP20224122FR <150> EP19306322.9 <151> 2019-10-09 <150> EP19306323.7 <151> 2019-10-09 <160> 93 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 373 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 1 Met Arg Met Glu Asp Glu Asp Tyr Asn Thr Ser Ile Ser Tyr Gly Asp 1 5 10 15 Glu Tyr Pro Asp Tyr Leu Asp Ser Ile Val Val Leu Glu Asp Leu Ser 20 25 30 Pro Leu Glu Ala Arg Val Thr Arg Ile Phe Leu Val Val Val Tyr Ser 35 40 45 Ile Val Cys Phe Leu Gly Ile Leu Gly Asn Gly Leu Val Ile Ile Ile 50 55 60 Ala Thr Phe Lys Met Lys Lys Thr Val Asn Met Val Trp Phe Leu Asn 65 70 75 80 Leu Ala Val Ala Asp Phe Leu Phe Asn Val Phe Leu Pro Ile His Ile 85 90 95 Thr Tyr Ala Ala Met Asp Tyr His Trp Val Phe Gly Thr Ala Met Cys 100 105 110 Lys Ile Ser Asn Phe Leu Leu Ile His Asn Met Phe Thr Ser Val Phe 115 120 125 Leu Leu Thr Ile Ile Ser Ser Asp Arg Cys Ile Ser Val 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Ser Phe Leu 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Gln Ser Lys Pro Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (21)

  1. 항-케메린 유사 수용체 1(anti-Chemerin Like Receptor 1; CMKLR1), 특히 사람 CMKLR1에 결합하는 항-케메린 유사 수용체 1(CMKLR1) 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 이의 항원-결합 단편의 상기 항체가 다음을 포함하는, 항-케메린 유사 수용체 1(CMKLR1) 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. 3개의 CDR들 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인으로서:
    - VHCDR1은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7로 이루어진 그룹에서 선택되고;
    - VHCDR2는 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12 및 서열 번호: 61로 이루어진 그룹에서 선택되고;
    - VHCDR3은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 이루어진 그룹에서 선택되는, 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및
    b. 3개의 CDR들 VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인으로서:
    - VLCDR1은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
    - VLCDR2는 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택되고;
    - VLCDR3은 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택되는, 항체 경쇄 가변(VL) 도메인.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CMKLR1의 제3의 세포외 루프(EL3), 특히 CMKLR1의 제3의 세포외 루프(EL3) 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합하거나, 또는 아미노산 서열 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 59를 포함하는 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열 서열 번호: 60 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합하는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    CMKLR1의 레졸빈 E1-유사 작용제이고, 특히 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 염증의 프로-분해 인자(pro-resolution factor)의 효과를 가지며, 특히 골수 세포와 상호 작용함으로써 이러한 효과를 가지는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    - VHCDR1은 서열 번호: 3 및 서열 번호: 4로 이루어진 그룹에서 선택되고; 및/또는,
    - VHCDR2는 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11 및 서열 번호: 61로 이루어진 그룹에서 선택되고; 및/또는,
    - VHCDR3는 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15로 이루어진 그룹에서 선택되는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    - VLCDR1은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19 및 서열 번호: 23으로 이루어진 그룹에서 선택되고; 및/또는,
    - VLCDR2는 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹에서 선택되고; 및/또는,
    - VLCDR3은 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹에서 선택되는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40 및 서열 번호: 62로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57 및 서열 번호: 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40 및 서열 번호: 62로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인; 및 서열 번호: 54, 서열 번호: 55 및 서열 번호: 56으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    다음의 CDR: 서열 번호: 4의 VHCDR1, 서열 번호: 12의 VHCDR2, 서열 번호: 13의 VHCDR3, 서열 번호: 19의 VLCDR1, 서열 번호: 26의 VLCDR2 및 서열 번호: 35의 VLCDR3을 포함하는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원- 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    다음의 골격: 서열 번호: 65의 VHFR1, 서열 번호: 67의 VHFR2, 서열 번호: 69의 VHFR3, 서열 번호: 71의 VHFR4, 서열 번호: 72의 VLFR1, 서열 번호: 73의 VLFR2, 서열 번호: 76의 VLFR3, 및 서열 번호: 77의 VLFR4을 포함하는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    시험관 내(in vitro) 및/또는 생체 내(in vivo)에서 CMKLR1-양성 세포에서 베타-아레스틴 신호전달 경로를 활성화하지 않는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    시험관 내(in vitro) 및/또는 생체 내(in vivo)에서 CMKLR1-양성 세포의 유의적인 고갈을 나타내지 않는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    CMKLR1과의 결합에 대해 케메린과 경쟁하지 않고, 및/또는 CMKLR1에 대한 케메린의 결합을 방해하지 않는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    사람화된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며, 특히 여기서 항체 경쇄 불변 도메인은 사람 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유래되고, 특히 여기서 경쇄 불변 도메인은 서열 번호: 79의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 항체 중쇄 불변 도메인은 사람 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 유래되고, 특히 여기서 항체 중쇄 불변 도메인은 특히 사람 IgG1 중쇄 불변 영역으로부터 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 82, 서열 번호: 83 또는 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 특히 여기서 항체 중쇄 불변 도메인은 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 83의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 특히 CMKLR1, 특히 사람 CMKLR1에 특이적으로 결합하는, 키메라, 변형되는, 및 사람화된 항체로 이루어진 그룹에서 선택된, 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    (i) 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12 및 서열 번호: 61에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VHCDR2, 및 (ii) 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16에 나타낸 아미노산 서열 또는 이의 돌연변이된 서열로, 아미노산 잔기(들)이 치환되어 돌연변이된 서열의 1번 및 2번 위치에서의 아미노산 잔기가 각각 L 및 I인 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VHCDR3,을 포함하는 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하고; 및,
    항-CMKLR1 화합물은 CMKLR1의 제3의 세포외 루프(EL3) 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합되고, 특히 화합물은 아미노산 서열 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 59를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열 서열 번호: 60 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합하며; 및
    상기 화합물은, 서열 번호: 37에 상응하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호: 49에 상응하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체와, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 59 또는 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 CMKLR1의 세포외 영역의 제3의 루프(EL3)를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 제16항에 있어서,
    다음의 CDR을 포함하는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    - 서열 번호: 4의 VHCDR1,
    - 서열 번호: 12의 VHCDR2,
    - 서열 번호: 13의 VHCDR3,
    - 서열 번호: 19의 VLCDR1,
    - 서열 번호: 26의 VLCDR2, 및
    - 서열 번호: 35의 VLCDR3.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    다음의 골격: 서열 번호: 65의 VHFR1, 서열 번호: 67의 VHFR2, 서열 번호: 69의 VHFR3, 서열 번호: 71의 VHFR4, 서열 번호: 72의 VLFR1, 서열 번호: 73의 VLFR2, 서열 번호: 76의 VLFR3, 서열 번호: 77의 VLFR4을 포함하는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 제18항에 있어서,
    서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    다음 질환의 예방학적 또는 치료학적 치료에 사용되는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    - 염증 질환, 특히 급성 염증 질환, 만성 염증 질환, 예를 들면, 만성 염증성 폐 질환, 각결막염, 치주질환, 습진, 염증성 창자 질환, 특히 크론 질환이나 대장염, 특히 궤양성 대장염 또는 자발성 대장염, 낭성 섬유증, NASH(비알콜성 간염), 경피증, 항-호중구 세포질 항체 관련 질환, ANCA 관련 질환, 특히 치료의 투여 결과로서, 염증의 분해능(resolution of inflammation)은 향상됨;
    - 자가 면역질환, 예컨대 당뇨병, 특히 제1형 당뇨병, 건선, 루푸스, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 소그렌 증후군, 셀리악 질환, 혈관염, 중증 근무력증, 또는 패혈증, 복막염, 퇴행성 질환, 상처 치유 장애 또는 안구 건조 증후군과 같은 감염성 질환, 특히 치료의 투여 결과로서, 염증의 분해능이 향상됨;
    - 암, 특히 전이성 암, 암종과 같은 고형 또는 액체 암, 특히 간 암종, 특히 유선 암종 또는 결장 암종, 결장직장 암 또는 폐암 또는 중피종 또는 백혈병과 같은 골수암, 특히 암세포가 CMKLR1을 발현하거나 종양의 미세환경이 CMKLR1을 발현하거나 과발현하는 세포에 의해 침입된 암, 특히 치료의 투여 결과로서, 염증의 분해능이 향상됨.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    NASH(비알코올성 지질간염), 경피증, 낭성 섬유증, 또는 항-호중구 세포질 항체-관련 질환(ANCA)을 예방학적 또는 치료학적 치료에 사용되는, 항-CMKLR1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
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