KR20230144932A - 설폰아미드계 화합물을 포함하는 근육질환 개선, 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

설폰아미드계 화합물을 포함하는 근육질환 개선, 치료 또는 예방용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 설폰아미드계 화합물 또는 이의 염을 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 설폰아미드계 화합물 또는 이의 염은 PHF20와 YY1의 발현을 조절하여 근모세포의 분화가 저해되는 것을 방지할 수 있다. 이로 인해, 근육의 감소를 방지 또는 완화 하거나, 근육의 재생을 촉진하고, 근육 증가 및 근 섬유의 비율 변화를 통한 근육의 운동 기능과 균형 능력, 악력 회복능력을 향상시킴으로써, 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료, 근 기능 개선 또는 근육량 개선을 위한 치료제, 식품 또는 사료 등에 효과적으로 사용할 수 있다.

Description

설폰아미드계 화합물을 포함하는 근육질환 개선, 치료 또는 예방용 조성물{COMPOSITION FOR IMPROVING, PREVENTING OR TREATING MUSCULAR DISORDERS COMPRISING SULFONAMIDE-BASED COMPOUNDS}
본 발명은 설폰아미드계 화합물을 포함하는 근육질환 개선, 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
근감소증은 질병과 노화 등에 의해 근육량이 감소하거나 근력이 떨어지는 질환이다. 근육량은 40대 이후부터 점진적으로 감소하며, 70대까지 매 10년마다 8%씩의 감소가 일어난다고 추정되며, 그 이후로는 더욱 급격한 감소가 발생하여 10년마다 15%까지 발생할 수 있다고 알려져 있다.
많은 추적 연구를 통해서 노인에서 발생하는 생리적 변화는 다양하며, 일반적으로 연령이 증가함에 따라 근육량과 골밀도가 동시에 감소한다는 것이 밝혀졌다. 노인성 근감소증(Sarcopenia)은 직접적인 근력 감소를 유발하여 각종 신체 기능의 감소 및 장애로 인해 사망의 위험성을 증가시킬 뿐 아니라, 신진대사의 감소 및 면역력 저하 등 고혈압, 당뇨, 관절염, 비만, 암 등과 같은 대사성 질환의 유병률을 높이는 원인이 되기도 한다. 특히 노인성 근감소증은 80세 이상 노인의 40%에서 발병하고 있어 고령화 시대에 사회·경제적 부담을 늘릴 것으로 예상되는 질환이다.
PHF 20(PHD finger protein 20)은 GLEA2(glioma-expressed antigen 2) 로도 알려진 단백질이다. 최근, PHF 20이 전사인자로서 하위 표적 단백질인 YY1을 조절해 근육 손상 및 근육감소증에 작용한다는 점이 밝혀졌다. 근모세포(C2C12)를 이용해 근육세포 분화 시 PHF20의 발현이 증가하다가 감소하며, 이러한 현상은 근육분화 억제단백질인 YY1의 발현과 같이 조절된다고 보고되었다.
한편, 근감소증의 치료방법으로 크게 3가지를 들 수가 있다. 첫 번째는 운동이다. 운동은 단기적으로 골격근의 단백질 합성 능력을 증가시키며, 노인들의 근육의 힘이나 운동성을 증가시킨다고 보고되고 있다. 그러나 장기적 치료방법에 부적절하다. 두 번째는 약물치료로서 테스토스테론(Testosterone) 또는 아나볼릭 스테로이드(anabolic steroid)의 사용이 가능하나 이는 여성에게는 남성화를 유도하며, 남성의 경우 전립선 증상(prostate symptoms) 등 부작용을 나타낸다. 다른 승인된 처방법으로 DHEA(dehydroepiandrosterone) 와 성장 호르몬이 있는데, SARMs(Selective Androgen Receptor Modulators)을 포함하는 부위에서 치료법으로 가능하다는 연구가 보고된 바 있다. 또한, 식이요법이 치료법으로 알려져 있지만 영양평가에 의하면 영양실조나, 현대 식습관은 적당한 총체질량(total body mass)을 유지하기 위해 부적절하다. 하지만 근감소증에 대한 근본적인 치료제나 개선제가 없는 것이 현실이다.
상기한 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 발명자는 PHF20/YY1를 이용해 구축된 스크리닝 시스템을 이용해서, PHF20 과발현에 의해서 근모세포에서 근육 분화가 저해되는 조건에서, 근육 분화의 저해를 회복 또는 완화할 수 있는 물질을 스크리닝하였다. 이에 따라 선발된 화합물을 이용해서 근육 감소 억제 및 근육 분화를 촉진할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 수단으로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 설폰아미드계 화합물 또는 이의 염을 포함하여 질병의 치료, 경감, 완화 또는 예방에 도움을 줄 수 있는 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 또는 목적하는 증상의 예방, 개선, 경감 또는 완화 시키거나 이에 도움을 줄 수 있는 식품 조성물; 의약외품 조성물; 사료 조성물; 또는 사료 첨가제용 조성물;을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 구체예로, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 설폰아미드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 구체예로, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 설폰아미드계 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근육질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 구체예로, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 설폰아미드계 화합물 또는 이의 염을 포함하는 근육 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, R1은 수소, *-(C=N)-NH2, 아세틸, 또는 C5-6의 아릴 또는 헤테로 아릴이고, 상기 R1은 비치환 이거나, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 및 페닐 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 치환되고, 상기 R2는 -NH2 또는 하기 화학식 1-1로 표시된 화합물이다.
[화학식 1-1]
본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여로 근육질환의 발병을 억제하거나, 근육질환의 정도가 심화되는 억을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "치료", "개선", "경감", 또는 "완화" 란 조성물의 투여로 근육질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "도움을 줄 수 있는"은 본 발명의 조성물을 투여하여 근육질환의 증상을 억제 또는 지연하거나, 근육질환에 의한 증세가 호전되게 하는데 도움을 주거나 도움을 주는 역할을 할 수 있는 것을 의미한다. 치료를 위한 의약품 효과를 증진시키는 보조제로 사용될 수 있고, 건강기능 식품 또는 기능성 식품으로서의 보조제로서 의미를 갖는다.
본 명세서에서 "" 및 "" 는 연결되는 위치를 의미한다.
본 발명의 상세한 설명 및 실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 설폰아미드계 화합물 또는 이의 염을 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 PHF20와 YY1의 발현을 조절하여 근모세포의 분화가 저해되는 것을 방지할 수 있다. 이로 인해, 근육의 감소를 방지 또는 완화 하거나, 근육의 재생을 촉진하여 근 기능 및 근육량을 개선할 수 있어, 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료, 근 기능 개선 또는 근육량 개선을 위한 치료제, 식품 또는 사료 등에 효과적으로 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 근육세포의 분화 양상을 손쉽게 모니터링 할 수 있는 세포주에 HTS(High Throughput Screening) 시스템 구축하는 과정을 보여주는 그림이다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 HTS(High Throughput Screening) 시스템 구축을 위한 스테이블 세포주(stable cell line)를 제조하기 위해서 선발 마커 농도에 따른 PHF20 발현(도 2a) 및 GFP 발현(도 2b)을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 HTS(High Throughput Screening) 시스템 구축을 위한 스테이블 세포주(stable cell line)를 제조하기 위해서 마커 농도와 시간에 따른 GFP 발현을 확인한 결과를 보여주는 형광 사진과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 구축된 HTS 시스템을 이용하여 후보물질을 스크리닝한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine) 처리 시 근모세포의 형성을 저해하는 작용을 억제하는 효과가 있음을 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)의 농도별 근모세포 형성 저해를 억제하는 결과를 바탕으로 IC50 값을 보여주는 그래프이다.
도 7은 C2C12 근육 세포주에 각 화합물에 대한 웨스턴 블럿 분석 결과이다.
도 8a 내지 도 8c는 C2C12-PHF20 inducible 세포주에 독시사이클린(Doxycyclin)을 처리하여 PHF20를 과발현 한 군과 독시사이클린(Doxycyclin)을 처리하지 않은 대조군으로부터 근관(Myotube)으로 분화시켜 분화 4일차에 약물(설폰아마이드계 화합물) 처리 후, 분화 5일차에 근육 기능과 발달에 관여하는 MF20(heavy chain of myosin II)로 염색한 후 근육세포의 분화능력을 확인하기 위한 세포면역형광염색 이미지이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 고령 마우스 모델의 설파살라진의 투여량에 따른 트레드밀 운동력 회복 효과를 확인하기 위해, 각 투여 그룹 별 마우스의 몸무게 변화를 확인한 그래프이다(그래프의 가로축은 투여일을 의미하고, 세로축은 마우스의 무게를 의미한다).
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 고령 마우스 모델의 설파살라진의 투여량에 따른 트레드밀 운동력 회복 효과의 변화를 보여주는 그래프이다(그래프의 가로축은 투여일을 의미하고, 세로축은 추락 시간 감소(latency to fall)를 의미한다).
도 11는 본 발명의 일 실시예에 따른 고령 마우스 모델의 설파살라진의 투여량에 따른 로타 로드(Rota Rhod)의 균형 능력 회복 효과 변화를 보여주는 그래프이다.
도 12a 및 도 12b는 본 발명의 일 실시예에 따른 고령 마우스 모델의 설파살라진의 투여량에 따른 악력(Grip Strength) 회복 효과를 확인한 것으로, 투여량에 따른 뒷다리(2paws)의 악력 회복 변화(12a)와 모든 다리(4paws)의 악력 회복 변화(12b)를 보여준다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 고지방식이 CTX 근감소증 마우스 모델의 설파살라진의 투여량에 따른 트레드밀 운동력 회복 효과를 확인하기 위해, 각 투여 그룹 별 마우스의 몸무게 변화를 확인한 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 고지방식이 CTX 근감소증 마우스 모델의 설파살라진의 투여량에 따른 로타 로드(Rota Rhod)의 균형 능력 회복 효과 변화를 보여주는 그래프이다.
도 15a 및 15b는 본 발명의 일 실시예에 따른 고지방식이 CTX 근감소증 마우스 모델의 설파살라진의 투여량에 따른 따른 악력(Grip Strength) 회복 효과를 확인한 것으로, 투여량에 따른 뒷다리(2paws)의 악력 회복 변화(15a)와 모든 다리(4paws)의 악력 회복 변화(15b)를 보여준다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 벨크로 부상 근감소증 마우스 모델을 촬영한 이미지로, 좌측 이미지는 마우스의 발목부터 종아리에 스포츠 테이프를 감은 후 촬영한 이미지이고, 가운데 및 우측 이미지는 마우스의 발목부터 전체다리에 스포츠 테이프를 감은 뒤 다리 전체를 벨크로로 감아 고정시킨 후 촬영한 이미지이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 벨크로 부상 근감소증 마우스 모델 의 설파살라진의 투여량에 따른 트레드밀 운동력 회복 효과를 확인하기 위해, 각 투여 그룹 별 마우스의 몸무게 변화를 확인한 그래프이다.
도 18a 및 도 18b는 본 발명의 일 실시예에 따른 벨크로 부상 근감소증 마우스 모델의 구축 여부를 확인하기 위해, 약물 투여 전 트레드밀을 뛴 거리(도 18a) 및 시간(도 18b)으로 확인한 그래프이다(도 18a의 가로축은 대조군 거리 대비 상대적 비율(%)을 의미하고, 세로축은 약물 처리군을 의미하며, 도 18b의 가로축은 대조군 시간 대비 상대적 비율(%)을 의미하고, 세로축은 약물 처리군을 의미한다).
도 19a 및 도 19b는 본 발명의 일 실시예에 따른 벨크로 부상 근감소증 마우스 모델의 트레드밀 운동력을 확인하기 위해, 설파살라진의 투여량과 투여일에 따른 그룹별 트레드밀을 뛴 거리(도 19a) 및 시간(도 19b)을 확인한 그래프이다(도 19a의 가로축은 투여일 의미하고, 세로축은 거리를 의미하며, 도 19b의 가로축은 투여일 의미하고, 세로축은 시간을 의미한다).
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 마우스 허벅지에 CTX를 주사한 다음 설파메타진(Sulfamethazine)을 10일간 경구 투여 후 근육 손상 회복을 H&E 염색 후 광학현미경으로 관찰한 사진이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 CTX-유도된 근감소증 마우스 모델에서 설파메타진(Sulfamethazine)을 10일간 경구 투여에 따른 근육 회복 효과를 근육 유형(myosin type I, myosin type IIa, myosin type IIb) 별로 확인하기 위해 형광 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)의 투여량에 따른 로타 로드(Rota Rhod) 균형 능력 회복 효과를 확인하기 위해, 각 투여 그룹 별 마우스의 몸무게 변화를 확인한 그래프이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 로타 로드(Rota Rhod) 균형 능력을 확인하는 방법 및 조건을 나타낸다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)의 투여량에 따른 로타 로드(Rota Rhod) 균형 능력 회복 효과의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)의 투여량에 따른 악력(Grip Strength) 회복 효과를 확인하기 위해, 각 투여 그룹 별 마우스의 몸무게 변화를 확인한 그래프이다.
도 26a 및 도 26b는 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)의 투여량에 따른 악력(Grip Strength) 회복 효과를 확인한 것으로, 투여량에 따른 뒷다리(2paws)의 악력(Grip Strength) 회복 변화(26a)와 모든 다리(4paws)의 악력(Grip Strength) 회복 변화(26b)를 보여준다.
도 27a 내지 27c는 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)의 단회 경구 투여에 따른 독성을 확인한 결과이다:
대조군(control)-PBS 투여;
Group 1 - 설파메타진 100mg/kg;
Group 2 - 설파메타진 500mg/kg;
Group 3 - 설파메타진 1000mg/kg)
도 28a 및 28b은 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)을 경구 투여한 마우스에서 간(liver)에 대한 독성을 확인한 사진이다.
도 29a 및 29b는 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)을 경구 투여한 마우스에서 폐(Lung)에 대한 독성을 확인한 사진이다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)을 경구 투여한 마우스에서 뇌(Brain)에 대한 독성을 확인한 사진이다.
도 31은 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)을 경구 투여한 마우스에서 심장(Heart)에 대한 독성을 확인한 사진이다.
도 32는 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)을 경구 투여한 마우스에서 위(Stomach)에 대한 독성을 확인한 사진이다.
도 33은 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)을 경구 투여한 마우스에서 이자(Pancreas)에 대한 독성을 확인한 사진이다.
도 34는 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)을 경구 투여한 마우스에서 지라(Spleen)에 대한 독성을 확인한 사진이다.
도 35a 및 35b는 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)을 경구 투여한 마우스에서 신장(Kideny)에 대한 독성을 확인한 사진이다.
도 36a 및 36b는 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)을 경구 투여한 마우스에서 소장(small intestine)에 대한 독성을 확인한 사진이다.
도 37a 및 37b는 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)을 경구 투여한 마우스에서 대장(large intestine)에 대한 독성을 확인한 사진이다.
도 38은 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)을 경구 투여한 마우스에서 정소(Testis)에 대한 독성을 확인한 사진이다.
도 39는 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)을 경구 투여한 마우스에서 자궁(Womb)에 대한 독성을 확인한 사진이다.
도 40은 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)을 경구 투여한 마우스에서 각 투여군 별 몸무게 변화를 보여주는 그래프이다.
도 41a 및 41b는 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)을 경구 투여한 후 14일 되는 날, 마우스에서 각 투여군 마우스의 뇌(Brain), 폐(Lung), 심장(Heart), 간(liver), 이자(Pancreas), 위(Stomach), 지라(Spleen). 신장(Kideny), 소장(Small intestine), 대장(Large intestine), 정소(Testis) 및 자궁(Womb) 각각의 무게를 확인한 그래프이다.
도 42a 및 42b는 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)을 단회 경구 투여한 후 14일 되는 날, 마우스의 간에서의 독성을 확인하기 위한 H&E 염색 사진을 나타낸다.
도 43a 및 43b는 본 발명의 일 실시예에 따른 설파메타진(Sulfamethazine)을 단회 경구 투여한 마우스에서 혈중 간 독성, 심장 독성 및 신장 독성 마커의 발현을 확인한 그래프이다.
이하에서, 본 발명을 보다 상세하기 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 설폰아미드계 화합물 또는 이의 염을 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료 용도; 하기 화학식 1로 표시되는 설폰아미드계 화합물 또는 이의 염을 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, R1은 수소, *-(C=N)-NH2, 아세틸, 또는 C5-6의 아릴 또는 헤테로 아릴이고, 상기 R1은 비치환 이거나, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 및 페닐 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 치환되고, 상기 R2는 -NH2 또는 하기 화학식 1-1로 표시된 화합물이다.
[화학식 1-1]
일 구체예에서, 상기 헤테로 아릴의 헤테로 원소는 S, N 및 O 중에서 선택된 하나 이상일 수 있고, 헤테로 원소는 1개 이상 포함될 수 있으며, 1개 이상의 서로 상이한 헤테로 원소가 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 아릴 또는 헤테로 아릴은 피롤, 피라졸, 트리아졸, 옥사졸, 푸란, 이속사졸, 이소티아졸, 이미티아졸, 디아졸, 티아디아졸, 페닐, 피리딘, 피리미딘, 트리아진, 옥사진, 및 티아진으로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 아릴 또는 헤테로아릴은 티아졸, 디아졸, 티아디아졸, 페닐, 피리딘 또는 피리미딘 일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 R1의 치환기는 C1-3 알킬, C1-3 알콕시 및 페닐 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기 일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 R1의 치환기는 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시 및 페닐로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 상기 R1의 치환기는 1개 포함될 수 있고, 서로 동일하거나 다른 치환기가 1개 이상 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 화학식 1의 화합물은 설파살라진(Sulfsalazine), 설파메타진(Sulfamethazine), 설파티아졸(Sulfathiazole), 설파피리딘(Sulfapyridine), 설파페나졸(Sulfaphenazole), 설파미터(Sulfameter), 설파메티졸(Sulfamethizole), 설파구아딘(Sulfaguanidine), 설파아세타아미드 소디움(Sulfacetamide sodium), 설파독신(Sulfadoxin), 설파디메톡신(Sulfadimethoxine), 설파닐아미드(Sulfanilamide) 또는 설파디아진(Sulfadiazine)일 수 있다.
일 구체예로, 본 발명의 화합물의 염은 본 발명 기술분야에서 통상적으로 허용되는 염의 종류를 모두 포함하며, 일 예로, 나트륨염일 수 있다.
일 구체예로, 상기 설파살라진(Sulfsalazine)은 하기 화학식 2로 표시된 화합물일 수 있다.
[화학식 2]
일 구체예로, 상기 설파메타진(Sulfamethazine)은 하기 화학식 3으로 표시된 화합물일 수 있다.
[화학식 3]
일 구체예로, 상기 설파티아졸(Sulfathiazole)은 하기 화학식 4로 표시된 화합물일 수 있다.
[화학식 4]
일 구체예로, 상기 설파피리딘(Sulfapyridine)은 하기 화학식 5로 표시된 화합물일 수 있다.
[화학식 5]
일 구체예로, 상기 설파페나졸(Sulfaphenazole)은 하기 화학식 6으로 표시된 화합물일 수 있다.
[화학식 6]
일 구체예로, 상기 설파미터(Sulfameter)은 하기 화학식 7로 표시된 화합물일 수 있다.
[화학식 7]
일 구체예로, 상기 설파메티졸(Sulfamethizole)은 하기 화학식 8로 표시된 화합물일 수 있다.
[화학식 8]
일 구체예로, 상기 설파구아딘(Sulfaguanidine)은 하기 화학식 9로 표시된 화합물일 수 있다.
[화학식 9]
일 구체예로, 상기 설파아세타아미드(Sulfacetamide)는 나트륨 염 형태로 존재할 수 있고, 보다 더 구체적으로 하기 화학식 10으로 표시된 화합물일 수 있다.
[화학식 10]
일 구체예로, 상기 설파독신(Sulfadoxin)은 하기 화학식 11로 표시된 화합물일 수 있다.
[화학식 11]
일 구체예로, 상기 설파디메톡신(Sulfadimethoxine)은 하기 화학식 12로 표시된 화합물일 수 있다.
[화학식 12]
일 구체예로, 상기 설파닐아미드(Sulfanilamide)는 하기 화학식 13으로 표시된 화합물일 수 있다.
[화학식 13]
일 구체예로, 상기 설파디아진(Sulfadiazine)은 하기 화학식 14로 표시된 화합물일 수 있다.
[화학식 14]
본 발명에서 근육 질환은 근 기능 저하; 근육량 감소; 근육 소모; 또는 근육 퇴화를 유발하거나, 이러한 증상을 심화시키는 질환 또는 증상을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 '근'은 힘줄, 근육을 포괄적으로 지칭하고, '근 기능'은 근육의 수축에 의해 힘을 발휘하는 능력을 의미하며, 근육이 저항을 이겨내기 위하여 최대한으로 수축력을 발휘할 수 있는 능력인 근력, 근육이 주어진 중량에 얼마나 오랫동안 또는 얼마나 여러 번 수축과 이완을 반복할 수 있는지를 나타내는 능력인 근지구력, 단시간 내에 강한 힘을 발휘하는 능력인 순발력을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 '근 기능 개선'은 근육량을 증가시켜 근 기능을 더 좋게 향상시키거나, 손상된 근육의 재생을 촉진하거나 재생력을 향상시키는 것을 말한다.
본 명세서에서 '근육 재생 촉진'은 손상된 근육의 재생이나 회복 시간을 단축 시키고, 활발하게 하여 근육량을 증가시키거나, 근육량이 감소되는 정도를 낮추는 것을 의미한다.
상기 근육 소모 및 퇴화는 유전적 요인, 후천적 요인, 노화 등을 원인으로 발생하며, 근육 소모는 근육량의 점진적 손실, 근육, 특히 골격근 또는 수의근 및 심장근육의 약화 및 퇴행을 특징으로 하나, 근육의 종류에 한정되지 않는다.
일 구체예로, 상기 근육 질환은 근감소증 (sarcopenia), 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 악액질(cachexia) 및 근무력증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 설폰아미드계 화합물 또는 이의 염을 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 근육 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물; 근육 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, R1은 수소, *-(C=N)-NH2, 아세틸, 또는 C5-6의 아릴 또는 헤테로 아릴이고, 상기 R1은 비치환 이거나, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 및 페닐 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 치환되고, 상기 R2는 -NH2 또는 하기 화학식 1-1로 표시된 화합물이다.
[화학식 1-1]
일 구체예에서, 상기 헤테로 아릴의 헤테로 원소는 S, N 및 O 중에서 선택된 하나 이상일 수 있고, 헤테로 원소는 1개 이상 포함될 수 있으며, 1개 이상의 서로 상이한 헤테로 원소가 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 아릴 또는 헤테로 아릴은 피롤, 피라졸, 트리아졸, 옥사졸, 푸란, 이속사졸, 이소티아졸, 이미티아졸, 디아졸, 티아디아졸, 페닐, 피리딘, 피리미딘, 트리아진, 옥사진, 및 티아진으로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 아릴 또는 헤테로아릴은 티아졸, 디아졸, 티아디아졸, 페닐, 피리딘 또는 피리미딘 일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 R1의 치환기는 C1-3 알킬, C1-3 알콕시 및 페닐 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기 일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 R1의 치환기는 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시 및 페닐로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 상기 R1의 치환기는 1개 포함될 수 있고, 서로 동일하거나 다른 치환기가 1개 이상 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 화학식 1의 화합물은 설파살라진(Sulfsalazine), 설파메타진(Sulfamethazine), 설파티아졸(Sulfathiazole), 설파피리딘(Sulfapyridine), 설파페나졸(Sulfaphenazole), 설파미터(Sulfameter), 설파메티졸(Sulfamethizole), 설파구아딘(Sulfaguanidine), 설파아세타아미드 소디움(Sulfacetamide sodium), 설파독신(Sulfadoxin), 설파디메톡신(Sulfadimethoxine), 설파닐아미드(Sulfanilamide) 또는 설파디아진(Sulfadiazine)일 수 있다.
일 구체예로, 본 발명의 화합물의 염은 본 발명 기술분야에서 통상적으로 허용되는 염의 종류를 모두 포함하며, 일 예로, 나트륨염일 수 있다.
일 구체예로, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 PHD20/YY1에 작용하여 근아 세포의 형성이 저해되는 것을 억제함으로써, 근육 조직 내에서 근육이 감소되는 것을 억제하거나 근육의 형성되는 것을 촉진하는 역할을 한다.
일 실시예로서, 본 발명의 설파메타진(Sulfamethazine)이 PHD20/YY1에 작용하여 근아 세포의 형성이 저해되는 것을 억제함으로써 근육 손상을 억제하고, 재생을 촉진하여, 로타 로드(Rota Rhod)의 균형 능력과 악력(Grip Strength) 회복이 근 손상 마우스 대비 우수함을 in vivo에서 확인하였다.
본 발명의 근육 질환 예방 또는 치료용 조성물이 약학적 조성물인 경우, 근육 소모 또는 퇴화로 인한 근육 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 근육 소모 및 퇴화는 유전적 요인, 후천적 요인, 노화 등을 원인으로 발생하며, 근육 소모는 근육량의 점진적 손실, 근육, 특히 골격근 또는 수의근 및 심장근육의 약화 및 퇴행을 특징으로 한다. 이와 관련된 질환의 예로는 근감소증 (sarcopenia), 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 악액질(cachexia) 및 근무력증 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있다. 또한, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들어, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구적인 투여방법으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다. 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 또는 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의 정제를 수득할 수 있다.
단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 또는 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
일 구체예로, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 함유하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS (phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
일 구체예로, 경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 '경피 투여'는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.
일 구체예로, 흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
본 발명의 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 화학식 1의 화합물을 유효량으로 포함할 때 바람직한 근육질환 예방 또는 치료 효과를 제공할 수 있다.
일 구체예에서, 일 구체예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 대상체에게 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 근육 질환의 치료방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 치료방법은 상기 투여 단계 이전에 상기 근육 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서, '치료적 유효량' 또는 '유효량'이라 함은 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 근 기능을 향상시키기에 충분한 양을 말한다. 본 발명의 약학적 조성물은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 0.01 내지 99.99% 포함될 수 있으며, 잔량은 약학적으로 허용 가능한 담체가 차지할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량은 조성물이 제품화되는 형태 등에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 대상체에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 상기 투여 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 대상체의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 대상체에 대한 유효 투여량이 결정될 수 있다. 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 근육질환 예방 또는 치료를 위한 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
상기 "대상체"는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 소 등의 포유류를 의미할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 또한 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 외용제의 제형으로 제공될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물이 피부 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.
다른 일 양태로, 본 발명의 근육 질환 예방 또는 개선용 조성물은 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근육 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 근육 질환 예방 또는 치료용 조성물이 식품 조성물인 경우, 근육 소모 또는 퇴화로 인한 근육 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 근육 소모 및 퇴화는 유전적 요인, 후천적 요인, 노화 등을 원인으로 발생하며, 근육 소모는 근육량의 점진적 손실, 근육, 특히 골격근 또는 수의근 및 심장근육의 약화 및 퇴행을 특징으로 한다. 이와 관련된 질환의 예로는 근감소증 (sarcopenia), 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 악액질(cachexia) 및 근무력증 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 구체예로, 상기 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food), 식품 첨가제(food additives) 또는 사료 등의 모든 형태를 포함하는 의미이며, 인간 또는 가축을 비롯한 동물을 취식대상으로 한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 영양보조제로는 이에 한정되지 않지만 캡슐, 타블렛, 환 등에 본 발명 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 건강기능식품으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 본 발명 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용(건강음료)할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다.
또한, 본 발명 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염과 근육 질환 예방 또는 개선 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 근육 질환 예방 또는 개선용 조성물이 건강음료 조성물로 이용되는 경우, 상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03g이다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염은 근육 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물의 유효성분으로 포함될 수 있는데, 그 양은 근육 질환 예방 또는 개선용 작용을 달성하기에 유효한 양으로 특별히 한정되는 것은 아니나, 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%인 것이 바람직하다. 본 발명의 식품 조성물은 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염과 함께 근육 질환 예방 또는 개선용 조성물에 효과가 있는 것으로 알려진 다른 활성 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또 다른 양태로, 본 발명의 근육 질환 예방 또는 개선용 조성물은 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 근육 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물 또는 사료 첨가용 조성물일 수 있다.
본 발명에서 용어 '사료'는, 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분으로, 본 발명에 따른 근육 질환 예방 또는 개선용 조성물을 유효성분으로 포함하는 사료는 당업계에 공지된 다양한 형태의 사료로 제조가능하며, 바람직하게는 농후 사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.
본 발명에서 용어, '사료첨가제'는 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 포함한다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 A D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 라이신 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
농후사료에는 밀, 귀리, 옥수수 등의 곡류를 포함하는 종자열매류, 곡물을 정제하고 얻는 부산물로서 쌀겨, 밀기울, 보릿겨 등을 포함하는 겨류, 콩, 유체, 깨, 아마인, 코코야자 등을 채유하고 얻는 부산물인 깻묵류와 고구마, 감자 등에서 녹말을 뺀 나머지인 녹말찌꺼기의 주성분인 잔존녹말질류 등의 찌꺼기류, 어분, 물고기찌꺼기, 어류에서 얻은 신선한 액상물(液狀物)을 농축시킨 것인 피시솔루블(fish soluble), 육분(肉粉), 혈분, 우모분, 탈지분유, 우유에서 치즈, 탈지유에서 카제인을 제조할 때의 잔액인 훼이(whey)를 건조한 건조훼이 등의 동물질사료, 효모, 클로렐라, 해조류가 있으나 이에 제한되지 않는다.
조사료에는 야초, 목초, 풋베기 등의 생초(生草)사료, 사료용 순무, 사료용 비트, 순무의 일종인 루터베어거 등의 뿌리채소류, 생초, 풋베기작물, 곡실(穀實) 등을 사일로에 채워 놓고 젖산발효시킨 저장사료인 사일리지(silage), 야초, 목초를 베어 건조시킨 건초, 종축용(種畜用) 작물의 짚, 콩과 식물의 나뭇잎이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 특수사료에는 굴껍데기, 암염 등의 미네랄 사료, 요소나 그 유도체인 디우레이드이소부탄 등의 요소사료, 천연사료원료만을 배합했을 때 부족하기 쉬운 성분을 보충하거나, 사료의 저장성을 높이기 위해서 배합사료에 미량으로 첨가하는 물질인 사료첨가물, 식이보조제가 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 근육질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제는 당업계에 공지된 다양한 사료 제조방법에 따라 적절한 유효 농도 범위에서 본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 첨가하여 제조 가능하다.
중복된 기재를 피하기 위해서, 별도의 언급이 없는 한, 화학식 1 및 약학적 조성물 부분에서 기술한 본 발명 각 구성에 대한 정의 및 설명은 식품 조성물, 사료 조성물에 그대로 준용된다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1. HTS(High Throughput Screening) 시스템 구축
1-1. 세포주 제작
근감소증 제어 물질을 발굴하기 위해서 근육세포의 분화 양상을 손쉽게 모니터링 할 수 있는 세포주에 HTS(High Throughput Screening) 시스템을 구축하였다.
구체적으로, 마우스 정상 근모세포(myoblast) C2C12 세포주는 ATCC (Manassas, VA, USA)로부터 입수하였다. C2C12 세포는 매 2 내지 3일 마다 10% 우태아혈청, 2mM 글루타민, 100 unit/ml 페니실린 및 100ug/ml 스트렙토마이신 (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)이 보충된 DMEM을 포함하는 100 mm 접시에서 계대배양 하였다. 상기 세포들은 가습된 상태에서 5% CO2, 37℃ 조건으로 배양하여 성장시켰다. 실험에 사용되는 동안, 상기 세포들은 추가 분석을 위해 처리 마지막에 회수하였다.
PHF20가 과발현 되어 있는 스테이블 세포(stable cell)인 C2C12 근모세포를 근육분화를 억제하는 YY1의 프로모터와 GFP가 같이 존재하는 플라스미드로 형질 전환하여, 스테이블 세포주(stable cell line)를 제작하였다. GFP 신호가 억제되는 정도를 수치화하여 측정함으로써 근육 분화 정도를 정량적 측정 지표로 활용 하였다(도 1).
1-2. 선발마커(selection marker) 농도에 따른 PHF20 발현확인
근육분화 정도의 정량적 측정 시스템 측정지표로 활용할 수 있는 HTS 시스템이 구축을 하기 위하여, GFP 발현을 위한 선발마커인 하이그로마이신(hygromycin)을 농도별로 처리하여 스테이블 세포주(stable cell line)를 선발하였다.
구체적으로, PHF20와 YY1-promoter-GFP 플라스미드가 형질 전환된 C2C12 세포주에 네오마이신(Neomycin) 1mg/ml, 푸로마이신(Puromycin) 2ug/ml과 함께 각각 하이그로마이신(hygromycin) 150ug/ml(1 Set), 50ug/ml(2 Set) 또는 250ug/ml(3 Set)을 처리하여 완벽하게 형질전환된 세포주 만을 선발하였다. 2일에 한 번씩 배지를 교체해 주며 함께 네오마이신, 푸로마이신 및 하이그로마이신은 각 농도별로 처리하였으며, 약 한달 간 진행하였다.
또한, 각기 다르게 선별된 3가지 타입(150ug/ml(1 Set), 50ug/ml(2 Set) 또는 250ug/ml(3 Set))의 C2C12-PHF20/YY1-promoter-GFP 세포주를 96-well 하얀 플레이트에 0.5 x 105으로 분주하고, 24시간 배양하여, 70% 컨플루언트(confluent) 상태의 세포에 독시사이클린(doxycycline)을 0, 50ng/ml, 250ng/ml, 500ng/ml, 또는 1000ng/ml로 처리한 후, 24시간 배양하였다. 독시사이클린의 농도에 따른 GFP의 형광을 확인하기 위해 세포들을 회수하고, GloMax Microplate readers Explorer (Promega, Madison, Wisconsin, USA)를 이용하여 형광을 확인하였다. Extension 값을 435-488로 설정한 후, 측정하여 GFP의 발광 정도를 정량화하였다.
또한, 웨스턴 블롯 분석을 위해, C2C12 세포들을 얼음에 방치한 다음, 차가운 PBS로 두 번 세척하고 세포 용해 버퍼 (50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 1%(v/v) Nonidet P-40, 250 mmol/L NaCl, 0.1 mmol/L phenyl methyl sulfonyl fluoride, 0.1 mmol/L sodium vanadate, 20 mmol/L β-glycerol phosphate, 2 mmol/L DTT, 1 mmol/L Leupeptin 및 10 mmol/L PNPP)에서 4℃, 30분간 용해시켰다. 그 후 상기 세포용해물을 16,000×g에서 4℃, 20 분간 원심분리 하였다. 그 상층액을 수집하여 SDS-PAGE에 사용하고 소혈청알부민 단백질 분석법으로 단백질 함량을 평가하였다. 단백질들은 β-메르캄토에탄올을 포함하는 샘플 버퍼와 혼합하고 100℃에서 2분간 가열하였다. 40㎍의 각 세포용해물을 10% 폴리아크릴아마이드 겔에서 SDS-PAGE로 분획하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 0.02% Tween 20을 포함하는 TBS(tri-buffered saline)에 녹인 5% 탈지유로 실온에서 1시간 동안 블로킹 시킨 후, 일차 항체(1:1000 희석)로 4℃에서 밤새 반응시켰다. 액틴(1:5000 희석)은 용량 대조군으로 사용하였다. 일차 항체로 반응시킨 후, 5% 탈지유를 포함하는 TBS/Tween-20에 녹여 1:2000 희석된 염소 항-마우스 또는 항-토끼 HRP(horse radish peroxidase)-결합 항체로 실온에서 1시간 동안 반응시키기 전에 블롯들을 TBS/Tween-20에서 4회 세척하였다. TBS/Tween-20에서 세척한 후, 상기 블롯들을 강화된 화학발광 시스템을 이용한 항원 검출에 사용하였다. 단백질들은 ECL-화학발광 키트(GE Healthcare, Life Sciences)로 가시화하였다.
도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 실시예 1-1에서 세포주에서 형광 현미경과 웨스턴 블랏 분석을 이용해서 확인한 결과, 독시사이클린-용량 의존적으로 발명의 세기가 강해지는 것을 확인하였다. 각의 조건에서 발광정도를 취합하여 비교 분석한 결과, 하이그로마이신(hygromycin)을 250ug/ml 처리하는 조건이 가장 효율적이었고, 독시사이클린(Doxycycline)을 250ng/ml 처리하는 조건으로 고정하여 실험을 진행하였다.
1-3. 독시사이클린 농도 및 처리 시간에 따른 효과 확인
C2C12-PHF20/YY1-promoter-GFP 세포주에 독시사이클린(Doxycycline)을 50ng/ml 또는 250ng/ml로 처리, 24시간 후에 형광현미경을 통해 녹색의 발광 정도를 확인하였다.
또한, C2C12-PHF20/YY1-promoter-GFP 세포주에 독시사이클린 250ng/ml을 12, 24, 36, 및 48시간 동안 각각 처리 후 위해 GloMax Microplate readers Explorer (Promega, Madison, Wisconsin, USA)를 이용하여 녹색 발광 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 고정된 독시사이클린 농도(250ng/ml) 조건에서는 반응 시간이 증가할수록 발광 정도가 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 2: 후보물질 스크리닝
2-1. 후보물질 스크리닝
실시예 1에서 구축한 HTS 시스템을 이용하여 물질을 스크리닝 하기 위해 FDA-승인된 약물 라이브러리 (APExBIO, DiscoveryProbe)를 구입하여 총 1670개의 화합물에 대한 GFP 저해 정도를 확인하였다.
구체적으로, 96-well 플레이트에 실시예 1에 따른 C2C12-PHF20/YY1-프로모터-GFP 세포주를 0.5 x 105으로 분주하고 24시간 배양하여 70% 컨플루언트(confluent) 상태의 세포를 대상으로 독시사이클린을 250ng/ml로 처리한 24시간 후, 각 화합물을 최종농도 10uM로 처리하였다. 화합물 처리 24시간 후에 GloMax Microplate readers Explorer (Promega, Madison, Wisconsin, USA)를 이용하여 녹색 발광정도를 확인하였다.
형광의 세기는 6-well 배양 플레이트에 C2C12-PHF20/YY1-프로모터-GFP세포를 4 x 105으로 분주하고 24시간 배양하였다. 그 후, 70% 컨플루언트(confluent) 상태의 세포를 대상으로 독시사이클린을 250ng/ml로 처리한 24시간 후, 설파메타진, 시클로피록스(Ciclopirox), 또는 IOX1을 각각 최종농도 10uM로 24시간 동안 처리하였다. 그 후, GloMax Microplate readers Explorer (Promega, Madison, Wisconsin, USA)를 이용하여 녹색 발광 정도를 확인하였다.
그 결과, 녹색 형광을 감소시키는 효과를 갖는 13종 화합물 설파살라진(Sulfsalazine), 설파메타진(Sulfamethazine), 설파티아졸(Sulfathiazole), 설파피리딘(Sulfapyridine), 설파페나졸(Sulfaphenazole), 설파미터(Sulfameter), 설파메티졸(Sulfamethizole), 설파구아딘(Sulfaguanidine), 설파세트아미드 소디움(Sulfacetamide sodium), 설파독신(Sulfadoxin), 설파디메톡신(Sulfadimethoxine), 설파닐아미드(Sulfanilamide) 및 설파디아진(Sulfadiazine)를 후보물질로 도출하였다(도 4).
2-2. 근모세포 분화 저해 억제능의 정량적 평가
상기 후보 물질 중 하나인, 설파메타진(Sulfamethazine)을 이용해서 효과를 확인하였다. 설파메타진은 Sigma(catalog No.S8876)에서 구입하여 사용하였고, 이를 DMSO에 10mM로 녹여 이후 세포실험에 사용하였다.
설파메타진(Sulfamethazine)의 농도에 따른 근모세포 형성 저해 억제능을 정량적으로 측정하기 위해서, 실시예 1에서 구축한 HTS 시스템에 설파메타진(Sulfamethazine)을 1nM, 10nM, 100nM, 1μM 또는 10μM씩 각각 처리하여 녹색 형광을 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 설파메타진(Sulfamethazine)을 처리하는 농도가 높을수록 형광의 세기가 약해지는 것을 확인하였고, 이는 설파메타진이 PHF20에 작용하여 근모세포 형성을 저해하는 YY1의 발현을 억제함을 가짐을 의미하며, 농도 의존적으로 상기 억제능이 향상됨을 의미한다.
또한, 상기한 실험에서 얻어진 녹색 형광 세기를 바탕으로 설파메타진의 IC50 값이 0.591uM임을 확인하였다(도 6).
또한, C2C12 근육 세포주에 각 화합물을 농도별로 24시간 처리하여 웨스턴 블랏 방법을 통해 단백질의 발현 (PHF20, YY1. MyoD1)을 확인하였다. 각 화합물을 처리한 군에서 PHF20와 YY1의 단백질 발현은 감소하였고, MyoD의 발현이 증가함을 확인하였다(도 7).
2-3. MF 20(Anti-Myosin)염색
12-well 플레이트에 멸균 커버슬립을 넣고, well 당 1×105 C2C12/Tet-On PHF20세포를 플레이팅 한 다음 37℃ 에서 성장시켰다. 세포를 24시간 동안 독시사이클린으로 처리하였다. 24시간 후 5일 동안 DM(HS2%)로 세포 분화를 하였으며, 이때 분화 4일 차에 각각의 설폰아마이드계 화합물을 농도별로 처리하였다. 이후, 분화 5일 차에 세포를 37℃로 PBS로 두 번 세척하고 4% 파라포름알데히드에서 1시간 동안 반응시켜 커버슬립에 고정하였다. 그런 다음 세포를 PBS로 두 번 세척하였다. blocking 전에 세포를 Triton x-100과 함께 PBS에서 30분 동안 반응시켰다. 커버슬립은 1% BSA에서 1시간 동안 실온에서 흔들면서 blocking 하였다. Anti-Myosin(MF20) 항체를 1% BSA에 첨가하고(1:200) 4℃에서 밤새 반응시켰다. 그런 다음 커버슬립을 PBS로 각각 3회 세척하고, 1% BSA에 있는 Alexa fluor 568 이차 항체(1:1000)를 첨가한 후 실온의 어두운 곳에서 혼합하면서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 커버슬립을 PBS로 3회 세척하고 DAPI VECTASHIELD(St. Louis, USA)가 포함된 장착 배지를 사용하여 슬라이드에 장착하고, Zeiss를 이용하여 염색된 세포의 이미지를 촬영하였으며, 이를 도 8a 내지 8c에 도시하였다.
구체적으로, 도 8a는 C2C12-PHF20 inducible 세포주에 독시사이클린(Doxycyclin)을 처리하여 PHF20를 과발현 한 군과 독시사이클린(Doxycyclin)을 처리하지 않은 대조군으로부터 근관(Myotube)으로 분화시켜 분화 4일차에 약물(설파메타진, 설파티아졸, 설파디아진, 설파독신, 설파디메톡신, 설파아세타아미드 소디움, 설파페나졸, 설파미터) 처리한 후, 분화 5일차에 근육 기능과 발달에 관여하는 MF20(heavy chain of myosin II)로 염색한 후 근육세포의 분화능력을 확인하기 위한 세포면역형광염색 이미지이다.
8a는 설파메타진, 설파티아졸, 설파디아진, 설파독신, 설파디메톡신, 설파아세타아미드 소디움, 설파페나졸, 설파미터로 처리했을 때의 근육세포의 분화능력을 확인하기 위한 세포면역형광염색 이미지이고, 8b는 설파메타진, 설파피리딘, 설파닐아미드, 설파메티졸로 처리했을 때의 근육세포의 분화능력을 확인하기 위한 세포면역형광염색 이미지이며, 도 8b는 설파살라진의 농도에 따라 처리했을 때의 근육세포의 분화능력을 확인하기 위한 세포면역형광염색 이미지이다.
실시예 3: 고령 마우스 모델에서 효과 확인
3-1. 고령 마우스 모델 구축 및 트레드밀 적응 실험
48주령 C57BL/6J 수컷 마우스 32마리를 KBSI에서 입수 후 실험 전 2주일 동안 일정한 실온 및 12 h 밤/낮 사이클 하에서 사육하였으며, 마우스는 설치류 표준 식단을 먹이고 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다.
3일간 Grade 0, speed(cm/sec) 15, 10분간, 전기 자극 02 AM ( 전기자극 연속 4회 이상 발생 시 탈진으로 규정) 조건으로 무작위로 트레드밀 적응을 수행하였고, 트레드밀 결과에 따라 유사한 능력을 가진 마우스를 각 그룹으로 분산시켜 그룹별 8마리씩 4군으로 나누었다.
3-2. 고령 마우스 모델의 설파살라진 투여량에 따른 트레드밀 운동력 확인
설파살라진 투여량에 따른 트레드밀 운동력을 확인하기 위해서, 상기 3-1에서 나누어진 마우스를 그룹 1군 PBS (Hyclone Dulbecco’s Phaosphate Buffer saline Cat. SH30028.02), 그룹 2군 설파살라진(Sigma, Cat. Nr S0883. CAS Number 599-79-1) 5mpk, 그룹 3군 설파살라진 50mpk, 그룹 4군 설파살라진 500mpk을 매일 10시 30분에 경구투여를 28일간 하였다. 트레드밀 운동 능력에 대한 오차를 줄이기 위하여 트레드밀 측정 전 3시간 동안 굶긴 후 하기 표 1에 따라 트레드밀을 7일 간격 (0일, 7일, 14일, 28일)으로 4회 수행 하였다.
Grade Time(min) Speed (cm/sec)
0 0 ~ 3 15
0 3 ~ 6 20
0 6 ~ 9 25
0 9 ~ 12 30
0 12 ~ 15 35
0 15 ~18 40
- 전기 자극 02 AM
- 투여 전 0일, 투여 후 7,14, 21, 28일
- 전기자극 연속 4회 이상 발생 시 탈진으로 규정
총 28일 동안, 마우스의 몸무게를 측정하여, 변화가 있는지 확인하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 전 실험 기간 동안 각 그룹별 몸무게 차이는 관찰되지 않았다.
트레드밀 운동력을 확인한 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 설파살라진 투여량이 높을수록 마우스의 트레드밀 운동력이 증가함을 확인하였다((*) p ≤ 0.05 vs G1, (**) p ≤ 0.01 vs G1, (***) p ≤ 0.001 vs G1).
3-3. 고령 마우스 모델의 설파살라진 투여량에 따른 로타 로드(Rota rod)의 균형 능력과 악력(Grip strength) 회복 확인
설파살라진 투여량에 따른 로타 로드의 균형 능력과 악력 회복 효과를 확인하기 위해서, 50주령 C57BL/6J 수컷 마우스에 PBS Group 1군, 설파살라진 5mg/kg Group 2군, 설파살라진 50mg/kg Group 3군, 설파살라진 500mg/kg Group 4군으로 나누어 매일 오전 10시에 경구투여를 28일 동안 하고 몸무게를 측정하였다.
상기 Group 2에 구축된 동물군으로 0, 7, 14, 21, 28일째 되는 날에 다음 표 2와 같은 조건으로 로타 로드를 측정하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다((*) p ≤ 0.05 vs G1). 로타 로드와 동일한 동물군으로 0, 9, 16, 23, 28일째 악력(Grip strength)을 마우스의 두 발, 네 발로 측정하였으며, 그 결과를 도 12a 및 12b에 나타내었다.
Constant test Acceleration
4 rpm in 30 second (mouse standing) 4 - 40 rpm in 300 second (until mouse fall down)
- Wash with 50%EtOH
- Interval 15 min
도 11a 및 도 11b에 나타낸 바와 같이, 설파살라진 용량의 증가와 투여일이 길어질수록 로타 로드에서 마우스의 균형 능력 회복이 향상됨을 확인하였다.또한, 도 12a 및 도 12b에 나타낸 바와 같이, 두 발(2 paw), 네발(4paw) 측정 모두에서 대조군인 Group 1군 대비 설파살라진 용량의 증가에 따라 악력의 향상이 나타났고, 투여일이 길어질수록 악력이 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 고지방식이 CTX-유도된 근감소증 마우스 모델에서 효과 확인
4-1. 고지방식이 CTX-유도된 근감소증 마우스 모델 구축과 몸무게 확인
고지방식이 CTX-유도된 근감소증 마우스 모델을 구축하기 위해서, 19주간 60% HFD 한 23주령 C57BL/6J 수컷 마우스에 카디오톡신(Cardiotoxin; LATOXAN, Portes-l
Figure pat00022
s-Valence, France)를 PBS에 1mg/ml로 녹여 고농도의 스탁 용액(stock solution)을 만들었다. 마우스에 적용하기 위해 최종 농도 0.03mg/ml로 PBS(Hyclone Dulbecco’s Phaosphate Buffer saline Cat. SH30028.02)에 다시 희석하여 사용하였으며, 1ml 주사기(24G)를 이용하여 마우스의 양쪽 사두근 (Quadriceps muscle)에 근육주사 하여 고지방식이 CTX-유도된 근감소증 마우스 모델을 구축하였다.
CTX를 주사하지 않은 고지방식이 마우스에 PBS를 경구투여한 Group 1군, CTX를 주사한 고지방식이 마우스에 PBS를 경구투여한 Group 2군, CTX를 주사한 고지방식이 마우스에 설파살라진 5mg/kg 경구투여 한 Group 3군, CTX를 주사한 고지방식이 마우스에 설파살라진 50mg/kg 경구투여 한 Group 4군, CTX를 주사한 고지방식이 마우스에 설파살라진 500mg/kg 경구투여 한 Group 5군으로 나누어 매일 오전 10시에 경구투여를 14일 동안 하고 몸무게를 측정하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 전 실험 기간 동안 각 그룹별 몸무게 차이는 관찰되지 않았다.
4-2. 고지방식이 CTX-유도된 마우스의 로타 로드(Rota rod)의 균형 능력과 악력(Grip strength)회복 능력 확인
상기 4-1에서 구축된 근감소증 마우스에 CTX를 주사하기 전 측정을 0일로 하고, CTX를 근육에 주사한 4, 8, 12일째 되는 날에 다음 표 3과 같은 조건으로 로타 로드(Rota rod(Harvard & Panlab, LE8205))를 측정하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다. 로타 로드와 동일한 동물군으로 CTX를 주사하기 전 측정을 0일로 하고, 5, 9, 13일째 0, 9, 16, 23, 28일째 되는 날에 악력(Grip strength)을 마우스의 두 발, 네 발로 측정하였으며, 그 결과를 도 15a 및 15b에 나타내었다((*) p ≤ 0.05 vs G2).
Constant test Acceleration
2 rpm in 30 second (mouse standing) 2 - 20 rpm in 300 second (until mouse fall down)
- Wash with 50%EtOH
- Interval 15 min
도 14에 나타낸 바와 같이, CTX 주사한 군 대비 설파살라진 용량의 증가와 투여일이 길어질수록 로타 로드에서 마우스의 균형 능력 회복이 향상됨을 확인하였다.
또한, 도 15a 및 도 15b에 나타낸 바와 같이, 두 발, 네발 측정 모두에서 CTX 주사한 군 대비 설파살라진 용량의 증가에 따라 악력의 향상이 나타났고, 투여일이 길어질수록 악력이 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 벨크로 부상(Velcro injury)으로 인한 근감소증 마우스 모델에서 효과 확인
5-1. 벨크로 부상으로 인한 근감소증 마우스 모델 구축
8주령 C57BL/6J 수컷 마우스의 왼쪽 다리에 아이소플루레인(Isoflurane)으로 마취를 하고 5 cm 스포츠 테이프를 발목 위부터 다리 전체를 감아준 뒤 폭 10 mm의 벨크로(Velcro)를 감아서 고정 시켜 주고, 14일 동안 매일 벨크로 상태를 확인하였다(도 16). 한편, 본 발명에서 벨크로 부상은 벨크로로 근육이 못 움직이게 감아 놓아 이러한 벨크로에 의해 근육의 손상이 일어난다는 것을 의미한다.
5-2. 벨크로 부상으로 인한 근감소증 마우스 모델의 설파살라진 투여량에 따른 트레드밀 운동력 확인
설파살라진 투여량에 따른 트레드밀 운동량을 확인하기 위해서, 부상이 없는 8주령 C57BL/6J 수컷 마우스에 PBS를 경구투여한 Group 1군(n=5), 벨크로 부상을 입은 마우스에 PBS를 경구투여한 Group 2군(n=5), 벨크로 부상을 입은 마우스에 설파살라진 5mg/kg 경구투여 한 Group 3군(n=5), 벨크로 부상을 입은 마우스에 설파살라진 50mg/kg 경구투여 한 Group 4군(n=5), 벨크로 부상을 입은 마우스에 설파살라진 500mg/kg 경구투여 한 Group 5군(n=5)으로 나누어 매일 오전 10시에 경구투여를 14일 동안 하고 몸무게를 측정하였으며, 그 결과를 도 18에 나타내었다. 14일 후 벨크로를 풀고 0, 3, 6, 10, 14일에 트레드밀을 측정하였고, 측정하기 전 3시간 동안 공복 시킨 후, 2분 동안 15cm/sec로 워밍업 시키고, 25cm/sec로 변경 후 탈진될 때까지 1분마다 15cm/sec로 증가시켰다(표 4).
Grade(%) Time(min) Speed (cm/sec)
0 0 ~ 2 15
0 2 ~ 3 25
0 3 ~ 4 26
0 4 ~ 5 27
0 5 ~ 6 28
0 6 ~ 7 29
- 전기 자극 02 AM
- 경사 10°
= 1분당 1cm/sec로 탈진할 때 까지 계속 증가
- 투여 전 0일, 투여 후 3, 6, 10, 14일
- 전기자극 5초 발생시 탈진으로 규정
총 14일 동안, 마우스의 몸무게를 측정하여, 변화가 있는지 확인하였다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 전 실험 기간 동안 각 그룹별 몸무게 차이는 관찰되지 않았다.
벨크로 부상을 입은 마우스와 벨크로 부상을 입지 않은 마우스의 트레드밀 운동력을 확인하기 위해, 도 18a에 나타낸 바와 같이 벨크로를 푼 첫날 트레드밀을 뛴 거리를 비교한 결과 벨크로를 감지 않은 마우스(그룹 1군) 대비 벨크로를 감은 마우스가 그룹(그룹 2군 내지 그룹 5군)별 동일하게 벨크로 부상을 입은 것을 확인하였고, 도 18b에 나타낸 바와 같이 트레드밀을 뛴 시간을 비교하여도 트레드밀을 뛴 거리와 동일한 결과를 확인할 수 있었다.
또한, 도 19a에 나타낸 바와 같이, 벨크로를 푼 날, 3일, 6일, 10일, 14일 각각 트레드밀을 뛴 거리를 비교해 본 결과 벨크로를 감지 않은 비교군 대비 투여 6일차 이후로 설파살라진의 투여량이 높고, 투여기간이 길어질수록 트레드밀 뛴 거리가 증가함을 확인하였다.
또한, 도 19b에 나타낸 바와 같이, 벨크로를 푼 날, 3일, 6일, 10일, 14일 각각 트레드밀을 뛴 시간을 비교해 본 결과 벨크로를 감지 않은 비교군 대비 투여 6일 이후로 설파살라진의 투여량이 높고, 투여기간이 길어질수록 트레드밀 뛴 시간이 증가함을 확인하였다((*) p ≤ 0.05, (**) p ≤ 0.01, (***) p ≤ 0.001).
실시예 6: 근감소증 마우스 모델에서 효과 확인
6-1. CTX-유도된 근감소증 마우스 모델에서 근육 재생 효과 확인
실험동물은 체중 20±3 g의 7주령 수컷 및 암컷 C57BL/6J 마우스를 두열바이오 (Seoul, South Korea)로부터 입수하였다. 상기 마우스는 실험 전 1주일 동안 일정한 실온 및 12 h 밤/낮 사이클 하에서 사육하였으며, 마우스는 설치류 표준 식단을 먹이고 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다.
CTX-유도된 근감소증 마우스 모델을 구축하게 위해서, 카디오톡신(Cardiotoxin; LATOXAN, Portes-l
Figure pat00023
s-Valence, France)를 PBS에 1mg/ml로 녹여 고농도의 스탁 용액(stock solution)을 만들었다. 마우스에 적용하기 위해 최종 농도 0.03mg/ml로 PBS에 다시 희석하여 사용하였으며, 1ml 주사기(24G)를 이용하여 마우스의 양쪽 허벅지 근육에 근육주사 하여 근감소증 마우스 모델을 구축하였다.
이후, 본 발명 설폰아미드계 화합물의 효과를 확인하기 위한 실험에서 CTX-유도된 근감소증 마우스 모델을 이용해 효능을 확인하였다.
6-2. CTX-유도된 근감소증 마우스 모델에서 근육 재생 효과 확인
상기 6-1의 마우스 모델(CTX 투여한 후 24시간 후)에 4uM의 설파메타진을 구강투여하고, 3일, 6일 및 10일 째에 마우스로 근육 조직을 채취하여, H&E 염색을 통해 근육의 분화 정도를 확인하였다.
구체적으로, 마우스 근육 조직 면역 염색을 위해, 비교군과 설파메타진 처리군의 근육 조직을 4% 파라포름알데히드에 고정하고 세척한 후 파라핀에 고정하였다. 약 4 mm 정도 두께로 조직을 자른 다음 슬라이드 고정 후, 근육 타입별 항체를 이용하여 염색하였다.
도 20에 나타낸 바와 같이, 마우스의 근육 조직을 H&E 염색을 통해 근육 분화정도를 확인해 본 결과, 대조군(설파메타진 미투여군)에서는 CTX에 의해 근육이 손상된 상태임을 확인할 수 있는데, 설파메타진을 구강투여한 군에서는 대조군에 비해 근육이 재생됨을 확인하였다. 특히, 설파메타진 처리 후, 3일째부터 근육 재생이 일어나고, 6일째, 10일째에 근육 재생이 빨리 이루어짐과 동시에 근육이 더 조밀함을 알 수 있다.
6-3. 근육 유형별 설파메타진의 효과 확인
상기 6-2와 동일한 방법으로, 마우스에 4uM의 설파메타진을 투여하고, 3일, 6일 및 10일 째에 마우스로 근육 조직을 채취하였다. 상기 근육 조직 샘플에서 미오신 I형(myosin type I, DSHB BA-75), 미오신 IIa형(myosin IIa, DSHB, BF-F3), 및 미오신 IIb형(myosin type IIb, DSHB, SC-71)에 대한 각각의 항체 염색을 통해서(미오신 I형-짙은 파랑; 미오신 IIa형-녹색; 미오신 IIb형-붉은색), 설파메타진의 처리에 의해서 근육 유형별로 근육 손상의 회복이 어떻게 달라지는지를 공초점현미경 (confocal, Leica, Wetzlar, Germany)를 이용하여 확인하였다.
도 21에 나타낸 바와 같이, 설파메타진 처리군에서 대조군 대비 초록색인 미오신 IIa와 붉은 색 미오신IIb 발현 증가를 확인할 수 있었고 6일째는 파란색 염색의 미오신 I 발현이 증가되었고, 10일째의 이미지는 정상 대조군 의 0일과 유사하게 회복되는 것으로 관찰되었다. 이는 CTX-유도된 근감소 마우스(설파메타진 미투여군) 대비 설파메타진 투여군의 근육 손상의 복구가 더 빠름을 의미한다.
6-4. 설파메타진 투여량에 따른 로타 로드(Rota Rod)의 균형 능력 확인
설파메타진 투여량에 따른 균형 능력을 확인하기 위해서, 7주령 수컷 마우스를 10마리씩 그룹으로 나누어 표 5와 같이 실험군을 설정하여 실험을 진행하였다. 구체적으로, CTX 주사 전에 로타 로드를 측정하고, CTX를 주사하고 난 후(0일), 10일간 1회/day로 약물을 구강투여하고, 4일째, 9일째, 14일 째 되는 날에 각각 로타 로드를 측정하였다. 로타 로드의 측정 조건은 도 23에 나타낸 바와 같다.
(-)PBS 그룹 (+)PBS 그룹 50mpk 그룹 100mpk 그룹 500mpk 그룹
CTX-투여 X O O O O
설파메타진 PBS PBS 50mg/kg 100 mg/kg 500 mg/kg
- CTX-투여: 0.03mg/ml, 양쪽 뒷다리 각각 50ul 주사
- 설파메타진 투여 기간: 10일 동안, 1회/day, 구강투여
- 로타 로드 측정: CTX 주사 전, 약물 후 투여 4일, 9일, 및 14일
- 각 그룹당 10마리
- 설파메타진 : Thermo Fisher, Cat. A19276. CAS Number 57-68-1
- 투여 : DMSO 10%와 Cremorphor 12.5%를 혼합한 다음, PBS로 희석하여 투여
총 14일 동안, 마우스의 몸무게를 측정하여, 변화가 있는지 확인하였다. 도 22에 나타낸 바와 같이, 식이 공급이 없었던 10일 째에 모든 그룹에서 몸무게가 감소한 것을 제외하고는, 전 실험 기간 동안 각 그룹별 몸무게 변화는 관찰되지 않았다.
로타 로드의 균형 능력을 확인한 결과, 도 24a 및 24b에 나타낸 바와 같이, CTX주사 후 PBS 투여한 그룹((+)PBS 그룹)에 대비, 설파메타진 투여량이 높을수록 마우스의 로타 로드의 균형 능력이 증가함을 확인하였다. 근감소 유도되지 않은 그룹((-)PBS 그룹)의 경우, 반복된 운동에 따른 로타 로드의 균형 능력 향상이 관찰되는 수준이었으나, 설파메타진 투여군의 경우 용량-의존적으로 균형 능력이 향상되었다.
6-5. 설파메타진 투여량에 따른 악력(Grip Strength) 회복 확인
설파메타진 투여량에 따른 악력 회복을 확인하기 위해서, 7주령 수컷 마우스를 10마리씩 그룹으로 나누어 표 6과 같이 실험군을 설정하여 실험을 진행하였다. 구체적으로, CTX 주사 전에 악력(Grip Strength)을 측정하고, CTX를 주사하고 난 후(0일), 10일간 1회/day로 약물을 구강투여하면서, 4일째, 9일째, 14일 째 되는 날에 각각 악력(Grip Strength)을 측정하였다.
(-)PBS 그룹 (+)PBS 그룹 50mpk 그룹 100mpk 그룹 500mpk 그룹
CTX-주사 X O O O O
설파메타진 PBS PBS 50mg/kg 100 mg/kg 500 mg/kg
- CTX-투여: 0.03mg/ml, 양쪽 뒷다리 각각 50ul 주사
- 설파메타진 투여 기간: 10일 동안, 1회/day, 구강투여
- 로타 로드 측정: CTX 주사 전, 약물 후 투여 4일, 9일, 및 14일
- 각 그룹당 10마리
- 설파메타진 : Thermo Fisher, Cat. A19276. CAS Number 57-68-1
- 투여 : DMSO 10%와 Cremorphor 12.5%를 혼합한 다음, PBS로 희석하여 투여
총 14일 동안, 마우스의 몸무게를 측정하여, 변화가 있는지 확인하였다. 도 22에 나타낸 바와 같이, 식이 공급이 없었던 10일 째에 모든 그룹에서 몸무게가 감소한 것을 제외하고는, 전 실험 기간 동안 각 그룹별 몸무게 변화는 관찰되지 않았다.
악력(Grip Strength) 회복 효과를 확인한 결과, 도 26a 내지 26d에 나타낸 바와 같이, CTX를 주사한 뒷다리(2paws)의 운동력은 CTX주사 후 PBS 투여한 그룹((+)PBS 그룹) 대비, 설파메타진 투여량이 높을수록 마우스의 악력(Grip Strength)이 증가함을 확인하였고, 4다리 모두 악력을 측정한 결과 또한 설파메타진 농도 의존적으로 증가하는 양상을 보였다. 이는 반복된 수준의 균형 능력 향상을 보여주었던 로타 로드의 근감소 유도되지 않은 그룹((-)PBS 그룹)과 마찬가지로, 악력(Grip Strength)에서도 설파메타진 투여군이 용량-의존적으로 악력 회복이 향상됨을 확인하였다.
실시예 7: 단회 경구투여 독성 확인
7-1. 단회 경구투여 독성 확인
체중 20±3 g의 7주령 수컷, 암컷 C57BL/6J 마우스는 두열바이오(Seoul, South Korea)로부터 입수하였다. 상기 마우스는 실험 전 1주일 동안 일정한 실온 및 12 h 밤/낮 사이클 하에서 사육하였으며, 마우스는 설치류 표준 식단을 먹이고 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다. 대조군과 시험군 (100 mg/kg, 500 mg/kg, 1000 mg/kg)으로 나누어 실험을 진행하였으며, 설파메타진은 12.5% DMSO, 12.5% cremophor로 희석하고, 10ml/kg으로 구강투여 하였다.
대조군: PBS (설파메타진 미투여)
Group 1: 100mg/kg (실험군, 설파메타진 투여)
Group 2: 500mg/kg (실험군, 설파메타진 투여)
Group 3: 1000mg/kg (실험군, 설파메타진 투여)
실험기간은 2주 동안 진행되었으며, 매일 1회 이상 일반상태, 사망 유, 무를 관찰하였다. 투여전, 투여후 1일, 3일, 7일, 14일 되는 날 몸무게를 측정하고, 14일 되는 날 부검을 진행하였다.
본 발명에서 단회 경구 투여 독성 시험은 시험물질을 시험동물에 단회투여(24시간이내의 분할 투여하는 경우도 포함)하였을 때 단기간 내에 나타나는 독성을 질적·양적으로 검사하는 시험을 말한다.
구체적으로, 도 27a는 암컷 마우스 및 수컷 마우스의 단회 경구 투여에 따른 독성을 확인하기 위한 전체 마우스를 나타낸 것이고, 도 27b는 수컷 마우스의 장기 적출 전 사진을 나타낸 것이며, 도 27c는 암컷 마우스의 장기 적출 전 사진을 나타낸 것이다.
또한, 두부, 흉강, 및 복강의 모든 장기를 관찰하였으며, 이를 도 28a 내지 도 39에 나타내었다.
구체적으로, 도 28a는 수컷 마우스의 간(liver)을 해부하여 독성을 확인한 사진이며, 도 28b는 암컷 마우스의 간(liver)을 해부하여 독성을 확인한 사진이고, 도 29a는 수컷 마우스의 폐(Lung)를 해부하여 독성을 확인한 사진이며, 도 28b는 암컷 마우스의 폐(Lung)를 해부하여 독성을 확인한 사진이고, 도 30은 수컷 마우스 및 암컷 마우스의 뇌(Brain)를 해부하여 독성을 확인한 사진이며, 도 31은 수컷 마우스 및 암컷 마우스의 심장(Heart)을 해부하여 독성을 확인한 사진이고, 도 32는 수컷 마우스 및 암컷 마우스의 위(Stomach)를 해부하여 독성을 확인한 사진이며, 도 33은 수컷 마우스 및 암컷 마우스의 이자(Pancreas)를 해부하여 독성을 확인한 사진이고, 도 34는 수컷 마우스 및 암컷 마우스의 지라(spleen)을 해부하여 독성을 확인한 사진이며, 도 35a는 수컷 마우스의 신장(Kideny)을 해부하여 독성을 확인한 사진이고, 도 35b는 암컷 마우스의 신장(Kideny)을 해부하여 독성을 확인한 사진이며, 도 36a는 수컷 마우스의 소장(S. intestine)을 해부하여 독성을 확인한 사진이고, 도 36b는 암컷 마우스의 소장(S. intestine)을 해부하여 독성을 확인한 사진이며, 도 37a는 수컷 마우스의 대장(L. intestine)을 해부하여 독성을 확인한 사진이고, 도 37b는 암컷 마우스의 대장(L. intestine)을 해부하여 독성을 확인한 사진이며, 도 38은 수컷 마우스의 정소(testis)을 해부하여 독성을 확인한 사진이고, 도 39는 암컷 마우스의 자궁(Womb)을 해부하여 독성을 확인한 사진을 나타낸 것이다.
또한, 상기 PBS 또는 설파메타진을 구강 투여한 후, 1일, 3일, 7일 또는 14일 되는 날 각 그룹의 수컷 마우스 및 암컷 마우스의 몸무게를 측정한 결과를 도 40에 나타내었으며, 14일 째의 각 수컷 마우스의 조직별 무게를 측정한 결과를 도 41a에 나타내었으며, 암컷 마우스의 조직별 무게를 측정한 결과를 41b에 나타내었다. 각 그룹 별로 조직의 무게에서 특이점은 없었고, 500mpk 그룹의 암컷의 췌장 무게가 감소한 것은, 해부 시 일부 조직의 소실에 의한 것임을 확인하였다.
7-2. 단회 경구투여에 의한 독성의 조직 화학적 평가
실험예 7-1과 같이 단회 경구투여된 마우스를 투여 후 14일 되는 날 해부하여, 조직 화학적 독성을 평가하였다. 해부된 간 조직에 H&E 염색을 통하여 간의 병리학적 관찰을 하였다.
도 42a 및 42b에 나타낸 바와 같이, 수컷 마우스 및 암컷 마우스의 적출된 간에서 독성이 확인되지 않은 것과 마찬가지로, 각 군 간에 특이적인 병리학적 소견이 관찰되지 않았다.
7-3. 혈중 간 독성, 심장 독성, 신장 독성 확인
실험예 7-1과 같이 단회 경구 투여된 마우스에서, 투여 후 14일 되는 날 마우스 심장에서 채혈하고, 혈청을 수집해서 간 독성 마커, 심장 독성 마커, 그리고 신장 독성 마커의 발현을 각각 확인하였다. 구체적으로, 혈액 샘플은 설파메타진을 투여한 후 14일 째 수술 후, 심장에서 수집하였다. 수집한 혈액은 상온에 1시간 두어 응고시켰으며, 원심분리기(13,000 rpm)에 20분간 작동시켜 혈청을 분리하였다. 혈액 분석은 간 독성, 심장 독성, 신장 독성으로 나누어 실시하였으며, 분석은 두열바이오텍 (Seoul, Korea)에 의뢰하여 진행하였다
그 결과 도 43a 및 43b에 나타낸 바와 같이, 설파메타진 투여 군에서 수컷 마우스 및 암컷 마우스의 간 독성, 심장 독성, 그리고 신장 독성과 관련한 특이한 현상은 관찰되지 않았다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 설폰아미드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]

    상기 화학식 1에서, R1은 수소, *-(C=N)-NH2, 아세틸, 또는 C5-6의 아릴 또는 헤테로 아릴이고, 상기 R1은 비치환 이거나, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 및 페닐 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 치환되고, 상기 R2는 -NH2 또는 하기 화학식 1-1로 표시된 화합물이다:
    [화학식 1-1]
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아릴 또는 헤테로 아릴은 티아졸, 디아졸, 티아디아졸, 페닐, 피리딘 또는 피리미딘을 포함하고, 상기 아릴 또는 헤테로 아릴은 비치환 이거나, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 및 페닐 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 치환된 것인, 약학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 C1-3 알킬 및 C1-3 알콕시 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기는 메틸 또는 메톡시인, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1은 하기 화학식 2 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 것인, 약학적 조성물:
    [화학식 2]

    [화학식 3]

    [화학식 4]

    [화학식 5]

    [화학식 6]

    [화학식 7]

    [화학식 8]

    [화학식 9]

    [화학식 10]

    [화학식 11]

    [화학식 12]

    [화학식 13]

    [화학식 14]
  5. 제1항에 있어서,
    상기 근육질환은 근감소증 (sarcopenia), 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 악액질(cachexia) 및 근무력증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
  6. 하기 화학식 1로 표시되는 설폰아미드계 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근육질환 예방 또는 개선용 식품 조성물:
    [화학식 1]

    상기 화학식 1에서, R1은 수소, *-(C=N)-NH2, 아세틸, 또는 C5-6의 아릴 또는 헤테로 아릴이고, 상기 R1은 비치환 이거나, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 및 페닐 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 치환되고, 상기 R2는 -NH2 또는 하기 화학식 1-1로 표시된 화합물이다:
    [화학식 1-1]
  7. 제6항에 있어서,
    상기 아릴 또는 헤테로 아릴은 티아졸, 디아졸, 티아디아졸, 페닐, 피리딘 또는 피리미딘을 포함하고, 상기 아릴 또는 헤테로 아릴은 비치환 이거나, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 및 페닐 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 치환된 것인, 식품 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 C1-3 알킬 및 C1-3 알콕시 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기는 메틸 또는 메톡시인, 식품 조성물.
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 설폰아미드계 화합물 또는 이의 염을 포함하는 근육 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물:
    [화학식 1]

    상기 화학식 1에서, R1은 수소, *-(C=N)-NH2, 아세틸, 또는 C5-6의 아릴 또는 헤테로 아릴이고, 상기 R1은 비치환 이거나, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 및 페닐 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 치환되고, 상기 R2는 -NH2 또는 하기 화학식 1-1로 표시된 화합물이다:
    [화학식 1-1]
  10. 제9항에 있어서,
    상기 아릴 또는 헤테로 아릴은 티아졸, 디아졸, 티아디아졸, 페닐, 피리딘 또는 피리미딘을 포함하고, 상기 아릴 또는 헤테로 아릴은 비치환 이거나, C1-3 알킬, C1-3 알콕시, 및 페닐 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 치환된 것인, 사료 조성물
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 C1-3 알킬 및 C1-3 알콕시 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기는 메틸 또는 메톡시인, 사료 조성물.
KR1020220186355A 2022-04-07 2022-12-27 설폰아미드계 화합물을 포함하는 근육질환 개선, 치료 또는 예방용 조성물 KR20230144932A (ko)

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