KR20230143135A - Cd19+, cd20+ 또는 cd22+ 종양 또는 b-세포 유래 자가-면역질환을 치료하기 위한 car t-세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백혈병 및 림프 악성 종양과 같은 CD19+, CD20+ 또는 CD22+ 종양을 치료하기 위한 강력한 CAR T-세포에 관한 것으로, 상기 종양의 치료법에서 향상된 안전성을 제공하고 CAR+ B-세포 백혈병 블라스트에서 에피토프 마스킹을 방지하며, 상기 CAR T-세포는 CD19-/CAR+, CD20-/CAR+ 또는 CD22-/CAR+ 백혈병 재발의 잠재적인 위험을 감소시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 CAR T-세포는 자가-항체를 생성하는 B 세포에 의해 유발되는 자가면역 질환의 치료에서도 향상된 안전성을 제공한다.

Description

CD19+, CD20+ 또는 CD22+ 종양 또는 B-세포 유래 자가-면역 질환을 치료하기 위한 CAR T-세포

본 발명은 CD19+, CD20+ 또는 CD22+ 종양 또는 자가-항체를 생성하는 B 세포에 의해 유발되는 자가면역 질환을 치료하기 위한 CAR T-세포에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 백혈병 및 림프 악성 종양과 같은 CD19+, CD20+ 또는 CD22+ 종양을 치료하기 위한 강력한 CAR T-세포에 관한 것으로, 상기 종양의 치료법에서 향상된 안전성을 제공하고 CAR+ B-세포 백혈병 블라스트에서 에피토프 마스킹을 방지하며, 상기 CAR T-세포는 CD19-10 /CAR+, CD20-/CAR+ 또는 CD22-/CAR+ 백혈병 재발의 잠재적인 위험을 감소시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 CAR T-세포는 자가-항체를 생성하는 B 세포에 의해 유발되는 자가면역 질환의 치료에서도 향상된 안전성을 제공한다.

CD19에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 환자-유래 T 세포는 재발성/불응성 B-세포 전구체 급성 림프모구 백혈병(Bcp-ALL: B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia) 환자를 위한 새롭고 효과적인 선택지를 나타낸다^1,2. 실제로 최근 두 건의 FDA 신속 심사 승인(각각 렌티바이러스 및 레트로바이러스 플랫폼에 기반한 Novartis의 CD19 표적 CAR T-세포 제품 Kymriah™와 Kite의 제품 Yescarta™)은 이 분야에서 빠른 진전이 이루어지고 있음을 강조하였다. CAR T-세포를 투여한 CD19+ 악성종양 환자에서 보고된 흥미로운 결과^3,4를 고려할 때, 이 치료를 고려하는 환자 수가 지속적으로 증가하여 유전자 변형 제품을 접하게 될 것으로 예상된다. 유전자 조작 기술은 비교적 새로운 기술이기 때문에 CAR T-세포 치료법과 관련된 일부 지가요성 부작용은 아직 예측할 수 없으며 의료 연구자, 기관 및 규제 기관은 유전자 치료법이 가능한 한 안전한지 확인하기 위해 노력하고 있다.

B-ALL의 경우, CAR T-세포 치료법은 신속하고 지속적인 임상 반응을 일으키지만, 널리 퍼지는 데 대한 장벽으로 재발, 사이토카인 방출 증후군(CRS), 표적 외 종양(on-target off-tumor) 효과와 같은 생명을 위협하는 반응이 나타난다.

재발은 높은 초기 완전 관해율에도 불구하고 CAR T-세포 항 백혈병 치료법에서 극복하기 어려운 단계이다. 조기 재발 CD19 양성(또는 또한 조기 재발이 예상되는 CD20/CD22 양성)은 CAR T-세포의 짧은 생체 내 지속성 또는 미세 환경에 의해 유도되는 억제와 관련이 있다. 시간이 지남에 따라 환자 재발의 최대 30%는, 대체 엑손 스플라이싱 또는 유전자 결실로 인해 항원의 손실이 발생하는 CD19 음성 B-ALL 진행이 특징이다. 이 돌연변이는 종양 세포를 강화(armored) CAR-T에 다시 보이지 않게 만든다⁵.

CRS는 치명적일 수 있는 기타 합병증 중 내장 또는 혈관 내피 손상, 심부전 및 호흡 곤란을 유발하는 염증성 사이토카인의 과도한 분비 및 다수의 T 세포의 활성화를 특징으로 하는 면역 매개 장애이다⁶.

표적 외 종양은 종양 관련 항원을 발현하는 정상 조직에 대한 CAR-T 세포의 반응성으로 인한 것이다. 따라서, 표적 항원은 종양 외 표적을 감소시키기 위해 가능한 한 특이적이어야 한다.

CAR.CD19 T 세포 치료의 경쟁에서, 환자에서 T 세포의 종양 외 작용은 장기적인 B 세포 무형성증(aplasia)과 관련이 있다⁷.

안전성 요점으로서, CAR 작제물을 수정하여 입양 이식된 T 세포를 선택적으로 제거하는 것은 이 접근법의 성공적인 임상 이행을 위한 중요한 단계가 되고 있다.

자살 유전자의 포함은 심각한 독성 발생 시 추가적인 안전 조치를 제공한다.

유전자 변형 T 세포의 항체-의존적 고갈 메커니즘을 매개하는 세포 독성 전구 약물(HSV-TK) 또는 표면 분자(CD20, EGFR)를 활성화하는 형질도입 효소의 유전적 통합에 기반한 여러 스위치가 개발되었다^8,9.

자살 유전자 유도성 카스파제 9(iC9)의 임상적 사용은 GVHD 또는 CRS 제어를 개선하기 위해 기증자의 림프구를 변형시킨 일배체 조혈 줄기 세포(haplo-identical hematopoietic stem cell) 이식을 받은 환자에서도 보고되었다. AP1903 약물의 주입은 iC9 이합체화 활성화를 통해 세포 사멸을 시작한다^10,11.

CAR T 세포 분야에서, 2세대 CAR.CD19를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터를 기반으로 한 유전자 조작을 통해 얻은 환자-유래 의약품(DP)에서 백혈병 클론형의 존재가 보고되었다. 구체적으로, CD19-음성, CAR.CD19-발현 B 백혈병이 재발한 두 명의 Bcp-ALL 환자가 보고되었다. 이러한 관찰은 CAR T-세포 제조 동안 2세대 CAR.CD19 렌티바이러스를 사용한 의도치 않은 백혈병성 B 세포 형질도입으로 해석할 수 있다. 이 백혈병 클론은 이종이식 모델에서 CAR.CD19 T 세포 사멸에 내성이 있는 것으로 나타났다¹². 기본적으로 표준 CAR.CD19 T 세포 주입을 받은 환자들의 임상 실무에서 CAR.CD19를 발현하는 백혈병이 재발한 환자들의 사례가 발견되었다. 동일한 CAR+ 백혈병에서, CAR 자체의 B 세포 백혈병에 대한 마스킹 효과 때문에 표적 항원 CD19가 더 이상 검출되지 않았다.

17개의 추가 주입 제품에 대한 차세대 면역글로불린 중쇄 서열 분석(NGIS)에서도 6개의 추가 제품(35%)에서 백혈병 클론형이 확인되었다.

시험관 내 및 생체 내 실험에서 이러한 CAR+ 백혈병 세포 클론은 CAR.CD19 T-세포에 의해 사멸되지 않는 것으로 증명되었다¹². 따라서, CAR T-세포 접근법은 CD19-/CAR+ 백혈병 재발의 잠재적인 위험을 드러냈다. 한 연구에 따르면 CAR+ 백혈병 세포 클론은 항-CAR.CD19 이디오타입 CAR에 의해 제어될 수 있다¹³. 이 접근법에 따르면 각 환자에 대해 CAR-T 세포와 항 CAR 세포 양자 모두를 생성해야 하므로 결과적으로 비용이 증가한다.

현재 자가면역 질환의 치료는 주로 비스테로이드성 항염증 약물, 항말라리아 약물, 글루코코르티코이드, 및 장기 기능장애를 갖는 중증 증상에 대한 면역억제제의 사용에 의존하고 있다. B 세포가 이러한 질환의 발병기전에서 중심적인 역할을 하기 때문에 최근 많은 B-세포-지향 면역요법이 개발되었다. 그러나 이러한 치료법은 혈청학적으로 활동성 질환을 가진 SLE 환자의 하위 그룹에서 소폭의 성공만을 보였다. SLE에 대한 최초의 표적 생물학적 치료제인 항-BAFF(B-세포-활성화 인자) 제제 벨리무맙은 미국 식품의약국과 유럽 의약품청의 승인을 받았지만 미경험(naive) B 세포를 부분적으로만 고갈시킬 수 있다. 이와 대조적으로, 타발루맙과 블리시비모드인 두 가지 다른 BAFF-차단제는 SLE 치료를 위한 임상 시험에서 부정적인 결과를 나타냈다. CD20에 대한 항체인 리툭시맙은 B 세포를 더 효율적으로 고갈시킬 수 있지만, SLE 환자의 반응률은 연구마다 매우 다양하다. 리툭시맙 치료 후의 질환 재발은 여전히 문제로 남아 있다. CD19, CD20 및 CD22 발현으로서의 B 세포 마커는 B-세포 분화의 모든 단계에 걸쳐 높은 수준으로 유지된다. 따라서, B 세포 마커는 이들 환자에서 보다 효율적이고 오래 지속되는 치료 반응을 달성하기 위한 좋은 표적으로 간주된다. 이러한 이유로 항-CD19 키메라 항원 수용체를 발현하는 자가 T 세포의 이식은 세 명의 SLE 환자를 치료하는 데 사용되었다(DOI: 10.1056/NEJMc2107725).

CAR T 주입으로 혜택을 받을 수 있는 환자 수가 증가함에 따라 유전자 치료 접근법의 안전성 수준을 높이는 것이 의무화되고 있다.

따라서 상기 관점에서, 알려진 CAR T 세포의 단점을 극복할 수 있는 CD19, CD20 및 CD22를 표적으로 하는 CAR T 세포를 추가로 제공해야 할 필요성이 분명해졌다.

이 경쟁에서 본 발명의 목적은 CD19, CD20 및 CD22를 표적으로 하는 CAR T 세포 유전자 치료법의 안전성을 높이는 것이다.

이러한 목표는 암 치료법과 관련이 있을 뿐만 아니라 전신 홍반성 루푸스(SLE), 전신 경화증(SSc), ANCA 연관 혈관염(AAV), 피부근염(DM)을 제한없이 포함하는 자가-항체를 생성하는 B 세포에 이해 유발된 자가면역 질환을 갖는 환자에게 CAR T-세포를 사용할 때에도 관련이 있다.

본 발명에 따르면, 짧은 링커를 포함하는 CAR은 원치 않는 CAR+ 종양 B 세포를 인식하고 사멸시킬 수 있기 때문에 표준 형태의 CAR에 비해 보안 수준이 향상된 분자라는 것이 이제 밝혀졌다.

본 발명에 따르면, 백혈병 세포가 풍부한 환자-유래 물질(골수-유래 세포뿐만 아니라 백혈병 블라스트의 45% 초과를 갖는 말초 혈액)로부터 CAR T-세포 생산을 시작한 경우에도, CAR+ 백혈병 B 세포 생성의 드문 경우에 보호를 제공할 수 있는 새로운 CAR CD19, CD20 또는 CD22 설계가 이제 제공된다.

실험 결과는 본 발명의 CAR 설계가 원치 않는 CAR+ 백혈병 세포의 잠재적인 생성을 인식하고 사멸시킬 수 있는 CAR.CD19 T 세포를 제공한다는 것을 보여준다.

구체적으로, 시험관 내 연구는, 긴 힌지(LH)를 갖는 것 외에 짧은 링커(SL) 벡터를 특징으로 하는 본 발명의 CAR.CD19(iCas9CAR.CD19SL-LH)로 형질도입된 CD19+ 백혈병 세포는 표적 항원 CD19의 발현이 감소되었으나 무효화되지 않아 시험관 내 및 생체 내에서 CAR.CD19 T 세포에 의해 인식될 수 있다는 것을 보여주었다.

실험 결과는 본 발명의 CAR.CD19가 백혈병 블라스트의 심한 오염을 특징으로 하는 생물학적 물질로부터 생산이 시작되는 경우에도 시험관 내 및 생체 내 실험 양자 모두에서 CAR+ 백혈병 세포를 제어할 수 있다는 것을 보여준다.

본 발명에 따르면, 환자-유래 출발 물질(SM)의 백혈병 오염의 높은 비율이 CAR T-세포 의약품(DP)에 미치는 영향도 평가되었다. 그 결과, SM에서 다수의 CD19+ 세포의 존재가 DP의 형질도입 수준에 영향을 미치지 않았지만, 그뿐만 아니라 SM이 CD19+ B 백혈병 세포 오염의 45% 이상을 가질 때 최종 회수율에도 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 면역글로불린(Ig)-재배열에 대한 세포형광 분석 및 분자 생물학으로 DP를 심층적으로 특성화한 결과, DP의 B세포 오염 수준은 SM의 CD19+ 세포 비율과 상관관계가 없는 것으로 나타났다.

따라서, B 백혈병 세포가 매우 풍부한 환자 유래 물질을 사용하면 백혈병 세포가 상당히 오염된 CAR T-세포 생성물이 생성된다는 증거가 제공된다.

본 발명에 따르면, 순환 블라스트의 비율이 높은 환자(진단 또는 재발 시 출발 물질에서 높은 수준의 B 세포 오염 가능성을 높이기 위해)로부터 분리된 말초 혈액 단핵 세포는 2세대 CAR.CD19.41bb 분자를 운반하는 γ-레트로바이러스 벡터로 유전적으로 변형되었다. Ig 재배열(분자 MRD)에 대한 정량적 PCR을 적용함으로써, 출발 물질에 존재하는 CD19+ 백혈병 세포의 비율과 DP의 MRD 사이에 통계적 상관관계가 없는 상태에서, CAR T-세포 생성물의 50%에서 B-세포 오염이 관찰되었다. 분자 분석의 민감도보다 낮은 수준의 B 세포가 검출된 CAR T-세포 샘플에서, EuroFlow 유세포 분석 플랫폼은 실제로 또한 CAR.CD19의 존재에 대해 양성으로 염색된 상당한 비율의 오염된 B 세포의 존재도 감지할 수 있었다.

본 발명에 따르면, 실시예에 나타낸 바와 같이, 짧은 링커를 갖는 CAR.CD19 벡터로 유전자 변형된 B 백혈병 세포주는, CD19 항체의 완전한 음성 결합을 나타내는 긴 링커를 갖는 CAR.CD19를 발현하는 B 세포주에서 관찰된 것과 비교하여, CD19 MFI가 상당히 감소하면서, CD19가 세포형광 분석에 의해 여전히 검출 가능함을 나타낸다.

기능 분석을 통해 다음이 확인되었다:

본 발명의 CAR.CD19 T 세포는 시험관 내 공동 배양에서 CAR+ 백혈병 세포주를 제거할 수 있었다.

마지막으로, 생체 내 모델은 위에서 언급한 시험관 내 데이터를 검증한다.

본 발명에 따른 CAR.CD19는 또한 작제물 내에 자살 유전자 유도성 카스파제 9(iC9)를 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 자살 유전자 iC9와 프레임 내에서 클로닝된 바이시스트로닉(bicistronic) 벡터인 iC9.CAR.CD19를 코딩하는 γ-레트로바이러스 벡터가 사용되었다.

따라서, CAR+ B 세포 백혈병은 CAR.CD19 T 세포의 전신 주입 또는 자살 유전자 유도성 카스파제 9(iC9)를 활성화하는 AP1903의 투여에 의해 생체 내에서 제어될 수 있었다.

실제로, AP1903(리미듀시드)은 불활성 소형 생체분자이며, 이는 작제물의 FK-결합 단백질 도메인의 이합체화를 유도하여 iC9-매개 카스파제 캐스케이드를 활성화할 수 있다¹⁰. T-세포 고갈된 동종이식을 받은 후 iC9로 형질도입된 기증자 T 세포를 이식 후 주입받은 환자에서 수행된 중심 연구에 따르면, AP1903 투여가 화학적으로 유도된 이합체화를 촉발하고 말초 혈액과 중추 신경계(CNS) 양자 모두에서 유전자 변형 T 세포를 제거하여 GVHD 및 CRS의 빠른 해소(resolution)를 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, AP1903의 단일 용량에 의한 iC9 활성화는 자살 유전자를 운반하는 T 세포의 신속하면서도 장기적인 제어를 생성한다¹¹.

아래 실시예에 설명된 바와 같이, CD19+ 종양 세포주는 CAR+ 백혈병 클론형을 재생산하기 위해 iC9.CAR.CD19를 코딩하는 바이시스트로닉 벡터로 유전적으로 변형되었다. 시험관 내 실험은, AP1903에 노출시켜 iC9을 활성화하면 CAR+ 백혈병 세포를 제거할 수 있음을 보여주었다. 구체적으로, AP1903으로 처리된 iC9.CAR+ 백혈병 세포주에 대한 세포형광 분석은, 배양에서 생존한 남아있는 세포가 비처리 세포에 비해 CAR의 발현이 크게 감소하는 특징이 있지만 여전히 검출 가능한 CAR MFI 임계값을 가지고 있었음을 보여준다. 보다 민감한 분자 분석은, iC9 활성화가 치료 후 잔류 세포 사이에서 전이유전자 검출의 상당한 감소와 관련이 있으며, AP1903 치료 후 생존한 백혈병 B 세포가 낮은 잔류 VCN 임계값을 나타냈음을 보여준다.

이러한 데이터를 통해 AP1903 치료가 iC9 발현 수준이 낮은 세포를 보존하면서 대부분의 iC9+ 세포를 제거하는 데 매우 효율적이라는 것을 보여주는 시험관 내 증거^14,15 및 생체 내 증거¹⁶ 양자 모두에서 여러 가지가 확인되었다. 실제로, 유전자 변형 T 세포의 경우, GVHD를 치료하기 위해 HSCT를 받은 후 일배체 iC9-T 세포 주입을 받은 환자들은 AP1903 투여 후 1%의 잔류 iC9-T 세포를 나타냈다. 잔류 iC9+ T 세포는 전이유전자의 상당하게 희미한 발현이 특징이었는데, 이는 아마도 낮은 수준의 T 세포 활성화와 관련이 있을 수 있다. 실제로, AP1903을 반복 투여하는 동안 T-세포 활성화에 의해 iC9+ T 세포 제거가 향상될 수 있었다¹⁶. 이와 대조적으로, 종양 세포에서 iC9가 발현되는 경우, AP1903은 대량으로 빠른 세포 사멸을 유도하여 상당한 생체 내 종양 제어로 이어질 수 있다^14,15.

본 발명의 맥락에서, iC9.CAR.CD19 유전자를 인코딩하는 레트로바이러스 벡터에 의해 백혈병 세포의 유전적 변형이 발생할 가능성이 희박한 경우, AP1903 노출에 생존하는 백혈병 세포는 표면에서 높은 CAR 발현이 결여되어, 그 결과 WT 백혈병/림프종 세포와 동일한 정도로, CAR.CD19 동종이형 NK 세포 및 CAR.CD19 T-세포 양자 모두에 의해 높은 효율로 CD19 항원을 표적으로 할 수 있다.

또한, 본 발명의 맥락에서, CAR 설계는 또한 CAR.CD19 T 세포의 항-백혈병 활성을 실질적으로 변형시키지 않으면서 CAR.CD19 T 세포가 CAR+ 백혈병 세포를 인식하고 사멸시키는 능력을 조절하는 관련 인자이다. 실제로, CAR.CD19SL/LH 또는 SL/SH T 세포는 시험관 내 및 생체 내 모델 양자 모두에서 기존의 CAR.CD19LL/SH T 세포와 동일한 정도로 상당한 항-백혈병 활성을 발휘한다. 그럼에도 불구하고, 백혈병 B-세포주의 동일한 세포막에서 CD19와 짧은 링커 CAR.CD19가 CIS로 발현되는 경우, 이들 후자는 야생형 B 세포에 비해 CD19 MFI가 상당히 감소하고, CD19가 유세포 분석에 의해 여전히 검출 가능한 것으로 나타났는데, 이는 항원의 완전한 CIS 마스킹이 이루어지지 않았음을 시사한다.

따라서, 본 발명의 구체적인 목적은 N-말단에서 C-말단으로,

a) 신호 펩타이드,

b) 항 CD19 단일 사슬 항체 도메인, 항 CD20 단일 사슬 항체 도메인 또는 항 CD22 단일 사슬 항체 도메인으로 구성된 군에서 선택되되, 링커에 의해 서로 연결된 VL 및 VH 서열을 포함하거나 또는 구성되는 단일 사슬 항체 도메인,

c) 힌지,

d) 막투과 도메인,

e) 공동-자극 신호전달 도메인, 및

f) CD3제타 사슬 서열

을 포함하거나 또는 구성되는 키메라 항원 수용체이며,

여기서, 상기 링커는 7 내지 14개의 길이(즉, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 아미노산 길이), 예를 들어 7 내지 12개 또는 7 내지 10개 또는 8개 아미노산 길이를 갖는 짧은 가요성 링커이다.

명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, scFv는 예를 들어 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단과 관련하여 임의의 순서로 VL 및 VH 가변 영역을 가질 수 있으며, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 항 CD19 단일 사슬 항체 도메인은 항 CD19 FMC63 하이브리도마 VL 및 VH 서열을 임의의 순서로 포함할 수 있으며, 여기서 항 CD19 FMC63 하이브리도마 VL 서열은 CDR1 서열 QDISKY(서열번호 1), CDR2 서열 HTS 및 CDR3 서열 GNTLP(서열번호 2)를 포함하는 한편, 항 CD19 FMC63 하이브리도마 VH 서열은 CDR1 서열 GVSLPDYG(서열번호 3), CDR2 서열 IWGSETT(서열번호 4) 및 CDR3 서열 AKHYYYGGSYAMDY(서열번호 5)를 포함하고;

항 CD20 단일 사슬 항체 도메인은 항 CD20 VL 및 VH 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 항 CD20 VL 서열²²은 CDR1 서열 SSVSY(서열번호 6), CDR2 서열 ATS 및 CDR3 서열 QQWTSNPPT(서열번호 7)를 포함하는 한편, 항 CD20 VH 서열은 CDR1 서열 GYTFTSYN(서열번호 8), CDR2 서열 IYPGNGDT(서열번호 9) 및 CDR3 서열 ARSTYYGGDWYFNV(서열번호 10)를 포함하고;

항 CD22 단일 사슬 항체 도메인은 항 CD22 VL 및 VH 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 항 CD22 VL 서열은 CDR1 서열 QSLANSYGNTF(서열번호 11), CDR2 서열 GIS 및 CDR3 서열 LQGTHQP(서열번호 12)를 포함하는 한편, 항 CD 22 VH 서열은 CDR1 서열 GYRFTNYWIH(서열번호 13), CDR2 서열 INPGNNYA(서열번호 14) 및 CDR3 서열 TR을 포함한다.

본 발명에 따르면, 항-CD19 FMC63 하이브리도마 VL 서열은 서열

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT(서열번호 15)

를 포함하거나 또는 구성될 수 있고,

항-CD19 FMC63 하이브리도마 VH 서열은 서열

EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS(서열번호 16)

를 포함하거나 또는 구성될 수 있으며;

항-CD20 VL 서열은 서열

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK(서열번호 17)

를 포함하거나 또는 구성될 수 있고,

항-CD20 VH 서열은 서열

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA(서열번호 18)

를 포함하거나 또는 구성될 수 있으며;

항-CD22 VL 서열은 서열

DVQVTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLANSYGNTFLSWYLHKPGKAPQLLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGTHQPYTFGQGTKVEIK(서열번호 19)

를 포함하거나 또는 구성될 수 있고,

항-CD22 VH 서열은 서열

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYRFTNYWIHWVRQAPGQGLEWIGGINPGNNYATYRRKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTREGYGNYGAWFAYWGQGTLVTVSS(서열번호 20)

를 포함하거나 또는 구성될 수 있다.

VL 및 VH 서열을 연결하는 링커는 (G4S)2 링커 GGGGSGGGG(서열번호 35), G4SG2 링커 GGGGSGG(서열번호 37) 또는 G3SG4 링커 GGGSGGGG(서열번호 38), SG4SG3 링커 SGGGGSGGG(서열번호 186), (SG4)2 S 링커 SGGGGSGGGGS(서열번호 187), (SG4)2 SG 링커 SGGGGSGGGGSG(서열번호 188), (SG4)2 SG3 링커 SGGGGSGGGGSGGG 링커(서열번호 189), (SG4)2 SGGGGSGGGG(서열번호 190), (SG4)2 SG2 SGGGGSGGGGSGG(서열번호 191)와 같은 짧은 가요성 글리신 풍부 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 G3SG4 링커이다.

특정 구현예에 따르면, 상기 힌지는 하기 힌지 중 하나 이상을 포함하거나 또는 구성될 수 있으며:

CD8stalk

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(서열번호 21)(뉴클레오타이드 ID 번호 M12828.1 및 단백질 ID 번호 AAB04637.1);

힌지 CD28 EVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(서열번호 22)(뉴클레오타이드 ID 번호 AJ517504.1 및 단백질 ID 번호 CAD57003.1);

힌지 CH2-CH3(UNIPROTKB:P01861)

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 23); 또는

힌지 CH3(UNIPROTKB:P01861):

ESKYGPPCPSCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 24),

바람직하게는 CD8stalk이다.

본 발명에 따르면, 힌지는 제2 링커(또는 어댑터)에 의해 단일 사슬 항체 도메인에 연결될 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 힌지는 N 말단에서, 추적 가능한 마커에 연결될 수 있으며, 상기 추적 가능한 마커는 선택적으로 제2 링커(또는 어댑터)에 의해 단일 사슬 항체 도메인에 연결되고, 즉 제2 링커(또는 어댑터)는 단일 사슬 항체 도메인과 추적 가능한 마커를 연결한다. 예를 들어, 제2 링커(또는 어댑터)는 예를 들어 GS와 같은 디펩타이드일 수 있다.

본 발명에 따르면, 추적 가능한 마커는

ΔCD34 ELPTQGTFSNVSTNVS(서열번호 25)(뉴클레오타이드 ID 번호 AB238231.1 및 단백질 ID 번호 BAE46748.1); 또는

NGFR

KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN(서열번호 26)(뉴클레오타이드 ID 번호 AK313654.1 및 단백질 ID 번호 BAG36408.1)

로 구성된 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 ΔCD34이다.

본 발명에 따르면, 힌지 CD8stalk는 추적 가능한 마커 ΔCD34에 연결될 수 있다.

막투과 도메인은 CD28TM FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(서열번호 27)(뉴클레오타이드 ID 번호 BC112085.1 및 단백질 ID 번호 AAI12086.1) 또는 CD8aTM IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(서열번호 28)(뉴클레오타이드 ID 번호 NM_001768.6 및 단백질 ID 번호 NP_001759.3)로 구성된 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 CD8aTM이다.

본 발명에 따르면, 공동-자극 신호전달 도메인은

CD28 세포질 서열 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(서열번호 29)(뉴클레오타이드 ID 번호 AF222341.1 및 단백질 ID 번호 AAF33792.1),

CD137 (4-1BB) 서열 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(서열번호 30)(뉴클레오타이드 ID 번호 U03397.1 및 단백질 번호 AAA53133.1),

OX40 서열 RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(서열번호 31)(뉴클레오타이드 ID 번호 NM_003327.3 및 단백질 번호 NP_003318.1), 또는

하기를 연결하여 얻은 서열:

CD28 세포질 서열(서열번호 29)과 CD137(4-1BB) 서열(서열번호 30),

CD137(4-1BB) 서열(서열번호 30)과 CD28 세포질 서열(서열번호 29),

CD28 세포질 서열(서열번호 29)과 OX40 서열(서열번호 31),

OX40 서열(서열번호 31)과 CD28 세포질 서열(서열번호 29),

OX40 서열(서열번호 31)과 CD137(4-1BB) 서열(서열번호 30),

CD137(4-1BB) 서열(서열번호 30)과 OX40 서열(서열번호 31)

로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따르면, CD3제타 사슬 서열은

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(서열번호 32)(뉴클레오타이드 ID 번호 J04132.1 및 단백질 ID 번호 AAA60394.1)이다.

본 발명에 따르면, 키메라 항원 수용체는 막투과 도메인 및 공동-자극 신호전달 도메인 사이에 CD8cyt의 세포질 모이어티: LYCNHRNRRRVCKCPR(서열번호 40)(뉴클레오타이드 ID 번호 NM_001768.6 및 단백질 ID 번호 NP_001759.3)를 추가로 포함할 수 있다.

CD8cyt의 세포질 모이어티는 디펩타이드, 예를 들어 VD와 같은 링커에 의해 공동-자극 신호전달 도메인에 연결될 수 있다.

본 발명에 따르면, 신호 펩타이드는 MEFGLSWLFLVAILKGVQC(서열번호 41)(뉴클레오타이드 ID 번호 AB776838.1 및 단백질 ID 번호 BAN63131.1)를 포함하거나 또는 구성될 수 있다.

본 발명에 따르면, 키메라 항원 수용체는

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSELPTQGTFSNVSTNVSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열번호 72) 또는

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열번호 33)

을 포함하거나 또는 구성된다.

즉, 본 발명에 따른 항-CD19 키메라 항원 수용체는 하기로 구성될 수 있다:

신호 펩타이드 MEFGLSWLFLVAILKGVQC(서열번호 41), 이는 SR 링커에 의해, FMC63 VL 서열 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT(서열번호 15)로 구성된 FMC63 하이브리도마 유래 항 CD19 단일 사슬 항체 도메인에 연결되고,

상기 서열번호 15의 서열은 Flex 링커(짧은 링커-SL), 바람직하게는 G3SG4 링커 GGGSGGGG(서열번호 38)에 의해, FMC63 VH 서열 EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS(서열번호 16)에 연결되며, FMC63 VH 서열은 GS 링커(즉 제2 링커 또는 어댑터)에 의해, 하기에 연결되며:

추적 가능한 마커 ΔCD34 ELPTQGTFSNVSTNVS(서열번호 25) 및 CD8stalk PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(서열번호 21)(긴 힌지-LH: ΔCD34 + CD8stalk) 또는 CD8stalk PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(서열번호 21)(짧은 힌지-SH: CD8stalk), 이는 하기에 연결되고:

CD8aTM IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(서열번호 28), 이는 하기에 연결되며:

CD8cyt의 세포질 모이어티 LYCNHRNRRRVCKCPR(서열번호 40), 이는 VD에 의해 하기에 연결되고:

공동-자극 신호전달 도메인 CD137(4-1BB) 서열: KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(서열번호 30), 이는 CD3제타 사슬 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(서열번호 32)에 연결됨.

본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 구성되는 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.

구체적으로, 항 CD19 FMC63 하이브리도마 VL 서열은 뉴클레오타이드 서열

GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA(서열번호 52)에 의해 인코딩될 수 있고,

항 CD19 FMC63 하이브리도마 VH 서열은 뉴클레오타이드 서열

GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(서열번호 53)에 의해 인코딩될 수 있으며;

항 CD20 VL 서열은 뉴클레오타이드 서열

CAGATCGTGCTGAGCCAGAGCCCCGCCATCCTGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGGGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAGCAGCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGTGAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGGGTGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGACCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG(서열번호 54)에 의해 인코딩될 수 있고,

항 CD20 VH 서열은 뉴클레오타이드 서열

CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCCGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCCGGCAGGGGCCTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTGTGGGGCGCCGGCACCACCGTGACCGTGAGC(서열번호 55)에 의해 인코딩될 수 있으며;

항 CD22 VL 서열은 뉴클레오타이드 서열

GACGTGCAGGTGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGAGCAGCCAGAGCCTGGCCAACAGCTACGGCAACACCTTCCTGAGCTGGTACCTGCACAAGCCCGGCAAGGCCCCCCAGCTGCTGATCTACGGCATCAGCAACAGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGGCACCCACCAGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG(서열번호 56)에 의해 인코딩될 수 있고,

항 CD22 VH 서열은 뉴클레오타이드 서열

GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGGTTCACCAACTACTGGATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGGCATCAACCCCGGCAACAACTACGCCACCTACAGGAGGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATGACCGCCGACACCAGCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGGGAGGGCTACGGCAACTACGGCGCCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC(서열번호 57)에 의해 인코딩될 수 있다.

본 발명에 따르면, 항-CD19 키메라 항체 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은:

ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(서열번호 58) 또는

ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAA(서열번호 34)이다.

본 발명에 따르면, 뉴클레오타이드 서열은, 2A 자가-절단 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 상기 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결된 자살 유전자 유도성 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열를 추가로 포함할 수 있다. 자살 유전자 유도성 아미노산 서열은 키메라 카스파제-9 폴리펩타이드일 수 있거나 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제를 포함한다.

따라서, 세포 내에서, 폴리뉴클레오타이드 2A 자가-절단 펩타이드는 자살 유전자 유도성 아미노산 서열과 키메라 항원 수용체를 포함하는 펩타이드를 두 개의 개별 펩타이드, 즉 자살 유전자 유도성 및 키메라 항원 수용체 아미노산 서열로 절단한다.

일 구현예에 따르면, 뉴클레오타이드 서열은:

ATGCTCGAGATGCTGGAGGGAGTGCAGGTGGAGACTATTAGCCCCGGAGATGGCAGAACATTCCCCAAAAGAGGACAGACTTGCGTCGTGCATTATACTGGAATGCTGGAAGACGGCAAGAAGGTGGACAGCAGCCGGGACCGAAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGGAAGCAGGAAGTGATCCGGGGCTGGGAGGAAGGAGTCGCACAGATGTCAGTGGGACAGAGGGCCAAACTGACTATTAGCCCAGACTACGCTTATGGAGCAACCGGCCACCCCGGGATCATTCCCCCTCATGCTACACTGGTCTTCGATGTGGAGCTGCTGAAGCTGGAAAGCGGAGGAGGATCCGGAGTGGACGGGTTTGGAGATGTGGGAGCCCTGGAATCCCTGCGGGGCAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGTCTATGGAGCCTTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAGAGCGGGCTGCGGACCAGAACAGGATCCAATATTGACTGTGAAAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAGGTGAAAGGCGATCTGACCGCTAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAACTGGCTCGGCAGGACCATGGGGCACTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGAGTCACGGCTGCCAGGCTTCACATCTGCAGTTCCCTGGGGCAGTCTATGGAACTGACGGCTGTCCAGTCAGCGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTCAACGGCACCTCTTGCCCAAGTCTGGGCGGGAAGCCCAAACTGTTCTTTATTCAGGCCTGTGGAGGCGAGCAGAAAGATCACGGCTTCGAAGTGGCTAGCACCTCCCCCGAGGACGAATCACCTGGAAGCAACCCTGAGCCAGATGCAACCCCCTTCCAGGAAGGCCTGAGGACATTTGACCAGCTGGATGCCATCTCAAGCCTGCCCACACCTTCTGACATTTTCGTCTCTTACAGTACTTTCCCTGGATTTGTGAGCTGGCGCGATCCAAAGTCAGGCAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGATATCTTTGAGCAGTGGGCCCATTCTGAAGACCTGCAGAGTCTGCTGCTGCGAGTGGCCAATGCTGTCTCTGTGAAGGGGATCTACAAACAGATGCCAGGATGCTTCAACTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACCTCCGCATCTAGGGCCCCGCGGGAAGGCCGAGGGAGCCTGCTGACATGTGGCGATGTGGAGGAAAACCCAGGACCACCATGGATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(서열번호 180)일 수 있다.

즉, iCas9CAR.CD19SL-LH로도 지칭되는 서열을 인코딩하는 이러한 뉴클레오티드 서열은 하기 서열들을 포함한다:

iCas9 키메라 단백질(FKBP12wt 결합 영역-링커-카스파제-9 폴리펩타이드):

FKBP12wt 결합 영역:

ATGCTCGAGATGCTGGAGGGAGTGCAGGTGGAGACTATTAGCCCCGGAGATGGCAGAACATTCCCCAAAAGAGGACAGACTTGCGTCGTGCATTATACTGGAATGCTGGAAGACGGCAAGAAGGTGGACAGCAGCCGGGACCGAAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGGAAGCAGGAAGTGATCCGGGGCTGGGAGGAAGGAGTCGCACAGATGTCAGTGGGACAGAGGGCCAAACTGACTATTAGCCCAGACTACGCTTATGGAGCAACCGGCCACCCCGGGATCATTCCCCCTCATGCTACACTGGTCTTCGATGTGGAGCTGCTGAAGCTGGAA(서열번호 59)(뉴클레오타이드 ID 번호 BT007066.1)

연결부(connection)의 링크

AGCGGAGGAGGATCCGGA(서열번호 60)

카스파제-9 폴리펩타이드

GTGGACGGGTTTGGAGATGTGGGAGCCCTGGAATCCCTGCGGGGCAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGTCTATGGAGCCTTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAGAGCGGGCTGCGGACCAGAACAGGATCCAATATTGACTGTGAAAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAGGTGAAAGGCGATCTGACCGCTAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAACTGGCTCGGCAGGACCATGGGGCACTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGAGTCACGGCTGCCAGGCTTCACATCTGCAGTTCCCTGGGGCAGTCTATGGAACTGACGGCTGTCCAGTCAGCGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTCAACGGCACCTCTTGCCCAAGTCTGGGCGGGAAGCCCAAACTGTTCTTTATTCAGGCCTGTGGAGGCGAGCAGAAAGATCACGGCTTCGAAGTGGCTAGCACCTCCCCCGAGGACGAATCACCTGGAAGCAACCCTGAGCCAGATGCAACCCCCTTCCAGGAAGGCCTGAGGACATTTGACCAGCTGGATGCCATCTCAAGCCTGCCCACACCTTCTGACATTTTCGTCTCTTACAGTACTTTCCCTGGATTTGTGAGCTGGCGCGATCCAAAGTCAGGCAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGATATCTTTGAGCAGTGGGCCCATTCTGAAGACCTGCAGAGTCTGCTGCTGCGAGTGGCCAATGCTGTCTCTGTGAAGGGGATCTACAAACAGATGCCAGGATGCTTCAACTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACCTCC(서열번호 61)(뉴클레오타이드 ID 번호 AK292111.1)

연결부의 링크

GCATCTAGGGCCCCGCGG(서열번호 62)

T2A 자가-절단 펩타이드

GAAGGCCGAGGGAGCCTGCTGACATGTGGCGATGTGGAGGAAAACCCAGGACCA(서열번호 63)(뉴클레오타이드 ID 번호 AF062037.1)

연결부의 짧은 링커

CCATGG

신호 펩타이드

ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGG(서열번호 64)(뉴클레오타이드 ID 번호 AB776838.1)

VL 서열(FMC63)

GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA(서열번호 52)

Flex 짧은 링커

GGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGC(서열번호 65)

VH 서열(FMC63)

GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(서열번호 53)

LH(긴 힌지): (짧은 링커, 즉 제2 링커 또는 어댑터) + (추적 가능한 마커: ΔCD34 세포외 + 힌지: CD8stalk 세포외):

짧은 어댑터

GGATCC

ΔCD34 세포외

GAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGT(서열번호 66)(뉴클레오타이드 ID 번호 AB238231.1)

CD8stalk 세포외

CCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGAC(서열번호 67)(뉴클레오타이드 ID 번호 M12828.1);

CD8aTM(막투과)

ATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACT(서열번호 68)(뉴클레오타이드 ID 번호 NM_001768.6)

CD8cyt(세포질)

CTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGG(서열번호 69)(뉴클레오타이드 ID 번호 NM_001768)

짧은 링커(Sal I 부위를 포함함)

GTCGAC

4-1BB

AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(서열번호 70)(뉴클레오타이드 ID 번호 U03397.1)

CD3제타 사슬

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(서열번호 71)(뉴클레오타이드 ID 번호 J04132.1).

본 발명에 따르면, iCas9CAR.CD19SL-SH는 짧은 힌지(SH): (짧은 어댑터) + (힌지: CD8줄기 세포외)를 포함한다는 사실을 제외하고는 iCas9CAR.CD19SL-LH의 서열로 구성된다.

본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같이 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터에 관한 것으로, 여기서 상기 벡터는 DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, γ-레트로바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터 또는 비 바이러스성 벡터이다.

또한, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 키메라 항원 수용체 및/또는 상기 정의된 바와 같은 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 알파/베타 및 감마/델타 T 세포와 같은 T 세포, NK 세포, NK-T 세포와 같은 세포에 관한 것이다.

본 발명에 따른 세포는 키메라 카스파제-9 폴리펩타이드와 같은 자살 유전자 유도성 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있거나 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제(HSVTK 서열번호 42)를 포함한다.

자살 유전자 유도성 아미노산 서열은 키메라 카스파제-9 폴리펩타이드일 수 있거나 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제(HSVTK 서열번호 42)를 포함한다.

키메라 카스파제-9 폴리펩타이드는 하기를 포함하거나 또는 구성될 수 있다:

짧은 5' 리더 펩타이드 MLEMLE(서열번호 43) 및 하기 서열의 인간 FKBP12(V36F)의 돌연변이체를 포함하거나 또는 구성되는 FKBP12 결합 영역:

GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE(서열번호 44)(뉴클레오타이드 ID 번호 BT007066.1 및 단백질 ID 번호 AAP35729.1), SGGGSG(서열번호 45) 링커와 같은 링커에 의해, 카스파제-9 폴리펩타이드:

VDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS(서열번호 46)(뉴클레오타이드 ID 번호　AK292111.1 및 단백질 ID 번호 BAF84800.1)에 연결되고, 이는 ASRAPR(서열번호 47) 링커(SacII 효소 부위를 함유함)와 같은 링커에 의해, 하기에 연결된다:

T2A(테냐 아시그나 바이러스 2(thosea asigna virus) 2 유래) AEGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 48)(뉴클레오타이드 ID 번호　AF062037.1 및 단백질 ID 번호 YP_009665206.1), P2A(돼지 테스코바이러스(porcine teschovirus)-1 2A 유래) ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 49)(뉴클레오타이드 ID 번호 AB038528.1 및 단백질 ID 번호 BAB32828.1), E2A(말 비염 A 바이러스(equine rhinitis A virus) 유래) QCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 50)(뉴클레오타이드 ID 번호 NC_039209.1　및 단백질 ID 번호 "YP_009513027.1") 또는 F2A(구제역바이러스(foot-and-mouth disease virus) 유래): VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 51)(뉴클레오타이드 ID 번호 AY593825.1 및 단백질 ID 번호 AAT01768.1)로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 2A 자가-절단 펩타이드, 바람직하게는 T2A.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 카스파제-9 폴리펩타이드는 하기로 구성된다:

- 리더 펩타이드 MLEMLE(서열번호 43),

- FKBP12 결합 영역

GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE(서열번호 44), 이는 SGGGSG(서열번호 45) 링커에 의해 하기에 연결됨:

- Caspase-9 polypeptide

VDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS(서열번호 46), 이는 링커 ASRAPR(서열번호 47)에 의해 하기에 연결됨:

- AEGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 48)를 인코딩하는 T2A 자가-절단 펩타이드.

본 발명에 따르면, 세포는 IL-7 및 IL-15가 모두 존재하는 배양 조건, 예를 들어 상기 세포의 제조를 위한 공정의 활성화 단계, 형질도입 단계 및/또는 증식 단계의 배양 조건에서 얻을 수 있다.

본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열, 또는 상기 정의된 바와 같은 벡터, 또는 상기 정의된 세포를 하나 이상의 부형제 및/또는 아쥬반트와 함께 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 의료 용도를 위한, 상기 정의된 바와 같은 키메라 항원 수용체, 상기 정의된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열, 상기 정의된 바와 같은 벡터, 상기 정의된 바와 같은 세포, 상기 정의된 바와 같은 약학 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 CD19+, CD20+ 또는 CD22+ 암, 예를 들어 B 세포 림프종(비호지킨 림프종(NHL)), 급성 림프모구 백혈병(ALL), 골수성 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병(CLL)의 치료에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 키메라 항원 수용체, 상기 정의된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열, 상기 정의된 바와 같은 벡터, 상기 정의된 바와 같은 세포, 상기 정의된 바와 같은 약학 조성물이다.

또한, 본 발명의 목적은 전신 홍반성 루푸스(SLE), 전신 경화증(SSc), ANCA-연관 혈관염(AAV), 피부근염(DM)을 제한 없이 포함하는, 자가-항체를 생성하는 B 세포에 의해 유발되는 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 키메라 항원 수용체, 상기 정의된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열, 상기 정의된 바와 같은 벡터, 상기 정의된 바와 같은 세포, 상기 정의된 바와 같은 약학 조성물이다.

본 발명은 이제 실시예 및 첨부한 도면을 구체적으로 참조하여 바람직한 구현예에 따라 예시적이지만 제한적이지 않은 방식으로 설명될 것이다.
- 도 1은 진단 시 Bcp-ALL 환자 유래 PBMC에서 생성된 CAR.CD19 T-세포를 보여준다. (A) α-CD19의 scFv는 iC9 자살 유전자, ΔCD34 추적 가능한 마커, 4.1BB 및 CD3ζ 신호 전달 엔도도메인을 모두 사용하여 프레임 내에서 클로닝된다. 진단 시 Bcp-ALL 환자의 PBMC를 가용성 α-hCD3/α-hCD28 mAb 및 rh-IL7/rh-IL15로 활성화한 다음 CAR.CD19 γ-레트로바이러스 상청액으로 형질도입한다. (B) 비-형질도입(NT) T-세포(음성 대조군, 왼쪽 패널) 및 CAR.CD19 유전자 변형 T-세포(오른쪽 패널)에서 ΔCD34 검출을 통해 CAR 발현을 보여주는 대표적인 기증자의 유세포 분석. (C) CAR T-세포 제조에 사용된 출발 원료 내 CD19+ 백혈병/림프종 세포가 45% 초과(n=8) 또는 45% 이하(n=7)인 DP 내 생산 종료 시점(Day+14)에서의 CAR+ T 세포의 비율. 45%의 중앙값을 컷오프로 사용하였다. (D) 생산 종료 시점의 DP 내 CAR+ T-세포의 비율과 환자의 출발 원료 내 CD19+ 백혈병 세포의 비율 사이의 상관관계 매트릭스. (E) SM 내 CD19+ B 세포가 45% 미만 또는 45% 초과인 두 하위 환자 그룹에서 생산 +3일째부터 종료 시까지 CAR T-세포의 총 배수 증식을 나타내는 히스토그램.
- 도 2는 BM 환자-유래 CAR T 세포 증식 및 형질도입을 보여준다. (A) 진단 시 환자의 BM 단핵 세포에서 생성된 대표적인 DP의 유세포 분석. 위쪽 패널 A는 NT T 세포의 음성 대조군 샘플에서의 CAR+ T 세포의 유세포 분석을 보여주는 한편, 아래쪽 패널은 iC9.CAR.CD19 유전자 변형 T 세포에서의 분석을 보여준다. (B) BM Bcp-ALL 환자(n=10)에서 생성된 DP 내 CD19+ 백혈병 블라스트 및 CAR+ T 세포의 백분율. (C) 생산 종료 시점에 10명의 Bcp-ALL 환자의 PB-유래 T 세포(흰색 막대)와 비교한 NT 및 iC9.CAR.CD19 BM-유래 T 세포(검은색 막대)의 배율 증식. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다.
- 도 3은 백혈병 세포로 고도로 오염된 진단 시 환자의 원료에서 생성된 DP의 MRD 분석을 보여준다. (A) 제조 시간이 DP의 MRD 값에 미치는 영향을 평가하기 위해 시간 경과 실험을 설계하였다. 5명의 상이한 환자(n=5)로부터 T-세포를 생성하여 MRD 분석을 위해 세포를 수집하기 전에 8일, 14일 또는 30일 동안 배양하고, 표 1에 명시된 검출 한계로 Ig 재배열에 대한 qPCR 분석을 수행하였으며, 도면에 10-4에서 10-5 사이의 음의 범위로 표시하였다(점선 영역). (B) 두 개의 DP에 대한 유세포 분석: MRD 값이 높은 ALL#12와 MRD 검출이 PCR 민감도 이하인 ALL#14. 패널은 CAR 발현에 양성인 백혈병 세포(검은색 점)의 존재를 보여주며, CAR 작제물 내 CD34 에피토프를 표적으로 하는 항-CAR.CD19 FITC 항체(항-CARTCD19, Cytognos SL, 스페인 살라망카 소재) 및 항-CD34 APC(CD34QBEND10) 양자 모두로 검출되었다. B 세포 전구체는 유세포 분석에 의한 Bcp-ALL의 고감도 MRD 측정에 대해 앞서 설명된 EuroFlow Bcp-ALL MRD 튜브(27-29)로 표면 마커 염색을 위한 EuroFlow 표준 운영 절차(SOP)(www.EuroFlow.org)(26)를 사용하여 확인하였다.
- 도 4는 대표적인 Bcp-ALL 환자 한 명의 비-형질도입 대조군 T 세포와 iC9.CAR.CD19LH T 세포의 유세포 분석을 보여준다. 위쪽 패널은 ALL#14 환자의 비-형질도입 대조군 T 세포 내 CD19 및 CD10 B 세포 마커의 유세포 분석에서 1.5%의 백혈병 세포가 검출된 반면, 동일한 ALL#14 환자에서 제조한 iC9.CAR.CD19LH T 세포 샘플에서는 오염이 상당히 감소했음(0.0036%의 백혈병 세포)을 보여준다.
- 도 5는 백혈병 세포에 의해 고도로 오염된 진단 시 Bcp-ALL 환자의 BM 원료에서 생성된 DP에 대한 MRD 분석을 보여준다. ALL#1 및 ALL#2 환자의, 두 개의 BM 유래 DP 내 B 세포 마커의 유세포 분석. 패널은 백혈병 세포의 존재를 보여준다(검은색 점).
- 도 6은 이들 둘 모두가 동일한 혈장막에서 발현될 때 CAR.CD19 구조가 CD19 항원 결합에 영향을 미친다는 것을 보여준다. (A) CAR.CD19LL/SH(a), CAR.CD19LL/LH(b), CAR.CD19SL/SH(c), CAR.CD19SL/LH(d)를 나타내는 카툰. (B) CAR.CD19LL/SH에 의해 유전자 변형된 NALM-6 세포에서 유세포 분석으로 검출된 CD19 발현. 매칭된 동종형(isotype) 염색 히스토그램과 CAR.CD19LL/SH 세포에 대한 특정 CD19 염색 히스토그램이 표시되어 있다(화살표 참조). (C-E) CAR.CD19LL/SH의 CD19 발현 히스토그램과 비교하여, CAR.CD19LL/LH(C), CAR.CD19SL/SH(D) 및 CAR.CD19SL/LH(E)에 의해 유전자 변형된 NALM-6 세포에서 유세포 분석으로 검출된 CD19 발현을 히스토그램으로 나타낸다.
- 도 7은 WT 및 CAR.CD19 Bcp-ALL 세포주 양자 모두에서의 CD19 mRNA 발현을 보여준다. (A) WT, CAR.CD19_LH 및 CAR.CD19_SH Bcp-ALL 세포주에서 CD19 mRNA 발현의 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR). 카르파스(Karpas) 세포주를 음성 대조군으로 사용하였다. mRNA 수준은 ACT-B mRNA 발현 대비 표적 유전자의 상대적 발현으로 나타낸다. 반응은 삼중으로 수행되었다. (B) 백혈병 및 림프종 세포주에서 CAR.CD19 발현의 MFI 분석. WT 및 CAR.CD19SL/LH DAUDI(위쪽 패널) 및 RAJI(아래쪽 패널)에서의 CAR.CD19 발현 수준의 MFI 값. 데이터는 대표적인 하나의 실험을 보여준다. (C) WT 및 CAR.CD19 NALM-6 세포주 양자 모두에 대해 CAR.CD19 T-세포의 항종양 활성을 평가하기 위한 장기 시험관 내 분석. 7일간의 시험관 내 공동-배양 후 WT(검은색 막대), NALM-6 CAR.CD19SL/LH(흰색 막대) 및 NALM-6 CAR.CD19 UPenn(CAR.CD19 LL/SH라고도 지칭함) 백혈병 세포(줄무늬 막대)의 백분율이다. 분석은 NALM-6 Bcp-ALL 종양 세포주에 대해 이펙터 표적 비율을 1:1에서 1:32로 감소시키면서 수행되었다. 실험은 삼중으로 수행되었다. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. * p-값=<0.05, ** p-값=<0.01, *** p-5 값=<0.001.
- 도 8은 CAR.CD19 양성 백혈병 또는 림프종 세포주를 제어하는 iC9 및 CAR.CD19 T-세포의 활성을 평가하기 위한 장기 시험관 내 분석을 보여준다. (A-B) CAR.CD19 T-세포와 함께 WT(검은색 막대) 및 CAR.CD19SL/LH(흰색 막대)의 7일간 공동-배양 분석(E:T 비율은 그래프의 X 축에 배양물 내 CAR+ T-세포의 백분율로 나타됨). ( C ) NT(검은색 막대), CAR.CD19SL/LH(흰색 막대), 및 CAR.CD19LL/SH(줄무늬 막대)와 함께 NALM-6 WT 및 CAR.CD19 유전자 변형 NALM-6의 7일간 공동-배양 분석. 모든 실험은 삼중으로 수행되었다(n=6). 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. * p-값=<0.05, ** p-값=<0.01, *** p-값=<0.001, **** p-값=<0.0001. (D-E) CAR.CD19 DAUDI 세포를 0 nM(D) 및 20 nM(E) AP1903으로 처리하고; 유세포 분석으로 시간 경과에 따라 CAR 및 CD19 발현 양자 모두를 모니터링하였다. (F) AP1903 노출 후 qRT-PCR에 의한 종양 세포 내 CAR.CD19 벡터의 검출. 반응은 삼중으로 수행되었다. 검은색 히스토그램은 참조의 양성 대조군(0nM AP1903)을 나타내고, 흰색 히스토그램은 한 번의 약물 노출(20nM AP1903) 후 결과를 나타낸다. * p-값=<0.05, ** p-값=<0.01, *** p-값=<0.001.
- 도 9는 CAR 구성 옆에 유사한 CAR.CD19 T 세포 활성화 프로파일을 보여준다. (A) 이펙터 T 세포와 NALM-6 WT, 또는 CAR.CD19 작제물로 유전자 변형된 NALM-6를 24시간 동안 공동-배양한 후 IFN-γ 생성을 측정하였다. HD에서 생성된 6가지 CAR T 생성물의 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. (B) NALM-6 세포로 변형된 CAR.CD19 또는 WT로 자극된, 및 자극되지 않은 CAR T-세포의 오버레이를 나타내는 CFSE 증식 분석.
- 도 10은 AP1903 투여가 iC9.CAR.CD19 Bcp-ALL 세포주에 미치는 영향을 보여준다. iC9.CAR.CD19(CAR.CD19LH) RAJI 및 NALM-6 세포주를 0 nM(A-D) 및 20 nM(B-D) AP1903으로 처리하고; FACS를 통해 CAR 및 CD19 발현 양자 모두를 시간 경과에 따라 모니터링하였다. AP1903 처리(20nM)는 약물 노출 6시간 후부터 시작하여 CAR+ 세포의 즉각적인 감소를 초래한다. AP1903 노출 후 CAR 양성의 감소는 세포 표면 상의 CD19 항원의 점진적인 검출과 관련이 있다. (E) iC9.CAR.CD19 DAUDI 세포주를 0 nM(검은색 선) 및 20 nM AP1903(짧은 점선)으로 처리하고, 처리 후 0일째부터 15일째까지 유세포 분석을 통해 CAR.CD19 MFI를 시간에 따라 모니터링하고 대조군 WT NALM-6 세포주(긴 점선)와 비교하였다. (F) 비처리되거나(검은색 막대) 20 nM(흰색 막대) AP1903에 노출된 NALM-6 세포주, RAZI 및 유전자 변형 DAUDI, 및 WT 내 전이유전자의 벡터 카피 수(VCN)를 보고하는 그래프. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다.
- 도 11은 iC9 활성화 후 남은 iC9.CAR.CD19 백혈병 및 림프종 세포가 CAR.CD19 T 세포뿐만 아니라 동종이형 CAR.CD19 NK 세포에 의해 효율적으로 인식 및 제거될 수 있었음을 보여준다. (A) 비-형질도입 T 세포 또는 CAR.CD19 T 세포와 wt DAUDI 세포, AP1903에 노출되지 않은 iC9.CAR.CD19LH DAUDI 세포, 및 AP1903 노출 후 잔류하고 추가로 재증식된 iC9.CAR.CD19LH DAUDI 사이에 7일간의 공동-배양 분석이 수행되었다(E:T 비율 1:1). (B) 비-형질도입 T 세포 또는 CAR.CD19 T 세포와 wt NALM-6 세포, AP1903에 노출되지 않은 iC9.CAR.CD19LH NALM-6 세포, 및 AP1903 노출 후 잔류하고 추가로 재증식된 iC9.CAR.CD19LH NALM-6 사이에서 7일간의 공동-배양 분석이 수행되었다(E:T 비율 1:1). (C) 비-형질도입 NK 세포 또는 CAR.CD19 NK 세포와 wt DAUDI 세포, AP1903에 노출되지 않은 iC9.CAR.CD19LH DAUDI 세포, 및 AP1903 노출 후 잔류하고 추가로 재증식된 iC9.CAR.CD19LH DAUDI 사이에 7일간의 공동-배양 분석이 수행되었다(E:T 비율 1:1). (D) 비-형질도입 NK 세포 또는 CAR.CD19 NK 세포와 wt NALM-6 세포, AP1903에 노출되지 않은 iC9.CAR.CD19LH NALM-6 세포, 및 AP1903 노출 후 잔류하고 추가로 재증식된 iC9.CAR.CD19LH NALM-6 사이에서 7일간의 공동-배양 분석이 수행되었다(E:T 비율 1:1). ** p-값=<0.01, *** p-값=<0.001.
- 도 12는 이종이식 마우스 모델에서 상이한 CAR.CD19 작제물로 유전자 변형된 T-세포가 CAR 양성 백혈병의 생체 내 증식을 제어하는 것을 보여준다. (A) -3일째에 주입된 FF-루시퍼라제 양성 NALM-6 WT 세포를 사용한 실험 설계의 개략도. 0일째에 마우스를 백혈병 생착에 대해 평가하고 10x106개의 비-형질도입(NT), 또는 CAR.CD19SL/LH 또는 CAR.CD19LL/SH T-세포/마우스로 처리하였다(상단 패널). 각 처리된 마우스의 생물발광 이미징(가운데 패널). NT(검은색 선) 또는 CAR.CD19SL/LH T-세포(짧은 점선) 또는 CAR.CD19LL/SH T 세포(긴 점선)를 받은 3개의 마우스 코호트의 생물발광 값의 평균 ± SD(하단 패널). (B) -3일째에 주입된 CAR.CD19SL/LH 양성/FF-루시퍼라제 양성 NALM-6 세포를 사용한 실험 설계의 개략도. 0일째에 마우스를 백혈병 생착에 대해 평가하고 10x106개의 비-형질도입(NT) 또는 CAR.CD19SL/LH로 처리하였다(상단 패널). 각 처리된 마우스의 생물발광 이미징(가운데 패널). NT(검은색 선) 또는 CAR.CD19SL/LH T-세포(짧은 점선)를 받은 2개의 마우스 코호트의 생물발광 값의 평균 ± SD(하단 패널). (C) -3일째에 주입된 CAR.CD19LL/SH 양성/FF-루시퍼라제 양성 NALM-6 세포를 사용한 실험 설계의 개략도. 0일째에 마우스를 백혈병 생착에 대해 평가하고 10x106개의 비-형질도입(NT) 또는 CAR.CD19LL/SH로 처리하였다(상단 패널). 각 처리된 마우스의 생물발광 이미징(가운데 패널). NT(검은색 선) 또는 CAR.CD19LL/SH T-세포(긴 점선)를 받은 2개의 마우스 코호트의 생물발광 값의 평균 ± SD(하단 패널). * p-값=<0.05, ** p-값=<0.01, *** p-값=<0.001, **** p-값=<0.0001.
(D) -3일째에 주입된 iC9.CAR.CD19_LH 양성 FF-루시퍼라제 양성 DAUDI 세포를 사용한 실험 설계의 개략도. 0일째에 마우스를 백혈병 생착에 대해 평가하고 10x10⁶개의 비-형질도입(NT) 또는 CAR.CD19 T세포/마우스로 처리하였다. 각 처리된 마우스의 생물발광 이미지. NT(검은색 선) 또는 CAR.CD19 T-세포(점선)를 받은 2개의 마우스 코호트의 생물발광 값의 평균 + 표준편차. * p-값=<0.05. (E) NALM-6 CAR.CD19SL/LH 및 CAR.CD19LL/SH NALM-6 세포를 보유한 마우스 사이에서 16일째의 종양 생물발광 차이를 나타내는 히스토그램. 데이터는 0일째와 비교하여 16일째에 2개의 마우스 코호트의 생물발광 증가의 평균 ± SD로 나타낸다.
- 도 13은 iC9 활성화가 이종이식 마우스 모델에서 iC9.CAR 양성 백혈병의 생체 내 증식을 제어할 수 있음을 보여준다. (A) -3일째에 주입된 iC9.CAR.CD19LH 양성 FF-루시퍼라제 양성 DAUDI 세포를 사용한 실험 설계의 개략도. 0일째에 마우스를 백혈병 생착에 대해 평가하고 0일째부터 28일째까지 100μg/마우스의 AP1903으로 처리하였다. (B) 각 비처리된 대조군 마우스와 각 AP1903 처리된 마우스의 생물발광 이미지. 마우스는 AP1903 중단 후 30일 초과 동안 모니터링되었다. (C) 2개의 코호트, 비처리(검은색 선) 또는 AP1903 처리(점선) 마우스에서 각 처리된 마우스의 시간 경과에 따른 생물발광 값. (D) 비처리(검은색 선) 또는 AP1903 처리(파란색 선) 백혈병 보유 마우스의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선 분석. **** p-값=<0.00001. AP1903 투여 후 IVIS 분석에서 지속적인 양성 신호를 나타낸 유일한 마우스(#20)를 35일째에 음성 대조군(#11) 및 양성 대조군(AP1903 투여에 노출되지 않은 마우스, #6)과 함께 희생시켜 백혈병 세포의 특성을 분석하였다.
- 도 14는 CAR.CD19 15aa 링커 (SG4)3 서열번호 39 vs CAR.CD19 8aa 링커 G3SG4 서열번호 38에 관한 인실리코(in silico) 모델링 데이터를 보여준다.
- 도 15는 CAR.CD19 15aa 링커 (SG4)3 서열번호 39 vs CAR.CD19 9aa 링커 G4SG3 서열번호 186에 관한 인실리코 모델링 데이터를 보여준다.
- 도 16은 CAR.CD19 15aa 링커 (SG4)3 서열번호 39 vs CAR.CD19 10aa 링커(SG4)2 서열번호 190에 관한 인실리코 모델링 데이터를 보여준다.
- 도 17은 CAR.CD19 15aa 링커 (SG4)3 서열번호 39 vs CAR.CD19 11aa 링커(SG4)2 S 서열번호 187에 관한 인실리코 모델링 데이터를 보여준다.
- 도 18은 CAR.CD19 15aa 링커 (SG4)3 서열번호 39 vs CAR.CD19 12aa 링커(SG4)2 SG 서열번호 188에 관한 인실리코 모델링 데이터를 보여준다.
- 도 19는 CAR.CD19 15aa 링커 (SG4)3 서열번호 39 vs CAR.CD19 13aa 링커(SG4)2 SG2(서열번호 191)에 관한 인실리코 모델링 데이터를 보여준다.
- 도 20은 CAR.CD19 15aa 링커 (SG4)3 서열번호 39 vs CAR.CD19 14aa 링커(SG4)2 SG3 서열번호 189에 관한 인실리코 모델링 데이터를 보여준다.
- 도 21은 CAR.CD19 15aa 링커 (SG4)3 서열번호 39 vs CAR.CD19 15aa 링커 (SG4)3 서열번호 39에 관한 인실리코 모델링 데이터를 보여준다.

실시예 1 : 본 발명에 따른 CAR 벡터 설계 및 CAR+ 백혈병 재발 사례에서의 안전성 연구

재료 및 방법

이들 실험에 사용된 인간 유래 생물학적 재료는 로마의 Bambino Ges

아동 병원의 기관 검토 위원회(IRB)에서 정한 규칙(OPBG; 윤리위원회 승인 N°969/2015 prot. N°669LB 및 N°1422/2017 prot.N°810)에 따라, 부모와 건강한 기증자 모두 서면 동의서에 서명한 후 샘플링되었다.

실험에 설명된 OGM은 국가 또는 지역사회 규정, 구체적으로 단락 6의 조항 및 2001년 4월 12일자 n.206 및 2003년 7월 8일 n.224 입법령에 따른 OGM에 관한 의무를 준수하여 작성되었다.

세포 배양.

CD19 양성 인간 버킷 림프종 세포주 Daudi, NALM-6 및 Raji(American Type Culture Collection Company(ATCC))와 CD19 음성 비호지킨 대세포 림프종 세포주 Karpas-299(Sigma Aldrich)를 RPMI 1640(EuroClone, 이탈리아 소재)에 10% 열 불활성화 태아 소 혈청(EuroClone, 이탈리아 소재), 2mM L-글루타민(GIBCO, 미국 소재), 25 IU/mL의 페니실린 및 25 mg/mL의 스트렙토마이신(EuroClone, 이탈리아 소재)을 보충하여 37°C에서 5% CO₂를 함유하는 가습된 환경에서 유지시켰다. 모든 세포주는 "BMR Genomics s.r.l."에서 PCR 단일 유전자좌 기술(PCR-single-locus-technology)(Promega, PowerPlex 21 PCR) 분석을 통해 인증되었으며, 마이코플라즈마 및 표면 마커 발현에 대해 주기적으로 확인하였다.

이펙터 세포 생성 및 증식.

건강한 기증자(HD)의 버피 코트(BC), 말초 혈액(PB) 및 Bcp-ALL 소아에서 유래한 골수(BM)를 사용하여 림프구 세포 분리 배지(Cedarlane, 캐나다 소재)를 사용하여 비분획 단핵 세포를 분리하였다. T 세포는 재조합 인간 인터루킨-7(IL7, 10 ng/㎖; R&D; 미국 소재) 및 인터루킨-15(IL15, 5 ng/㎖; R&D; 미국 소재)의 조합과 함께 가용성 OKT3 및 항-CD28(1 μg/㎖, Miltenyi, 독일 소재) 단일 클론 항체(mAb)로 활성화하였다. 앞서 설명된 방법에 따라 HD의 BC에서 NK 세포를 생성하였다¹⁷. 그런 다음 3/4일 후 레트로바이러스 상청액으로 T세포와 NK 세포를 재조합 인간 RetroNectin(Takara-Bio. Inc, 일본 소재)으로 사전 코팅된 24웰 플레이트로 형질도입시켰다. T 림프구는 사이토카인의 존재 하에서 TexMacs 완전 배지(Miltenyi, 독일 소재)에서 증식되고 일주일에 두 번 보충되었다.

CAR 작제물.

실험을 수행하기 위해 4개의 상이한 레트로바이러스 CAR 작제물이 사용되었다:

1) CD8 줄기 도메인(짧은 힌지, SH), CD8 막투과 도메인, 4.1bb 및 CD3ζ 세포질 도메인(CAR.CD19 VL-3GS-VH-CD8-4.1bb.ζ, 즉, LL/SH)이 있는 프레임 내, VL 및 VH 단편이 3개의 GSSSS 반복(3xG4S, 긴 링커, LL)으로 표시되는 링커로 결합된 FMC63 클론으로부터 항-인간 CD19-scFv를 운반하는 CAR 작제물;

CAR.CD19 LL/SH nt(서열번호 73)

ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAAGCGGAGGTGGGGGCAGCGGAGGTGGGGGCAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA

CAR.CD19 LL/SH aa(서열번호 74)

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITSGGGGSGGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR-

2) 인간 CD19 항원 유래의 16aa 서열(ΔCD34, 긴 힌지, LH), CD8 줄기 도메인, CD8 막투과 도메인, CD8 세포질 도메인, 4.1bb 및 CD3ζ 세포질 도메인(CAR.CD19 VL-3GS-VH-CD34-CD8-4.1bb.ζ, 즉 LL/LH)이 있는 프레임 내, VL 및 VH 단편이 3개의 GSSSS 반복(3xG4S, 긴 링커, LL)으로 표시되는 링커로 결합된 FMC63 클론으로부터 항-인간 CD19-scFv를 운반하는 CAR 작제물;

CAR.CD19LL/LH nt 서열(서열번호 36):

ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAAGCGGAGGTGGGGGCAGCGGAGGTGGGGGCAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCGCATGCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTGCGGCCGCcCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA

CAR.CD19LL/LH aa 서열(서열번호 39):

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITSGGGGSGGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSACELPTQGTFSNVSTNVSAAAPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR-

3) CD8 줄기 도메인(짧은 힌지, SH), CD8 막투과 도메인(짧은 힌지, SH), CD8 막투과 도메인, 4.1bb 및 CD3ζ 세포질 도메인(CAR.CD19 VL-1GS-VH-CD8-4.1bb.ζ, 즉 SL/SH)가 있는 프레임 내, VL 및 VH 단편이 1개의 GGGSGGGG 반복(서열번호 38)(G3SG4, 짧은 링커, SL)으로 표시되는 링커로 결합된 FMC63 클론으로부터 항-인간 CD19-scFv를 운반하는 CAR 작제물;

CAR.CD19 SL/SH nt 서열(서열번호 34):

ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAA

CAR.CD19 SL/SH aa 서열(서열번호 33):

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

4) 인간 CD19 항원 유래의 16aa 서열(ΔCD34, 긴 힌지, LH), CD8 줄기 도메인, CD8 막투과 도메인, CD8 세포질 도메인, 4.1bb 및 CD3ζ 세포질 도메인(CAR.CD19 VL-1GS-VH-CD34-CD8-4.1bb.ζ, 즉 SL/LH)가 있는 프레임 내, VL 및 VH 단편이 1개의 GGGSGGGG(서열번호 38) 반복(G3SG4, 짧은 링커, SL)으로 표시되는 링커로 결합된 FMC63 클론으로부터 항-인간 CD19-scFv를 운반하는 CAR 작제물.

CAR.CD19SL/LH nt 서열(서열번호 58):

ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA

CAR.CD19SL/LH의 단백질(서열번호 72):

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSELPTQGTFSNVSTNVSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*

이미 공개된 CAR.CD19를 운반하는 렌티바이러스 벡터로 유전자 변형된 NALM6(5)는 실험에 NALM6 CAR UPenn(Dr Ruella가 제공한 렌티바이러스 플랫폼의 CAR.CD19 LL/SH(5))으로 포함되었다.

HD 유래 NK 세포뿐만 아니라 HD 또는 Bcp-ALL 환자 유래 T 세포는, CD8 줄기 도메인, 인간 CD34 항원 유래의 16aa 서열(ΔCD34; 긴 힌지), 막투과 도메인, 4.1bb 및 CD3ζ 세포질 도메인(CAR.CD19 긴 힌지, CAR.CD19_LH)이 있는 프레임 내, V_H 및 V_L 단편이 1개의 GGGSGGGG(서열번호 38)(G3SG4, 짧은 링커)로 표시되는 링커로 결합된 FMC63 클론으로부터 항-인간 CD19-scFv를 운반하는 레트로바이러스 작제물로 유전적으로 변형되었다. 레트로바이러스 벡터는 상기 설명된 CAR 작제물이 자살 유전자 유도성 카스파제 9(iC9)를 코딩하는 유전자 카세트와 함께 프레임 내에 있는 바이시스트로닉 작제물이다. iC9-CAR.CD19SL/LH 레트로바이러스 작제물은 DAUDI, RAZI 및 NALM-6을 포함한 B 백혈병 세포주를 유전적으로 변형하는 데에도 사용되었다. CAR+ B 세포주는 형질도입 후 CAR 발현에 대해 FACS 분류되었다. NALM-6 세포는 또한 CD8 줄기 도메인(짧은 힌지), CD8 막투과 도메인, 4.1bb 및 CD3ζ 세포질 도메인(NALM-6 CAR.CD19 짧은 힌지, CAR.CD19 _UPenn ; Dr Ruella가 친절하게 제공함)이 있는 프레임 내, V_H 및 V_L 단편이 (S3G4)3 Flex 링커(SGGGGSGGGGSGGGG 서열번호 39, 긴 링커)로 표시되는 링커로 결합된 FMC63 클론으로부터 항-인간 CD19-scFv를 운반하는 렌티바이러스 작제물로 유전적으로 변형되었다.

자살 유전자의 활성화.

iC9의 시험관 내 활성화를 유도하기 위해 세포를 20 nm의 AP1903(Medchemexpress, Cat. HY-16046)으로 1회 처리하였다. AP1903 처리 후 CAR⁺ 세포의 백분율은 지정된 시점에 FACS로 평가되었다. 생체 내 실험의 경우, 자살 유전자 iC9가 AP1903에 의한 활성화 시 CAR+ 백혈병 증식의 제어에 있어서 활성화되는 능력을 증명하기 위해, NSG 마우스에 FF-루시퍼라제용 레트로바이러스 작제물로 유전자 변형된 0.25x10⁶개의 iC9.CAR.CD19_LH-DAUDI 세포를 주입하고; IVIS 영상 시스템으로 종양 생착을 모니터링한 후, 이합체화 약물 AP1903을 1일째부터 28일째까지 복강 내 투여하였다(100μg/마우스). 대조군 코호트에는 비히클 용액으로서 멸균 PBS를 주입하였다. 매주 IVIS 영상 분석을 통해 종양을 모니터링하였다.

표현형 분석.

세포 표면 항원 발현을 결정하기 위해 유세포 분석을 수행하고; 필요에 따라 CD45, CD3, CD19, CD22, CD10, CD34에 대한 단일 클론 항체(모두 Becton Dickinson, 미국 소재)를 상이한 형광과 결합시켰다. iC9.CAR.CD19 발현은 hCD34 에피토프에 대한 mAb(미국 소재 R&D System의 항-CD34 QBend-10 PE) 또는 CD19 CAR 검출 시약(Biotin; Miltenyi, 독일 소재)을 사용하여 검출하였다. 유세포 분석은 BD LSRFortessa X-20 세포 분석기(BD Biosciences, 미국 소재 소재)를 사용하여 수행하였으며 FACSDiva 소프트웨어(BD Biosciences, 미국)로 분석하였다. CAR-형질도입 종양 세포주에 대한 FACS-분류는 FACSAria(BD Biosciences, 미국 소재)에서 수행되었다.

DP는 또한 표면 마커 염색만을 위한 EuroFlow 표준 운영 절차(SOP)(www.EuroFlow.org에서 이용 가능함)를 사용하여 항체 + CD19-FITC 인간 단백질의 11색 또는 16색 조합으로 특징지어졌다¹⁸. 사용된 항체 조합은 양자 모두 유세포 분석에 의한 B-세포 급성 림프모구 백혈병의 고감도 MRD 측정을 위해 앞서 설명된 EuroFlow BCP-ALL MRD 튜브로 구성된 백본을 기반으로 하였으며^19-21, 여기에, 각각 감염된 T-세포와 감염되지 않은 T-세포의 염색과 CD19-음성 B세포 전구체 및 블라스트의 특이적인 게이팅을 위해, 항-CD22 및 항-HLADR 항체 시약 양자 모두와 항-CD3를 추가하였다. 마지막으로, 감염된 CAR.CD19 세포의 식별을 위해 시약 염색 혼합물에 항-CD34 Qbend10 클론(R&D Systems, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)과 CD19-FITC 인간 단백질(Cytognos SL, 스페인 살라망카 소재)도 추가하였다.

모든 특정 시약은 아래에 보고된 표 1 A, B, C에 나열되어 있다.

[표 1A]

[표 1B]

[표 1C]

샘플 채취는 샘플 조제가 완료된 직후에 수행되었으며, 샘플당 1.5 × 10⁶개 세포(범위: 1.6 내지 7.5 × 10⁶개 세포)를 LSRFortessa X-20[Becton Dickinson Biosciences(BD), 미국 캘리포니아주 산호세 소재] 유세포분석기와 FACSDiva 소프트웨어(BD) 또는 SpectroFlo 소프트웨어(Cytek)가 탑재된 3-레이저 Aurora(Cytek Biosciences, 미국 캘리포니아주 프리몬트 소재) 스펙트럼 유세포분석기를 사용하여 측정하였다. 기기 설정 및 데이터 수집을 위해 기기의 설정 및 교정을 위한 EuroFlow SOP(www.euroflow.org에서 이용 가능함)를 엄격하게 준수하였다. DOI: 10.1038/leu.2012.122. 데이터 분석에는 Infinicyt 소프트웨어(Cytognos SL, 스페인 살라망카 소재)를 사용하였다.

정량적 실시간 PCR.

총 DNA는 제조업체에 따라 QIAamp DNA 미니 키트(Qiagen, 미국 소재)로 정제하였다.

정량적 실시간 PCR

세포당 평균 벡터 카피 수(VCN)는 Primer Express^® 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하여 레트로바이러스 작제물로 설계된 TaqMan 프로브를 사용하여 실시간 PCR로 결정하였으며 표 2에 보고하였다(iC9 프로브 및 프라이머 iC9).

유전자	iC9
정방향 프라이머	5'-ACCAGCTGGATGCCATCTC-3'(서열번호 177)
역방향 프라이머	5'-CAGCTGCCTGACTTTGGATC-3'(서열번호 178)
TaqMan 프로브	5'AGCCTGCCC/ZEN/ACACCTTCTGACAT 3'(서열번호 179) 5' 내에 5HEX 및 3' 내에 3IABkFQ를 가짐

TaqMan 프라이머/프로브는 Primer Express^® 소프트웨어(Applied Biosystems, 이탈리아 소재)로 각 특이적 면역글로불린(IG) 또는 T-세포 수용체(TR) 클론 표적에 대해 설계되었다.

VCN의 경우, 각 샘플을 삼중으로 분석하고 임계값 주기의 평균을 사용하여 음성 대조 샘플의 평균 값과 비교하여 DNA 카피를 정량화하였다. 상대적 유전자 발현은 하우스키핑 유전자 ACT1N1(Hs_02249516 ACT1N1, ThermoFisher Scientific)을 사용하여 계산하였으며, qPCR은 QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR 시스템(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 수행하였다. DP의 IG/TR PCR-MRD의 경우, 상응하는 표준 곡선으로부터 각 MRD 값을 계산하고 그 결과를 하우스키핑 알부민 유전자 값에 대해 정규화하였다. 분석된 각 샘플에 적절한 MRD 값을 할당하기 위해 정량적 범위(QR) 및 민감도 범위(SR), 양성 값, 복제물의 재현성을 Euro MRD 가이드라인에 따라 해석하였다. qPCR은 7900 HT 고속 실시간 PCR(fast-Real Time-PCR) 시스템과 ViiA7 시스템(ThermoFisher Scientific) 및 TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 수행하였다.

생체 내 CAR+ 백혈병 마우스 모델.

Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) 암컷 마우스는 Charles River가 제공하였으며 이탈리아 로마 Castel Romano의 Plaisant 동물 시설에서 관리되었다. 모든 절차는 미국 국립보건원의 동물 관리 및 사용 지침(동물실험윤리위원회 Prot. N 088/2016-PR)에 따라 수행되었다. CAR+ 백혈병에 대한 CAR T 활성을 테스트하기 위해, 반딧불 루시퍼라제(FF-Luc)로 유전적으로 변형된 0.25x10⁶개 NALM-6 WT 또는 NALM-6 CAR.CD19_SL/LH 또는 NALM-6 CAR.CD19_LL/SH 또는 DAUDI CAR.CD19_SL/LH 세포를 NSG 마우스 모델에 정맥 내로 이식하였다. +3일째에 마우스를 10x10⁶개 CAR.CD19 T-세포 또는 대조군 비형질도입(NT) T-세포로 처리하였다. D-Luciferin(퍼킨엘머, D-루시페린 칼륨 염)을 복강 내 투여한 후 IVIS 이미징 시스템으로 종양 성장을 매주 모니터링하였다.

통계 분석.

별도의 언급이 없는 한, 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 요약된다. 샘플 간 통계적으로 유의미한 차이를 결정하기 위해 스튜던트 t-검정(2-측)을 사용하였으며, p 값이 0.05 미만인 경우 유의미한 차이를 나타낸다. 마우스 생존 데이터는 카플란-마이어 생존 곡선을 사용하여 분석하였으며, 통계적으로 유의미한 차이를 측정하기 위해 피셔 정확 검정(Fisher's exact test)을 사용하였다. 가치 있는 샘플은 분석에서 제외하지 않았다. 동물은 종양 이식 후 치료 전에 사망한 경우에만 제외되었다. 생체 내 연구 동안 무작위 배정이나 맹검이 수행되지 않았다. 그러나 대조군 또는 특정 군의 주입 전에 대조군과 치료군의 종양 신호에 따라 마우스를 매칭하였다. 시간 경과에 따른 종양의 성장을 비교하기 위해 생물발광 신호 강도를 블라인드 방식으로 수집하였다. 생물발광 신호 강도를 로그 변환한 다음 2-샘플 t-검정을 사용하여 비교하였다. 각 데이터 그룹 내에서 유의미한 차이가 없는 것을 고려하여 샘플 크기를 추정하였다. 가능한 한 작은 샘플 크기를 사용하여 결론에 도달하려고 노력하였다. 80%의 검정력으로 0.05의 유의 수준에서 평균 2의 표준 편차의 차이를 감지할 수 있는 샘플 크기가 추정되었다. 그래픽 표현 및 통계 분석은 GraphPad Prism 6(GraphPad Software, 미국 캘리포니아주 라호야 소재)을 사용하여 수행하였다.

결과

Bcp-ALL에 걸린 환자의 PB 단핵 세포에서의 CAR.CD19 T-세포 생성.

진단 시 환자에서 분리된 분획되지 않은 PB 단핵세포 집단은 순환 블라스트의 중앙값이 45.05±28.12%(n=10. 범위, 5.5 내지 86.4%)이었다. 등록 환자의 PB에서 유래한 단핵세포를 도 1A에 설명된 방법에 따라 2세대 iC9.CAR.CD19 긴 힌지(iC9.CAR.CD19_LH)로 형질도입시켰다. 형질도입 공정 5일 후, T-세포 생성물은 55,15±16,54%의 형질도입 효율을 보였다(도 1B는 예시적인 분석 결과이지만, 도 1C는 45% 중앙값 컷오프를 고려하여 출발 물질의 %CD19⁺ 세포를 기준으로 두 그룹으로 세분한 백혈병 환자 15명의 평균을 보여준다). 환자 샘플의 백혈병 블라스트 오염이 CAR T-세포 생산에 임의의 영향을 미치는지 여부를, 특히 DP의 CAR 형질도입 수준뿐만 아니라 생성된 CAR T-세포의 총 수 측면에서 평가하였다. 제조 절차의 종료 시점에서의 CAR T-세포 백분율과 출발 물질을 오염시키는 CD19+ B 세포 수준(도 1C 및 1D)뿐만 아니라 45% 초과의 CD19⁺ 세포(컷오프 배지 값, 도 1E)가 특징인 환자의 물질로 제조를 시작했을 때 관찰된 CAR T-세포 수율 사이에는 상관관계가 발견되지 않았다. 높은 백분율의 백혈병 블라스트 세포뿐만 아니라 더 미성숙한 단계의 백혈병 세포를 갖는 환자 샘플을 고려하기 위해 진단 시 Bcp-ALL 환자의 BM 흡인 샘플(n=6. 도 2A)로부터 출발하여 CAR T-세포를 생성하였으며, 출발 물질의 평균 CD19+ 세포는 73.1±17,80%(범위, 40.5 내지 83.5%)이었다. BM-유래 샘플의 형질도입 수준은 PB-샘플보다 상당히 낮았지만(도 2A 및 2B; 각각 36,04±19,83% vs 55,15±16,54% CAR+ T 세포; p=0.03), PB 또는 BM 샘플에서 DP 회수의 총 수율 측면에서는 차이가 관찰되지 않았다(도 2C).

환자 유래 CAR T-세포 생성물의 심층 특성 분석.

각 환자의 진단 시 관찰된 환자 특이적 Ig 재배열의 증폭을 위해 CAR T-세포 DP(14일째, 생산 종료일)에 대해 실시간 정량 PCR을 수행하였다. 테스트한 14개 CAR T 세포 DP 중 7개에서 MRD 양성이 관찰되었으며, MRD 중앙값은 6.01E-3±1.00E-2였다(표 3).

모든 환자(PB)	%CD19+ 블라스트	샘플	MRD#1	MRD#2
ALL#7	86,4	NT	1,00E-04	NEG
		CAR	1,20E-04	NEG
ALL#8	28,5	NT	NEG	ND
		CAR	NEG	ND
ALL#9	5,5	NT	NEG	NEG
		CAR	NEG	NEG
ALL#4	28,7	NT	ND	ND
		CAR	NEG	NEG
ALL#10	44,8	NT	9,40E-03	2,30E-03
		CAR	8,40E-03	1,90E-03
ALL#6	75,3	NT	NEG	NEG
		CAR	NEG	NEG
ALL#11	13,9	NT	1,10E-03	6,00E-04
		CAR	NEG	NEG
ALL#12	79,8	NT	1,50E-04	1,00E-04
		CAR	3,50E-04	1,30E-04
ALL#13	33,6	NT	NEG	NEG
		CAR	NEG	ND
ALL#14	36,8	NT	1.2E-04	NEG
		CAR	NEG	NEG
ALL#15	48.3	NT	1.9E-04	ND
		CAR	6.4E-04	ND
ALL#16	75.2	NT	3.4E-03	3.5E-03
		CAR	2.7E-03	2.1E-02
ALL#18	36.4	NT	3.4E-04	6.2E-04
		CAR	3.0E-04	NEG
ALL#19	94.1	NT	3.8E-03	ND
		CAR	2.1E-03	ND

표 3은 CAR T 제조를 위해 고려되는 미처리 출발 물질에서의 CD19+ 백혈병 세포의 백분율에 대한 등록된 각 환자의 데이터와, 각 단일 환자의 진단 시 확인된 두 개의 상이한 Ig 마커(MRD#1 및 MRD#2)에 대한 MRD 값을 보여 준다. MRD 데이터는 비-형질도입 대조군 T 세포 샘플(NT)과 CAR.CD19 T 세포 샘플(CAR) 양자 모두에 대해 보고되었다.

또한, 테스트된 13개의 비-형질도입 T 세포 샘플 중 9개에서도 백혈병 블라스트 세포 오염이 관찰되어(NT, 표 3), 형질도입 공정과 무관하게 백혈병 세포가 배양에서 생존한다는 것이 입증되었다. 보다 심층적인 실험을 위해 시간 경과 실험을 수행하였으며, 여기서 DP는 활성화 후 초기 시점인 +8일째, CAR T 제조의 표준 절차인 +14일째, CAR T-세포 DP의 연장 배양 시점인 +30일째에 MRD에 대해 분석되었다(5명의 상이한 환자 생성물에서 얻은 데이터, n=5). 도 3A에서 볼 수 있듯이, MRD 수준과 시험관내 배양 시간 경과 사이에 역 상관관계가 관찰되었으며, 배양 시간이 점차 증가함에 따라 MRD가 상당히 감소하여(+8일째 vs +14일째의 MRD를 고려하면 p=0.02) 마지막 시점인 +30일째에서 민감도보다 뒤처지는 수준에 도달하였다. 이용 가능한 물질이 충분한 샘플의 경우 고감도 EuroFlow 세포측정 플랫폼을 적용하여 DP 분석도 수행하였다(Leukemia. 2012 Sep; 26(9): 1899-1907). NT T-세포의 대조군 배양 및 제조 공정 14일째의 한 예시적인 CAR T-세포 DP의 데이터를 보고한 도 3B에서 명확하게 볼 수 있듯이, 적용된 세포형광측정 분석은 양성 MRD를 검출하기에 충분히 민감하였다. CAR 생성물을 오염시키는 B세포 전구체는 CD19는 매우 희미하게 나타났지만(도 4), CD10과 같은 다른 B세포 마커는 보존되었다(도 4). 그럼에도 불구하고 시험관 내 증식된 NT T-세포를 오염시켜 CD19+ CD10+를 생성하는 B 세포의 백분율은 CAR 샘플에서 관찰된 것보다 상당히 더 높았다(도 4, MRD 각각 1.5% vs 0.00036%). B 세포가 CAR 형질도입에 의해 특징지어지는지 확인하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, PCR에서 양성 MRD인 두 샘플을 세포형광측정 분석으로 분석한 결과, CAR 양성 백혈병 세포가 검출되어 CAR 분자에 대한 두 가지 상이한 염색(iC9.CAR.CD19_LH의 힌지 영역에서의 항-CD34 검출 에피토프뿐만 아니라 CAR.CD19 scFv가 인식하는 CD19 에피토프)에 이중 양성을 나타냈다. BM-유래 DP에 대한 데이터도 확인되었는데, RT-qPCR은 6개의 CAR T 생성물 중 6개에서 MRD의 양성을 보였다(표 4).

모든 환자 (BM)	%CD19+ 블라스트	샘플	MRD#1	MRD#2
ALL#1	80,7	NT	6,03E-03	7,50E-03
		CAR	3,60E-03	5,20E-03
ALL#2	40,5	NT	7,60E-03	5,20E-03
		CAR	9,90E-03	7,00E-03
ALL#3	50,9	NT	2,60E-03	4,20E-03
		CAR	5,40E-02	5,40E-02
ALL#4	75,6	NT	2,80E-03	2,60E-03
		CAR	2,30E-03	1,90E-03
ALL#5	83,9	NT	1,20E-03	ND
		CAR	1,20E-03	1,90E-04
ALL#6	83,5	NT	ND	ND
		CAR	POS<QR	NEG

표 4는 CAR T 세포 제조에 대해 미처리 출발 재료로 사용된 환자 유래 BM 단핵구 세포에서 CD19+ 백혈병 세포의 백분율과 각 단일 환자에서 진단 시 확인된 두 가지 상이한 Ig 마커에 대한 MRD 값에 관한 각 등록 환자의 데이터를 보여준다. MRD 데이터는 비-형질도입 대조군 T 세포 샘플(NT)과 iC9.CAR.CD19LH T 세포 샘플(CAR) 양자 모두에 대해 보고되었다.

두 개의 BM-유래 예에 대해 EuroFlow 세포측정 플랫폼에서도 MRD가 확인되었다(도 5). 이 경우, 분석의 민감도와 냉동 샘플의 품질로 인해 CAR 양성 B 세포 전구체를 검출할 수 없었다. 또한 BM-유래 CAR T 세포 생성물에서 DP를 오염시키는 B-세포 전구체는 CD19가 희미하고/음성이었지만, B 세포를 오염시키는 비-형질도입 T-세포 생성물에서는 CD19가 높은 발현되었다.

요약하면, 의약품에 대한 심층 특성 분석을 수행하면 백혈병 CAR+ B 세포의 발생을 자주 감지 가능하다는 증거가 제공되었으며, 곧 많은 수의 환자가 CAR T 세포로 치료를 받게 될 것이므로 CAR 작제물의 안전성 프로파일을 개선해야 할 시급한 필요성이 강조되었다.

CAR 링커의 길이는 에피토프 마스킹에 영향을 미친다

CAR.CD19가 동일한 세포막에서 CD19와 공동-발현될 때 링커와 힌지 영역의 CAR.CD19 설계가 CD19 마스킹에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 평가하였다. 구체적으로, 도 6A에 요약된 4가지 특정 형태를 고려하여 CAR 작제물에서 어떤 구성 형태가 CAR+ 백혈병 세포에서 CD19 항원 마스킹에 대해 반응 가능한지 입증하였다. 이를 위해 4가지 상이한 CAR 작제물을 사용하여 NALM-6 세포주를 유전적으로 변형하였다. 세포는 mRNA 수준에서 CD19 양성을 유지했지만(도 7A), NALM-6 CAR.CD19LL/SH(밝은 회색 히스토그램)의 CD19 관련 형광 수준 패턴은 대조군 아이소타입(어두운 회색 히스토그램)과 겹쳐져 있어(도 6B) 이전에 공개된 데이터(5)를 확인하였다. 그런 다음, (이전과 마찬가지로) 긴 링커를 특징으로 하지만, ΔCD34를 포함하는 긴 힌지(CAR.CD19LL/LH)의 존재 하에, 상이한 2세대 CAR.CD19 구성이 고려되었다. 이 경우 마스킹 유세포 분석은 참조 CAR.CD19LL/SH와 비교하여 차이가 없는 것으로 나타났다(도 6C). 그런 다음 CAR.CD19SL/SH를 운반하는 NALM-6에서 CD19의 MFI 검출을 고려하여 VL과 VH 영역 사이의 링커 길이의 기여도를 평가하였다. 도 6D에 도시된 바와 같이, CD19 MFI는 참조 CAR.CD19LL/SH에 비해 NALM-6 CAR.CD19SL/SH에서 더 높았다. 마지막으로, 본 발명의 CAR 작제물로 유전자 변형된 NALM-6는 VL과 VH 사이의 짧은 링커가 ΔCD34를 포함하는 긴 힌지에 연관되어 CAR T-세포에 대한 추적 가능한 마커로 고려되었다. 또한 LH의 경우, SH는 참조 구조물과 관련하여 상이한 CD19 MFI와 연관되었다(도 6E). 다른 두 개의 상이한 B 세포주인 DAUDI 및 RAZI 세포에서도 동일한 데이터가 관찰되었는데, 림프종 세포가 CAR.CD19SL/LH로 유전적으로 변형되었을 때 불완전한 CD19 마스킹이 나타났다(도 7B). 이러한 관찰을 바탕으로 링커 길이가 레트로바이러스 플랫폼에서 CAR+ 백혈병 세포 상의 완전 또는 불완전한 CD19 항원 CIS 마스킹을 유발하는 요인이 될 수 있다고 추측하였다. 이러한 결과는 기능 분석을 통해서도 확증되었다. 실제로 야생형 세포주(도 8A 내지 8C)와 비교했을 때, 특히 낮은 이펙터/표적 비율에서 낮은 정도이기는 하지만 DAUDI, RAZI 및 NALM-6 CAR.CD19SL/LH 세포 상에서 매우 낮은 수준의 CD19 발현만으로도 CAR.CD19 T-세포 반응을 유도하기에 충분하였다. 도 8C에 도시된 바와 같이, CAR.CD19 T 세포는 NALM-6 WT에 대해 완전한 백혈병 제어 효과를 발휘하며, 이는 NALM-6 CAR.CD19SL/SH 및 NALM-6 CAR.CD19SL/LH에 대해 관찰된 항-백혈병 활성과 비교하여 큰 차이가 없다. 주목할 만한 점은 이전 간행물(5)에서 Ruella et al이 적용한 NALM-6 CAR+를 CAR.CD19 T 세포가 완전히 인식하지 못한 반면(도 7C), NALM-6 CAR.CD19LL/SH에 대한 CAR.CD19 T 세포의 활성은 어느 정도 관찰되었지만 NALM-6 CAR.CD19SL/SH 및 NALM-6 CAR.CD19SL/LH에 비해 낮은 정도였다는 점이다(도 8C). 이러한 발견과 일치하여, SL 또는 LL를 포함하는 CAR.CD19 양자 모두로 유전적으로 변형된 NALM-6 세포는 CAR T 세포에 의해 상당한 양의 인터페론 감마(IFN-g)를 유도할 수 있을 뿐만 아니라(도 9A) 증식을 유도할 수 있는 것으로 관찰되었다(도 9B).

CAR.CD19 작제물의 짧은 링커와 긴 힌지는 CAR 기능 및 면역원성에 영향을 미치지 않았다.

특히, CAR.CD19SL/LH는 불완전한 CD19 항원 CIS 마스킹을 유도하지만, T 세포에서 발현된 경우 백혈병/림프종 제어에 상당한 효과를 발휘할 수 있었다. 구체적으로, 공동-배양 분석을 통해 DAUDI(도 8A), Raji(도 8B) 및 NALM-6(도 8C) 세포주에 대한 CAR.CD19SL/LH T 세포의 세포 독성 효과를 입증하였다. 도 8A와 8B에서 볼 수 있듯이, CAR.CD19SL/LH T 세포는 낮은 이펙터/표적 비율로 사용할 때에도 배양액에서 종양 세포를 제거할 수 있다. NALM-6 모델의 경우, CAR.CD19SL/LH T 세포의 항-백혈병 활성을 보다 표준적인 CAR.CD19LL/SH T 세포와 비교한 결과 세포 독성(도 8C, NALM-6 WT), 인터페론 감마(IFN-g) 생성(도 9A) 또는 항원 자극 후 증식 지수(도 9B) 측면에서 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 이 마지막 분석은 CFSE가 탑재된 CAR T 세포에 NALM-6 WT 세포를 자극하여 수행되었으며, CAR 작제물에 관계없이 두 CAR.CD19 T 세포가 자극되지 않은 세포(짙은 회색 히스토그램)에 비해 비슷한 수준의 높은 증식 세포(연한 회색 히스토그램)에 도달할 수 있음을 관찰하였다. 또한, 추적 가능한 마커 CD34가 CAR 구성에 포함되었기 때문에 면역원성을 예측하기 위해 인실리코 분석도 수행하였다. 구체적으로, CD34 도메인을 포함하는 CAR 영역에서 MHC 분자가 제시할 것으로 확실하게 예측되는 펩타이드 서열을 연구하였다. "STNVSPAPR"(서열번호 181) 펩타이드는 CD34-포함 작제물에 대해 잠재적으로 면역원성이 있는 것으로 예측된다(표 5, MHC 분자인 HLA-A11:01 및 HLA-A33:03에 의해 제시됨). 펩타이드 "GSELPTQGTF"(서열번호 182)도 선택 기준과 일치하지만, 이 경우 결합 코어는 "ELPTQGTF"(서열번호 183)이며 전적으로 CD34 에피토프 영역의 일부이므로 면역원성이 높지 않을 가능성이 높다. CD34 도메인을 고려하지 않은 CAR 작제물의 경우, 펩타이드 "SVTVSSPAPR"(서열번호 184)과 그 짧은 버전인 "VTVSSPAPR"(서열번호 185)은 양자 모두 동일한 대립유전자 HLA-A11:01 및 HLA-A33:03에 의해 제시된 면역원성이 있는 것으로 예측된다. 이러한 데이터에 비추어 볼 때, CD34 도메인을 작제물에 포함시키는 것이 CAR의 면역원성 프로파일에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 예측된다.

펩타이드	결합 대립유전자	CAR 작제물
VTVSSPAPR (서열번호 185)	HLA-A11:01, HLA-A33:03	CD34 없는 짧은 힌지
SVTVSSPAPR (서열번호 184)	HLA-A33:03	CD34 없는 짧은 힌지
GSELPTQGTF (서열번호 182)	HLA-B40:01	CD34를 포함하는 긴 힌지
STNVSPAPR (서열번호 181)	HLA-A11:01,HLA-A33:03	CD34를 포함하는 긴 힌지

자살 유전자 iC9의 활성화는 CAR+ 백혈병 세포의 증식을 제어한다.

DAUDI, RAZI 및 NALM-6 iC9.CAR+ 세포를 20 nm의 AP1903에 노출시킴으로써 CAR+ 백혈병 세포를 즉각적으로 제거할 수 있는 가능성이 입증되었다. 실제로 자살 유전자 iC9의 매우 조기의 활성화(6시간)는 CAR+ 백혈병 세포의 백분율을 상당히 감소시켰다(DAUDI 세포의 경우 도 8D 및 8E, RAJI 및 NALM6 세포의 경우 도 10). AP1903으로 처리한 iC9.CAR.CD19 DAUDI 세포의 장기간 배양은 iC9.CAR+ 백혈병 세포의 재증식과 관련이 없었다(도 8E). 구체적으로, AP1903 처리 세포에서 CAR 발현의 MFI는 142±22(임계값, 도 10E)로, 처리하지 않은 세포에 비해 상당히 낮았지만, DAUDI WT 세포의 CAR 염색(125.8±20.6, 도 10E)보다는 높았다. RAJI(도 10A 및 10B) 및 NALM-6(도 10C 및 10D) 세포 모델에서도 동일한 결과가 확인되었다. AP1903 처리 세포에서는 유세포 분석으로 CAR 발현 MFI가 높은 백혈병 세포의 존재를 감지할 수 없었지만, 야생형 세포주에서와 같이 CAR.CD19의 발현이 매우 희미(즉, 중간 정도)한 백혈병 세포의 존재가 관찰되었으나 CD19 항원의 완전한 재확립된 검출이 관찰되었다(도 8E, 10B 및 10D). 실제로 qPCR 분석 결과, AP1903 노출 후 나머지 세포에서 트랜스진(TG)이 검출되었지만(도 9F), 처리되지 않은 CAR+ 세포에 비해 상당히 감소하였다(DAUDI 세포의 22.8%, RAJI 세포의 18.6%, 및 NALM-6 세포의 0.6%에서 TG 양성이 관찰됨). 벡터 카피 수 분석 결과, AP1903으로 처리된 잔류 세포는 처리되지 않은 세포에 비해 삽입된 벡터 수가 상당히 적었다(모든 고려된 세포 모델에 걸쳐 처리되지 않은 세포와 AP1903으로 처리된 B 세포의 VCN 임계값 평균은 각각 5.3±4.2 및 0.1±0.1이었음; 도 10F). AP1903 노출 후 구조된 iC9.CAR+ B 세포에서 CD19 검출이 완전히 재확립되었으므로 이들을 CAR.CD19 T-세포로 표적화될 수 있는지 여부를 검증하였다. 도 11에서 볼 수 있듯이 CAR.CD19 T-세포(도 11A 및 11B)는 AP1903 처리에 의해 보존된 CAR+ 백혈병 세포를 제거할 수 있었다. 또한, CAR+ B 세포가 재발한 환자로부터 자가 CAR T-세포 생성물을 생성하는 것이 임상적으로 불가능하기 때문에 건강한 기증자-유래 CAR.CD19 NK-세포가 AP1903 노출 후 구조된 iC9.CAR+ B 세포를 유의하게 제어할 수 있다는 사실도 입증되었다(도 11C 및 11D).

CAR+ 백혈병의 생체 내 제어를 위한 이중 전략.

CAR.CD19 T 세포가 SL 또는 LL을 갖는 CAR 작제물 외에 야생형 B 세포 백혈병을 표적화하는 능력은 B 세포 백혈병 NSG 이종이식 모델에서 생체 내에서 입증되었다. 구체적으로, 마우스에 FF-루시퍼라제로 유전자 변형된 NALM-6를 전신적으로 주입하여 시간 경과에 따라 백혈병 부담을 생체 내에서 모니터링할 수 있도록 하였다. 생물발광 신호를 측정하여 종양 생착을 분석하고, +0일째에 마우스를 CAR.CD19SL/LH 및 CAR.CD19LL/SH T 세포 양자 모두 뿐만 아니라 HD에서 유래한 대조군 NT-T 세포로 처리하였다(도 12A). 생물발광 분석에 의해 명확하게 입증된 바와 같이, CAR.CD19SL/LH 및 CAR.CD19LL/SH T 세포는 생체 내 NALM-6 증식을 상당히 제어할 수 있었다. 그런 다음 생체 내 환경에서도 NALM-6 CAR.CD19SL/LH가 CAR T-세포에 의해 인식되는지 여부를 평가하였다. 도 12B에 도시된 바와 같이, CAR.CD19SL/LH T 세포는 대조군 NT T 세포에 비해 생체 내 CAR+ NALM-6 세포의 증식을 상당히 감소시킬 수 있었다. DAUDI 세포주의 덜 공격적인 림프종 모델에서도 동일한 데이터가 확인되었다(도 12D). 이 모델에서 CAR.CD19SL/LH T 세포는 치료된 모든 마우스에서 CAR+ 림프종 세포를 제어하고 제거할 수 있었다. CAR.CD19 T-세포로 치료된 마우스 코호트는 실험 절차의 종료 시점에(21일째) 100%의 무병 생존율(DFS)에 도달한 반면, NT T-세포를 받은 대조군 마우스 코호트는 0%의 DFS이었다. 또한 NALM-6 CAR.CD19LL/SH와 관련된 시험관 내 데이터도 확증되었다. 또한 생체 내 환경에서도 CAR T 세포는 CAR.CD19SL/LH 모델(도 12B 및 도 12E)에서 관찰된 것보다 낮은 정도이기는 하지만 NALM-6 CAR.CD19LL/SH에 대해 항-백혈병 제어 효과를 발휘할 수 있었다(도 12C).

마지막으로 자살 유전자 iC9이 AP1903에 의해 활성화되면 CAR+ 백혈병 증식을 제어하는 능력이 생체 내에서 활성화된다는 사실도 입증되었다. 구체적으로, NSG 마우스에 iCas9.CAR.CD19_LH DAUDI 세포를 주입하고 종양 생착 후 이합체화 약물 AP1903을 1일째부터 28일째까지 복강 내로 투여하였다(도 13A). AP1903을 투여하여 iC9을 활성화한 결과, 연구된 마우스 10마리 중 9마리에서 CAR+ 백혈병이 완전히 박멸되었다(도 13B 및 13C). 또한, AP1903을 투여하면 약물 투여 중단 후에도 치료된 마우스의 100%가 생존할 수 있었으며 63일째(실험 종료 시점, 도 13D)까지 백혈병 재발을 보인 마우스는 없었다. CID 투여 후 IVIS 분석에서 양성 신호를 보인 유일한 마우스는 백혈병 세포의 특성을 파악하기 위해 음성 대조군(동일한 코호트의 마우스) 및 양성 대조군(CID를 투여하지 않은 마우스)과 함께 35일째에 고통의 징후 없이 조기 희생되었다. 말초 혈액, 비장, 경골 BM(왼쪽 옆구리)에 세포형광측정 분석을 적용한 결과, CAR 분자가 양성으로 발현된 CID를 투여한 마우스에서는 백혈병 세포를 검출할 수 없었다.

실시예 2 : 8aa 내지 14aa의 짧은 링커와, 긴 링커를 가진 상이한 CAR.CD19 분자의 비교

인실리코 모델을 수행하여 8 aa 내지 14 aa의 짧은 링커로 구성된 CAR.CD19 분자는 15aa의 긴 링커를 가진 고전적인 CAR.CD19와 비교하여 상이한 3D 구조를 특징으로 하며, 이는 감소된 길이를 갖는 링커를 가진 CAR.CD19가 15aa의 표준 링커를 가진 CAR.CD19에서 관찰되는 것에 비해 상이한 표적 마스킹을 제공하는 공간 구성을 가지고 있다는 것을 추가로 증명한다.

하기 링커를 VL 서열(서열번호 15)와 VH 서열(서열번호 16)을 연결하기 위해 사용하였다:

G3SG4 GGGSGGGG 짧은 링커(서열번호 38)

SG4SG3 SGGGGSGGG(서열번호 186),

(SG4)2 SGGGGSGGGG(서열번호 190)

(SG4)2 S SGGGGSGGGGS(서열번호 187)

(SG4)2 SG SGGGGSGGGGSG(서열번호 188)

(SG4)2 SG2 SGGGGSGGGGSGG(서열번호 191)

(SG4)2 SG3 SGGGGSGGGGSGGG(서열번호 189)

(SG4)3 SGGGGSGGGGSGGGG 긴 링커(서열번호 39)

이 모델에서는, 수정된 쿼터니언 접근법을 사용하여 단백질 중첩을 계산하기 위해 Superpose 도구를 사용하였다. Superpose는 두 개 이상 구조의 중첩으로부터 서열 정렬, 구조 정렬, PDB 좌표, RMSD 통계, 차이 거리 플롯(Difference Distance Plot) 및 중첩된 구조의 상호작용형 이미지를 생성한다. SuperPose 웹 서버는 PDB 형식의 파일 또는 PDB 수탁 번호의 제출을 지원한다. 이 도구는 전체 레퍼토리에 걸쳐 8aa에서 15aa에 걸친 상이한 길이의 링커를 포함하는 CAR.CD19의 구조를 비교하는 데 사용되었다.

상이한 거리 매트릭스는 PNG 이미지로 생성되어 8 내지 14 aa의 링커를 포함하는 임의의 구조와 15 aa의 긴 링커를 포함하는 표준 CAR.CD19 구조 사이에 상당한 차이가 있는 영역을 시각적으로 식별하는 데 사용할 수 있다. 밝은 영역일수록 구조가 더 유사하다(도 14 내지 21). 마찬가지로, 영역이 어두울수록 구조가 더 상이하다. SuperPose의 차이 거리 플롯의 기본 디스플레이에는 6단계로 구분된 컷오프가 표시된다.

0과 1,5 옹스트롬(A) 사이의 차이는 흰색, 1,5와 3,0 A 사이의 차이는 매우 밝은 회색, 3,0과 5,0 A 사이의 차이는 밝은 회색, 5와 7 A 사이의 차이는 회색, 7과 9 A 사이의 차이는 짙은 회색, 9와 12 A 사이의 차이는 매우 짙은 회색이고, 12 A 이상의 차이는 검은색이다.

도 14 내지 21은 또한 알파 카본과 백본뿐만 아니라 무거운 구조물에 대한 (루트-평균-제곱 편차) RMSD 데이터에 대한 요약 표를 도시한다. 이들 표는 더 긴 15aa 링커를 가진 CAR.CD19 구성과 비교하여 8 내지 14aa에 걸친 링커를 가진 모든 CAR.CD19 구성의 유의미한 차이를 보여준다. 이러한 차이는 8 내지 14aa를 포함하는 링커를 가진 CAR.CD19가 더 긴 링커를 가진 CAR.CD19에 비해 상이한 마스킹 잠재력을 갖는다는 것을 시사한다. 원자 위치의 제곱근 평균 편차 또는 간단히 제곱근 평균 편차(RMSD)는 중첩된 단백질의 원자(일반적으로 백본 원자) 사이의 평균 거리를 측정한 값이다.

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SEQUENCE LISTING <110> Ospedale Pediatrico Bambino Ges? <120> CAR T CELLS FOR TREATING CD19+, CD20+ OR CD22+ TUMORS OR B-CELL DERIVED AUTO-IMMUNE DISEASES <130> PCT45294 <150> IT102020000030266 <151> 2020-12-10 <160> 191 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Asn Thr Leu Pro 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr 1 5 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of anti CD20 VL sequence <400> 6 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of anti CD20 VL sequence <400> 7 Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> 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polypetide comprising iC9 and anti-CD19 CAR <400> 180 atgctcgaga tgctggaggg agtgcaggtg gagactatta gccccggaga tggcagaaca 60 ttccccaaaa gaggacagac ttgcgtcgtg cattatactg gaatgctgga agacggcaag 120 aaggtggaca gcagccggga ccgaaacaag cccttcaagt tcatgctggg gaagcaggaa 180 gtgatccggg gctgggagga aggagtcgca cagatgtcag tgggacagag ggccaaactg 240 actattagcc cagactacgc ttatggagca accggccacc ccgggatcat tccccctcat 300 gctacactgg tcttcgatgt ggagctgctg aagctggaaa gcggaggagg atccggagtg 360 gacgggtttg gagatgtggg agccctggaa tccctgcggg gcaatgccga tctggcttac 420 atcctgtcta tggagccttg cggccactgt ctgatcatta acaatgtgaa cttctgcaga 480 gagagcgggc tgcggaccag aacaggatcc aatattgact gtgaaaagct gcggagaagg 540 ttctctagtc tgcactttat ggtcgaggtg aaaggcgatc tgaccgctaa gaaaatggtg 600 ctggccctgc tggaactggc tcggcaggac catggggcac tggattgctg cgtggtcgtg 660 atcctgagtc acggctgcca ggcttcacat ctgcagttcc ctggggcagt ctatggaact 720 gacggctgtc cagtcagcgt ggagaagatc gtgaacatct tcaacggcac ctcttgccca 780 agtctgggcg ggaagcccaa actgttcttt attcaggcct gtggaggcga gcagaaagat 840 cacggcttcg aagtggctag cacctccccc gaggacgaat cacctggaag caaccctgag 900 ccagatgcaa cccccttcca ggaaggcctg aggacatttg accagctgga tgccatctca 960 agcctgccca caccttctga cattttcgtc tcttacagta ctttccctgg atttgtgagc 1020 tggcgcgatc caaagtcagg cagctggtac gtggagacac tggacgatat ctttgagcag 1080 tgggcccatt ctgaagacct gcagagtctg ctgctgcgag tggccaatgc tgtctctgtg 1140 aaggggatct acaaacagat gccaggatgc ttcaactttc tgagaaagaa actgttcttt 1200 aagacctccg catctagggc cccgcgggaa ggccgaggga gcctgctgac atgtggcgat 1260 gtggaggaaa acccaggacc accatggatg gagtttggac tttcttggtt gtttttggtg 1320 gcaattctga agggtgtcca gtgtagcagg gacatccaga tgacacagac tacatcctcc 1380 ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagt 1440 aaatatttaa attggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctaccat 1500 acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat 1560 tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag 1620 ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg gggactaagt tggaaataac aggcggagga 1680 agcggaggtg ggggcgaggt gaaactgcag gagtcaggac ctggcctggt ggcgccctca 1740 cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca ggggtctcat tacccgacta tggtgtaagc 1800 tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg gggtagtgaa 1860 accacatact ataattcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga caactccaag 1920 agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat ttactactgt 1980 gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggtca aggaacctca 2040 gtcaccgtct cctcaggatc cgaacttcct actcagggga ctttctcaaa cgttagcaca 2100 aacgtaagtc ccgccccaag accccccaca cctgcgccga ccattgcttc tcaacccctg 2160 agtttgagac ccgaggcctg ccggccagct gccggcgggg ccgtgcatac aagaggactc 2220 gatttcgctt gcgacatcta tatctgggca cctctcgctg gcacctgtgg agtccttctg 2280 ctcagcctgg ttattactct gtactgtaat caccggaatc gccgccgcgt ttgtaagtgt 2340 cccagggtcg acaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 2400 agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 2460 gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 2520 cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 2580 ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 2640 caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 2700 gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 2760 acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 2817 <210> 181 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic peptide <400> 181 Ser Thr Asn Val Ser Pro Ala Pro Arg 1 5 <210> 182 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic peptide <400> 182 Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe 1 5 10 <210> 183 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic peptide <400> 183 Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe 1 5 <210> 184 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic peptide <400> 184 Ser Val Thr Val Ser Ser Pro Ala Pro Arg 1 5 10 <210> 185 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic peptide <400> 185 Val Thr Val Ser Ser Pro Ala Pro Arg 1 5 <210> 186 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 186 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 187 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 187 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 188 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 188 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 189 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 189 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 190 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 190 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 191 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 191 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10

Claims (28)

1. 키메라 항원 수용체로서,
   N-말단에서 C-말단으로,
   a) 신호 펩타이드,
   b) 항 CD19 단일 사슬 항체 도메인, 항 CD20 단일 사슬 항체 도메인 또는 항 CD22 단일 사슬 항체 도메인으로 구성된 군에서 선택되되, 링커에 의해 서로 연결된 VL 및 VH 서열을 포함하거나 또는 구성되는 단일 사슬 항체 도메인,
   c) 힌지,
   d) 막투과 도메인(trans membrane domain),
   e) 공동-자극 신호전달 도메인(co-stimulatory signaling domain), 및
   f) CD3제타 사슬 서열
   을 포함하거나 또는 구성되고,
   상기 링커는 7 내지 12개, 7 내지 10개 또는 8개의 아미노산과 같은 7 내지 14개의 아미노산 길이를 갖는 짧은 가요성 링커인, 키메라 항원 수용체.
2. 제1항에 있어서,
   항 CD19 단일 사슬 항체 도메인은 항 CD19 FMC63 하이브리도마 VL 및 VH 서열을 포함하되, 여기서 항 CD19 FMC63 하이브리도마 VL 서열은 CDR1 서열 QDISKY(서열번호 1), CDR2 서열 HTS 및 CDR3 서열 GNTLP(서열번호 2)를 포함하는 한편, 항 CD19 FMC63 하이브리도마 VH 서열은 CDR1 서열 GVSLPDYG(서열번호 3), CDR2 서열 IWGSETT(서열번호 4) 및 CDR3 서열 AKHYYYGGSYAMDY(서열번호 5)를 포함하고;
   항 CD20 단일 사슬 항체 도메인은 항 CD20 VL 및 VH 서열을 포함하되, 여기서 항 CD20 VL 서열은 CDR1 서열 SSVSY(서열번호 6), CDR2 서열 ATS 및 CDR3 서열 QQWTSNPPT(서열번호 7)를 포함하는 한편, 항 CD20 VH 서열은 CDR1 서열 GYTFTSYN(서열번호 8), CDR2 서열 IYPGNGDT(서열번호 9) 및 CDR3 서열 ARSTYYGGDWYFNV(서열번호 10)를 포함하고;
   항 CD22 단일 사슬 항체 도메인은 항 CD22 VL 및 VH 서열을 포함하되, 여기서 항 CD22 VL 서열은 CDR1 서열 QSLANSYGNTF(서열번호 11), CDR2 서열 GIS 및 CDR3 서열 LQGTHQP(서열번호 12)를 포함하는 한편, 항 CD 22 VH 서열은 CDR1 서열 GYRFTNYWIH(서열번호 13), CDR2 서열 INPGNNYA(서열번호 14) 및 CDR3 서열 TR을 포함하는,
   키메라 항원 수용체.
3. 제2항에 있어서,
   항 CD19 FMC63 하이브리도마 VL 서열은 서열
   DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT(서열번호 15)를 포함하거나 또는 구성되고,
   항 CD19 FMC63 하이브리도마 VH 서열은 서열
   EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS(서열번호 16)를 포함하거나 또는 구성되며;
   항 CD20 VL 서열은 서열
   QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK(서열번호 17)를 포함하거나 또는 구성되고,
   항-CD20 VH 서열은 서열
   QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA(서열번호 18)를 포함하거나 또는 구성되며;
   항 CD22 VL 서열은 서열
   DVQVTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLANSYGNTFLSWYLHKPGKAPQLLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGTHQPYTFGQGTKVEIK(서열번호 19)를 포함하거나 또는 구성되고,
   항-CD22 VH 서열은 서열
   EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYRFTNYWIHWVRQAPGQGLEWIGGINPGNNYATYRRKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTREGYGNYGAWFAYWGQGTLVTVSS(서열번호 20)를 포함하거나 또는 구성되는,
   키메라 항원 수용체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   VL 및 VH 서열을 연결하는 상기 링커는 (G4S)2 링커 GGGGSGGGG(서열번호 35), G4SG2 링커 GGGGSGG(서열번호 37) 또는 G3SG4 링커 GGGSGGGG(서열번호 38), SG4SG3 링커 SGGGGSGGG(서열번호 186), (SG4)2 S 링커 SGGGGSGGGGS(서열번호 187), (SG4)2 SG 링커 SGGGGSGGGGSG(서열번호 188), (SG4)2 SG3 링커 SGGGGSGGGGSGGG 링커(서열번호 189), (SG4)2 SGGGGSGGGG(서열번호 190), (SG4)2 SG2 SGGGGSGGGGSGG(서열번호 191)와 같은 글리신-풍부 가요성 Flex 링커로 구성된 군에서 선택되고, 바람직하게는, G3SG4 링커인,
   키메라 항원 수용체.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 힌지는 다음 힌지 중 하나 이상:
   CD8stalk
   TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(서열번호 21);
   힌지 CD28
   EVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(서열번호 22);
   힌지 CH2-CH3
   ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 23); 또는
   힌지 CH3:
   ESKYGPPCPSCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 24)
   을 포함하거나 또는 구성되며,
   바람직하게는 CD8stalk인,
   키메라 항원 수용체.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 힌지는 N 말단에서 추적 가능한 마커에 연결되고, 상기 추적 가능한 마커는 선택적으로 제2 링커에 의해 단일 사슬 항체 도메인에 연결되는, 키메라 항체 수용체.
7. 제6항에 있어서,
   상기 추적 가능한 마커는
   ΔCD34 ELPTQGTFSNVSTNVS(서열번호 25); 또는
   NGFR
   KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN(서열번호 26)
   으로 구성된 군에서 선택되고,
   바람직하게는 ΔCD34인,
   키메라 항체 수용체.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 힌지 CD8stalk는 상기 추적 가능한 마커 ΔCD34에 연결되는, 키메라 항체 수용체.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 막투과 도메인은 CD28TM FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(서열번호 27) 또는 CD8aTM IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(서열번호 28)로 구성된 군에서 선택되고, 바람직하게는 CD8aTM인, 키메라 항원 수용체.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공동-자극 신호전달 도메인은
    CD28 세포질 서열 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(서열번호 29),
    CD137(4-1BB) 서열 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(서열번호 30),
    OX40 서열 RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(서열번호 31), 또는
    하기를 연결하여 얻은 서열:
    CD28 세포질 서열(서열번호 29)과 CD137(4-1BB) 서열(서열번호 30),
    CD137(4-1BB) 서열(서열번호 30)과 CD28 세포질 서열(서열번호 29),
    CD28 세포질 서열(서열번호 29)과 OX40 서열(서열번호 31),
    OX40 서열(서열번호 31)과 CD28 세포질 서열(서열번호 29),
    OX40 서열(서열번호 31)과 CD137(4-1BB) 서열(서열번호 30),
    CD137(4-1BB) 서열(서열번호 30)과 OX40 서열(서열번호 31)
    로 구성된 군에서 선택되는, 키메라 항체 수용체.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD3제타 사슬 서열은
    RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(서열번호 32)인,
    키메라 항체 수용체.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    막투과 도메인과 공동-자극 신호전달 도메인 사이에 CD8cyt의 세포질 모이어티: LYCNHRNRRRVCKCPR(서열번호 40)를 추가로 포함하는, 키메라 항체 수용체.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신호 펩타이드는 MEFGLSWLFLVAILKGVQC(서열번호 41)를 포함하거나 또는 구성되는, 키메라 항원 수용체.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-CD19 키메라 항원 수용체는 다음 서열:
    MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSELPTQGTFSNVSTNVSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열번호 72) 또는
    MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열번호 33)
    을 포함하거나 또는 구성되는, 키메라 항체 수용체.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 구성되는 뉴클레오타이드 서열.
16. 제15항에 있어서,
    항 CD19 FMC63 하이브리도마 VL 서열은 뉴클레오타이드 서열
    GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA(서열번호 52)
    에 의해 인코딩되고,
    항 CD19 FMC63 하이브리도마 VH 서열은 뉴클레오타이드 서열
    GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(서열번호 53)
    에 의해 인코딩되며;
    항 CD20 VL 서열은 뉴클레오타이드 서열
    CAGATCGTGCTGAGCCAGAGCCCCGCCATCCTGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGGGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAGCAGCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGTGAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGGGTGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGACCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG(서열번호 54)
    에 의해 인코딩되고
    항 CD20 VH 서열은 뉴클레오타이드 서열
    CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCCGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCCGGCAGGGGCCTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTGTGGGGCGCCGGCACCACCGTGACCGTGAGC(서열번호 55)에 의해 인코딩되며;
    항 CD22 VL 서열은 뉴클레오타이드 서열
    GACGTGCAGGTGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGAGCAGCCAGAGCCTGGCCAACAGCTACGGCAACACCTTCCTGAGCTGGTACCTGCACAAGCCCGGCAAGGCCCCCCAGCTGCTGATCTACGGCATCAGCAACAGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGGCACCCACCAGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG(서열번호 56)에 의해 인코딩되고,
    항 CD22 VH 서열은 뉴클레오타이드 서열
    GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGGTTCACCAACTACTGGATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGGCATCAACCCCGGCAACAACTACGCCACCTACAGGAGGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATGACCGCCGACACCAGCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGGGAGGGCTACGGCAACTACGGCGCCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC(서열번호 57)
    에 의해 인코딩되는,
    뉴클레오타이드 서열.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    항-CD19 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 상기 뉴클레오타이드 서열은:
    ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(서열번호 58) 또는
    ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAA(서열번호 34)인,
    뉴클레오타이드 서열.
18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뉴클레오타이드 서열은, 2A 자가-절단 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 상기 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결된 자살 유전자 유도성 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 추가로 포함하는, 뉴클레오타이드 서열.
19. 제18항에 있어서,
    상기 자살 유전자 유도성 아미노산 서열은 키메라 카스파제-9 폴리펩타이드거나 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제를 포함하는, 뉴클레오타이드 서열.
20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    ATGCTCGAGATGCTGGAGGGAGTGCAGGTGGAGACTATTAGCCCCGGAGATGGCAGAACATTCCCCAAAAGAGGACAGACTTGCGTCGTGCATTATACTGGAATGCTGGAAGACGGCAAGAAGGTGGACAGCAGCCGGGACCGAAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGGAAGCAGGAAGTGATCCGGGGCTGGGAGGAAGGAGTCGCACAGATGTCAGTGGGACAGAGGGCCAAACTGACTATTAGCCCAGACTACGCTTATGGAGCAACCGGCCACCCCGGGATCATTCCCCCTCATGCTACACTGGTCTTCGATGTGGAGCTGCTGAAGCTGGAAAGCGGAGGAGGATCCGGAGTGGACGGGTTTGGAGATGTGGGAGCCCTGGAATCCCTGCGGGGCAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGTCTATGGAGCCTTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAGAGCGGGCTGCGGACCAGAACAGGATCCAATATTGACTGTGAAAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAGGTGAAAGGCGATCTGACCGCTAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAACTGGCTCGGCAGGACCATGGGGCACTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGAGTCACGGCTGCCAGGCTTCACATCTGCAGTTCCCTGGGGCAGTCTATGGAACTGACGGCTGTCCAGTCAGCGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTCAACGGCACCTCTTGCCCAAGTCTGGGCGGGAAGCCCAAACTGTTCTTTATTCAGGCCTGTGGAGGCGAGCAGAAAGATCACGGCTTCGAAGTGGCTAGCACCTCCCCCGAGGACGAATCACCTGGAAGCAACCCTGAGCCAGATGCAACCCCCTTCCAGGAAGGCCTGAGGACATTTGACCAGCTGGATGCCATCTCAAGCCTGCCCACACCTTCTGACATTTTCGTCTCTTACAGTACTTTCCCTGGATTTGTGAGCTGGCGCGATCCAAAGTCAGGCAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGATATCTTTGAGCAGTGGGCCCATTCTGAAGACCTGCAGAGTCTGCTGCTGCGAGTGGCCAATGCTGTCTCTGTGAAGGGGATCTACAAACAGATGCCAGGATGCTTCAACTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACCTCCGCATCTAGGGCCCCGCGGGAAGGCCGAGGGAGCCTGCTGACATGTGGCGATGTGGAGGAAAACCCAGGACCACCATGGATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(서열번호 180)인,
    뉴클레오타이드 서열.
21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로서,
    상기 벡터는 DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, γ-레트로바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터, 또는 비바이러스 벡터인, 벡터.
22. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 키메라 항원 수용체 및/또는 제21항에 따른 벡터 또는 플라스미드를 포함하는, 알파/베타 및 감마/델타 T 세포와 같은 T 세포, NK 세포, NK-T 세포와 같은 세포.
23. 제22항에 있어서,
    키메라 카스파제-9 폴리펩타이드와 같은 자살 유전자 유도성 아미노산 서열을 추가로 포함하거나 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제를 포함하는, 세포.
24. 제23항에 있어서,
    상기 키메라 카스파제-9 폴리펩타이드는
    하기 서열의 인간 FKBP12(V36F)의 돌연변이체 및 짧은 5' 리더 펩타이드 MLEMLE(서열번호 43)를 포함하거나 또는 구성되는 FKBP12 결합 영역:
    GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE(서열번호 44)-이는 SGGGSG(서열번호 45) 링커와 같은 링커에 의해 카스파제-9 폴리펩타이드에 연결됨-;
    VDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS(서열번호 46)-이는 ASRAPR(서열번호 47) 링커와 같은 링커에 의해, T2A AEGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 48), P2A ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 49), E2A QCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 50) 또는 F2A: VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 51)로 구성된 군에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 2A 자가-절단 펩타이드, 바람직하게는 T2A에 연결됨-
    을 포함하거나 또는 구성되는, 세포.
25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-7 및 IL-15 양자 모두가 존재하는 배양 조건, 예를 들어 상기 세포의 제조를 위한 공정의 활성화 단계, 형질도입(transduction) 단계 및/또는 증식(expansion) 단계의 배양 조건에서 얻어지는, 세포.
26. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열, 또는 제21항에 따른 벡터, 또는 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 세포를 하나 이상의 부형제 및/또는 아쥬반트와 함께 포함하는 약학 조성물.
27. 의료 용도를 위한, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 키메라 항원 수용체, 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열, 제21항에 따른 벡터, 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 세포, 제26항에 따른 약학 조성물.
28. CD19+, CD20+ 또는 CD22+ 암, 예를 들어 B 세포 림프종(비호지킨 림프종(NHL)), 급성 림프모구 백혈병(ALL), 골수성 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병(CLL), B 세포 유래 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 키메라 항원 수용체, 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열, 제21항에 따른 벡터, 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 세포, 제26항에 따른 약학 조성물.