IT202000030266A1 - Car t cells for treating cd19+, cd20+ or cd22+ tumors. - Google Patents
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Description
CELLULE CAR T PER TRATTARE TUMORI CD19+, CD20+ O CD22+
La presente invenzione riguarda cellule CAR T per trattare tumori CD19+, CD20+ o CD22+. In particolare, la presente invenzione riguarda potenti cellule CAR T per trattare tumori CD19+, CD20+ o CD22+, come leucemia e neoplasie maligne linfoidi, che forniscono una maggiore sicurezza nella terapia di detti tumori e impediscono il mascheramento degli epitopi in blasti di leucemia a cellule B CAR+, dette cellule CAR T essendo in grado di ridurre il rischio potenziale di una recidiva leucemica CD19-/CAR+, CD20-/CAR+ o CD22-/CAR+.
Le cellule T derivate da pazienti geneticamente modificate per esprimere recettori chimerici di antigeni (chimeric antigen receptor, CAR) specifici per il CD19 rappresentano una nuova opzione efficace per i pazienti con una leucemia linfoblastica acuta da precursori di cellule B recidivante/refrattaria (Bcp-ALL)<1,2>. Di fatto, due recenti approvazioni rapide della FDA (il prodotto di cellule CAR T che bersaglia CD19 Kymriah? di Novartis e il prodotto Yescarta? di Kite, basati su una piattaforma lentivirale e retrovirale, rispettivamente) hanno evidenziato l?avanzamento rapido dei progressi realizzati in questo campo. In considerazione dei risultati entusiasmanti segnalati in pazienti con neoplasie maligne CD19+ a cui sono state somministrate cellule T CAR<3,4>, si prevede che un numero continuamente crescente di pazienti sar? considerato per questo trattamento e, pertanto, sar? esposto a prodotti con geni modificati. Poich? le tecniche di manipolazione genica sono relativamente nuove, alcuni degli effetti collaterali ritardati associati alla terapia a base di cellule CAR T sono ancora imprevedibili, e i ricercatori medici, le istituzioni e gli enti regolatori stanno lavorando per garantire che la terapia genica sia il pi? sicura possibile.
Nel caso di una B-ALL, la terapia con cellule CAR T determina una risposta clinica rapida e prolungata, ma una barriera per la diffusione ? rappresentata dalle reazioni potenzialmente letali quali recidiva, sindrome da rilascio di citochine (cytokine release syndrome, CRS) ed effetto on-target off-tumor.
La recidiva ? una fase difficile da superare per una terapia anti-leucemica con cellule CAR T, nonostante i tassi elevati di remissione completa iniziali. Le recidive precoci, CD19-positive (o CD20/CD22-positive per cui sono altres? previste recidive precoci), sono correlate alla breve persistenza in vivo delle cellule CAR T, oppure alla sua inibizione indotta dal microambiente. Nel corso del tempo, fino al 30% delle recidive dei pazienti ? caratterizzato da una progressione di B-ALL CD19-negativa, in cui si verifica la perdita di antigene, in ragione di uno splicing alternativo degli esoni, o di una delezione genica. La mutazione rende le cellule tumorali nuovamente invisibili alle CAR-T corazzate<5>.
La CRS ? un disturbo immuno-mediato caratterizzato dall?attivazione di un numero cospicuo di cellule T e da una secrezione eccessiva di citochine infiammatorie che determina una lesione endoteliale viscerale o vascolare, insufficienza cardiaca e sofferenza respiratoria tra le altre complicazioni che possono essere fatali<6>.
L? on-target off-tumor ? dovuto a una reattivit? delle cellule CAR-T contro tessuti normali, che esprimono gli antigeni associati al tumore. Pertanto, gli antigeni bersagliati devono essere quanto pi? specifici possibile per ridurre il bersagliamento offtumor.
Nel contesto di un trattamento con cellule T CAR.CD19, l?azione off-tumor delle cellule T nei pazienti ? associata a un?aplasia delle cellule B a lungo termine<7>.
Come punto di sicurezza, una modifica del costrutto di CAR per eliminare selettivamente le cellule T trasferite in modo adottivo sta diventando una fase fondamentale per la traslazione clinica proficua di questo approccio.
L?inclusione di un gene suicida fornisce una misura di sicurezza aggiuntiva nel caso di una tossicit? grave.
Sono state sviluppate diverse variazioni, basate sull?integrazione genetica di un enzima transgenico per attivare un pro-farmaco citotossico (HSV-TK), o molecole superficiali (CD20, EGFR) che mediano un meccanismo di deplezione anticorpo-dipendente di cellule T geneticamente modificate<8,9>.
L?uso clinico del gene suicida caspasi 9 inducibile (inducible caspase 9, iC9) ? stato altres? segnalato in pazienti che hanno ricevuto un trapianto aplo-identico di cellule staminali ematopoietiche, in cui i linfociti dei donatori erano stati modificati per migliorare il controllo di GVHD o CRS. L?infusione del farmaco AP1903 avvia l?apoptosi cellulare mediante l'attivazione della dimerizzazione di iC9<10,11>.
Nel campo delle cellule T CAR, ? stata segnalata la presenza di clonotipi leucemici in prodotti farmaceutici (Drug Products, DP) derivati dai pazienti ottenuti attraverso una manipolazione genica basata su un vettore lentivirale che codifica per un CAR.CD19 di seconda generazione. In particolare, sono stati segnalati due pazienti con Bcp-ALL che hanno presentato una recidiva di leucemia che esprime CAR.CD19 CD19-negativa. Questa osservazione essendo interpretabile come una trasduzione accidentale di cellule leucemiche con un lentivirus CAR.CD19 di seconda generazione durante la produzione di cellule T CAR. Questo clone leucemico ? risultato essere resistente all?uccisione delle cellule T CAR.CD19 in un modello di xenotrapianto<12>.
L?analisi del sequenziamento di catene pesanti delle immunoglobuline di nuova generazione (nextgeneration immunoglobulin heavy chain sequencing, NGIS) di 17 prodotti di infusione aggiuntivi ha anche identificato i clonotipi leucemici in sei prodotti aggiuntivi (35%).
Gli esperimenti in vitro e in vivo hanno dimostrato che questi cloni di cellule leucemiche CAR+ non erano stati uccisi dalle cellule T CAR.CD19<12>. Di conseguenza, gli approcci con le cellule CAR T hanno rivelato un rischio potenziale di ricaduta leucemica CD19-/CAR+. Uno studio mostra che i cloni di cellule leucemiche CAR+ possono essere controllati mediante un CAR di idiotipo anti-CAR.CD19<13>. Secondo questo approccio, le cellule sia CAR-T sia anti-CAR devono essere generate per ciascun paziente con un conseguente aumento dei costi.
Alla luce di quanto precede, ? pertanto evidente la necessit? di fornire ulteriori cellule CAR T che bersagliano CD19, CD20 e CD22, che siano in grado di superare gli svantaggi delle cellule CAR T note.
In questo contesto, lo scopo della presente invenzione ? aumentare la sicurezza di una terapia genica con cellule CAR T che bersagliano CD19, CD20 e CD22.
Secondo la presente invenzione, ? stato ora trovato che un CAR comprendente un linker corto ? in grado di riconoscere e uccidere cellule tumorali CAR+ indesiderate.
Secondo la presente invenzione, viene ora fornita una nuova progettazione di CAR CD19, CD20 o CD22 in grado di fornire una protezione nel caso improbabile di una generazione di cellule leucemiche CAR+, anche quando la produzione di cellule CAR T ? stata avviata a partire da un materiale derivato dai pazienti ricco di cellule leucemiche (sangue periferico con pi? del 45% di blasti leucemici, cos? come cellule derivate da midollo osseo).
I risultati sperimentali mostrano che la progettazione di CAR della presente invenzione fornisce cellule T CAR.CD19 in grado di riconoscere e uccidere la generazione potenziale di cellule leucemiche CAR+ indesiderate.
In particolare, studi in vitro hanno mostrato che le cellule leucemiche CD19+ trasdotte con il CAR.CD19 (iCas9CAR.CD19SL-LH) della presente invenzione, che ? caratterizzato da un vettore a linker corto (short linker, SL), oltre ad avere una cerniera lunga (long hinge, LH), mostrano un?espressione ridotta ma non assente dell?antigene bersaglio CD19, consentendo di essere riconosciute da cellule T CAR.CD19 in vitro e in vivo.
I risultati sperimentali mostrano che un CAR.CD19 della presente invenzione consente di controllare cellule leucemiche CAR+ in esperimenti sia in vitro sia in vivo, anche quando la produzione inizia da un materiale biologico caratterizzato da una pesante contaminazione di blasti leucemici.
Secondo la presente invenzione, ? stata anche valutata l?incidenza di una percentuale elevata di contaminazione leucemica in un materiale di partenza (starting material, SM) derivato dai pazienti su un prodotto farmaceutico (DP) di cellule T CAR. I risultati hanno mostrato che, bench? la presenza di un numero cospicuo di cellule CD19+ in SM non abbia influito sul livello di trasduzione dei DP, cos? come sulla resa di recupero finale quando l?SM presentava pi? del 45% di contaminazione di cellule leucemiche B CD19+. I DP sono stati approfonditamente caratterizzati mediante un saggio citofluorimetrico e una biologia molecolare per ridisposizioni di immunoglobuline (Ig), mostrando che il livello di contaminazione di cellule B nei DP non era correlato alla percentuale di cellule CD19+ nel SM.
Pertanto, vengono fornite prove secondo cui l?uso di un materiale derivato da pazienti fortemente arricchito di cellule leucemiche B ha determinato la generazione di prodotti di cellule T CAR con una contaminazione significativa di cellule leucemiche.
Secondo la presente invenzione, cellule mononucleari di sangue periferico isolate da pazienti con una percentuale elevata di blasti in circolazione (alla diagnosi oppure alla recidiva per aumentare la possibilit? di un livello elevato di contaminazione di cellule B nei materiali di partenza) sono state geneticamente modificate con un vettore ?-retrovirale che trasporta una molecola CAR.CD19.41bb di seconda generazione. Applicando una PCR quantitativa per ridisposizioni di Ig (MRD molecolare), ? stata osservata una contaminazione di cellule B nel 50% dei prodotti di cellule CAR T, in assenza di qualsiasi correlazione statistica tra una MRD nei DP e la percentuale di cellule leucemiche CD19+ presenti nel materiale di partenza. In un campione di cellule T CAR con un livello di rilevamento di cellule B inferiore alla sensibilit? del saggio molecolare, la piattaforma per citometria a flusso EuroFlow ? stata di fatto in grado di rilevare la presenza di una percentuale significativa di cellule B contaminanti, che si sono anch?esse colorate positivamente per la presenza di CAR.CD19.
Secondo la presente invenzione, come mostrato nell?esempio, le linee di cellule leucemiche B geneticamente modificate con vettore CAR.CD19 con un linker corto mostrano una riduzione significativa della MFI di CD19, con il CD19 ancora rilevabile mediante saggio citofluorimetrico, rispetto a quanto osservato nella linea di cellule B che esprime CAR.CD19 con il linker lungo, mostrando un legame negativo completo di anticorpo CD19.
Un?analisi funzionale ha confermato queste risultanze:
le cellule T CAR.CD19 dell?invenzione erano in grado di eliminare linee di cellule leucemiche CAR+ in una co-coltura in vitro.
Infine, i modelli in vivo corroborano i dati in vitro summenzionati.
Un CAR.CD19 secondo la presente invenzione pu? comprendere anche il gene suicida caspasi 9 inducibile (iC9) nel costrutto.
Secondo la presente invenzione, ? stato usato un vettore ?-retrovirale che codifica per iC9.CAR.CD19, che ? un vettore bicistronico clonato in framecon il gene suicida iC9.
Pertanto, una leucemia a cellule B CAR+ pu? essere controllata in vivo mediante l?infusione sistemica di cellule T CAR.CD19 oppure mediante la somministrazione di AP1903 per attivare il gene suicida caspasi 9 inducibile (iC9).
Infatti, AP1903 (Rimiducid) ? una bio-molecola inerte di piccole dimensioni, che ? in grado di attivare la cascata della caspasi iC9-mediata inducendo una dimerizzazione del dominio della proteina di legame a FK del costrutto<10>. In uno studio pivotale condotto su pazienti sottoposti a un allotrapianto depleto di cellule T con una conseguente infusione post-trapianto di cellule T del donatore trasdotte con iC9, ? stato mostrato che la somministrazione di AP1903 pu? innescare una dimerizzazione indotta chimicamente ed eliminare cellule T geneticamente modificate sia dal sangue periferico sia dal sistema nervoso centrale (central nervous system, CNS), determinando una rapida risoluzione di GVHD e CRS. Pertanto, un?attivazione di iC9 mediante una singola dose di AP1903 produce un controllo sia rapido sia a lungo termine delle cellule T che trasportano il gene suicida<11>.
Come descritto nell?esempio di seguito, le linee di cellule tumorali CD19<+ >sono state geneticamente modificate con il vettore bicistronico che codifica per iC9.CAR.CD19 per riprodurre un clonotipo leucemico CAR+. Gli esperimenti in vitro hanno mostrato che l'attivazione di iC9 mediante un?esposizione ad AP1903 era in grado di eliminare le cellule leucemiche CAR+. In particolare, l?analisi citofluorimetrica di linee di cellule leucemiche iC9.CAR+ trattate con AP1903 mostra che le cellule rimanenti che sopravvivevano in coltura erano caratterizzate da un?espressione notevolmente ridotta del CAR rispetto alle cellule non trattate, ma ancora con una soglia di MFI di CAR rilevabile. Un?analisi molecolare pi? sensibile rivela che un?attivazione di iC9 era associata a una riduzione significativa del rilevamento del transgene tra le cellule residue dopo il trattamento, con le cellule B leucemiche che sopravvivevano dopo il trattamento con AP1903 mostrando una soglia di VCN bassa residua.
Questi dati hanno confermato svariate evidenze sia in vitro<14,15 >sia in vivo<16>, mostrando che un trattamento con AP1903 ? estremamente efficiente nell?eliminare la grande maggioranza delle cellule iC9+, risparmiando al contempo le cellule con un livello inferiore di espressione di iC9. In effetti, nel contesto delle cellule T geneticamente modificate, i pazienti che hanno ricevuto un?infusione di cellule iC9-T aploidentiche dopo un HSCT per trattare una GVHD, hanno mostrato l?1% di cellule iC9-T residue dopo la somministrazione di AP1903. Le cellule T iC9+ residue erano caratterizzate da una notevole debole espressione del transgene, probabilmente correlata a un basso livello di attivazione delle cellule T. In effetti, l?eliminazione delle cellule T iC9+ potrebbe essere potenziata mediante l'attivazione delle cellule T durante somministrazioni ripetute di AP1903<16>. Per contro, quando la iC9 viene espressa nelle cellule tumorali, AP1903 ? in grado di indurre un?apoptosi massiva e rapida, determinando un controllo tumorale in vivo significativo<14,15>.
Nel contesto della presente invenzione, nel caso di un evento improbabile di modifica genetica delle cellule leucemiche mediante un vettore retrovirale che codifica un gene di iC9.CAR.CD19, le cellule leucemiche che sopravvivono a un?esposizione ad AP1903 saranno prive di un?espressione di CAR elevata sulla propria superficie, determinando la possibilit? di bersagliare l?antigene CD19 con un?efficacia elevata mediante sia cellule NK allogeniche CAR.CD19 sia cellule T CAR.CD19, nella stessa misura delle cellule di leucemia/linfoma WT.
Inoltre, nel contesto della presente invenzione, la progettazione del CAR ? anche un fattore rilevante che regola la capacit? delle cellule T CAR.CD19 di riconoscere e uccidere le cellule leucemiche CAR+, senza modificare in modo sostanziale l?attivit? antileucemica delle cellule T CAR.CD19. In effetti, le cellule T CAR.CD19SL/LH o SL/SH esercitano un?attivit? anti-leucemica significativa in modelli sia in vitro sia in vivo, nella stessa misura delle cellule T CAR.CD19LL/SH pi? convenzionali. Ciononostante, quando il CD19 e il CAR.CD19 a linker corto vengono espressi in CIS sulla stessa membrana cellulare di linee di cellule B leucemiche, queste ultime hanno mostrato una MFI di CD19 significativamente ridotta rispetto a cellule B wild-type, con il CD19 essendo ancora rilevabile mediante citometria a flusso, suggerendo un mascheramento CIS non completo dell?antigene.
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione un recettore chimerico di antigene comprendente o consistente in, dall?N-terminale al C-terminale:
a) un peptide segnale,
b) un dominio anticorpale a catena singola scelto dal gruppo consistente in dominio anticorpale a catena singola anti-CD19, dominio anticorpale a catena singola anti-CD20 o dominio anticorpale a catena singola anti-CD22, detto dominio anticorpale a catena singola comprendendo o essendo consistente in sequenze VL e VH legate tra loro mediante un linker,
c) una cerniera,
d) un dominio transmembrana,
e) un dominio di segnalazione costimolatorio, e f) sequenza della catena CD3Zeta,
in cui detto linker ? un linker flessibile corto con una lunghezza da 7 a 14, ad esempio da 7 a 12 oppure da 7 a 10 o 8 amminoacidi.
Salvo specificato, come usato nella presente, un scFv pu? avere le regioni variabili VL e VH in qualsiasi ordine, ad esempio rispetto alle estremit? N-terminali e C-terminali del polipeptide, l?scFv pu? comprendere VL-linker-VH oppure pu? comprendere VH-linker-VL.
Secondo la presente invenzione, un dominio anticorpale a catena singola anti-CD19 pu? comprendere sequenze VL e VH di ibridoma FMC63 anti-CD19, in qualsiasi ordine, in cui la sequenza VL di ibridoma FMC63 anti-CD19 comprende la sequenza di CDR1 QDISKY (SEQ ID NO:1), la sequenza di CDR2 HTS e la sequenza di CDR3 GNTLP (SEQ ID NO:2), mentre la sequenza VH di ibridoma FMC63 anti-CD19 comprende la sequenza di CDR1 GVSLPDYG (SEQ ID NO:3), la sequenza di CDR2 IWGSETT (SEQ ID NO:4) e la sequenza di CDR3 AKHYYYGGSYAMDY (SEQ ID NO:5);
un dominio anticorpale a catena singola anti-CD20 pu? comprendere sequenze VL e VH anti-CD20, in cui la sequenza VL anti-CD20<22 >comprende la sequenza di CDR1 SSVSY (SEQ ID NO:6), la sequenza di CDR2 ATS e la sequenza di CDR3 QQWTSNPPT (SEQ ID NO:7), mentre la sequenza VH anti-CD20 comprende la sequenza di CDR1 GYTFTSYN (SEQ ID NO:8), la sequenza di CDR2 IYPGNGDT (SEQ ID NO:9) e la sequenza di CDR3 ARSTYYGGDWYFNV (SEQ ID NO:10);
un dominio anticorpale a catena singola anti-CD22 pu? comprendere sequenze VL e VH anti-CD22, in cui la sequenza VL anti-CD22 comprende la sequenza di CDR1 QSLANSYGNTF (SEQ ID NO:11), la sequenza di CDR2 GIS e la sequenza di CDR3 LQGTHQP (SEQ ID NO:12), mentre la sequenza VH anti-CD 22 comprende la sequenza di CDR1 GYRFTNYWIH (SEQ ID NO:13), la sequenza di CDR2 INPGNNYA (SEQ ID NO:14) e la sequenza di CDR3 TR.
Secondo la presente invenzione, la sequenza VL di ibridoma FMC63 anti-CD19 pu? comprendere o consistere nella sequenza DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYH TSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLE IT (SEQ ID NO:15) e
la sequenza VH di ibridoma FMC63 anti-CD19 pu? comprendere o consistere nella sequenza EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGV IWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSY AMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:16);
la sequenza VL anti-CD20 pu? comprendere o consistere nella sequenza
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYAT SNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEI K (SEQ ID NO:17) e
la sequenza VH anti-CD20 pu? comprendere o consistere nella sequenza
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGA IYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGD WYFNVWGAGTTVTVSA (SEQ ID NO:18);
la sequenza VL anti-CD22 pu? comprendere o consistere nella sequenza
DVQVTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLANSYGNTFLSWYLHKPGKAPQ LLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGTHQPYTFGQ GTKVEIK (SEQ ID NO:19) e
la sequenza VH anti-CD22 pu? comprendere o consistere nella sequenza
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYRFTNYWIHWVRQAPGQGLEWIGG INPGNNYATYRRKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTREGYGNYG AWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:20).
Il linker che lega le sequenze VL e VH pu? essere scelto dal gruppo consistente in una sequenza di amminoacidi ricca di glicine corta e flessibile, come il linker (G4S)2 GGGGSGGGG (SEQ ID NO:35), il linker G4SG2 GGGGSGG (SEQ ID NO:37) o il linker G3SG4 GGGSGGGG (SEQ ID NO:38), preferibilmente il linker G3SG4.
Secondo forme di realizzazione specifiche, detta cerniera pu? comprendere o consistere in una o pi? delle seguenti cerniere:
CD8stalk
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO:21) (ID NO di nucleotide: M12828.1 e ID NO di proteina: AAB04637.1);
Cerniera CD28 EVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO:22) (ID NO di nucleotide: AJ517504.1 e ID NO di proteina: CAD57003.1);
cerniera CH2-CH3 (UNIPROTKB:P01861) ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:23); o
cerniera CH3 (UNIPROTKB:P01861):
ESKYGPPCPSCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:24), preferibilmente CD8stalk.
Secondo la presente invenzione, la cerniera pu? essere legata al dominio anticorpale a catena singola mediante un secondo linker (o adattatore).
Secondo la presente invenzione, detta cerniera pu? essere legata, in corrispondenza dell?N-terminale, a un marcatore tracciabile, detto marcatore tracciabile essendo legato, facoltativamente mediante un secondo linker (o adattatore), al dominio anticorpale a catena singola, vale a dire che il secondo linker si lega al dominio anticorpale a catena singola e al marcatore tracciabile. Ad esempio, il secondo linker (o adattatore) pu? essere un dipeptide, come ad esempio GS.
Secondo la presente invenzione, il marcatore tracciabile pu? essere scelto dal gruppo consistente in:
?CD34 ELPTQGTFSNVSTNVS (SEQ ID NO:25) (ID NO di nucleotide AB238231.1 e ID NO di proteina: BAE46748.1); o
NGFR KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVS ATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSG LVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAEC EEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVV TRGTTDN (SEQ ID NO:26) (ID NO di nucleotide: AK313654.1 e ID NO di proteina: BAG36408.1), preferibilmente ?CD34.
Secondo la presente invenzione, la cerniera CD8stalk pu? essere legata al marcatore tracciabile ?CD34.
Il dominio transmembrana pu? essere scelto dal gruppo consistente in CD28TM FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:27) (ID NO di nucleotide: BC112085.1 e ID NO di proteina: AAI12086.1) o CD8aTM IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO:28) (ID NO di nucleotide NM_001768.6 e ID NO di proteina: NP_001759.3), preferibilmente CD8aTM.
Secondo la presente invenzione, il dominio di segnalazione costimolatorio pu? essere scelto dal gruppo consistente in
sequenza citoplasmatica di CD28 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:29) (ID NO di nucleotide: AF222341.1 e ID NO di proteina: AAF33792.1),
sequenza di CD137 (4-1BB) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO:30) (ID NO di nucleotide: U03397.1 e NO di proteina: AAA53133.1),
sequenza di OX40 RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:31) (ID NO di nucleotide: NM_003327.3 e NO di proteina: NP_003318.1), o
una sequenza ottenuta legando:
la sequenza citoplasmatica di CD28 (SEQ ID NO:29) con la sequenza di CD137 (4-1BB) (SEQ ID NO:30),
la sequenza di CD137 (4-1BB) (SEQ ID NO:30) con la sequenza citoplasmatica di CD28 (SEQ ID NO:29),
la sequenza citoplasmatica di CD28 (SEQ ID NO:29) con la sequenza di OX40 (SEQ ID NO:31),
la sequenza di OX40 (SEQ ID NO:31) con la sequenza citoplasmatica di CD28 (SEQ ID NO:29),
la sequenza di OX40 (SEQ ID NO:31) con la sequenza di CD137 (4-1BB) (SEQ ID NO:30),
la sequenza di CD137 (4-1BB) (SEQ ID NO:30) con la sequenza di OX40 (SEQ ID NO:31).
Secondo la presente invenzione, la sequenza della catena CD3Zeta ? RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP PR* (SEQ ID NO:32) (ID NO di nucleotide: J04132.1 e ID NO di proteina: AAA60394.1).
Secondo la presente invenzione, il recettore chimerico di antigene pu? inoltre comprendere una frazione citoplasmatica di CD8cyt: LYCNHRNRRRVCKCPR (SEQ ID NO:40) (ID NO di nucleotide NM_001768.6 e ID NO di proteina: NP_001759.3) tra il dominio transmembrana e il dominio di segnalazione costimolatorio.
La frazione citoplasmatica di CD8cyt pu? essere legata al dominio di segnalazione costimolatorio mediante un linker, come un dipeptide, ad esempio VD.
Secondo la presente invenzione, il peptide segnale pu? comprendere o consistere in MEFGLSWLFLVAILKGVQC (SEQ ID NO:41) (ID NO di nucleotide: AB776838.1 e ID NO di proteina: BAN63131.1).
Secondo la presente invenzione, il recettore chimerico di antigene comprende o consiste in MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLN WYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQ QGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSL PDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNS LQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSELPTQGTFSNVSTNVSP APRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVL LLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSC RFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDP EMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATK DTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:72) o MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLN WYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQ QGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSL PDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNS LQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSPAPRPPTPAPTIASQPL SLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRR RVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKF SRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:33).
Nello specifico, un recettore chimerico di antigene anti-CD19 secondo la presente invenzione pu? consistere in:
peptide segnale MEFGLSWLFLVAILKGVQC (SEQ ID NO:41), che ? legato mediante un linker SR a
un dominio anticorpale a catena singola anti-CD19 proveniente dall?ibridoma FMC63 consistente della sequenza VL di FMC63 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLH SGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
(SEQ ID NO:15) legata mediante un linker Flex (linker corto-SL), preferibilmente linker G3SG4 GGGSGGGG (SEQ ID NO:38), a una sequenza VH di FMC63 EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSE TTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYW GQGTSVTVSS (SEQ ID NO:16), la sequenza VH di FMC63 essendo legata mediante il linker GS (vale a dire il secondo linker o adattatore) a un:
marcatore tracciabile ?CD34 ELPTQGTFSNVSTNVS (SEQ ID NO:25) e CD8stalk PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO:21) (cerniera lunga-LH: ?CD34 CD8stalk) o CD8stalk PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO:21) (cerniera corta-SH: CD8stalk), che ? legato a CD8aTM IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO:28), che ? legato a
la frazione citoplasmatica di CD8cyt LYCNHRNRRRVCKCPR (SEQ ID NO:40), che ? legata mediante un linker VD a
la sequenza di dominio di segnalazione costimolatorio CD137 (4-1BB): KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO:30), che ? legata alla catena CD3Zeta RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP PR* (SEQ ID NO:32).
La presente invenzione riguarda anche una sequenza nucleotidica comprendente o consistente in una sequenza nucleotidica che codifica per un recettore chimerico di antigene come definito in precedenza.
In particolare, la sequenza VL di ibridoma FMC63 anti-CD19 pu? essere codificata dalla sequenza nucleotidica GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGA CAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGG TATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGAT TACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTC TCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAG GGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA
(SEQ ID NO:52) e
la sequenza VH di ibridoma FMC63 anti-CD19 pu? essere codificata dalla sequenza nucleotidica GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAG CCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGC TGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTA GTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGA CAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACA GCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACT ACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:53); la sequenza VL anti-CD20 pu? essere codificata dalla sequenza nucleotidica CAGATCGTGCTGAGCCAGAGCCCCGCCATCCTGAGCGCCAGCCCCGGCGA GAAGGTGACCATGACCTGCAGGGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATCCACTGGTTC CAGCAGAAGCCCGGCAGCAGCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGG CCAGCGGCGTGCCCGTGAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCT GACCATCAGCAGGGTGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGG ACCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG (SEQ ID NO:54) e
la sequenza VH anti-CD20 pu? essere codificata dalla sequenza nucleotidica CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCCGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAG CGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCAC TGGGTGAAGCAGACCCCCGGCAGGGGCCTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCG GCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGC CGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGAC AGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCA ACGTGTGGGGCGCCGGCACCACCGTGACCGTGAGC (SEQ ID NO:55);
la sequenza VL anti-CD22 pu? essere codificata dalla sequenza nucleotidica GACGTGCAGGTGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGG TGACCATCACCTGCAGGAGCAGCCAGAGCCTGGCCAACAGCTACGGCAACACCTT CCTGAGCTGGTACCTGCACAAGCCCGGCAAGGCCCCCCAGCTGCTGATCTACGGC ATCAGCAACAGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCA CCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTA CTGCCTGCAGGGCACCCACCAGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAG ATCAAG(SEQ ID NO:56) e
la sequenza VH anti-CD22 pu? essere codificata dalla sequenza nucleotidica
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGA AGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGGTTCACCAACTACTGGATCCACTGGGT GAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGGCATCAACCCCGGCAAC AACTACGCCACCTACAGGAGGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATGACCGCCGACA CCAGCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGCACCAGGGAGGGCTACGGCAACTACGGCGCCTGGTTCGCCTAC TGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO:57).
Secondo la presente invenzione, la sequenza nucleotidica che codifica un recettore chimerico di antigene anti-CD19 ?:
ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGT GTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGG AGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAAT TGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAA GATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTA TTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAA CAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAG GCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCT GGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTA CCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGC TGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAG ACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGT CTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTG GTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGG ATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCC GCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGA GACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGA TTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTT CTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTT GTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAA ACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGC CGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGA GCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAA TCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCT GAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAAC TGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCG CCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAG GACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA (SEQ ID NO:58)o
ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGT GTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGG AGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAAT TGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAA GATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTA TTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAA CAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAG GCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCT GGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTA CCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGC TGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAG ACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGT CTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTG GTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGG ATCCCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTG AGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAG GACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGG AGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGC CGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATA TATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTG TAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTC AGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACG AGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCG GGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTAC AATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAG GCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGC CACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAA
(SEQ ID NO:34).
Secondo la presente invenzione, la sequenza nucleotidica pu? inoltre comprendere una sequenza nucleotidica che codifica per la sequenza amminoacidica di un gene suicida inducibile legata alla sequenza nucleotidica che codifica per detto recettore chimerico di antigene mediante una sequenza nucleotidica che codifica un peptide autoclivante 2A. La sequenza amminoacidica del gene suicida inducibile pu? essere un polipeptide di Caspasi-9 chimerico oppure comprende una timidin chinasi del virus dell?herpes simplex.
Di conseguenza, nella cellula, il peptide autoclivante di polinucleotide 2A taglia il peptide comprendente la sequenza amminoacidica del gene suicida inducibile e il recettore chimerico di antigene in due peptidi separati, vale a dire le sequenze di amminoacidi del gene suicida inducibile e del recettore chimerico di antigene.
Secondo una forma di realizzazione, la sequenza nucleotidica pu? essere:
ATGCTCGAGATGCTGGAGGGAGTGCAGGTGGAGACTATTAGCCCCGGAGA TGGCAGAACATTCCCCAAAAGAGGACAGACTTGCGTCGTGCATTATACTGGAATG CTGGAAGACGGCAAGAAGGTGGACAGCAGCCGGGACCGAAACAAGCCCTTCAAGT TCATGCTGGGGAAGCAGGAAGTGATCCGGGGCTGGGAGGAAGGAGTCGCACAGAT GTCAGTGGGACAGAGGGCCAAACTGACTATTAGCCCAGACTACGCTTATGGAGCA ACCGGCCACCCCGGGATCATTCCCCCTCATGCTACACTGGTCTTCGATGTGGAGC TGCTGAAGCTGGAAAGCGGAGGAGGATCCGGAGTGGACGGGTTTGGAGATGTGGG AGCCCTGGAATCCCTGCGGGGCAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGTCTATGGAG CCTTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAGAGCGGGC TGCGGACCAGAACAGGATCCAATATTGACTGTGAAAAGCTGCGGAGAAGGTTCTC TAGTCTGCACTTTATGGTCGAGGTGAAAGGCGATCTGACCGCTAAGAAAATGGTG CTGGCCCTGCTGGAACTGGCTCGGCAGGACCATGGGGCACTGGATTGCTGCGTGG TCGTGATCCTGAGTCACGGCTGCCAGGCTTCACATCTGCAGTTCCCTGGGGCAGT CTATGGAACTGACGGCTGTCCAGTCAGCGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTCAAC GGCACCTCTTGCCCAAGTCTGGGCGGGAAGCCCAAACTGTTCTTTATTCAGGCCT GTGGAGGCGAGCAGAAAGATCACGGCTTCGAAGTGGCTAGCACCTCCCCCGAGGA CGAATCACCTGGAAGCAACCCTGAGCCAGATGCAACCCCCTTCCAGGAAGGCCTG AGGACATTTGACCAGCTGGATGCCATCTCAAGCCTGCCCACACCTTCTGACATTT TCGTCTCTTACAGTACTTTCCCTGGATTTGTGAGCTGGCGCGATCCAAAGTCAGG CAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGATATCTTTGAGCAGTGGGCCCATTCTGAA GACCTGCAGAGTCTGCTGCTGCGAGTGGCCAATGCTGTCTCTGTGAAGGGGATCT ACAAACAGATGCCAGGATGCTTCAACTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGAC CTCCGCATCTAGGGCCCCGCGGGAAGGCCGAGGGAGCCTGCTGACATGTGGCGAT GTGGAGGAAAACCCAGGACCACCATGGATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTT TGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGAC TACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCA AGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTG TTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTT CAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAA GAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCG GAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGT GAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTC ACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCC AGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCAC ATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAG AGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACT ACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCA AGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTC TCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGA CCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGG CGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCA CCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACT GTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGG CAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACT ACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGAT GTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGG CCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTT TTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGA ACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTA CAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTT TACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGG CCCTGCCCCCTCGCTAA (SEQ ID NO:180).
Nello specifico, questa sequenza nucleotidica, che codifica la sequenza denominata anche iCas9CAR.CD19SL-LH, comprende le seguenti sequenze:
proteina chimerica iCas9 (regione di legame a FKBP12wt-linker-polipeptide di Caspasi-9):
regione di legame a FKBP12wt:
ATGCTCGAGATGCTGGAGGGAGTGCAGGTGGAGACTATTAGCCCCGGAGA TGGCAGAACATTCCCCAAAAGAGGACAGACTTGCGTCGTGCATTATACTGGAATG CTGGAAGACGGCAAGAAGGTGGACAGCAGCCGGGACCGAAACAAGCCCTTCAAGT TCATGCTGGGGAAGCAGGAAGTGATCCGGGGCTGGGAGGAAGGAGTCGCACAGAT GTCAGTGGGACAGAGGGCCAAACTGACTATTAGCCCAGACTACGCTTATGGAGCA ACCGGCCACCCCGGGATCATTCCCCCTCATGCTACACTGGTCTTCGATGTGGAGC TGCTGAAGCTGGAA (SEQ ID NO:59) (ID NO di nucleotide: BT007066.1)
Legame di collegamento
AGCGGAGGAGGATCCGGA (SEQ ID NO:60)
Polipeptide di caspasi-9
GTGGACGGGTTTGGAGATGTGGGAGCCCTGGAATCCCTGCGGGGCAATGC CGATCTGGCTTACATCCTGTCTATGGAGCCTTGCGGCCACTGTCTGATCATTAAC AATGTGAACTTCTGCAGAGAGAGCGGGCTGCGGACCAGAACAGGATCCAATATTG ACTGTGAAAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAGGTGAA AGGCGATCTGACCGCTAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAACTGGCTCGGCAG GACCATGGGGCACTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGAGTCACGGCTGCCAGG CTTCACATCTGCAGTTCCCTGGGGCAGTCTATGGAACTGACGGCTGTCCAGTCAG CGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTCAACGGCACCTCTTGCCCAAGTCTGGGCGGG AAGCCCAAACTGTTCTTTATTCAGGCCTGTGGAGGCGAGCAGAAAGATCACGGCT TCGAAGTGGCTAGCACCTCCCCCGAGGACGAATCACCTGGAAGCAACCCTGAGCC AGATGCAACCCCCTTCCAGGAAGGCCTGAGGACATTTGACCAGCTGGATGCCATC TCAAGCCTGCCCACACCTTCTGACATTTTCGTCTCTTACAGTACTTTCCCTGGAT TTGTGAGCTGGCGCGATCCAAAGTCAGGCAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGA TATCTTTGAGCAGTGGGCCCATTCTGAAGACCTGCAGAGTCTGCTGCTGCGAGTG GCCAATGCTGTCTCTGTGAAGGGGATCTACAAACAGATGCCAGGATGCTTCAACT TTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACCTCC (SEQ ID NO:61) (ID NO di nucleotide: AK292111.1)
Legame di collegamento
GCATCTAGGGCCCCGCGG (SEQ ID NO:62)
Peptidi autoclivanti T2A
GAAGGCCGAGGGAGCCTGCTGACATGTGGCGATGTGGAGGAAAACCCAGG ACCA (SEQ ID NO:63) (ID NO di nucleotide: AF062037.1)
Linker corto di collegamento
CCATGG
Peptide segnale
ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGT CCAGTGTAGCAGG (SEQ ID NO:64) (ID NO di nucleotide: AB776838.1)
Sequenza VL (FMC63) GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGA CAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGG TATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGAT TACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTC TCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAG GGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA
(SEQ ID NO:52)
Linker corto Flex
GGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGC (SEQ ID NO:65)
Sequenza VH (FMC63) GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAG CCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGC TGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTA GTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGA CAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACA GCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACT ACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:53) LH (cerniera lunga): (linker corto, vale a dire il secondo linker o adattatore) (marcatore tracciabile: ?CD34 extracellulare cerniera: CD8stalk extracellulare):
Adattatore corto
GGATCC ?CD34 extracellulare GAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGT
(SEQ ID NO:66) (ID NO di nucleotide AB238231.1) CD8stalk extracellulare
CCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCT GAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGA GGACTCGATTTCGCTTGCGAC (SEQ ID NO:67) (ID NO di nucleotide: M12828.1);
CD8aTM (transmembrana) ATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAG CCTGGTTATTACT (SEQ ID NO:68) (ID NO di nucleotide NM_001768.6)
CD8cyt (citoplasmatica) CTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGG
(SEQ ID NO:69) (ID NO di nucleotide NM_001768) Linker corto (contenente sito Sal I)
GTCGAC
4-1BB AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAG ACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAA GAAGAAGGAGGATGTGAACTG (SEQ ID NO:70) (ID NO di nucleotide: U03397.1)
Catena CD3Zeta AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCA GAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTG GACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACC CTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAG TGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTAC CAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCC TGCCCCCTCGCTAA (SEQ ID NO:71) (ID NO di nucleotide: J04132.1).
Secondo la presente invenzione, iCas9CAR.CD19SL-SH consiste nella sequenza di iCas9CAR.CD19SL-LH a eccezione del fatto di comprendere una cerniera corta (short hinge, SH): (adattatore corto) (cerniera: CD8stalk extracellulare).
La presente invenzione riguarda anche un vettore comprendente la sequenza nucleotidica come definita in precedenza, in cui detto vettore ? un vettore di DNA, un vettore di RNA, un plasmide, un vettore di lentivirus, un vettore adenovirale, un vettore di retrovirus, come un vettore ?-retrovirale, o un vettore non virale.
Inoltre, la presente invenzione riguarda una cellula, come cellula T, come cellula T alfa/beta e gamma/delta, cellule NK, cellule NK-T, comprendente il recettore chimerico di antigene come definito in precedenza e/o il vettore o plasmide come definito in precedenza.
La cellula secondo la presente invenzione pu? inoltre comprendere una sequenza di amminoacidi di un gene suicida inducibile come un polipeptide di Caspasi-9 chimerico oppure comprende una timidin chinasi del virus dell?herpes simplex (HSVTK SEQ ID NO:42).
La sequenza di amminoacidi del gene suicida inducibile pu? essere un polipeptide di Caspasi-9 chimerico oppure comprendere una timidin chinasi del virus dell?herpes simplex (HSVTK SEQ ID NO:42).
Il polipeptide di Caspasi-9 chimerico pu? comprendere o consistere in:
una regione di legame a FKBP12 comprendente o consistente di un peptide leader 5? corto MLEMLE (SEQ ID NO:43) e il mutante di FKBP12(V36F) umana di sequenza
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFML GKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLK LE (SEQ ID NO:44) (ID NO di nucleotide: BT007066.1 e ID NO di proteina: AAP35729.1), che ? legata mediante un linker, come il linker SGGGSG (SEQ ID NO:45), al polipeptide di Caspasi-9 VDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTG SNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSH GCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQK DHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYST FPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPG CFNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO:46) (ID NO di nucleotide: AK292111.1 e ID NO di proteina: BAF84800.1), che ? legato mediante un linker, come il linker ASRAPR (SEQ ID NO:47) (contenente il sito enzimatico SacII), a un peptide autoclivante di polinucleotide 2A scelto dal gruppo consistente in T2A (derivato da virus thosea asigna 2) AEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO:48) (ID NO di nucleotide: AF062037.1 e ID NO di proteina: YP_009665206.1), P2A (derivato da teschovirus-1 2A suino) ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO:49) (ID NO di nucleotide: AB038528.1 e ID NO di proteina: BAB32828.1), E2A (derivato dal virus della rinite A equina) QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:50) (ID NO di nucleotide: NC_039209.1 e ID NO di proteina: ?YP_009513027.1?) o F2A (derivato dal virus della malattia piedi e bocca: VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:51) (ID NO di nucleotide: AY593825.1 e ID NO di proteina: AAT01768.1.3), preferibilmente T2A.
Secondo una forma di realizzazione specifica della presente invenzione, il polipeptide di Caspasi-9 chimerico consiste in:
- il peptide leader MLEMLE (SEQ ID NO:43),
- la regione di legame a FKBP12 GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLG KQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKL
E (SEQ ID NO:44), che ? legata mediante un linker SGGGSG (SEQ ID NO:45) a
- polipeptide di Caspasi-9 VDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGS NIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHG CQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKD HGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTF PGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGC FNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO:46), che ? legato mediante un linker ASRAPR (SEQ ID NO:47) ai
- peptidi autoclivanti T2A che codificano AEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO:48).
Secondo la presente invenzione, la cellula pu? essere ottenuta in condizioni di coltura in cui sono presenti sia IL-7 sia IL-15, ad esempio nelle condizioni di coltura della fase di attivazione, della fase di trasduzione e/o della fase di espansione del procedimento per la preparazione di detta cellula.
La presente invenzione riguarda anche una composizione farmaceutica comprendente la sequenza nucleotidica come definita in precedenza, oppure il vettore come definito in precedenza, oppure la cellula come definita in precedenza, insieme a uno o pi? eccipienti e/o adiuvanti.
Inoltre, la presente invenzione riguarda un recettore chimerico di antigene come definito in precedenza, una sequenza nucleotidica come definita in precedenza, un vettore come definito in precedenza, una cellula come definita in precedenza, una composizione farmaceutica come definita in precedenza, per uso medico.
? altres? oggetto della presente invenzione un recettore chimerico di antigene come definito in precedenza, una sequenza nucleotidica come definita in precedenza, un vettore come definito in precedenza, una cellula come definita in precedenza, una composizione farmaceutica come definita in precedenza, per l?uso nel trattamento di cancri CD19+, CD20+ o CD22+, ad esempio linfomi a cellule B (linfoma Non-Hodgkin (Non-Hodgkin?s Lymphoma, NHL)), leucemia linfoblastica acuta (acute lymphoblastic leukemia, ALL), leucemia mieloide e leucemia linfocitica cronica (chronic lymphocytic leukemia, CLL).
La presente invenzione sar? ora descritta in modo illustrativo, ma non limitativo, secondo le forme di realizzazione preferite della stessa, con particolare riferimento agli esempi e ai disegni allegati, in cui:
- la Figura 1 mostra cellule T CAR.CD19 generate da PBMC derivate da pazienti con Bcp-ALL alla diagnosi.
(A) L?scFv di ?-CD19 viene clonato in frame con il gene suicida di iC9, il marcatore tracciabile ?CD34 e gli endodomini di segnalazione sia 4.1BB sia CD3?. Le PBMC di pazienti con Bcp-ALL alla diagnosi vengono attivate con mAb ?-hCD3/?-hCD28 e rh-IL7/rh-IL15 solubili e in seguito trasdotte con il supernatante ?-retrovirale di CAR.CD19. (B) Analisi mediante citometria a flusso di un donatore rappresentativo che mostra un?espressione di CAR mediante il rilevamento di ?CD34 in cellule T non trasdotte (NT) (controllo negativo; griglia di sinistra) e cellule T geneticamente modificate con CAR.CD19 (griglia di destra). (C) Percentuale di cellule T CAR+ in corrispondenza della fine-produzione (Giorno+14) in DP con pi? del 45% (n=8) o pari al/meno del 45% (n=7) di cellule di leucemia/linfoma CD19+ nel materiale grezzo di partenza usato per la produzione di cellule CAR T. Il valore mediano del 45% ? stato usato come cutoff. (D) Matrice di correlazione tra la percentuale di cellule T CAR+ nei DP alla fine della produzione e la percentuale di cellule leucemiche CD19+ nei materiali grezzi di partenza provenienti dai pazienti. (E) Istogrammi che rappresentano l?espansione in volte totale dal Giorno 3 alla fine della produzione delle cellule T CAR nei due sottogruppi di pazienti con il <45% o il >45% di cellule B CD19+ nell?SM.
La Figura 2 mostra la proliferazione e la trasduzione di cellule CAR T derivate da pazienti BM.
(A) Analisi mediante citometria a flusso in un DP rappresentativo generato da cellule mononucleari di BM di un paziente alla diagnosi. Il riquadro superiore A mostra un?analisi mediante citometria a flusso di cellule T CAR+ nel campione di controllo negativo di cellule T NT, mentre il riquadro inferiore mostra l?analisi in cellule T geneticamente modificate iC9.CAR.CD19. (B) Percentuale di blasti leucemici CD19+ e cellule T CAR+ in DP generati da pazienti BM con Bcp-ALL (n=10). (C) Espansione in volte di cellule T derivate da BM NT e con iC9.CAR.CD19 (barre nere) rispetto a cellule T derivate da PB (barre bianche) di 10 pazienti con Bcp-ALL, alla fine della produzione. I dati vengono espressi come media ? DS;
- la Figura 3 mostra l?analisi MRD in DP generati da materiali grezzi di pazienti alla diagnosi altamente contaminati da cellule leucemiche. (A) Gli esperimenti nel tempo sono stati progettati per valutare l?incidenza del tempo di produzione sul valore MRD in DP. Le cellule T sono state generate da 5 pazienti diversi (n= 5) e coltivate per 8, 14 o 30 giorni prima del prelievo delle cellule per l?analisi MRD, eseguita mediante analisi qPCR sulla ridisposizione delle Ig con il limite di rilevamento specificato nella Tabella 1, e rappresentate nella figura come intervallo negativo tra 10-4 e 10-5 (area tratteggiata). (B) Analisi mediante citometria a flusso di due DP: ALL#12 con valori MRD elevati e ALL#14 per cui il rilevamento di MRD era inferiore alla sensibilit? della PCR. I riquadri mostrano la presenza di cellule leucemiche (punti neri) positive per l'espressione di CAR, rilevate sia con un anticorpo FITC anti-CAR.CD19 (anti-CARTCD19, Cytognos SL, Salamanca, Spagna) sia con APC anti-CD34 (CD34QBEND10), bersagliando l?epitopo CD34 nel costrutto di CAR. I precursori di cellule B sono stati identificati mediante l?uso di procedure operative standard (standard operating procedures, SOP) EuroFlow per la colorazione di marcatori superficiali (www.EuroFlow.org) (26) mediante provette di MRD Bcp-ALL EuroFlow, precedentemente descritte per misurazioni di MRD estremamente sensibili in Bcp-ALL mediante citometria a flusso.(27-29)
- la Figura 4 mostra un?analisi mediante citometria a flusso di cellule T non trasdotte di controllo e cellule T iC9.CAR.CD19LH provenienti da un paziente con Bcp-ALL rappresentativo. I riquadri superiori mostrano un?analisi citometrica a flusso di marcatori di cellule B CD19 e CD10 in cellule T non trasdotte di controllo provenienti da un paziente ALL#14 rivelando l?1,5% di cellule leucemiche, mentre la contaminazione ? stata significativamente ridotta nel campione di cellule T iC9.CAR.CD19LH prodotto a partire dallo stesso paziente ALL#14 (lo 0,0036% di cellule leucemiche).
- la Figura 5 mostra l?analisi MRD di DP generati da materiali grezzi di BM di pazienti con Bcp-ALL alla diagnosi estremamente contaminati da cellule leucemiche. Analisi mediante citometria a flusso di marcatori di cellule B in due DP derivati da BM provenienti dai pazienti ALL#1 e ALL#2. I riquadri mostrano la presenza di cellule leucemiche (punti neri);
- la Figura 6 mostra che la struttura di CAR.CD19 incide sulcoinvolgimento dell?antigene CD19 quando vengono entrambi espressi sulla stessa membrana plasmatica. (A) Disegni che rappresentano CAR.CD19LL/SH (a), CAR.CD19LL/LH (b), CAR.CD19SL/SH (c) e CAR.CD19SL/LH (d). (B) Espressione di CD19 rilevata mediante citometria a flusso in cellule NALM-6 geneticamente modificate mediante CAR.CD19LL/SH. Vengono mostrati l?istogramma di colorazione di isotipi abbinati e l?istogramma di colorazione di CD19 specifica per cellule CAR.CD19LL/SH (vedere le frecce).
(C-E) L?espressione di CD19 rilevata mediante citometria a flusso in cellule NALM-6 geneticamente modificate mediante CAR.CD19LL/LH (C), mediante CAR.CD19SL/SH (D) e mediante CAR.CD19SL/LH (E) viene mostrata mediante istogrammi, rispetto all?istogramma dell?espressione di CD19 su CAR.CD19LL/SH.
- la Figura 7 mostra l?espressione del mRNA di CD19 in linee cellulari di Bcp-ALL sia WT sia CAR.CD19. (A) PCR in tempo reale quantitativa (Quantitative Real Time PCR, qRT-PCR) di espressione del mRNA di CD19 in linee cellulari Bcp-ALL WT, CAR.CD19LH e CAR.CD19SH. Una linea cellulare Karpas ? stata usata come controllo negativo. I livelli di mRNA vengono mostrati come espressione relativa di un gene bersaglio rispetto all?espressione del mRNA di ACT-B. Le reazioni sono state eseguite in triplicati; (B) Analisi MFI dell?espressione di CAR.CD19 in linee cellulari di leucemia e linfoma. I valori MFI dei livelli di espressione di CAR.CD19 in DAUDI (riquadri superiori) e RAJI (riquadri inferiori) WT e CAR.CD19SL/LH. I dati mostrano un esperimento rappresentativo. (C) Saggio in vitro a lungo termine per valutare l?attivit? antitumorale delle cellule T CAR.CD19 su linee di cellule NALM-6 sia WT sia CAR.CD19. Percentuale di cellule leucemiche WT (barre nere), NALM-6 CAR.CD19SL/LH (barre bianche) e NALM-6 CAR.CD19 UPenn (barre a strisce) dopo 7 giorni di co-coltura in vitro. Il saggio ? stato eseguito a rapporti di effettore/bersaglio decrescenti, da 1:1 a 1:32 su linee cellulari tumorali NALM-6 Bcp-ALL. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicati. I dati vengono espressi come media ? DS. * valore p=<0,05, ** valore p=<0,01, *** valore p=<0,001.
- la Figura 8 mostra saggi in vitro a lungo termine per valutare l'attivit? di cellule T CAR.CD19 e controllare mediante iC9 linee cellulari di leucemia o linfoma CAR.CD19 positive. (A-B) Saggio di co-coltura di 7 giorni di WT (barre nere) e CAR.CD19SL/LH (barre bianche) con cellule T CAR.CD19 (il rapporto E:T viene mostrato nell?asse delle x del grafico come percentuale di cellule T CAR+ nella coltura). (C) Saggio di cocoltura di 7 giorni di NALM-6 WT e NALM-6 geneticamente modificate con CAR.CD19 con NT (barre nere), CAR.CD19SL/LH (barre bianche) e CAR.CD19LL/SH (barre a strisce). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato (n=6). I dati vengono espressi come media ? DS. * valore p=<0,05, ** valore p=<0,01, *** valore p=<0,001, **** valore p=<0,0001. (D-E) Cellule DAUDI CAR.CD19 sono state trattate con 0 nM (D) e 20 nM (E) di AP1903; le espressioni sia di CAR sia di CD19 sono state monitorate nel tempo mediante citometria a flusso. (F) Rilevamento di vettore CAR.CD19 in cellule tumorali mediante qRT-PCR dopo l?esposizione ad AP1903. Le reazioni sono state eseguite in triplicato. Gli istogrammi neri rappresentano il controllo positivo del riferimento (0nM di AP1903) e gli istogrammi bianchi rappresentano i risultati dopo un?esposizione al farmaco (20nM di AP1903). * valore p=<0,05, ** valore p=<0,01, *** valore p=<0,001.
- la Figura 9 mostra il profilo di attivazione delle cellule T CAR.CD19 che ? simile oltre alla configurazione di CAR. (A) Una produzione di IFN-? ? stata misurata dopo 24h di co-coltura di cellule T effettrici e NALM-6 WT, o NALM-6 geneticamente modificate con costrutti di CAR.CD19. I dati provenienti da 6 prodotti T CAR diversi generati da HD vengono espressi come media ? SD. (B) Analisi mediante proliferazione di CFSE che rappresenta le sovrapposizioni di cellule T CAR non stimolate e stimolate con cellule NALM-6 WT o modificate con CAR.CD19.
- la Figura 10 mostra l?effetto della somministrazione di AP1903 su linee cellulari di Bcp-ALL iC9.CAR.CD19. Linee di cellule RAJI e NALM-6 iC9.CAR.CD19 (CAR.CD19LH) sono state trattate con 0 nM (A-D) e 20 nM (B-D) di AP1903; l?espressione sia di CAR sia di CD19 ? stata monitorata nel tempo mediante FACS. Il trattamento con AP1903 (20nM) determina una rapida riduzione di cellule CAR+ a partire da 6 ore dopo l?esposizione al farmaco. La riduzione della positivit? a CAR dopo l?esposizione ad AP1903 ? associata a un rilevamento graduale dell?antigene CD19 sulla superficie cellulare. (E) La linea di cellule DAUDI iC9.CAR.CD19 ? stata trattata con 0 nM (linea nera) e 20 nM di AP1903 (linea corta tratteggiata); l?MFI di CAR.CD19 ? stata monitorata nel tempo mediante un?analisi con citometria a flusso dal Giorno 0 al Giorno 15 dopo il trattamento e rispetto alla linea di cellule NALM-6 WT di controllo (linea tratteggiata lunga). (F) Grafico che riporta il numero di copie di vettore (vector copy number, VCN) di transgene in linee di cellule DAUDI, RAJI e NALM-6 WT e modificate per geni non trattate (barre nere) oppure esposte a 20 nM (barre bianche) di AP1903. I dati vengono espressi come media ? DS.
- la Figura 11 mostra che cellule di leucemia e linfoma iC9.CAR.CD19 risparmiate dopo l?attivazione di iC9 possono essere riconosciute ed eliminate in modo efficiente da cellule T CAR.CD19 cos? come da cellule NK CAR.CD19 allogeniche. (A) Un saggio di co-coltura di 7 giorni ? stato condotto tra cellule T non trasdotte o cellule T CAR.CD19 e cellule DAUDI WT, cellule DAUDI iC9.CAR.CD19LH mai esposte ad AP1903 e DAUDI iC9.CAR.CD19LH residue dopo l?esposizione ad AP1903 e ulteriormente riespanse (a un rapporto E:T di 1:1). (B) Un saggio di co-coltura di 7 giorni ? stato condotto tra cellule T non trasdotte o cellule T CAR.CD19 e cellule NALM-6 WT, cellule NALM-6 iC9.CAR.CD19LH mai esposte ad AP1903 e NALM-6 iC9.CAR.CD19LH residue dopo l?esposizione ad AP1903 e ulteriormente riespanse (a un rapporto E:T di 1:1). (C) Un saggio di co-coltura di 7 giorni ? stato condotto tra cellule NK non trasdotte o cellule NK CAR.CD19 e cellule DAUDI WT, cellule DAUDI iC9.CAR.CD19LH mai esposte ad AP1903 e DAUDI iC9.CAR.CD19LH residue dopo l?esposizione ad AP1903 e ulteriormente riespanse (a un rapporto E:T di 1:1). (D) Un saggio di co-coltura di 7 giorni ? stato condotto tra cellule NK non trasdotte o cellule NK CAR.CD19 e cellule NALM-6 WT, cellule NALM-6 iC9.CAR.CD19LH mai esposte ad AP1903 e NALM-6 iC9.CAR.CD19LH residue dopo l?esposizione ad AP1903 e ulteriormente riespanse (a un rapporto E:T di 1:1). ** valore p=<0,01, *** valore p=<0,001.
- la Figura 12 mostra che le cellule T geneticamente modificate con costrutti di CAR.CD19 diversi controllano l?espansione in vivo di una leucemia CAR positiva in un modello di xenotrapianto di topo. (A) Rappresentazione schematica della progettazione sperimentale, con cellule WT NALM-6 FF-Luciferasi positive, infuse al Giorno -3. Al Giorno 0, i topi sono stati valutati per l?attecchimento della leucemia e trattati con 10x106 cellule T non trasdotte (NT) o CAR.CD19SL/LH o CAR.CD19LL/SH/topo (riquadro superiore). Rappresentazione per immagini a bioluminescenza di ciascun topo trattato (riquadro al centro). Media ? DS di valori di bioluminescenza delle tre coorti di topi, che ricevono cellule T NT (linea nera) o CAR.CD19SL/LH (linea tratteggiata corta) o cellule T CAR.CD19LL/SH (linea tratteggiata lunga)(riquadro inferiore). (B) Rappresentazione schematica della progettazione sperimentale, con cellule NALM-6 CAR.CD19SL/LH positive/FF-Luciferasi positive, infuse al Giorno -3. Al Giorno 0, i topi sono stati valutati per l?attecchimento della leucemia e trattati con 10x106 cellule non trasdotte (NT) o CAR.CD19SL/LH (riquadro superiore). Rappresentazione per immagini a bioluminescenza di ciascun topo trattato (riquadro al centro). Media ? DS di valori di bioluminescenza delle due coorti di topi, che ricevono cellule T NT (linea nera) o CAR.CD19SL/LH (linea tratteggiata corta) (riquadro inferiore). (C) Rappresentazione schematica della progettazione sperimentale, con cellule NALM-6 CAR.CD19LL/SH positive/FF-Luciferasi positive, infuse al Giorno -3. Al Giorno 0, i topi sono stati valutati per l?attecchimento della leucemia e trattati con 10x106 cellule non trasdotte (NT) o CAR.CD19LL/SH (riquadro superiore). Rappresentazione per immagini a bioluminescenza di ciascun topo trattato (riquadro al centro). Media ? DS di valori di bioluminescenza delle due coorti di topi, che ricevono cellule T NT (linea nera) o CAR.CD19LL/SH (linea tratteggiata lunga)(riquadro inferiore). * valore p=<0,05, ** valore p=<0,01, *** valore p=<0,001, **** valore p=<0,0001.
(D) Rappresentazione schematica della progettazione sperimentale, con cellule DAUDI iC9.CAR.CD19LH positive FF-Luciferasi positive infuse al Giorno -3. Al Giorno 0, i topi sono stati valutati per l?attecchimento della leucemia e trattati con 10x10<6 >cellule T non trasdotte (NT) o CAR.CD19/topo. Immagini di bioluminescenza di ciascun topo trattato. Media pi? deviazione standard di valori di bioluminescenza delle due coorti di topi, che ricevono cellule T NT (linea nera) o CAR.CD19 (linea tratteggiata). * valore p=<0,05. (E) Istogramma che rappresenta le differenze di bioluminescenza del tumore al Giorno 16 tra topi che trasportano cellule NALM-6 CAR.CD19SL/LH e NALM-6 CAR.CD19LL/SH. I dati vengono mostrati come Media ? DS di aumento di bioluminescenza delle due coorti di topi al Giorno 16 rispetto al Giorno 0.
- la Figura 13 mostra che l?attivazione di iC9 ? in grado di controllare l?espansione in vivo di una leucemia iC9.CAR positiva in un modello di xenotrapianto di topo. (A) Rappresentazione schematica della progettazione sperimentale, con cellule DAUDI iC9.CAR.CD19LH positive FF-Luciferasi positive infuse al Giorno -3. Al Giorno 0, i topi sono stati valutati per l?attecchimento della leucemia e trattati con 100?g/topo di AP1903 dal giorno 0 al giorno 28. (B) Immagini di bioluminescenza di ciascun topo non trattato di controllo e ciascun topo trattato con AP1903. I topi sono stati monitorati per pi? di 30 giorni dopo l?interruzione di AP1903. (C) Valori di bioluminescenza nel tempo per ciascun topo trattato nelle due coorti, per topi non trattati (linee nere) o trattati con AP1903 (linea tratteggiata). (D) Analisi della curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier di topi con leucemia non trattati (linea nera) o trattati con AP1903 (linea blu). **** valore p=<0,00001. L?unico topo (#20) che ha mostrato un segnale positivo persistente all?analisi IVIS dopo la somministrazione di AP1903 ? stato soppresso al giorno 35 insieme a un controllo negativo (#11) e a un controllo positivo (topo non esposto a somministrazione di AP1903, #6), per caratterizzare le cellule leucemiche.
ESEMPIO 1: Progettazione di vettori di CAR secondo la presente invenzione e studio della sicurezza relativa nel caso di una recidiva di leucemia CAR+
Materiali e metodi
Il materiale biologico di origine umana usato in questi esperimenti ? stato campionato dopo che sia i genitori sia i donatori sani hanno firmato un consenso informato scritto, in conformit? con le disposizioni definite dal Comitato di revisione istituzionale (Institutional Review Board, IRB) dell?Ospedale pediatrico Bambino Ges? di Roma (OPBG; Approvazione del Comitato etico N?969/2015 prot. N?669LB, e N?1422/2017 prot. N?810).
Gli OGM descritti negli esperimenti sono stati preparati in conformit? con le obbligazioni relative agli OGM, derivanti da regolamenti nazionali o comunitari, e in particolare dalle disposizioni di cui al paragrafo 6 e dei decreti legislativi del 12 aprile 2001, n. 206, e dell?8 luglio 2003, n. 224.
Colture cellulari.
Linee cellulari di linfoma di Burkitt umano CD19 positive Daudi, NALM-6 e Raji (American Type Culture Collection Company (ATCC)), e una linea cellulare di linfoma a grandi cellule Non-Hodgkin CD19 negativa Karpas-299 (Sigma Aldrich) sono state mantenute in RPMI 1640 (EuroClone, Italia) integrato con il 10% di siero bovino fetale inattivato con calore (EuroClone, Italia),L-glutammina 2mM (GIBCO, Stati Uniti), 25 IU/mL di penicillina, e 25 mg/mL di streptomicina (EuroClone, Italia), in un?atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 a 37 ?C. Tutte le linee cellulari sono state autenticate mediante l?analisi con tecnologia a locus singolo PCR (Promega, PowerPlex 21 PCR) in ?BMR Genomics s.r.l.?, e sono state periodicamente controllate per l?espressione di marcatori superficiali e micoplasma.
Generazione ed espansione di cellule effettrici. Strati leucopiastrinici (buffy coat, BC) provenienti da donatori sani (healthy donor, HD), sangue periferico (peripheral blood, PB) e midollo osseo (bone marrow, BM) derivati da bambini con Bcp-ALL sono stati usati per isolare cellule mononucleari non frazionate usando Lympholyte Cell Separation Media (Cedarlane, Canada). Le cellule T sono state attivate con un anticorpo monoclonale (monoclonal antibody, mAb) OKT3 e anti-CD28 (1 ?g/ml, Miltenyi, Germania) solubile con una combinazione di interleuchina-7 (IL7, 10 ng/ml; R&D; Stati Uniti) e interleuchina-15 (IL15, 5 ng/ml; R&D; Stati Uniti) umane ricombinanti. Le cellule NK sono state generate da BC di HD seguendo il metodo descritto in precedenza<17>. In seguito, le cellule T e NK sono state trasdotte con un surnatante retrovirale, dopo tre/quattro giorni, in piastre a 24 pozzetti prerivestite con RetroNectina umana ricombinante (Takara-Bio. Inc; Giappone). I linfociti T sono stati espansi in presenza di citochine, in terreno completo TexMacs (Miltenyi, Germania) e reintegrati due volte a settimana.
Costrutti di CAR.
Quattro costrutti di CAR retrovirali diversi sono stati usati per condurre gli esperimenti:
1) costrutto di CAR che trasporta scFv anti-CD19 umano proveniente da un clone di FMC63 in cui frammenti VL e VH sono stati uniti mediante un linker rappresentato da tre ripetizioni GSSSS (3xG4S, linker lungo (long linker), LL), in frame con il dominio CD8 stalk (cerniera corta, SH), dominio transmembrana CD8, dominio citoplasmatico 4.1bb e CD3? (CAR.CD19 VL-3GS-VH-CD8-4.1bb.?, vale a dire LL/SH);
CAR.CD19 LL/SH nt (SEQ ID NO:73) ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGT CCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCT CTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATT TAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATAC ATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACA GATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTT GCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAAT AACAAGCGGAGGTGGGGGCAGCGGAGGTGGGGGCAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTG AAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCA CATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCA GCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACA TACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGA GCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTA CTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAA GGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTG CGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGC TGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATC TGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTC TGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAA ACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTA CAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAG GAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCA GCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTAC GATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAA GGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGA GGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGAT GGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACA TGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA CAR.CD19 LL/SH aa (SEQ ID NO:74) MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDI SKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIA TYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITSGGGGSGGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQS LSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKD NSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSPAPRP PTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSL VITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPE EEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGG KPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD ALHMQALPPR-2) costrutto di CAR che trasporta scFv anti-CD19 umano proveniente da un clone di FMC63 in cui frammenti VL e VH sono stati uniti mediante un linker rappresentato da tre ripetizioni GSSSS (3xG4S, linker lungo (LL), in frame con una sequenza 16aa derivata da antigene CD34 umano (?CD34, cerniera lunga, LH), dominio CD8 stalk, dominio transmembrana CD8, dominio citoplasmatico 4.1bb e CD3? (CAR.CD19 VL-3GS-VH-CD34-CD8-4.1bb.?, vale a dire LL/LH);
Sequenza nt di CAR.CD19LL/LH (SEQ ID NO:36): ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGT CCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCT CTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATT TAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATAC ATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACA GATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTT GCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAAT AACAAGCGGAGGTGGGGGCAGCGGAGGTGGGGGCAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTG AAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCA CATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCA GCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACA TACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGA GCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTA CTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAA GGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCGCATGCGAACTTCCTACTCAGGGGA CTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTGCGGCCGCcCCCGCCCCAAGACCCCC CACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGC CGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACA TCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGT TATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGG GTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGA GACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGA AGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCC GCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAG AGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAA GCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAG ATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGG GGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGC CCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
Sequenza aa di CAR.CD19LL/LH (SEQ ID NO:39): MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLN WYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQ QGNTLPYTFGGGTKLEITSGGGGSGGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTC TVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQ VFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSACELPTQGTF SNVSTNVSAAAPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRP VQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGH DGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR-3) costrutto di CAR che trasporta scFv anti-CD19 umano proveniente da un clone di FMC63 in cui frammenti VL e VH sono stati uniti mediante un linker rappresentato da una ripetizione GSSSS (G4S, linker corto, SL), in frame con il dominio CD8 stalk (cerniera corta, SH), dominio transmembrana CD8, dominio citoplasmatico 4.1bb e CD3? (CAR.CD19 VL-1GS-VH-CD8-4.1bb.?, vale a dire SL/SH);
Sequenza nt di CAR.CD19 SL/SH (SEQ ID NO:34):
ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGT CCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCT CTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATT TAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATAC ATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACA GATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTT GCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAAT AACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCT GGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCT CATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGA GTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAA TCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGA ACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTA CGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCC TCAGGATCCCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAAC CCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATAC AAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACC TGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATC GCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCT GTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGAT GGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGA AGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTA TAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGT GGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCC TGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGAT GAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGT ACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCT AAA
Sequenza aa di CAR.CD19 SL/SH (SEQ ID NO:33):
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLN WYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQ QGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSL PDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNS LQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSPAPRPPTPAPTIASQPL SLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRR RVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKF SRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
4) costrutto di CAR che trasporta scFv anti-CD19 umano proveniente da un clone di FMC63 in cui frammenti VL e VH sono stati uniti mediante un linker rappresentato da una ripetizione GGGSGGGG (SEQ ID NO:38) (G3SG4, linker corto, SL), in frame con una sequenza 16aa derivata da antigene CD34 umano (?CD34, cerniera lunga, LH), dominio CD8 stalk, dominio transmembrana CD8, dominio citoplasmatico 4.1bb e CD3? (CAR.CD19 VL-1GS-VH-CD34-CD8-4.1bb.?, vale a dire SL/LH).
Sequenza nt di CAR.CD19SL/LH (SEQ ID NO:58):
ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGT GTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGG AGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAAT TGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAA GATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTA TTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAA CAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAG GCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCT GGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTA CCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGC TGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAG ACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGT CTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTG GTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGG ATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCC GCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGA GACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGA TTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTT CTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTT GTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAA ACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGC CGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGA GCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAA TCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCT GAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAAC TGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCG CCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAG GACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA PROTEINA di CAR.CD19SL/LH (SEQ ID NO:72):
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDI SKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIA TYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTV SGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVF LKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSELPTQGTFSNVS TNVSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAG TCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEE DGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKR RGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGL STATKDTYDALHMQALPPR*
NALM-6 geneticamente modificate con un vettore lentivirale che trasporta CAR.CD19 gi? pubblicate (5) sono state incluse negli esperimenti come NALM6 CAR UPenn (CAR.CD19 LL/SH nella piattaforma di lentivirus fornita dal Dott. Ruella (5)).
Cellule NK provenienti da HD, cos? come cellule T provenienti da HD o pazienti con Bcp-ALL, sono state geneticamente modificate mediante un costrutto retrovirale che trasporta scFv anti-CD19 umano proveniente da un clone di FMC63 in cui frammenti VH e VL sono stati uniti mediante un linker rappresentato da un GGGSGGGG (SEQ ID NO: 38) (G3SG4, linker corto), in frame con un dominio CD8 stalk, una sequenza 16aa derivata da un antigene CD34 umano (?CD34; cerniera lunga), un dominio transmembrana CD8 e un dominio citoplasmatico 4.1bb e CD3? (cerniera lunga di CAR.CD19, CAR.CD19LH). Il vettore retrovirale ? un costrutto bicistronico in cui il costrutto di CAR descritto in precedenza ? in frame con la cassetta genica codificante per il gene suicida caspasi 9 inducibile (iC9). Il costrutto retrovirale iC9-CAR.CD19SL/LH ? stato usato anche per modificare geneticamente linee di cellule leucemiche B, includendo DAUDI, RAJI e NALM-6. Le linee di cellule B CAR+ sono state separate mediante FACS per l?espressione di CAR dopo la trasduzione. Le cellule NALM-6 sono state altres? geneticamente modificate con un costrutto lentivirale che trasporta scFv anti-CD19 umano proveniente da un clone di FMC63 in cui frammenti VH e VL sono stati uniti mediante un linker rappresentato da un linker (S3G4)3 Flex (SGGGGSGGGGSGGGG SEQ ID NO:39), (linker lungo), in frame con un dominio CD8 stalk (cerniera corta), dominio transmembrana CD8, dominio citoplasmatico 4.1bb e CD3? (cerniera corta di NALM-6 CAR.CD19, CAR.CD19 UPenn; gentilmente fornita dal Dott. Ruella).
Attivazione del gene suicida.
Per indurre l'attivazione in vitro di iC9, le cellule sono state trattate una volta con 20 nM di AP1903 (Medchemexpress, Cat. HY?16046). La percentuale di cellule CAR<+ >dopo il trattamento con AP1903 ? stata valutata mediante FACS in corrispondenza dei punti temporali indicati. Per gli esperimenti in vivo, per dimostrare la capacit? del gene suicida iC9 di essere attivo nel controllo dell?espansione di una leucemia CAR+ in seguito all?attivazione mediante AP1903, topi NSG sono stati infusi con 0,25x10<6 >di cellule iC9.CAR.CD19LH-DAUDI geneticamente modificate con un costrutto retrovirale per FF-Luciferasi; dopo l?attecchimento del tumore monitorato mediante il sistema di rappresentazione per immagini IVIS, il farmaco dimerizzante AP1903 ? stato somministrato per via intraperitoneale dal giorno 1 al giorno 28 (100?g/topo). Una coorte di controllo ? stata infusa con PBS sterile come soluzione veicolo. Il tumore ? stato monitorato tramite analisi mediante rappresentazione per immagini IVIS con cadenza settimanale.
Analisi fenotipica.
Un?analisi mediante citometria a flusso ? stata eseguita per determinare l?espressione di antigeni superficiali cellulari; anticorpi monoclonali per CD45, CD3, CD19, CD22, CD10, CD34 (tutti da Becton Dickinson, Stati Uniti) sono stati combinati con una fluorescenza diversa a seconda delle necessit?. L?espressione di iC9.CAR.CD19 ? stata rilevata usando un mAb diretto verso un epitopo hCD34 (anti-CD34 QBend-10 PE da R&D System, Stati Uniti), o un reagente di rilevamento di CAR CD19 (Biotin; Miltenyi, Germania). L?analisi mediante citometria a flusso ? stata eseguita usando un citometro BD LSRFortessa X-20 (BD Biosciences, Stati Uniti) e analizzata mediante software FACSDiva (BD Biosciences, Stati Uniti). La separazione FACS su linee di cellule tumorali CAR-trasdotte ? stata eseguita su un FACSAria (BD Biosciences, Stati Uniti).
I DP sono stati anche caratterizzati mediante una combinazione di 11 colori o 16 colori di anticorpi pi? la proteina umana CD19-FITC, usando le procedure operative standard (SOP) EuroFlow per la colorazione dei marcatori superficiali soltanto, disponibile al www.EuroFlow.org<18>. Le combinazioni di anticorpi usate si basavano entrambe su una catena principale consistente delle provette di MRD Bcp-ALL EuroFlow precedentemente descritte per misurazioni di MRD estremamente sensibili in una leucemia linfoblastica acuta a cellule B mediante citometria a flusso<19-21>, a cui i reagenti anticorpali anti-CD3 e sia anti-CD22 sia anti-HLADR sono stati addizionati per una colorazione di cellule T trasfettate e non trasfettate e un gating specifico di blasti e precursori di cellule B CD19-negativi, rispettivamente. Infine, il clone Qbend10 anti-CD34 (R&D Systems, Minneapolis, MN) e la proteina umana CD19-FITC (Cytognos SL, Salamanca, Spagna) sono stati anch?essi addizionati alla miscela di colorazione con reagenti per l?identificazione di cellule CAR.CD19 trasfettate.
Tutti i reagenti specifici sono elencati nelle Tabelle 1 A, B e C riportate di seguito.
Tabella 1A
Tabella 1B
Tabella 1C
L?acquisizione di campioni ? stata eseguita immediatamente dopo aver completato la preparazione dei campioni, >1,5 ? 10<6 >cellule (intervallo: 1,6 - 7,5 ? 10<6 >cellule) sono state misurate per campione usando un citometro a flusso LSRFortessa X-20 [Becton Dickinson Biosciences (BD), San Jose, CA] e il software FACSDiva (BD) o un citometro a flusso spettrale a 3 laser Aurora (Cytek Biosciences, Fremont, CA) dotato del software SpectroFlo (Cytek). Per la configurazione dello strumento e l?acquisizione dei dati, ? stata rigorosamente seguita la SOP EuroFlow per la configurazione e la calibrazione dello strumento, disponibile al www.euroflow.org, DOI: 10.1038/leu.2012.122. Il software Infinicyt
? stato usato per l?analisi dei dati.
PCR quantitativa in tempo reale.
Il DNA totale ? stato purificato mediante QIAamp DNA Mini Kit secondo il produttore.
PCR quantitativa in tempo reale
La media del numero di copie di vettore (VCN) per cellula ? stata determinata mediante una PCR in tempo reale, usando una sonda TaqMan progettata sul costrutto retrovirale usando il software Primer Express? (Applied Biosystems) e riportata nella Tabella 2 (sonda di iC9 e primer di iC9).
Tabella 2
Primer/sonde TaqMan sono stati progettati per ciascun bersaglio clonale specifico di immunoglobulina (IG) o recettore di cellule T (T-cell Receptor, TR) mediante il software Primer Express?
Per il VCN, ciascun campione ? stato analizzato in triplicato e la media di cicli di soglia ? stata usata per quantificare le copie di DNA in relazione ai valori medi di campioni di controllo negativo. L?espressione genica relativa ? stata calcolata usando il gene costitutivo (housekeeping) ACT1N1 (Hs_02249516 ACT1N1, ThermoFisher Scientific), ? stata eseguita una qPCR impiegando il QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System (ThermoFisher Scientific). Per la PCR-MRD IG/TR dei DP, ciascun valore di MRD ? stato calcolato a partire dalla curva standard corrispondente, e i risultati sono stati normalizzati per valori del gene costitutivo dell?albumina. L?intervallo quantitativo (quantitative range, QR) e l?intervallo sensibile (sensitive range, SR), il valore positivo, e la riproducibilit? di replicati sono stati interpretati seguendo le linee guida Euro MRD, al fine di assegnare il valore di MRD adeguato a ciascun campione analizzato. Una qPCR ? stata eseguita usando il 7900 HT fast-Real Time-PCR System e il sistema ViiA7 (ThermoFisher Scientific) e il TaqMan Gene Expression Master Mix (ThermoFisher Scientific).
Modello di topo con leucemia CAR+ in vivo.
Topi di sesso femminile Cg-Prkdc<scid >Il2rg<tm1Wjl>/SzJ (NSG) sono stati forniti da Charles River e mantenuti nella struttura per animali Plaisant a Castel Romano, Roma, Italia. Tutte le procedure sono state eseguite in conformit? con le Linee Guida per la Cura e l?Uso degli Animali dell?Istituto Nazionale di Sanit? (Comitato etico per la sperimentazione animale Prot. N 088/2016-PR). Per testare l?attivit? di T CAR su una leucemia CAR+, il modello di topo NSG ? stato sottoposto a innesto per via endovenosa di 0,25x10<6 >cellule NALM-6 WT o NALM-6 CAR.CD19SL/LH o NALM-6 CAR.CD19LL/SH o DAUDI CAR.CD19SL/LH geneticamente modificate con luciferasi di lucciola (FF-Luc). Al giorno 3, i topi sono stati trattati con 10x10<6 >cellule T CAR.CD19 o cellule T non trasdotte (NT) di controllo. La crescita tumorale ? stata monitorata con cadenza settimanale mediante un sistema di rappresentazione per immagini IVIS, dopo la somministrazione per via intraperitoneale di D-Luciferina (PerkinElmer, sale di potassio di D-Luciferina).
Analisi statistica.
Salvo diversamente indicato, i dati vengono riassunti come media ? deviazione standard (DS). Un test t di Student (bilaterale) ? stato usato per determinare differenze statisticamente significative tra i campioni, con il valore p <0,05 che indica una differenza significativa. I dati relativi alla sopravvivenza dei topi sono stati analizzati usando la curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier e il test esatto di Fisher ? stato usato per misurare differenze statisticamente significative. Nessun campione di valore ? stato escluso dalle analisi. Gli animali sono stati esclusi soltanto nell?eventualit? della loro morte dopo un impianto tumorale ma prima del trattamento. N? la randomizzazione n? la valutazione in cieco sono state eseguite durante lo studio in vivo. Tuttavia, i topi sono stati abbinati in base al segnale tumorale per gruppi di trattamento e di controllo prima dell?infusione di controllo o specifico. Per confrontare la crescita dei tumori nel tempo, un?intensit? del segnale di bioluminescenza ? stata raccolta in cieco. L?intensit? del segnale di bioluminescenza ? stata sottoposta a trasformazione logaritmica e in seguito confrontata usando un test t a due campioni. La dimensione del campione ? stata stimata considerando nessuna variazione significativa all?interno di ciascun gruppo di dati. Si ? tentato di raggiungere una conclusione usando una dimensione del campione il pi? piccola possibile. ? stata stimata la dimensione del campione per rilevare una differenza nelle medie di 2 deviazioni standard in corrispondenza del livello di significativit? 0,05 con una potenza dell?80%. Le rappresentazioni grafiche e l?analisi statistica sono state eseguite usando un GraphPad Prism 6 (GraphPad Software,
Risultati
Generazione di cellule T CAR.CD19 da cellule mononucleari da PB di pazienti con Bcp-ALL.
La popolazione non frazionata di cellule mononucleari da PB ? stata isolata dai pazienti alla diagnosi aventi il 45,05?28,12% medio di blasti circolanti (n=10. Intervallo, 5,5-86,4%). Le cellule mononucleari derivate da PB dei pazienti arruolati sono state trasdotte con una cerniera lunga di iC9.CAR.CD19 di seconda generazione (iC9.CAR.CD19LH) secondo il metodo dettagliato nella figura 1A. Dopo 5 giorni dal procedimento di trasduzione, i prodotti di cellule T hanno mostrato un?efficacia di trasduzione del 55,15?16,54% (la figura 1B mostra un?analisi esemplificativa, mentre la figura 1C mostra la media di 15 pazienti leucemici suddivisi in due gruppi in base alla % di cellule CD19<+ >nel materiale di partenza, considerando il 45% del cut-off del valore mediano). ? stato valutato se la contaminazione di blasti leucemici nel campione di pazienti abbia un?eventuale incidenza sulla produzione delle cellule T CAR, in particolare in termini di livello di trasduzione di CAR nei DP, cos? come sul numero totale di cellule T CAR generate. Non ? stata osservata alcuna correlazione tra la percentuale di cellule T CAR alla fine della procedura di produzione e il livello di cellule B CD19+ che contaminano il materiale di partenza (figura 1C e 1D), cos? come sulla resa di cellule T CAR osservata quando la produzione ? iniziata dal materiale proveniente da un paziente caratterizzato da pi? del 45% di cellule CD19<+ >(valore medio di cut-off; figura 1E). Per considerare i campioni provenienti dai pazienti con una percentuale aumentata di blastociti leucemici, cos? come le cellule leucemiche con uno stadio pi? immaturo, le cellule T CAR sono state generate a partire da campioni di aspirato di BM di pazienti con Bcp-ALL alla diagnosi (n=6. Figura 2A) in cui la media di cellule CD19+ nel materiale di partenza era del 73,1?17,80% (intervallo, 40,5-83,5%). Bench? il livello di trasduzione in campioni derivati da BM fosse significativamente inferiore rispetto a quello in campioni di PB (figura 2 A-B; 36,04?19,83% rispetto al 55,15?16,54% di cellule T CAR+, rispettivamente; p=0,03), non ? stata osservata alcuna differenza in termini di resa totale di recupero di DP da campioni di PB o BM (figura 2C).
Caratterizzazione approfondita di prodotti di cellule T CAR derivati da pazienti.
Una PCR quantitativa in tempo reale ? stata eseguita su DP di cellule T CAR (giorno 14, fineproduzione) per l?amplificazione di ridisposizioni di Ig paziente-specifiche, osservate alla diagnosi di ciascun paziente. ? stata osservata una positivit? di MRD in 7 dei 14 DP di cellule T CAR testati, con una MRD media di 6,01E-3?1,00E-2 (Tabella 3).
Tabella 3
La Tabella 3 mostra dati provenienti da ciascun paziente arruolato come relativi alla percentuale di cellule leucemiche CD19+ nel materiale di partenza grezzo considerato per la produzione di T CAR, e il valore di MRD per due marcatori di Ig diversi (MRD#1 e MRD#2) identificato al momento della diagnosi in ogni singolo paziente. I dati di MRD sono stati riportati sia per i campioni di cellule T non trasdotte di controllo (NT) sia per i campioni di cellule T CAR.CD19 (CAR).
Inoltre, ? stato osservato che la contaminazione da blastociti leucemici era anche presente in 9 dei 13 campioni di cellule T non trasdotte testati (NT, Tabella 3), dimostrando che le cellule leucemiche sopravvivono in coltura indipendentemente dal processo di trasduzione. Pi? nel dettaglio, sono stati eseguiti esperimenti nel tempo, in cui i DP sono stati analizzati per MRD in corrispondenza del punto temporale molto precoce del Giorno+8 dopo l?attivazione, del Giorno+14 come procedure standard per la produzione di T CAR, e del Giorno+30 come coltura molto estesa per un DP di cellule T CAR (dati ottenuti da 5 produzioni da pazienti diverse, n=5). Come mostrato nella figura 3A, ? stata osservata una correlazione inversa tra i livelli di MRD e l?andamento temporale della coltura in vitro, con una riduzione significativa di MRD all?aumentare progressivo del periodo di coltura (p=0,02 considerando l?MRD al Giorno+8 rispetto al Giorno+14), raggiungendo un livello dietro la sensibilit? in corrispondenza dell?ultimo punto temporale del Giorno+30. Per quei campioni con abbastanza materiali disponibili, l?analisi di DP ? stata anche eseguita applicando la piattaforma per citometria EuroFlow a sensibilit? elevata (Leukemia. Sett. 2012; 26(9): 1899-1907). Come mostrato chiaramente nella figura 3B che riporta dati provenienti da un DP di cellule T CAR esemplificativo al Giorno+14 del procedimento di produzione e una coltura di controllo di cellule T NT, l?analisi citofluorimetrica applicata era abbastanza sensibile da rilevare una MRD positiva. I precursori di cellule B che contaminano prodotti di CAR risultavano essere molto opachi a CD19 (figura 4), ma hanno preservato altri marcatori di cellule B, come CD10 (figura 4). Ciononostante, la percentuale di cellule B che contaminano cellule T NT espanse in vitro, risultando CD19+ CD10+, era significativamente superiore rispetto a quelle osservate in campioni di CAR (figura 4, MRD 1,5% rispetto allo 0,00036%, rispettivamente). ? stato verificato se le cellule B fossero caratterizzate da una trasduzione di CAR. Come mostrato nella figura 5, per due campioni con MRD positiva in PCR e in seguito analizzati mediante saggio citofluorimetrico, cellule leucemiche CAR positive sono state rilevate, mostrando una doppia positivit? a due colorazioni diverse per una molecola di CAR (epitopo di rilevamento anti-CD34 sulla regione cerniera di iC9.CAR.CD19LH cos? come l?epitopo CD19 riconosciuto dal scFv di CAR.CD19). I dati sono stati altres? confermati su DP derivati da BM, in cui una RT-qPCR mostra una positivit? di MRD in 6 su 6 produzioni di T CAR (Tabella 4).
Tabella 4
La Tabella 4 mostra i dati di ciascun paziente arruolato come relativi alla percentuale di cellule leucemiche CD19+ nelle cellule mononucleari di BM derivate dai pazienti usate come materiale grezzo di partenza per la produzione di cellule T CAR, e il valore di MRD per due marcatori di Ig diversi identificati al momento della diagnosi in ogni singolo paziente. I dati di MRD sono stati riportati sia per i campioni di cellule T non trasdotte (NT) di controllo sia per i campioni di cellule T iC9.CAR.CD19LH (CAR).
Per due DP derivati da BM, l?MRD ? stata altres? confermata mediante una piattaforma per citometria EuroFlow (figura 5). In questi casi, la sensibilit? del saggio e la qualit? dei campioni congelati non hanno consentito il rilevamento di precursori di cellule B CAR positivi. Anche nei prodotti di cellule T CAR derivati da BM, i precursori di cellule B che contaminano i DP erano CD19 opachi/negativi, mentre nei prodotti di cellule T non trasdotte che contaminano le cellule B hanno mostrato un?espressione elevata di CD19.
La lunghezza del linker di CAR incide sul mascheramento degli epitopi
? stato valutato se una progettazione di CAR.CD19 nel linker e nelle regioni cerniera potesse avere qualche incidenza sul mascheramento di CD19 quando un CAR.CD19 viene co-espresso con CD19 sulla stessa membrana cellulare. In particolare, quattro conformazioni specifiche, riassunte nella figura 6A, sono state considerate per dimostrare quale conformazione di configurazione nel costrutto di CAR sia responsabile per il mascheramento dell?antigene CD19 nelle cellule leucemiche CAR+. A tal fine, i 4 costrutti di CAR diversi sono stati usati per modificare geneticamente una linea di cellule NALM-6. Bench? le cellule abbiano mantenuto una positivit? a CD19 a livello del mRNA (figura 7A), il motivo dei livelli di fluorescenza CD19-associati in NALM-6 CAR.CD19LL/SH (istogramma grigio chiaro) era sovrapponibile all?isotipo di controllo (istogramma grigio scuro) (figura 6B), confermando i dati precedentemente pubblicati (5). In seguito, ? stata considerata una configurazione di CAR.CD19 di seconda generazione diversa, caratterizzata da un linker lungo (come quello prima), ma in presenza di una cerniera lunga che include ?CD34 (CAR.CD19LL/LH). In questo caso, un?analisi mediante citometria a flusso con mascheramento non ha mostrato alcuna differenza rispetto al CAR.CD19LL/SH di riferimento (figura 6C). In seguito, ? stato valutato il contributo della lunghezza del linker tra regioni VL e VH, considerando il rilevamento mediante MFI di CD19 in NALM-6 che trasportano CAR.CD19SL/SH. Come mostrato nella figura 6D, l?MFI di CD19 era superiore in NALM-6 CAR.CD19SL/SH rispetto al CAR.CD19LL/SH di riferimento. Infine, sono state considerate NALM-6 geneticamente modificate con il costrutto di CAR della presente invenzione in cui il linker corto tra VL e VH ? associato alla cerniera lunga che include ?CD34, come marcatore tracciabile per cellule T CAR. Anche nel caso di una LH, l?SH ? associata a una MFI di CD19 diversa rispetto alla struttura di riferimento (figura 6E). Gli stessi dati sono anche stati osservati in altre due linee di cellule B diverse, cellule DAUDI e RAJI, in cui un mascheramento di CD19 incompleto ? stato mostrato quando cellule di linfoma erano state geneticamente modificate con CAR.CD19SL/LH (figura 7B). Sulla base di queste osservazioni, ? stato ipotizzato che la lunghezza del linker potesse essere il fattore che determina un mascheramento CIS dell?antigene CD19 completo o incompleto su cellule leucemiche CAR+ nella piattaforma retrovirale. Questi risultati sono anche stati corroborati mediante un?analisi funzionale. Di fatto, un livello molto basso di espressione di CD19 su cellule DAUDI, RAJI e NALM-6 CAR.CD19SL/LH era sufficiente per suscitare una risposta delle cellule T CAR.CD19, bench? in misura minore rispetto alle linee cellulari wild type (figura 8A-C), in particolare a bassi rapporti effettore/bersaglio. Come mostrato nella figura 8C, le cellule T CAR.CD19 esercitano un controllo della leucemia completo contro NALM-6 WT, senza alcuna differenza significativa rispetto all?attivit? anti-leucemica osservata contro NALM-6 CAR.CD19SL/SH e NALM-6 CAR.CD19SL/LH. Di rilievo, mentre le cellule T CAR.CD19 erano completamente incapaci di riconoscere NALM-6 CAR+ applicate da Ruella et al nella pubblicazione precedente (5) (figura 7C), ? stata osservata una certa attivit? delle cellule T CAR.CD19 contro NALM-6 CAR.CD19LL/SH, bench? in misura minore rispetto a NALM-6 CAR.CD19SL/SH e NALM-6 CAR.CD19SL/LH (figura 8C). In linea con queste risultanze, ? stato anche osservato che le cellule NALM-6 geneticamente modificate con entrambi i CAR.CD19 con SL o LL erano in grado di indurre una quantit? significativa di interferone-gamma (IFN-g) mediante cellule T CAR (figura 9A), cos? come di indurre la loro proliferazione (figura 9B).
Un linker corto e una cerniera lunga in un costrutto di CAR.CD19 non hanno avuto un?incidenza sulla funzionalit? e sulla immunogenicit? di CAR.
Nello specifico, mentre CAR.CD19SL/LH porta al mascheramento CIS dell?antigene CD19 incompleto, quando espresso sulle cellule T, era in grado di esercitare un controllo della leucemia/del linfoma significativo. In particolare, un saggio di co-coltura ? stato usato per dimostrare l?effetto citotossico di cellule T CAR.CD19SL/LH contro una linea di cellule DAUDI (figura 8A), Raji (figura 8B) e NALM-6 (figura 8C). Come mostrato nelle figure 8A e 8B, cellule T CAR.CD19SL/LH sono in grado di eliminare cellule tumorali dalla coltura anche quando usate a un rapporto effettore/bersaglio basso. Per il modello NALM-6, anche l?attivit? anti-leucemica delle cellule T CAR.CD19SL/LH ? stata confrontata con quella delle cellule T CAR.CD19LL/SH pi? standard, non mostrando alcuna differenza sostanziale in termini di citotossicit? (figura 8C, NALM-6 WT), produzione di interferone gamma (IFN-g) (figura 9A) o indice di proliferazione in seguito a stimolazione dell?antigene (figura 9B). Quest?ultimo saggio ? stato eseguito stimolando cellule T CAR caricate con CFSE con cellule NALM-6 WT, e osservando che, indipendentemente dal costrutto di CAR, entrambe le cellule T CAR.CD19 sono state in grado di raggiungere un livello paragonabile di cellule a proliferazione elevata (istogrammi grigio chiaro) rispetto alle cellule non stimolate (istogrammi grigio scuro). Inoltre, poich? il marcatore tracciabile CD34 ? stato incluso nella configurazione di CAR, un?analisi in silico ? stata altres? eseguita per prevedere la sua immunogenicit?. In particolare, sono state studiate le sequenze di peptidi che si prevede fiduciosamente siano presentate mediante molecole di MHC nella regione di CAR che include un dominio CD34. ?STNVSPAPR? (un peptide di SEQ ID NO:181 viene previsto come potenzialmente immunogenico per un costrutto includente CD34 (Tabella 5, presentata mediante le molecole di MHC HLA-A11:01 e HLA-A33:03)). Il peptide ?GSELPTQGTF? (SEQ ID NO:182) corrisponde anch'esso ai criteri di selezione, ma in questo caso il suo nucleo di legame ? ?ELPTQGTF? (SEQ ID NO:183) ed ? interamente parte della regione dell?epitopo CD34; di conseguenza, ? improbabile che sia altamente immunogenico. Per il costrutto di CAR in cui il dominio CD34 non ? stato considerato, si prevede che entrambi i peptidi ?SVTVSSPAPR? (SEQ ID NO:184) e la sua versione pi? corta ?VTVSSPAPR? (SEQ ID NO:185) siano immunogenici, presentati mediante gli stessi alleli HLA-A11:01 e HLA-A33:03. In considerazione di questi dati, prevediamo che l?inclusione del dominio CD34 nel costrutto non abbia inciso in modo sostanziale sul profilo immunogenico del CAR.
Tabella 5
L?attivazione del gene suicida iC9 controlla l?espansione delle cellule leucemiche CAR+.
? stata dimostrata la possibilit? di eliminare prontamente le cellule leucemiche CAR+ attraverso l?esposizione di cellule DAUDI, RAJI e NALM-6 iC9.CAR+ a 20 nM di AP1903. Di fatto, un?attivazione molto precoce (6 ore) del gene suicida iC9 corrispondeva a una riduzione significativa della percentuale di cellule leucemiche CAR+ (figura 8D e 8E per le cellule DAUDI e figura 10 per le cellule RAJI e NALM6). Una coltura prolungata di cellule DAUDI iC9.CAR.CD19 trattate con AP1903 non ? stata associata a una riespansione delle cellule leucemiche iC9.CAR+ (figura 8E). In particolare, l?MFI dell'espressione di CAR in cellule trattate con AP1903 era pari a 142?22 (valore di soglia; figura 10E), un valore significativamente inferiore rispetto alle cellule non trattate, ma superiore alla colorazione con CAR di cellule DAUDI WT (125,8?20,6, figura 10E). Gli stessi risultati sono stati anche confermati in modelli cellulari RAJI (figura 10A-B) e NALM-6 (figura 10C-D). Bench? la presenza di cellule leucemiche con una MFI di espressione di CAR elevata non fosse rilevabile tramite un?analisi mediante citometria a flusso in cellule trattate con AP1903, la presenza di cellule leucemiche ? stata osservata con un?espressione molto debole (vale a dire moderata) di CAR.CD19, ma un rilevamento ristabilito completo di antigene CD19, come in linee cellulari wild type (figura 8E, 10B e 10D). Di fatto, un?analisi mediante qPCR rivela il rilevamento del transgene (TG) nelle cellule rimanenti dopo l?esposizione ad AP1903 (figura 9F), bench? significativamente ridotto rispetto alle cellule CAR+ non trattate (una positivit? del TG ? stata osservata nel 22,8% di cellule DAUDI, nel 18,6% di cellule RAJI e nello 0,6% di cellule NALM-6). L?analisi del numero di copie di vettore rivela che cellule residue trattate con AP1903 presentavano un numero significativamente inferiore di vettore inserito rispetto a quello non trattato (5,3?4,2 e 0,1?0,1 media di soglia di VCN in cellule B trattate con AP1903 e non trattate, rispettivamente, attraverso tutti i modelli cellulari considerati; figura 10F). Poich? il rilevamento di CD19 ? stato completamente ristabilito in cellule B iC9.CAR+ recuperate dopo l?esposizione ad AP1903, ? stato verificato se potessero essere bersagliate mediante cellule T CAR.CD19. Come mostrato nella figura 11, le cellule T CAR.CD19 (figura 11A e 11B) erano in grado di eliminare cellule leucemiche CAR+ risparmiate dal trattamento con AP1903. Inoltre, in ragione dell?impossibilit? clinica di generare un prodotto di cellule T CAR autologo da pazienti con una ricomparsa di cellule B CAR+, ? stato anche dimostrato che cellule NK CAR.CD19 derivate da donatori sani sono in grado di controllare in modo significativo cellule B iC9.CAR+ recuperate dopo l?esposizione ad AP1903 (figura 11C e 11D).
Una duplice strategia per il controllo in vivo di una leucemia CAR+.
La capacit? delle cellule T CAR.CD19 di bersagliare una leucemia a cellule B wild type oltre a un costrutto di CAR con un SL o un LL ? stata dimostrata in vivo in un modello di xenotrapianto NSG di leucemia a cellule B. In particolare, i topi sono stati infusi per via sistemica con NALM-6 geneticamente modificate con FF-luciferasi per consentire il monitoraggio in vivo del carico leucemico nel tempo. L?attecchimento tumorale ? stato analizzato misurando il segnale di bioluminescenza e, al Giorno+0, i topi sono stati trattati con cellule T sia CAR.CD19SL/LH sia CAR.CD19LL/SH, cos? come con cellule T NT di controllo derivate da HD (figura 12A). Le cellule T CAR.CD19SL/LH e CAR.CD19LL/SH erano in grado di controllare in modo significativo l?espansione in vivo di NALM-6, come dimostrato chiaramente mediante un?analisi di bioluminescenza. In seguito, ? stato valutato se NALM-6 CAR.CD19SL/LH fossero anche state riconosciute da cellule T CAR nello scenario in vivo. Come mostrato nella figura 12B, cellule T CAR.CD19SL/LH sono state in grado di ridurre in modo significativo l?espansione in vivo delle cellule NALM-6 CAR+ rispetto alle cellule T NT di controllo. Gli stessi dati sono stati anche confermati in un modello di linfoma meno aggressivo di linea di cellule DAUDI (figura 12D). In questo modello, le cellule T CAR.CD19SL/LH sono state in grado di controllare ed eliminare cellule di linfoma CAR+ in tutti i topi trattati. La coorte di topi trattata con cellule T CAR.CD19 ha raggiunto il 100% di sopravvivenza libera da malattia (disease-free survival, DFS) alla fine della procedura sperimentale (giorno 21) rispetto allo 0% di DFS per la coorte di controllo di topi che hanno ricevuto cellule T di NT. Inoltre, sono stati anche corroborati i dati in vitro in relazione a NALM-6 CAR.CD19LL/SH. Anche nello scenario in vivo, le cellule T CAR sono state in grado di esercitare un controllo anti-leucemico contro NALM-6 CAR.CD19LL/SH (figura 12C), bench? in misura minore a quelli osservati nel modello CAR.CD19SL/LH (figura 12B e figura 12E).
Infine, la capacit? del gene suicida iC9 di essere attivo nel controllo dell?espansione di una leucemia CAR+ in seguito all?attivazione mediante AP1903 ? stata anch?essa dimostrata in vivo. In particolare, topi NSG sono stati infusi con cellule DAUDI iCas9.CAR.CD19LH; dopo l?attecchimento tumorale, il farmaco dimerizzante AP1903 ? stato somministrato per via intraperitoneale dal giorno 1 al giorno 28 (figura 13A). L?attivazione di iC9 mediante la somministrazione di AP1903 ha determinato un?eradicazione di leucemia CAR+ completa in 9 su 10 topi studiati (figura 13B e 13C). Inoltre, la somministrazione di AP1903 consente la sopravvivenza del 100% dei topi trattati anche dopo la sospensione della somministrazione del farmaco, con nessun topo che mostrava una recidiva della leucemia fino al giorno 63 (punto terminale dell?esperimento; figura 13D). L?unico topo che mostrava una segnalazione positiva nell?analisi IVIS dopo la somministrazione mediante CID ? stato precocemente soppresso al giorno 35 senza segni di sofferenza, insieme a un controllo negativo (topo della stessa coorte) e un controllo positivo (topo senza somministrazione mediante CID), per caratterizzare le cellule leucemiche. Applicando un?analisi citofluorimetrica su BM di sangue periferico, milza e tibia (fianco sinistro), le cellule leucemiche non hanno potuto essere rilevate nei topi trattati con CID con un?espressione positiva di molecola di CAR.
Claims (28)
1) Recettore chimerico di antigene comprendente o consistente in, dall?N-terminale al C-terminale:
a) un peptide segnale,
b) un dominio anticorpale a catena singola scelto dal gruppo consistente in un dominio anticorpale a catena singola anti-CD19, un dominio anticorpale a catena singola anti-CD20 o un dominio anticorpale a catena singola anti-CD22, detto dominio anticorpale a catena singola comprendendo o essendo consistente in sequenze VL e VH legate tra loro mediante un linker, c) una cerniera,
d) un dominio transmembrana,
e) un dominio di segnalazione costimolatorio, e f) sequenza della catena CD3Zeta,
in cui detto linker ? un linker flessibile corto con una lunghezza da 7 a 14 amminoacidi, come da 7 a 12, da 7 a 10 o 8 amminoacidi.
2) Recettore chimerico di antigene secondo la rivendicazione 1, in cui
un dominio anticorpale a catena singola anti-CD19 comprende sequenze VL e VH di ibridoma FMC63 anti-CD19, in cui la sequenza VL di ibridoma FMC63 anti-CD19 comprende la sequenza di CDR1 QDISKY (SEQ ID NO:1), la sequenza di CDR2 HTS e la sequenza di CDR3 GNTLP (SEQ ID NO:2), mentre la sequenza VH di ibridoma FMC63 anti-CD19 comprende la sequenza di CDR1 GVSLPDYG (SEQ ID NO:3), la sequenza di CDR2 IWGSETT (SEQ ID NO:4) e la sequenza di CDR3 AKHYYYGGSYAMDY (SEQ ID NO:5);
un dominio anticorpale a catena singola anti-CD20 comprende sequenze VL e VH anti-CD20, in cui la sequenza VL anti-CD20 comprende la sequenza di CDR1 SSVSY (SEQ ID NO:6), la sequenza di CDR2 ATS e la sequenza di CDR3 QQWTSNPPT (SEQ ID NO:7), mentre la sequenza VH anti-CD20 comprende la sequenza di CDR1 GYTFTSYN (SEQ ID NO:8), la sequenza di CDR2 IYPGNGDT (SEQ ID NO:9) e la sequenza di CDR3 ARSTYYGGDWYFNV (SEQ ID NO:10);
un dominio anticorpale a catena singola anti-CD22 comprende sequenze VL e VH anti-CD22, in cui la sequenza VL anti-CD22 comprende la sequenza di CDR1 QSLANSYGNTF (SEQ ID NO:11), la sequenza di CDR2 GIS e la sequenza di CDR3 LQGTHQP (SEQ ID NO:12), mentre la sequenza VH anti-CD 22 comprende la sequenza di CDR1 GYRFTNYWIH (SEQ ID NO:13), la sequenza di CDR2 INPGNNYA (SEQ ID NO:14) e la sequenza di CDR3 TR.
3) Recettore chimerico di antigene secondo la rivendicazione 2, in cui
la sequenza VL di ibridoma FMC63 anti-CD19 comprende o consiste nella sequenza DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYH TSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLE IT (SEQ ID NO:15) e
la sequenza VH di ibridoma FMC63 anti-CD19 comprende o consiste nella sequenza EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGV IWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSY AMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:16);
la sequenza VL anti-CD20 comprende o consiste nella sequenza
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYAT SNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEI
K (SEQ ID NO:17) e
la sequenza VH anti-CD20 comprende o consiste nella sequenza
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGA IYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGD WYFNVWGAGTTVTVSA (SEQ ID NO:18);
la sequenza VL anti-CD22 comprende o consiste nella sequenza
DVQVTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLANSYGNTFLSWYLHKPGKAPQ LLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGTHQPYTFGQ GTKVEIK (SEQ ID NO:19) e
la sequenza VH anti-CD22 comprende o consiste nella sequenza
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYRFTNYWIHWVRQAPGQGLEWIGG INPGNNYATYRRKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTREGYGNYG AWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:20).
4) Recettore chimerico di antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui il linker che lega le sequenze VL e VH ? scelto dal gruppo consistente in un linker Flex flessibile ricco di glicine, come il linker (G4S)2 GGGGSGGGG (SEQ ID NO:35), il linker G4SG2 GGGGSGG (SEQ ID NO:37) o il linker G3SG4 GGGSGGGG (SEQ ID NO:38), preferibilmente il linker G3SG4.
5)Recettore chimerico di antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui detta cerniera comprende o consiste in una o pi? delle seguenti cerniere:
CD8stalk TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO:21);
Cerniera CD28 EVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO:22);
cerniera CH2-CH3 ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:23); o
cerniera CH3:
ESKYGPPCPSCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:24), preferibilmente CD8stalk.
6) Recettore chimerico di antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui detta cerniera ? legata, in corrispondenza dell?N terminale, a un marcatore tracciabile, detto marcatore tracciabile essendo legato, opzionalmente mediante un secondo linker, al dominio anticorpale a catena singola.
7) Recettore chimerico di antigene secondo la rivendicazione 6, in cui il marcatore tracciabile ? scelto dal gruppo consistente in:
?CD34 ELPTQGTFSNVSTNVS (SEQ ID NO:25); o
NGFR KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVS ATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSG LVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAEC EEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVV TRGTTDN (SEQ ID NO:26), preferibilmente ?CD34.
8) Recettore chimerico di antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7, in cui la cerniera CD8stalk ? legata al marcatore tracciabile ?CD34.
9) Recettore chimerico di antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8, in cui il dominio transmembrana ? scelto dal gruppo consistente in CD28TM FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:27) o CD8aTM IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO:28), preferibilmente CD8aTM.
10) Recettore chimerico di antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9, in cui il dominio di segnalazione costimolatorio ? scelto dal gruppo consistente in
sequenza citoplasmatica di CD28 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:29),
sequenza di CD137 (4-1BB) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO:30),
sequenza di OX40 RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:31), oppure
una sequenza ottenuta legando:
la sequenza citoplasmatica di CD28 (SEQ ID NO:29) con la sequenza di CD137 (4-1BB) (SEQ ID NO:30),
la sequenza di CD137 (4-1BB) (SEQ ID NO:30) con la sequenza citoplasmatica di CD28 (SEQ ID NO:29),
la sequenza citoplasmatica di CD28 (SEQ ID NO:29) con la sequenza di OX40 (SEQ ID NO:31),
la sequenza di OX40 (SEQ ID NO:31) con la sequenza citoplasmatica di CD28 (SEQ ID NO:29),
la sequenza di OX40 (SEQ ID NO:31) con la sequenza di CD137 (4-1BB) (SEQ ID NO:30),
la sequenza di CD137 (4-1BB) (SEQ ID NO:30) con la sequenza di OX40 (SEQ ID NO:31).
11) Recettore chimerico di antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-10, in cui la sequenza della catena CD3Zeta ? RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP PR* (SEQ ID NO:32).
12) Recettore chimerico di antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-11, comprendente ulteriormente una frazione citoplasmatica di CD8cyt: LYCNHRNRRRVCKCPR (SEQ ID NO:40) tra il dominio transmembrana e il dominio di segnalazione costimolatorio.
13)Recettore chimerico di antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-12, in cui il peptide segnale comprende o consiste in MEFGLSWLFLVAILKGVQC (SEQ ID NO:41).
14) Recettore chimerico di antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-13, in cui detto recettore chimerico di antigene anti-CD19 comprende o consiste nella seguente sequenza:
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLN WYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQ QGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSL PDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNS LQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSELPTQGTFSNVSTNVSP APRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVL LLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSC RFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDP EMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATK DTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:72) o MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLN WYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQ QGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSL PDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNS LQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSPAPRPPTPAPTIASQPL SLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRR RVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKF SRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(SEQ ID NO:33) .
15) Sequenza nucleotidica comprendente o consistente in una sequenza nucleotidica che codifica un recettore chimerico di antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-14.
16) Sequenza nucleotidica secondo la rivendicazione 15, in cui
la sequenza VL di ibridoma FMC63 anti-CD19 ? codificata dalla sequenza nucleotidica GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGA CAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGG TATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGAT TACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTC TCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAG GGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA (SEQ ID NO:52) e
la sequenza VH di ibridoma FMC63 anti-CD19 ? codificata dalla sequenza nucleotidica GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAG CCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGC TGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTA GTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGA CAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACA GCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACT ACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:53);
la sequenza VL anti-CD20 ? codificata dalla sequenza nucleotidica CAGATCGTGCTGAGCCAGAGCCCCGCCATCCTGAGCGCCAGCCCCGGCGA GAAGGTGACCATGACCTGCAGGGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATCCACTGGTTC CAGCAGAAGCCCGGCAGCAGCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGG CCAGCGGCGTGCCCGTGAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCT GACCATCAGCAGGGTGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGG ACCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG (SEQ ID NO:54) e
la sequenza VH anti-CD20 ? codificata dalla sequenza nucleotidica CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCCGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAG CGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCAC TGGGTGAAGCAGACCCCCGGCAGGGGCCTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCG GCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGC CGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGAC AGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCA ACGTGTGGGGCGCCGGCACCACCGTGACCGTGAGC (SEQ ID NO:55);
la sequenza VL anti-CD22 ? codificata dalla sequenza nucleotidica
GACGTGCAGGTGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGA CAGGGTGACCATCACCTGCAGGAGCAGCCAGAGCCTGGCCAACAGCTACGGCAAC ACCTTCCTGAGCTGGTACCTGCACAAGCCCGGCAAGGCCCCCCAGCTGCTGATCT ACGGCATCAGCAACAGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAG CGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACC TACTACTGCCTGCAGGGCACCCACCAGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGG TGGAGATCAAG(SEQ ID NO:56) e
la sequenza VH anti-CD22 ? codificata dalla
sequenza nucleotidica
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAG CGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGGTTCACCAACTACTGGATCCAC TGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGGCATCAACCCCG GCAACAACTACGCCACCTACAGGAGGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATGACCGC CGACACCAGCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGAC ACCGCCGTGTACTACTGCACCAGGGAGGGCTACGGCAACTACGGCGCCTGGTTCG CCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC(SEQ ID NO:57).
17) Sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15-16, in cui la sequenza nucleotidica che codifica un recettore chimerico di antigene anti-CD19 ?:
ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGT GTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGG AGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAAT TGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAA GATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTA TTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAA CAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAG GCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCT GGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTA CCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGC TGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAG ACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGT CTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTG GTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGG ATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCC GCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGA GACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGA TTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTT CTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTT GTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAA ACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGC CGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGA GCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAA TCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCT GAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAAC TGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCG CCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAG GACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA (SEQ ID NO:58) o
ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGT GTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGG AGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAAT TGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAA GATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTA TTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAA CAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAG GCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCT GGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTA CCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGC TGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAG ACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGT CTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTG GTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGG ATCCCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTG AGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAG GACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGG AGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGC CGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATA TATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTG TAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTC AGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACG AGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCG GGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTAC AATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAG GCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGC CACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAA
(SEQ ID NO:34).
18) Sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15-17, detta sequenza nucleotidica comprendendo ulteriormente una sequenza nucleotidica che codifica la sequenza amminoacidica di un gene suicida inducibile legata alla sequenza nucleotidica che codifica detto recettore chimerico di antigene mediante una sequenza nucleotidica che codifica un peptide autoclivante 2A.
19) Sequenza nucleotidica secondo la rivendicazione 18, in cui la sequenza amminoacidica del gene suicida inducibile ? un polipeptide di Caspasi-9 chimerico oppure comprende una timidin chinasi del virus dell?herpes simplex.
20) Sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15-19, che ?
ATGCTCGAGATGCTGGAGGGAGTGCAGGTGGAGACTATTAGCCCCGGAGA TGGCAGAACATTCCCCAAAAGAGGACAGACTTGCGTCGTGCATTATACTGGAATG CTGGAAGACGGCAAGAAGGTGGACAGCAGCCGGGACCGAAACAAGCCCTTCAAGT TCATGCTGGGGAAGCAGGAAGTGATCCGGGGCTGGGAGGAAGGAGTCGCACAGAT GTCAGTGGGACAGAGGGCCAAACTGACTATTAGCCCAGACTACGCTTATGGAGCA ACCGGCCACCCCGGGATCATTCCCCCTCATGCTACACTGGTCTTCGATGTGGAGC TGCTGAAGCTGGAAAGCGGAGGAGGATCCGGAGTGGACGGGTTTGGAGATGTGGG AGCCCTGGAATCCCTGCGGGGCAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGTCTATGGAG CCTTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAGAGCGGGC TGCGGACCAGAACAGGATCCAATATTGACTGTGAAAAGCTGCGGAGAAGGTTCTC TAGTCTGCACTTTATGGTCGAGGTGAAAGGCGATCTGACCGCTAAGAAAATGGTG CTGGCCCTGCTGGAACTGGCTCGGCAGGACCATGGGGCACTGGATTGCTGCGTGG TCGTGATCCTGAGTCACGGCTGCCAGGCTTCACATCTGCAGTTCCCTGGGGCAGT CTATGGAACTGACGGCTGTCCAGTCAGCGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTCAAC GGCACCTCTTGCCCAAGTCTGGGCGGGAAGCCCAAACTGTTCTTTATTCAGGCCT GTGGAGGCGAGCAGAAAGATCACGGCTTCGAAGTGGCTAGCACCTCCCCCGAGGA CGAATCACCTGGAAGCAACCCTGAGCCAGATGCAACCCCCTTCCAGGAAGGCCTG AGGACATTTGACCAGCTGGATGCCATCTCAAGCCTGCCCACACCTTCTGACATTT TCGTCTCTTACAGTACTTTCCCTGGATTTGTGAGCTGGCGCGATCCAAAGTCAGG CAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGATATCTTTGAGCAGTGGGCCCATTCTGAA GACCTGCAGAGTCTGCTGCTGCGAGTGGCCAATGCTGTCTCTGTGAAGGGGATCT ACAAACAGATGCCAGGATGCTTCAACTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGAC CTCCGCATCTAGGGCCCCGCGGGAAGGCCGAGGGAGCCTGCTGACATGTGGCGAT GTGGAGGAAAACCCAGGACCACCATGGATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTT TGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGAC TACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCA AGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTG TTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTT CAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAA GAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCG GAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGT GAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTC ACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCC AGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCAC ATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAG AGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACT ACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCA AGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTC TCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGA CCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGG CGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCA CCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACT GTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGG CAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACT ACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGAT GTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGG CCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTT TTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGA ACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTA CAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTT TACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGG CCCTGCCCCCTCGCTAA (SEQ ID NO:180).
21) Vettore comprendente la sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15-20, in cui detto vettore ? un vettore di DNA, un vettore di RNA, un plasmide, un vettore di lentivirus, un vettore adenovirale, un vettore di retrovirus, come un vettore ?-retrovirale, o un vettore non virale.
22)Cellula, come cellula T, come cellula T alfa/beta e gamma/delta, cellule NK, cellule NK-T, comprendente il recettore chimerico di antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-14 e/o il vettore o plasmide secondo la rivendicazione 21.
23) Cellula secondo la rivendicazione 22, comprendente ulteriormente una sequenza amminoacidica di un gene suicida inducibile come un polipeptide di Caspasi-9 chimerico oppure comprende una timidin chinasi del virus dell?herpes simplex.
24) Cellula secondo la rivendicazione 23, in cui il polipeptide di Caspasi-9 chimerico comprende o consiste in:
una regione di legame a FKBP12 comprendente o consistente in un peptide leader 5? corto MLEMLE (SEQ ID NO:43) e il mutante di FKBP12(V36F) umana di sequenza
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFML GKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLK LE (SEQ ID NO:44), che ? legato mediante un linker, come il linker SGGGSG (SEQ ID NO:45), al polipeptide di Caspasi-9
VDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTG SNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSH GCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQK DHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYST FPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPG CFNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO:46), che ? legato mediante un linker, come il linker ASRAPR (SEQ ID NO:47), a
un peptide autoclivante di Polinucleotide 2A scelto dal gruppo consistente in T2A AEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO:48), P2A ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO:49), E2A QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:50) o F2A: VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:51), preferibilmente T2A.
25) Cellula secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 22-24, che viene ottenuta in condizioni di coltura in cui sono presenti sia IL-7 sia IL-15, ad esempio nelle condizioni di coltura della fase di attivazione, della fase di trasduzione e/o della fase di espansione del procedimento per la preparazione di detta cellula.
26) Composizione farmaceutica comprendente la sequenza nucleotidica secondo le rivendicazioni 16-20, oppure il vettore secondo la rivendicazione 21, oppure la cellula secondo le rivendicazioni 22-25 insieme a uno o pi? eccipienti e/o adiuvanti.
27) Recettore chimerico di antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15, sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 16-20, vettore secondo la rivendicazione 21, cellula secondo le rivendicazioni 22-25, composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 26, per uso medico.
28) Recettore chimerico di antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15, sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 16-20, vettore secondo la rivendicazione 21, cellula secondo le rivendicazioni 22-25, composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 26, per uso nel trattamento di cancri CD19+, CD20+ o CD22+, ad esempio linfomi a cellule B (linfoma Non-Hodgkin (NHL)), leucemia linfoblastica acuta (ALL), leucemia mieloide e leucemia linfocitica cronica (CLL).
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|---|---|---|---|---|
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2020
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3556772A1 (en) * | 2016-12-13 | 2019-10-23 | Carsgen Therapeutics Ltd | Anti-cd19 humanized antibody and immune effector cell targeting cd19 |
Non-Patent Citations (28)
| Title |
|---|
| BLOOD, vol. 128, 2016, pages 1441 |
| BONINI, C. ET AL.: "HSV-TK gene transfer into donor lymphocytes for control of allogeneic graft-versus-leukemia", SCIENCE, vol. 276, 1997, pages 1719 - 1724, XP002057927, DOI: 10.1126/science.276.5319.1719 |
| BRUDNO, J. N.KOCHENDERFER, J. N: "Recent advances in CAR T-cell toxicity: Mechanisms, manifestations and management", BLOOD REV, vol. 34, 2019, pages 45 - 55 |
| DI STASI, A. ET AL.: "Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy", N ENGL J MED, vol. 365, 2011, pages 1673 - 1683, XP055181696, DOI: 10.1056/NEJMoa1106152 |
| DIJOSEPH, J. F. ET AL.: "Antibody-targeted chemotherapy of B-cell lymphoma using calicheamicin conjugated to murine or humanized antibody against CD22", CANCER IMMUNOL IMMUNOTHER, vol. 54, 2005, pages 11 - 24, XP008060233, DOI: 10.1007/s00262-004-0572-2 |
| DINA SCHNEIDER ET AL: "A tandem CD19/CD20 CAR lentiviral vector drives on-target and off-target antigen modulation in leukemia cell lines", JOURNAL FOR IMMUNOTHERAPY OF CANCER, BIOMED CENTRAL LTD, LONDON, UK, vol. 5, no. 1, 16 May 2017 (2017-05-16), pages 1 - 17, XP021245145, DOI: 10.1186/S40425-017-0246-1 * |
| FREY, N: "The what, when and how of CAR T cell therapy for ALL", BEST PRACT RES CLIN HAEMATOL, vol. 30, 2017, pages 275 - 281, XP085226906, DOI: 10.1016/j.beha.2017.07.009 |
| GOKBUGET, N: "How should we treat a patient with relapsed Ph-negative B-ALL and what novel approaches are being investigated?", BEST PRACT RES CLIN HAEMATOL, vol. 30, 2017, pages 261 - 274, XP085226907, DOI: 10.1016/j.beha.2017.07.010 |
| KALINA, T. ET AL.: "EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols", LEUKEMIA, vol. 26, 2012, pages 1986 - 2010, XP055602761, DOI: 10.1038/leu.2012.122 |
| KANTARJIAN, H.THOMAS, D.WAYNE, A. S.O'BRIEN, S: "Monoclonal antibody-based therapies: a new dawn in the treatment of acute lymphoblastic leukemia", J CLIN ONCOL, vol. 30, 2012, pages 3876 - 3883 |
| KEMPER, K.RODERMOND, H.COLAK, S.GRANDELA, C.MEDEMA, J. P: "Targeting colorectal cancer stem cells with inducible caspase-9", APOPTOSIS, vol. 17, 2012, pages 528 - 537, XP035040973, DOI: 10.1007/s10495-011-0692-z |
| LEUKEMIA, vol. 26, no. 9, September 2012 (2012-09-01), pages 1899 - 1907 |
| MAGDELAINE-BEUZELIN, C. ET AL.: "Structure-function relationships of the variable domains of monoclonal antibodies approved for cancer treatment", CRIT REV ONCOL HEMATOL, vol. 64, 2007, pages 210 - 225, XP022344458, DOI: 10.1016/j.critrevonc.2007.04.011 |
| MAUDE SLTEACHEY DTPORTER DL: "Grupp SA. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia", BLOOD, vol. 125, no. 26, 2015, pages 4017 - 4023 |
| MAUDE, S. L. ET AL.: "Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia", N ENGL J MED, vol. 378, 2018, pages 439 - 448, XP055665831, DOI: 10.1056/NEJMoa1709866 |
| PARK, J. H. ET AL.: "Long-Term Follow-up of CD19 CAR Therapy in Acute Lymphoblastic Leukemia", N ENGL J MED, vol. 378, 2018, pages 449 - 459 |
| PHILIP, B. ET AL.: "A highly compact epitope-based marker/suicide gene for easier and safer T-cell therapy", BLOOD, vol. 124, 2014, pages 1277 - 1287, XP055229811, DOI: 10.1182/blood-2014-01-545020 |
| QUINTARELLI, C. ET AL.: "Efficacy of third-party chimeric antigen receptor modified peripheral blood natural killer cells for adoptive cell therapy of B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia", LEUKEMIA, vol. 34, 2020, pages 1102 - 1115, XP037080458, DOI: 10.1038/s41375-019-0613-7 |
| RUELLA, M. ET AL.: "A cellular antidote to specifically deplete anti-CD19 chimeric antigen receptor-positive cells", BLOOD, vol. 135, 2020, pages 505 - 509 |
| RUELLA, M. ET AL.: "Dual CD19 and CD123 targeting prevents antigen-loss relapses after CD19-directed immunotherapies", J CLIN INVEST, vol. 126, 2016, pages 3814 - 3826, XP055420115, DOI: 10.1172/JCI87366 |
| RUELLA, M. ET AL.: "Induction of resistance to chimeric antigen receptor T cell therapy by transduction of a single leukemic B cell", NAT MED, vol. 24, 2018, pages 1499 - 1503, XP036619498, DOI: 10.1038/s41591-018-0201-9 |
| SEDEK, L. ET AL.: "Differential expression of CD73, CD86 and CD304 in normal vs. leukemic B-cell precursors and their utility as stable minimal residual disease markers in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia", J IMMUNOL METHODS, vol. 475, 2019, pages 112429 |
| THEUNISSEN, P. ET AL.: "Standardized flow cytometry for highly sensitive MRD measurements in B-cell acute lymphoblastic leukemia", BLOOD, vol. 129, 2017, pages 347 - 357 |
| WANG, Z.WU, Z.LIU, Y.HAN, W: "New development in CAR-T cell therapy", J HEMATOL ONCOL, vol. 10, 2017, pages 53, XP055452552, DOI: 10.1186/s13045-017-0423-1 |
| XIN GU ET AL: "Molecular Modeling and Affinity Determination of scFv Antibody: Proper Linker Peptide Enhances Its Activity", ANNALS OF BIOMEDICAL ENGINEERING, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS-PLENUM PUBLISHERS, NE, vol. 38, no. 2, 9 October 2009 (2009-10-09), pages 537 - 549, XP019765877, ISSN: 1573-9686 * |
| YAGYU, S.HOYOS, V.DEL BUFALO, F.BRENNER, M. K.: "An Inducible Caspase-9 Suicide Gene to Improve the Safety of Therapy Using Human Induced Pluripotent Stem Cells", MOL THER, vol. 23, 2015, pages 1475 - 1485, XP055517946, DOI: 10.1038/mt.2015.100 |
| ZHOU, X. ET AL.: "Inducible caspase-9 suicide gene controls adverse effects from alloreplete T cells after haploidentical stem cell transplantation", BLOOD, vol. 125, 2015, pages 4103 - 4113 |
| ZHOU, X. ET AL.: "Serial Activation of the Inducible Caspase 9 Safety Switch After Human Stem Cell Transplantation", MOL THER, vol. 24, 2016, pages 823 - 831 |
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