KR20230139979A

KR20230139979A - 동충하초 균사체 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물

Info

Publication number: KR20230139979A
Application number: KR1020220038496A
Authority: KR
Inventors: 양재경; 하시영; 정지영
Original assignee: 경상국립대학교산학협력단
Priority date: 2022-03-29
Filing date: 2022-03-29
Publication date: 2023-10-06

Abstract

본 발명은 동충하초 균사체(Cordyceps militaris) 분획물, 구체적으로 메탄올(methanol), 에테르(ether), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 증류수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 분획화한 동충하초 균사체 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 동충하초 균사체 분획물이 타이로시네이즈(tyrosinase) 활성 저해 및 멜라닌(melanin) 생성 유전자 발현 억제를 통해 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백 효과를 나타내는 것을 확인함으로써, 피부 미백용 조성물 또는 멜라닌 과다 생성에 따른 피부 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

동충하초 균사체 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물{Composition for whitening skin comprising Cordyceps militaris mycelium fractions as an active ingredient}

본 발명은 동충하초 균사체(Cordyceps militaris) 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색은 피부 속 기저층에 존재하는 멜라노사이트(melanocyte)라는 색소 세포에서 합성하는 멜라닌(melanin)의 양에 따라 결정되는데, 멜라닌은 몸 전체에 걸쳐 고루 분포되어 있으며, 태양의 가시광선을 흡수해 햇빛으로부터 피부를 보호해 주는 역할을 하나, 과도하게 생성되면 피부의 색소 침착 등의 문제를 유발하기도 한다. 멜라닌의 농도와 분포역에 따라서 유전적인 요인이 가장 중요하나, 유전적인 요인 이외에도 태양의 자외선이나, 피로, 스트레스, 임신 등의 환경적 또는 생리적 조건 등에 영향을 받는다.

미백은 타이로시네이즈(tyrosinase)라는 효소의 활성을 저해하거나, 이미 생성된 멜라닌 색소의 환원을 촉진하여 유도된다. 피부표면인 표피에 존재하는 멜라닌 세포인 멜라노좀(melanosome)에서 생성되는 티로신은 멜라닌의 전구체에 해당되며, 도파퀴논(DOPA-quinone)을 거쳐 멜라닌으로 합성된다. 이러한 중간과정에서 타이로시네이즈라는 효소가 작용하는데, 이처럼 티로신이 도파 및 도파크롬(dopachrome)으로 산화되는 과정에 관여하는 타이로시네이즈의 활성을 억제하게 되면, 멜라닌 생성이 억제되고, 이에 따라 피부 톤이 밝아지는 미백 효과가 나타난다.

최근 미백에 대한 수요가 전 세계적으로 증가하고 있고, 타이로시네이즈의 활성을 저해하는데 초점을 맞추어 미백 화장품 개발을 위한 연구가 활발히 이루어지고 있는 추세이다.

한편, 동충하초(Cordyceps militaris , 冬蟲夏草)는 겨울에는 벌레, 여름에는 버섯으로 나온다는 뜻에서 이름이 붙여졌다. 대부분이 곤충병원성진균(entomopathogenic fungi)으로 약 800여 종이 알려져 있으며, 기주곤충에 감염되어 내부에서 균사 생장을 하여 자실체를 생성하는 것이 큰 특징이다. 이러한 동충하초는 아시아(중국, 한국, 일본 등)에서 예전부터 약초로 쓰여 왔다. 그 효능으로는 면역력 증강, 성인병 예방, 천식, 빈혈 등에 좋은 약재로 사용되어져 왔다.

동충하초는 동의보감을 통해서 오랫동안 많은 효능이 인정되어 각종 성인병 질환의 치료 및 건강유지를 위하여 사용되어 왔다. 중국에서는 육상선수들이 동충하초를 복용하고 기적의 기록들을 나타낸다고 하여 동충하초를 3대 천연식품 건강 명약으로 인정하고 있다.

대한민국 등록특허 제10-0863449호(2003.04.07. 공개)

본 발명의 목적은 동충하초 균사체(Cordyceps militaris) 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 동충하초 균사체(Cordyceps militaris)를 메탄올(methanol), 에테르(ether), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 증류수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 분획화한 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 동충하초 균사체(Cordyceps militaris)를 메탄올(methanol), 에테르(ether), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 증류수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 분획화한 분획물을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 과다 생성에 따른 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 동충하초 균사체(Cordyceps militaris)를 메탄올(methanol), 에테르(ether), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 증류수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 분획화한 분획물을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 과다 생성에 따른 피부 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 동충하초 균사체(Cordyceps militaris)를 LED 광조사 조건하에서 배양하는 단계; 상기 배양된 동충하초 균사체를 원심분리한 후 건조하는 단계; 상기 건조한 동충하초 균사체를 증류수에 용해하고 메탄올을 첨가 및 층 분리하여 메탄올 용해층 및 불용층을 획득하는 단계; 상기 메탄올 불용층에 에테르를 첨가 및 층 분리하여 에테르 용해층 및 불용층을 획득하는 단계; 상기 에탄올 불용층에 에틸아세테이트를 첨가 및 층 분리하여 에틸아세테이트 용해층 및 불용층을 획득하는 단계; 및 상기 에틸아세테이트 용해층에 증류수를 첨가 및 층 분리하여 물 용해층 및 불용층을 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동충하초 균사체 분획물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 동충하초 균사체(Cordyceps militaris) 분획물이 타이로시네이즈(tyrosinase) 활성 저해 및 멜라닌(melanin) 생성 유전자 발현 억제를 통해 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백 효과를 나타내는 것을 확인함에 따라, 피부 미백용 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.

또한, 상기 분획물을 멜라닌 과다 생성에 따른 피부 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 이용함으로써, 과도한 멜라닌 생성으로 발생되는 기미, 주근깨, 검버섯 등의 비정상적 피부 색소 침착 질환들을 효과적으로 예방, 치료 또는 개선할 수 있다.

도 1은 동충하초 균사체를 이용한 미백 기능성 화장료 조성물 제조 단계에 대한 전체적인 공정의 요약도이다.
도 2는 동충하초 균사체로부터 분획물을 획득하는 단계에 대한 전체적인 공정의 요약도이다.
도 3은 B16F10 melanoma 세포에 대한 동충하초 균사체 분획물의 농도별 세포독성 분석 결과이다.
도 4는 B16F10 melanoma 세포에 대한 동충하초 균사체 분획물의 농도별 타이로시네이즈(tyrosinase) 저해 효과를 분석한 결과이다.
도 5는 B16F10 melanoma 세포에 대한 동충하초 균사체 분획물의 농도별 멜라닌(melanin) 함량 변화를 분석한 결과이다. SF는 Soluble fraction, IF는 Insoluble fraction을 의미하고, 막대그래프 상위 알파벳으로 표시된 통계 테스트는 p<0.05의 유의성을 나타낸다.
도 6은 동충하초 균사체 에테르 용해층의 미백 활성에 관여하는 유전자의 발현 변화를 분석한 결과이다. 상기 유전자는 타이로시네이즈(tyrosinase), tyrosinase related protein 1(TRP-1) 및 tyrosinase related protein 2(TRP-2)를 의미하고, *<0.05, **<0.01, ***<0.001의 유의성을 나타낸다.
도 7은 동충하초 균사체 에테르 용해층의 멜라닌 증식에 관여하는 단백질 저해 효과를 분석한 결과이다. *<0.05, **<0.01, ***<0.001의 유의성을 나타낸다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자는 피부 미백 화장품 개발에 예의 노력한 결과, 동충하초 균사체(Cordyceps militaris) 분획물이 타이로시네이즈(tyrosinase) 활성 저해 및 멜라닌(melanin) 생성 유전자 발현 억제를 통해 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백 효과를 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 동충하초 균사체(Cordyceps militaris)를 메탄올(methanol), 에테르(ether), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 증류수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 분획화한 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 분획물은

1) 동충하초 균사체를 배양한 후 건조하는 단계;

2) 상기 건조한 동충하초 균사체를 증류수에 용해하고 메탄올을 첨가 및 층 분리하여 메탄올 용해층 및 불용층을 획득하는 단계;

3) 상기 메탄올 불용층에 에테르를 첨가 및 층 분리하여 에테르 용해층 및 불용층을 획득하는 단계;

4) 상기 에테르 불용층에 에틸아세테이트를 첨가 및 층 분리하여 에틸아세테이트 용해층 및 불용층을 획득하는 단계; 및

5) 상기 에틸아세테이트 불용층에 증류수를 첨가 및 층 분리하여 물 용해층 및 불용층을 획득하는 단계를 통해 획득되는 것을 특징으로 한다.

상기 배양은 LED 광 조사 하에서 15 내지 30℃에서 5 내지 10일 동안 배양하는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 분획물은 타이로시네이즈(tyrosinase), tyrosinase related protein 1(TRP-1) 및 tyrosinase related protein 2(TRP-2)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 발현 또는 생성을 억제하는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 분획물은 멜라닌 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 분획물은 화장료 조성물 100 중량부에 대하여 5 내지 10 중량부로 첨가되는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 제형을 갖는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 “유효성분으로 포함하는”은 피부 미백 효과를 나타낼 수 있는 유효량을 함유하는 것을 의미할 수 있다.

상기 "미백"은 멜라닌 색소 등의 과다 침착을 억제, 저해 또는 완화시켜, 상기 색소 침착으로 야기되는 피부의 흑화를 방지하여 피부 트러블을 개선하는 작용을 의미한다.

상기 "화장료"란, 피부 색소 침착 등의 예방 또는 개선의 효과를 가지는 기능성 화장료를 포함할 수 있고, 상기 기능성 화장료는 일반 화장료와 달리 생리활성적인 효능, 효과가 강조된 전문적인 기능성을 갖는 것으로, 화장품법에 정의된 바에 따라 피부 미백 등 특정 효능과 효과가 강조된 화장료를 의미한다.

구체적으로, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형으로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등의 메이크업 제거제; 또는 클렌징 폼, 비누, 바디워시 등의 세정제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 피부 외용제는, 연고, 패치, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 추출물이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 추출물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물이 비누로 제형화될 때, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.

다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.

또한, 본 발명은 동충하초 균사체(Cordyceps militaris)를 메탄올(methanol), 에테르(ether), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 증류수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 분획화한 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능 식품"이라 함은 건강기능 식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

상기 건강기능식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다. 예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능 식품 중 경질 캡슐제는 통상의 경질 캡슐에 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합 및 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캡슐제는 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합하고 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에서 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 "개선"이란 본 발명의 조성물을 개체에 투여하거나 섭취시켜 질환의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 의미한다.

상기 피부 질환은 기미, 주근깨, 잡티, 검버섯 및 오타모반으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 색소 질환인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물에 포함되는 첨가제의 함량은 특별히 한정되는 것은 아니며 통상의 제제화에 사용되는 함량 범위 내에서 적절하게 조절될 수 있다.

상기 약학 조성물은 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 피부 외용제 형태로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제는 전분, 당 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 윤활제, 포비돈 및 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 경구 투여일 경우, 정제, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽, 엘릭시르제 등으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여일 경우, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등으로 제형화 될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이 체질 특이성, 제제의 성질, 질병의 정도, 조성물의 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율 및 약물 형태에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 이 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 약 0.1 내지 10,000mg/kg의 범위일 수 있으나 이제 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여되거나 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하 내, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 약학적 유효량 및 유효 투여량은 약학 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간, 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다.

또한, 본 발명은

1) 동충하초 균사체(Cordyceps militaris)를 LED 광조사 조건 하에서 배양하는 단계;

2) 상기 배양된 동충하초 균사체를 원심분리한 후 건조하는 단계;

3) 상기 건조한 동충하초 균사체를 증류수에 용해하고 메탄올을 첨가 및 층 분리하여 메탄올 용해층 및 불용층을 획득하는 단계;

4) 상기 메탄올 불용층에 에테르를 첨가 및 층 분리하여 에테르 용해층 및 불용층을 획득하는 단계;

5) 상기 에테르 불용층에 에틸아세테이트를 첨가 및 층 분리하여 에틸아세테이트 용해층 및 불용층을 획득하는 단계; 및

6) 상기 에틸아세테이트 불용층에 증류수를 첨가 및 층 분리하여 물 용해층 및 불용층을 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동충하초 균사체 분획물의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[실시예 1] 동충하초 균사체 분획물 제조

동충하초 균사체(Cordyceps militaris)는 PDB(Potato Dextrose Broth) 배지를 이용하여 24℃에서 100rpm으로 7일 동안 배양하였으며, 이때 LED(Light-Emitting Diode) red광과 blue광을 3:7 비율로 12hours/day 조사했다. 배양이 완료된 균사체는 원심분리 후 -80℃ 동결 건조기에서 3일간 건조 후 획득했다. 분획물 획득을 위하여 동충하초 균사체를 메탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 증류수를 이용하여 순차적으로 분획했다. 분획여두에 동충하초 균사체에 증류수 50mL에 용해한 다음, 메탄올 250mL를 투입한 후 실온에 방치하여 층을 분리했다. 분획여두의 유리콕크를 이용하여 메탄올 용해층을 분리하였으며, 이같은 과정을 총 4회 반복하여 메탄올 용해층을 획득했다. 메탄올 용해층을 획득하는 과정과 동일한 방법으로 에테르 용해층, 에틸아세테이트 용해층 및 물 용해층을 분리하였으며, 최종적으로 물 불용층을 획득했다. 획득된 분획물은 회전식 감압농축기를 이용하여 유기용매를 제거하고 수용성으로 제조했다. 수용성의 분획물은 -80℃ 동결 건조기를 이용하여 3일간 건조함으로써 분말 형태로 제조했다(도 1 및 도 2).

[실시예 2] 세포 독성 평가

실험에서 사용한 마우스 흑색종(mouse melanoma, B16F10) 세포는 한국 세포주 은행으로부터 분양받았으며, 세포는 melanoma disease가 발병된 C57BL/6J 마우스의 피부로부터 유래된 것을 사용했다. 분양받은 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; 이하 FBS라 함)와 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이오신(streptomycin)(100U/mL)을 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM) 배지에서 배양했다. 세포 배양은 37℃, 5% CO₂조건의 CO₂incubator(BB15, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)에서 진행했고, inverted microscope(ELWD 0.3 T1-SNCP, Nikon ECLIPSE, Tokyo, Japan)를 이용하여 세포 사진을 촬영했다.

세포 독성을 측정하기 위해, 마우스 흑색종(mouse melanoma, B16F10) 세포를 24 well plate에 3 × 10⁴ cells/well이 되도록 500μL 분주하여 2일 동안 배양했다. DMSO에 농도별(0~500ppm)로 용해시킨 동충하초 분획물을 세포가 배양된 배지에 첨가한 후 37℃, 5% CO₂incubator(BB15, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)에서 2일 동안 반응했다. 반응이 종료된 배지에 5mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 50μL를 첨가하여 1시간 동안 빛을 차단한 후 37℃, 5% CO₂조건의 CO₂incubator(BB15, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)에서 배양하였으며, 모든 배지를 제거한 후 200μL/well의 DMSO를 처리했다. DMSO를 사용하여 formazan 결정을 녹인 후, microplate reader(SpectraMax 190, Molecular Devices LLC, California, United States)를 사용하여 550nm에서 흡광도를 측정했고, 하기 식을 이용하여 세포 생존율을 계산했다.

[수학식 1]

세포독성(cell viablity , % ) = ( 시료첨가군의 흡광도/ 무첨가군의 흡광도)×100

그 결과, 무처리군, 메탄올 용해층, 에테르 용해층, 에틸아세테이트 용해층, 물 용해층 및 물 불용층은 각각 세포 생존율이 100.0%, 95.2%, 70.5%, 89.9%, 92.3% 및 88.1%를 나타내어 에틸아세테이트 용해층을 제외하고 모든 분획물에서 세포 독성이 없는 것을 확인했다(도 3).

[실시예 3] 타이로시네이즈(tyrosinase) 활성 저해 효과 분석

타이로시네이즈는 멜라닌 합성과정의 속도결정단계를 촉매하는 역할을 하고, DOPA 산화반응에 대한 활성저해를 측정하여 미백에 대한 평가를 위해 일반적으로 사용된다.

따라서 동충하초 균사체 분획물의 미백 효과를 확인하기 위해, 타이로시네이즈의 저해활성을 측정했고, 분광학적인 방법으로 측정했으며, 본 실험에서는 Maeda and Fukuda(2013) 법에 따라 측정했다. 0.1M potassium phosphate buffer(pH 6.8) 0.1mL, 0.3mg/mL 농도의 L-tyrosine 수용액 0.1mL 및 1250 unit/mL의 mushroom 타이로시네이즈 0.1mL를 혼합한 후, 31.25~500ppm 농도의 동충하초 균사체 분획물을 각각 0.1mL를 첨가하여 37℃에서 20분간 효소반응 시켰다. 그 후, 반응용액의 흡광도를 475nm에서 측정했고, 하기 식을 이용해 효소 활성 저해율을 계산했다. 양성 대조군(positive control)으로 알부틴(arbutin, Bioland, Korea)을 사용했고, 동충하초 균사체 분획물과 동일한 농도 및 방법으로 분석했다.

[수학식 2]

타이로시네이즈 저해율(tyrosinase Inhibition rate, %) = [(A-B)/A] × 100

A : 시료를 첨가하지 않은 반응용액의 475nm에서 흡광도

B : 시료를 첨가한 반응용액의 475nm에서 흡광도

그 결과, 모든 용해층에서 농도 의존적으로 타이로시네이즈 저해 활성을 나타냈고, 특히 에테르 용해층이 가장 우수한 저해 활성을 나타냈다(도 4). 또한, 알부틴, 메탄올 용해층, 에테르 용해층, 에틸아세테이트 용해층, 물 용해층 및 물 불용층 순으로 타이로시네이즈를 50% 억제할 수 있는 IC50은 각각 20.87, 18.87, 8.54, 20.04, 106.06 및 107.28ppm인 것을 확인했다.

[실시예 4] 멜라닌(melanin) 생성 억제 효과 분석

멜라닌(melanin)은 검은색 피부에서 함량이 증가하고, 미백이 일어나면 감소하는 물질로, 주로 melanocyte라는 미백 세포 내에 존재하며, 피부 내부에서 기미, 주근깨, 흑색종 등을 일으키는 원인으로 작용한다.

따라서 동충하초 균사체 분획물의 미백 효과를 확인하기 위해, 마우스 흑색종 세포를 통해 멜라닌 생성 억제 효과를 측정했고, 분광학적인 방법으로 측정했으며, 본 실험에서는 Maeda and Fukuda(2013) 법에 따라 측정했다. 24 well plate에 2×10⁴ cells/mL의 B16F10 cell을 24시간 배양한 후, 배양이 종료된 배지를 제거하고 PBS(phosphate buffered saline)로 세척했다. 100nM의 α-Melanocyte stimulating hormone(α-MSH)을 포함하는 배지로 교환해주고 동시에 시료를 처리하여 72시간 동안 배양했다. 시료는 동충하초 균사체 분획물(31.25~500ppm) 및 알부틴(31.25~500ppm)을 사용했다. 배양이 끝나면 배지를 PBS buffer로 세척한 후 1N NaOH 200μL를 넣고 70℃ water bath에서 1시간 멜라닌을 용해시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정했다.

그 결과, 모든 용해층에서 농도 의존적으로 멜라닌 함량이 감소하는 것으로 나타났고, 특히 에테르 용해층에서 가장 낮은 멜라닌 함량을 나타냈다(도 5).

이는 동충하초 균사체 분획물이 멜라닌 생성을 억제하는 것을 시사한다.

[실시예 5] 멜라닌 형성 유전자 억제 효과 분석

B16F10 melanoma 세포를 10% 소혈청 및 1% 항생제를 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM, GIBCO, USA)에 1 × 10⁶ 세포의 밀도로 100mm 디쉬에 접종하고 1일 동안 5% CO₂및 37℃ 조건에서 배양했다. α-MSH(0.34μg/mL, Sigma)가 포함된 새로운 DMEM 10% 배지로 교체 후 동충하초 균사체 에테르 용해층을 500ppm로 배양판에 처리하여 3일 동안 배양했다. 배양 후 미백 관련 유전자의 mRNA 발현량을 조사하기 위해, 세포에 trizol(Invitrogen, USA) 1mL을 첨가하여 Invitrogen 사의 RNA 분리법에 따라 RNA를 분리했다. 자외선 검출기를 이용하여 260nm에서 RNA 양을 정량한 후, Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)을 실시했다. RT-PCR은 All-in-one RT-PCR kit(Super bio, Korea)를 사용했고, All-in-one RT-PCR kit의 메뉴얼에 따라 실험을 진행했다.

타이로시네이즈의 서열은 sense : 5'-GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT-3'; anti-sense : 5'-TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC-3'이고, 90℃에서 30초 동안 denaturation하였으며 60℃에서 30분 동안 역전사 후 94℃에서 1분 동안 역전사 효소를 불활성화 및 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 1분 동안 30 cycle로 PCR 반응했다.

Tyrosinase related protein 1(이하 TRP-1라 함)의 서열은 sense : 5'-GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC-3'; anti-sense : 5'-AAG ACG CTG CAC TGC TGG TCT-3'이고, 90℃에서 30초 동안 denaturation하였으며 60℃에서 30분 동안 역전사 후 94℃에서 1분 동안 역전사 효소를 불활성화 및 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 1분 동안 30 cycle로 PCR 반응했다.

Tyrosinase related protein 2(이하 TRP-2라 함)의 서열은 sense : 5'-GGA TGA CCG TGA GCA ATG GCC-3'; anti-sense : 5'-CGG TTG TGA CCA ATG GGT GCC-3'이고, 50℃에서 30분 동안 역전사 후 96℃에서 3분 동안 역전사 효소를 불활성화 후 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분 동안 25 cycle로 PCR 반응했다.

음성대조군으로 α-멜라닌세포 자극 호르몬인 α-MSH(500ppm)를 사용했고, 동충하초 균사체 에테르 용해층 처리를 통한 타이로시네이즈, TRP-1 및 TRP-2의 발현 저해 효과를 분석했다.

그 결과, 동충하초 균사체 에테르 용해층이 타이로시네이즈, TRP-1 및 TRP-2의 발현을 억제하는 것을 확인했다(도 6).

[실시예 6] 멜라닌 형성 단백질 저해 효과 분석

B16F10 melanoma 세포를 10% FBS 및 1% 항생제를 첨가한 DMEM에 5 × 10⁵세포 밀도로 100mm 디쉬에 접종하고 5% CO₂, 37℃에서 1일 배양했다. α-MSH(0.34μg/mL, Sigma)가 포함된 새로운 배지로 교환하고 동충하초 균사체 에테르 용해층 500ppm으로 처리하여 3일간 배양했다. 배양한 세포를 PBS로 세척하여 1.5mL microtube로 옮기고 세포 파쇄 버퍼(40mM Tris-Cl(pH 7.4), 10mM EDTA, 120mM NaCl, 0.1% NP-40, 1mM PMSF, protease inhibitor cocktail)를 첨가하여 세포를 파괴한 후 4℃에서 15,000rpm으로 10분간 원심 분리하고 상층액을 회수하여 단백질을 분리했다. 분리한 단백질은 시그마사의 BCA 방법에 따라 정량한 후 SDS-PAGE를 진행했다. SDS-PAGE 젤을 PVDF 막으로 옮긴 후 일차 항체와 퍼옥시다제(peroxidase)가 결합된 2차 항체를 이용하여 단백질을 표지하고 western blot detection kit(Intron, Korea)를 사용하여 X-ray 필름에 감광한 후 단백질 발현 정도를 분석했다.

그 결과, 동충하초 균사체 에테르 용해층을 음성대조군인 α-MSH와 비교했을 때, 타이로시네이즈의 저해효과를 확인했고, p-value 0.001 이하의 유의성을 나타냈다(도 7).

결론적으로, 동충하초 균사체 에테르 용해층이 미백 활성을 저해하는 단백질 발현 감소에 효과적이며, 미백크림 제조를 위한 적정 농도일 것으로 판단했다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Composition for whitening skin comprising Cordyceps militaris mycelium fractions as an active ingredient <130> ADP-2021-0963 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Tyrosinase(forward sense) <400> 1 ggccagcttt caggcagagg t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Tyrosinase(anti sense) <400> 2 tggtgcttca tgggcaaaat c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Tyrosinase related protein 1(forward sense) <400> 3 gctgcaggag ccttctttct c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Tyrosinase related protein 1(anti sense) <400> 4 aagacgctgc actgctggtc t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Tyrosinase related protein 2(forward sense) <400> 5 ggatgaccgt gagcaatggc c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Tyrosinase related protein 2(anti sense) <400> 6 cggttgtgac caatgggtgc c 21

Claims

동충하초 균사체(Cordyceps militaris)를 메탄올(methanol), 에테르(ether), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 증류수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 분획화한 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 분획물은
동충하초 균사체를 배양한 후 건조하는 단계;
상기 건조한 동충하초 균사체를 증류수에 용해하고 메탄올을 첨가 및 층 분리하여 메탄올 용해층 및 불용층을 획득하는 단계;
상기 메탄올 불용층에 에테르를 첨가 및 층 분리하여 에테르 용해층 및 불용층을 획득하는 단계;
상기 에테르 불용층에 에틸아세테이트를 첨가 및 층 분리하여 에틸아세테이트 용해층 및 불용층을 획득하는 단계; 및
상기 에틸아세테이트 불용층에 증류수를 첨가 및 층 분리하여 물 용해층 및 불용층을 획득하는 단계를 통해 획득되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 배양은 LED 광 조사 하에서 15 내지 30℃에서 5 내지 10일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 분획물은 타이로시네이즈(tyrosinase), tyrosinase related protein 1(TRP-1) 및 tyrosinase related protein 2(TRP-2)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 발현 또는 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 분획물은 멜라닌 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 분획물은 화장료 조성물 100 중량부에 대하여 5 내지 10 중량부로 첨가되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
동충하초 균사체(Cordyceps militaris)를 메탄올(methanol), 에테르(ether), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 증류수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 분획화한 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 건강기능식품 조성물.
동충하초 균사체(Cordyceps militaris)를 메탄올(methanol), 에테르(ether), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 증류수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 분획화한 분획물을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 과다 생성에 따른 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
청구항 9에 있어서, 상기 피부 질환은 기미, 주근깨, 잡티, 검버섯 및 오타모반으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 색소 질환인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
동충하초 균사체(Cordyceps militaris)를 메탄올(methanol), 에테르(ether), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 증류수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 분획화한 분획물을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 과다 생성에 따른 피부 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
동충하초 균사체(Cordyceps militaris)를 LED 광조사 조건 하에서 배양하는 단계;
상기 배양된 동충하초 균사체를 원심분리한 후 건조하는 단계;
상기 건조한 동충하초 균사체를 증류수에 용해하고 메탄올을 첨가 및 층 분리하여 메탄올 용해층 및 불용층을 획득하는 단계;
상기 메탄올 불용층에 에테르를 첨가 및 층 분리하여 에테르 용해층 및 불용층을 획득하는 단계;
상기 에테르 불용층에 에틸아세테이트를 첨가 및 층 분리하여 에틸아세테이트 용해층 및 불용층을 획득하는 단계; 및
상기 에틸아세테이트 용해층에 증류수를 첨가 및 층 분리하여 물 용해층 및 불용층을 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동충하초 균사체 분획물의 제조방법.
청구항 12에 있어서, 상기 배양은 LED 광 조사 하에서 15 내지 30℃에서 5 내지 10일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 동충하초 균사체 분획물의 제조방법.