KR20230138243A - Mkk3 특이적 화합물을 함유한 천포창 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents
Mkk3 특이적 화합물을 함유한 천포창 개선 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 미토겐-활성화된 단백질 키나제 키나제 3 (MKK3) 활성을 효과적으로 억제하는 화합물을 함유한 천포창 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 상기 화합물이 MKK3에 결합하여 억제하거나 MKK3 kinase를 억제하는데 효과적임을 확인함으로써, 본 발명의 화합물을 이용하여 천포창 질환 치료에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 미토겐-활성화된 단백질 키나제 키나제 3 (MKK3) 활성을 효과적으로 억제하는 화합물을 함유한 천포창 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
천포창은 각질형성세포의 세포 표면에 대한 자가항체와 관련된 피부 및 점막의 자가면역 수포 질환군을 말하며, 결과적으로 각질형성세포의 세포-세포 접착력이 상실됩니다. 천포창은 네 가지 주요 유형(심상성천포창(pemphigus vulgaris), 낙엽상천포창(pemphigus foliaceus), 종양수반성 천포창(pemphigus paraneoplastic) 및 IgA 천포창(IgA pemphigus))으로 나눌 수 있다(Kang S, et al., 2019). 그 중, 천포창의 고전적 유형은 심상성천포창(PV) 및 낙엽상천포창(PF)이다. PF와 PV 모두에서 병원성 IgG 항체는 주로 데스모좀의 막관통 당단백질인 데스모글레인(Dsg)을 표적으로 하며, PV의 표적 항원은 Dsg 3이고 PF 표적 항원은 Dsg 1이다(Bolognia JL, et al., 2018).
천포창에서 세포-세포 접착의 파괴는 현재 자가항체에 의한 직접적인 억제와 항체 결합에 의한 후속 신호 전달에 의해 매개되는 것으로 생각된다. p38 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 경로의 역할은 천포창의 발병기전에 잘 확립되어 있다. p38은 MAPK 계열의 일원으로 삼투/산화 스트레스 뿐만 아니라 다양한 감염 및 환경 자극에 대한 세포 반응에 중요한 역할을 한다(Mao X, et al., 2011). p38은 PV 혈청 IgG 및 mAb를 사용한 시험관 내 연구 및 천포창 환자 피부의 생체 내에서 활성화되어 p38을 유망한 약물 치료 표적으로 만든다. 그러나 p38은 4가지 다른 isoform(α, β, γ, δ)을 가질 뿐만 아니라 다양한 세포 과정에도 관여한다. 따라서 p38 억제제를 사용하여 p38을 표적으로 삼는 것은 표적 외 효과와 전신 독성을 유발할 수 있다(Mao X, et al., 2014).
고전적인 p38 MAPK 캐스케이드는 MKK3, MKK4 또는 MKK6을 활성화하는 MEKK4 활성화를 특징으로 하며, 이는 후속적으로 Thr180 및 Tyr 182에서 p38 MAPK를 인산화한다. 약 80% 아미노산 상동성을 공유하는 MKK3 및 MKK6은 p38 활성화의 주요 참가자이다(Mavropoulos A, et al., 2013). 이전 연구에서는 MKK3/MKK6 녹아웃 마우스에서 p38 MAPK의 완전한 활성화에 MKK3 및 MKK6이 모두 필요하다고 보고되었다(Lu HT, et al., 1999). 또한, MKK3와 MKK6은 모두 p38의 중요한 조절자이며 류마티스 관절염(RA) 환자의 활막에서 활성화된다(Chabaud-Riou M, et al., 2004). 그러나, 천포창에서 p38의 활성화와 MKK3의 관련성은 밝혀지지 않았다.
이에 본 발명자들은 천포창에서 MKK3의 기능적 관련성을 연구하기 위해 소분자를 사용하여 천포창에 대한 잠재적인 치료 표적이 될 수 있는지 여부를 평가하던 중에 약리학적 MKK3 억제는 천포창 환자를 치료하기 위한 가능한 치료 전략이 될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
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본 발명의 목적은 미토겐-활성화된 단백질 키나제 키나제 3 (MKK3) 활성을 효과적으로 억제하는 화합물을 함유한 천포창 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 MKK3 활성을 억제하는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 천포창은 심상성천포창(pemphigus vulgaris), 낙엽상천포창(pemphigus foliaceus), 종양수반성 천포창(pemphigus paraneoplastic), IgA 천포창(IgA pemphigus) 및 유사천포창(pemphigoid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.
상기 MKK3 활성 억제는 화합물이 MKK3에 결합하거나 화합물이 MKK3 kinase를 억제하는 것인 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.
상기 MKK3 활성을 억제하는 화합물은 KW-2449({4-[(E)-2-(1H-인다졸-3-일)비닐]페닐}(1-피페라지닐)메탄온), TAE684(5-클로로-N4-[2-(이소프로필설포닐)페닐]-N2-{2-메톡시-4-[4-(4-메틸-1-피페라지닐)-1-피페리디닐]페닐}-2,4-피리미딘디아민), R406(6-({5-플루오로-2-[(3,4,5-트리메톡시페닐)아미노]-4-피리미디닐}아미노)-2,2-디메틸-2H-피리도[3,2-b][1,4]옥사진-3(4H)-온), Torkinib(2-(4-아미노-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-1H-인돌-5-올), Foretinib(N-[3-플루오로-4-({6-메톡시-7-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-4-퀴놀리닐}옥시)페닐]-N'-(4-플루오로페닐)-1,1-사이클로프로판디카복사미드) 및 Cabozantinib(N-{4-[(6,7-디메톡시-4-퀴놀리닐)옥시]페닐}-N'-(4-플루오로페닐)-1,1-사이클로프로판디카복사미드)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.
또한, 상기 화합물은 KW-2449({4-[(E)-2-(1H-인다졸-3-일)비닐]페닐}(1-피페라지닐)메탄온), TAE684(5-클로로-N4-[2-(이소프로필설포닐)페닐]-N2-{2-메톡시-4-[4-(4-메틸-1-피페라지닐)-1-피페리디닐]페닐}-2,4-피리미딘디아민), 및 Foretinib(N-[3-플루오로-4-({6-메톡시-7-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-4-퀴놀리닐}옥시)페닐]-N'-(4-플루오로페닐)-1,1-사이클로프로판디카복사미드)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.
상기 조성물은 전신 투여용으로 제형화되는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.
또한, 상기 성물은 국소 투여용으로 제형화되는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.
상기 조성물은 정제, 캡슐, 액체, 현탁액 또는 분말 형태로 경구 투여되는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 젤, 하이드로젤, 연고, 크림, 폼(foam), 스프레이, 로션, 액체 또는 피부 패치의 형태인 것을 특징으로 하는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 주사 투여되는 주사제형의 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.
상기 조성물은 상기 MKK3 활성을 억제하는 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 화합물은 조성물 총 중량의 0.001중량% 내지 20중량%의 농도로 첨가될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. “약학적으로 허용 가능”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 또한, 상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로즈, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아라비아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산프로필, 탈크, 스테아르산마그네슘 및 광물유를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 안정화제, 결합제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 MKK3 활성을 억제하는 화합물이 포함된 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 미결정셀룰로오스, 수크로스 또는 락토오스, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 히프로멜로오스 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아르산마그네슘, 탈크 같은 활택제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 유동파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 MKK3 활성을 억제하는 화합물이 포함된 조성물을 멸균되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질과 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다.
상기 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 뇌혈관내 주사 또는 피부 도포에 의해 투여될 수 있다. 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여시간, 투여경로, 약물의 흡수, 분포 및 배설률, 사용되는 다른 약물의 종류 및 처방자의 판단 등에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 500㎎/㎏/일의 범위이다. 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 200㎎/㎏/일이며, 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 200㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 미토겐-활성화된 단백질 키나제 키나제 3 (MKK3) 활성을 효과적으로 억제하는 화합물을 함유한 천포창 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 상기 화합물이 MKK3에 결합하여 억제하거나 MKK3 kinase를 억제하는데 효과적임을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 화합물을 이용하여 천포창 질환 치료에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 AK23은 HaCaT 세포에서 MKK3 및 p38 활성화 유도를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 본 발명에서 사용된 MKK3 억제제(화합물 1 내지 4)의 화학구조, MKK3 결합 친화도 및 무독성 농도를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 HaCaT 세포에서 MKK3 억제제(본발명 화합물 1 내지 4)의 항천포창 활성을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 4는 본 발명에서 사용된 MKK3 억제제(화합물 5 내지 6)의 화학구조, MKK3 IC50 및 무독성 농도를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 5는 HaCaT 세포에서 MKK3 억제제(화합물 5 내지 6)의 항천포창 활성을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 본 발명에서 사용된 MKK3 억제제(화합물 1 내지 4)의 화학구조, MKK3 결합 친화도 및 무독성 농도를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 HaCaT 세포에서 MKK3 억제제(본발명 화합물 1 내지 4)의 항천포창 활성을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 4는 본 발명에서 사용된 MKK3 억제제(화합물 5 내지 6)의 화학구조, MKK3 IC50 및 무독성 농도를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 5는 HaCaT 세포에서 MKK3 억제제(화합물 5 내지 6)의 항천포창 활성을 확인한 결과를 보여주고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. AK23의 MKK3 및 p38 활성화 유도 확인>
1-1. HaCaT 세포 배양
불멸화 인간 케라티노사이트 HaCaT 세포(AddexBio, CA, USA)를 37℃ 및 5% CO2에서 10% 소 태아 혈청 및 1% 항생제-항진균 용액과 함께 DMEM/고글루코스에서 배양하였다. 세포 배양을 위한 모든 재료는 HyClone(UT, USA)에서 구입하였다.
1-2. 웨스턴 블롯 분석
HaCaT 세포(5x105 cells/well)를 6-well plate에 접종하고 24시간 동안 배양한 다음 지정된 시간 동안 5㎍/ml의 항-Dsg 3단클론 항체 클론 AK23 IgG(MBL, Japan; AK23으로 지칭)로 처리하였다. 세포를 PBS로 세척하고 프로테아제 억제제 칵테일(ThermoFisher Scientific, MA, USA)과 포스파타제 억제제 칵테일(ThermoFisher Scientific)을 함유하는 RIPA 완충액(ELPIS biotech, Korea)으로 얼음 위에서 용해시킨 후, 4℃에서 13,000 rpm으로 30분간 원심분리하였다. 상층액의 단백질 양은 Pierce BCA 단백질 분석 키트(ThermoFisher Scientific)로 정량화하였다. 단백질(10 μg)은 5~20% 구배 겔(ATTO, Tokyo, Japan), 130V에서 90분 동안 전기영동으로 분해하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드(ATTO)로 옮겼다. 옮긴 막을 실온에서 1시간 동안 5% BSA가 포함된 TBST(Tris-buffered saline, 0.1% Tween 20)로 차단하고, 막을 지시된 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 모든 항체는 Cell Signaling Technology(MA, USA)에서 구입했으며 GAPDH를 내부 대조군으로 사용하였다. TBST로 3회 세척한 후, 막을 상온에서 2시간 동안 양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다제(HRP)-결합 이차 항체로 탐침하였다. TBST로 3회 세척한 후, WSE-6100 LuminoGraph(ATTO)를 사용하여 ECL 웨스턴 검출 시약(Millipore Corporation, MA, USA)에 의한 HRP의 신호를 검출하였다. 그런 다음 ATTO Densitometry Software CS Analyzer 4를 사용하여 밴드의 강도를 분석하고 대조군의 상대적인 정규화된 강도 비율을 제시하였다.
1-3. 실험 결과
항Dsg3 항체 AK23은 HaCaT 세포에서 MKK3 활성화를 유도한다. 도 1에서 보는 바와 같이 AK23 처리한 HaCaT 세포에서 MKK3와 p38의 인산화를 유도하였으며 MKK2 및 p38의 활성화는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다.
<실시예 2. MKK3 억제제 화합물 1 내지 4의 화학구조, MKK3 결합 친화도, 무독성 농도 확인 및 항천포창 활성 확인>
2-1. MKK3 결합 친화도
MKK3에 대한 결합친화도는 단백질의 결합 상수(Kd)를 다음과 같은 방법으로 계산한다. 사람 유래 MKK3(Accession no. NP_002747.2)의 키나아제가 부착된 T7 phage strain을 BL21 strain으로부터 유래한 E. coli host 내에서 동시에 성장시켜, E.coli를 log-phase로 성장시키고 T7 phage로 감염시키고 (multiplicity of infection = 0.4), 그 후 32℃에서 90-150분 정도 진탕 배양한다. 이후, E.coli의 용해물(lysates)을 원심분리 (6,000 x g)시키고, 0.2 μm 필터로 여과시킨 후, HEK-293 세포에서 키나아제를 생성시키고, DNA를 부착시켜, 결과적으로 qPCR 검출을 위한 DNA-부착(tagged) 키나아제로 완성한다. 키나제 분석을 위한 친화 레진(affinity resins)는 실온에서 30분 동안 biotinylated small molecule ligand들로 처리된 streptavidin-코팅 마그네틱 비드(magnetic beads)로 만들고, 이후 ligand가 부착된 비드(liganded beads)는 과량의 바이오틴(biotin)으로 블로킹(blocking)하고, 블로킹 완충액 (SeaBlock (Pierce), 1 % BSA, 0.05 % Tween 20, 1 mM DTT)으로 세척하여, 결합되지 않은 리간드를 제거하고, 비-특이적 파지 결합을 줄이도록 한다. 이후, 1x binding buffer (20 % SeaBlock, 0.17x PBS, 0.05 % Tween 20, 6 mM DTT)에 준비된 키나아제와 리간드-친화 비드 및 화합물을 polypropylene 384-well plate에서 0.02 ml의 최종 부피가 되도록 혼합하고, 실온에서 진탕 배양한다. 1시간의 반응 후, 친화 비드를 세척 완충액 (1x PBS, 0.05 % Tween 20)으로 세척하고, 용출완충액 (elution buffer; 1x PBS, 0.05 % Tween 20, 0.5 μM non-biotinylated affinity ligand)에 재현탁하여 실온에서 30분 동안 진탕 배양한다. 이후, 용출된 시료에서의 키나아제 농도는 qPCR로 측정하여, 활성값은 대조군에 대비한 %값(% of ctrl)으로 표기한다. 결합력 50%를 표현하는 Kd50값을 계산하기 위해서, 화합물은 최고 농도 1 uM부터 1/3씩 희석하여 총 9개의 농도로 처리하여 활성을 평가하여 50%의 결합을 보이는 농도를 Kd50값으로 정의한다.
2-2. 세포 생존력 분석
HaCaT 세포(4x103 cells/well)를 96-well plate에 접종하고 24시간 동안 배양한 다음 MKK3 inhibitor(Selleckchem, TX, USA) 또는 p38 inhibitor(SB202190; Sigma, MO, USA)를 지정된 농도에서 3일 동안 처리하였다. KW2449, TAE684, R406 및 Torkinib은 MKK3 억제제로 사용되었다. 세포 생존율은 제조업체의 프로토콜에 따라 Cell Counting Kit-8(Dojindo Molecular Technologies, ML, USA)을 사용하여 3중으로 평가되었다. HIDEX 센스 마이크로플레이트 리더(Hidex, Finland)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. GraphPad Prism 5(GraphPad Software Inc., CA, USA)를 사용하여 세포 생존력을 나타내는 용량 반응 곡선을 생성하였다.
2-3. Dispase-기반 해리 분석
Heupel WM, et al., Am J Pathol. 174(2):475-85 (2009)의 방법을 참고하여 분석을 수행하였다. HaCaT 세포(5x105 세포/웰)를 24-웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 인큐베이션한 다음 24시간 동안 표시된 무독성 농도의 화합물 없이 또는 화합물과 함께 5 ㎍/ml의 AK23으로 처리하였다. 그런 다음, 세포를 미리 데워진 PBS로 세척하고 Dispase Ⅱ 용액(2.4 U/ml; Sigma)이 포함된 Hanks 완충 식염수(HBSS, Gibco) 150 ul와 함께 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 200 ul의 HBSS를 첨가한 후, 세포 단층은 단층 전단을 위해 1 ml 피펫으로 15회 피펫팅하여 기계적 응력에 노출되었다. 이어서, 세포를 MTT(5 mg/ml; Sigma)로 20분 동안 염색하였다. 생성된 단편의 수를 세고 현미경으로 이미지를 캡처하였다. 해리 분석은 3회 수행되었으며 통계적 차이는 스튜던트 t-검정을 사용하여 분석되었다. p<0.05의 값은 유의미한 것으로 간주되었다.
2-4. 실험 결과
알려진 MKK3 억제제를 나열하고 그 활성을 KinaseNET (http://www.kinasenet.ca/)에 요약하였다. 도 2에서 보는 바와 같이 4가지 화합물(KW-2449, TAE684, R406, Torkinib)을 선정하여 본 연구에 사용하기 전에 화합물-MKK3 상호작용의 결합 친화성을 확인하기 위해서 Discoverx에서 MKK3에 대한 결합 친화도를 각각의 억제제 결합 상수(Kd 값)를 측정하여 결정하였다. KinaseNET에서 KW-2449, TAE684, R406 및 Torkinib의 보고된 Kd 값은 150, 170, 100 및 92 nM이었고 측정된 Kd 값은 각각 190, 340, 140 및 240 nM이었다. 4가지 화합물 모두 MKK3에 대해 submicromolar Kd 값을 나타내므로 모두 다음 실험에 적용하였다.
Dispase 기반 해리 분석은 HaCaT 세포와 같은 세포의 단층을 사용하는 대표적인 시험관내 천포창 모델로 보고되었다(Ref.). 명백하게, HaCaT 세포 단층에서의 AK23 처리는 천포창과 같은 피부의 자가면역 수포 질환의 주요 특징인 세포간 접착의 손실을 나타내는 단편 수를 증가시켰다. 화학적 독성 자체가 세포 부착 손실을 유발할 가능성을 배제할 수 없기 때문에 HaCaT 세포에서 KW-2449, TAE684, R406 및 Torkinib의 무독성 농도를 측정하고(도 2), 각각의 MKK3 억제제의 표시된 무독성 용량을 dispase-기반 해리 분석에 적용하였다. 도 3에서 보는 바와 같이 AK23 단독으로는 HaCaT 세포 단층의 단편화를 강력하게 유도하였으나, 본 연구에 사용된 모든 MKK3 억제제(KW2449, TAE684, R406 및 Torkinib)는 항천포창 p38 억제제 SB202190 (Ref.)과 유사하게 AK23에 의한 단편화를 극적으로 억제하여, MKK3 결합 화합물의 MKK3의 약리학적 억제 효과가 항천포창 활성을 나타낼 수 있음을 시사한다.
<실시예 3. MKK3 억제제 화합물 5 및 6의 화학구조, MKK3 IC
50
, 무독성 농도 확인 및 항천포창 활성 확인>
3-1. MKK3 키나아제 활성 평가
MKK3에 대한 키나아제 활성 억제는 다음과 같은 방법으로 계산한다. 재조합 인간 MKK3 단백질을 반응액(25 mM Tris/HCl, pH7.5, 0.2 mM EGTA, 0.5 mM sodium orthovanadate, 0.5 mM 5-glycerophosphate, 0.01% Triton X-100, 1% glycerol, 10 mM DTT, 0.5 mg/mL MBP, 20 μg/mL unactive SAPK2a(h), 10 mM Magnesium acetate, 155 uM [gamma-33P-ATP])에서 화합물과 혼합한 후 상온에서 40분간 반응시킨다. 이후, phosphoric acid가 0.5%가 되도록 넣어 반응을 종결시키고, 10 μl의 반응액을 P30 필터에 점적한다. 점적한 필터는 4분간 0.425% phosphoric acid 용액에서 씻는 과정을 4회 반복한 후, methanol에서 한번 더 씻은 후 말려서 scintillation counting을 통해 MKK3의 활성을 측정한다. 화합물이 들어가지 않은 군에서 나온 활성값을 100% of control로 정하여 화합물에 의한 MKK3 저해 정도를 환산한다. IC50값을 계산하기 위해서, 화합물은 최고 농도 1 uM부터 1/3씩 희석하여 총 9개의 농도로 처리하여 저해 정도를 평가하여 50% 억제되는 농도를 IC50값으로 정의한다.
3-2. 세포 생존력 분석
HaCaT 세포(4x103 cells/well)를 96-well plate에 접종하고 24시간 동안 배양한 다음 MKK3 inhibitor(Selleckchem, TX, USA)를 지정된 농도에서 3일 동안 처리하였다. Foretinib 및 cabozantinib은 MKK3 억제제로 사용되었다. 세포 생존율은 제조업체의 프로토콜에 따라 Cell Counting Kit-8(Dojindo Molecular Technologies, ML, USA)을 사용하여 3중으로 평가되었다. HIDEX 센스 마이크로플레이트 리더(Hidex, Finland)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. GraphPad Prism 5(GraphPad Software Inc., CA, USA)를 사용하여 세포 생존력을 나타내는 용량 반응 곡선을 생성하였다.
3-3. Dispase-기반 해리 분석
Ref.(Heupel WM, et al., Pemphigus vulgaris IgG cause loss of desmoglein-mediated adhesion and keratinocyte dissociation independent of epidermal growth factor receptor. Am J Pathol. (2009) 174(2):475-85.)의 방법을 참고하여 분석을 수행하였다. 간단히 말해서, HaCaT 세포(5x105 세포/웰)를 24-웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 인큐베이션한 다음 24시간 동안 표시된 무독성 농도의 화합물 없이 또는 화합물과 함께 5 ㎍/ml의 AK23으로 처리하였다. 그런 다음, 세포를 미리 데워진 PBS로 세척하고 Dispase Ⅱ 용액(2.4 U/ml; Sigma)이 포함된 Hanks 완충 식염수(HBSS, Gibco) 150 ul와 함께 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 200 ul의 HBSS를 첨가한 후, 세포 단층은 단층 전단을 위해 1 ml 피펫으로 15회 피펫팅하여 기계적 응력에 노출되었다. 이어서, 세포를 MTT(5 mg/ml; Sigma)로 20분 동안 염색하였다. 생성된 단편의 수를 세고 현미경으로 이미지를 캡처하였다. 해리 분석은 3회 수행되었으며 통계적 차이는 스튜던트 t-검정을 사용하여 분석되었다. p<0.05의 값은 유의미한 것으로 간주되었다.
3-4. 실험 결과
도 4에서 보는 바와 같이 2가지 화합물(Foretinib 및 cabozantinib)의 MKK3 활성 억제 정도를 평가하기 위하여 MKK3 IC50 값을 측정하였으며, 측정된 IC50 값은 각각 205 및 288 nM이었다.
Dispase 기반 해리 분석은 HaCaT 세포와 같은 세포의 단층을 사용하는 대표적인 시험관내 천포창 모델로 보고되었다(Ref.). 명백하게, HaCaT 세포 단층에서의 AK23 처리는 천포창과 같은 피부의 자가면역 수포 질환의 주요 특징인 세포간 접착의 손실을 나타내는 단편 수를 증가시켰다. 화학적 독성 자체가 세포 부착 손실을 유발할 가능성을 배제할 수 없기 때문에 HaCaT 세포에서 Foretinib 및 cabozantinib의 무독성 농도를 측정하고(도 4), 각각의 MKK3 억제제의 표시된 무독성 용량을 dispase-기반 해리 분석에 적용하였다. 도 5에서 보는 바와 같이 AK23 단독으로는 HaCaT 세포 단층의 단편화를 강력하게 유도하였으나, 본 연구에 사용된 모든 MKK3 억제제(Foretinib 및 cabozantinib)는 AK23에 의한 단편화를 극적으로 억제하여, MKK3 kinase 억제 화합물의 MKK3의 약리학적 억제 효과가 항천포창 활성을 나타낼 수 있음을 시사한다.
상기의 실시예 2 내지 3 결과들을 통해, MKK3는 천포창에서 수포 형성에 중요한 역할을 할 수 있으며, 따라서 MKK3 결합 화합물(KW2449, TAE684, R406 및 Torkinib) 또는 MKK3 kinase 억제 화합물(Foretinib 및 cabozantinib)을 이용한 약리학적 MKK3 억제는 천포창 환자를 치료하기 위한 가능한 치료 전략이 될 수 있음을 확인하였다.
<제제예 1. 약학적 제제>
제제예 1-1. 정제의 제조
본 발명의 화합물 1 200㎎을 락토즈 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄하여 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활성 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
제제예 1-2. 주사액제의 제조
본 발명의 화합물 1 100㎎, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
<제제예 2. 피부외용제>
제제예 2-1. 연고의 제조
본 발명의 화합물 1 2.0중량%, 디에틸세바케이트 8.0중량%, 경납 5.0중량%, 폴리옥시에틸렌올레일에테르포스페이트 6.0중량%, 벤조산나트륨 0.1중량%, 잔량의 바세린을 고속 교반으로 균일하게 혼합하여 교반함으로써, 배합하여 제조하였다.
제제예 2-2. 크림의 제조
본 발명의 화합물 1 0.5중량%, 스테아린산 15.0중량%, 세탄올 1.0중량%, 수산화칼륨 0.7중량%, 글리세린 5.0중량%, 프로필렌글리콜 3.0중량%, 방부제 0.05중량%, 잔량의 정제수를 고속 교반으로 균일하게 혼합하여 교반함으로써, 배합하여 제조하였다.
Claims (10)
- MKK3 활성을 억제하는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 천포창은 심상성천포창(pemphigus vulgaris), 낙엽상천포창(pemphigus foliaceus), 종양수반성 천포창(pemphigus paraneoplastic), IgA 천포창(IgA pemphigus) 및 유사천포창(pemphigoid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 MKK3 활성 억제는 화합물이 MKK3에 결합하거나 화합물이 MKK3 kinase를 억제하는 것을 특징으로 하는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 MKK3 활성을 억제하는 화합물은 {4-[(E)-2-(1H-인다졸-3-일)비닐]페닐}(1-피페라지닐)메탄온, 5-클로로-N4-[2-(이소프로필설포닐)페닐]-N2-{2-메톡시-4-[4-(4-메틸-1-피페라지닐)-1-피페리디닐]페닐}-2,4-피리미딘디아민, 6-({5-플루오로-2-[(3,4,5-트리메톡시페닐)아미노]-4-피리미디닐}아미노)-2,2-디메틸-2H-피리도[3,2-b][1,4]옥사진-3(4H)-온, 2-(4-아미노-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-1H-인돌-5-올, N-[3-플루오로-4-({6-메톡시-7-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-4-퀴놀리닐}옥시)페닐]-N'-(4-플루오로페닐)-1,1-사이클로프로판디카복사미드 및 N-{4-[(6,7-디메톡시-4-퀴놀리닐)옥시]페닐}-N'-(4-플루오로페닐)-1,1-사이클로프로판디카복사미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 MKK3 활성을 억제하는 화합물은 {4-[(E)-2-(1H-인다졸-3-일)비닐]페닐}(1-피페라지닐)메탄온, 5-클로로-N4-[2-(이소프로필설포닐)페닐]-N2-{2-메톡시-4-[4-(4-메틸-1-피페라지닐)-1-피페리디닐]페닐}-2,4-피리미딘디아민 및 N-[3-플루오로-4-({6-메톡시-7-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-4-퀴놀리닐}옥시)페닐]-N'-(4-플루오로페닐)-1,1-사이클로프로판디카복사미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제4항 또는 제5항에 있어서,
상기 약학 조성물은 전신 투여용으로 제형화되는 것을 특징으로 하는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제4항 또는 제5항에 있어서,
상기 약학 조성물은 국소 투여용으로 제형화 되는 것을 특징으로 하는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제4항 또는 제5항에 있어서,
상기 약학 조성물은 정제, 캡슐, 액체, 현탁액 또는 분말 형태로 경구 투여되는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제4항 또는 제5항에 있어서,
상기 약학 조성물은 젤, 하이드로젤, 연고, 크림, 폼(foam), 스프레이, 로션, 액체 또는 피부 패치의 형태인 것을 특징으로 하는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제4항 또는 제5항에 있어서,
상기 약학 조성물은 주사로 투여되는 주사제인 것을 특징으로 하는 천포창 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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