KR20230136422A

KR20230136422A - 코끼리 마늘 추출물의 제조방법

Info

Publication number: KR20230136422A
Application number: KR1020220034148A
Authority: KR
Inventors: 박승만; 정인선; 박정진; 김현아; 김승
Original assignee: 농업회사법인 현대에프엔비 주식회사
Priority date: 2022-03-18
Filing date: 2022-03-18
Publication date: 2023-09-26

Abstract

본 발명은, 코끼리 마늘과 추출 용매를 혼합하여 추출액을 수득하는 단계; 상기 수득한 추출액을 여과하는 단계; 상기 여과한 추출액을 감압농축시키는 단계; 및 상기 농축된 추출물을 건조시켜 분말로 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 코끼리 마늘 추출물의 제조방법을 제공한다.

Description

코끼리 마늘 추출물의 제조방법{METHOD FOR PREPARING ELEPHANT GARLIC EXTRACT}

본 발명은 코끼리 마늘 추출물의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 테스토스테론의 생성과 합성을 촉진시키고 분해를 억제하며, 항산화 효능을 향상시킬 수 있는 코끼리 마늘 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

갱년기란 여성의 경우 갱년기 전후, 폐경기 전후, 또는 폐경기에 걸쳐서 나타나는 호르몬 부족으로 유발되는 증상들을 의미한다. 여기서, 폐경이란 난소 기능이 점차적으로 저하되어 월경이 끝나는 것을 말하며, 이때 월경주기가 불규칙해지고 에스트로겐 감소 및 난포자극호르몬이 증가하는 등의 호르몬 변화가 주요 신호로 나타나게 된다. 또한 폐경기의 에스트로겐 결핍은 골 손실을 가속화시켜 골다공증의 위험을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 갱년기는 엄밀하게는 폐경기보다는 포괄적인 의미로서 가임기에서 폐경기로 이행하는 시기를 의미한다.

이러한 여성 갱년기의 증상으로는, 생리불순, 안면홍조, 빈맥, 발한, 인지장애, 기억력장애, 수면장애, 질 건조, 질 위축증, 피로감, 우울감, 골다공증, 관절통, 탈모증, 동맥경화성 심혈관질환 및 고지혈증이 나타날 수 있다.

이와는 달리, 남성의 갱년기란 신체의 노화 현상에 따라 남성이 전반적인 신체적, 정신적 측면의 쇠퇴 현상을 겪게 되는 과정이며, 남성 호르몬의 저하로 인한 영향으로 남성적 특징, 전반적인 생활 활력이나 기분이 서서히 저하되는 것을 의미한다.

남성 갱년기 증상으로는, 무기력증, 활력 저하, 성욕 감퇴 및 발기능의 감소, 피로감, 공간 지각력의 감소, 신경과민, 정서불안, 우울증, 현기증, 안면홍조, 발한, 수면장애, 기억력 저하, 업무 능력 감소, 근육량 및 근력의 감소, 체모의 감소, 피부 노화, 지구력 감소, 골밀도 감소, 내장 지방 증가 등의 증상이 발현될 수 있다.

이러한 갱년기 증상 들을 개선, 치료하기 위해서 인위적으로 남성 호르몬 약물 투여하는 요법이 있으나, 이러한 남성 호르몬의 투여하는 방법의 경우 간 독성을 나타낼 수도 있고, 지질 상태, 심혈관 및 전립선 질환, 수면 및 행동 장애에 역효과를 미칠 수도 있어, 이러한 부작용 때문에 지속적인 방법으로 사용하는 것은 기피 하게 된다는 문제점이 있다.

이에 최근에는 이러한 부작용이 없으면서도 남성 갱년기 증상을 개선 시킬 수 있는 천연 식물 성분에 관한 관심이 높아지고 있으며 이에 맞추어 많은 개발이 시도되고 있는 추세이나, 다양한 남성 갱년기 증상 중에서 성 기능 등의 단편적인 증상만을 경감시키는 분야로 한정되고 집중될 뿐, 남성 갱년기 증후군을 근원적으로 개선할 수 있는 분야에 대한 개발은 미흡한 현실이다.

대한민국 공개특허공보 제2017-0118787호 대한민국 공개특허공보 제2012-0121468호

본 발명의 목적은, 남성 갱년기 증후군에 중요한 테스토스테론에 관여하고, 우수한 황산화 효능을 제공하여, 남성 갱년기 증상 개선에 우수한 효과를 제공할 수 있는 코끼리 마늘 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은, 코끼리 마늘과 추출 용매를 혼합하여 추출액을 수득하는 단계; 상기 수득한 추출액을 여과하는 단계; 상기 여과한 추출액을 감압농축시키는 단계; 및 상기 농축된 추출물을 건조시켜 분말로 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 코끼리 마늘 추출물의 제조방법에 의해 달성된다.

여기서, 상기 추출액을 수득하는 단계에서는, 상기 코끼리 마늘과 상기 추출 용매는 1:3의 중량비로 혼합할 수 있다.

또한, 상기 추출액을 수득하는 단계에서는, 상온에서 7일간 추출하여 수득할 수 있다.

그리고, 상기 추출 용매는, 물, 알코올, 또는 이들의 혼합용매 중에서 선택할 수 있다.

한편, 상기 감압농축시키는 단계에서는, 50℃의 온도에서 60분 동안 감압농축시킬 수 있다.

그리고, 상기 분말을 수득하는 단계에서는, -40℃의 온도에서 16시간 동안 동결건조하여 수득할 수 있다.

본 발명에 따르면, 우수한 세포 생존율을 제공하며, 테스토스테론의 생성량 및 테스토스테론 합성 관련 효소 활성을 증가시키고, 테스토스테론 분해 관련 효소 활성을 감소시키는 한편, 코끼리 마늘 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 우수한 함유성과 DPPH 라디칼 소거능을 통한 높은 항산화력을 제공하고, 향상된 지질 과산화 억제능 및 우수한 산화질소 활성을 제공할 수 있음에 따라, 갱년기 증후군 발생의 근본적인 원인 해결을 통한 복합적인 갱년기 증상 개선 효과가 우수한 코끼리 마늘 추출물의 제조방법이 제공된다.

도 1은 본 발명에 따른 코끼리 마늘 추출물에 대한 세포 독성 평가 결과를 나타낸 그래프이고,
도 2 내지 도 4는 본 발명에 따른 코끼리 마늘 추출물의 테스토스테론 활성 평가결과를 나타낸 그래프이고,
도 5 내지 도 7은 본 발명에 따른 코끼리 마늘 추출물의 항산화능 분석 결과를 나타낸 그래프이고,
도 8은 본 발명에 따른 코끼리 마늘 추출물의 지질 과산화 억제능 분석결과를 나타낸 그래프이고,
도 9는 본 발명에 따른 코끼리 마늘 추출물의 산화질소 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하에서, 실시예에 대해 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

이하에서는, 본 발명의 일실시예를 구체적으로 설명하기로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 코끼리 마늘 추출물의 제조방법은, a) 코끼리 마늘과 추출 용매를 혼합하여 추출액을 수득하는 단계; b) 상기 수득한 추출액을 여과하는 단계; c) 상기 여과한 추출액을 감압농축시키는 단계; 및 d) 상기 농축된 추출물을 건조시켜 분말로 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 a) 단계에서는 코끼리 마늘의 껍질을 제거하고 세척하여 준비를 한 후, 추출용매와 혼합하여 추출할 수 있다.

여기서, 코끼리 마늘과 추출 용매를 혼합 시 1: 3 비율(중량 기준)로 혼합하는 것이 가장 바람직할 수 있으며, 상기 추출 용매를 상기 비율 미만 또는 초과하여 혼합되는 경우 추후 분말화를 위한 추출액으로 수득되지 아니할 수 있으므로 1:3인 것이 가장 바람직할 수 있다.

상기 a) 단계에서 추출 용매로 물, 알코올, 또는 이의 혼합물을 사용하여 추출하는 것이 바람직할 수 있으며, 가장 바람직하게는 70% 에탄올을 추출용매로 사용하여 상온에서 7일간 추출할 수 있다. 다른 추출 용매를 사용하여 저온 또는 고온에서 7일 미만 또는 7일 초과하는 경우, 갱년기 증상 개선을 위한 유효성분이 제대로 추출되지 아니하여 효과가 저하될 수 있다.

상기 a) 단계에서 사용하는 코끼리마늘(Allium ampeloprasum var. ampeloprasum)은 부추속의 재배식물이며, 학명은 Allium ampeloprasum var. ampeloprasum이다. 마늘과 이름을 같이 쓰고 생긴 것도 마늘과 유사하나 마늘(Allium sativum L.)과는 종이 다르다. 즉 마늘(A. sativum)과 다른 종인 코끼리 마늘(A. ampeloprasum) 품종이다. 리크나 구슬양파와는 종이 같으며, 식물 키는 1m 내외로 일반 마늘에 비해 30~40cm정도 크며, 마늘 한 톨은 일반 마늘보다 2~3배, 한 쪽은 7~10배 정도 크다. 그리고 맛은 리크보다 마늘과 비슷한데, 일반 마늘보다 맵고 아린 맛이 적고 향이 덜하다. 구우면 단 맛이 난다.

코끼리 마늘은, 대부분 기존 마늘과 비슷한 영양성분을 갖고 있으며, 그중 스코르디닌(scordinin) 성분은 일반 마늘에 비해 약 2배가 넘는다. 또한 알리신 성분뿐만 아니라 당뇨로 손상된 혈관을 보호하는 역할을 하는 항산화 성분인 S-아릴시스테인 성분이 마늘보다 훨씬 풍부하게 들어있다.

코끼리 마늘의 일반 효능 관련하여서는 일상 생활과 관련된 박테리아의 번식을 억제할 수 있고, 코끼리 마늘의 항균 능력은 일반마늘보다 강할 뿐만 아니라 어떤 변종의 경우 페니실린보다 강하며, 지방세포의 분화를 억제함으로써 생체 외 항비만효과 및 항암 효능을 제공할 수 있다.

상기 b) 단계는 여과 단계로서, 상기 a) 단계에서 추출된 추출액을 여과지를 통해 여과하는 것이 바람직할 수 있다.

상기 c) 단계는, 상기 b) 여과 단계를 거친 추출액에서 상기 a) 단계에서 사용된 추출 용매를 제거하는 한편 상기 b) 여과 단계를 거친 추출액을 농축시키는 단계로서, 여기서 50℃의 온도에서 60분 동안 감압농축하는 것이 가장 바람직할 수 있다. 50℃ 미만의 온도 또는 초과 온도 및 60분 미만 또는 초과 시간 동안 진행되는 경우 용매가 제거되지 아니하고 잔존하거나 분말화를 위한 점도로 농축되지 아니할 수 있다.

상기 d) 단계는, 상기 c) 단계 후 분말로 제조하기 위한 단계로서, -40℃의 온도에서 16시간 동안 동결 건조하여 분말로 수득하는 것이 가장 바람직할 수 있다. -40℃ 온도 미만 또는 초과하는 온도에서 16시간 미만 또는 초과하여 동결 건조하는 경우 분말로 수득되지 아니하거나 수득 시간이 오래 소요되어 생산성이 저하될 수 있다.

한편 상기 d) 단계를 통해 이렇게 수득한 최종 수득물은 이하 실험예들을 위해 -20℃로 냉동보관하였으며 배지에 녹여 실험에 사용하였다.

이와 같이 본 발명에 따른 한 a)~d)단계를 통해 제조된 코끼리 마늘 추출물의 경우, 우수한 세포 생존율을 제공하고, 테스토스테론에 관여하며, 높은 항산화력을 제공하고, 향상된 지질 과산화 억제능 및 우수한 산화질소 활성을 제공함에 따라 우수한 갱년기 증상 개선의 효과가 발생하게 된다.

이러한 효과 중에서 본 발명에 따른 추출물이 테스토스테론의 생성, 합성, 분해 억제에 관여하는 효과를 설명하기 위해 이하에서는 갱년기 증상과 연결된 테스토스테론에 대해 구체적으로 설명하기로 한다.

테스토스테론이 감소하면서 남성갱년기 증세가 나타나게 되는데, 남성 갱년기와 관련된 호르몬으로, 테스토스테론은 남성의 주요 순환 안드로겐이다. 주로 고환의 레이디히(Leydig) 세포에 의해 분비되고, 테스토스테론은 주로 남성의 2차 성징의 발달 및 유지에 관여한다. 신체에서 순환하는 테스토스테론은 5α-환원효소에 의해 디히드로테스토스테론(Dihydrotestosterone, DHT)로 대사될 수 있다. 테스토스테론은 간, 지방 및 고환에서 발견되는 아로마타아제(aromatase) 효소복합체에 의해 에스트라디올(estradiol)로 대사될 수 있다. 테스토스테론이 에스트라디올로 방향화됨으로써 여성형 유방 증상과 같은 남성갱년기 증상이 나타날 수 있다. 테스토스테론을 증가시키고, 디히드로테스토스테론 및 에스트라디올의 수준을 감소시키는 것이 남성갱년기 증상을 완화하는데 도움을 준다.

테스토스테론의 DHT로의 전환은 많은 측면에서 중요하다. 예를 들어, DHT는 테스토스테론보다 훨씬 높은 친화도로 SHBG에 결합한다. 또한, 많은 조직에서 테스토스테론의 활성이 시토솔 수용체 단백질에 결합한 DHT로의 환원을 결정한다. 스테로이드 수용체 복합체는 핵으로 이동되고, 전사 및 안드로겐 작용과 관련된 세포 변화가 시작된다. 테스토스테론은 단백질에 98% 결합되어 혈액에서 순환한다. 남성에서 대략 40%는 고친화성 성호르몬 결합 글로불린(Sex hormone binding globulin, SHBG)에 결합한다. 나머지 60%는 알부민에 약하게 결합한다. 따라서, 임상 실험으로부터 다수의 테스토스테론에 대한 측정이 가능하다. 단백질에 결합되지 않은 혈액 중의 테스토스테론 부분을 "유리" 테스토스테론이라고 하고, 유리 테스토스테론과 단백질 결합 테스토스테론을 포함하여 "전체 테스토스테론" 또는 "테스토스테론"이라고 한다.

SHBG는 테스토스테론과 결합하여 테스토스테론의 실제 작용을 조절하는 역할을 한다. SHBG이 테스토스테론과 결합하면 호르몬의 활성을 잃어버리며, 분리되면 실제로 작용하는 호르몬이 된다. 테스토스테론의 40~80%는 SHBG와 결합하여 생물학적으로 불활성화 상태로 존재하며 남성 40~70세를 대상으로 조사한 결과 SHBG가 증가하는 것으로 나타났다. 노화에 따른 혈중 SHBG의 증가로 생체이용가능한 테스토스테론은 더욱 감소하므로 남성 갱년기 증상이 악화될 수 있다.

이에 본 발명에서는 이러한 갱년기 증상을 발생시키는 원인을 파악하고 갱년기 증상을 현저하게 개선할 수 있도록 코끼리 마늘 추출물을 제조하였으며, 이에 대해서는 이하 실시예를 통해 구체적으로 제조방법을 설명하고, 이 실시예의 실험예를 통해 확인된 본 발명의 효과에 대해 구체적으로 설명하기로 한다.

실시예(코끼리 마늘 추출물의 제조)

코끼리 마늘의 껍질을 제거하고 세척 한 후, 세척이 완료된 코끼리 마늘은 70% 에탄올에 1:3 중량비로 혼합한 후, 상온에서 7일간 추출하였다.

이 추출액을 여과지(filter paper, Advantec, Tokyo, Japan)로 여과한 후, 50℃에서 1시간 동안 회전 감압농축기(Tokyo Rikakikai, Tokyo, Japan)를 이용하여 추출에 사용한 용매를 제거하고 농축하였다.

다음으로 동결건조기(Ilshin Lab, Dongducheon, Korea)로 -40℃에서 16시간 동안 동결건조하여 분말을 제조하였다. 이 분말은 -20℃에서 냉동 보관하였으며, 배지에 녹여 실험에 사용하였다.

실험예

1. 코끼리 마늘 추출물이 세포 생존율에 미치는 영향 확인

1) TM3 세포배양 및 세포독성

쥐의 고환에서 유래하며 남성 호르몬인 테스토스테론을 분비하는 라이디히 세포(Leydig cell)인 TM3 세포는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였고, 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% antibiotics가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)을 이용하여 37℃, 5% CO₂의 조건으로 유지되는 배양기에서 배양하였다.

세포독성을 측정하기 위해 MTT assay를 수행, TM3 세포를 96-well plate에 4×10³ cells/well로 분주하며, 24시간 동안 배양하고 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. MTT 용액을 각 well에 첨가하여 4시간 동안 반응, MTT 용액을 제거하고, DMSO(dimethyl sulfoxide)를 넣고 15분 후에 ELISA reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 control 값에 대한 비율로 계산하였다.

2) 코끼리 마늘 추출물이 TM3 세포에 미치는 독성 평가

코끼리 마늘 추출물이 TM3 세포에 미치는 독성을 평가하기 위해, 추출물을 농도별로 처리한 후 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 구하였다. 이에, 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 추출물을 0, 50, 100, 200, 300, 500, 700, 1000, 2000㎍/㎖의 농도로 24시간 처리한 후 확인한 결과, 700㎍/㎖ 까지 세포 생존율이 감소하지 않았으며, 1000, 2000㎍/㎖를 처리하였을 때 각각 92.77, 70.63%의 세포 생존율을 보임을 확인할 수 있었다.

2. 코끼리 마늘 추출물이 테스토스테론(Testosterone)에 미치는 영향 확인

1) 테스토스테론(Testosterone) 생성 및 17β-HSD2, 3β-HSD2, aromatase, 5α-Reductase 2 측정

시료를 처리한 TM3 세포로부터 얻은 배지로부터 테스토스테론(Testosterone), 17β-HSD2, 3β-HSD2, aromatase, 5α-Reductase 2 함량 및 활성을 분석하였다. ELISA kit를 이용하여 제조사의 매뉴얼(manual)에 따라 흡광도를 측정하여 표준곡선을 이용하여 계산하였다.

2) 테스토스테론(Testosterone)의 생성에 미치는 영향 평가

테스토스테론은 정소의 라이디히 세포(Leydig cell)에서 생성되며 남성 성징 및 정자 형성을 촉진한다. 남성의 노화에 따라 라이디히 세포(Leydig cell)가 감소하게 되고 이에 따라 테스토스테론(testosterone)의 생성을 감소시켜 남성 갱년기의 원인이 된다. 이에 테스토스테론(testosterone)의 생성을 증가시킨다면 남성 갱년기 증상을 개선시킬 수 있게 되므로, 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 추출물이 테스토스테론 생성에 미치는 영향을 확인할 수 있도록 300, 400, 500 ㎍/㎖ 농도로 TM3 세포에 24시간 동안 처리한 후 측정하였다.

도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 코끼리 마늘 추출물을 처리하지 않은 세포에서는 31.51 pg/㎖이었지만, 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 추출물을 처리한 세포에서는 처리농도에 따라 36.09, 48.64, 56.12 pg/㎖로 테스토스테론의 생성이 증가하였다.

이와 같은 도 2의 결과를 통해, TM3 세포에 있어서 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 추출물에 의해 테스토스테론(testosterone)의 생성량이 농도 의존적으로 증가한다는 것을 확인할 수 있었다.

3) 테스토스테론(Testosterone)의 합성 관련 효소 활성에 미치는 영향 평가

테스토스테론(testosterone) 생합성 과정에서 3β-HSD2는 안드로스텐디올(Androstenediol)에서 테스토스테론(testosterone)으로 전환시키는 효소이며, 17β-HSD3는 안드로스테네디온(androstenedione)을 테스토스테론(testosterone)으로 변환하는 효소이다. 테스토스테론(testosterone)의 생성을 증가시키기 위해서는 3β-HSD2와 17β-HSD3의 활성을 유지해야 한다. 이에 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 추출물에 의한 3β-HSD2와 17β-HSD3의 활성 변화를 확인하기 위해 300, 400, 500㎍/㎖ 농도로, TM3 세포에 24시간 동안 처리한 후 측정하였다.

도 3의 (A)에서 볼 수 있는 바와 같이, 17β-HSD3은 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 추출물을 처리하지 않은 세포에서는 11.05pg/㎖이었지만, 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 추출물을 처리한 세포에서는 처리농도에 따라 14.39, 20.08, 32pg/㎖로 효소 활성이 증가하였다.

그리고, 도 3의 (B)에서 볼 수 있는 바와 같이, 3β-HSD2는 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 추출물을 처리하지 않은 세포에서는 0.59pg/㎖이었지만, 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 추출물을 처리한 세포에서는 처리농도에 따라 0.61, 0.80, 1.20pg/㎖로 효소 활성이 증가한다는 것을 확인할 수 있었다.

4) 테스토스테론(Testosterone)의 분해 관련 효소 활성에 미치는 영향 평가

아로마테이스(aromatase)는 테스토스테론(testosterone)과 안드로스테네디온(androstenedione)을 에스트라디올(estradiol)로 분해하며, 5α-Reductase 2는 테스토스테론(testosterone)을 디하이드로테스토스테론(Dihydrotestosterone, DHT)으로 전환 시켜 테스토스테론(testosterone)의 함량을 감소시킨다. 이에 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 추출물이 아로마테이스(aromatase)와 5α-Reductase 2의 활성을 감소시키는지를 확인하기 위해 300, 400, 500㎍/㎖ 농도로 TM3 세포에 24시간 동안 처리한 후 측정하였다.

도 4의 (A)에서 볼 수 있는 바와 같이, Aromatase의 경우, 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 추출물을 처리하지 않은 세포에서는 115pg/㎖이었지만, 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 추출물을 처리한 세포에서는 처리농도에 따라 102, 89, 75pg/㎖로 효소 활성이 감소하였다.

그리고 도 4의 (B)에서 볼 수 있는 바와 같이, 5α-Reductase 2의 경우, 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 추출물을 처리하지 않은 세포에서는 220.63pg/㎖이었지만, 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 추출물을 처리한 세포에서는 처리농도에 따라 201, 179, 158pg/㎖로 효소 활성이 감소함을 확인할 수 있었다.

이를 통해, 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 추출물은, TM3 세포에서 테스토스테론(testosterone)의 수치를 회복시키는 효과가 있는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 원인으로 테스토스테론(testosterone)의 합성에 관여하는 효소의 활성 증가와 분해에 관여하는 효소의 활성을 억제함으로써 나타나는 결과라는 것을 확인할 수 있었다.

3. 코끼리 마늘 추출물의 In vitro 항산화능 분석

1) 코끼리 마늘 추출물의 총 폴리페놀 농도 분석

다양한 농도의 시료에 폴린-데니스 시약(Folin-Denis reagent, Fluka, Buchs, Switzerland)을 100㎕을 가하여 혼합한 후 3분간 실온에서 반응시켰다.

3분 후 10% 탄산 나트륨 용액(sodium carbonate solution) 100㎕을 가하여 혼합하고 1시간 반응시킨 후 상층액을 취하여 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 760nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 5에 도시된 바와 같이, 총 폴리페놀 농도 분석은, 갈산(gallic acid)을 기준물질로 수행된 표준곡선을 활용하여 수행하였다.

표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 농도를 분석한 결과, 코끼리 마늘 에탄올 추출물에서 총 폴리페놀 농도는 3.56 ± 0.26 mg/g으로 확인되었다.

[표] 1

본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 농도는 다른 소재인 예컨대 오가피(0.5 mg/g), 보리수(2.9 mg/g), 대추(3.1 mg/g)보다 높은 것으로 분석되었다.

2) 코끼리 마늘 추출물의 플라보노이드 농도 분석

다양한 농도의 시료에 디에틸렌 글라이콜(diethylene glycol)을 1㎖씩 가하여 혼합한 후 1N 수산화나트륨(NaOH)을 100㎕ 가하여 잘 혼합하고 37℃ 워터 배스(water bath)에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 420nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 6에 도시된 바와 같이, 플라보노이드 농도 분석은, 나린진(naringin)을 기준물질로 수행된 표준곡선을 활용하여 수행되었다.

표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 에탄올 추출물의 플라보노이드 농도를 분석한 결과, 코끼리 마늘 에탄올 추출물에서 플라보노이드 농도는 2.22 ± 0.19 mg/g로 확인되었다.

[표 2]

본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 에탄올 추출물의 플라보노이드 농도는 다른 소재 예컨대 손바닥 선인장 열매(1.6 mg/g), 오미자(2.0 mg/g)보다 높은 것으로 분석되었다. 플라보노이드는 활성산소종을 효과적으로 제거하여 항산화 효능이 높으며 항암, 항염증, 항바이러스 등의 효과를 제공할 수 있다.

3) 코끼리 마늘 추출물의 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), 히드록실(hydroxyl) 라디칼 소거능 분석

다양한 농도의 시료에, 0.1mM DPPH 시약 0.5㎖을 넣고 20분 동안 빛을 차단한 조건에서 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다.

그리고, 제조된 시료용액 0.15㎖에 buffer 0.35㎖, 3mM 디옥시리보스(deoxyribose), 0.1mM 아스코르브산(ascorbic acid), 0.1mM EDTA, 0.1mM FeCl₃, 1mM 과산화수소(H₂O₂)용액 0.1㎖을 넣어 잘 교반한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, 반응이 끝난 후 2% TCA 용액과 1% TBA 용액을 잘 섞은 후 100℃에서 20분간 반응시킨 후, 실온으로 냉각하여 원심분리한 뒤 상등액을 취하여 분광광도계를 이용하여 532nm에서 흡광도를 측정하였다.

본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 에탄올 추출물의 항산화 효능을 평가하기 위해 DPPH 라디칼 소거능을 분석한 것으로서, 안정적인 라디칼인 DPPH는 산화방지물질로부터 전자 혹은 수소를 제공 받으면 비라디칼 물질로 전환되면서 흡광도 감소의 변화가 있음에 따라 이 원리로 항산화 활성측정법으로 이용하는 것이다. 여기서, DPPH 라디칼 소거능은 불안정한 유리기에 환원기능을 가진 수소양이온(proton ion)을 제공하여 안정화 되도록 유도하는 기능으로 생체 내에서 발생하는 불안정하고 유해한 유리기를 안정화시키는 역할을 한다. 따라서, 미지의 특정물질이 생체의 생리작용 혹은 산화작용에 의하여 발생하는 히드록실(hydroxyl) 혹은 슈퍼옥사이드라디칼(superoxide radical) 등을 제거하는 항산화 능력을 평가할 때 사용되는 지표로 높은 값일수록 항산화능이 우수한 것으로 판단한다.

이에 음성대조군으로 시료 대신 에탄올(ethanol)을 사용하였고, 양성대조군으로는 수용성 비타민C인 아스코르브산(ascorbic acid)을 0.5, 1, 2, 3, 4μg으로 다양한 농도로 사용하였다. 그리고 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 에탄올 추출물은 각각 10, 20, 50, 100μg의 농도로 사용하였다.

517nm에서 측정된 각 반응액의 흡광도에서 일반대조군의 흡광도 값을 100%로 하여 비교 분석한 결과, 도 7의 (B)에서 볼 수 있는 바와 같이, 양성대조군 수용성 비타민C에서는 DPPH 라디칼을 0.5μg에서 37.69 ± 0.41%, 1μg에서 87.62 ± 0.19%, 2μg에서 87.93 ± 0.20%, 3μg에서 87.81 ± 0.20%, 4μg에서 87.64 ± 0.22%로 확인되었다.

그리고, 도 7의 (A)에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 에탄올 추출물의 경우, 다양한 농도 중 10μg에서는 3.16 ± 0.49%, 20μg에서는 7.22 ± 0.62%, 50μg에서는 9.31 ± 0.51%, 100μg에서는 16.83 ± 1.16%로 확인되었다.

이처럼, 본 발명에 따른 코끼리 마늘 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함유와 라디칼 소거능은 항산화력과 관련 있으며, 이는 약물, 스트레스, 환경오염, 노화 등에 의해 유발되는 유리기와 활성산소종의 생성 및 산화물질 축적으로 갱년기 증상, 유전자 손상, 세포 노화, 동맥경화, 암, 염증질환에 노출시킬 수 있는 활성산소종과 유리기의 활성을 저해하거나 생성을 지연시키는 기능을 확인할 수 있었다.

4. 코끼리 마늘 추출물의 조직 내 In vitro 효능 분석(남성 갱년기 및 성기능 개선 효능의 확인)

1) 지질 과산화 억제능 분석

지질 과산화 억제능을 분석하기 위해 조직 절편의 호모제네이트(homogenate)를 만든 후 0.8% TBA 1㎖와 1mM FeSO₄ in 20% TCA 0.5㎖와 증류수(DW) 1.3㎖를 첨가한 다음 잘 혼합하여 98℃ 수욕조에서 30분 동안 반응시킨 후 바로 냉각하였으며, 냉각한 튜브(tube)에 노르말 부탄올(n-butanol) 5㎖을 가하여 잘 섞고 4,000rpm에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취하여 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 532nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 1,1,3,3-tetraethoxypropane(TEP)을 사용하고, 지질과산화물 수준은 조직의 nmol MDA/g로 표현하였다.

본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 에탄올 추출물의 지질 과산화 억제능을 분석하고 NO 활성을 측정하여 남성 갱년기 및 성기능 개선 효능을 확인하기 위한 것으로서, 노화 및 갱년기 증상으로 조직 내 과산화를 유발할 수 있고 NO 활성이 감소될 수 있으므로 이를 지표로 활용한 분석이다.

도 8의 (A)에서 볼 수 있는 바와 같이, 음경조직 내 지질 과산화 억제능은 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 에탄올 추출물의 다양한 농도 중 10μg에서는 3.16 ± 0.49%, 20μg에서는 7.22 ± 0.62%, 50μg에서는 9.31 ± 0.51%, 100μg에서는 16.83 ± 1.16%로 확인되었다.

도 8의 (B)에서 볼 수 있는 바와 같이, 양성대조군 수용성 비타민C에서는 음경조직 내 지질 과산화를 0.5μg에서 8.14 ± 0.63%, 1μg에서 10.58 ± 0.96%, 2μg에서 13.91 ± 2.05%, 3μg에서 19.66 ± 2.49%, 4μg에서 24.16 ± 3.55%로 확인되었다.

2) NO 활성 측정

NO 활성을 측정하기 위해 각 농도별 시료 1㎖에 0.1㎖의 그리스 시약(Griess reagent)을 잘 혼합한 다음 실온에서 15분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 NO의 양을 산출하고 NO농도는 외부표준곡선으로부터 계산하였다.

도 9에서 볼 수 있는 바와 같이 음경조직 내 NO 활성은 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 추출물로 처리하지 않은 그룹의 활성을 100%로 하였을 때, 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 에탄올 추출물의 다양한 농도 처리그룹 중 10μg에서는 100.51 ± 0.03%, 20μg에서는 101.37 ± 0.65%, 50μg에서는 103.98 ± 0.55%, 100μg에서는 104.22 ± 0.41%로 확인되었다.

분자생물학적으로 성기능은 음경의 신경말단과 혈관내피세포에서 산화질소의 합성과 분비로 변환되며, 산화질소의 생성은 L-아르기닌(Arginine)이 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase)에 의해 환원되어 이루어진다. 이후 산화질소는 세포 내로 유입되어 이차전달자를 통해 성기능을 유도한다. 따라서, 이러한 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 에탄올 추출물은 음경조직 내 산화적 스트레스를 감소시키고 성기능을 유도할 수 있는 산화질소 활성을 통해 성기능을 개선시킬 수 있는 기능을 확인할 수 있었다.

이처럼 본 발명의 실시예에 따른 코끼리 마늘 추출물을 다양하게 평가한 실험예들을 통해서, 본 발명에 따른 코끼리 마늘 추출물은 우수한 세포 생존율을 제공하며, 테스토스테론의 생성량 및 테스토스테론 합성 관련 효소 활성을 증가시키고, 테스토스테론 분해 관련 효소 활성을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 코끼리 마늘 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 우수한 함유성과 DPPH 라디칼 소거능을 통한 높은 항산화력을 제공하고, 향상된 지질 과산화 억제능 및 우수한 산화질소 활성을 제공하는 것을 확인할 수 있었다. 이에 최종적으로 본 발명은 갱년기 증후군 발생의 근본적인 원인 해결을 통해 복합적인 갱년기 증상의 매우 우수한 개선 효과를 제공할 수 있게 되는 것이다.

이상 본 발명의 실시예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims

코끼리 마늘과 추출 용매를 혼합하여 추출액을 수득하는 단계;
상기 수득한 추출액을 여과하는 단계;
상기 여과한 추출액을 감압농축시키는 단계; 및
상기 농축된 추출물을 건조시켜 분말로 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 코끼리 마늘 추출물의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 추출액을 수득하는 단계에서는, 상기 코끼리 마늘과 상기 추출 용매는 1:3의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 코끼리 마늘 추출물의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 추출액을 수득하는 단계에서는, 상온에서 7일간 추출하여 수득하는 것을 특징으로 하는 코끼리 마늘 추출물의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 추출 용매는, 물, 알코올, 또는 이들의 혼합용매 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 코끼리 마늘 추출물의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 감압농축시키는 단계에서는, 50℃의 온도에서 60분 동안 감압농축시키는 것을 특징으로 하는 코끼리 마늘 추출물의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 분말을 수득하는 단계에서는, -40℃의 온도에서 16시간 동안 동결건조하여 수득하는 것을 특징으로 하는 코끼리 마늘 추출물의 제조방법.