KR20230134833A - 치료불응 막성사구체신염 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 치료불응 막성사구체신염 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 hsa-let-7f-1-3p, hsa-miR-12136, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-23a-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-6126 및 hsa-miR-8485로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA를 유효성분으로 포함하는 치료불응 막성사구체신염 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 치료불응 막성사구체신염에 특이적으로 발현하는, 혈액 또는 혈청 유래 엑소좀으로부터 유래된 miRNA를 포함함으로써, 치료불응 막성사구체신염을 보다 용이하게 진단할 수 있고, 치료불응 막성사구체신염을 조기 진단함으로써, 그에 따른 적절한 치료를 통해 증상 악화, 이에 따른 합병증 등을 최소화하여 보다 효과적으로 치료불응 막성사구체신염을 치료할 수 있다.
상기 조성물은 치료불응 막성사구체신염에 특이적으로 발현하는, 혈액 또는 혈청 유래 엑소좀으로부터 유래된 miRNA를 포함함으로써, 치료불응 막성사구체신염을 보다 용이하게 진단할 수 있고, 치료불응 막성사구체신염을 조기 진단함으로써, 그에 따른 적절한 치료를 통해 증상 악화, 이에 따른 합병증 등을 최소화하여 보다 효과적으로 치료불응 막성사구체신염을 치료할 수 있다.
Description
본 발명은 치료불응 막성사구체신염(refractory membranous glomerulonephritis) 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
일차성 신증후군(primary nephrotic syndrome)은 심한 부종, 다량의 단백뇨 및 혈액의 저알부민혈증을 특징으로 정의된다. 일차성 신증후군의 원인 질환은 신장의 사구체(glomerulus)에 염증이 발생하는 사구체 질환(glomerulitis)으로, 종류는 10가지 이상이며 발병률을 기준으로 막성사구체신염(Membranous glomerulonephritis, MGN) 및 특발성 사구체신염(Idiopathic nephrotic syndrome, INS)이 대다수를 차지한다. 일차성 신증후군은 질환별로 치료 방법 및 치료 예후가 다양한 것이 특징이다. MGN 치료 시, 앤지오텐신전환효소 억제제, 앤지오텐신수용체 차단제 등의 비면역요법 치료에 반응하지 않는 경우에는, 면역억제제 치료가 필요할 수 있는데, 관해(resolution)를 위해서는 고용량의 스테로이드와 시클로포스파미드(cyclophosphamide)와 같은 면역억제제 병합 치료가 필요하다.
MGN의 임상 경과는 다양하다. 약 1/3의 환자에서는 자연 완전완화(complete remission) 혹은 부분완화(partial remission)가 일어나며, 다른 약 1/3 환자들에서는 신증후군이 반복되면서 신기능은 비교적 정상 범위에서 유지되며, 남은 1/3 환자들은 말기 신부전으로 진행하거나 합병증으로 사망한다. 치료반응 막성사구체신염(MGN-W)의 경우, 치료시작 후 12개월까지 완전관해(단백뇨 300mg/day 미만) 또는 부분관해(단백뇨 50% 이하 감소)이면서 24개월까지 단백뇨가 nephrotic range(3.5g/day) 이상으로 증가하지 않은 경우를 말하며, 치료불응 막성사구체신염(MGN-R)의 경우, 치료 후 12개월까지의 반응이 부분관해도 달성하지 못하였거나 부분관해이었지만 그 뒤 추적검사에서 단백뇨가 3.5g/day 이상으로 다시 증가한 경우로 정의할 수 있다. 최근 phospholipase A2 receptor(PLA2R)에 대한 항체(anti-PLA2R IgG 항체)가 진단 및 예후 예측에 도움이 되는 생체표지자로 각광을 받고 있으나, anti-PLA2R IgG 항체가 치료 반응을 판단하는데 도움이 되는지는 연구가 많지 않고, anti-PLA2R IgG 항체는 MGN에서 70~80%에서만 발견된다. 이 외에도 MGN의 치료 반응을 예측할 수 있는 생체 지표는 아직 명확치 않다.
신증후군에서 원인 질환의 정확한 진단을 위해서 gun needle을 이용하여 신장 조직을 채취하는 침습적인 조직검사(kidney biopsy)가 필수적이다. 또한, 심장병과 뇌혈관 질환의 재발을 위해 복용하는 항혈소판제(antiplatelet agents) 및 항응고제(anticoagulation) 복용 시에는 침습적인 조직검사는 매우 위험한 검사이다. 따라서 침습적인 진단 방법인 조직검사와 더불어 질환의 확진에 도움을 주거나, 침습적인 조직검사가 불가능한 경우를 위한 비침습적인 바이오마커의 개발이 매우 중요하다.
한편, 마이크로 RNA(microRNA; miRNA; miR)는 동식물 모두의 게놈에 존재하는 비암호화의 작은 RNA로 생물의 전반적인 모든 과정에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 최근 이러한 miRNA를 질병 진단용 바이오마커로 사용하기 위한 연구들이 진행되고 있다. 현재 임상에서 사용되는 대부분의 바이오마커는 체액에 순환하는 단백질이나, 불행히도 새로운 단백질 기반의 바이오마커 개발은 시료 내 표적 단백질의 낮은 친화도로 인하여 상당한 기술적 어려움에 직면해 있는 바, miRNA를 이용한 바이오마커의 개발은 단백질 바이오마커의 한계점을 극복할 수 있는 하나의 대안이 될 수 있다.
본 발명의 목적은 치료불응 막성사구체신염 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 치료불응 막성사구체신염 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 hsa-let-7f-1-3p, hsa-miR-12136, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-23a-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-6126 및 hsa-miR-8485로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA를 유효성분으로 포함하는 치료불응 막성사구체신염 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 hsa-let-7f-1-3p, hsa-miR-12136, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-23a-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-6126 및 hsa-miR-8485로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 치료불응 막성사구체신염 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 치료불응 막성사구체신염 진단용 조성물을 유효성분으로 포함하는 치료불응 막성사구체신염 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 개체로부터 시료를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 시료에서 hsa-let-7f-1-3p, hsa-miR-12136, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-23a-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-6126 및 hsa-miR-8485로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 치료불응 막성사구체신염 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 치료불응 막성사구체신염에 특이적으로 발현하는, 혈액 또는 혈청 유래 엑소좀으로부터 유래된 miRNA를 포함함으로써, 치료불응 막성사구체신염을 보다 용이하게 진단할 수 있다.
이를 이용하여 치료불응 막성사구체신염을 조기 진단함으로써, 그에 따른 적절한 치료를 통해 증상 악화, 이에 따른 합병증 등을 최소화하여 보다 효과적으로 치료불응 막성사구체신염을 치료할 수 있다.
도 1은 정상군(HV) 및 치료반응 막성사구체신염(MGN-W) 환자군의 혈청에서 분리한 엑소좀 내 miRNA의 발현수준을 확인한 결과이다. 도 1a는 정상군에 비해 치료반응 막성사구체신염 환자군에서 유의적으로 2배 이상(p < 0.05) 발현이 감소 또는 증가한 miRNA의 발현수준에 따른 계층적 클러스터링을 수행한 히트맵 결과이고, 도 1b는 상기에서 검출된 miRNA의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과이다.
도 2는 치료반응 막성사구체신염(MGN-W) 환자군 및 치료불응 막성사구체신염(MGN-R) 환자군의 혈청에서 분리한 엑소좀 내 miRNA의 발현수준을 확인한 결과이다. 도 2a는 치료불응 막성사구체신염 환자군에 비해 치료반응 막성사구체신염 환자군에서 유의적으로 2배 이상(p < 0.05) 발현이 감소 또는 증가한 miRNA의 발현수준에 따른 계층적 클러스터링을 수행한 히트맵 결과이고, 도 2b는 상기에서 검출된 miRNA의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과이다.
도 3은 정상군(HV) 및 치료불응 막성사구체신염(MGN-R) 환자군의 혈청에서 분리한 엑소좀 내 miRNA의 발현수준을 확인한 결과이다. 도 3a는 정상군에 비해 치료불응 막성사구체신염 환자군에서 유의적으로 2배 이상(p < 0.05) 발현이 감소 또는 증가한 miRNA의 발현수준에 따른 계층적 클러스터링을 수행한 히트맵 결과이고, 도 3b는 상기에서 검출된 miRNA의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과이다.
도 4는 상기 도 1, 2 및 3의 결과로부터 발현이 유의하게 증가 또는 감소된 miRNA을 벤다이어그램으로 표현하여 정상군 및 치료반응 막성사구체신염 환자군에 비해 치료불응 막성사구체신염 환자군에서만 발현이 증가 또는 감소된 miRNA를 확인한 결과(23개)이다.
도 5는 상기 도 4에서 확인한 23개의 miRNA 중에서 GFR, 단백뇨, anti-PLA2R IgG 항체 등의 임상양상과 유의한 관련성을 나타내는 8개의 miRNA 발현을 정상군 및 치료반응 막성사구체신염 환자군과 비교한 결과이다.
도 2는 치료반응 막성사구체신염(MGN-W) 환자군 및 치료불응 막성사구체신염(MGN-R) 환자군의 혈청에서 분리한 엑소좀 내 miRNA의 발현수준을 확인한 결과이다. 도 2a는 치료불응 막성사구체신염 환자군에 비해 치료반응 막성사구체신염 환자군에서 유의적으로 2배 이상(p < 0.05) 발현이 감소 또는 증가한 miRNA의 발현수준에 따른 계층적 클러스터링을 수행한 히트맵 결과이고, 도 2b는 상기에서 검출된 miRNA의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과이다.
도 3은 정상군(HV) 및 치료불응 막성사구체신염(MGN-R) 환자군의 혈청에서 분리한 엑소좀 내 miRNA의 발현수준을 확인한 결과이다. 도 3a는 정상군에 비해 치료불응 막성사구체신염 환자군에서 유의적으로 2배 이상(p < 0.05) 발현이 감소 또는 증가한 miRNA의 발현수준에 따른 계층적 클러스터링을 수행한 히트맵 결과이고, 도 3b는 상기에서 검출된 miRNA의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과이다.
도 4는 상기 도 1, 2 및 3의 결과로부터 발현이 유의하게 증가 또는 감소된 miRNA을 벤다이어그램으로 표현하여 정상군 및 치료반응 막성사구체신염 환자군에 비해 치료불응 막성사구체신염 환자군에서만 발현이 증가 또는 감소된 miRNA를 확인한 결과(23개)이다.
도 5는 상기 도 4에서 확인한 23개의 miRNA 중에서 GFR, 단백뇨, anti-PLA2R IgG 항체 등의 임상양상과 유의한 관련성을 나타내는 8개의 miRNA 발현을 정상군 및 치료반응 막성사구체신염 환자군과 비교한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 치료불응 막성사구체신염을 효과적으로 진단할 수 있는 바이오마커 발굴에 예의 노력한 결과, 혈청 유래 엑소좀에 존재하는 마이크로 RNA(miRNAs)를 분석하여 정상군 및 치료반응 막성사구체신염 환자군에 비해 치료불응 막성사구체신염 환자군에서 발현이 유의하게 증가 혹은 감소하는 miRNA를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 hsa-let-7f-1-3p, hsa-miR-12136, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-23a-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-6126 및 hsa-miR-8485로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA를 유효성분으로 포함하는 치료불응 막성사구체신염 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
상기 miRNA는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 혈청, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생물학적 시료에서 유래된 엑소좀(exosome)에서 유래된 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 miRNA는 하기와 같은 서열을 가진다.
1) hsa-let-7f-1-3p : cuauacaaucuauugccuuccc (서열번호 1)
2) hsa-miR-12136 : gaaaaagucauggaggcc (서열번호 2)
3) hsa-miR-1285-3p : ucugggcaacaaagugagaccu (서열번호 3)
4) hsa-miR-23a-5p : gggguuccuggggaugggauuu (서열번호 4)
5) hsa-miR-425-5p : aaugacacgaucacucccguuga (서열번호 5)
6) hsa-miR-483-5p : aagacgggaggaaagaagggag (서열번호 6)
7) hsa-miR-6126 : gugaaggcccggcggaga (서열번호 7)
8) hsa-miR-8485 : cacacacacacacacacguau (서열번호 8)
본 명세서에서, "막성사구체신염(membranous glomerulonephritis, MGN)"은 신조직 소견상 면역 침착으로 사구체 모세혈관 막이 두꺼워지는 질환으로, '막성신증' 또는 '막성사구체병증'이라고도 한다. 형태학적으로는 미만성의 사구체 기저막 비후와 내장상피 하부와 관련하여 과립상의 전자밀도성 면역글로불린의 침착을 특징으로 하는 신질환이다. 35세 이상의 성인에게 가장 흔하게 나타나고, 남성이 여성에 비해 2배 정도 많이 발생한다. 환자의 80％ 정도는 단백뇨, 혈중 알부민의 감소, 지방질 증가, 부종 등 신증후군의 4대 증세가 나타난다.
치료반응 막성사구체신염(MGN-W)의 경우, 치료시작 후 12개월까지 완전관해(단백뇨 300mg/day 미만) 또는 부분관해(단백뇨 50% 이하 감소)이면서 24개월까지 단백뇨가 Nephrotic range(3.5g/day) 이상으로 증가하지 않은 경우를 말하며, 치료불응 막성사구체신염(MGN-R)의 경우, 치료 후 12개월까지의 반응이 부분관해도 달성하지 못하였거나, 부분관해이었지만 그 뒤 추적검사에서 단백뇨가 3.5g/day 이상으로 다시 증가한 경우로 정의할 수 있다.
본 명세서에서, "진단(diagnosis)"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것으로, 본 발명의 목적상 치료불응 막성사구체신염의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하는 것을 의미하며, 치료불응 막성사구체신염 또는 이의 적어도 하나 이상의 증상에 대한 대상의 감수성을 판정하는 것, 테라메트릭스(therametrics)(예를 들어, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것) 등을 포함한다. 또한, 임상 상태의 일차 진단 또는 재발한 질병의 진단을 포함한다.
본 명세서에서, "바이오마커(biomarker)"란 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표로서, 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 이의 변화 여부 등을 확인할 수 있는 물질로, 폴리펩타이드, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함할 수 있고, 이를 이용하여 본 발명과 같이 치료불응 막성사구체신염 여부를 진단할 수 있다.
또한, 본 발명은 hsa-let-7f-1-3p, hsa-miR-12136, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-23a-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-6126 및 hsa-miR-8485로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 치료불응 막성사구체신염 진단용 조성물을 제공한다.
상기 miRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxl group)를 가지는 핵산 서열로, 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 시점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA polymerase 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오타이드 트리포스페이트(nucleotide triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 명세서에서, "프로브(probe)"는 miRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 수 개 내지 수백 개의 염기서열의 단편을 의미하며, 라벨링 되어있어서 상기 miRNA의 존재 유무 및 발현량을 확인할 수 있다. 적절한 프로브 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 치료불응 막성사구체신염 진단용 조성물을 유효성분으로 포함하는 치료불응 막성사구체신염 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 치료불응 막성사구체신염이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 상기 miRNA의 발현수준을 측정하여 치료불응 막성사구체신염 발병 여부를 진단하는 데 사용될 수 있다.
상기 치료불응 막성사구체신염 진단용 키트는 상기 miRNA 발현수준을 측정하는 제제뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 키트는 PCR을 수행하기 위해 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 포함할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 생물학적 시료에서 hsa-let-7f-1-3p, hsa-miR-12136, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-23a-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-6126 및 hsa-miR-8485로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 치료불응 막성사구체신염 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 정보 제공 방법은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 혈액지표 변화 수준을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 혈청, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에서 유래된 엑소좀(exosome)에서 유래된 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 miRNA의 발현 수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray) 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[
실험예
1]
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 분석대상 모집
치료불응 막성사구체신염(이하 MGN-R라 함)을 조기에 진단하고 막성사구체신염 관련 합병증의 발병을 예방하기 위한 MGN-R 진단용 바이오마커를 발굴하기 위해, 정상군(이하 HV라 함) 20명, 치료반응 막성사구체신염(이하 MGN-W라 함) 환자군 9명 및 MGN-R 환자군 10명의 대상자들을 모집하였으며, 상기 각 군의 대상자들로부터 혈청을 제공받았다.
2. 혈청으로부터 RNA 분리 및 서열분석
앞서 각 군의 대상자들로부터 수집한 혈청 샘플에 Exoquick(SBI, USA)을 사용해 엑소좀(exosome)을 분리하였고, 상기 분리된 엑소좀으로부터 Qiagen miRNeasy kit를 이용하여 총 RNA를 추출하였으며, 추출된 총 RNA의 질은 Agilent RNA Bioanalyzer를 이용해 제조사의 지시에 따라 측정하였다.
이후 상기 분리된 RNA를 이용하여 Takara SMARTer smRNA for illumina kit(마이크로젠)를 사용하여 라이브러리를 제작한 후 Hiseq 2500으로 차세대 염기서열 분석(NGS)을 실시하여 microRNA를 검출하였다.
[실시예 1] MGN-R 진단용 마이크로 RNA(micro RNA) 발굴
1. HV vs MGN-W에서 발현 수준 차이를 나타내는 micro RNA 확인
먼저, 상기 실험예와 같이 모집된 HV 20명 및 MGN-W 환자군 9명의 혈액 유래 엑소좀에서 발현수준의 차이가 나는 micro RNA(miRNA)를 동정하기 위하여, 상기 실험예와 같이 각 대상자들에서 채취한 혈청으로부터 엑소좀을 분리하고 추출된 총 RNA에 대한 NGS 분석을 수행하였다. 분석 결과 233개의 miRNAs가 검출되었으며, 상기 검출된 miRNAs의 발현수준을 비교하였다.
그 결과, 도 1a와 같이 233개의 miRNAs 중에 HV에 비해 MGN-W 환자군에서 2배 이상(p < 0.05) 발현이 증가하는 miRNA가 21개, 발현이 감소하는 miRNA가 23개인 것을 확인하였다. 또한, 상기 유의한 발현 변화를 보이는 miRNAs의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과를 도 1b와 같이 확인하였다.
2. MGN-W vs MGN-R의 발현 수준에 차이가 있는 micro RNA 분석
상기 MGN-W 환자군 9명 및 MGN-R 환자군 10명의 혈액 유래 엑소좀에서 발현 수준의 차이가 나는 miRNA를 동정하기 위하여, 상기와 동일한 방법으로 얻은 엑소좀 내 총 RNA에 대한 NGS 분석을 수행하였다. 분석결과 233개의 miRNA가 검출되었으며, 상기 검출된 miRNAs의 발현수준을 비교하였다.
그 결과, 도 2a와 같이 233개의 miRNAs 중에 MGN-R 환자군에 비해 MGN-W 환자군에서 2배 이상(p < 0.05) 발현이 증가하는 miRNA가 24개, 발현이 감소하는 miRNA가 18개인 것을 확인하였다. 또한, 상기 유의한 발현 변화를 보이는 miRNA의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과를 도 2b와 같이 확인하였다.
3. HV vs MGN-R의 발현 수준에 차이가 있는 microRNA 확인
상기 HV 20명 및 MGN-R 환자군 10명의 혈액 유래 엑소좀에서 발현 수준의 차이가 나는 miRNA를 동정하기 위하여, 상기와 동일한 방법으로 얻은 엑소좀 내 총 RNA에 대한 NGS 분석을 수행하였다. 분석결과 233개의 miRNA가 검출되었으며, 상기 검출된 miRNAs의 발현수준을 비교하였다.
그 결과, 도 3a와 같이 233개의 miRNAs 중에 HV에 비해 MGN-R 환자군에서 2배 이상(p < 0.05) 발현이 증가하는 miRNA가 37개, 발현이 감소하는 miRNA가 40개인 것을 확인하였다. 또한, 상기 유의한 발현 변화를 보이는 miRNAs의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과를 도 3b와 같이 확인하였다.
4. MGN-R 진단용 microRNA 확인
상기 확인된 결과로부터 MGN-R을 특이적으로 진단할 수 있는 miRNA를 발굴하기 위해, 상기 분석결과 발현이 유의하게 증가 또는 감소하는 것으로 확인된 miRNA를 도 4와 같이 벤다이어그램으로 나타내었다.
그 결과, 표 1과 같이 HV 및 MGN-W 환자군에 비해 MGN-R 환자군에서 발현이 유의하게 증가 또는 감소한 miRNA 23종을 확인하였고, 상기 miRNA 중 표 2와 같이 GFR, 단백뇨, anti-PLA2R IgG 항체 등의 임상양상과 유의한 관련성을 나타내는 8종의 miRNA(hsa-let-7f-1-3p, hsa-miR-12136, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-23a-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-6126 및 hsa-miR-8485)를 최종 선별하였으며, 도 5에서 HV, MGN-W 환자군 및 MGN-R 환자군에서 그 발현을 차이를 나타내었고 각각의 서열은 표 3과 같다.
| 불응군/정상군 | 반응군/불응군 | |||
| Mature_ID | Fold change | p-value | Fold change | p-value |
| hsa-let-7f-1-3p | -2.39 | 0.0003 | 2.35 | 0.0081 |
| hsa-miR-106b-3p | -3.77 | 0.0001 | 3.23 | 0.0008 |
| hsa-miR-12136 | 2.66 | 0.0002 | -4.35 | 0.0006 |
| hsa-miR-1273c | 4.63 | 0.0000 | -4.15 | 0.0010 |
| hsa-miR-1285-3p | 4.64 | 0.0000 | -3.10 | 0.0028 |
| hsa-miR-145-3p | 7.27 | 0.0001 | -9.24 | 0.0012 |
| hsa-miR-148b-3p | -7.70 | 0.0007 | 8.45 | 0.0007 |
| hsa-miR-15b-3p | -2.08 | 0.0025 | 2.72 | 0.0059 |
| hsa-miR-181a-5p | -6.09 | 0.0001 | 4.20 | 0.0194 |
| hsa-miR-224-5p | -15.56 | 0.0000 | 8.43 | 0.0010 |
| hsa-miR-23a-5p | 2.59 | 0.0004 | -2.26 | 0.0227 |
| hsa-miR-30b-5p | -5.44 | 0.0001 | 4.32 | 0.0173 |
| hsa-miR-331-3p | -4.21 | 0.0001 | 2.80 | 0.0201 |
| hsa-miR-425-5p | -2.33 | 0.0000 | 2.23 | 0.0028 |
| hsa-miR-483-5p | 4.67 | 0.0000 | -3.07 | 0.0095 |
| hsa-miR-548aa | 2.38 | 0.0080 | -4.12 | 0.0007 |
| hsa-miR-548t-3p | 2.38 | 0.0081 | -4.12 | 0.0007 |
| hsa-miR-5684 | 4.17 | 0.0000 | -6.52 | 0.0016 |
| hsa-miR-6126 | 3.73 | 0.0000 | -2.28 | 0.0074 |
| hsa-miR-625-3p | -4.25 | 0.0000 | 3.29 | 0.0181 |
| hsa-miR-642a-3p | 2.49 | 0.0096 | -2.95 | 0.0390 |
| hsa-miR-6873-3p | 3.10 | 0.0071 | -3.76 | 0.0253 |
| hsa-miR-8485 | 3.21 | 0.0000 | -2.56 | 0.0104 |
| GFR | 24시간 단백뇨 (진단 시) |
24시간 단백뇨 (진단 후 12개월) |
Anti-PLA2R Ab | |||||
| r | p | r | p | r | p | r | p | |
| hsa-let-7f-1-3p | 0.075 | 0.665 | -0.370 | 0.027 | -0.560 | 0.046 | 0.125 | 0.656 |
| hsa-miR-12136 | -0.460 | 0.003 | 0.043 | 0.793 | 0.398 | 0.159 | 0.233 | 0.353 |
| hsa-miR-1285-3p | -0.251 | 0.129 | 0.447 | 0.005 | 0.648 | 0.012 | 0.391 | 0.108 |
| hsa-miR-23a-5p | -0.185 | 0.272 | 0.375 | 0.022 | 0.154 | 0.616 | 0.616 | 0.008 |
| hsa-miR-425-5p | 0.163 | 0.321 | -0.366 | 0.022 | -0.376 | 0.185 | -0.006 | 0.981 |
| hsa-miR-483-5p | -0.366 | 0.022 | 0.372 | 0.020 | 0.059 | 0.840 | 0.274 | 0.270 |
| hsa-miR-6126 | -0.228 | 0.163 | 0.504 | 0.001 | 0.376 | 0.185 | 0.157 | 0.535 |
| hsa-miR-8485 | -0.228 | 0.163 | 0.289 | 0.074 | 0.640 | 0.014 | 0.390 | 0.110 |
| NO. | miRNA | sequence |
| 1 | hsa-let-7f-1-3p | cuauacaaucuauugccuuccc |
| 2 | hsa-miR-12136 | gaaaaagucauggaggcc |
| 3 | hsa-miR-1285-3p | ucugggcaacaaagugagaccu |
| 4 | hsa-miR-23a-5p | gggguuccuggggaugggauuu |
| 5 | hsa-miR-425-5p | aaugacacgaucacucccguuga |
| 6 | hsa-miR-483-5p | aagacgggaggaaagaagggag |
| 7 | hsa-miR-6126 | gugaaggcccggcggaga |
| 8 | hsa-miR-8485 | cacacacacacacacacguau |
상기 결과로부터 각각 HV 및 MGN-W 환자군에 비해 MGN-R 환자군에서만 발현이 유의하게 증가하거나 감소하는 상기 8종의 miRNAs는 MGN-R을 특이적으로 진단할 수 있는 바이오마커로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
[실시예 2] 혈액 지표 확인
상기 실험예에서 수집된 HV 20명, MGN-W 환자군 9명 및 MGN-R 환자군 10명의 혈청에서 다양한 지표의 수준변화는 표 4와 같고, MGN-W 환자군 및 MGN-R 환자군 사이에 유의한 차이는 없었다.
| HV(n=20) | MGN-W(n=9) | MGN-R(n=10) | P value* | |
| Age | 53±11 | 56(37~74) | 59(36~84) | 0.702 |
| Male, n(%) | 11(55) | 5(56) | 6(60) | 0.605 |
| DM, n(%) | 0(0) | 6(67) | 5(50) | 0.395 |
| Hypertension, n(%) | 0(0) | 7(78) | 4(40) | 0.115 |
| Hemoglobin(mg/dl) | 13.9±1.2 | 12.8(11.1~15.1) | 12.5(10.0~18.0) | 0.447 |
| Serum albumin(mg/dl) | 4.6±0.2 | 2.2(1.6~3.6) | 2.3(1.5~3.0) | 0.968 |
| Triglyceride(mg/dl) | 116±53 | 242(146~871) | 209(123~611) | 0.447 |
| eGFR(ml/min/1.73m2) | 83±16 | 89(42~110) | 75(48~109) | 0.549 |
| BUN(mg/dL) | 13.9±3.2 | 13.5±6.1 | 15.3±5.5 | 0.673 |
| Cr(mg/dL) | 0.89±0.17 | 0.85±0.10 | 1.01±0.29 | 0.232 |
| 24h-proteinuria (baseline) |
85±54 | 6462(110~17296) | 8084(2148~13044) | 0.356 |
| * P value; MGN-W vs MGN-R HVs-Health volunteers, eGFR-estimated glomerular filtration rate |
||||
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University
Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation
<120> Biomarker composition for diagnosing refractory membranous
glomerulonephritis and use thereof
<130> ADP-2022-0055
<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Unknown
<220>
<223> hsa-let-7f-1-3p
<400> 1
cuauacaauc uauugccuuc cc 22
<210> 2
<211> 18
<212> RNA
<213> Unknown
<220>
<223> hsa-miR-12136
<400> 2
gaaaaaguca uggaggcc 18
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> Unknown
<220>
<223> hsa-miR-1285-3p
<400> 3
ucugggcaac aaagugagac cu 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> Unknown
<220>
<223> hsa-miR-23a-5p
<400> 4
gggguuccug gggaugggau uu 22
<210> 5
<211> 23
<212> RNA
<213> Unknown
<220>
<223> hsa-miR-425-5p
<400> 5
aaugacacga ucacucccgu uga 23
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> Unknown
<220>
<223> hsa-miR-483-5p
<400> 6
aagacgggag gaaagaaggg ag 22
<210> 7
<211> 18
<212> RNA
<213> Unknown
<220>
<223> hsa-miR-6126
<400> 7
gugaaggccc ggcggaga 18
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> Unknown
<220>
<223> hsa-miR-8485
<400> 8
cacacacaca cacacacgua u 21
Claims (9)
- hsa-let-7f-1-3p, hsa-miR-12136, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-23a-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-6126 및 hsa-miR-8485로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA를 유효성분으로 포함하는 치료불응 막성사구체신염 진단용 바이오마커 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 miRNA는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 혈청, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생물학적 시료에서 유래된 엑소좀(exosome)에서 유래된 것을 특징으로 하는 치료불응 막성사구체신염 진단용 바이오마커 조성물.
- hsa-let-7f-1-3p, hsa-miR-12136, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-23a-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-6126 및 hsa-miR-8485로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 치료불응 막성사구체신염 진단용 조성물.
- 청구항 3에 있어서, 상기 miRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 치료불응 막성사구체신염 진단용 조성물.
- 청구항 3 또는 청구항 4의 조성물을 유효성분으로 포함하는 치료불응 막성사구체신염 진단용 키트.
- 개체로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계; 및
상기 분리된 생물학적 시료에서 hsa-let-7f-1-3p, hsa-miR-12136, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-23a-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-6126 및 hsa-miR-8485로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 치료불응 막성사구체신염 진단을 위한 정보 제공 방법. - 청구항 6에 있어서, 상기 정보 제공 방법은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 혈액지표 변화 수준을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 치료불응 막성사구체신염 진단을 위한 정보 제공 방법.
- 청구항 6 또는 청구항 7에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 혈청, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에서 유래된 엑소좀(exosome)에서 유래된 것을 특징으로 하는 치료불응 막성사구체신염 진단을 위한 정보 제공 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 miRNA의 발현수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray) 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 치료불응 막성사구체신염 진단을 위한 정보 제공 방법.
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-
2022
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