KR20230128410A - 약제, 용도 및 방법 - Google Patents

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린다 마르텐손
마크 크라그
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Abstract

불응성 암 및/또는 재발한 암의 치료에서 사용하기 위한 항체 분자 및 제제를 포함하는 조성물, 및 항체 분자 및 제제를 투여하는 것을 포함하는 불응성 암 및/또는 재발한 암을 치료하는 방법이 기재된다. 또한 항체 분자 및 제제를 포함하는 키트가 기재된다.

Description

약제, 용도 및 방법{MEDICAMENTS, USES AND METHODS}
본 발명은 불응성 암 및/또는 재발한 암의 치료에서 사용하기 위한 항체 분자 및 제제(agent)를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항체 분자 및 제제를 투여하는 것을 포함하는 불응성 암 및/또는 재발한 암의 치료 방법에 관한 것이다. 또한 항체 분자 및 제제를 포함하는 키트가 기재된다.
치료적 항체는 면역계와 연계된 신규한 메커니즘을 밝히는 변형된 암 요법을 갖는다. 예를 들면, 항체가 치료적 효과를 행사할 수 있는 메커니즘은 천연 이펙터 시스템, 예를 들면, 세포독성 세포(예를 들면, 대식세포) 및 효소(예를 들면, 보체)의 모집을 통해 암 및 기타 원치않는 세포의 제거를 자극한 다음, 항체 분자가 결합된 세포를 표적화하는 것이다.
CD20 특이적 단클론 항체(mAb) 리툭시맙은 암 면역요법용으로 승인된 첫번째 항체이고, 이는 여포성 림프종(FL), 미만성 거대 세포 B 세포 림프종(DLBCL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 및 맨틀 세포 림프종(MCL)을 포함하는 CD20 발현 B 세포 암을 갖는 환자에게 광범위하게 투여되어 왔다(문헌[Lim, S.H., et al., Anti-CD20 monoclonal antibodies: historical and future perspectives. Haematologica 95, 135-143(2010)]에서 검토됨).
항체 요법이 효과적임에도 불구하고, 일부 경우에 환자는 항체 요법에 내성을 얻게 될 것이고, 이는 치료가 효과적이지 않게 되고 암이 악화되는 것을 야기할 것이다. 기타 경우에, 암은 암 요법에 전혀 반응하지 않을 수 있다.
불행하게도, 재발한 암 및/또는 불응성 암에 대한 효과적인 치료적 항체 치료가 여전히 부족하다. 암의 몇몇 유형의 치료를 위해 개발되고 있는 항체 요법의 증가된 수와 함께, 이러한 요법에 대한 암 세포 내성을 이해하고 이러한 내성을 극복하는 약물을 개발하는 최근 생겨난 필요가 존재한다.
예를 들면, 리툭시맙 반응성 림프종 중에서, 몇몇 개체는 첫번째 치료에 내성을 보이거나, 리툭시맙-함유 병용 요법에 내성을 갖게 된다. 리툭시맙 이외에, 림프종은 또한 다른 항체 요법; 예를 들면, 항체 분자 오파투무맙(CD20에 결합됨) 또는 알렘투주맙(CD52에 결합됨)에 내성을 나타낼 수 있다.
그러한 배경과 반대로, 본 발명자들은 놀랍게도 항체 분자의 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb 결합을 방지하거나 감소시키는 항체 및 제제를 포함하는 치료가 재발한 암 및/또는 불응성 암을 치료하는데 사용될 수 있는 것으로 확인하였다.
FcγRIIb와 치료적 항체 리툭시맙의 상호작용을 저해하는 것은 항체의 재순환을 감소시키고 만성 림프구성 백혈병 및 맨틀 세포 림프종의 치료에서 리툭시맙의 효능을 개선시킬 수 있는 것으로 이전에 나타났다(문헌[Lim, S.H., et al. Fc gamma receptor IIb on target B cells promotes rituximab internalization and reduces clinical efficacy. Blood(2011)] 및 제WO 2012/022985호).
치료적 항체의 활성은 Fc 감마 수용체(FcγR)와 이의 상호작용에 의해 부분적으로 지배되는 것으로 추가로 알려져 있다. 특히, 이는 많은 IgG를 설명하는 FcγR의 상대적인 발현 수준, 친화도 및 활성이다(문헌[Nimmerjahn, F. & Ravetch, J.V. FcgammaRs in health and disease. Curr Top Microbiol Immunol 350, 105-125(2011), 및 Nimmerjahn, F. & Ravetch, J.V. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews 8, 34-47(2008)]에서 검토됨).
그러나, 본 발명의 발명자들은 현재 놀랍게도 항체 분자의 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb 결합을 방지하거나 감소시키는 항체 및 제제를 포함하는 병용 요법이 재발한 암 및/또는 불응성 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 증명하였다. 따라서, 본 발명은 재발한 암 및/또는 불응성 암을 갖는 환자의 하위그룹을 치료하기 위한 방법 및 용도를 제공한다.
다시 말해서, 본 발명의 발명자들은 대상체의 암이 이에 반응하지 않는(즉, 내성이 있는) 항체를 포함하는 병용 요법이, 항체 분자의 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb 결합을 방지하거나 감소시키는 제제와 병용으로, 항체에 대한 암의 내성의 감소 및/또는 극복에 의해 재발한 암 및/또는 불응성 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 증명하였다.
본 분할출원은 원출원(대한민국 특허출원 제10-2016-7034598호)의 최초 기재된 모든 발명 대상을 포함한다.
제1 측면에 있어서, 본 발명은,
(i) 표적 세포의 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체 분자로서, FcγRIIb와 결합할 수 있는 Fc 도메인을 갖는 상기 항체 분자를;
(ii) 항체 분자의 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합을 방지하거나 감소시키는 제제와 병용하여 포함하되;
조성물이 대상체에서 재발한 암 및/또는 불응성 암의 치료에서 사용하기 위한 것이고, 대상체가 FcγRIIb를 발현하는 표적 세포를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
제2 측면에 있어서, 본 발명은,
(i) 표적 세포의 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체 분자로서, FcγRIIb와 결합할 수 있는 Fc 도메인을 갖는 상기 항체 분자를;
(ii) 항체 분자의 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합을 방지하거나 감소시키는 제제와 병용하여 포함하되;
용도가 대상체에서 재발한 암 및/또는 불응성 암의 치료에서 사용하기 위한 약제의 제조이고, 대상체가 FcγRIIb를 발현하는 표적 세포를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
제3 측면에 있어서, 본 발명은, 대상체에서 재발한 암 및/또는 불응성 암을 치료하는 방법으로서,
(i) 표적 세포의 세포 표면 항원과 특이적으로 결합하는 항체 분자로서, FcγRIIb와 결합할 수 있는 Fc 도메인을 갖는 상기 항체 분자를;
(ii) 항체 분자의 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합을 방지하거나 감소시키는 제제와 병용으로 투여하는 것을 포함하되;
대상체가 재발한 암 및/또는 불응성 암을 갖는 것과 대상체가 FcγRIIb를 발현하는 표적 세포를 갖는 것을 기반으로 선택되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
제4 측면에 있어서, 본 발명은, 대상체에서 재발한 암 및/또는 불응성 암의 치료에서 사용하기 위한 키트로서,
(i) 표적 세포의 세포 표면 항원과 특이적으로 결합하는 항체 분자로서, FcγRIIb와 결합할 수 있는 Fc 도메인을 갖는 항체 분자;
(ii) 항체 분자의 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합을 방지하거나 감소시키는 제제;
(iii) 리툭시맙; 리툭시맙 바이오시밀러; 오파투무맙; 오비누투주맙; 알렘투주맙; 갈릭시맙; 토시투모맙; 방사성 접합된 토시투모맙; 이브리투모맙; 방사성 접합된 이브리투모맙; 항-CD40 항체; 항-CD19 항체; 항-CD37 항체; B 세포 암을 치료하는데 사용되는 치료적 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하고;
용도가 대상체에서 재발한 암 및/또는 불응성 암의 치료를 위한 것이고, 대상체가 FcγRIIb를 발현하는 표적 세포를 갖는 것을 특징으로 하는 키트를 제공한다.
본 발명의 제4 측면의 바람직한 실시형태에 있어서, 하나 이상의 성분은 리툭시맙(또는 리툭시맙 바이오시밀러) 및 오파투무맙; 또는 리툭시맙(또는 리툭시맙 바이오시밀러) 및 오비누투주맙을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명의 제4 측면의 대안적인 바람직한 실시형태에 있어서, 하나 이상의 성분은 알렘투주맙 및 항-CD40 항체; 알렘투주맙 및 항-CD19 항체; 알렘투주맙 및 항-CD37 항체; 또는 알렘투주맙 및 항-CD40 항체 및 항-CD19 항체 및 항-CD37 항체를 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명의 제4 측면의 대안적인 바람직한 실시형태에 있어서, 하나 이상의 성분은 B 세포 암을 치료하는데 사용되는 치료적 항체, 예를 들면, 갈릭시맙을 포함하거나 이로 이루어진다.
항체 분자는 면역학 및 분자 생물학 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 항체 분자는 체액성 면역계의 구성원이고, 신체에 이질적인 대상, 예를 들면, 박테리아 및 바이러스를 식별하고 중화시키는 이펙터 B 세포에 의해 생성된 단백질이다.
전형적으로, 항체 분자는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 항체 분자 중쇄는 1개의 가변 도메인 및 3개의 불변 도메인을 포함하고, 항체 분자 경쇄는 1개의 가변 도메인 및 1개의 불변 도메인을 포함한다. 가변 도메인(때때로 총괄하여 FV 영역으로 지칭됨)은 항체의 표적에 결합하고, 각각의 가변 도메인은 상보적 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 3개의 루프를 포함하고, 이는 표적 결합의 원인이다.
따라서, 용어 "항체 분자"에, 본 발명자들은 단클론 항체, 또는 다클론 항체, 또는 합성 항체, 또는 재조합적으로 생성된 항체, 또는 다중-특이적 항체, 또는 이중-특이적 항체, 또는 인간 항체, 또는 인간화된 항체, 또는 키메라 항체, 또는 카멜화된(camelized) 항체, 또는 단쇄 Fv(scFv), 또는 단쇄 항체, 또는 Fab 단편, 또는 F(ab') 단편, 또는 이황화-결합된 Fv(sdFv), 또는 세포내항체, 또는 항체 중쇄, 또는 항체 경쇄, 또는 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 호모다이머 또는 헤테로다이머, 또는 항원 결합 기능적 단편 또는 이의 유도체, 또는 IgG, 또는 IgG1, 또는 IgG2, 또는 IgG3, 또는 IgG4, 또는 IgA, 또는 IgM, 또는 IgD, 또는 IgE를 포함하는 항체 분자 및 이의 기능적 단편의 모든 유형 및 부류를 포함한다.
항체 분자는 지정된 표적 분자와 특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있다. 다시 말해서, 항체 분자는 이의 표적과 우선적으로, 그리고 선택적으로 결합하고, 표적이 아닌 분자에는 그렇지 않다.
단백질 결합을 평가하는 방법은 생화학 및 면역학 분야의 숙련가에게 알려져 있다. 당해 분야의 숙련가에게 이러한 방법은 표적에 대한 항체 분자의 결합 및/또는 Fc 수용체에 대한 항체의 Fc 도메인의 결합; 뿐만 아니라 이러한 상호작용에서 상대적인 강도, 또는 특이성, 또는 저해, 또는 방지, 또는 감소를 평가하는데 사용될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 단백질 결합을 평가하는데 사용될 수 있는 방법의 예는, 예를 들면, 면역분석, 비아코어(BIAcore), 웨스턴 블롯, 방사면역분석(RIA) 및 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)이다(항체 특이성과 관련된 논의는 문헌[Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York at pages 332-336(1989)]을 참조한다).
따라서, "특이적으로 결합하는 항체 분자"에, 본 발명자들은 항체 분자가 특이적으로 표적에 결합하지만, 비표적에 결합하지 않거나 표적보다 더 약하고(예를 들면, 더 낮은 친화도로) 비표적에 결합한다는 것을 포함한다.
본 발명자들은 또한 항체 분자가 비표적보다 적어도 2배 더 강하게, 또는 적어도 5배 더 강하게, 또는 적어도 10배 더 강하게, 또는 적어도 20배 더 강하게, 또는 적어도 50배 더 강하게, 또는 적어도 100배 더 강하게, 또는 적어도 200배 더 강하게, 또는 적어도 500배 더 강하게, 또는 적어도 약 1000배 더 강하게 표적에 특이적으로 결합하는 의미를 포함한다.
추가로, 본 발명자들은 항체 분자가 적어도 약 10-1 Kd, 또는 적어도 약 10-2 Kd, 또는 적어도 약 10-3 Kd, 또는 적어도 약 10-4 Kd, 또는 적어도 약 10-5 Kd, 또는 적어도 약 10-6 Kd, 또는 적어도 약 10-7 Kd, 또는 적어도 약 10-8 Kd, 또는 적어도 약 10-9 Kd, 또는 적어도 약 10-10 Kd, 또는 적어도 약 10-11 Kd, 또는 적어도 약 10-12 Kd, 또는 적어도 약 10-13 Kd, 또는 적어도 약 10-14 Kd, 또는 적어도 약 10-15 Kd의 Kd로 표적에 결합하는 경우, 표적에 특이적으로 결합하는 의미를 포함한다.
항체 분자의 또 다른 중요한 부분은 Fc 도메인(단편 결정화 가능 도메인으로도 알려짐)이고, 이는 각각의 항체 분자 중쇄의 2개의 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인은 항체 분자와 Fc 수용체 사이의 상호작용의 원인이 된다.
Fc 수용체는 면역계 세포의 세포 표면에서 종종 발견되는 막 단백질이다(즉, Fc 수용체는 원형질 막 또는 세포질 막으로도 알려진 표적 세포 막에서 발견된다). Fc 수용체의 역할은 Fc 도메인을 통해 항체와 결합하는 것 및 항체를 세포 내로 내재화하는 것이다. 면역계에서, 이는 항체-매개된 식균작용 및 항체-의존성 세포-매개된 세포독성을 야기할 수 있다.
본 발명에 포함된 Fc 수용체의 예는 FcγRIIb(CD32, CD32B, CD32B1, CD32B2, FcRII, FcγRII 또는 FcRIIB로도 알려짐)이고, 이는 항체에 대한 결합 및 재순환의 원인이 되는 저해성 Fc 수용체이다.
따라서, "FcγRIIb와 결합할 수 있는 Fc 도메인"에, 본 발명자들은 본 발명의 항체 분자의 Fc 도메인이 FcγRIIb와 결합할 수 있고, 바람직하게는 또 다른 단백질, 또는 펩타이드, 또는 폴리펩타이드, 또는 Fc 수용체에 결합하는 항체 분자보다 적어도 2배 더 강하게, 또는 적어도 5배 더 강하게, 또는 적어도 10배 더 강하게, 또는 적어도 약 20배 더 강하게, 또는 적어도 50배 더 강하게, 또는 적어도 100배 더 강하게, 또는 적어도 200배 더 강하게, 또는 적어도 500배 더 강하게, 또는 적어도 1000배 더 강하게 결합한다는 것을 포함한다.
본 발명의 제제는 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합을 방지하거나 감소시키고, 이는 항체 분자의 세포 내로의 내재화를 방지하거나 감소시킨다.
본 발명의 제제를 구성할 수 있는 것 및 본 발명의 제제를 식별하는 방법은 분자 생물학 분야의 숙련가에게 용이하게 명백할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 제제는 웨스턴 블롯팅에 의해 검출된 바와 같은 세포내 면역수용체 티로신계 저해성(ITIM) 모티프에서 티로신-293의 인산화에 의해 지시되는 바와 같은, FcγRIIb의 자극 또는 신호전달을 차단하는 제제에 대한 스크리닝에 의해 식별될 수 있다. 예를 들면, Raji 세포는 인산화 FcγRIIb(WO 2012/022985)의 면역블롯팅 전에 항-FcγRIIb 시험 제제의 존재 또는 부재하에 세포 표면 항원에 대한 항체 분자, 예를 들면, 항-CD20 리툭시맙과 함께 배양될 수 있다.
본 명세서에 참고로서 포함된 문헌[Neubig et al(2003) Pharmacol. Rev. 55, 597-606]에는 항체 분자의 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb 결합을 방지하거나 감소시키는 제제를 식별하기 위하여 스크리닝될 수 있는 분자의 다양한 부류가 기재된다.
본 발명의 제제는 작은 유기 잔기, 또는 작은 무기 잔기, 또는 펩타이드, 또는 폴리펩타이드, 또는 펩타이드모방체, 또는 핵산, 또는 펩타이드 핵산(PNA), 또는 앱타머, 또는 지질, 또는 탄수화물, 또는 항체 분자일 수 있다.
"FcγRIIb 결합을 방지하거나 감소시키는 제제"에, 본 발명자들은 항체 분자의 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합을 완전하게 차단하거나 항체 분자의 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합을 부분적으로 차단하는 제제를 포함한다.
"완전하게 차단함"에, 본 발명자들은 FcγRIIb와 항체 분자의 Fc 도메인 사이의 검출 가능한 결합이 존재하지 않는다는 것을 포함한다. "부분적으로 차단함"에, 본 발명자들은 제제의 존재하에 FcγRIIb와 항체 분자의 Fc 도메인 사이의 검출 가능한 결합이 제제의 부재하에 FcγRIIb와 항체 분자의 Fc 도메인 사이의 검출 가능한 결합보다 낮다는 것을 포함한다.
제제는 입체 장애, 및/또는 항체 분자에 대한 결합, 및/또는 Fc 도메인에 대한 결합, 및/또는 FcγRIIb에 대한 결합, 및/또는 항체 분자에 대한 결합 및 FcγRIIb와의 접촉 차단, 및/또는 Fc 도메인에 대한 결합 및 FcγRIIb와의 접촉 차단, 및/또는 FcγRIIb와의 결합 및 Fc 도메인과의 접촉 차단에 의하여 FcγRIIb 결합을 방지하거나 감소시킬 수 있다.
본 발명자들은 또한 제제의 존재하에 결합이 제제의 부재하에 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합의 약 90% 미만, 또는 약 80% 미만, 또는 약 70% 미만, 또는 약 60% 미만, 또는 약 50% 미만, 또는 약 40% 미만, 또는 약 30% 미만, 또는 약 20% 미만, 또는 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만, 또는 약 1% 미만인 경우, 제제가 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합을 감소시킨다는 것을 포함한다.
본 발명자들은 추가로 제제의 부재하에 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합보다 제제의 존재하에 결합이 적어도 2배 더 약하고, 또는 적어도 5배 더 약하고, 또는 적어도 10배 더 약하고, 또는 적어도 20배 더 약하고, 또는 적어도 50배 더 약하고, 또는 적어도 100배 더 약하고, 또는 적어도 200배 더 약하고, 또는 적어도 500배 더 약하고, 또는 적어도 1000배 더 약한 경우, 제제는 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합을 감소시킨다는 것을 포함한다.
본 발명자들은 제제의 존재하에 결합이 검출 가능하지 않은 경우, 또는 결합이 검출 가능하지만 검출 가능한 결합이 무시할 만한 양인 경우, 제제가 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합을 방지하는 것으로 포함한다.
본 발명에 포함된 항체 분자 표적의 예는 항체 분자에 대한 에피토프(당해 내용에서 세포 표면 에피토프로도 알려짐)일 것인 세포 표면 항원이다. 세포 표면 항원 및 에피토프는 면역학 또는 세포 생물학 분야의 숙련가에게 용이하게 이해될 용어이다.
"세포 표면 항원"에, 본 발명자들은 세포 표면 항원이 세포 막의 세포외 면에 노출되지만, 오직 세포 막의 세포외 면에 일시적으로 노출될 수 있다는 것을 포함한다. "일시적으로 노출됨"에, 본 발명자들은 세포 표면 항원이 세포 내로 내재화될 수 있거나, 세포 막의 세포외 면으로부터 세포외 공간으로 방출될 수 있다는 것을 포함한다. 세포 표면 항원은 절단에 의해 세포 막의 세포외 면으로부터 방출될 수 있고, 이는 프로테아제에 의해 매개될 수 있다.
본 발명자들은 또한 세포 표면 항원이 세포 막에 연결될 수 있지만, 오직 세포 막과 일시적으로 연관될 수 있다는 것을 포함한다. "일시적으로 연관됨"에, 본 발명자들은 세포 표면 항원이 세포 막의 세포외 면으로부터 세포외 공간으로 방출될 수 있다는 것을 포함한다. 세포 표면 항원은 절단에 의해 세포 막의 세포외 면으로부터 방출될 수 있고, 이는 프로테아제에 의해 매개될 수 있다.
본 발명자들은 세포 표면 항원이 펩타이드, 또는 폴리펩타이드, 또는 탄수화물, 또는 올리고당 쇄, 또는 지질; 및/또는 단백질, 또는 당단백질, 또는 지단백질로 존재할 수 있는 에피토프일 수 있다는 것을 추가로 포함한다.
본 발명에 의해 치료되는 질환은 재발한 암 및/또는 불응성 암이다.
재발한 암은 이전에 치료된 적이 있고, 그 치료의 결과로서, 대상체가 완전하거나 부분적인 회복을 갖지만(즉, 대상체는 관해(즉, 차도)(remission)가 있다고 함), 치료의 중단 후, 암이 다시 시작되거나 악화된 암이다. 다르게 말하면, 재발한 암은 이것이 효과적이고 대상체가 완전하게 또는 부분적으로 회복되는 일정 기간 후, 치료에 내성을 갖게 된 것이다.
획득된 내성으로 인하여, 암이 재발한 암, 또는 재발한 암 및 불응성 암일 수 있다는 것이 인식될 것이다. "획득된 내성"에, 본 발명자들은 암 및/또는 대상체 및/또는 표적 세포가 처음으로 투여되기 전에는 특정한 치료에 내성이 없지만 처음으로 투여된 후 또는 적어도 처음으로 투여되는 동안, 예를 들면, 치료가 투여된 두번째 후, 세번째 후, 네번째 후, 다섯번째 후, 여섯번째 후, 일곱번째 후, 여덟번째 후, 아홉번째 후, 열번째 후, 열한번째 후, 열두번째 후, 내성이 생긴다는 것을 포함한다.
본 발명의 내용 내에서, 재발한 암이 이전에 항체로 치료되었고, 그 항체에 내성이 생긴 것이 바람직하다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 이러한 재발한 암을 갖는 환자의 하위그룹을 치료하는 수단을 제공하고, 즉, 본 발명은 항체에 의한 치료에 내성이 있는 재발한 암을 갖는 대상체를 치료하는 수단을 제공한다.
본 발명의 내용 내에서, 재발한 암이 본 명세서에서 정의된 바와 같은 항체 분자로 이전에 치료되었고, 그 항체 분자에 내성이 생긴 것이 추가로 바람직하다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 이러한 재발한 암을 갖는 환자의 하위그룹을 치료하는 수단을 제공하고, 즉, 본 발명은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 항체 분자에 내성이 있는 재발한 암을 갖는 대상체를 치료하는 수단을 제공한다.
본 발명은 따라서 암이 내성이 있는 동일한 항체 분자를 사용하는, 대상체에서 암을 치료하는 수단을 제공하는 것으로 인식될 것이다. 불응성 암은 치료되었지만 그 치료에 반응하지 않는 암 및/또는 치료되었지만 치료 동안 진행된 암이다. 다르게 말하면, 불응성 암은 치료에 내성이 있는 암이다.
암은 고유한 내성으로 인하여 불응성 암일 수 있다는 것이 인식될 것이다. "고유한 내성"에, 본 발명자들은 암 및/또는 대상체 및/또는 표적 세포가 처음으로 투여될 때부터 특정한 치료에 내성이 있다는 의미를 포함한다.
본 발명의 내용 내에서, 불응성 암은 항체로 이전에 치료되었지만 그 항체에 내성이 있는 것이 바람직하다. 본 명세서에 논의된 바와 같이, 본 발명은 이러한 불응성 암을 갖는 환자의 하위그룹을 치료하는 수단을 제공하고, 즉, 본 발명은 항체에 의한 치료에 내성이 있는 불응성 암을 갖는 대상체를 치료하는 수단을 제공한다.
본 발명의 내용 내에서, 불응성 암은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 항체 분자로 이전에 치료되었지만, 그 항체 분자에 내성이 있는 것이 추가로 바람직하다. 본 명세서에 논의된 바와 같이, 본 발명은 이러한 불응성 암을 갖는 환자의 하위그룹을 치료하는 수단을 제공하고, 즉, 본 발명은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 항체 분자에 내성이 있는 불응성 암을 갖는 대상체를 치료하는 수단을 제공한다.
본 발명은 따라서 암이 내성이 있는 동일한 항체 분자를 사용하는, 대상체에서 암을 치료하는 수단을 제공하는 것으로 인식될 것이다.
재발한 암 및/또는 불응성 암은 약제 분야의 숙련가에 의해 용이하게 진단될 것이고, 본 명세서에서 추가로 논의된다.
본 발명자들은 현재 예상외로, 항체 분자에 대한 FcγRIIB 결합을 차단하는 항체 분자 및 제제에 의한 치료가 재발한 암 및/또는 불응성 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 밝혀냈다. 첨부된 실시예에서 증명되는 바와 같이, 본 발명의 항체 분자 및 제제는 불응성 만성 림프구성 백혈병 및/또는 재발한 만성 림프구성 백혈병의 치료에 특히 효과적이다.
본 발명자들은 이러한 항체 분자를 내재화함으로써 재발한 암 및/또는 불응성 암을 치료하는데 있어서, FcγRIIB가 치료적 항체 분자의 효능을 감소시키기 때문에, 본 발명의 항체 분자 및 제제에 의한 치료가 기능한다고 생각한다. 이들 발견을 고려하여, 본 발명자들은 본 발명의 이러한 항체 분자 및 제제가 치료적 항체 분자에 의해 치료될 수 있고 대상체의 표적 세포가 FcγRIIB를 발현하는 임의의 재발한 암 및/또는 불응성 암을 치료하는데 효과적일 것으로 생각한다.
비록 상이한 수준일지라도, 다수의 B 세포 암이 FcγRIIB를 발현하는 것으로 인식된다. FcγRIIB 발현은 만성 림프구성 백혈병 및 맨틀 세포 림프종에서 가장 두드러지고, 미만성 거대 B 세포 림프종에서 중간 정도이며, 여포성 림프종에서 가장 적게 두드러진다. 그러나, 일부 경우 일반적으로 낮은 수준의 FcγRIIB를 발현하는 암(예를 들면, 여포성 림프종)을 갖는 대상체는 매우 높은 수준의 FcγRIIB 발현을 가질 수 있다. 상이한 유형의 B 세포 암(및, 특히, 상기 언급된 것들)에서 FcγRIIB의 발현 수준은 항체 분자 리툭시맙의 내재화의 비율과 관련이 있다. 따라서, FcγRIIB의 발현 및 항체 분자의 연관된 내재화는 B 세포 암에 의해 공유되는 공통 메커니즘인 것으로 생각된다(Lim et al., 2011). 항체 분자의 FcγRIIB-의존성 초기화는 FcγRIIB에 대한 본 명세서에 기재된 항체에 의해 차단될 수 있다(실시예, 특히 도 3).
따라서, 본 발명의 항체 분자 및 제제는 B 세포 암, 및, 특히, 재발한 맨틀 세포 림프종 및/또는 불응성 맨틀 세포 림프종, 및/또는 재발한 여포성 림프종 및/또는 불응성 여포성 림프종, 및/또는 재발한 미만성 거대 B 세포 림프종 및/또는 불응성 미만성 거대 B 세포 림프종을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서 재발한 암 및/또는 불응성 암을 갖는 대상체를 치료하기 위하여, 대상체는 FcγRIIb를 발현하는 표적 세포를 가져야 한다. FcγRIIb는 세포 표면 수용체인 것으로 인식되고, 따라서 표적 세포의 표면에 존재할 것이다.
상이한 생물학적 마커가 FcγRIIb; 예를 들면, FcγRIIb 단백질 및/또는 FcγRIIb mRNA의 존재를 평가하는데 사용될 수 있다는 것이 숙련가에게 이해될 것이다. 숙련가는 FcγRIIb 단백질을 측정하기 위하여 당해 분야에 공지된 방법; 예를 들면, 면역조직화학, 웨스턴 블롯팅, 브래드포드(Bradford) 단백질 검정, 유세포 분석 및 AT-10 항체를 사용하는 검출이 있다는 것을 인식할 것이다. 숙련가는 FcγRIIb mRNA를 측정하기 위하여 당해 분야에 공지된 방법; 예를 들면, 노턴 블롯팅, RNA 시퀀싱, 정량적 PCR, 및 마이크로어레이 혼성화가 있다는 것을 인식할 것이다.
숙련가는 FcγRIIb의 존재를 평가하기 위하여, 표적 세포에서의 FcγRIIb 생물학적 마커의 수준을 FcγRIIb를 발현하지 않는 대조군 세포에서의 FcγRIIb 생물학적 마커의 수준과 비교할 필요가 있을 수 있다는 것을 인식할 것이다. 대조군 세포는 FcγRIIb를 발현하지 않는 개체로부터의 대조군 세포, 또는 개체로부터의 FcγRIIb를 발현하지 않는 대조군 세포, 또는 대상체로부터 FcγRIIb를 발현하지 않는 대조군 세포, 또는 FcγRIIb를 발현하지 않도록 유전자 조작된 세포일 수 있다.
"FcγRIIb를 발현하는 표적 세포"에, 본 발명자들은 표적 세포가 FcγRIIb 단백질 및/또는 FcγRIIb mRNA를 발현한다는 것을 포함한다. 본 발명자들은 또한 표적 세포가 FcγRIIb 단백질 및/또는 FcγRIIb mRNA가 대조군 세포보다 표적 세포에서 2배 이상 높은 경우, 또는 5배 이상 높은 경우, 또는 10배 이상 높은 경우, 또는 20배 이상 높은 경우, 또는 50배 이상 높은 경우, 또는 100배 이상 높은 경우, 또는 200배 이상 높은 경우, 또는 500배 이상 높은 경우, 또는 1000 이상 높은 경우, FcγRIIb를 발현하는 것으로 정의될 수 있다는 것을 포함한다.
약제는 상이한 첨가제로 변형되어, 예를 들면, 약제가 신체에 흡수되는 비율을 변화시킬 수 있고; 상이한 형태로 변형되어 신체의 특정한 투여 경로를 허용할 수 있다는 것이 의학 숙련가에게 알려져 있을 것이다.
따라서, 본 발명자들은 본 발명의 조성물, 및/또는 항체, 및/또는 제제, 및/또는 약제는 부형제 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 희석제 및/또는 애주번트와 배합될 수 있다는 것을 포함한다.
본 발명자들은 또한 본 발명의 조성물, 및/또는 항체, 및/또는 제제, 및/또는 약제가 항산화제, 및/또는 완충제, 및/또는 정균제, 및/또는 제형을 의도된 부형제의 혈액과 등장성이 되도록 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및/또는 비수성 무균 주사 용액; 및/또는 현탁제 및/또는 증점제를 포함할 수 있는 수성 및/또는 비수성 무균 현탁액을 포함하는 비경구 투여에 적합할 수 있다는 것을 포함한다. 본 발명의 조성물, 및/또는 항체, 및/또는 제제, 및/또는 약제는 단위-용량 또는 다중-용량 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰플 및 바이알 내에 존재할 수 있고, 사용 직전 오직 무균 액체 담체, 예를 들면, 주사용수의 첨가만 필요한 냉동-건조된(즉, 동결건조된) 상태로 저장될 수 있다.
즉석 주사 용액 및 현탁액은 이전에 기재된 종류의 무균 분말, 및/또는 과립, 및/또는 정제로부터 제조될 수 있다.
인간 환자에의 비경구 투여를 위하여, 본 발명의 조성물, 및/또는 항체, 및/또는 제제, 및/또는 약제의 일일 투약량 수준은 일반적으로 성인 일당 1 pg 내지 10㎎으로 단일 또는 나누어진 용량으로 투여될 것이다. 의사는 어떤 경우에도 임의의 개인 환자에게 가장 적합할 것인 실제 투약량을 결정할 것이고, 이는 특정 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 다양할 것이다. 상기 투약량은 평균 경우의 예시이다. 물론, 더 높거나 낮은 투약량 범위가 가치가 있고 본 발명의 범위 내에 속하는 개별적인 성분이 존재할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 조성물 및/또는 약제는 본 발명의 항체 및/또는 제제를 대략 2㎎/㎖ 내지 150㎎/㎖, 또는 대략 2㎎/㎖ 내지 200㎎/㎖의 농도로 함유할 것이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 약제 및/또는 조성물은 본 발명의 항체 및/또는 제제를 본 발명의 항체 및/또는 제제를 10㎎/㎖의 농도로 함유할 것이다.
일반적으로, 인간에 있어서, 본 발명의 조성물, 및/또는 항체, 및/또는 제제, 및/또는 약제의 경구 또는 비경구 투여는 가장 편리하면서 바람직한 경로이다. 수의학 사용에 있어서, 본 발명의 조성물, 및/또는 항체, 및/또는 제제 및/또는 약제는 정상적인 수의학적 실시에 따라 적합하게 허용 가능한 제형으로서 투여되고, 수의사는 특정한 동물에게 가장 적절할 것인 투약 계획 및 투여 경로를 결정할 것이다. 따라서, 본 발명은 다양한 병태(상기 기재되고 하기 추가로 기재된 바와 같음)를 치료하는데 유효한 본 발명의 항체 및/또는 제제의 양을 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 바람직하게는, 조성물, 및/또는 항체, 및/또는 제제, 및/또는 약제는 정맥내; 근육내; 피하를 포함하는 군으로부터 선택된 경로에 의한 전달을 위하여 개조된다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드 결합 잔기의 약제학적으로 허용 가능한 산 또는 염기 부가 염을 포함하는 조성물, 및/또는 항체, 및/또는 제제, 및/또는 약제를 포함한다. 본 발명에 유용한 상기 언급된 염기 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 산 부가 염을 제조하는데 사용되는 산은 비독성 산 부가 염, 즉, 그 중에서도 약물학적으로 허용 가능한 음이온을 함유하는 염, 예를 들면, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 나이트레이트, 설페이트, 바이설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 아세테이트, 락테이트, 시트레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 바이타르트레이트, 석시네이트, 말레에이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 사카레이트, 벤조에이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트 및 파모에이트[(즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-하이드록시-3 나프토에이트)] 염을 형성하는 것들이다. 약제학적으로 허용 가능한 염기 부가 염은 또한 본 발명에 따른 제제의 약제학적으로 허용 가능한 염 형태를 제조하는데 사용될 수 있다. 자연에서 산성인 본 발명의 제제의 약제학적으로 허용 가능한 염기 염을 제조하는 시약으로서 사용될 수 있는 화학적 염기는 이러한 화합물과 비독성 염기 염을 형성하는 것들이다. 이러한 비독성 염기 염은 그 중에서도 이러한 약물학적으로 허용 가능한 양이온, 예를 들면, 알칼리 금속 양이온(예를 들면, 칼륨 및 나트륨) 및 알칼리 토금속 양이온(예를 들면, 칼슘 및 마그네슘), 암모늄 또는 수용해성 아민 부가 염, 예를 들면, N-메틸글루카민-(메글루민), 및 저급 알칸올암모늄 및 약제학적으로 허용 가능한 유기 아민의 기타 염기 염으로부터 유래된 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 제제 및/또는 폴리펩타이드 결합 잔기는 저장을 위해 동결건조될 수 있고, 사용 전에 적합한 담체 중에 재구성될 수 있다. 임의의 적합한 동결건조 방법(예를 들면, 분무 건조, 케이크 건조) 및/또는 재구성 기술이 사용될 수 있다. 동결건조 및 재구성은 다양한 정도의 항체 활성 손실(예를 들면, 통상적인 면역글로불린, IgM 항체는 IgG 항체보다 더 큰 활성 손실을 갖는 경향이 있다)을 야기할 수 있고, 사용 수준은 보완을 위하여 상향 조절되어야 할 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련가에게 인식될 것이다. 하나의 실시형태에 있어서, 동결건조된(냉동 건조된) 폴리펩타이드 결합 잔기는 재수화 시 이의 활성(동결건조 전)의 약 20% 이하, 약 25% 이하, 약 30% 이하, 약 35% 이하, 약 40% 이하, 약 45% 이하, 약 50% 이하를 손실한다.
본 발명자들은 대상체가 포유동물 또는 비포유동물일 수 있다는 것을 포함한다. 바람직하게는, 포유동물 대상체는 인간이거나 비포유동물, 예를 들면, 말, 또는 소, 또는 양, 또는 돼지, 또는 낙타, 또는 개, 또는 고양이이다. 가장 바람직하게는, 포유동물 대상체는 인간이다.
바람직하게는, 본 발명은 재발한 암 및/또는 불응성 암이 항체 치료에 내성이 있는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 재발한 암 및/또는 불응성 암이 (i)에서 정의된 바와 같은 항체 분자에 내성이 있는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 제제가 항체 분자의 Fc 도메인에 대한 결합으로부터 표적 세포에 존재하는 FcγRIIb를 방지하거나 감소시키는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
상기 요약된 바와 같이, Fc 수용체(FcγRIIb 포함)는 세포에 존재하는 막 단백질이다. 숙련가는 단백질이 세포에 존재하는지 여부를 검출하기 위한 당해 분야에 공지된 방법; 예를 들면, 면역조직화학, 및 검출 가능한 라벨로 표시된 단백질의 가시화가 있다는 것을 이해할 것이다.
"표적 세포에서 FcγRIIb 존재"에, 본 발명자들은 FcγRIIb가 FcγRIIb 단백질인 것, 및/또는 FcγRIIb가 표적 세포 막 위에 존재하는 것, 및/또는 FcγRIIb가 표적 세포 막 내에 존재하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 항체 분자가 FcγRIIb와 결합할 수 있는 Fc 도메인을 갖는, 표적 세포의 세포 표면 항원과 특이적으로 결합하는 항체 분자가 FcγRIIb-의존성 방식으로 표적 세포 내로 내재화될 수 있는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
상기 요약된 바와 같이, Fc 수용체(FcγRIIb 포함)는 세포 내로 항체 분자의 내재화를 매개하고, 이는 항체 분자의 파괴를 야기할 수 있다. FcγRIIb가 세포 내로 항체 분자의 내재화를 매개하는 방식은 세포 생물학 분야의 숙련가에게 알려질 것이다.
"표적 세포 내로 내재화됨"에, 본 발명자들은 항체 분자가 세포 막으로부터 표적 세포 내로 제거되는 것, 및/또는 항체 분자가 표적 세포 내로 재순환되는 것, 및/또는 항체 분자가 표적 세포 내로 내재화되고 파괴되는 것, 및/또는 항체 분자가 표적 세포의 엔도솜 내에 캡슐화되는 것, 및/또는 항체 분자가 표적 세포 내로 내재화되고, 따라서 더이상 치료적으로 효과적이지 않은 것, 및/또는 항체 분자가 표적 세포에 의해 내포작용되는 것을 포함한다.
항체 분자가 다수의 상이한 과정으로 세포 내로 내재화될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 교시는 항체 분자가 FcγRIIb에 대한 항체 분자의 Fc 도메인 결합을 통해 내재화될 수 있다는 것이다. 그러나, 항체 분자가 또다른 과정, 예를 들면, 세포외 분자가 수동적으로 세포 내로 흡수될 수 있는 공정인 음세포작용을 통해 내재화될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 항체 분자가 세포 내로 흡수될 수 있는 다른 과정은 세포 생물학 분야의 숙련가에게 알려질 것이다.
"FcγRIIb-의존성 방식"에, 본 발명자들은 항체 분자가 FcγRIIb 활성을 필요로 하는 방식으로 내재화된다는 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 항체 분자의 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합을 방지하거나 감소시키는 제제가 표적 세포 내로의 항체 분자의 내재화를 추가로 방지하거나 감소시키는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은, 불응성 암이, 대상체가 암 치료를 받은 적이 있고 반응하지 않는 경우, 및/또는 대상체가 암 치료를 받은 적이 있지만 암이 상기 치료 동안 대상체에서 진행된 경우, 불응성 암인 것으로 특징지어지는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
"대상체가 암 치료를 받은 적이 있음"에, 본 발명자들은 대상체가 이전에 치료적 제제로 치료된 적이 있거나, 현재 치료적 제제로 치료 중인 것을 포함한다.
본 발명자들은 또한 대상체가 이전에 치료적 제제로 치료된 적이 있는 경우, 치료가 이전에 약 1일, 또는 약 2일, 또는 약 3일, 또는 약 4일, 또는 약 5일, 또는 약 6일, 또는 약 1주 이상, 또는 약 2주 이상, 또는 약 3주 이상, 또는 약 1개월 이상, 또는 약 2개월 이상, 또는 약 3개월 이상, 또는 약 4개월 이상, 또는 약 5개월 이상, 또는 약 6개월 이상, 또는 약 7개월 이상, 또는 약 8개월 이상, 또는 약 9개월 이상, 또는 약 10개월 이상, 또는 약 11개월 이상, 또는 약 1년 이상, 약 2년 이상, 또는 약 3년 이상, 또는 약 4년 이상, 또는 약 5년 이상, 또는 약 10년 이상 발생된다는 것을 포함한다.
"치료적 제제"에, 본 발명자들은 리툭시맙, 리툭시맙 바이오시밀러, 오파투무맙, 오비누투주맙, 알렘투주맙, 오크렐리주맙, 갈릭시맙, 토시투모맙, 이브리투모맙, CD20 항체, CD40 항체, CD19 항체, CD37 항체, CD52 항체, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 과분할된 사이클로포스파미드, 플루다라빈, 옥살리플라틴, 이브루티닙, 뉴클레오시드 유사체, 알킬레이터, 벤다무스틴, 보르테조밉, 레날리도미드, 빈크리스틴, 독소루비신(또한 아드리아마이신으로도 알려짐), 프레드니손, 이다루비신, 멜팔란, 클라드리빈, 사이타라빈, 덱사메타손, 메토트렉세이트, 메스나, 젬시타빈, 템시롤리무스, 미톡산트론, 시스플라틴, 탈리도미드, 에토포시드, 프로카바진, 플라보피리돌, 엔자스타우린, 블레오마이신, 빈블라스틴, 안트라사이클린, 이포스파미드, 카보플라틴, 메틸프레드니솔론 및 다카바진을 포함하는 목록으로부터 선택된 하나 이상의 치료적 제제; 및/또는 플루다라빈 및 사이클로포스파미드(FC); 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신, 리포솜 독소루비신 및 프레드니손(CHOP); 사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손(COP - 또한 CVP로도 알려짐); 리툭시맙, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손(R-COP - 또한 R-CVP로도 알려짐); 이다루비신 및 플루다라빈; 멜팔란, 클로람부실 및 프레드니손(MCP); 리툭시맙 및 클로람부실; 리툭시맙, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신 및 프레드니손(R-CHOP); 리툭시맙, 플루다라빈 및 사이클로포스파미드(R-FC); 메스나, 이포스파미드, 미톡산트론 및 에토포시드; 메스나, 이포스파미드, 미톡산트론, 에토포시드 및 리툭시맙; 레날리도미드 및 리툭시맙; 리툭시맙 및 클라드리빈; 리툭시맙, 멜팔란, 클로람부실 및 프레드니손(R-MCP); 사이타라빈, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신 및 프레드니손; 과분할된 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신 및 덱사메타손(하이퍼-CVAD); 리툭시맙, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신 및 덱사메타손(R-하이퍼-CVAD); 이포스파미드, 카보플라틴 및 에토포시드(ICE); 이포스파미드, 카보플라틴, 에토포시드 및 리툭시맙; 젬시타빈, 덱사메타손 및 카보플라틴; 젬시타빈, 덱사메타손, 카보플라틴 및 리툭시맙; 젬시타빈 및 옥살리플라틴; 젬시타빈, 옥살리플라틴 및 리툭시맙; 메토트렉세이트 및 사이타라빈; 보르테조밉 및 젬시타빈; 리툭시맙 및 보르테조밉; 플루다라빈, 사이클로포스파미드 및 미톡산트론(FCM); 리툭시맙, 플루다라빈, 사이클로포스파미드 및 미톡산트론(R-FCM - FCMR로도 알려짐); 리툭시맙 및 플루다라빈; 덱사메타손 및 젬시타빈; 덱사메타손, 젬시타빈 및 시스플라틴; 덱사메타손, 젬시타빈, 시스플라틴 및 리툭시맙; 덱사메타손, 플루다라빈, 미톡산트론 및 덱사메타손(RFND); 탈리도미드 및 리툭시맙; 프레드니손, 에토포시드, 프로카바진 및 사이클로포스파미드(PEP-C); 리툭시맙, 탈리도미드, 프레드니손, 에토포시드, 프로카바진 및 사이클로포스파미드; 벤다무스틴 및 리툭시맙(BR); 리툭시맙, 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 에토포시드 및 프레드니손(R-CHOEP - 또한 EPOCH-R로도 알려짐); 아드리아마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카바진(ABVD); 블레오마이신, 에토포시드, 아드리아마이신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프로카바진 및 프레드니손(BEACOPP); 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프로카바진 및 프레드니손(COPP); 사이클로포스파미드, 에토포시드, 프레드니손 및 프로카바진(CEPP); 리툭시맙, 사이클로포스파미드, 에토포시드, 프레드니손 및 프로카바진(RCEPP); 리툭시맙, 사이클로포스파미드, 리포솜 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손(RCDOP); 리툭시맙, 사이클로포스파미드, 미톡산트론, 빈크리스틴 및 프레드니손(RCNOP); 리툭시맙, 사이클로포스파미드, 에토포시드, 빈크리스틴 및 프레드니손; 덱사메타손, 시스플라틴, 사이타라빈 및 리툭시맙(DHAP); 에토포시드, 메틸프레드니솔론, 사이타라빈, 시스플라틴 및 리툭시맙(ESHAP); 및, 클로람부실, 빈블라스틴, 프로카바진 및 프레드니손(ChlVPP)을 포함하는 목록으로부터 선택된 하나 이상의 치료적 제제 조합을 포함한다.
상기 요약된 치료적 제제 이외에, 의학 분야의 숙련가들은 암, 및/또는 재발한 암, 및/또는 불응성 암을 치료하는데 사용될 수 있는 치료적 제제의 다른 유형 및 조합을 이해할 것이고; 이의 예는 문헌[the Agency for Healthcare Research and Quality Guideline Summary NGC-9392 September 2012, Agency for Healthcare Research and Quality Guideline Summary NGC-9278 2012, McKay et al., 2012, British Journal of Haematology: 12046, Hallek et al., 2008, Blood, 111: 5446-5456, Wang et al., 2013, N. Engl. J. Med., 369(6): 507-516, Byrd et al., N. Engl. J. Med., 369(1): 32-42, 및 NCCN Guidelines on Non-Hodgkin's Lymphomas Version 1.2014]에서 찾을 수 있다.
"암 치료를 받았고 반응하지 않음"에, 본 발명자들은 암 치료를 받은 후, 대상체가 암 증상의 중증도의 감소를 나타내지 않는 것, 및/또는 대상체가 암 증상의 수의 감소를 나타내지 않는 것, 및/또는 대상체가 개선된 암 예후를 갖지 않는 것, 및/또는 대상체가 암의 진단 마커에서 감소를 나타내지 않는 것을 포함한다.
"암이 대상체에서 진행됨"에, 본 발명자들은 암 치료 동안 대상체가 암 증상의 중증도의 증가를 나타내는 것, 및/또는 대상체가 암 증상의 수의 증가를 나타내는 것, 및/또는 대상체가 더 악화된 암 예후를 갖는 것, 및/또는 대상체가 암의 진단 마커에서 증가를 나타내는 것을 포함한다.
"나타내다"에, 본 발명자들은 대상체가 암 증상 및/또는 암 진단 마커를 보이는 것, 및/또는 암 증상 및/또는 암 진단 마커가 측정, 및/또는 평가, 및/또는 정량될 수 있는 것을 포함한다.
암 증상 및 암 진단 마커가 될 수 있는 것, 및 암 증상의 중증도에서 감소 또는 증가, 또는 암 진단 마커에서 감소 또는 증가가 존재하는지 여부를 측정 및/또는 평가 및/또는 정량하는 방법; 뿐만 아니라 이러한 암 증상 및/또는 암 진단 마커가 암에 대한 예후를 형성하는데 사용될 수 있는 방법은 의학 분야의 숙련가에게 용이하게 명백할 것이다.
암 치료는 종종 치료의 과정으로서 투여되고, 이는 다시 말해서, 치료적 제제는 일정한 시간 동안 투여된다는 것이다. 치료의 과정의 시간 길이는 다수의 인자에 따라 좌우될 것이고, 이는 그 중에서도 투여되는 치료적 제제의 유형, 치료되는 암의 유형, 치료되는 암의 중증도, 및 대상체의 연명 및 건강을 포함할 수 있다.
"치료 동안"에, 본 발명자들은 대상체가 현재 치료 과정을 받고 있는 중인 것, 및/또는 치료적 제제를 제공받고 있는 것, 및/또는 치료적 제제의 과정을 받고 있는 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은, 대상체가 이전에 암에 대한 치료를 받은 적이 있지만 부분 관해 이하를 달성하는 경우, 대상체는 반응하지 않는 것으로 특징지어지는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
관해는 암 의학 분야에서 잘 알려진 용어로서, 이는 대상체에서 암의 감소를 평가하는 것에 관한 것이다. 부분 관해는 또한 암 의학 분야에 잘 알려진 용어로서, 이는 특정한 암 증상 및/또는 암 진단 마커를 사용하여 측정된 바, 대상체에서 암이 치료 전에 특정한 암 증상 및/또는 암 진단 마커의 수준과 비교하여 50% 감소된 관해의 단계에 관한 것이다. 몇몇 상황에 있어서, 부분 관해를 갖는 것으로 분류되는 대상체에 있어서, 암 증상 및/또는 암 진단 마커에서 감소는 특정한 시간 길이 동안 유지되어야 한다. 대상체가 암에 대하여 관해인지 여부, 및 대상체가 관해의 무슨 단계에 있는지는 의학 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
"부분 관해 이하를 달성함"에, 본 발명자들은 암 증상 또는 암 진단 마커가 암 증상의 중증도의 감소, 및/또는 암 증상의 수의 감소, 및/또는 개선된 암 예후, 및/또는 암 진단 마커의 감소를 기반으로 평가 및/또는 측정 및/또는 정량되고; 치료 전 암 증성 또는 암 진단 마커와 비교하여 50% 미만으로 감소된 것을 포함한다.
본 발명자들은 또한 대상체가 부분 관해 미만을 달성하는지 여부의 평가 및/또는 측정 및/또는 정량은 치료의 중단 후 암 증상 및/또는 암 진단 마커, 및 치료가 시작되기 전 암 증상 및/또는 암 진단 마커, 및/또는 치료 동안 암 증상 및/또는 암 진단 마커의 비교를 기반으로 한다는 것을 포함한다. 또한 대상체가 부분 관해 미만을 달성하는 것으로 기재되기 전에 평가 및/또는 측정 및/또는 정량이 적어도 1회, 또는 적어도 2회, 또는 적어도 3회, 또는 적어도 4회, 또는 적어도 5회, 또는 적어도 6회, 또는 적어도 7회, 또는 적어도 8회, 또는 적어도 9회, 또는 적어도 10회, 또는 적어도 15회, 또는 적어도 20회 발생할 수 있다는 것이 포함된다.
본 발명자들은 추가로 치료 중단 후 암 증상 및/또는 암 진단 마커의 감소가 치료가 시작되기 전 암 증상 및/또는 암 진단 마커, 및/또는 치료 동안 암 증상 및/또는 암 진단 마커와 비교하여 약 1% 미만, 또는 약 5% 미만, 또는 약 10% 미만, 또는 약 15% 미만, 또는 약 20% 미만, 또는 약 25% 미만, 또는 약 30% 미만, 또는 약 35% 미만, 또는 약 40% 미만, 또는 약 45% 미만, 또는 약 50% 미만인 경우, 대상체가 부분 관해 미만을 달성하는 것으로 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은, 대상체가 이전에 암에 대하여 치료되었고 이전에 치료에 반응하였지만 그 후에 재발한 경우, 상기 재발한 암이 재발한 암인 것으로 특징지어지는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
"이전에 암에 대하여 치료되었음"에, 본 발명자들은 대상체가 이전에 치료적 제제로 치료되었지만, 치료가 중단된 것을 포함한다. 따라서, 본 발명자들은 대상체가 이전에 암에 대하여 치료되었고, 치료적 제제에 의한 치료 중단이 이전에 적어도 약 1일, 또는 적어도 약 2일, 또는 적어도 약 3일, 또는 적어도 약 4일, 또는 적어도 약 5일, 또는 적어도 약 6일 이상, 또는 약 1주 이상, 또는 약 2주 이상, 또는 약 3 주 이상, 또는 약 1개월 이상, 또는 약 2개월 이상, 또는 약 3개월 이상, 또는 약 4개월 이상, 또는 약 5개월 이상, 또는 약 6개월 이상, 또는 약 7개월 이상, 또는 약 8개월 이상, 또는 약 9개월 이상, 또는 약 10개월 이상, 또는 약 11개월 이상, 또는 약 1년 이상, 또는 약 2년 이상, 또는 약 3년 이상, 또는 약 4년 이상, 또는 약 5년 이상, 또는 약 10년 이상 발생되었던 경우를 포함한다.
의학 분야의 숙련가에게 환자가 치료에 반응했는지 여부를 명백할 것이다.
"이전에 치료에 반응했었음"에, 본 발명자들은 치료 중단 후, 암 증상의 중증도의 감소, 및/또는 암 증상의 수의 감소, 및/또는 개선된 암 예후, 및/또는 암 진단 마커의 감소를 평가 및/또는 측정 및/또는 정량이 존재한다는 것을 포함한다.
재발은 암 의학 분야에서 잘 알려진 용어로, 이는 대상체의 암이 이전에 치료에 반응한 후, 대상체의 암이 악화되는 것에 관한 것이다. 암이 재발했던 시기는 의학 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
"그 후에 재발함"에, 본 발명자들은 대상체가 이전에 치료에 반응한 후, 대상체가 암 증상의 중증도의 증가를 나타내는 것, 및/또는 대상체가 암 증상의 수의 증가를 나타내는 것, 및/또는 대상체가 악화된 암 예후를 갖는 것, 및/또는 대상체가 암 진단 마커의 증가를 나타내는 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 대상체가 (i) 치료 후, 적어도 부분 관해를 달성하는 것 및/또는 대상체가 치료 후 적어도 완전 관해를 달성하지만, (ii) 치료 중단 후, 암이 대상체에서 진행되는 경우, 대상체가 그 후에 재발한 것으로 특징지어지는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
"치료 후, 완전 관해"에, 본 발명자들은 치료 중단 후, 검출 가능한 암 증상 및/또는 암 진단 마커가 존재하지 않는 것을 포함한다.
본 발명자들은 또한 몇몇 경우에 있어서 치료 후, 완전 관해는 암 증상 및/또는 암 진단 마커가 치료 중단 후, 적어도 약 1일, 또는 적어도 약 2일, 또는 적어도 약 3일, 또는 적어도 약 4일, 또는 적어도 약 5일, 또는 적어도 약 6일 이상, 또는 약 1주 이상, 또는 약 2주 이상, 또는 약 3 주 이상, 또는 약 1개월 이상, 또는 약 2개월 이상, 또는 약 3개월 이상, 또는 약 4개월 이상, 또는 약 5개월 이상, 또는 약 6개월 이상, 또는 약 7개월 이상, 또는 약 8개월 이상, 또는 약 9개월 이상, 또는 약 10개월 이상, 또는 약 11개월 이상, 또는 약 1년 이상, 또는 약 2년 이상, 또는 약 3년 이상, 또는 약 4년 이상, 또는 약 5년 이상, 또는 약 10년, 또는 약 20년, 또는 약 30년, 또는 약 40년, 또는 약 50년 동안 검출 가능하지 않은 경우인 것을 포함한다. 가장 특히, 본 발명자들은 몇몇 경우에 있어서 치료 후, 완전 관해가 암 증상 및/또는 암 진단 마커가 치료 중단 후, 약 6개월 이상 동안 검출 가능하지 않은 경우인 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 대상체가 치료 중단 후 약 1개월 이상 후에 재발한, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 대상체가 치료 중단 후, 약 1개월 이상, 또는 약 2개월 이상, 또는 약 3개월 이상, 또는 약 4개월 이상, 또는 약 5개월 이상, 또는 약 6개월 이상, 또는 약 7개월 이상, 또는 약 8개월 이상, 또는 약 9개월 이상, 또는 약 10개월 이상, 또는 약 11개월 이상, 또는 약 12개월 이상, 또는 약 2년 이상, 또는 약 3년 이상, 또는 약 4년 이상, 또는 약 5년 이상, 또는 약 6년 이상, 또는 약 7년 이상, 또는 약 8년 이상, 또는 약 9년 이상, 또는 약 10년 이상 후에 재발한, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다. 가장 바람직하게는, 대상체는 치료 중단 후, 약 6개월 이상 후에 재발한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 대상체가 적어도 1회, 또는 적어도 2회, 또는 적어도 3회, 또는 적어도 4회, 또는 적어도 5회, 또는 적어도 6회, 또는 적어도 7회, 또는 적어도 8회, 또는 적어도 9회, 또는 적어도 10회 재발한 암의 특징을 나타내는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
"재발한 암의 특징을 나타냄"에, 본 발명자들은 대상체가 이전에 암에 대하여 치료되었고, 이전에 치료에 반응하였고, 그 후에 재발한 것을 포함한다.
이전에 대상체에서 암을 치료하는데 사용되었던 치료에 내성을 갖기 때문에 암이 재발할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 재발한 암을 갖는 대상체는 종종 대상체에서 이전에 암을 치료하는데 사용된 치료적 제제와 상이한 치료적 제제를 사용하여 치료된다. 따라서, 바로 상기에 언급된 실시형태에 있어서, 본 발명자들은 각각의 후속적인 시간에 대상체가 재발한 암의 특징을 나타낸 다음, 대상체가 이전에 치료되었던 치료적 제제와 상이한 치료적 제제로 치료되는 것 및/또는 대상체가 이전에 치료되었던 치료적 제제와 동일한 치료적 제제로 치료되는 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 치료는 항체 치료, 예를 들면, 상기 실시형태의 (ii)에서 정의된 바와 같은 제제의 부재하에 투여되는, 상기 실시형태의 (i)에서 정의된 바와 같은 항체 분자인, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
"부재하에 투여됨"에, 본 발명자들은 (i)에서 정의된 바와 같은 항체 분자는 (ii)에서 정의된 바와 같은 제제 후 및/또는 전 시간의 기간에 투여된 것을 포함한다. 따라서, "시간의 기간"에, 본 발명자들은 (i)에서 정의된 바와 같은 항체 분자가 (ii)에서 정의된 바와 같은 제제 전 및/또는 후, 1시간 이상, 또는 2시간 이상, 또는 3시간 이상, 또는 6시간 이상, 또는 12시간 이상, 또는 18시간 이상, 또는 24시간 이상, 또는 2일 이상, 또는 3일 이상, 또는 4일 이상, 또는 5일 이상, 또는 6일 이상, 또는 7일 이상, 또는 2주 이상, 또는 3주 이상, 또는 4주 이상, 또는 5주 이상, 또는 6주 이상, 또는 7주 이상, 또는 8주 이상, 또는 3개월 이상, 또는 4개월 이상, 또는 5개월 이상, 또는 6개월 이상, 또는 7개월 이상, 또는 8개월 이상, 또는 9개월 이상, 또는 10개월 이상, 또는 11개월 이상, 또는 12개월 이상, 또는 1년 이상, 또는 2년 이상, 또는 3년 이상, 또는 4년 이상, 또는 5년 이상, 또는 10년 이상, 또는 20년 이상 투여되었던 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 치료가 하나 이상의 치료적 제제를 포함하는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 표적 세포가 FcγRIIb 발현의 상승된 수준을 포함하는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
분자 생물학 및 세포 생물학 분야의 숙련가에게 무엇이 FcγRIIb 발현의 상승된 수준인지, 및 발현이 측정될 수 있는 방법이 알려져 있을 것이다. 예를 들면, 상기 언급된 FcγRIIb 발현의 측정 방법 이외에, FcγRIIb 발현 수준은 종양 생검의 면역조직화학에 의해 측정될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 FcγRIIb 발현 수준의 측정을 위한 여러 기술 및 방법이 존재한다는 것을 이해할 것이다.
"표적 세포가 FcγRIIb 발현의 상승된 수준을 포함하는 것"에, 본 발명자들은 FcγRIIb 단백질의 상승된 수준을 포함하는 것 및/또는 표적 세포가 하기 기재된 바와 같이, 대조군과 비교하여 FcγRIIb mRNA의 상승된 수준을 포함하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 표적 세포 위의 상승된 FcγRIIb 발현이 대조군과 비교하여 측정되는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
적합한 대조군은 FcγRIIb 발현의 정상 수준을 갖는 것일 것이다. 정확한 대조군의 선택 및 FcγRIIb 발현의 정상 수준의 정의는 대상체, 대상체 위의 표적 세포 유형의 유형, 및 암의 유형과 같은 다수의 변수에 따라 좌우될 것이다. 분자 생물학 또는 세포 생물학 분야의 숙련가에게 적절한 대조군 및 FcγRIIb 발현의 정상 수준이 무엇인지가 명백할 것이다.
"대조군"에, 본 발명자들은 대조군이 대조군 세포인 것, 및/또는 대조군이 FcγRIIb 발현 수준의 데이터베이스로부터의 정보인 것을 포함한다. 본 발명자들은 또한 대조군 세포가 표적 세포와 상이한 세포 유형인 것, 및/또는 표적 세포에 동일한 세포 유형인 것을 포함한다. 본 발명자들은 추가로 대조군 세포가 대조군 개체로부터인 것, 및 그 대조군 개체가 대상체 및/또는 대상체 이외의 개체일 수 있는 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 대조군이 비불응성 암 및/또는 비재발한 암을 갖는 대조군 개체의 대조군 세포를 포함하는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
"비불응성 암 및/또는 비재발한 암을 갖는 대조군 개체"에, 본 발명자들은 대조군 개체가 재발한 암 및/또는 불응성 암이 아닌 암을 갖는 것을 포함한다. 본 발명자들은 또한 그 대조군 개체가 이전에 치료적 제제로 적어도 1회 치료되었던 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 상승된 FcγRIIb 발현이 대조군과 비교하여 대상체의 표적 세포에서 적어도 2배 높은, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
본 발명자들은 또한 상승된 FcγRIIb 발현이 대조군과 비교하여 표적 세포에서 약 10배 높거나, 약 20배 높거나, 약 30배 높거나, 약 40배 높거나, 약 50배 높거나, 약 60배 높거나, 약 70배 높거나, 약 80배 높거나, 약 90배 높거나, 약 100배 높거나, 약 200배 높거나, 약 300배 높거나, 약 400배 높거나, 약 500배 높거나, 약 600배 높거나, 약 700배 높거나, 약 800배 높거나, 약 900배 높거나, 약 1000배 높은 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 표적 세포가 암 세포인, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
암 세포는 암의 특징을 나타내는 세포이고, 다시 말해서, 하나 이상의 암 진단 마커를 나타내는 세포이다. 세포 생물학 및 종양학 분야의 숙련가에게 표적 세포가 암 세포인지 여부는 명백할 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 표적 세포가 B 세포인, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
B 세포(B 림프구로도 알려짐)는 후천성 면역 반응의 세포 유형이고, 이는 세포 표면 위의 B 세포 수용체의 존재에 의해 면역계의 다른 세포와 구별된다.
"B 세포"에, 본 발명자들은 형질 B 세포(또한 이펙터 B 세포로도 알려짐), 및/또는 기억 B 세포, 및/또는 B-1 세포, 및/또는 B-2 세포, 및/또는 변연부 B 세포, 및/또는 모낭 B 세포, 및/또는 조절 B 세포, 및/또는 나이브 B 세포를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 재발한 암, 및/또는 불응성 암, 및/또는 암 세포, 및/또는 동일한 암 유형, 및/또는 암이 비호지킨 림프종; 여포성 림프종; 미만성 거대 B 세포 림프종; 맨틀 세포 림프종; 만성 림프구성 백혈병; 소 림프구성 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
비호지킨 림프종(NHL)은 그 중에서도 모낭 세포 림프종, 맨틀 세포 림프종, 비장 변연부 림프종, MALT 림프종, 림프구형질세포 NHL(또한 발덴스트롬 마크로글로불린혈증으로도 알려짐), 소 림프구성 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 미만성 혼합 세포 림프종, 버키트 림프종, 역형성 거대 세포 림프종, 및 미만성 혼합 세포 림프종을 포함하는 상이한 림프종의 군에 대한 총괄적 명칭이다.
상기 기재된 각각의 암은 잘 알려져 있고, 증상 및 암 진단 마커는 이러한 암을 치료하는데 사용되는 치료적 제제로서 잘 기재되어 있다. 따라서, 비호지킨 림프종, 여포성 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 맨틀 세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 및 소 림프구성 림프종을 치료하는데 사용되는 증상, 암 진단 마커, 및 치료적 제제는 의학 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있을 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 반응하지 않았던 대상체, 및/또는 대상체의 부분 관해, 및/또는 대상체의 완전 관해, 및/또는 대상체에서 진행되었던 암은 하기를 포함하는 군으로부터 하나 이상을 측정함으로써 측정되는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다:
(i) 림프구 계수; 및/또는
(ii) 호중구 계수; 및/또는
(iii) 혈소판 계수; 및/또는
(iv) 헤모글로빈 계수; 및/또는
(v) 종양 세포의 퍼센트; 및/또는
(vi) 골수 림프구의 퍼센트; 및/또는
(vii) 순환성 림프구의 퍼센트; 및/또는
(viii) 림프구 위의 바이오마커의 존재 및/또는 부재; 및/또는
(ix) 암 병기; 및/또는
(x) 조직학적 검사; 및/또는
(xi) 골수 검사; 및/또는
(xii) 세포유전학적 검사; 및/또는
(xiii) 림프절 평가; 및/또는
(xiv) 신체 증상; 및/또는
(xv) 비장에서 암 세포의 감소.
(i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii), (ix), (x), (xi), (xii), (xiii) 및 (xv)는 "암 진단 마커"에 관한 것이고; (xiv)는 "암 증상"에 관한 것임이 인식될 것이다.
종양학 분야에서 수십년간 연구 및 혁신를 통해, 다수의 암의 "암 진단 마커" 및 "암 증상"은 암 진단 마커 및 암 증상의 측정 및 평가 방법으로서 잘 특성화되어 있다. 따라서, 종양학 분야의 숙련가는 상기 각각의 점이 특정한 암에 관련되는 방법을 인식할 것이고, 특정한 암 진단 마커 또는 암 증상의 측정 또는 평가를 기반으로, 대상체가 치료에 반응하지 않는지 여부, 또는 대상체가 부분 관해인지 여부, 또는 대상체가 완전 관해인지 여부, 또는 암이 대상체에서 진행되었는지 여부는 숙련된 개체에게 용이하게 명백할 것이고; 이의 예는 문헌[McKay et al., 2012, British Journal of Haematology: 12046, Hallek et al., 2008, Blood, 111: 5446-5456 및 NCCN Guidelines on Non-Hodgkin's Lymphomas Version 1.2014]에서 찾을 수 있다.
다수의 진단학적 암 마커의 평가(예를 들면, "림프구 계수", "호중구 계수", "혈소판 계수", "헤모글로빈 계수", "비정형 세포의 퍼센트", "골수 림프구의 퍼센트", 및 "순환성 림프구의 퍼센트")는 대상체 내의 세포 및 분자의 정량에 의존한다. 이러한 세포 및 분자의 정량은 당해 분야에 잘 알려져 있다.
"종양 세포"에, 본 발명자들은 신생물 세포, 및/또는 CD19+, CD5+ 및 CD23+인 신생물 세포를 포함한다.
다수의 바이오마커는 특정한 암 유형을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 만성 림프구성 백혈병 세포는 CD5, CD19, CD20 및 CD23을 동시발현한다. 그러나, CD20 및 CD79b의 수준은 정상 B 세포에 비해 낮다.
"림프구 위의 바이오마커의 존재 및/또는 부재"에, 본 발명자들은 용어 "존재"가 대조군 B 세포와 비교시 바이오마커의 증가된 양, 또는 검출 가능한 바이오마커를 포함하고, 부재가 대조군 B 세포와 비교시 바이오마커의 감소된 양, 또는 검출 가능하지 않은 바이오마커를 포함하는 것을 포함한다. 본 발명자들은 또한 대조군 B 세포가 "대조군 개체"로부터인 것을 포함한다. 본 발명자들은 추가로 림프구 위의 바이오마커의 존재 및/또는 부재가 CD5, 및/또는 CD19, 및/또는 CD20, 및/또는 CD23, 및/또는 사이클린 D1, 및/또는 BCL2, 및/또는 FMC6, 및/또는 CD3, 및/또는 CD10 및/또는 BCL6, 및/또는 CD21, 및/또는 CD45, 및/또는 Ki-67, 및/또는 IRF4/MUM1, 및/또는 MYC, 및/또는 CD30, 및/또는 CD138, 및/또는 EBER-ISH, 및/또는 ALK, 및/또는 HHV8, 및/또는 카파/람다, 및/또는 CD79b의 존재, 및/또는 CD20, 및/또는 CD79b, 및/또는 CD10, 및/또는 CD23, 및/또는 BCL6의 부재를 포함하는 것을 포함한다.
다수의 암의 진단, 예후 및 진행의 임상학적 정의는 병기로서 알려진 특정한 분류에 의존한다. 이러한 병기 시스템은 암의 진단, 및/또는 예후, 및/또는 진행의 요약을 제공하는 다수의 상이한 암 진단 마커 및 암 증상을 수집하도록 작용한다. 병기 시스템을 사용하여 암의 진단, 및/또는 예후, 및/또는 진행을 평가하는 방법, 및 그럴려면 어떤 암 진단 마커 및 암 증상이 사용되어야 하는지는 종양학 분야의 숙련가에게 알려져 있을 것이다.
"암 병기"에, 본 발명자들은 0기, I기, II기, III기 및 IV기를 포함하는 라이(Rai) 병기, 및/또는 A기, B기 및 C기를 포함하는 비네트(Binet) 병기, 및/또는 I기, II기, III기 및 IV기를 포함하는 앤 아버(Ann Arbour) 병기를 포함한다.
암이 세포의 형태학에서 비정상을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 비정상은 종종 특정한 암에서 재생적으로 발생하고, 이는 형태학에서 이러한 변화의 검사(조직학적 검사로도 알려짐)가 암의 진단 또는 예후에서 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 세포의 형태학을 검사하기 위한 샘플의 가시화, 및 가시화를 위한 샘플의 제조를 위한 기술은 당해 분야에 잘 알려져 있고; 예를 들면, 광학 현미경 또는 공초점 현미경이 있다.
"조직학적 검사"에, 본 발명자들은 작은 성숙 림프구의 존재, 및/또는 세포질의 좁은 경계를 갖는 작은 성숙 림프구의 존재, 분명한 핵소체가 부족한 밀도 있는 핵을 갖는 작은 성숙 림프구의 존재, 및/또는 세포질의 좁은 경계 및 분명한 핵소체가 부족한 밀도 있는 핵을 갖는 작은 성숙 림프구의 존재, 및/또는 비정형 세포, 및/또는 절단된 세포, 및/또는 전림프구의 존재를 포함한다.
암이 세포의 DNA에서 돌연변이의 결과라는 것이 잘 알려져 있고, 이는 세포가 세포 사멸을 피하거나 제어할 수 없게 증식하는 것을 야기할 수 있다. 따라서, 이러한 변이체의 검사(또한 세포유전학적 검사로도 알려짐)는 암의 진단 및/또는 예후를 평가하는 유용한 도구일 수 있다. 이의 예는 염색체 위치 13q14.1의 결실이고, 이는 만성 림프구성 백혈병이 특징이다. 세포에서 돌연변이를 검사하기 위한 기술은 당해 분야에 잘 알려져 있고; 예를 들면, 형광 동일반응계 혼성화(FISH)가 있다.
"세포유전학적 검사"에, 본 발명자들은 세포에서 DNA, 및, 특히 염색체의 검사를 포함한다. 세포유전학적 검사는 불응성 암 및/또는 재발한 암의 존재와 연관될 수 있는 DNA 변화를 식별하는데 사용될 수 있다. 이는 염색체 13의 롱 암의 결실, 및/또는 염색체 위치 13q14.1의 결실, 및/또는 염색체 12의 삼염색체, 및/또는 염색체 12의 롱 암의 결실, 및/또는 염색체 11의 롱 암의 결실, 및/또는 11q의 결실, 및/또는 염색체 6의 롱 암의 결실, 및/또는 6q의 결실, 및/또는 염색체 17의 숏 암의 결실, 및/또는 17p의 결실, 및/또는 t(11:14) 전좌, 및/또는 (q13:q32) 전좌, 및/또는 항원 유전자 수용체 재배열, 및/또는 BCL2 재배열, 및/또는 BCL6 재배열, 및/또는 t(14:18) 전좌, 및/또는 t(11:14) 전좌, 및/또는 (q13:q32) 전좌, 및/또는 (3:v) 전좌, 및/또는 (8:14) 전좌, 및/또는 (8:v) 전좌, 및/또는 t(11:14) 및 (q13:q32) 전좌를 포함할 수 있다.
암을 갖는 대상체는 특정한 신체 증상을 나타내는 것으로 알려져 있고, 이는 종종 신체에서 암의 부담으로 결과로 인한 것이다. 이러한 증상은 종종 동일한 암에서 재발하고, 따라서 질환의 진단, 및/또는 예후, 및/또는 진행의 특징이 될 수 있다. 의학 분야의 숙련가는 어떤 신체 증상이 어떤 암과 연관이 있는지, 및 이러한 신체 체계의 평가가 질환의 진단, 및/또는 예후, 및/또는 진행과 연관될 수 있는 방법을 이해할 것이다.
"신체 증상"에, 본 발명자들은 간비대, 및/또는 비장비대를 포함한다.
"반응하지 않았던 대상체"에, 본 발명자들은 치료 전과 치료 중단 후를 비교 시, 및/또는 치료 동안과 치료 중단 후 사이를 비교 시, 및/또는 치료 동안 대상체에서 바로 상기 실시형태의 (i), 및/또는 (ii), 및/또는 (iii), 및/또는 (iv), 및/또는 (v), 및/또는 (vi), 및/또는 (vii), 및/또는 (viii), 및/또는 (ix), 및/또는 (x), 및/또는 (xi), 및/또는 (xii), 및/또는 (xiii), 및/또는 (xiv) 및/또는 (xv) 요소의 측정 및/또는 평가가 변화하지 않는 것, 또는 변화가 무시할 수 있는 정도로 발생한 경우를 포함한다.
"대상체의 부분 관해"에, 본 발명자들은 "림프구 계수"에 있어서 치료 전과 비교하여 치료 중단 후 및/또는 치료 동안, 림프구의 수에서 적어도 50% 감소가 존재하는 것, 및/또는 "림프절 평가"에 있어서 치료 전과 비교하여 치료 중단 후 및/또는 치료 동안, 하나 이상의 림프절의 크기에서 적어도 50%가 감소하는 것, 및/또는 추가로 확대된 림프절이 없음, 및/또는 "신체 증상"에 있어서 치료 전과 비교하여 치료 중단 후 및/또는 치료 동안 비장의 크기에서 적어도 50% 감소하는 것(비장비대와 관련하여), 및/또는 치료 전과 비교하여 치료 중단 후 및/또는 치료 동안 간의 크기에서 적어도 50% 감소하는 것(간비대와 관련하여), 및/또는 "호중구 계수"에 있어서 1500 세포/㎕ 이하, 및/또는 "혈소판 계수"에 있어서 100,000 혈소판/㎕ 이하가 존재하는 것, 및/또는 치료 전과 비교하여 치료 중단 후 및/또는 치료 동안 호중구 계수의 수에서 적어도 50% 감소하는 것, 및/또는 "헤모글로빈 계수"에 있어서 11 g/㎗ 이하가 존재하는 것, 및/또는 치료 전과 비교하여 치료 중단 후 및/또는 치료 동안 헤모글로빈의 양에서 적어도 50% 감소가 존재하는 것을 포함한다.
"대상체의 완전 관해"에, 본 발명자들은 "림프구 계수"에 있어서 많아도 4000 세포/㎕의 세포 수가 존재하는 것, 및/또는 "림프절 평가"에 있어서 림프절이 직경이 많아도 1.5cm인 것, 및/또는 "신체 증상"에 있어서 검출 가능하지 않은 간비대 및/또는 검출 가능하지 않은 비장비대가 존재하는 것, 및/또는 "호중구 계수"에 있어서 1500 세포/㎕ 이하, 및/또는 "혈소판 계수"에 있어서 100,000 혈소판/㎕ 이하가 존재하는 것, 및/또는 "헤모글로빈 계수"에 있어서 11 g/㎗ 이하가 존재하는 것을 포함한다.
"대상체에서 진행되었던 암"에, 본 발명자들은 "림프구 계수"에 있어서 치료 전과 비교하여 치료 중단 후 및/또는 치료 동안 림프구 계수의 수에서 적어도 50% 증가가 존재하는 것, 및/또는 적어도 5000 세포/㎕ 이상, 및/또는 "림프절 평가"에 있어서 적어도 1.5cm의 직경으로의 림프절의 확대가 존재하는 것, 및/또는 치료 전과 비교하여 치료 중단 후 및/또는 치료 동안 림프절의 크기에서 적어도 50% 증가, 및/또는 "신체 증상"에 있어서 간비대의 외양이 존재하는 것, 및/또는 비장비대의 외양이 존재하는 것, 및/또는 치료 전과 비교하여 치료 중단 후 및/또는 치료 동안 비장 크기에서 적어도 50% 증가하는 것(비장비대와 관련하여) 및/또는 치료 전과 비교하여 치료 중단 후 및/또는 치료 동안 간 크기에서 적어도 50% 증가하는 것(간비대와 관련하여), 및/또는 "헤모글로빈 계수"에 있어서 20 g/L 이상으로 헤모글로빈 수준 감소, 및/또는 100g/L 미만으로 헤모글로빈 수준 감소, "혈소판 계수"에 있어서 치료 전과 비교하여 치료 중단 후 및/또는 치료 동안 호중구 계수의 수에서 적어도 50% 감소가 존재하는 것, 및/또는 많아도 100,000 혈소판/㎕가 존재하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 제제가 폴리펩타이드; 또는 안티칼린; 또는 펩타이드; 또는 항체; 또는 키메라 항체; 또는 단쇄 항체; 또는 앱타머; 또는 다르핀(darpin); 또는 Fab, 또는 F(ab')2, 또는 Fv, 또는 ScFv 또는 dAb 항체 단편; 또는 IgG2 항체; 또는 IgG4 항체; 또는 IgG2 및 IgG4의 키메라 분자; 또는 N297Q 돌연변이를 포함한 항체 변이체; 또는 DANA 변이 항체; 또는 소분자; 또는 천연 생성물; 또는 아피바디; 또는 펩타이드모방체; 또는 핵산; 또는 펩타이드 핵산 분자; 또는 지질; 또는 탄수화물; 또는 안키린 반복 단백질, 또는 아라마딜로 반복 단백질, 또는 류신 풍부 단백질, 또는 테타리오펩타이드 반복 단백질, 또는 설계된 안키린 반복 단백질(Designed Ankyrin Repeat Protein: DARPin)을 포함하는 분자 골격을 기반으로 한 단백질을 포함하는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 (ii)에서 정의된 바와 같은 제제가 특이적으로 FcγRIIb와 결합하는 하나 이상의 항체 분자인, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 (ii)에서 정의된 바와 같은 제제가 이펙터 세포를 모집할 수 있는 도메인을 포함하지 않는 하나 이상의 항체 분자인, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
면역계는 각각이 면역 반응을 생성하거나, 보조하거나, 유지하는 상이한 역할을 갖는 다수의 상이한 세포 유형을 포함한다. 면역에서 이의 역할을 담당하기 위하여, 면역계의 세포는 종종 자극에 반응하여 세포가 특정한 신체 위치 또는 표적(예를 들면, 신호를 보유한 세포)으로 이동하도록 야기할 것이다. 면역계의 세포의 한 부류는 이펙터 세포이고; 이의 정체성 및 역할은 면역학 분야의 숙련가에게 잘 알려질 것이다.
"이펙터 세포"에 본 발명자들은 이펙터 T 세포, 및/또는 이펙터 B 세포(또한 형질 세포로도 알려짐), 및/또는 이펙터 기억 T 세포, 및/또는 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및/또는 이펙터 기억 CD8+ T 세포를 포함한다.
"이펙터 세포를 모집할 수 있는 도메인"에, 본 발명자들은 이펙터 세포를 항체 분자의 위치로 이동시킬 항체 분자 위의 에피토프 및/또는 항원을 포함한다. 본 발명자들은 또한 이펙터 세포를 모집할 수 있는 도메인이 항체 분자의 Fc 도메인, 및/또는 항원 및/또는 항체 분자의 Fc 도메인 위의 에피토프일 수 있다는 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 (ii)에서 정의된 바와 같은 제제가 단클론 항체 분자, 및/또는 다클론 항체 분자, 및/또는 이중-특이적 항체 분자인 하나 이상의 항체 분자인, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
상기 요약된 바와 같이, 항체의 상이한 유형 및 형태는 본 발명에 포함되고, 면역학 분야의 숙련가에게 잘 알려질 것이다. 치료적 목적으로 사용되는 항체가 종종 항체 분자의 성질을 변형하는 추가의 구성분으로 변형된다는 것이 잘 알려져 있다.
따라서, 본 발명자들은 본 발명의 항체 분자(예를 들면, 단클론 항체 분자, 및/또는 다클론 항체 분자, 및/또는 이중-특이적 항체 분자)가 검출 가능한 잔기 및/또는 세포독성 잔기를 포함한다는 것을 포함한다.
"검출 가능한 잔기"에, 본 발명자들은 효소; 방사성 원자; 형광 잔기; 화학발광 잔기; 생물발광 잔기를 포함하는 군으로부터의 하나 이상을 포함한다. 검출 가능한 잔기는 항체 분자가 시험관내, 및/또는 생체내, 및/또는 생체외에서 가시화되는 것을 허용한다.
"세포독성 잔기"에, 본 발명자들은 방사성 잔기, 및/또는 효소를 포함하고, 여기서 효소는 카스파제, 및/또는 독소이고, 독소는 박테리아성 독소 또는 독이고; 세포독성 잔기는 세포 용해를 유도할 수 있다.
본 발명자들은 추가로 항체 분자가 단리된 형태 및/또는 정제된 형태일 수 있고/있거나 PEG화될 수 있다는것을 포함한다.
하기 실시형태에 있어서, 서열 번호는 하기 클론에 나타낸 서열을 지칭한다.
상기 논의된 바와 같이, 항체의 CDR은 항체 표적에 결합한다. 본 명세서에 기재된 각각의 CDR에 아미노산의 배정은 문헌[Kabat EA et al. 1991, In "Sequences of Proteins of Immulogical Interest" Fifth Edition, NIH Publication No. 91-3242, pp xv-xvii]에 따른 정의에 따른 것이다.
숙련가는 각각의 CDR에 아미노산을 배정하는 다른 방법이 또한 존재한다는 것을 알 것이다. 예를 들면, 문헌[http://www.imgt.org/ and Lefranc and Lefranc "The Immunoglobulin FactsBook" published by Academic Press, 2001]이 있다.
3개 이하의 CDR 영역(몇몇 경우, 심지어 단지 단일 CDR 또는 이의 한 부분)을 함유하는 분자는 CDR(들)이 유래된 항체의 항원-결합 활성을 보유할 수 있다는 것이 인식된다. 예를 들면, 문헌[Gao et al., 1994, J. Biol. Chem., 269: 32389-93]에서 전체 VL 쇄(모든 3개의 CDR 포함)는 이의 기질에 높은 친화도를 갖는 것으로 기재된다.
2개의 CDR 영역을 함유하는 분자가, 예를 들면, 문헌[Vaughan & Sollazzo 2001, Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 4: 417-430]에 기재된다. 418쪽(우측 열 - 3 우리의 설계 전략)에 골격 영역 내에 배지된 H1 및 H2 CDR 초가변 영역만을 포함하는 미니바디가 기재되어 있다. 미니바디는 표적에 결합할 수 있는 것으로 기재되어 있다. 문헌[Pessi et al., 1993, Nature, 362: 367-9 및 Bianchi et al., 1994, J. Mol. Biol., 236: 649-59]은 본 앤 솔라쪼(Vaughan & Sollazzo)에 의해 참고되고, H1 및 H2 미니바디 및 이의 성질에 대하여 상세히 기재된다. 문헌[Qiu et al., 2007, Nature Biotechnology, 25:921-9]에서 2개의 결합된 CDR로 이루어진 분자가 항원과 결합할 수 있다는 것이 증명된다. 문헌[Quiocho 1993, Nature, 362: 293-4]은 "미니바디" 기술이 요약을 제공한다.[Ladner 2007, Nature Biotechnology, 25:875-7]은 항원-결합 활성을 보유할 수 있는 2개의 CDR을 함유하는 분자가 논의된다.
단일 CDR 영역을 함유하는 분자는, 예를 들면, 문헌[Laune et al., 1997, JBC, 272: 30937-44]에 기재되고, 여기서 CDR로부터 유래된 헥사펩타이드 범위는 항원-결합 활성을 나타내는 것이 증명되고, 완전한, 단일, CDR의 합성 펩타이드는 강한 결합 활성을 나타내는 것으로 기재되어 있다. 문헌[Monnet et al., 1999, JBC, 274: 3789-96]에 12-머 펩타이드의 범위 및 연관된 골격 영역은 항원-결합 활성을 갖는 것으로 나타났고, CDR3-유사 펩타이드가 단독으로 항원과 결합할 수 있는지 여부에 대하여 논의된다. 문헌[Heap et al., 2005, J. Gen. Virol., 86: 1791-1800]에 "마이크로-항체"(단일 CDR을 함유하는 분자)가 항원에 결합하는 것이 보고되고, 항-HIV 항체로부터의 환형 펩타이드가 항원-결합 활성 및 기능을 갖는 것으로 나타난다. 문헌[Nicaise et al., 2004, Protein Science, 13:1882-91]에서 단일 CDR은 이의 리소자임 항원에 항원-결합 활성 및 친화도를 부여할 수 있는 것을 나타난다.
따라서, 3개 이하의 CDR을 갖는 분자가 이들이 유래된 것에 대하여 항체의 항원 결합 성질을 보유할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명은 제제가 하기 CDR을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 포함하는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다:
(i) 서열 번호 51 및 서열 번호 52 및 서열 번호 53; 또는
(ii) 서열 번호 57 및 서열 번호 58 및 서열 번호 59; 또는
(iii) 서열 번호 63 및 서열 번호 64 및 서열 번호 65; 또는
(iv) 서열 번호 69 및 서열 번호 70 및 서열 번호 71; 또는
(v) 서열 번호 75 및 서열 번호 76 및 서열 번호 77; 또는
(vi) 서열 번호 81 및 서열 번호 82 및 서열 번호 83; 또는
(vii) 서열 번호 87 및 서열 번호 88 및 서열 번호 89; 또는
(viii) 서열 번호 93 및 서열 번호 94 및 서열 번호 95; 또는
(ix) 서열 번호 99 및 서열 번호 100 및 서열 번호 101; 또는
(x) 서열 번호 105 및 서열 번호 106 및 서열 번호 107; 또는
(xi) 서열 번호 111 및 서열 번호 112 및 서열 번호 113; 또는
(xii) 서열 번호 117 및 서열 번호 118 및 서열 번호 119; 또는
(xiii) 서열 번호 123 및 서열 번호 124 및 서열 번호 125; 또는
(xiv) 서열 번호 129 및 서열 번호 130 및 서열 번호 131; 또는
(xv) 서열 번호 135 및 서열 번호 136 및 서열 번호 137; 또는
(xvi) 서열 번호 141 및 서열 번호 142 및 서열 번호 143; 또는
(xvii) 서열 번호 147 및 서열 번호 148 및 서열 번호 149; 또는
(xviii) 서열 번호 153 및 서열 번호 154 및 서열 번호 155; 또는
(xix) 서열 번호 159 및 서열 번호 160 및 서열 번호 161; 또는
(xx) 서열 번호 165 및 서열 번호 166 및 서열 번호 167; 또는
(xxi) 서열 번호 171 및 서열 번호 172 및 서열 번호 173; 또는
(xxii) 서열 번호 177 및 서열 번호 178 및 서열 번호 179; 또는
(xxiii) 서열 번호 183 및 서열 번호 184 및 서열 번호 185; 또는
(xxiv) 서열 번호 189 및 서열 번호 190 및 서열 번호 191.
바람직하게는, 본 발명은 제제가 하기 CDR을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다:
(i) 서열 번호 54 및 서열 번호 55 및 서열 번호 56; 또는
(ii) 서열 번호 60 및 서열 번호 61 및 서열 번호 62; 또는
(iii) 서열 번호 66 및 서열 번호 67 및 서열 번호 68; 또는
(iv) 서열 번호 72 및 서열 번호 73 및 서열 번호 74; 또는
(v) 서열 번호 78 및 서열 번호 79 및 서열 번호 80; 또는
(vi) 서열 번호 84 및 서열 번호 85 및 서열 번호 86; 또는
(vii) 서열 번호 90 및 서열 번호 91 및 서열 번호 92; 또는
(viii) 서열 번호 96 및 서열 번호 97 및 서열 번호 98; 또는
(ix) 서열 번호 102 및 서열 번호 103 및 서열 번호 104; 또는
(x) 서열 번호 108 및 서열 번호 109 및 서열 번호 110; 또는
(xi) 서열 번호 114 및 서열 번호 115 및 서열 번호 116; 또는
(xii) 서열 번호 120 및 서열 번호 121 및 서열 번호 122; 또는
(xiii) 서열 번호 126 및 서열 번호 127 및 서열 번호 128; 또는
(xiv) 서열 번호 132 및 서열 번호 133 및 서열 번호 134; 또는
(xv) 서열 번호 138 및 서열 번호 139 및 서열 번호 140; 또는
(xvi) 서열 번호 144 및 서열 번호 145 및 서열 번호 146; 또는
(xvii) 서열 번호 150 및 서열 번호 151 및 서열 번호 152; 또는
(xviii) 서열 번호 156 및 서열 번호 157 및 서열 번호 158; 또는
(xix) 서열 번호 162 및 서열 번호 163 및 서열 번호 164; 또는
(xx) 서열 번호 168 및 서열 번호 169 및 서열 번호 170; 또는
(xxi) 서열 번호 174 및 서열 번호 175 및 서열 번호 176; 또는
(xxii) 서열 번호 180 및 서열 번호 181 및 서열 번호 182; 또는
(xxiii) 서열 번호 186 및 서열 번호 187 및 서열 번호 188; 또는
(xxiv) 서열 번호 192 및 서열 번호 193 및 서열 번호 194.
바람직하게는, 본 발명은 제제가 서열 번호 3; 서열 번호 4; 서열 번호 5; 서열 번호 6; 서열 번호 7; 서열 번호 8; 서열 번호 9; 서열 번호 10; 서열 번호 11; 서열 번호 12; 서열 번호 13; 서열 번호 14; 서열 번호 15; 서열 번호 16; 서열 번호 17; 서열 번호 18; 서열 번호 19; 서열 번호 20; 서열 번호 21; 서열 번호 22; 서열 번호 23; 서열 번호 24; 서열 번호 25; 및 서열 번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄(VH) 아미노산 서열을 포함하는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 제제가 서열 번호 27; 서열 번호 28; 서열 번호 29; 서열 번호 30; 서열 번호 31; 서열 번호 32; 서열 번호 33; 서열 번호 34; 서열 번호 35; 서열 번호 36; 서열 번호 37; 서열 번호 38; 서열 번호 39; 서열 번호 40; 서열 번호 41; 서열 번호 42; 서열 번호 43; 서열 번호 44; 서열 번호 45; 서열 번호 46; 서열 번호 47; 서열 번호 48; 서열 번호 49; 및 서열 번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 경쇄(VL) 아미노산 서열을 포함하는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 제제가 하기 CDR 아미노산 서열을 포함하는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다:
(i) 서열 번호 51 및 서열 번호 52 및 서열 번호 53 및 서열 번호 54 및 서열 번호 55 및 서열 번호 56; 또는
(ii) 서열 번호 57 및 서열 번호 58 및 서열 번호 59 및 서열 번호 60 및 서열 번호 61 및 서열 번호 62; 또는
(iii) 서열 번호 63 및 서열 번호 64 및 서열 번호 65 및 서열 번호 66 및 서열 번호 67 및 서열 번호 68; 또는
(iv) 서열 번호 69 및 서열 번호 70 및 서열 번호 71 및 서열 번호 72 및 서열 번호 73 및 서열 번호 74; 또는
(v) 서열 번호 75 및 서열 번호 76 및 서열 번호 77 및 서열 번호 78 및 서열 번호 79 및 서열 번호 80; 또는
(vi) 서열 번호 81 및 서열 번호 82 및 서열 번호 83 및 서열 번호 84 및 서열 번호 85 및 서열 번호 86; 또는
(vii) 서열 번호 87 및 서열 번호 88 및 서열 번호 89 및 서열 번호 90 및 서열 번호 91 및 서열 번호 92; 또는
(viii) 서열 번호 93 및 서열 번호 94 및 서열 번호 95 및 서열 번호 96 및 서열 번호 97 및 서열 번호 98; 또는
(ix) 서열 번호 99 및 서열 번호 100 및 서열 번호 101 및 서열 번호 102 및 서열 번호 103 및 서열 번호 104; 또는
(x) 서열 번호 105 및 서열 번호 106 및 서열 번호 107 및 서열 번호 108 및 서열 번호 109 및 서열 번호 110; 또는
(xi) 서열 번호 111 및 서열 번호 112 및 서열 번호 113 및 서열 번호 114 및 서열 번호 115 및 서열 번호 116; 또는
(xii) 서열 번호 117 및 서열 번호 118 및 서열 번호 119 및 서열 번호 120 및 서열 번호 121 및 서열 번호 122; 또는
(xiii) 서열 번호 123 및 서열 번호 124 및 서열 번호 125 및 서열 번호 126 및 서열 번호 127 및 서열 번호 128; 또는
(xiv) 서열 번호 129 및 서열 번호 130 및 서열 번호 131 및 서열 번호 132 및 서열 번호 133 및 서열 번호 134; 또는
(xv) 서열 번호 135 및 서열 번호 136 및 서열 번호 137 및 서열 번호 138 및 서열 번호 139 및 서열 번호 140; 또는
(xvi) 서열 번호 141 및 서열 번호 142 및 서열 번호 143 및 서열 번호 144 및 서열 번호 145 및 서열 번호 146; 또는
(xvii) 서열 번호 147 및 서열 번호 148 및 서열 번호 149 및 서열 번호 150 및 서열 번호 151 및 서열 번호 152; 또는
(xviii) 서열 번호 153 및 서열 번호 154 및 서열 번호 155 및 서열 번호 156 및 서열 번호 157 및 서열 번호 158; 또는
(xix) 서열 번호 159 및 서열 번호 160 및 서열 번호 161 및 서열 번호 162 및 서열 번호 163 및 서열 번호 164; 또는
(xx) 서열 번호 165 및 서열 번호 166 및 서열 번호 167 및 서열 번호 168 및 서열 번호 169 및 서열 번호 170; 또는
(xxi) 서열 번호 171 및 서열 번호 172 및 서열 번호 173 및 서열 번호 174 및 서열 번호 175 및 서열 번호 176; 또는
(xxii) 서열 번호 177 및 서열 번호 178 및 서열 번호 179 및 서열 번호 180 및 서열 번호 181 및 서열 번호 182; 또는
(xxiii) 서열 번호 183 및 서열 번호 184 및 서열 번호 185 및 서열 번호 186 및 서열 번호 187 및 서열 번호 188; 또는
(xxiv) 서열 번호 189 및 서열 번호 190 및 서열 번호 191 및 서열 번호 192 및 서열 번호 193 및 서열 번호 194.
바람직하게는, 본 발명은 제제가 하기 아미노산 서열을 포함하는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다:
(i) 서열 번호 3 및 서열 번호 27; 또는
(ii) 서열 번호 4 및 서열 번호 28; 또는
(iii) 서열 번호 5 및 서열 번호 29; 또는
(iv) 서열 번호 6 및 서열 번호 30; 또는
(v) 서열 번호 7 및 서열 번호 31; 또는
(vi) 서열 번호 8 및 서열 번호 32; 또는
(vii) 서열 번호 9 및 서열 번호 33; 또는
(viii) 서열 번호 10 및 서열 번호 34; 또는
(ix) 서열 번호 11 및 서열 번호 35; 또는
(x) 서열 번호 12 및 서열 번호 36; 또는
(xi) 서열 번호 13 및 서열 번호 37; 또는
(xii) 서열 번호 14 및 서열 번호 38; 또는
(xiii) 서열 번호 15 및 서열 번호 39; 또는
(xiv) 서열 번호 16 및 서열 번호 40; 또는
(xv) 서열 번호 17 및 서열 번호 41; 또는
(xvi) 서열 번호 18 및 서열 번호 42; 또는
(xvii) 서열 번호 19 및 서열 번호 43; 또는
(xviii) 서열 번호 20 및 서열 번호 44; 또는
(xix) 서열 번호 21 및 서열 번호 45; 또는
(xx) 서열 번호 22 및 서열 번호 46; 또는
(xxi) 서열 번호 23 및 서열 번호 47; 또는
(xxii) 서열 번호 24 및 서열 번호 48; 또는
(xxiii) 서열 번호 25 및 서열 번호 49; 또는
(xxiv) 서열 번호 26 및 서열 번호 50.
본 발명의 제제는 또한 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 불변 영역(CH) 및 (CL)을 포함할 수 있다.
추가의 실시형태에 있어서, 제제는 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합을 방지하거나 감소시키기 위하여 본 명세서에 기재된 본 발명의 제제, 예를 들면, 상기 실시형태에 기재된 아미노산 서열(예를 들면, 서열 번호 1-194)을 포함하는 제제와 경쟁할 수 있다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 제제(예를 들면, 항원 분자)로 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합을 방지하거나 감소시키기 위하여 "경쟁할 수 있음"에, 본 발명자들은 시험된 제제가 FcγRIIb에 대한 본 명세서에 정의된 바와 같은 제제의 결합을 저해하거나, 그렇지 않으면, 적어도 부분적으로, 방해하거나, Fc 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합을 방지하거나 감소시킬 수 있는 것을 의미한다.
예를 들면, 제제는 본 명세서에 기재된 제제의 결합을 적어도 약 10%; 예를 들면, 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100% 저해할 수 있고/있거나 항체 분자의 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합을 방지하거나 감소시키는 제제의 능력을 적어도 약 10%; 예를 들면, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 억제할 수 있다.
경쟁 결합은 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)과 같은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려진 방법으로 측정될 수 있다.
ELISA 분석은 에피토프-변형 또는 항체 차단을 평가하는데 사용될 수 있다. 경쟁 항체를 확인하는데 적합한 추가의 방법은 문헌[항체: A Laboratory Manual, Harlow & Lane]에 기재되고, 이는 참고로서 본 명세서에 포함된다(예를 들면, 567 내지 569, 574 내지 576, 583 및 590 내지 612쪽, 1988, CSHL, NY, ISBN 0-87969-314-2 참고).
본 발명의 제제는 하기 불변 영역(CH 및 CL)을 포함할 수 있다:
IgG1-CH[서열 번호 1]
l-CL[서열 번호 2]
본 발명의 제제는 하기 클론의 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다:
항체 클론: 1A01
1A01-VH[서열 번호 3]
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항체 클론: 6C12
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항체 클론: 6H08
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CDR 영역
CDRH1: NYGMH[서열 번호 177]
CDRH2: VISYDGSNKYYAD SVKG[서열 번호 178]
CDRH3: EYKDAFDI[서열 번호 179]
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항체 클론: 7C07
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7C07-VL[서열 번호 49]
CDR 영역
CDRH1: SYGMH[서열 번호 183]
CDRH2: VISYDGSNKYYADSVKG[서열 번호 184]
CDRH3: EFGYIILDY[서열 번호 185]
CDRL1: SGSSSNIGSNTVN[서열 번호 186]
CDRL2: RDYERPS[서열 번호 187]
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항체 클론: 4B02
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4B02-VL[서열 번호 50]
CDR 영역
CDRH1: NHGMH[서열 번호 189]
CDRH2: VISYDGTNKYYADSVRG[서열 번호 190]
CDRH3: ETWDAFDV[서열 번호 191]
CDRL1: SGSSSNIGSNNAN[서열 번호 192]
CDRL2: DNNKRPS[서열 번호 193]
CDRL3: QAWDSSTVV[서열 번호 194]
바람직하게는, 본 발명은 제제가 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb의 결합을 방지하거나 감소키시기 위한 상기 실시형태에서 정의된 바와 같은 제제와 경쟁할 수 있는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 제제가 FcγRIIb 신호전달을 방지하거나 감소시키는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
Fc 수용체는 세포 신호전달을 통해 세포 행동을 조절할 수 있다. 세포 생물학 분야의 숙련가에게 어떤 다운스트림 세포 신호전달 조절제가 FcγRIIb 신호전달에 의해 활성화 및/또는 비활성화되는지, 그리고 이러한 세포 신호전달 조절제의 활성화 및/또는 비활성화가 세포에 어떤 효과를 갖는지가 알려질 것이다.
"제제가 FcγRIIb 신호전달을 방지하거나 감소시키는 것"에, 본 발명자들은 FcγRIIb가 Fc 도메인에 결합시 FcγRIIb 신호전달이 방지되거나 감소되는 것, 및/또는 FcγRIIb가 Fc 도메인에 결합하지 않을시 FcγRIIb 신호전달이 방지되거나 감소되는 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 제제가 표적 세포에 의해 항체 분자의 내재화를 방지하거나 감소시키는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 세포 표면 항원이 CD19: 또는 이의 일부분; CD20: 또는 이의 일부분; CD40: 또는 이의 일부분; CD52: 또는 이의 일부분; Thy-1(즉, CD90, 분화 90의 클러스터(Biofactors. 2009 May-Jun;35(3):258-65)): 또는 이의 일부분; Ly-6(즉, 림프구 항원 6(Mol Biol Rep. 2009 Apr;36(4):697-703)): 또는 이의 일부분; CD59(즉, 보체 조절 단백질(Mol Immunol. 2007 Jan;44(l-3):73-81)): 또는 이의 일부분; Fas(즉, FS7-연관 세포 표면 항원, CD95, APO-1 또는 TNFRSF6(Adv Exp Med Biol. 2009;647:64-93)): 또는 이의 일부분; EGFR(즉, 표피 성장 인자 수용체(FEBS J. 2010 Jan;277(2):301-8)): 또는 이의 일부분; Her2(즉, 인간 표피 성장 인자 수용체 2(Clin Breast Cancer. 2008 Oct; 8(5): 392- 401)): 또는 이의 일부분; CXCR4(즉, 케모킨 수용체 4(Biochim Biophys Acta. 2007 Apr;1768(4):952-63)): 또는 이의 일부분; HLA 분자(즉, 인간 백혈구 항원 분자(Korean J Lab Med. 2010 Jun;30(3):203)): 또는 이의 일부분; GM1(즉, 강글리오시드, 모노시알로테트라헥소실강글리오시드(J Lipid Res. 2010 Sep;51(9):2731-8)): 또는 이의 일부분; CD22(즉, Cheson(2008) NEJM 359(6): 613-26): 또는 이의 일부분; CD23(Cheson, 2008): 또는 이의 일부분; CD80(Cheson, 2008): 또는 이의 일부분; CD74(Cheson, 2008): 또는 이의 일부분; DRD(Cheson, 2008): 또는 이의 일부분으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 (i)에서 정의된 바와 같은 항체 분자가 특이적으로 CD20에 결합하는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 (i)에서 정의된 바와 같은 항체 분자가 유형 I CD20 항체인, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 (i)에서 정의된 바와 같은 항체 분자가 유형 II CD20 항체인, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
CD20 항체 분자의 2가지 유형이 존재하고, 이는 발명자들에 의해 2003년에 다른 그룹에 속하는 것으로 처음으로 정의되었고(Cragg et al., 2003. Complement-mediated lysis by anti-CD20 mAb correlates with segregation into lipid rafts. Blood 101:1045-1052 및 Chan, et al., 2003. CD20-induced lymphoma cell death is independent of both caspases and its redistribution into triton X-100 insoluble membrane rafts. Cancer Res 63:5480-5489), 그 다음, 후속적으로 2004년에 유형 I 및 II 항체 분자로서 정의되었다(Cragg and Glennie 2004. Antibody specificity controls in vivo effector mechanisms of anti-CD20 reagents. Blood 103:2738-2743). 초기 이에 대한 근거는 림프종 이종이식을 근절할 수 있는 능력을 기반으로 한 시약의 2개의 개별적인 유형인 보체를 이용하는 유형 I(예를 들면, 리툭시맙 및 1F5); 및 유형 II(예를 들면, Bl)에 속하는 항-CD20 mAb가 아닌 것이었다. 항체 분자의 두가지 유형은 생존의 우수한 연장을 제공하지만, CVF 투여에 의한 보체 활성의 감속에 의해 리툭시맙 및 1F5의 효능을 상당히 감소시키지만, Bl의 활성에 영향을 미치지 못하였다. 이러한 결과는 상이한 CD20 항체 분자는 생체내 상이한 이펙터 메커니즘을 작동시키는 것으로 명확하게 나타났다. 게다가, 이들은 리툭시맙 및 1F5를 나타내는 이전 작업과 완전하게 일치하고, 이는 Bl-유형 항체 분자는 할 수 없는 어떤 것인, 표적 세포 막에서 지질 래프트에 대한 전좌 CD20의 결과로서 효과적으로 보체를 활성화시킬 수 있다(Cragg et al., 2003. Complement-mediated lysis by anti-CD20 mAb correlates with segregation into lipid rafts. Blood 101:1045-1052). 보체와 연계되고 CD20를 유도하여 지질 래프트로 이동시키는 항체 분자의 능력과 우수한 관련성이 존재한다(Cragg et al., 2003. Complement-mediated lysis by anti-CD20 mAb correlates with segregation into lipid rafts. Blood 101:1045-1052 및 Cragg, and Glennie 2004. Antibody specificity controls in vivo effector mechanisms of anti-CD20 reagents. Blood 103:2738-2743). 따라서 유형 I 및 II 종류는 CD20를 지질 래프트로 이동시키는 이의 능력에 의해 정의될 수 있다. 이는 하기 지시된 바와 같이 결정될 수 있다. 또한 더 강력한 동형성 부착 및 직접적인 세포 사멸을 유도할 수 있는 유형 II 항체 분자와 관련성이 존재하지만, 이들은 유형 I 또는 II 항체 분자를 정의하는데 단독으로 사용될 수 없다(Tx-100 래프트 분석과 달리; 하기 참조).
따라서, 다양한 항-CD20 항체 분자는 원형질 막에서 CD20를 재분배하는 이의 능력 및 다양한 이펙터 분석에서 이의 활성에 따라 유형 I(예를 들면, 리툭시맙 및 오파투무맙) 또는 유형 II(예를 들면, 토시투모맙(Bl), GA101 및 11B8)로 분류된다(Weng and Levy 2009. Genetic polymorphism of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIb is not associated with clinical outcome in patients with follicular lymphoma treated with rituximab. Leuk Lymphoma 50:723-727., Chan et al., 2003. CD20-induced lymphoma cell death is independent of both caspases and its redistribution into triton X-100 insoluble membrane rafts. Cancer Res 63:5480-5489 및 Cragg and Glennie2004. Antibody specificity controls in vivo effector mechanisms of anti-CD20 reagents. Blood 103:2738-2743). 유형 I(예를 들면, 리툭시맙, 오파투무맙) 항-CD20 항체 분자는 CD20를 유도하여 큰 세제 내성 마이크로도메인(래프트)으로 재분배하는 반면, 유형 II(토시투모맙-유사) 항-CD20 단클론 항체는 그렇지 않다(Beer et al., 2010. Seminars in Haematology 47(2):ppl07-l 14).
상기 논의된 바와 같이, 항-CD20 항체 분자는 이들이 CD20를 지질 래프트로 재분재하는지 여부에 따라 유형 I 또는 유형 II으로서 설계될 수 있다. 이는 Tx-100 불용해성 분석 또는 수크로스 밀도 구배 분리 및 웨스턴 블롯팅에 의해 수행된다. 두 방법 모두 하기와 같이 문헌[Cragg et al Blood 2003]에 기재된다:
1. 트리톤 X-100 불용해성에 의한 래프트 연관된 항원의 평가
래프트 마이크로도메인에서 항원 존재의 신속한 평가로서, 본 발명자들은 저온에서 트리톤 X-100 불용해성을 기반으로 한 유세포 분석 방법을 이용하였다. 간략하게, 세포를 RPMI/1% BSA 중에서 세척하고, 2.5 x 106/㎖로 재현탁시켰다. 그 다음, 세포를 FITC 접합된 mAb 10 ㎍/㎖와 함께 15분 동안 37℃에서 배양하고, 차가운 PBS/1% BSA/20mM 나트륨 아자이드 중에서 세척한 다음, 샘플을 반으로 나누었다. 이분의 일은 100% 표면 항원 수준의 계산을 허용하기 위해 얼음 위에 유지하고, 다른 이분의 일은 0.5% 트리톤 X-100으로 15분 동안 얼음 위에서 처리하여 불용해성 래프트 분획 중에 남은 항원의 비율을 측정하였다. 그 다음, 세포를 나머지 분석 전체에서 4℃에서 유지하고, PBS/BSA/아자이드에서 1회 세척하고, 재현탁하고, 상기 설명된 바와 같이 유세포 분석으로 평가하였다. 유사한 결과를 검출의 간접적인 방법을 사용하여 수득하였다. 표적 항원의 래프트 연관의 구성요소 수준을 측정하기 위하여, 세포를 먼저 0.5% 트리톤 X-100으로 15분 동안 얼음 위에서 처리하고, FITC-표지된 mAb의 결합 전에 PBS/BSA/아자이드 중에서 세척하였다. 더 많은 항원이 추가의 가교결합에 의해 트리톤 X-100 불용해성 분획으로 이동될 수 있는지 여부를 평가하기 위하여, 세포를 상기와 같이 FITC-mAb와 함께 배양한 다음, 4개로 나누었다. 이러한 샘플 중 2개를 염소 항-마우스 Ig F(ab')2 단편과 15분 동안 얼음 위에서 배양하였다. 세척 후, 가교결합된 샘플 중 1개 및 가교결합되지 않은 샘플 중 1개를 트리톤 X-100 중에 용해시키고, 유세포 분석 전에 상기 설명된 바와 같이 세척하였다.
2. 수크로스 밀도 구배 분리 및 웨스턴 블롯팅 - 지질 래프트 분획의 제조 및 웨스턴 블롯팅
단클론 Ab(1㎍/106 세포)를 37℃에서 세포에 가하였다. 20분 배양 후, 세포를 MES-완충된 염수(25mM MES, pH 6.5, 150mM NaCl, 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 5 ug/㎖ 아프로티닌, 5 ㎍/㎖ 루펩틴, 10mM EDTA) 중의 얼음-차가운 1.0% 트리톤 X-100 중에 펠렛화 및 용해시켰다. 그 다음, 지질 래프트 분획을 수크로스 밀도 구배 원심분리에 의해 제조되었다. 간략하게, 용해물을 용해 완충제 중의 80% 수크로스의 동량 용적과 혼합하고, 비연속 5 내지 30% 수크로스 밀도 구배와 중첩시킨 다음, 200,000 x g로 16시간 동안 원심분리하였다. 분획(0.5㎖)을 수집하고, 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 각각의 분획의 15 ㎖ 분취량을 2 x 로딩 완충제 중에 1:1로 희석하고, 95℃로 5분 동안 가열하고, PVDF 막 위로 옮기기 전, 15% SDS- PAGE 겔 위에 분리하고, 일차 항체(예를 들면, 마우스 항-CD20, CD20 또는 항-Lyn 토끼 폴리세라를 검출하는 클론 7D1; 래프트 분획을 확인하는 세로텍(Serotec, 영국에 소재)와 배양한 다음, HRP-접합된 이차 항체(아머샴 바이오사이언시스 UK 엘티디(Amersham Biosciences UK Ltd))와 배양하였다. 블롯을 ECL + 플러스(아머샴 바이오사이언시스 UK 엘티디)를 사용하여 가시화하였다.
항-CD20 항체 분자는 CD20의 큰 루프에서 AxP 모티프를 필요로 할 수 있다(오파투무맙 및 기타 Genmab 항체는 그렇지 않다). 그러나, 문헌[Niederfellner, G et al. 2011. Blood 118, 358-367]은 유형 I과 비교하여 CD20 루프의 약간 상이한 영역에 결합하는 유형 II 항체 분자를 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명은 유형 I CD20 항체가 리툭시맙, 또는 리툭시맙 바이오시밀러, 또는 오파투무맙인, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 유형 II CD20 항체가 오비누투주맙, 또는 토시투모맙인, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 (i)에서 정의된 바와 같은 항체 분자가 CD52 항체인, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 CD52 항체가 알렘투주맙인, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 조성물 또는 키트가 하나 이상의 치료적 제제를 포함하는, 조성물, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 조성물이 추가로 하나 이상의 치료적 제제를 포함하는, 용도를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 대상체가 추가로 하나 이상의 치료적 제제로 투여되는, 방법을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 대상체가 불응성 암 또는 재발한 암을 갖거나, 대상체가 불응성 암 및 재발한 암을 갖는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 대상체가 불응성 만성 림프구성 백혈병 또는 재발한 만성 림프구성 백혈병을 갖거나, 대상체가 불응성 만성 림프구성 백혈병 및 재발한 만성 림프구성 백혈병을 갖는, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 실질적으로 설명, 및/또는 실시예, 및/또는 첨부된 도면을 참고로 하여 본 명세서에 기재되고/기재되거나 청구된 바와 같은, 조성물, 또는 용도, 또는 방법, 또는 키트를 제공한다.
명백하게 이전에 공개된 문서의 본 명세서에서의 열거 또는 논의는 반드시 문서가 최첨단 부분이거나 주지의 일반적인 지식이라는 인정으로서 취해질 필요는 없다.
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도 1a. hFcγRIIB와 hFcγRIIA를 구별할 수 있는 mAb의 생성 및 특성화 (A) scFv 클론을 hFcγRIIB 또는 및 hFcγRIIA에 대한 특이적 결합을 위하여 스크리닝하였다. 황색 점은 전체-길이 IgG로 전환을 위하여 선택된 hFcγRIIB에 특이적인 클론을 나타낸다. (B) hFcγRIIB mAb의 결합 분석. hFcγRIIB mAb를 hFcγRIIB-형질감염된 세포(적색선) 또는 hFcγRIIA-형질감염된 세포(청색선)에 대한 결합을 평가하였다. 동일한 mAb를 IC 위에 존재하에 hFcγRIIB-형질감염된 세포에 대한 결합에 대하여 평가하고(3 nM, 녹색선), 이는 mAb가 hFcγRIIB-발현 세포에 대한 IC 결합과 경쟁할 수 있다는 것을 지시한다. 도면을 hFcγRIIB 클론을 대표하는 것으로부터의 데이터를 나타낸다. (C) 유세포 분석에 의해 측정된 PBMC 집단 위에 생성된 결합 프로파일. hFcγRIIA 특이적 mAb는 단핵구 및 호중구에 대한 강한 결합을 나타내는 반면, 6A09가 또한 단핵구 및 호중구에 결합하고, hFcγRIIA 및 B에 이중-특이적으로 보이는 것을 제외하고, hFcγRIIB 특이적 mAb는 B 세포에 우선적으로 결합한다. (D) B 세포에 대한 mAb의 용량-의존성 결합. mAb를 0.1, 1 또는 10 ㎍/㎖로 가하였고, 염색 강도는 유세포 분석으로 측정하였다. (E) hFcγRIIB mAb의 친화도. hFcγRIIB 특이적 mAb(7C07, 5C04, 5C05)의 선택을 표면 플라즈몬 공명에 의해 다양한 농도의 hFcγRIIB 융합 단백질(0(적색), 0.16(녹색), 0.8(청색), 4(분홍색), 20(청록색), 및 100(갈색) nM)에 대한 이들의 결합에 대하여 평가하였다. 센소그램은 각각의 mAb에 대한 전형적인 결합 반응을 나타낸다. KD 값은 1:1 결합 모델(표 2 참조)로부터 계산하였다.
도 1b. hFcγRII mAb(AT10)의 치료적 효과 및 hFcγRIIB 및 hFcγRIIA를 구별할 수 있는 특이적 mAb의 생성 (상부) Daudi 세포(s.c.)로 이종이식된 SCID 마우스(5/그룹)을 화살표가 지시하는 바와 같이 처리하였다(i.p.). 평균 종양 중량을 ± SEM로 플롯팅하고, 비쌍체 t 시험을 사용하여 분석하고; p 값으로 리툭시맙(Rit) 단독 대 Rit + AT10-처리된 그룹(**p≤0.005)을 비교한다. 대표적인 데이터(n=2). (하부) hFcγRIIB-(적색선) 또는 hFcγRIIA-형질감염된 세포(청색선)에 대한 hFcγRIIB mAb 결합 및 hFcγRIIB-형질감염된 세포(녹색선)에 대한 IC 결합의 mAb-의존성 저해. 또한 도 7 및 8 및 표 6을 참조한다.
도 2. hFcγRIIB mAb는 표적 세포의 표면에서 FcγRIIB와 연계된 리툭시맙(Rit)을 차단할 수 있다. (A) hFcγRIIB ITIM 인산화를 유도하는 hFcγRIIB 특이적 mAb의 능력. Raji 세포를 N297Q hFcγRIIB 특이적 mAb(10 ㎍/㎖)로 37℃에서 30분 동안 처리한 후, 용해하고, hFcγRIIB의 인산화 상태(pFcγRIIB)에 대한 면역블롯팅으로 평가하였다. hIgG1 동형 대조군(iso ctrl) 및 Rit를 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용하였다. α-튜불린을 로딩 대조군으로서 프로빙하였다. (B) Rit에 의해 유도된 hFcγRIIB ITIM 인산화를 차단하는 hFcγRIIB 특이적 mAb의 능력. Raji 세포를 N297Q hFcγRIIB mAb(10 ㎍/㎖)로 10분 동안 전처리한 후, Rit 10 ㎍/㎖를 37℃에서 30분 동안 가하였다. 처리된 세포를 용해하고, 상기와 같이 pFcγγRIIB 및 α-튜불린에 대한 면역블롯팅으로 평가하였다. 적어도 3개의 독립적인 실험의 대표적인 블롯이 표시된다. (C) Rit에 의해 유도된 내재화를 차단하는 hFcγRIIB 특이적 mAb의 능력. 벡터 ctrl 또는 hFcγRIIB-형질감염된 Ramos 세포를 hFcγRIIB mAb의 WT 또는 N297Q 변이체(10 ㎍/㎖) 및 AF488-표지된 Rit(5 ㎍/㎖)로 지시된 시간점 동안 37℃에서 처리하였다. Rit의 내재화를 ??칭 분석을 사용하여 측정하고, 표면 CD20 발현의 %로서 표시한다. CD20의 연계에 따라 유의미하게 내재화되지 않기 때문에 AF488-표지된 토시투모맙을 음성 대조군으로서 사용하였다.22 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. (D) Rit 내재화를 차단하는 mAb의 패널의 능력(C에 도시됨)은 상대적으로 높은 친화력(R 2 = 0.78)과 연관성이 있었다. (E) Rit 내재화를 차단하는 mAb의 패널의 능력(C에 도시됨)은, 이미지 J(Image J) 밀도계 소프트웨어(R 2 = 0.79)로 평가된 바, hFcγRIIB(B)의 Rit-유도된 인산화를 차단하는 이들의 능력과 연관성이 있었다.
도 3. hFcγRIIB mAb 6G11은 시험관내 강력한 세포독성 활성을 갖고, 표적 CLL 세포의 표면 위의 hFcγRIIB와 Rit 연계를 차단할 수 있다. (A) hFcγRIIB mAb 7C07 및 6G11의 IHC 분석을 냉동된 조직의 범위에 대하여 평가하였다. 6G11은 비림프구성 세포에 대한 사실상 부재하는 백그라운드 염색으로 인간 비장에서 세포에 매우 특이적 결합 및 시노몰구스 원숭이 또는 마우스로부터 비장 조직에 대한 거의 없는 염색을 나타내고, 7C07은 예상되는 바와 같은 림프구뿐만 아니라 인간 및 시노몰구스 원숭이 조직 둘 다의 내피 내벽에 모두 결합을 나타냈다. (B 내지 E) 일차 환자 CLL 세포에 대하여 ADCC(B), PCD(C) 및 ADCP(D)를 측정하는 분석에서 6G11의 세포독성 능력. CLL 세포를 6G11(10 ㎍/㎖)로 옵소닌 처리하고; Rit(10 ㎍/㎖)를 각각이 분석에서 양성 대조군으로서 가하였다. 각각의 점은 1명의 CLL 환자로부터의 삼중 샘플의 평균을 나타낸다. (E) 높거나 낮은 친화도 hFcγRIIIA 대립 변이체(각각 158F 및 V)를 갖는 이펙터 세포를 사용하는 ADCC 분석. 6G11는 두 경우에서 Rit와 비교하여 ADCC를 유도 시 더 강력하였다. 도면은 3개의 상이한 CLL 공여자를 사용하여 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다. (F) CLL 세포의 표면으로부터의 Rit 내재화를 손상시키는 6G11의 능력. 6개의 CLL 샘플을 WT(좌측 패널) 또는 N297Q(우측 패널) mAb, iso ctrl 또는 6G11(10-20 ㎍/㎖) 및 AF488-표지된 Rit(5 ㎍/㎖)로 37℃에서 6시간 이하 동안 처리하였다. Rit의 내재화를 상기와 같이 평가하고, 표면 CD20 발현%로 표시하였다. (G) CLL 세포의 표면에 남는 6G11의 능력. 6개의 CLL 샘플을 WT 또는 N297Q 6G11(10 ㎍/㎖)로 6시간 이하 동안 처리하고, hFcγRIIB 표면 발현을 항-hF(ab')2-PE에 의한 염색으로 간접적으로 정량하였다. 값을 얼음 위에서 0 시간에 수행된 염색에 대하여 정규화시키고, 표면 hFcγRIIB 발현%로서 표시하였다. 데이터를 박스 및 위스커스(Whiskers) 플롯으로 표시하고; p 값으로 지시된 바와 같은 그룹을 비교한다(*p ≤ 0.05). (H 및 I) 6G11에 의한 ADCP의 증대. CFSE-표지된 CLL 세포를 N297Q iso ctrl 또는 6G11과 병용으로 3시간 동안 배양에서 Rit로 옵소닌 처리하고, 세척하고, 5:1 비로 MDM에 가하였다. 동시배양에 따라, -CD206-APC 염색을 사용하여 MDM를 확인하고, 결과를 유세포 분석으로 분석하였다. 대표적인 점 플롯을 (H)에 나타내고, 이중-양성 이벤트의 %를 (I)에 나타낸 식균작용된 CFSE+ve CLL 세포를 갖는 MDM의 비율로서 계산하였다. (J) 6G11에 의한 ADCC의 증대. CLL 세포를 N297Q iso ctrl 또는 6G11와 병용으로 3시간 동안 Rit로 옵소닌 처리한 다음, NK 세포와 동시배양하였다. 각각의 점은 하나의 일차 CLL 샘플로부터 삼중의 평균을 나타낸다. 데이터를 쌍체 t 시험(B, C, D, E, I 및 J) t 시험을 통해 분석하고; p 값으로 지시된 바와 같은 그룹을 비교한다(*p ≤ 0.05, **p ≤ 0.005, ****p = 0.0001).
도 4a. hFcγRIIB mAb 6G11은 생체내 활성이고, B 세포의 CD20 mAb 고갈을 강화시킨다. (A 및 B) 생체내 hFcγRIIB+ve 표적 세포를 제거하는 6G11의 능력. 각각 높거나 낮은 수준의 CFSE로 표지된 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 표적 및 mFcγRII-/- 비표적 C57BL/6 비장세포를 WT 또는 γKO C57BL/6 마우스로 선별적으로 전달하였다(i.v.). 24시간 후, 마우스에 지시된 WT 또는 N297Q 6G11 mAb(i.v.)를 제공하고; 16시간 후 순환성(A) 또는 비장(B) 세포를 분석하여 남은 표적 대 비표적 비를 측정하였다. ctrl(NT) 표적:비표적 비 1.0을 수득하도록 데이터를 규정화하였다. 각각의 점은 개체 마우스로부터의 결과를 수평선(± SEM)에 의해 지시된 평균 비와 함께 나타낸다. 데이터를 적어도 2개의 독립적인 실험으로부터 조합한다. (C 내지 E) 생체내 표적 세포를 제거하는 Rit의 능력을 증대하는 6G11의 능력. (C) 각각 높거나 낮은 수준의 CFSE로 표지된 hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 표적 및 mFcγRII-/- 비표적 C57BL/6 비장세포를 상기와 같이 WT C57BL/6 부형제 마우스에 주사하였다(i.v.). 24시간 후, 마우스에 지시된 mAb 단독 또는 병용(5 내지 10㎍; i.v.)을 제공하고; 16시간 후, 비장을 분석하여 표적 대 비표적 비를 측정하고, 상기와 같이 정규화하였다. 데이터를 적어도 3개의 독립적인 실험으로부터 조합한다. (D) CFSE+ve hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 표적 및 mFcγRII-/- 비표적 C57BL/6 비장세포를 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- C57BL/6 부형제 마우스에 상기와 같이 주사하였다(i.v.). 1일 및 2일에, 마우스에 WT 6G11(500㎍; i.v./i.p.)를 제공한 후, Rit(5 내지 50㎍; i.v.)를 2일에 제공하고; 16시간 후, 비장을 분석하여 표적 대 비표적 비를 측정하고, 상기와 같이 규정화하였다. 데이터를 적어도 3개의 독립적인 실험으로부터 조합한다. (E) hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- C57BL/6 마우스에 0일에 Rit 또는 6G11(500㎍) 또는 각각의 mAb 250 ㎍을 병용으로 i.v. 제공하고, 지시된 바와 같이 순환성 B 세포의 수를 시간에 따라 측정하였다. 막대는 전처리 수준으로 정규화된, 적어도 2개의 독립적인 실험으로부터 12마리 이하의 마우스/그룹에서 순환성 B 세포의 %의 평균 ± SEM을 나타낸다. 양방향 ANOVA 통계 시험을 수행하여 치료 그룹을 비교하고; p 값으로 지시된 바와 같이 그룹을 비교하였다(**p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001). (F 내지 G) 생체내 표적 세포를 제거하는 GA101gly의 능력을 증대하는 6G11의 능력. CFSE+ve hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 표적 및 mFcγRII-/- 비표적 C57BL/6 비장세포를 WT 부형제 마우스에 주사하고(i.v.), 후속적으로 1일에 GA101gly 또는 6G11 단독 또는 병용(0.2㎍; i.v.)으로 시험하고, 16시간 후, 비장을 부석하여 표적 대 비표적 비를 측정하고, 상기와 같이 표시하였다. 데이터를 3개의 독립적인 실험으로부터 조합한다. (G) CFSE+ve hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 표적 및 mFcγRII-/- 비표적 C57BL/6 비장세포를 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 부형제 마우스에 주사하고(i.v.), 후속적으로 1일 및 2일에 WT iso ctrl 또는 6G11(500㎍; i.p.)로 처리하고, 2일에 GA101gly(1 ㎍; i.v.)로 처리하고, 16시간 후, 비장을 분석하여 표적 대 비표적 비를 측정하고, 상기 설명된 바와 같이 표시하였다. 일방향 ANOVA 통계 시험을 수행하여 치료 그룹과 NT / iso ctrl 또는 CD20 mAb/6G11 단독-처리된 그룹(A-D 및 F-G)을 비교하고; p 값으로 지시된 바와 같이 그룹을 비교한다(*p ≤ 0.05, **p = 0.01, ***p ≤ 0.001).
도 4b. hFcγRIIB mAb 6G11은 생체내 활성이고, B 세포의 CD20 mAb 고갈을 강화시킨다. hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스에 0일에 Rit ± WT 또는 N297Q 6G11(20 ㎎/㎏) 또는 각각의 항체 10 ㎎/㎏을 병용으로 제공하고, 다수의 순환성 B 세포를 시간에 따라 평가하였다. (상부) 전치료 및 2일 후 mAb 주사를 나타내는 순환성 B 세포를 분석하는 대표적인 점 플롯. 상부 우측 사분면은 전치료 수준과 비교된 % B 세포를 나타낸다. (하부) 좌측 그래프 Rit ± WT 6G11에 의한 순환성 B 세포의 고갈을 나타내고; 상부 우측 그래프는 Rit ± WT 또는 N297Q 6G11에 의한 순환성 B 세포의 고갈을 나타내고; 하부 우측 그래프는 Rit(m2a; 4 ㎎/㎏) ± 6G11(mIgG1; 20 ㎎/㎏)에 의한 순환성 B 세포의 고갈을 나타낸다. 전치료 수준으로 정규화된 % 순환성 B 세포 후치료의 평균 + SD를 나타내고; 12마리 이하의 마우스/그룹을 적어도 2개의 독립적인 실험으로부터 조합하였다. 양방향 ANOVA 수행하였다. 또한 도 15를 참고한다.
도 5a. hFcγRIIB mAb 6G11은 생체내 환자 CLL 세포의 Rit 고갈을 강화시킨다. (A-B) 일차 환자 CLL 세포를 NOD/SCID 마우스에 생착하고, 인간에서 관찰된 것과 유사한, 비장에서 뚜렷한 증식성 클러스터가 형성된다. 마우스를 6-10x107 일차 환자 CLL 세포로 i.v. 접종 전에 조사하였다. 주사 4 내지 5일 후, 비장을 획득하고, 절개를 제조하고, (A) hCD19(적색) 또는 Ki67(녹색)의 존재에 대하여 염색하고, 면역형광으로 평가하거나, (B) hCD20 및 Ki67에 대하여 IHC로 평가한다. (C) 인간 CLL 세포가 주사된 마우스에서 Rit, 6G11 또는 병용의 항-종양 활성. NOD/SCID 마우스를 상기와 같이 일차 인간 CLL 세포로 접종하고, 접종 4 내지 5일 후, 마우스를 hCD20 mAb, hFcγRII mAb 또는 둘 다의 1-10 ㎎/㎏으로 처리하였다. 2 내지 3일 후, 마우스에 제2 주사를 제공하고, 마지막 치료 2 내지 3일 후 희생시키고, 비장에 남은 인간 CLL 세포의 %를 열거하고, 동형 대조군 mAb로 치료 후 존재하는 비율로 규정화하였다. 10명의 상이한 환자로부터의 CLL 샘플을 이러한 방식으로 평가하였다. 각각의 점은 1마리의 마우스를 나타낸다. (D 및 E) 그 다음, 완전 반응자(D), 즉, 비장에서 CLL 세포가 검출되지 않은 마우스, 및 객관적인 반응자, 즉, CLL 세포(E)에서 ≥75% 감소를 갖는 마우스의 비율을 (C)에서 상기 나타낸 데이터로부터 계산하였다. (F-G) 생체내 치료에 불응성인 환자 CLL 세포의 반응. 이전에 불응성으로 정의된 환자로부터의 CLL 세포(n=4; 표 4 참조)를 (C-E)에서와 같이 접종하고, 처리하고 평가하였다. (F)는 개체 마우스를 나타내는 점이 있는 기초 데이터를 나타내고, (G)는 Rit-불응성 환자에서 객관적인 반응자의 빈도를 나타낸다. 일방향 ANOVA 분석을 수행하여 치료 그룹을 비교하고; p 값으로 지시된 바와 같이 그룹을 비교한다(*p ≤ 0.05, **p = 0.01, ***p ≤ 0.001).
도 5b. hFcγRIIB mAb 6G11은 생체내 정상 및 악성 표적 세포의 치료적 mAb 고갈을 강화시킨다. (A-B) 일차 환자 CLL 세포가 생착된 NOD/SCID 마우스의 비장을 면역형광(A) 또는 IHC(B); ctrl, 일차 mAb 없음으로 평가하였다. (C) 인간 CLL 세포(n=11 환자)가 이종이식된 마우스를 hCD20 mAb(Rit), hFcγRIIB mAb(6G11), 또는 둘 다의 1-10 ㎎/㎏으로 처리하고, 비장에 남은 CLL 세포 %를 열거하고, iso ctrl으로 치료 후 비율에 대해 정규화하였다. (D) 이전에 불응성으로 정의된 환자로부터의 CLL 세포가 이종이식된 마우스(n=4)를 (C)에서와 같이 처리하고 평가하였다. (E) CFSE+ hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/-(표적) 및 mFcγRII-/-(비표적) 비장세포를 WT 마우스로 주사하고(i.v.), GA101gly 또는 6G11 단독 또는 병용(0.008 ㎎/㎏)으로 처리하고, 상기와 같이 비장에서 결실을 평가하였다. 데이터를 2 내지 3개의 독립적인 실험으로부터 조합하였다. (F) CFSE+ hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/-(표적) 및 mFcγRII-/-(비표적) 비장세포를 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 부형제 마우스에 주사하고, WT iso ctrl 또는 6G11(20 ㎎/㎏) 후, GA101gly(0.04 ㎎/㎏)로 처리하고, (E)에서와 같이 분석하였다. (G) CLL 세포로 생착된 마우스(n=4)를 GA101(0.2 ㎎/㎏), 6G11(1 ㎎/㎏), 또는 둘 다로 처리하고, (C)에서와 같이 분석하였다. (H) CLL 세포로 생착된 마우스(n=3)를 알렘투주맙(Alem; 1 ㎎/㎏), 6G11(1 ㎎/㎏) 또는 둘 다로 처리하고, (C)에서와 같이 평가하였다. (C-D 및 G-H) 파이 도표는 표 1에 정의된 바와 같은, mAb 요법 후 NR(흑색), 또는 (청색) 및 CR(녹색) 일차 환자 CLL-함유 마우스의 수를 나타낸다. (C-H) 각각의 점은 수평선에 의해 지시된 바와 같은 평균 비율과 함께 개체 마우스를 나타낸다. (E 및 F) 일방향 ANOVA 및 (C-D 및 G-H) 순열 통계 시험을 사용하여 데이터를 분석하였다. 또한 도 16 및 17 및 표 8 및 4를 참고한다.
도 6a. hFcγRIIB mAb 6G11은 용인되고, 생체내 및 시험관내 시스템에서 임상전 독성을 야기하지 않는다. (A-D) 단일 투여 후 6G11의 생체내 효능 및 반감기(도 17A). 연령 및 성별 매칭된 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스(6-7 마우스/그룹)에 지시된 농도의 WT 6G11 mAb를 주사하였다(i.v. 또는 i.p.). (A) 순환성 B 세포의 %를 시간에 따라 7일까지 유세포 분석으로 평가하였다. (B) 7일에 마우스를 희생시키고, 비장의 B 세포의 수(비장 림프구의 %로서 표시됨)를 유세포 분석으로 정량하였다. (C) 혈청 6G11 mAb 농도 및 (D) MAHA 역가를 7일 기간에 걸쳐 물질 및 방법 부분에 기재된 바와 같은 MSD(평균 + SEM)로 평가하였다. (E-F) 다중 투여 후, 생체내 효능 및 6G11의 반감기. 연령 및 성별 매칭된 hFcγRIIB Tg x mFcγRII-/- 마우스(6 마우스/그룹) 또는 mFcγRII-/- 마우스(3 마우스/그룹)에 0일에 10 ㎎/㎏ WT 6G11 mAb를 i.v. 주사한 후, 3, 7 및 10일에 동일한 용량의 i.p. 주사를 제공하였다. 마우스를 10일 후(24일) 희생시키고, 장기를 독성에 대하여 평가하였다(도 17C). (E) 혈액을 시간에 따라 샘플링하고, 순환성 B 세포를 유세포 분석으로 평가하였다(평균 + SD). (F) 6G11 mAb에 대항한 MAHA 역가를 (D)에서와 같이 평가하였다(평균 + SEM). (G) 고밀도 전배양된 인간 PBMC를 사용하는 시험관내 사이토킨 반응. 인간 PBMC를 1x107/㎖로 48시간 동안 전배양한 다음, PBS(NT) 또는 iso ctrl 또는 6G11의 WT 또는 N297Q 변이체 10 ㎍/㎖을 48시간 동안 가하였다. 상청액을 수확하고, IFN-γ, IL-6, IL-10 및 TNF-α의 농도를 MSD로 평가하였다. CD3 mAb(OKT3)를 양성 대조군으로서 최적 및 차선의 농도(각각 1 및 0.02 ㎍/㎖)로 사용하였다. 데이터는 3명의 독립적인 건강한 공여자로부터의 PBMC를 사용하는 3개의 독립적인 실험의 대표이다(평균 ± SEM).
도 6b. hFcγRIIB mAb 6G11은 용인되고, 독성을 야기하지 않는다. hFcγRIIB+ 혈액 B 세포(좌측 그래프), 단핵구(중간 그래프) 또는 호중구(우측 그래프)의 고갈에서 Rit ± WT 또는 N297Q 6G11의 효능을 평가하는 시험관내 전혈 고갈 분석. 평균 값을 나타내고(수평선), 각각의 점을 개별적인 공여자를 나타낸다. 또한 도 14, 도 18 및 도 19 그리고고 표 7을 참조한다.
도 7. hFcγRII mAb(AT10)는 생체내 Rit에 의한 악성 B 세포의 제거를 강화한다. (A) 5x106 Daudi 또는 (B) Raji 세포를 마트리겐 중에 1:1 비로 혼합하여 SCID 마우스(5마리 이하의 마우스/그룹)의 옆구리에 주사하였다(s.c.). 종양-함유 마우스에 후속적으로 X축(화살표)에 지시된 바와 같이, 지시된 mAb를 7일에 출발하여 주 단위로, 4회 이하로, 주사하였다. 종양 성장을 시간에 따라 모니터링하고, 하기 화학식을 사용하여 추정하였다: [중량 = (길이 × 너비2)/2]. 평균 종양 용적을 측정값 ± SE로 플롯팅하였다. 2개의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 데이터를 나타낸다. (C) 2.5x106 Raji 세포를 SCID 마우스(6마리 마우스/그룹)에 주사하였다(i.v.). 상기와 같이, 종양-함유 마우스에 후속적으로 지시된 mAb를 7일에 시작하여 주 단위로, 4회 이하로, 주사하였다(i.p.). 마우스를 시간에 따라 모니터링하고, 최종 종양 발달의 징후의 발병되면 희생시킨다. 비쌍체 t 시험을 사용하여 데이터를 분석하고; p 값으로 지시된 바와 같이 그룹을 비교한다(*p ≤ 0.05, **p ≤ 0.005).
도 8. 생성된 클론은 hFcγRIIB에 매우 특이적이다. (A) 고도로 상동성 hFcγRIIB 단백질(하부)과 비교된 hFcγRIIA 아미노산(aa) 서열(상부)의 정렬. 차이를 적색으로 강조하고, IgG 결합 부위를 나타낸다. (B-D) hFcγRIIB-특이적 mAb를 PBMC와 함께 배양한 다음, CD14+ve 단핵구에 대한 결합, (B) CD19+ve B 세포(C) 또는 CD3+ve T 세포(D)를 유세포 분석으로 평가하였다. 혈액에서 CD19+ve B 세포에 대한 높은 용량-의존성 결합(C)은 2B08 및 2E08을 제외한 모든 클론에 대하여 관찰된 반면, CD14+ve 단핵구에 대한 결합(B)에 대하여 반대가 성립하였다. 클론 6A09는 단핵구 및 B 세포 둘 다에 대한 교차 반응성을 나타냈다. (D) mAb 중 어느 것도 CD3+ve T 세포를 염색하지 않았다.
도 9. hFcγRIIB mAb의 WT 및 N297Q 변이체 둘 다는 표적 세포의 표면으로부터의 Rit 내재화를 동일하게 차단할 수 있다. (A-B) 각각 단리된 인간 편도선 B 세포(A) 및 일차 말초 혈액 단핵구(B) 위의 hFcγRIIB ITIM 인산화(pFcγRIIB)를 유도하는 WT 및/또는 N297Q(NQ) hFcγRIIB 특이적 mAb(클론 6G11 및 6G08)의 능력. α-튜불린, GAPDH 및 hFcγRIIB를 지시된 바와 같이, 로딩 대조군으로서 사용하고; 대표적인 블롯을 나타냈다. (C) hFcγRIIB-형질감염된 Ramos 세포를 37℃에서 지시된 시간점 동안 hFcγRIIB mAb(길항제 및 효능제의 선택을 나타냄) 또는 동형 대조군(iso ctrl) 및 AF488-표지된 Rit(Rit; 5 ㎍/㎖)의 선택의 WT 또는 N297Q 변이체(10 ㎍/㎖)로 처리하였다. Rit의 내재화를 ??칭 분석을 사용하여 측정하고, 표면 CD20 발현의 퍼센트로서 표시하였다. AF488-표지된 토시투모맙은 CD20의 연계 후 유의미하게 내재화하지 않음으로써 음성 대조군으로서 사용되었다.22 3개의 독립적인 실험의 평균 + SD를 나타냈다.
도 10. 시험관내 hFcγRIIB mAb의 ADCC 활성 (A) hFcγRIIB mAb로 옵소진 전처리된 Raji 세포를 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 정제된 NK 세포와 동시 배양하고, ADDC 활성을 물질 및 방법 부분에서 기재된 바와 같이 평가하였다. 도면은 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 + SD를 나타낸다. (B) A에서의 결과를 기반으로, 7개의 hFcγRIIB 특이적 mAb를 농도의 범위에 따라 ADCC 활성에 대해 추가로 기험하였다. Rit(Rit)는 양성 대조군으로서 포함되었다. 모든 hFcγRIIB mAb는 Rit보다 더 바람직하게 수행하는 것을 나타냈고, 심지어 낮은 농도에서도, 7C07 및 6G11가 가장 우수한 수행의 mAb였다. 2개 중 하나의 대표적인 실험을 나타내고; 데이터 점은 삼중 샘플로부터 평균 ± SD를 나타낸다.
도 11. WT 또는 N297Q hFcγRIIB mAb로 염색된 인간 조직의 IHC. 7C07 또는 6G11의 WT 또는 N297Q 변이체를 다양한 조직으로부터 수득된 신선한 냉동 절편에 가하였다. 과산화수소 블록 없이 티라마이드 시그널 앰플리피케이션(TSA: Tyramide Signal Amplification; 퍼킨엘머(PerkinElmer)) 증폭을 사용하여 조직 반응성을 검출하였다. (A) 인간 비장의 7C07 염색. 7C07은 비특이적으로 유동 및 혈관을 염색하는 것을 나타냈다. (B) 6G11의 WT 또는 N297Q 변이체를 인간 비장 절편에 가하고, 상기 설명된 바와 같이 결합을 평가하였다. 두 형식은 모두 이러한 조직에서 동등하게 소 림프구 세포를 염색하는 것으로 나타났다. (C) 부분에 지시된 바와 같이, 다양한 인간 조직으로부터의 냉동보존된 횡단면에 대한 6G11 염색(1 ㎍/㎖) 후, TSA 검출. 반응성이 관찰되지 않았다.
도 12. 아글리코실화된 N297Q 6G11 변이체는 고유한 Fc-의존성 이펙터 활성이 결여되어 있고, 시험관내에서 ADDC를 유도하는데 실패한다. 일차 인간 CLL 세포를 6G11의 WT 또는 N297Q 버전 또는 WT hIgG1 동형 대조군(10 ㎍/㎖)으로 옵소닌 처리한 다음, NK92 세포와 동시 배양하고, ADDC 활성을 물질 및 방법 부분에 기재된 바와 같이 평가하였다. WT 6G11과 달리, N297Q 6G11 mAb는, iso ctrl-옵소닌 처리된 표적 세포와 유사한 ADCC 효능에 의해 설명된 바와 같이, 고유한 Fc 매개된 이펙터 기능을 갖지 않는다. 각각의 점은 1명의 CLL 환자를 나타내고; 쌍체 스튜던트 t 시험에 의해 측정된 바, **** p ≤ 0.0001.
도 13. hFcγRIIB는 일차 인간 CLL 세포 위의 CD20보다 mAb-유도된 내재화에 더 내성이 있다. 6개의 CLL 샘플을 AF488-표지된 Rit(회색 막대) 또는 AF488-표지된 WT 6G11(백색 막대) 5 ㎍/㎖로 37℃에서 2 또는 6시간 동안 내재화 평가 전에 상기와 같이 처리하고; 표면 CD20 또는 hFcγRIIB 발현%를 나타낸다. (B) 6개의 CLL 샘플을 WT 또는 N297Q AT10(10 ㎍/㎖)로 1 내지 6시간 동안 처리하고, 항-hF(ab')2-PE 염색으로 hFcγRIIB 표면 발현을 간접적으로 정량하였다. 값을 얼음 위에서 0 시간에 수행된 염색에 정규화시키고, 표면 hFcγRIIB 발현%로서 표시하였다. 데이터를 박스 및 위스커스 블롯으로 표시하고, 윌콕슨(Wilcoxon) 시험을 수행하여 치료 그룹을 비교하고; p 값으로 지시된 바와 같이 그룹을 비교한다(*p ≤ 0.05).
도 14a 내지 도 14c. hFcγRIIB 마우스의 생성 및 특성화 (A) 전체 길이 hFcγRIIB2를 Raji 세포로부터 증폭시키고, 오버랩핑 PCR을 통해 동일한 세포로부터 단리된 천연 hFcγRIIB 프로모터로 결찰시켜 지시된 구조물을 생성하였다. (B) hFcγRIIB Tg의 발현을 양성 및 음성 마우스 라인에서 PCR 증폭으로 평가하였다. (C) 마우스를 생성하고, 역교배시키고, 순환성 혈액을 CD19-PE 및 hFcγRII(AT10)-FITC mAb에 의한 염색에 의해 표현형화하고, 유세포 분석으로 평가하였다. (D) 발현 활성 및 저해성 mFcγRII 및/또는 hFcγRIIB 수용체를 지시된 마우스 계통으로부터 생성된 BMDM에 대하여 특이적 자체 제조된 mAb를 사용하여 조사하였다(Tutt et al, 준비 중인 원고). 데이터는 인간 이식유전자의 존재하에 활성 및 저해성 mFcγR에서 상보적 변화의 부족을 나타낸다. (E) mFcγRII 또는 hFcγRIIB의 발현을 각각 지시된 WT 또는 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스의 비장으로부터의 CD19-ve CD11b+ve NK1.1-ve Ly6G+ve 호중구에 대하여 평가하였다. 3개의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 점 플롯을 나타낸다. 예상되는 바와 같이, 호중구에서 mFcγRII는 발현되지만 hFcγRIIB는 발현되지 않는다. (F) WT 또는 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스 비장으로부터의 냉동 절편을 면역형광으로 분석하고, hFcγRIIB Tg의 발현을 평가하고, 지시된 마커(각각 AT130-2 및 AT10 mAb; 적색); B 세포(B220; 상부 패널(녹색)) 및 대식세포(F4/80; 하부 패널(녹색))를 사용하여 내인성 mFcγRII 수용체와 비교하였다.
도 14d. hFcγRIIB Tg 마우스의 생성 및 특성화 및 6G11 mAb의 PK, PD, MABEL 및 CRS-유도 성질의 평가. 도 14에 관한 것이다. (D) 면역표현형 마우스 백혈구 하위세트를 위한 게이팅 전략(Rose et al, 2012). (E) mFcγRII 또는 hFcγRIIB의 발현을 각각, 지시된 WT 또는 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스 및 인간 혈액의 순환성(혈액) 및 비장 B 세포, 단핵구/대식세포 및 호중구에 대하여 평가하였다. 적어도 3개의 독립적인 실험의 대표적인 점 플롯을 나타낸다.
도 14e. hFcγRIIB Tg 마우스의 생성 및 특성화 및 6G11 mAb의 PK, PD, MABEL 및 CRS-유도 성질의 평가. 도 14에 관한 것이다. (F) hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스의 순환성(혈액) 및 비장 백혈구 하위세트 및 건강한 인간 백혈구뿐만 아니라 CLL 환자 및 B 세포주에 대한 hFcγRIIB 발현의 평가를 지시된 바와 같이 나타냈다. 평균 ± SD를 나타내고; 각각의 점은 단일 공여자/샘플을 나타낸다. (중간 패널) WT 또는 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스 비장으로부터의 냉동 절편을 면역형광으로 분석하고, hFcγRIIB Tg의 발현을 평가하고, 지시된 마커(각각 AT130-2 및 AT10 mAb; 적색); B 세포(B220; 상부 패널(녹색)) 및 대식세포(F4/80; 하부 패널(녹색))을 사용하여 내인성 mFcγRII와 비교하였다. (하부 패널) hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스 간에서 CD31+ 내피 세포에 대한 hFcγRIIB 발현의 평가.
도 15. hFcγRII mAb AT10은 생체내 활성이고, B 세포의 Rit 고갈을 강화시킨다. (A) 각각 높거나 낮은 수준의 CFSE로 표지된 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 표적 및 mFcγRII-/- 비표적 C57BL/6 비장세포를 WT 또는 γKO C57BL/6 부형제 마우스로 선별적으로 전달하였다(i.v.). 24시간 후, 마우스에 hFcγRII mAb AT10의 지시된 WT 또는 F(ab)2 단편(i.v.; mIgG1)을 제공하고; 16시간 후, 비장 세포를 분석하여 남은 표적 대 비표적 비를 측정하였다. 데이터를 정규화하여 ctrl(NT) 표적:비표적 비 1.0을 수득하였다. 각각이 점은 수평선에 의해 지시된 평균 비율과 함께 개체 마우스로부터의 결과를 나타낸다. 데이터를 적어도 2개의 독립적인 실험으로부터의 4 내지 6마리 마우스/그룹으로부터 조합한다. (B) 각각 높거나 낮은 수준의 CFSE로 표지된 hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 표적 및 mFcγRII-/- 비표적 C57BL/6 비장세포를 WT C57BL/6 부형제 마우스 내로 주사하였다(i.v.). 24시간 후, 마우스에 지시된 mAb 단독 또는 병용(10 ㎍; i.v.)으로 제공하고; 16시간 후, 비장을 분석하여 상기와 같이 표적 대 비표적 비를 측정하였다. 데이터를 적어도 3개의 독립적인 실험으로부터 조합한다. (C 및 D) Rit 및 AT10를 단독 또는 병용으로 사용하는 B 세포의 전신적 고갈. hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- C57BL/6 마우스에 0일에 Rit(Rit, hIgG1), AT10(mIgG1) 500㎍ 또는 각각의 mAb 250 ㎍을 병용으로 제공하고(i.v.), 순환성 B 세포의 수를 유세포 분석으로 시간에 따라 평가하였다. (C) 대표적인 유세포 분석은 전치료 및 2일 후 mAb 주사를 지시하는 순환성 B 세포의 분석을 점 플롯팅한다. (D) 막대는 mAb 주사 후 일에 순환성 B 세포 수의 평균 ± SEM을 나타내고; 2개의 독립적인 실험으로부터의 ≥ 6 마우스/그룹을 전치료 순환성 혈액 B 세포로 정규화하였다(% 순환성 B 세포로서 표시됨). 일방향(B) 및 양방향 ANOVA(D) 통계 시험을 수행하여 치료 그룹을 비교하였고; p 값으로 지시된 바와 같은 그룹을 비교한다(*p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01 및 ***p ≤ 0.001).
도 16. CLL 세포를 간질 세포 주사에 의하여 Rit-의존성 고갈로부터 보호한다.
(A) 6-10x107 일차 환자 CLL 세포를 면역결핍 NOD/SCID 마우스에 동시에 i.v. 및 i.p 전달하였다. 주사 4 내지 5일 후 마우스를 Rit(Rit)의 1 또는 2 용량 또는 동형 대조군 10 ㎎/㎏으로 처리하였다. 2일 후, 마우스를 희생시키고, 비장 및 복막에 남은 CLL 세포의 수를 유세포 분석으로 평가한 후, 동형 대조군을 제공받은 샘플에 대해 정규화하였다. 데이터는 복막에서 CLL 세포가 mAb의 단일 용량으로 효과적으로 제거된 반면(대시 막대), 비장으로부터의 Rit-유도된 고갈(채워진 막대)은 심지어 Rit의 2 용량 후에도 불완전한 것을 나타낸다. 도면은 3-5마리 마우스/그룹의 평균 + SEM을 나타낸다. 데이터는 t 시험을 통해 분석하고; p 값으로 지시된 바와 같이 그룹을 비교한다(**p ≤ 0.01, ****p ≤ 0.001).
(B) 인간 CLL 세포가 이종이식된 마우스에서 Rit, 6G11 또는 병용의 항-종양 활성. 마우스를 hCD20 mAb(Rit), hFcγRIIB mAb(6G11) 또는 둘 다의 1 내지 10 ㎎/㎏로 처리하고, 비장에 남은 % CLL 세포를 열거하고, iso ctrl로 치료 후 비율에 대하여 정규화하였다. 각각의 독립적인 실험으로부터의 평균 값을 각각의 환자 색상 코드(n=11 환자)로 나타낸다.
(C) 이전에 불응성으로 정의된 환자로부터의 CLL 세포(n=4; 표 S4 참조)를 (B)에서와 같이 이종이식하고, 처리하고, 평가하였다. 쌍체 일방향 ANOVA 시험을 사용하여 데이터를 분석하였다.
도 17. hFcγRIIB mAb 6G11은 생체내 맨틀 세포 림프종(MCL) 세포의 Rit 고갈을 강화한다. (A) NOD/SCID 마우스를 10x106 Jeko-1 MCL 세포로 접종하고(s.c.), 종양이 4x4 mm에 도달시 6G11, Rit(Rit)의 병용 또는 둘 다의 병용으로 처리하였다. 마우스를 시간에 따라 모니터링하고, 최종 종양 발달의 징후가 발병되고 희생시켰다. 비쌍체 t 시험을 사용하여 데이터를 분석하였다(*p ≤ 0.05 및 *** p ≤ 0.001). (B) NOD/SCID 마우스를 조사한 다음, 6 내지 7x106 일차 인간 MCL 세포로 접종하였다. 접종 4 내지 5일 후, 마우스를 Rit(Rit), 6G11 또는 둘 다의 1㎎/㎏으로 처리하였다. 마우스에 2 내지 3일 후 제2 주사를 제공하고, 2 내지 3일 후 희생시키고, 비장에 남은 인간 MCL 세포의 %를 열거하였다. 데이터는 일차 인간 MCL 세포를 제거하는 두 mAb 및 특히 병용 능력을 명백하게 나타낸다. 일방향 ANOVA 시험을 수행하여 치료 그룹을 비교하고; p 값으로 지시된 바와 같이 그룹을 비교한다(*p ≤ 0.05, *** p ≤ 0.001).
(C 및 D) 생체내에서 표적 세포를 제거하는 유형 II hCD20 mAb GA101gly의 능력을 증가시키는 6G11의 능력. (C) CFSE+ hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/-(표적) 및 mFcγRII-/-(비표적) 비장세포를 WT 마우스로 선별적으로 전달하고(i.v.), GA101gly 또는 6G11 단독 또는 병용으로(0.008 ㎎/㎏) 처리하고 혈액을 상기와 같이 평가하였다. 데이터를 2 내지 3개의 독립적인 실험으로부터 조합한다. (D) CFSE+ hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/-(표적) 및 mFcγRII-/-(비표적) 비장세포를 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 부형제 마우스로 선별적 전달하고(i.v.), iso ctrl 또는 6G11(20 ㎎/㎏) 후, GA101gly(0.04 ㎎/㎏)로 처리하고, 혈액을 상기와 같이 분석하였다. 각각의 점은 수평선에 의해 지시된 바와 같은 평균 비와 함께 개별적인 마우스로부터의 결과를 나타낸다(B, C, F 및 G). 데이터를 일방향 ANOVA 시험으로 분석하였다(*p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001 및 ****p ≤ 0.0001).
도 18. 생체내 6G11의 PK, PD 및 MABEL 성질의 평가. (A 및 B) 연령 및 성별 매칭된 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스(6-7 마우스/그룹)에 1 내지 100 ㎎/㎏ WT 6G11 mAb를 주사하고(i.v. 또는 i.p.), 계통도(A)에 도시된 바와 같이 샘플링하였다. 마우스를 실험 7일에 희생시키고, 장기를 독성의 징후에 대하여 평가하였다. (B) 마우스 중량을 mAb 주사 후 시간에 따라 7일까지(168시간) 평가하였다(0일의 중량을 100%로 하여 정규화한 다음, 각각의 그룹에 대하여 평균 + SEM로 표시함). (C 및 D) 계통도(C)에 지시된 바와 같이, 연령 및 성별 매칭된 hFcγRIIB Tg x mFcγRII-/- 마우스(6 마우스/그룹) 또는 mFcγRII-/- 마우스(3 마우스/그룹)에 0일에 WT 6G11(i.v.) 10 ㎎/㎏ 주사한 다음, 3, 7 및 10일에 mAb의 동일한 용량을 주사하였다. 마우스를 실험 24일에 희생시키고, 장기를 독성 징후에 관하여 평가하였다. (D) 마우스 중량을 실험 전체에서 측정하고, (B)에서 설명된 바와 같이 평가하였다.
(하부 패널) hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스(4 마우스/그룹; 평균 + SD)에서 WT 6G11(20 ㎎/㎏)에 의한 순환성 단핵구 및 호중구 고갈의 평가.
도 19. 시험관내 전혈 및 희석된 혈액(20% v/v) 사이토킨 방출 분석. 3명의 건강한 자원자로부터의 (A) 신선한 또는 (B) 5x 희석된(혈청-무함유 CTL 배지 중에) 헤파린화된 혈액을 37℃에서 24시간 동안 지시된 mAb 10 ㎍/㎖로 처리한 다음, 상청액을 후속적인 분석을 위하여 수확하였다. 사이토킨(IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-α 및 IFN-γ)을 MSD에 의해 정량하였다. 각각의 점은 개별적인 공여자를 나타낸다(n = 3).
실시예
실시예 1: 실험 데이터
요약
치료적 항체는 면역계를 연계함으로써 작용의 신규한 메커니즘을 풀어낸, 변형된 암 요법을 갖는다. 불행하게도, 치유는 거의 발생하지 않고, 환자는 고유하거나 획득된 내성을 나타낸다. 여기서, 본 발명자들은 면역 세포 탈감각 및 항체 약물에 대한 종양 세포 내성에 연관된 수용체인 인간(h) FcγRIIB를 표적화하고 차단하는 치료적 가능성을 증명한다. FcγRIIB-차단 항체는 CD20-특이적 항체 리툭시맙의 내재화를 방지하였고, 이로써 세포 표면 접근성을 최대화하였고, 면역 이펙터 세포는 시험관내 및 생체내 항종양 활성을 매개하였다. 완전하게 공통유전자 hFcγRIIB Tg 마우스 모델에서, hFcγRIIB mAb는 리툭시맙 B 세포 고갈을 강화하였다. 내성-경향이 있는 간질 구획으로부터의 인간 만성 림프구성 백혈병(CLL) 종양 세포의 고갈을 평가하는 마우스 모델에서, 리툭시맙과의 공동투여는, 재발한/불응성 환자로부터의 CLL 세포 실험을 포함하여, 객관적인 및 완전한 반응을 개선시킨다. 유력한 후보 hFcγRIIB-특이적 항체, 6G11은 우수한 표적에 대한 면역반응성, 바람직한 약동학 및 생체내 부작용 없음과 함께 리툭시맙과 병용으로 부가적/상승적 활성을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 B-세포 림프증식성 질병의 면역요법에 대한 이러한 hFcγRIIB-특이적 mAb의 추가의 임상학적 발달을 지지한다.
도입
일반적인 및 특히, 단클론 항체(mAb)에서 생물학적 요법은 치료제의 계속 확장되는 부류이다.1 이들은 혁신된 암 요법을 갖고, 몇몇 악성종양에 대한 통상적인 화학요법과 함께 관리의 표준이 되었다. 10년이 넘는 기간 동안, 본 발명자들은 많은 치료적 mAb의 활성이 Fc 감마 수용체(FcγR)와의 상호작용에 의해 지배된다는 것을 알았다. 특히, 이는 IgG의 많은 치료적 활성을 설명하는 FcγR의 상대적인 발현 수준, 친화도 및 활성이다( 2 , 3 에서 검토됨). 하물며 항체 약물에 대한 고유한 또는 획득된 내성을 기반으로 한 메커니즘은 알려져 있지 않다. CD47와 같은 '나를 먹지마(don't-eat-me)' 신호는 항체 매개된 이펙터 세포 항-암 활성을 제한하는 것으로 나타났고 4 , 이의 임상학적 중요성의 증거는 여전히 초기 단계에 있다. 암의 몇몇 유형의 치료에 대해 개발 중인 항체 요법의 증가하는 수와 함께, 이들 요법에 대한 암 세포 내성을 이해하고 이를 극복하는 약물을 개발할 필요가 증가하고 있다.
몇몇 항-암 mAb가 전임상적 5-8 및 임상적 효능 9-11 에 있어서 항체-의존성 면역 세포-매개된 항-종양 메커니즘의 연계에 의존하기 때문에, 이들 일반적인 항체 이펙터 메커니즘에 내성 메커니즘을 이해하고 방지하기 위한 특정한 필요성이 존재한다.
인간(h) CD20 특이적 mAb 리툭시맙은 암 면역요법에 대하여 첫번째로 승인되었고, 여포성 림프종(FL), 미만성 거대 세포 B 세포 림프종(DLBCL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 및 맨틀 세포 림프종(MCL)( 12 에서 검토됨)을 포함하는 CD20 발현 B 세포 암을 갖는 환자에게 광범위하게 투여되었다. 흥미롭게도, 리툭시맙이 FL 및 DLBCL에서 효과적이고, 이는 전체 생존율을 개선시키고, CLL 및 MCL에서는 겨우 보통 정도의 반응이 보인다. 추가로, 심지어 리툭시맙-반응성 림프종 내에서 몇몇 개체는 첫번째 치료에 대한 내성을 보이거나, 리툭시맙-함유 병용 요법에 내성을 갖게 되고, 이를 mAb 내성 메커니즘을 연구하는 이상적인 시스템으로 만든다.
최근 연구는 저해성 Fc 감마 수용체 IIB(FcγRIIB/CD32B)가 표적 B 세포로부터 리툭시맙 내재화를 촉진한다는 것을 증명하였다32, 33. B 세포에서 발현되는 주요 IgG 결합 면역 수용체로서, 모든 mAb-의존성 면역 세포 항-암 메커니즘을 효과적으로 돌연변이시키는 FcγRIIB는 B 세포 표면으로부터 리툭시맙을 '빨아들임'으로써 작용하는 것으로 나타난다( 13 및 준비 중인 원고). 대조적으로, 소위 유형 II 항-CD20 mAb, 예를 들면, 최근 승인된 오비누투주맙(GA101)은 아마도 CD20를 지질 래프트에 재분배할 수 없는 이들의 능력으로 인해, 이러한 과정에 민감하지 않다(Cragg et al., 2003; Lim et al., 2011). FcγRIIB-매개된 리툭시맙 내재화는 임상학적 반응성과 연관성이 있었고, CLL > MCL > FL 및 DLBCL 순서를 따랐다32, 33. Ab 내성에서 FcγRIIB에 대한 역할을 유지하면서, 리툭시맙 면역화학요법으로 치료된 MCL 환자의 소급 분석은 FcγRIIB-양성 종양 생검과 비교하여 FcγRIIB-음성의 환자 중에서 더 큰 생존율을 증명하였다. 13 유사하게 불량한 반응은 리툭시맙 단일요법( 14 및 제출된 원고)을 제공받는 FcγRIIB의 높은 수준을 발현하는 FL 환자에서 관찰되었다.
하기 실시예는 리툭시맙 내재화를 차단할 수 있고 시험관내 및 생체내 이들의 치료적 가능성을 조사하는 hFcγRIIB에 대한 항체의 개발을 설명한다. 인간 세포 유형- 및 조직-특이적 방식에서 이식유전자(Tg) 마우스 동시발현 hCD20 및 hFcγRIIB를 생성시키고, PK/PD 및 독물학적 파라미터를 평가하는 개념 입증 연구에 사용하였다. 그 다음, 내성의 방지 또는 극복에서 단독 또는 리툭시맙 또는 기타 CD20 mAb와 병용으로 사용된 hFcγRIIb mAb의 효과를, 인간 CLL 세포(환자의 표현형, 즉 리툭시맙-반응성 또는 재발한/불응성을 유지)가 인간 간질 세포를 포함하는 관련 내성-경향이 있는 조직 구획에서 생체내 연구될 수 있는 이들 및 기타 유일한 마우스 모델에서 평가하였다.
물질 및 방법
동물 및 세포
인간(h) CD20 Tg, γ-쇄-/- 및 마우스(m) FcγRIIB-/- 마우스는 PCR 및/또는 유세포 분석에 의해 확인된 유전형으로 이전에 기재되었다(Beers et al., 2008). 마우스는 내무성 지침에 따라 지역 시설에서 사육하고 유지하였다. 동물 실험을 지역 윤리 위원회를 통해 분명히 하고, 내무성 허가 PPL30/1269 및 M90-11하에 수행하였다. 인간(h) CD20 Tg, γ-쇄-/- 및 FcγRIIB-/- 마우스는 PCR 및/또는 유세포 분석에 의해 확인된 유전형으로 이전에 15 기재되었다. 10 내지 12주 연령의 암컷 BALB/c 및 C57BL/6 마우스는 할란 유케이 리미티드(Harlan UK Limited)(영국 옥스퍼드주의 블랙손에 소재)에 의해 공급되었고, 지역 동물 시설에서 유지하였다. CB-17 SCID 마우스를 찰스 리버(Charles River)로부터 구입한 다음, 지역 동물 시설에서 사육하고 유지하였다. 일차 종양 세포에 대한 이종이식 연구(하기 참조)를 위하여, 6-8주 연령의 암컷 NOD SCID 마우스를 타코닉(Taconic)(덴마트 봄홀트에 소재)으로부터 공급받고, 지역 시설에서 유지하였다.
임상 샘플
임상 샘플의 사용을 위한 윤리적인 승인을 사우샘프톤으로부터의 사우샘프톤 대학 병원 NHS 트러스트 및 사우스 웨스트 햄프셔 연구 윤리 위원회 또는 스칸 대학 병원의 윤리 위원회로부터 수득하였다. 고지된 동의서를 헬싱키 선언에 따라 제공하였다. 샘플은 사우샘프톤 대학의 암 과학 유닛 조직 은행으로부터 허가된 인간 조직 인가로부터 방출되고, 룬드의 스칸 대학 병원에서 혈액학 부서 및 종양학 부서를 통해 수득하였다. CLL 및 MCL 샘플을 단리되고 단일 세포 현탁액으로서 평가하고, 피콜(Ficoll) 정제하고, 후속적인 분석을 위하여 냉동보존하거나 이종이식 연구에서 신선하게 사용하였다.
세포 배양
세포 배양을 보충된 RPMI(2mM 글루타민, 1mM 피루베이트, 100 IU/㎖ 페니실린 및 스트렙토마이신 및 10% FCS[마이오클론(Myoclone)]를 함유한 RPMI)(깁코 비알엘(GIBCO BRL), 스코틀랜드의 페이즐리에 소재)에서 수행하였다. 마우스 비장 B 세포를 MACS B 세포 단리 키트(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), 영국에 소재)를 사용하여 음성 선택으로 정제하고, 동일한 배지에서 배양하였다. 세포주를 ECACC로부터 수득하고, 항생제-무함유 보충된 RPMI 배지에서 유지하였다. 정상 인간 말초 B 세포를 MACS B-세포 단리 키트(밀테니 바이오텍, 영국에 소재)를 사용하여 음성 선택으로 정제하였다.
단핵구-유래된 대식세포(MDM) 및 골수 유래된 대식세포(BMDM)
인간 MDM을 국립수혈국, 사우샘프톤 일반 병원(영국의 사우샘프톤에 소재) 또는 햄스타드 병원의 혈액 센터 또는 스칸 대학 병원(스웨덴)으로부 수득된 말초 혈액으로부터 분화시켰다. 간략하게, 이전에 기재된 바와 같이 16 , 부착 CD14+ 단핵구를 페니실린(100 U/㎖), 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖), 10% FCS 및 25-100 ng/㎖ 내독소-저 재조합 인간 대식세포-콜로니 자극 인자(M-CSF; R&D 시스템스(R&D 시스템스), 미국 소재) 또는 자체 제조)를 함유한 RPMI에서 배양하였다. 배지의 반을 수확 때까지 2일 마다 신선한 M-CSF를 교체하였다. 7 내지 10일에, MDM를 차가운 PBS에 의한 단기간 배양 후 수확하였다.
이전에 보고된 바와 같이 17 , BMDM을 마우스의 대퇴골 및 경골의 골수로부터 단리된 세포로부터 생성하였다. 간략하게, 골수 세포를 10% FCS, 2mM 글루타민 및 1mM 피루베이트, 페니실린 및 스트렙토마이신(각각 100 ㎍/㎖)이 풍부한 RPMI 1640(라이프 테크놀로지스 인비트로겐, 영국의 페이즐리에 소재), 및 20% L929 세포-조건화된 배지(M-CSF 함유)에서 배양하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 사용 10-14일 전에 배양하였다. 대식세포 분화를 CD11b 및 F4/80 발현에 대한 형태학 검사 및/또는 유세포 분석으로 일정하게 확인하였다.
항체 및 시약
mAb를 융합세포 또는 안정하게 형질감염된 CHO-k1 세포의 배양 상청액으로부터 전형적으로 제조하고, IgG를 전기영동(벡크만(Beckman) EP 시스템; 벡크만)에 의해 평가된 순도를 갖는 단백질 A에 대하여 정제하고, 응집 부족을 HPLC로 확인하였다. F(ab')2 단편을 이전에 기재된 바와 같이 제조하였다. 18 hFcγRII mAb AT10은 이전에 기재되었다. 19 리툭시맙은 사우샘프톤 일반 병원 종양학 약국으로부터 증여받거나 스웨덴 룬드의 대학 병원 약국으로부터 구입하였다. 인산화 hFcγRIIB에 대항하는 항체(클론 EP926Y)(오리진(Origene), 미국 소재), 및 α-튜불린(셀 시그날링(Cell 신호전달), 미국 소재)을 면역블롯팅에 사용하였다. AF647 표지된 IgG1, 항-CD3-PE, 항-CD19-perCp-Cy5.5 및 항-CD56-AF488(BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))를 사용하여 PBMC를 표지화하였다. PBMC 면역표현형에 있어서, 제논 라벨링 키트(몰라큘라 프로브스(Molecular Probes))를 사용하여 PE로 표지된 FcγRIIB mAb를 항-CD3-FITC, 항-CD19-PerCP-Cy5.5 및 항-CD56-APC와 접합하여 사용하였다.
유세포 분석
형광 접합된 mAb를 BD 바이오사이언시스, 이바이오사이언스(eBiosciences), AbD 세로텍(AbD Serotec)으로부터 구입하거나 자체 제조하였다. 유세포 분석은 이전에 20 기재된 바와 같고, 샘플은 CellQuest Pro 또는 FACSDiva로 분석된 데이터와 함께 FACScan, FACSCalibur 또는 FACSCanto II에 대하여 평가하였다(모두 BD 바이오사이언시스).
hFcγRIIB mAb의 생성
n-CoDeRβscFv 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하여 hFcγRIIB mAb를 확인하였다. hFcγRIIB 및 hFcγRIIA의 세포외 도메인을 mIgG3-Fc(hFcγRIIA/B-Fc)에 융합시켜 각각 표적 및 비표적으로서 사용하고, 단백질 A에 대한 정제 후, 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포에서 제조하였다. 세번의 연속 선택을 수행하였다. 선택 1 전에 사전-선택이 발생하였고, 이를 스트렙타비딘 다이나비드에 로딩된 코팅된 마우스 IgG3κ 및 비오티닐화된 hFcγRIIA-Fc에 대항하여 수행하였다. 결합 파지를 트립신 소화로 용리시키고, 표준 과정을 사용하여 증폭시켰다. 21 선택 1로부터의 증폭된 파지를 에칭된 폴리스티렌 볼(폴리사이언시스(Polysciences), 미국)에 코팅된 hFcγRIIB에 대항한 선택에 사용하였다. 선택 2를 위한 사전-선택을 과량으로 코팅된 스트렙타비딘에 대항하여 수행하였다. 선택 3을, 예를 들면, 비오티닐화된 hFcγRIIB를 상이한 농도로 사용하여, 한계 희석 선택으로서 수행하였다. hFcγRIIA를 모든 선택에 대한 경쟁자로서 사용하였다. 선택 3으로부터의 파지미드를 scFv 제조 형식으로 전환하고, 후속적인 스크리닝 분석에서 사용하고, 여기서 가용성 또는 세포 결합된 항원에 대한 특이적 결합뿐만 아니라 면역 착물 결합의 저해를 평가하였다. hFcγRII에 대항하는 3개의 상이한 상업적인 항체(MCA1075XZ, AbD 세로텍; MAB1330, R&D 시스템스; AF1330, R&D 시스템스)를 재조합 및 세포 표면 결합된 FcγRIIB의 평가를 위하여 사용하였다. 유세포 분석 및 형광 마이크로어레이 기술(FMAT)에 의한 세포 표면 결합된 FcγRIIB의 평가를 위하여, 마우스 항-hFcγRII-APC(BD 파르미겐(Pharmingen))를 또한 사용하였다. 모든 실험에서 상응하는 동형 대조군은 음성 대조군으로서 포함되었다. 세포-결합된 항원의 평가를 위하여, CHO-k1 세포를 FuGENE(로슈(Roche))를 사용하는 pIRESpuro와 함께 FcγRIIA-pIRO 또는 FcγRIIB-pIRO로 동시-형질감염시켰다. 10 ㎎/㎖의 파이로마이신(인비보겐(InvivoGen))을 형질감염된 세포의 선택을 위하여 사용하였다. 그 다음, 한계 희석을 통해 수득된 개체 클론을 hFcγRII 항체(BD 바이오사이언시스)로 염색하고, 가장 높은 발현 클론을 선택하기 위한 유세포 분석 및 FMAT 분석 후 상응하는 동형 대조군을 추가의 실험에 사용하였다. scFv의 일차 스크리닝을 위하여, FcγRIIA 및 FcγRIIB 형질감염된 CHO-k1 세포를 FMAT 플레이트에 접종하였다. scFv를 발현한 이.콜라이(E. coli)를 가한 후, 데글리코실화된 마우스 항-HIS 항체(R&D 시스템스) 및 데글리코실화된 항-마우스-Cy5(GE 헬쓰케어(GE Healthcare))를 가하였다. 염색된 세포를 8200 검출 시스템(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)를 사용하여 검출하였다. FcγRIIA 및 FcγRIIB 형질감염된 세포에 대한 결합을 위하여, 일차 스크리닝으로부터의 양성 클론을 한번 더 재발현시키고 재시험하였다. FcγRIIA 또는 FcγRIIB와 특이적으로 결합되고 IC 결합을 저해하는 ScFv 클론을 유일한 클론을 확인하는 표준 과정을 사용하여 CDR H1, H2 및 H3에 대하여 서열화하였다. 이.콜라이에서 10 ㎖ 발현 제조로부터 리소자임(시그마(Sigma))으로 주변세포질 제조 후, 유일한 클론을 Ni-NTA 스핀 컬럼(GE 헬쓰케어)에서 정제하였다. 총 17개에서 유일한 클론을 WT 및 N297Q hIgG1 변이체로 전환시켰다. VH 및 VL을 PCR 증폭시키고, 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 함유한 발현 벡터로 삽입하였다. 그 후, 현탁액 중의 성장에 맞춰진 HEK 293EBNA 세포(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))를 PEI를 사용하여 형질감염시킨 다음, 세포-현탁액을 4시간 동안 37℃에서 진탕하에 배양을 허용한 후, 공급 용액(울트라펩소이(UltraPepSoy), 셰필드 바이오-사이언스(Sheffield Bio-Science))으로 희석하고, 형질감염-후 6일에 수확하였다. 수확된 배양 배지를 살균 여과하고, AKTA 퓨리파이어(AKTA Purifier) 시스템에 연결된 MabSelect(GE 헬쓰케어)로 패킹된 컬럼에 적용하였다. 컬럼을 로딩 완충제로 세척하고, 저-pH 완충제로 용리시켰다. 용리된 항체를 무균 여과하고, 스펙트라/포르(Spectra/Por) 투석막 4(스펙트럼 라보라토리스 인크(Spectrum Laboratories Inc))를 사용하여 적절한 제형 완충제로 투석하였다. 투석 후, 물질을 무균 여과하고, 4℃에서 저장하였다. 그 다음, 정제된 IgG를 형질감염된 CHO-k1 세포뿐만 아니라 세포주 및 FcγRIIB를 음성적으로 발현하는 PBMC에 대한 결합에 대하여 평가하였다.
면역 착물(IC) 결합의 차단
FITC에 특이적인 hIgG1을 FITC-BSA-비오틴 또는 FITC-BSA와 10:1 몰비로 혼합하여 IC를 수득하였다. 사용 전에 혼합물을 1시간 동안 실온에서 전배양하였다. FcγRIIA 및 FcγRIIB에 특이적으로 결합된 ScFv 클론을 발현하는 이.콜라이의 상청액(10 ㎖)을 FcγRIIA 및 FcγRIIB 발현 CHO-k1 세포에 가하고, 1시간 동안 결합되도록 놔두었다. IC를 3nM로 가하였다. 결합된 IC를 스트렙 알렉사 플루오르(Strep Alexa Fluor) (AF)-647(라이프 테크놀로지스, 영국에 소재)을 사용하여 검출 후, 유세포 분석을 수행하고, 차단을 AF674 신호의 손실로서 정량하였다.
항체-의존성 세포성 식균작용(ADCP) 및 세포성 세포독성(ADCC)
식균작용 분석(ADCP)을 이전에 기재된 바와 같이 주로 수행하였다. 23 대식세포로의 성숙 후, 얼음-차가운 PBS 또는 아큐타제(Accutase)(시그마) 또는 트립신/EDTA(라이프 테크놀로지스, 영국)을 사용하여 세포를 수확하고, 96-웰 플레이트에서 5x104 세포/웰에 재플레이팅하고, 2 내지 4시간 또는 밤새 37℃에서 배양하였다. 후속적으로, CLL 세포를 5μM 카복실플루오레신 석신이미딜 에스터(CFSE, 몰라큘라 프로브스)로 15분 동안 37℃에서 표지화하였다. 세척 후, CLL 세포를 30분 동안 mAb(들) 10 ㎍/㎖로 옵소닌 처리와 함께 배양한 후, 대식세포 배양에 5:1 비로 가하였다. 1시간 후, 세포를 스크랩핑을 사용하여 수집하고, APC-표지된 CD206(BD 바이오사이언시스) 또는 hFcγRIII mAb(3G8, 자체)로 15분 동안 얼음 위에서 염색하여 MDM를 구별하였다. 세포를 수확하고, 수집된 최소 5000 대식세포로 유세포 분석으로 분석하였다. 이중 양성 염색된 세포의 퍼센트를 식세포 가능성의 척도로서 측정하였다. 식균작용의 확인은 공초점 현미경에 의해 일정하게 제공되었다. 23
건강한 자원자의 말초 혈액으로부터 단리된 일차 CD56+ve NK 세포 MACS(밀테니 바이오텍, 독일에 소재), 또는 GFP(콘크웨스트(Conkwest)로부터 구입, 캘리포니아주의 산 디에고에 소재)와 함께 CD16-158V 대립유전자를 발현하도록 안정하게 형질감염된 NK-92 세포주를 사용하여 ADCC 분석을 양방향으로 수행하였다. 24 일차 NK 세포 이펙터를 사용하는 분석에서, 표적 세포를 NK 세포와의 혼합 전에 30분 동안 mAb 1-10 ㎍/㎖로 전배양하였다. 세포를 3 내지 4시간 동안 20:1 이펙터:표적 세포 비로 10mM HEPES 완충제, 1mM 나트륨 피루베이트 및 10% FBS(모두 깁코)를 함유한 RPMI 1640 + GlutaAMX 배지(라이프 테크놀로지스)에서 배양하였다. 제조사의 설명서에 따라 CellaTOX 키트(셀 테크놀로지 인크)를 사용하여 용해를 측정하고, 수득된 생물형광을 Victor2V 발광측정계에서 판독하였다. NK 세포주를 사용하는 경우, NK 세포를 표적과 함께 1:1 내지 5:1 과량으로 4시간 동안 배양하고, 용해를 유세포 분석으로 측정하였다. 간략하게, 배양의 끝에서, 세포 현탁액을 9 nM SYTOX 적색 죽은 세포 염색(라이프 테크놀로지스)과 함께 20분 동안 암실에서 배양한 다음, 세포를 유세포 분석으로 분석하였다.
내재화의 저해가 ADCP 및 ADCC에 영향을 주는 방식을 조사하기 위하여, 이펙터와 공동배양 전에 CLL 세포를 리툭시맙 단독 또는 동형 대조군 또는 6G11의 N297Q 돌이변이된 변이체와 병용으로 3 내지 4시간 동안 배양하는 것을 허용하여 항체 내재화를 위한 시간을 허용하였다.
내재화 분석 및 AF488 표지화
mAb를 제조사의 설명서(라이프 테크놀로지스, 영국에 소재)에 따라 AF488로 라벨링하였다. 내재화를 측정하기 위하여, ??칭 분석을 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다. 23 간략하게, 세포 샘플(2-4 x 105 세포/웰)을 정해진 시간 동안 AF488 표지된 mAb(5 ㎍/㎖)와 배양하고, 세척하고, 재현탁하고, 4℃에서 30분 동안 항-AF488 ??칭 항체(라이프 테크놀로지스, 영국에 소재)의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 그 다음, 샘플을 유세포 분석으로 분석하였다. 결과를 표면 접근성 mAb%로서 표시되고, 이는 내재화된 mAb의 양에 반비례한다.
웨스턴 블롯팅
웨스턴 블롯팅을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 26 간략하게, 2.5-5 x 106 세포를 처리하고, 세척하고, 프로테아제 및 포스파타제 저해제의 칵테일을 함유한 오닉스 완충제로 용해시켰다. 그 다음, 샘플을 SDS PAGE로 분리하고, 단백질을 즉시 PVDF 막 위로 옮겼다. 막을 5% 무지방 드라이 밀크로 차단하고, 적절하게 희석된 일차 항체와 함께 배양하고, 세척한 다음, 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 항-토끼 또는 항-마우스 IgG(시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 영국에 소재)와 함께 배양하였다. 향상된 화학발광(ECL; GE 헬쓰케어, 영국에 소재)과 함께 배양 및 감광 필름(하이퍼필름 ECL(Hyperfilm ECL); GE 헬쓰케어, 영국에 소재)에의 노출로 밴드를 가시화하였다. 밀도계를 제조사의 설명서에 따라 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
생체내 면역요법
선별적 전달 분석: 이전에 설명된 바와 같이(Beers et al., 2010b), ~2x107 비장세포/㎖를 각각 5 μM 및 0.5 μM CFSE으로 표적 또는 비표적으로서 염색하고, 세척하고, 1:1 비로 조합하고, i.v로 부형제 마우스(~5x106 세포/마우스)에 주사하였다. 그 다음, 마우스를 1 및/또는 2일에 i.v. 및/또는 i.p. 주사하고, 1일 후 선별하여 유세포 분석을 사용하여 혈액 및 비장 백혈구를 검사하였다.
선별적 전달: 선별적 전달 분석을 이전에 설명된 바와 같이 주로 수행하였다. 27 간략하게, 관련 C57BL/6 마우스로부터의 ~2 x 107 비장세포/㎖를 표적(T) 또는 비표적(NT)로서 각각 5 μM 및 0.5 μM CFSE로 10분 동안 실온에서 염색하고, 세척하고, 1:1 NT:T 비로 조합하고, -1일에 정맥내로(i.v.) 부형제 마우스(~5 x 106 비장세포/마우스)에 주사하였다. 그 다음, 마우스를 0일에 mAb로 i.v. 주사하고, 1일 후 선별하여 NT 및 T 세포에 대하여 이의 혈액 및 비장세포를 검사하였다. 그 다음, 몇몇 선별적 실험에서, 부형제 마우스에 0일 및 1일(i.v. 및/또는 i.p. 경로를 통해)에 mAb를 주사하고, 1일 후 선별하여 NT 및 T 세포에 대하여 이의 혈액 및 비장세포를 검사하였다. B 세포 집단을 FSC-H 및 SSC-H 파라미터 및 유세포 분석을 사용하는 CD19 양성으로 확인하였다.
B 세포 결실: 전신적 B 세포 고갈 분석을 위하여, 다양한 유전형의 마우스를 hCD20, hFcγRII 또는 두 mAb의 단일 용량으로 i.v. 제공(250-500㎍)한 다음, 혈액 또는 장기에 남은 B 세포의 비율을 이전에 기재된 바와 같이 유세포 분석 또는 면역조직화학(IHC)으로 시간에 따라 평가하였다. 27
일차 인간 이종이식 모델: 백혈병 단계에서 CLL 또는 MCL 환자로부터의 혈액 샘플을 수집하고, 수집 24시간 내에 이종이식 연구에 사용하였다. 간략하게, PBMC를 피콜 파크 플러스(Ficoll Paque PLUS)를 사용하여 단리하고, 세척을 통한 후, 세포를 무균 PBS 중에 3-5x108 세포/㎖로 재현탁시켰다. 6-10x107 세포/마우스에 상응하는 세포 현탁액 200 ㎕로 i.v. 주사 1-5시간 전에 마우스를 1Gy로 조사하였다. 세포 주사 후 4 내지 5일에, 마우스를 hCD20 mAb, hFcγRII mAb 또는 둘 다 1-10 ㎎/㎏으로 처리하였다. 마우스에 2 내지 3일 후 제2 주사를 제공하고, 2 내지 3일 후 희생시켰다. 비장을 단리하고, 둘로 나누어 1/2은 OCT 중에 냉동하고, 다른 1/2는 단일 세포 현탁액에 제공하였다. 그 후, 적혈구를 용해 완충제(깁코)로 용해한 다음, 세포 표면 염색 mAb와 함께 30분 동안 얼음 위에서 배양하였다. 인간 세포를 hCD5 및 hCD19 염색(BD 바이오사이언시스)을 통해 hCD45 양성 및 백혈병 세포로서 확인 및 정량하였다.
생체내 백혈구 고갈
마우스 말초 혈액 백혈구의 전신적 고갈을 유세포 분석 후, 동형 대조군 또는 WT 6G11 20 ㎎/㎏의 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- C57BL/6 마우스 주사(i.v.)로 시간에 따라 평가하였다. 백혈구 하위세트 수준을 전-용량 수준으로 정규화하고, %로서 표시하였다.
생체내 PD, PK 및 면역원성
6G11(PK) 및 MAHA의 혈청 농도를 ECL 면역분석법을 사용하여 측정하였다. 비오티닐화된-항-6G11 다클론 염소 혈청 및 스트렙타비딘-설포 Tag(메소 스케일 디아그노스틱스(Meso Scale Diagnostics), 미국에 소재)를 사용하여 6G11 mAb를 마우스 혈청 중에 검출하였다. 6G11에 대하여 생성된 공지된 표준 곡선과 비교하여 혈청 중의 mAb 수준의 정량을 수행하였다. 6G11 PK 파라미터(Cmax, Tmax, AUC, CL(F), Vz(F), Vss 및 t1/2)를 소프트웨어 어플리케이션 피닉스(Phoenix)™ 윈놀린(WinNonlin) v.6.2(파르사이트 코프(Pharsight Corp), 미국 캘리포니아주에 소재)를 사용하여 비구획적 모델로 평가하였다. Cmax 및 Tmax를 혈청 농도-시간 플파일로부터 직접 수득하였다.
정성 및 반-정량 ECL 면역분석을 사용하여 마우스 혈청 중의 6G11에 연결된 MAHA의 존재를 검출하였다. 샘플을 비오틴 및 설포-Tag 표지된 6G11을 갖는 분석 완충제 중에 희석하였다. 배양 후, 샘플을 사전-차단된 스트렙타비딘 플레이트로 전달하였다. 샘플에 존재하는 항-6G11의 수준에 비례하는 발광 신호로, MSD 기반 기술을 사용하여 신호를 평가하였다. 친화도 정제된 염소 항-6G11 혈청을 양성 대조군 샘플의 제조를 위하여 사용하였다.
생체내 약력학(PD), 약동학(PK), 최소 예상된 생물학적 효과 수준(MABEL) 및 면역원성 연구
단일 용량 PD, PK 및 MABEL: 연령 및 성별 매칭된 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스에 WT 6G11의 1, 10 또는 100 ㎎/㎏의 단일 용량을 주사하고, 10 ㎎/㎏ 용량으로 투여의 i.v. 및 i.p. 경로를 시험하였다(도 17A). 일련의 혈액 샘플을 주사 직후부터 종결 168시간 전까지 수득하였다. 고통, 체중 감소, 독성 또는 병리의 임의의 징후에 대하여 동물을 전체적으로 검사하였다. hFcγRIIB+ve B 세포(PD)의 고갈 및 기타 파라미터(예를 들면, 6G11 PK 및 마우스 항-인간 항체[MAHA])를 하기와 같이 조사하였다.
반복된 용량 면역원성: 연령 및 성별 매칭된 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스 및 mFcγRII-/- 대조군 마우스에 WT 6G11 10 ㎎/㎏의 멀티 샷을 도 17C에 지시된 바와 같이 10일 기간 동안 주사하였다(초기 i.v. 투여 후, 3 용량 i.p. 전달). 전-용량 혈액 샘플을 순환성 B 세포(CD19+ve 및 B220+ve)에 대하여 유세포 분석으로 분석하였다. 상기와 같이 전체적으로, 그리고 14일 후 동물을 검사하였다. 6G11(PK) 및 MAHA의 혈청 농도를 하기와 같이 측정하였다.
6G11 PK 분석: ECL 면역분석을 사용하여 마우스 혈청 중의 6G11 농도를 측정하였다. 양 항-hIgG(결합 부위) 또는 염소 항-hλ(AbD 세로텍)(리툭시맙의 존재하에)를 96-웰 MSD 플레이트에 코팅한 다음, 0.45% 피쉬 젤라틴을 사용하여 차단하였다. 6G11 mAb를 비오티닐화된-항-6G11 다클론 염소 혈청 및 스트렙타비딘-설포 Tag(메소 스케일 디아그노스틱스, MSD)의 후속적인 첨가로 검출하고, 임의의 미결합 물질이 세척되도록 허용하였다. 트라이폴리아민을 함유한 판독 버퍼 T(MSD)를 가하고, 6G11와 연관된 sTag는 전기 전압 적용시 화학발광 신호를 생성하였다. 6G11에 대하여 생성된 공지된 표준 곡선과 비교하여 혈청의 mAb 수준의 정량을 수행하였다.
6G11 PK를 소프트웨어 어플리케이션 피닉스™ 윈놀린 v.6.2(파르사이트 코프, 미국 캘리포니아주의 마운틴 뷰에 소재)를 사용하여 비구획적 모델로 평가하였다. Cmax, Tmax, AUC, CL(F), Vz(F), Vss 및 t1/2를 포함한 PK 파라미터 추정값을 측정하였다. Cmax 및 Tmax를 혈청 농도-시간 프로파일로부터 직접 수득하였다(표 3).
시험관내 전혈 고갈 분석
신선한 헤파린화된 인간 혈액을 CTL 배지(셀 테크놀로지 리미티드(Cell Technology Limited), 독일에 소재) 중에 5x로 희석하고, 96-웰 플레이트에서 Rit 및/또는 WT 또는 N297Q 6G11 20 ㎍/㎖로 접종하거나; NT를 24시간 동안 놔둔 후, 세포를 수확하고, 항-인간 CD3-PerCP-Cy5.5/FITC, CD19-PE, CD14-APC 및 CD66b-FITC mAb로 염색하여 유세포 분석을 위하여 각각 T 세포, B 세포, 단핵구 및 호중구를 확인하였다. CD3+ 세포에 대한 백혈구 하위세트의 비를 계산하였다.
용량 그룹　 t1/2
(일)		 Vz
(㎖/kg)		 Vss
(㎖/kg)		 CL
(㎖/일
/kg)		 AUC
(day*㎍/㎖)		 Cmax
(㎍/㎖)		 Tmax
(hr)
10 ㎎/㎏ IV
N=6		 기하 평균 　 88.8 82.5 48.5 206 201000 0.166
표준편차 0.607 14.2 15.1 36.2 106 55800 　
CV (%) 　 16.0 18.3 74.6 51.3 27.8 　
조화 평균 1.08 　
CV(%) 56.0
10 ㎎/㎏ IP
N=4		 기하 평균 　 107 　 29.0 344 117000 3.83
표준 편차 0.65 7.52 　 6.10 72.0 13300 2.50
CV (%) 　 7.04 　 21.0 20.9 11.4 65.2
조화 평균 2.49 　
CV(%) 26.0
100 ㎎/㎏ IV
N=6		 기하 평균 　 53.7 54.6 12.2 7770 2350000 0.224
표준평차 0.925 16.0 16.2 1.12 638 402000 0.340
CV (%) 　 29.7 29.6 9.16 8.21 17.2 152
조화 평균 3.09 　
CV(%) 29.9
면역원성 분석(MAHA): 정성 및 반-정량 ECL 면역분석을 사용하여 마우스 혈청 중의 WT hIgG1 6G11 에 연결된 MAHA의 존재를 검출하였다. 샘플을 비오틴 및 설포-Tag 표지된 6G11을 갖는 분석 완충제 중에 희석하였다. 배양 후, 샘플을 사전-차단된 스트렙타비딘 플레이트로 전달하였다. 트라이폴리아민을 포함하는 판독 버퍼 T(MSD)를 가하고, 샘플에 존재하는 항-6G11의 수준에 비례하는 발광 신호로, MSD 기반 기술을 사용하여 신호를 평가하였다. 친화도 정제된 염소 항-6G11 혈청을 양성 대조군 샘플의 제조를 위하여 사용하였다.시험관내 사이토킨 방출 분석
PBMC를 림포프렙(Lymphoprep)(아식스-쉴드(Axis-Shield), 노르웨이 오슬로에 소재) 밀도 원심분리로 정제하였다. 세포를 고밀도(1.5 ㎖/웰)로 24-웰 플레이트에서 48시간 동안 혈청-무함유 CTL 배지(셀 테크놀로지 리미티드, 독일에 소재)에서 고밀도 배양 28 (1x107/㎖)으로 전배양하였다. 세포를 후속적으로 세척하고, 혈청-무함유 CTL 배지(1x106 /㎖) 중에 재현탁하고, OKT3 0.02 또는 1 ㎍/㎖로 전코팅되거나 미처리된 채로 있는(NT)96 웰 플레이트(100 ㎕/웰)에 접종하였다. hFcγRIIB mAb(클론 6G11)의 WT 및 N297Q 변이체 또는 동형 매칭된 대조군 mAb(hIgG1)을 농도 10 ㎍/㎖로 가하고, 세포를 추가 48시간 동안 배양하였다. 사이토킨(IL-6, -10, IFN-γ 및 TNF-α)을 처리된 PBMC 상청액 중에서 MSD V-Plex 분석(메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery), 미국 록빌에 소재)으로 제조사의 설명서에 따라 정성분석하였다.
면역조직화학(IHC)
인간 및 기타 동물 조직의 IHC 염색을 하기와 같이 수행하였다. 다양한 출처로부터 장기를 수확하고, 냉동한 다음, 6G11 및 7C07 클론의 면역염색 전에 절단하였다. 조직 반응성을 과산화수소 블록 없이 티라마이드 시그널 앰플리피케이션(TSA; 퍼킨엘머) 증폭을 사용하여 검출하였다. 항원 음성 조직을 포함하여 임의의 비-hFcγRIIB 특이적 결합을 확인하였다.
통계적인 분석
시험관내 실험 그룹 사이의 차이를 비교하기 위하여, 양측꼬리 t-시험 분석을 수행하였다. 생체내 실험 그룹 사이의 생존 차이를 평가하기 위하여, 카플란 메이어 곡선을 생성하고, 로그 순위 시험으로 분석하였다. 두 그룹 이상을 함유하는 생체내 실험을 위하여, 양방향 또는 일방향 ANOVA를 사용하였다. 객관적인 또는 완전한 반응에서 차이를 위하여, 생체내 카이자승 시험을 사용하였다. 통계적인 분석은 그래프패드프리즘(GraphPadPrism) 소프트웨어(윈도우 5 버전)을 사용하여 수행하였다.
hFcγRIIB 및 hCD20를 발현하는 이식유전자 마우스의 생성
상이한 엑손 및 인트론 정션을 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 오버랩핑함으로써 hFcγRIIB2 이식유전자를 Raji 게놈 DNA 및 cDNA로부터 구성하였다. 발현 카세트는 hFcγRIIB 프로모터 22 엑손 1/2, 인트론 2-3 및 엑손 3-7(2.4 kb)를 포함하고, 초기에 NotI 및 XbaI 부위를 통해 pcDNA3(인비트로겐(Invitrogen))로 클로닝되고, 벡터의 BGH 폴리A 서열에 결찰되었다. 구조물(폴리A 서열 포함)은 3517bp 길이이고, 추가로 NotI 및 SmaI 부위를 통해 벡터 pBC-SK(Stratagene)로 서브클로닝되었다. AT10-FITC를 사용하는 유세포 분석으로 구조물의 기능적 발현을 일시적으로 형질감염된 IIA1.6 세포에서 확인하였다. 정제된 발현 카세트 부족 벡터 서열을 FVB/N 접합체의 숫컷 전핵으로 마이크로 주사하였다. Tg 마우스를 PCR(귀 끝으로부터 추출된 게놈 DNA으로부터의 cDNA 단편의 엑손 3-7의 증폭) 또는 AT10-FITC를 사용하는 말초 혈액의 유세포 분석으로 스크리닝하였다. 수득된 Tg-양성 파운더를 10 세대 초과에 있어서 C57BL/6 또는 BALB/c 마우스에 역교배시켰다. 마우스 FcγRIIB-/- 마우스와 교잡하여, 상응하는 마우스 수용체가 부족한 hFcγRIIB Tg 마우스를 생성하였다. 그 다음, 수득된 마우스를 hCD20 Tg 마우스와 교잡하여 hCD20 x hFcγRIIB+/- x mFcγRIIB-/- 자손을 생성시켰다.
표면 플라즈몬 공명
비아코어 T100 분석기(GE 헬쓰케어, 영국에 소재)를 사용하여 달리 기재된 바와 같이 25 hFcγRIIB mAb의 결합 친화도를 측정하였다. 제조사의 설명서에 따라 표준 아민 커플링을 사용하여 mAb를 CM5 센서칩(GE 헬쓰케어, 영국에 소재)에 고정화시켰다. 가용성 hFcγRIIB(0.16-100 nM; R&D 시스템스, 영국에 소재)를 5분 동안 주사하고, 10분 동안 해리 모니터링하였다. 대조군 유세포에 대한 배경 결합을 모니터링하고, 자동으로 차감하였다. 비아코어 T100 평가 소프트웨어를 사용하여 K D 값을 1:1 결합 모델로부터 계산하였다.
생체내 면역요법
피하 세포주 이종이식 종양 모델: 0일에 SCID 마우스(3-6마리 마우스/그룹)에 성장 인자 감소된 마트리겔 매트릭스(Matrigel Matrix)(BD 바이오사이언시스, 영국에 소재) 중의 5x106 Daudi 또는 Raji 세포를 피하 주사하고, 후속적으로 매주 7, 14, 21 및 28일에 치료적 mAb로 치료하였다. NOD.SCID 마우스에 0일에 10x106 Jeko-1 세포를 피하 주사하였다. 종양 성장을 모니터링하고, 종양이 4x4 mm에 도달하는 경우, 마우스를 무작위화하고, 치료적 mAb 10 ㎎/㎏으로 매주 2회 처리하였다. 종양 성장을 캘리퍼스를 사용하여 시간에 따라 모니터링하고, 하기 식을 사용하여 종양 크기를 추정하였다:
[중량 = (길이 × 너비2)/2]
정맥내 세포주 이종이식 모델: 0일에 SCID 마우스(6/그룹)에 2.5x106 Raji 세포(BD 바이오사이언시스, 영국에 소재)를 i.v. 주사하고, 후속적으로 7, 14, 21 및 28일에 매주 4회 이하 치료적 mAb로 치료하였다. 임의의 마비 징후에 대해 마우스를 검사함으로써, 종양 성장을 주기적으로 모니터링하였다.
시험관내 사이토킨 방출 분석
신선한 또는 5x 희석된(혈청-무함유 CTL 배지 중에) 헤파린화된 혈액을 96-웰 플레이트(U형 바닥)에서 배양하고, mAb 10 ㎍/㎖로 24시간 동안 37℃에서 처리한 후, 상청액을 후속적인 분석을 위하여 수확하였다. 사이토킨(IL-1β, -2, -4, -6, -10, IFN-γ 및 TNF-α)을 제조사의 설명서에 따라 MSD V-Plex 분석(메소 스케일 디스커버리, 미국 록빌에 소재)로 처리된 완전한 또는 희석된 혈액 상청액 중에서 정성분석하였다.
형광 현미경
절편화를 위한 조직을 드라이 아이스 배드 위의 이소펜탄에 놓인 OCT 배지(RA 램(RA Lamb), 써모 산돈(Thermo Shandon)) 중에 냉동하였다. 10 ㎛ 냉동된 절편을 아세톤 중에 고정하고, 5% 정상 염소 혈청으로 차단하고, hFcγRII/CD32에 대한 mAb(클론 AT10, 자체 제조), mFcγRII/CD32(클론 AT130-2, 자체 제조 29 ) B 세포(래트 항-마우스 CD45R/B220; BD 파르미겐, 영국에 소재), 모낭 수지상 세포(래트 항-마우스 FDC; BD 파르미겐, 영국에 소재) 및 대식세포(래트 항-마우스 F4/80; AbD 세로텍, 영국에 소재) 후, DyLight594-접합된 염소 항-hIgG(에이비캠(Abcam), 영국의 캠브릿지에 소재) 및 AF488-접합된 염소 항-rat IgG(라이프 테크놀로지스, 영국에 소재)와 함께 배양하였다. 절편을 벡타쉴드(Vectashield)(벡터 라보라토리스(Vector Laboratories), 영국에 소재)에 삽입하고, 플란 아크로매트(Plan Achromat) 10x 0.25 대물 렌즈를 사용하여, 셀 B 소프트웨어하에 작동하는 CC12 색상 카메라가 장착된 CKX41 도립 현미경 반사 형광 시스템을 사용하여 이미지를 수집하였다(모두 올림푸스, 영국에 소재). RGB 이미지 파일(TIFF)을 아도비 포토샵(Adobe Photoshop)(CS6)으로 옮기고, 적색/녹색 이미지 오버레이를 콘트라스트 확장하여 홀 그레이 스케일(whole grey scale)을 사용하였다.
호중구 염색 프로토콜
혈액 샘플 또는 비장을 연령 및 성별 매칭된 C57BL/6, mFcγRII -/- 및 mFcγRII -/- X hFcγRIIb+/- 마우스로부터 수득하였다. 비장을 100㎛ 세포 여과기(BD)를 통해 통과함으로써 균질화한 다음, 완전 RPMI에서 세척하고, PBS 5㎖ 중에 재현탁시키고, 세포 현탁액 200㎕를 유세포 분석용 튜브에 사용하였다. 샘플을 항-마우스 CD19(1D3-PE, 자체), 항-마우스 NK1.1(PK136-AlexaFluor 647), 항-마우스 CD11b(M1/70-퍼시픽 블루), 항-마우스 CD11c(N418-PE-Cy7), 항-마우스 Ly-6-G(1A8-APC-Cy7), 항-마우스 Ly-6C(HK1.4-PerCP-Cy5.5; 달리 지시되지 않는 한, 모두 바이오레전드(BioLegend))와 함께, 항-마우스 FcγRII(AT130-2 F(ab')2-FITC), 항-인간 FcγRII(AT10 F(ab')2-FITC) 또는 관련 없는 대조군(3G8 F(ab')2-FITC)(모두 자체 제조 및 표지화) 10㎍/㎖로 염색하였다. 세포를 30분 동안 4℃에서 염색한 다음, 적혈구 용해 완충제(AbD 세로텍, 영국에 소재) 1㎖를 가하고, 세포를 원심분리한 다음, 1회 세척하고, FAC 칸토(FAC Canto)에서 분석하였다. Debris 및 CD11chigh 세포를 제외하고, 호중구는 CD19- CD11b+ NK1.1- Ly-6G+였다.
결과
hFcγRIIB의 Fc 결합 도메인에 특이적인 mAb의 생성 및 특성화
몇몇 림프종 환자에 있어서 유형 I CD20 mAb인 리툭시맙에 대한 내성은 종양으로부터의 이의 내재화에 의한 것으로, 부분적으로, 설명될 수 있고, 표적 B 세포 표면 위의 저해성 FcγRIIB/CD32B의 발현이 이러한 과정을 촉진하는 것으로 최근 보고되었다. 13 , 23 이러한 가설과 일치하게, 리툭시맙과 AT10의 생체내 공동투여는 hCD20 및 hFcγRIIB가 종양에서 동시발현되는 2개의 상이한 림프종 이종이식 모델에서 부가적/상승적 항-종양 반응을 야기하였다(도 7).
hFcγRIIB의 세포외 도메인은 주요 활성제 FcγR인 hFcγRIIA의 세포외 도메인에 ~98% 상동성이다(도 8A). 이러한 2개의 수용체가 반대 작용을 매개하기 때문에, 이는 hFcγRIIB에 매우 특이적인 치료적 항체에 중요하다. AT10은 hFcγRIIA 및 hFcγRIIB 둘 다에 유사한 친화도로 결합하기 때문에, 이러한 기준을 만족시키지 못한다. 19 추가로 뮤린 유래(IgG1)이고, 이는 이의 번역 가능성을 제한한다. 인간에서 치료 가능성을 갖는 hFcγRIIB 특이적 항체를 생성시키기 위하여, 본 발명자들은 hFcγRIIB에 대한 결합에 대하여, 그리고 hFcγRIIA(또는 역으로)에 대한 결합에 대항하여 패닝(panning)하여 단일-특이적 시약을 생성시키는, 우리의 전매 인간 항체 파지-디스플레이 라이브러리 n-CoDeR® 30 를 사용하였다(도 1). 수득된 mAb를 FcγRIIB(도 1A)에 선택적으로 결합하고, hFcγRIIA에 대해서는 아니지만 hFcγRIIB에 대한 면역 착물(IC) 결합을 차단하는 이의 능력을 평가하였다(도 1B). 개체 인간 PBMC 하위세트(호중구, 단핵구, B 세포, T 세포 및 NK 세포), 단리된 B 세포(도 1C 및 D; Fig 8B-D), 악성 인간 B 세포주 또는 Tg 마우스로부터의 비장세포(hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/-; 데이터를 도시되지 않음)에 대한 결합을 위한 스크리닝은 hFcγRIIB 또는 hFcγRIIA에 대한 항체의 높은 특이성을 증명하였다. hFcγRIIB에 대한 이들 mAb의 상대적인 친화도는 범위 2 x 10-6 - 2 x 10-8 M에서 hFcγRIIB에 대한 결합에 대한 KD를 나타내는 표면 플라즈몬 공명에 의해 평가된 하위세트로 ELISA(표 1)로 측정하였다(도 1E 및 표 2). 상기 발견을 기반으로, 14개의 매우 특이적인 hFcγRIIB mAb를 확인하고 입증하였다. 각각의 mAb에 대한 미세한 특이성이 정의되지 않았음에도 불구하고, 이들은 모두 IC 결합을 차단하고 FcγRIIA에 대하여 교차 반응하지 않고, 이는 이들이 FcγRIIA 및 B 사이에서 상이한 잔기의 고농도가 발생하는 IgG 결합 틈 주위에 결합하는 것을 강하게 나타낸다(도 7 및 8).
hFcγRIIA 및 hFcγRIIB mAb EC50 데이터
클론
명칭 		EC50
FcγRIIA +ve CHO 		EC50
FcγRIIB +ve CHO 		EC50
FcγRIIA 		EC50
FcγRIIB
iso ctrl nb nb nb nb
1A01 0.4 nm 0.2
1B07 0.3 nb 0.3
1C04 0.3 nb 1.5
1E05 0.5 nb 0.7
2A09 0.6 nb 0.6
2B08 0.6 nm 2.0
2E08 0.3 nm 1.3
5C04 nm 0.4 0.8
5C05 nb 1.7 2.7
5D07 nm 0.4 0.6
5E12 nb 1.0 3.4
5G08 nb 0.7 0.7
5H06 nm 0.4 0.6
6A09 nm 1.4 3.7
6B01 nm 0.5 1.4
6C11 nb 0.5 2.3
6C12 nb 0.3 1.0
6D01 nm 0.3 0.9
6G03 nb 0.4 0.9
6G08 nb 0.6 1.7
7C07 nm 0.3 0.3
4B02 nb 0.6 1.0
6G11 nm 0.3 0.4
6H08 nb 1.4 3.6
길항성 hFcγRIIB mAb는 리툭시맙 내재화를 차단한다
리툭시맙과의 hFcγRIIB+ve B 세포의 배양은 저해성 hFcγRIIB를 통한 저해성 신호전달을 유도하고, 이는 hFcγRIIB 세포질 ITIM 모티프의 인산화와 관련이 있다. 31-33 본 발명자들은 이러한 수용체의 면역 저해 기능을 기반으로, 두 CD20 내재화를 방지하고 hFcγRIIB 활성화/인산화를 차단할 수 있는 mAb가 치료적 흥미가 있을 것이라는 것을 추측한다. 본 발명자들은 따라서 비호지킨 림프종 Raji B 세포에서 FcγRIIB 인산화를 조절하는 이들의 능력에 대한 14개의 hFcγRIIB 특이적 mAb를 스크리닝하였다. 가변 도메인 의존성 방식에서 항체-매개된 효과를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 이들의 불변 Fc 도메인을 통해 FcγR에 결합할 수 없는 이들의 불변 영역에서 N297Q 돌연변이체를 운반하는 항체 변이체를 조작하였다(하기 참조). 34 hFcγRIIB mAb에 의한 Raji 세포의 단기간 처리(30분)는 두 가지 상이한 반응인, hFcγRIIB ITIM의 높은 수준의 인산화를 유도하는 mAb(예를 들면, 클론 5C04 및 6G08) 및 효과가 적거나 없는 것들, 예를 들면, 클론 6G11 및 7C07을 야기하였다(도 2A). 이는 일차 CLL 세포, 편도선, 및 단핵구에서 유사하게 관찰되었다(도 9B 및 9C, 데이터가 도시되지 않음). 이들 데이터는 이러한 수용체를 활성화시키지 않으면서 hFcγRIIB에 대한 면역-착물 결합을 차단할 수 있는 hFcγRIIB mAb가 성공정으로 생성되었음을 증명한다.
다음, 본 발명자들은 hFcγRIIB mAb가 hFcγRIIB와 리툭시맙 사이의 상호작용을 차단하고 결과적인 리툭시맙 내재화를 방지할 수 있는지 여부를 조사하였다. 몇몇 mAb, 예를 들면, 6G08은 수용체 인산화를 자극하는 효능성으로 남아 있었다. 대조적으로, 여기서 길항성으로 언급되는 두 가지 mAb(6G11 및 7C07)는 Raji 및 일차 CLL 세포(도 2B, 데이터는 도시되지 않음)에 리툭시맙 결합 후, 유도된 FcγRIIB 인산화를 거의 완전하게 방지할 수 있었고, 이는 AT10와 매우 유사하다. 32 유세포 분석 ??칭 분석 23 을 사용하여, 본 발명자들은 동일한 mAb가 hFcγRIIB-형질감염된 Ramos 세포의 표면으로부터 리툭시맙의 내재화를 효과적으로 차단할 수 있었다는 것을 측정하였다(도 2C). 특히, 이러한 mAb의 존재하에 내재화의 부족은 유형 II mAb, 토시투모맙, 및 hFcγRIIB가 부족한 Ramos 세포에서 보인 것과 유사하였다(도 2C). 두 WT 및 N297Q 변이체는 이러한 분석에서 동등한 활성을 가졌고, 이는 항체 가변 도메인(Fv)-의존성 효과(도 9)를 나타내고, 길항 효과가 WT hIgG1 형식으로 유지되는 것을 증명한다. 후속적인 분석은 리툭시맙 내재화를 차단하는 mAb 패널의 능력이 hFcγRIIB에 대한 이의 상대적인 친화도인 R2 = 0.78(도 2D)과 직접적으로 관련되고, 차례로 리툭시맙 자극 후 hFcγRIIB의 인산화를 차단하는 이의 상대 순위 능력인 R2 = 0.79(도 2E)와 관련성이 있음을 나타낸다. 따라서, 높은 친화도 길항성 hFcγRIIB mAb는 표적 세포 표면으로부터의 리툭시맙의 hFcγRIIB-매개된 제거를 방지하였다.
길항성 hFcγRIIB mAb는 Fc:FcγR-의존성 세포독성을 유도하고 리툭시맙 내재화를 차단하여, 강력한 시험관내 항-종양 활성을 유도한다
생산적으로 활성제 FcγR-발현 면역 세포와 연계되는 몇몇 mAb의 길항 효과가 WT hIgG1 형식으로 보유된다는 발견은 이들 mAb가 고유한 Fc:FcγR-의존성 항-종양 활성을 가질 수 있음을 제시하였다. 본 발명자들은 따라서 우리의 hFcγRIIB mAb를 이러한 효과에 대하여 스크리닝하였다. 일차 NK 세포와 함께 옵소닌 처리된 표적 Raji 세포의 배양은 길항성 mAb 7C07 및 6G11이 또한 리툭시맙 그 자체에 의해 유도되는 것보다 큰 가장 높은 세포독성 활성을 가졌다는 것을 증명하였다(도 10A 및 B). 이들 2개의 클론이 리툭시맙 내재화의 차단 및 ADCC의 유도에서 가장 높은 친화도, 가장 강한 활성을 갖는다는 것을 확립하기 위하여, 본 발명자들은 다음으로 FcγR를 발현하는 것으로 알려진 인간 및 동물 조직의 패널에 대한 이들의 결합을 평가하였다. 클론 7C07 및 6G11는 둘 다 인간 비장 및 편도선의 림프구를 특이적으로 염색하였다(도 3A, 데이터는 도시되지 않음). 7C07 또는 6G11는 둘 다 시노몰구스 원숭이, 래트, 토끼 또는 마우스의 림프구와 반응하지 않았고, 이는 이들 mAb가 다른 종의 FcγRIIB와 교차 반응하지 않음을 나타낸다(도 3A, 데이터는 도시되지 않음). 그러나, 6G11가 아닌, 클론 7C07는 또한 인간 및 다른 종의 비장의 동양혈관 및 림프절 조직을 염색하였고, 이는 바람직하지 않은 교차-반응성을 나타낸다(도 3A 및 도 11A). WT 및 N297Q mAb는 동등하게 염색하는 것으로 나타났고(도 11B), 추가의 예상하지 못한 교차-반응성은 다른 인간 조직에서 관찰되지 않았다(도 11C). 이러한 반응성 프로파일을 기반으로, 클론 6G11을 우리의 주요 임상학적 후보로 선택하였다.
6G11의 고유한 세포독성 활성을 ADCC, PCD 및 ADCP 분석에서, 일차 환자 CLL 샘플의 넓은 패널을 사용하여 추가로 탐색하였다. 실질적인 활성은 각각의 분석에서 리툭시맙에 의해 관찰된 것보다 유의미하게 큰 수준인 것으로 증명되었다(도 3B-D). 추가로, 6G11은 hFcγRIIIA(각각 158 V 또는 F)의 높거나 낮은 친화도 변이체를 발현하는 NK 세포 이펙터에 의한 분석에서 리툭시맙과 비교하여 세포 사멸 유도에 더 효과적이었다(도 3E).
후속적으로, 본 발명자들은 CLL 세포로부터 리툭시맙의 내재화를 방지하는 6G11의 능력을 검사하였다. 6G11(그 자체로 고유한 Fc-의존성 이펙터 활성이 결여됨; 도 12)의 WT 및 N297Q 변이체 둘 다는 리툭시맙 내재화를 유의미하게 방지할 수 있었다(도 3F). 흥미롭게도, CD20와 달리, 이전에 보고된 바와 같이 17 , WT 또는 N297Q hIgG1 mAb(6G11 또는 AT10)에 의한 CLL 세포의 표면 위의 hFcγRIIB의 연계는 직접 또는 간접 평가 시 높은 수준의 hFcγRIIB 내재화을 야기하지 않는다(도 3G 및 도 13A 및 도 13B).
6G11가 또한 이의 내재화를 방지함으로써 리툭시맙의 세포독성 활성을 향상시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 일차 CLL 세포를 리툭시맙 및 6G11의 N297Q 변이체와 함께 동시배양하고, MDM ADCP 및 NK 세포 ADCC를 평가하였다. 현저하게, N297Q 6G11은 리툭시맙 단독에 비하여 리툭시맙-옵소닌 처리된 CLL 세포를 흡인하는 MDM의 능력을 실질적으로 촉진하는 것으로 나타났다(도 3H 및 I). 활성에서 유사한 증가가 NK 세포에 의한 ADCC 분석에서 나타났다(도 3J). NK 세포는 FcγRIIB를 발현하지 않고, 이는 hFcγRIIB mAb에 의해 유발된 임의의 증대가 리툭시맙 내재화의 이의 저해로 인한 표적 세포에 대한 효과로부터 발생한 것이라는 것을 확인시켜 준다. 이러한 데이터는 B 세포 표적의 표면 위의 hFcγRIIB를 차단하는 것이 mAb:Ag:hFcγRIIB 착물의 내재화를 저해하고, 이펙터 세포에 의하여 결실에 대한 표적이 되는 이의 능력을 증대시키는 것을 확인시켜 준다.
종합하면, 이러한 관찰들은 6G11이 이중 메커니즘-고유한 세포독성 활성을 통한 항-종양 활성 및 세포 표면으로부터 이의 제거를 방지하는 것을 통한 리툭시맙 활성의 강화를 유발할 수 있다는 것을 제시하였다.
6G11은 활성이 고갈된 고유한 B 세포를 갖고, 면역 컴피턴트 hCD20 +ve hFcγRIIb +ve Tg 마우스에서 리툭시맙에 의한 고갈을 강화한다
상기 논의된 바와 같이, hFcγRIIB는 두 표적 B 세포에서 발현되고, 여기서 이는 세포 표면으로부터 리툭시맙의 바람직하지 않은 제거를 매개하고, 주요 면역 이펙터 세포, 예를 들면, 대식세포에서, 이는 항-암 항체 반응을 약화시키는 기능을 한다. 5-7 , 35 관련된 hFcγRIIB-발현 세포 유형에서 전신적으로 hFcγRIIB를 표적으로 하는 것의 충격을 이해하기 위하여, 본 발명자들은 hFcγRIIB 프로모터의 대조군하에 hFcγRIIB 유전자를 발현하는 마우스를 생성시켰다(도 14A 및 B). Tg 마우스에서 hFcγRIIB의 발현 및 재분재는 B 림프구, BMDM 및 단핵구에서 강하게 발현되는 인간 조직에서의 것과 밀접하게 유사하지만, mFcγRII과 달리 호중구에서는 그렇지 않다(도 14C-F, 도시되지 않음). 추가로, 등가 발현은 mFcγRII-/- 배경에서 유지되었고, 이는 우리가 내인성 마우스 저해성 FcγR로부터의 복합성의 부재하에 hFcγRIIB의 효과를 연구하는 것을 허용한다. 중요하게, 6G11의 길항 활성은 이러한 마우스에서 보유되었다(도 14e). 추가로, 내피 세포에서 hFcγRIIB 발현은 WT 마우스에서의 것보다 낮고 인간에서의 것과 더 유사하였다(도 14e).
생체내 6G11 치료의 안전성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 1, 10 또는 100 ㎎/㎏의 6G11를 갖는 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스의 코호트를 처리하는 용량-단계적 증가 연구를 수행하였다(도 18). 처리된 마우스 중 어느 것도 급성 효과, 고통 또는 체중 감소와 같은 부작용을 겪지 않았다(도 18). 7일에 조직 검사는 장기(신장, 비장, 간, 폐)에서 임의의 육안 독성을 나타내는데 실패하였다. hFcγRIIB+ B 세포의 실질적인 고갈은 10 및 100 ㎎/㎏ 그룹에서 등가의 활성을 갖는 1 ㎎/㎏ 이상의 용량으로 혈액(도 6A) 및 비장(도 6B) 둘 다에서 관찰되었다. 6G11은 마우스의 혈청에서 용이하게 검출되지만 선천적 면역원성인 완전한 인간 mAb이고, 따라서 본 발명자들은 동시에 이의 반감기 및 마우스 항-인간 항체(MAHA) 반응의 증거를 평가하였다. 용량 > 1 ㎎/㎏에서, PK 프로파일에 영향을 주는 표적-매개된 제거가 극복되었고, 10 및 100 ㎎/㎏ 그룹에서 표적 결합의 효과는 적거나 없었다(도 6C). 그러나, 7일 이내에 빠른 mAb 제거를 야기하는 유의미한 MAHA가 관찰되었다(도 6D). 유의미한 MAHA의 출현 전 시간점을 기준으로, 본 발명자들은 10 및 100 ㎎/㎏ 용량에 있어서 2 내지 4일의 영역으로 mAb 반감기를 추정하였다(도 6C, D 및 표 7).
본 발명자들은 또한 6G11이 임상적으로 전달될 수 있는 방법을 더 우수하게 모방하기 위하여 반복 용량 연구를 수행하였고, 이는 이를 이전과 같이 검사된 마우스에 24-일 기간(도 18) 전체에서 4회 투여하는 것이다. 순환성 B 세포의 고갈은 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/-에서 관찰되지만, 6G11의 다중 용량(10 ㎎/㎏)가 주사된 mFcγRII-/- 대조군 그룹에서는 관찰되지 않았다(도 6E). 이와 같이, 마우스는 체중 감소(도 18) 또는 부작용을 겪지 않았고, 육안 독성의 어떠한 징후도 관찰되지 않았다(데이터는 도시되지 않음). 이전과 같이, 실질적인 MAHA 반응이 1주 이내 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스에서 관찰되었고, 이는 혈청으로부터의 6G11의 빠른 손실에 기여하였다(도 6F). 대조적으로, MAHA는 mFcγRII-/- 대조군 그룹에서 검출되지 않았고, 이는 MAHA 유도에 필요한 이종이식 mAb 및 표면 항원의 공동의존성을 나타낸다(도 6F).
B 세포 이외의 hFcγRIIB+ 세포가 6G11 치료 후 제거될 수 있는지를 탐색하기 위하여, 인간 혈액에 의한 전혈 고갈 분석(도 6b) 및 hFcγRIIB Tg 마우스에 의한 생체내 실험(도 S4N)을 수행하였다. 단핵구 또는 호중구가 아닌 B 세포는 WT 6G11 IgG1에 의해 제거되지만 N297Q 6G11에 의해 제거되지 않았다. 단핵구 및 호중구의 고갈의 동일한 부족은 리툭시맙과의 병용으로 나타났다(도 6b). 다음으로, 본 발명자들은 최근 개발된 시험관내 사이토킨 방출 증후군(CRS) 분석(CRA)(Hussain et al., 2015)을 사용하여 CRS를 유발함으로써 이전에 강조된 몇몇 mAb 특이성(CD3, CD28 또는 CD52)의 첨가에 따른 고밀도 배양(Romer et al., 2011)을 통한 자극에 민감하게 만들어지고 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-8의 실질적인 수준을 검출할 수 있는 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 대한 6G11의 강한 충격을 평가하였다. 48시간 동안 WT 또는 N297Q 6G11의 적용은 CD3 mAb의 500x 낮은 용량과 달리 실질적인 사이토킨 방출에서 야기되지 않았다(도 6). 완전한 또는 희석된 혈액 CRA를 사용하여 유사한 결과를 수득하였다(도 19).
총괄하여, 이러한 데이터는 부작용이 없음을 증명하였고, 효능 연구를 지지하는 6G11 mAb에 대한 치료적으로 관련된 PK 프로파일을 나타냈다.
6G11은 고유한 활성을 갖고, 면역-컴피턴트 마우스에서 리툭시맙에 의한 고갈을 강화한다
단독 또는 리툭시맙와 병용으로 hFcγRIIB의 표적화 제거 가능성을 hIgG1 6G11 및 mIgG1 AT10 둘 다를 사용하여 평가하였다. 먼저, 단기간 선별적 전달 분석 23 에서, CFSE+ve hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 비장세포를 WT 부형제로 주사하고, 따라서 6G11(도 4A 및 B)로 처리하였거나, AT10(도 15A) 전달된 세포를 순환 및 비장으로부터 유효하게 고갈되는 것으로 관찰되었다. 흥미롭게도, mAb 1 ㎍ 만큼 낮은 투여는 ~50% B 세포 고갈을 유발하는데 효과적이었다. 활성이 F(ab')2 단편 및 N297Q 변이체에 의해 손실됨에 따라 고갈은 Fc:활성제 FcγR 상호작용에 대한 전체적으로 의존성이고; hFcγRIIB+ve 표적은 또한 γ 쇄-/- 마우스에서 제거되지 않았고, 활성제 FcγRs도 부족하였다(도 4 A 및 B 및 도 15A). 이들 데이터는 길항성 hFcγRII mAb가 생체내 표적 세포를 제거할 수 있다는 것을 확인시켜 주고, 면역 이펙터 세포에 대한 활성제 FcγRs과의 상호작용에 대한 의존성은 이전에 36 기재된 바와 같다.
리툭시맙과의 병용 요법으로 우리의 분석을 확장하기 위하여, hCD20+/- 15 , 37 x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스를 상호교잡으로 생성시켰다. 리툭시맙 및 6G11(또는 AT10)의 병용은 WT 부형제로 표적을 옮기는 단기간 분석에서 mAb 단독과 비교하여 hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- B 세포의 더 높은 고갈을 야기하였다(각각 도 4C 및 도 15B). 유사하게, 선별적으로 전달된 hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- B 세포는 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 부형제 마우스(이펙터 세포에서 또한 hFcγRIIB를 발현)에서 리툭시맙과 6G11의 병용에 의하여 더 유의미하게 고갈되었다(도 4D).
본 발명자들은 다음으로 hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스 모델에서 순환성 B 세포에 대한 병용의 효과를 조사하였다. 이전과 같이 단일요법과 비교하여 순환성 B 세포의 유의미하게 더 높은 고갈을 야기하고(도 4E 및 도 15C 및 D), 이는 hFcγRIIB가 표적 및 이펙터 세포 둘 다에서 발현되는 완전하게 공통유전자 시스템에서 처음으로 이의 능력을 증명하였다. 2배 더 높은 용량으로 단일 적용된 개체 mAb에 의해 관찰된 반응으로부터 판단한 바, 리툭시맙 및 WT hIgG1 6G11(또는 AT10)의 병용의 효과는 추가의 활성(각각 도 4b 및 도 15)에 대하여 예상된 것보다 컸다.
6G11 고유한(B 세포 고갈) 대 외인성(리툭시맙 부스팅) 효과가 이러한 활성에 더 중요한지 여부를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스에서 N297Q 6G11을 사용하고, N297Q 6G11 단독이 결실에서 불활성이고, B 세포의 리툭시맙 결실을 유의미하게 부스팅하는 것을 나타낸다(도 4b). 유사한 결과가 mIgG1 6G11에서 나타났다. 예상된 바와 같이, 그리고 AT10에서 관찰된 바와 같이(도 15), 하지만 N297Q hIgG1 6G11와 유사하게, mIgG1 6G11은 hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스에서 불량한 단일 제제 고갈 활성을 나타냈고(Hamaguchi et al., 2006), B 세포를 고갈시키는 이의 능력에서 리툭시맙의 뮤린 IgG2a 버전을 유의미하게 부스팅할 수 있었다(도 15). 게다가, 이의 마우스 Fc 때문에, 이는 MAHA에 의하여 능동적으로 제거된 것이 아니고, 이는 병용 요법의 장기간 평가를 가능하게 한다. 이러한 데이터는 리툭시맙의 생체내 고갈 활성을 향상시키기 위한 hFcγRIIB-기능의 길항작용의 장기간 유리한 효과를 나타낸다.
함께, 이들 연구는 내재화의 방지를 통한 리툭시맙 항-종양 활성의 강화와 연결된 고유한 항-종양 기능을 포함하는, 6G11을 위한 생체내 작용이 이중 메커니즘을 확인시켜 준다.
6G11은 생체내 B 세포의 유형 II hCD20 mAb-매개된 고갈을 향상시킨다
6G11이 또한, 유형 I CD20 mAb 13 , 23 , 33 와 동일한 정도로 내재화되지 않고 최근 CLL에서 사용이 승인된 유형 II hCD20 mAb와의 병용으로 효과적인지 여부를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 선별적 전달 모델에서 실험을 수행하였다. 리툭시맙에서와 같이, GA101gly(글리코실화된 오비누투주맙) 및 6G11 단일요법은 둘 다 비장 및 순환성 표적 CFSE+ve hCD20+/- x hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- B 세포의 중간 정도의 고갈을 야기한 반면, 병용 요법은 부형제 WT 및 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스에서 비장 및 순환성 표적 세포 둘 다의 고갈을 유의미하게 향상시켰다(도 4F 및 G; 데이터는 도시되지 않음). 이들 데이터는 6G11이 또한 다른 직접적인 B 세포 표적화 mAb와 병용으로 효과적일 수 있음을 제시한다.
6G11은 일차 CLL 세포의 리툭시맙-매개된 고갈을 부스팅하고, 생체내 객관적이고 완전한 항-종양 반응을 개선시킨다
리툭시맙이 몇몇 B 세포 악성종양의 치료를 개선시키는데 성공적으로 사용되었음에도 불구하고, 이는 CLL을 제어하는 제한된 활성을 갖는다. 혈액에서 초기 말초 고갈에도 불구하고, 이차 림프 조직으로부터의 효과적인 종양 부피감소 및 소위 증식 센터는 덜 성공적이었다. 따라서, CLL 세포에 대항하는 6G11의 항-종양 활성을 더 우수하게 평가하기 위하여, 본 발명자들은 일차 인간 CLL 세포가 이차 림프 장기(비장 및 골수)를 거처로 삼고, 지원 인간 T 세포와 동시에 클러스터 내에서 증식하고, 이로써 인간 질환의 상황을 밀접하게 모방하는 동물 모델을 개발하였다(도 5 A 및 B). 이러한 모델에서, 리툭시맙은 복막강에서 거주하는 CLL 세포를 고갈시키는데 효과적이지만, 비장에 존재하는 증식 센터에서 CLL 세포를 고갈시키는데는 불완전하게 효과적이다(도 16).
일차 CLL 세포가 생착된 마우스가 리툭시맙 또는 6G11 단독으로 처리된 경우, 동형 대조군 mAb로 처리된 동물에 비하여 종양 덩어리에서 유의미한 감소가 비장에서 나타났다(도 5C). 리툭시맙 및 6G11의 병용에 의한 치료는 훨씬 더 높은 고갈 비율을 야기하였다(도 5C). 게다가, 이들 데이터를 반응 비율을 기준으로 평가하는 경우, 병용 요법 후의 부분적 및 완전한 반응자의 수는 동형 대조군-처리된 마우스 또는 단일요법(각각 도 5D 및 5E)보다 유의미하게 더 높았다.
추가로, 병용 요법 후의 객관적인-(OR; 비장에서 CLL 세포의 75% 초과의 감소로서 정의됨) 및 완전한-반응자(CR; 비장에서 CLL 세포의 0.1% 미만으로서 정의됨)의 수는 동형 대조군-처리된 마우스 또는 단일요법(도 5a 및 도 5b, 및 표 5)보다 유의미하게 더 높았다. 이들 데이터는 생체내 일차 CLL 세포에 대항하여 리툭시맙/6G11 병용 요법의 증가된 효능을 증명한다.
그 다음, 본 발명자들은 리툭시맙, 오파투무맙(hCD20 mAb) 및/또는 알렘투주맙(hCD52 mAb)-불응성 환자로부터 단리된 CLL 세포가 생착된 마우스를 치료하는 6G11의 능력을 검사하였다(표 4). 이종이식된 마우스를 단일 요법으로서 6G11 또는 리툭시맙으로, 또는 병용으로서 2개의 mAb로 치료하였다. 예상된 바와 같이, 리툭시맙 단독에 의한 치료는 불충분하였고(도 5a 및 도 5b 그리고 표 8), 95% 초과의 마우스는 OR를 생성하는데 실패하였다. 대조적으로, 6G11 단독은 유의미한 CLL 세포 고갈을 나타냈지만, OR을 개선시키는데 실패하였다(도 5a 및 도 5b 그리고 표 5). 놀랍게도, 그러나, 리툭시맙과 6G11의 공동투여는 25% 초과의 OR(표 5)로 왕성한 고갈(도 5a 및 도 5b, 및 표 8)을 야기하였다. 이들 데이터는 반응자 환자에서 리툭시맙 활성을 부스팅하는 것 외에, 6G11가 치료-불응성 CLL 세포에 대항하는 활성일 수 있다는 것을 제시한다.
리툭시맙과 6G11의 병용 요법은 생체내 불응성 CLL 세포를 극복한다
그 후, 본 발명자들은 리툭시맙의 존재 또는 부재하에, 리툭시맙 및/또는 알렘투주맙(hCD52 mAb)-불응성 환자로부터 단리된 CLL 세포가 생착된 마우스를 치료하는 6G11의 능력을 검사하였다(표 4). 예상된 바와 같이, 리툭시맙 단독에 의한 세포의 고갈은 불충분하지만, 이는 6G11의 존재하에 유의미하게 개선되었다(도 5F). 게다가, 병용 요법을 제공받은 불응성 CLL 세포로 생착된 마우스의 더 높은 수는 병용에 의한 부부적 반응을 달성하였다(도 5G). 이들 데이터는 6G11이 리툭시맙-감응성 및 -불응성 환자 그룹 둘 다에서 리툭시맙의 효능을 부스팅할 수 있다는 것을 격려한다.
환자 정보, 이전 치료 및 리툭시맙 불응성으로 임상학적으로 정의된 환자의 반응에 관한 정보. 이를 동형 대조군 처리된 마우스의 비장에서 CLL 세포의 수가 100% +SD로 설정된 생체내 모델에서 상대적인 반응과 비교한다.
이전 치료 추가 정보 생체내 치료에 대한 상대적인 반응, %
Cntrl Rit 6G11 Rit+6G11
1년: FCx2 - 반응 없음
3년: FC+알렘투주맙x3 후, BR - 반응 없음
5년: DHAPx1 - 반응 없음
6-7년: 조사		 -여성
-44세
-샘플링 7년 전 진단됨
-샘플링 시간에 WBC 234
100±15
92±21
78±18
73±14
2년: 초기 반응과 함께 FCR x3, 7개월 이내 진행
3년: BR - 치료 동안 진행
3년: 오파투무맙 - 반응 없음
3년: 질병에 걸림		 -여성
-71세
-샘플링 3년 전 진단됨
-13q 및 일염색체 12
-샘플링 시간에 WBC 50
-BR과 오파투무맙 치료 사이에 획득된 샘플
100±21
100±28
98±31
79±18
1-2년: 클로람부실
3년: F+알레무투주맙 - 반응, 하지만 약 1년 이내에 진행.
5년: FCR x2 - 반응, 하지만 약 1년 이내 진행
7년: BR x4 - 반응, 하지만 7개월 이내 진행8년: BR - 부분적 반응9년: 질병에 걸림		 -여성
-66세
-샘플링 8년 전에 진단됨
-FISH 정상(13q, 11q, 17p, +12)
-샘플링 시간에 WBC 359(2013년 9월)
-8년의 마지막 BR 치료 전에 획득된 샘플
100±36
74±35
52±16
31±10
2년: 스테로이드 플러스+알레무투주맙 - 부분적이지만 짧은 관해
3년: 오파투무맙-3개월 이내 주 초기 반응이 진행
4년: 질병에 걸림		 -남성
-70세
-샘플링 3년 전에 진단됨
-50% chr 12 삼염색체
-샘플링 시간에 WBC 77
-오파투무맙 치료 후 진행 동안 샘플
100±38
88±56
73±49
55±26
리툭시맙과 6G11의 병용 요법은 일차 MCL 세포에 대항하는 생체내 활성을 갖는다악성 B 세포의 다른 유형을 표적으로 하는 6G11의 능력을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 Jeko MCL 세포 또는 신선하게 단리된 일차 MCL 세포(각각 도 17A 및 B)가 생착된 면역결핍 마우스 모델을 사용하였다. 마우스에 Jeko MCL 세포가 생착되는 경우, 6G11 또는 리툭시맙에 의한 단일요법은 장기간 생존을 야기하지 않았던 반면, 병용은 100일 동안 마우스 ~30%가 치유되는데 효과적이었다. 유사하게, 일차 CLL 세포에 의한 것과 같이, 일차 MCL 세포는 병용 요법에 바람직하게 반응하였다(도 17B).
6G11은 잘 용인되고, 치료적으로 관련된 생체내 약동학을 가지며, 시험관내 사이토킨 스톰을 야기하지 않는다
다음으로, 6G11 mAb 치료의 안전성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 6G11의 1, 10 또는 100 ㎎/㎏의 단일샷을 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스의 코호트를 처리하는 용량 단계적 증가 연구를 수행하여, 10 ㎎/㎏ 용량으로 투여 i.v. 및 i.p. 경로 둘 다를 시험하였다(도 18A). 처리된 마우스 중 어느 것도 급성 효과, 고통 또는 체중 감소와 같은 부작용을 겪지 않았다(도 17B). 7일에 조직 검사는 장기(신장, 비장, 간, 폐)에서 임의의 육안 독성을 나타내는데 실패하였다(데이터는 도시되지 않음). hFcγRIIB+ve B 세포의 고갈은 10 및 100 ㎎/㎏ 그룹에서 등가의 활성을 갖는 1 ㎎/㎏ 이상의 용량으로 혈액(도 6A) 및 비장(도 6B) 둘 다에서 관찰되었다. 6G11은 마우스의 혈청에서 용이하게 검출되지만 선천적 면역원성인 완전한 인간 mAb이고, 따라서 본 발명자들은 동시에 이의 반감기 및 마우스 항-인간 항체(MAHA) 반응의 증거를 평가하였다(도 6C 및 D). 용량 > 1 ㎎/㎏에서, PK 프로파일에 영향을 주는 표적-매개된 제거가 극복되었고, 10 및 100 ㎎/㎏ 그룹에서 표적 결합의 효과는 적거나 없었다고 나타냈다. 그러나, 7일 이내에 빠른 mAb 제거를 야기하는 유의미한 MAHA가 관찰되었다(4일부터 7일까지 10㎎/㎏ i.v. 그룹에서 네자릿수로 증가; 도 6D). 유의미한 MAHA의 출현 전 시간점을 기준으로, 본 발명자들은 10 및 100 ㎎/㎏ 용량에 있어서 2 내지 4일의 영역으로 mAb 반감기를 추정하였다(도 6C, D 및 표 3).
본 발명자들은 또한 6G11이 임상적으로 전달될 수 있는 방법을 더 우수하게 모방하기 위하여 반복 용량 연구를 수행하였고, 이는 이를 10일 기간 동안 투여하고(초기 i.v. 투여 후, 3 용량을 i.p.로 전달; 17C) 고통, 체중 감소, 독성 또는 병리의 임의의 징후에 대하여 전체적으로, 그리고 14일 후(총 mAb 제공에서 24일)에 검사된 동물을 검사하는 것이다. 이전과 같이, 순환성 B 세포의 고갈은 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/-에서 관찰되지만, 6G11의 다중 용량(10 ㎎/㎏)가 주사된 mFcγRII-/- 대조군 그룹에서는 관찰되지 않았다(도 6E). 이와 같이, 마우스는 체중 감소(도 17B)를 겪지 않았고, 부작용을 겪지 않은 것으로 보였고, 육안 독성의 어떠한 징후도 관찰되지 않았다(도 17D; 데이터는 도시되지 않음). 이전과 같이, 실질적인 MAHA 반응이 1주 이내 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스에서 관찰되었고, 이는 혈청으로부터의 6G11의 빠른 손실에 기여하였다(도 6F). 흥미롭게도, MAHA는 mFcγRII-/- 대조군 그룹에서 검출되지 않았고, 이는 MAHA 유도에 필요한 표면 항원의 존재를 나타낸다(도 6F).
최종적으로, 본 발명자들은 최근 개발된 시험관내 사이토킨 방출 증후군(CRS) 분석(CRA)을 사용하여 고밀도 배양을 통한 자극에 민감하게 만들어진 인간 PBMC의 6G11의 강한 충격을 평가하였다. 28 이러한 분석 시스템은 CRS를 유발함으로써 이전에 강조된 몇몇 mAb 특이성(CD3, CD28 또는 CD52)의 추가 후의 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-8의 실질적인 수준을 검출할 수 있다(도 6F 및 준비 중인 원고). 48시간 동안 이러한 분석에서 WT 또는 N297Q 6G11의 적용은 CD3 mAb의 500배 낮은 용량과 달리 실질적인 사이토킨 방출을 야지하지 않았다(도 6G). 전혈 사이토킨 분석을 사용하여 유사한 결과를 수득하고(도 18), 이는 인간에서 조사 전에 6G11에 대한 우수한 안전성 프로파일을 함께 나타낸다.
6G11은 다른 임상적으로 관련된 항체의 생체내 치료적 활성을 향상시킨다
최근 관찰은 FcγRIIB-의존성 내재화가 리툭시맙 이외에 몇몇 임상적으로 관련된 항체에 대한 내성의 기저를 이룰 수 있다는 것을 나타낸다(Vaughan et al., 2014); Pallasch et al., 2014). 본 발명자들은 따라서 6G11과 최근 승인된 hCD20 mAb 오비누투주맙(GA101), 및 임상적으로 잘 입증된 hCD52 특이적 mAb 알렘투주맙의 병용을 시험하였다. hCD20에 대한 오비누투주맙의 특이성은 본 발명자들은 공통유전자 마우스 모델에서 효과를 연구하는 것을 허용하였다. GA101 및 6G11 단일요법 둘 다는 비장 및 순환성 B 세포의 중간 정도의 고갈을 야기한 반면, 병용은 WT(도 5b) 및 hFcγRIIB+/- x mFcγRII-/- 마우스에서 고갈을 유의미하게 향상시켰다(도 6F 및 S6G). 6G11과 GA101의 병용은 CLL-환자 이종이식 마우스 모델에서 비장 종양 세포 고갈을 유의미하게 개선시켰다(도 5b 그리고 표 5 및 표 8). hCD52에 대한 알렘투주맙의 특이성은 공통유전자 hCD20 모델에서 연구를 불가능하게 만들고, 6G11 및 알렘투주맙이 CLL-마우스 모델에서 병용되는 경우, 치료적 활성에서 유의미한 개선이 존재하였고, 병용-처리된 마우스의 90% 초과가 CR을 발달시켰다(도 5b 그리고 표 5 및 표 8).
이들 데이터는 6G11이 다중 표적에 대한 mAb 약물-내성을 극복할 수 있다는 증거를 제공한다.
도 1과 관련됨. ELISA 및/또는 SPR에 의해 평가된 hFcγRIIA 및 hFcγRIIB mAb의 친화도 측정
클론 명칭 EC550
FcγRIIA + CHO 		EC550
FcγRIIB + CHO 		EC550
FcγRIIA 		EC550
FcγRIIB 		K A (1/MS) K D (1/s) K D (M)
iso ctrl nb a Nb nb nb
1A01 0.4 Nm 0.2
1B07 0.3 Nb 0.3
1C04 0.3 Nb 1.5
1E05 0.5 Nb 0.7
2A09 0.6 Nb 0.6
2B08 0.6 Nm 2.0
2E08 0.3 Nm 1.3
5C04 nm b 0.4 0.8 3.24 x 105 0.04808 1.42 x 10-7
5C05 nb 1.7 2.7 801.6 0.001769 5.45 x 10-7
5D07 nm 0.4 0.6
5E12 nb 1.0 3.4
5G08 nb 0.7 0.7 4.72 x 105 0.3365 7.13 x 10-7
5H06 nm 0.4 0.6
6A09 nm 1.4 3.7
6B01 nm 0.5 1.4
6C11 nb 0.5 2.3
6C12 nb 0.3 1.0
6D01 nm 0.3 0.9
6G03 nb 0.4 0.9
6G08 nb 0.6 1.7
7C07 nm 0.3 0.3 9.13 x 105 0.01851 2.39 x 10-8
4B02 nb 0.6 1.0
6G11 nm 0.3 0.4 6.9 x 106 0.1819 2.64 x 10-8
6H08 nb 1.4 3.6
a nb: 결합 없음.
b nm: 측정되지 않음.
도 14와 관련됨. hFcγRIIB +/- x mFcγRII -/- 마우스에서 WT 6G11 mAb의 약동학(PK) 파라미터 추정값
용량 그룹 t1/2
(일) a 		Vz
(㎖/kg) b 		Vss
(㎖/kg) c 		CL
(㎖/일/kg) d 		AUC
(일*㎍/㎖) e 		Cmax
(㎍/㎖) f 		Tmax
(시간) g
10 ㎎/㎏ (i.v.)
n=6		 기하 평균 88.8 82.5 48.5 206 201000 0.166
표준편차 0.607 14.2 15.1 36.2 106 55800
CV(%) 16.0 18.3 74.6 51.3 27.8
조화 평균 1.08
CV(%) 56.0
10 ㎎/㎏ (i.p.)
n=4		 기하 평균 107 29.0 344 117000 3.83
표준편차 0.65 7.52 6.10 72.0 13300 2.50
CV(%) 7.04 21.0 20.9 11.4 65.2
조화 평균 2.49
CV(%) 26.0
100 ㎎/㎏
(i.v.)
n=6		 기하 평균 53.7 54.6 12.2 7770 2350000 0.224
표준편차 0.925 16.0 16.2 1.12 638 402000 0.340
CV(%) 29.7 29.6 9.16 8.21 17.2 152
조화 평균 3.09
CV(%) 29.9
a mAb 반감기
b 최종 단계와 연관된 재분배의 용적.
c 정상 상태에서 재분배의 용적(정상 상태, 투여의 특정한 수 종료시 수득된 평형 상태).
d 제거; 단위 시간당 개끗한(즉, 관련된 임의의 약물을 더 이상 함유하지 않음) 혈장의 용적.
e 곡선하 면적; 확정 시간의 간격에 대한 약물의 혈장 농도의 적분에 상응한다.
f 투여 후 약물의 피크 형질 농도
g Cmax에 도달하는데 걸리는 시간
논의
암 세포는 고도로 증식성이고 선천적으로 게놈 불안정하며 돌연변이에 대한 높은 성향을 갖는다. 이러한 양상은 통상적인 항-암 약물로부터의 선택하에 세포 진화를 위한 완벽한 환경을 제공하고, 여기서 유전적으로 구별된 치료 내성 클론은 치료 실패를 야기하는 것으로 드러난다. 이러한 능력은 DNA 손상 화학요법 38 및 표적 구별된 신호전달 경로를 표적으로 하는 소분자 저해제, 예를 들면, 이마티닙, 에를로티닙 및 이브루티닙 39-43 에 대항하여 발달하는 내성 메커니즘에서 명백하게 드러난다. 이러한 메커니즘은 표적화된 수용체에서 돌연변이 또는 다운스트림 신호전달 단백질에서 상보적 변화를 포함한다. 44 다른 것들은 약물 유출 펌프( 45 에서 검토됨)의 상향 조절을 통해 달성된 다중약물 내성 메커니즘을 포함한다. 통상적인 및 표적화된 소분자 저해제의 실패는 면역제와 연계된 것들을 포함하여 이의 내성 방식 및 또한 대안적인 요법을 극복하는 수단을 위한 탐색으로 이끌었다.
단클론 항체(mAb)는 현재까지 이러한 접근법의 가장 성공적인 대표자이었고, 혈액학 질병에서 Ab는 선두에 있다. B 세포 암은 항체 요법과 관련하여 암의 임상적으로 가장 우수하게 연구된 유형을 나타낸다. 1997년에 리툭시맙의 승인, 및 제2(오파투무맙) 및 제3(오비누투주맙) 생성 hCD20 mAb의 최근 승인 이후로, 이들 제제는 B 세포 암을 치료하는 의료품에서 중요한 중심이 되어 왔다. 그러나, mAb 면역요법이 또한 고유한 및 획득된 내성 둘 다에 취약하다는 것이 분명하다. 현재 종양은 간질 및 골수 세포를 전복시킴으로써 이들 주위의 미세환경에 양항을 주어 이의 생존 및 성장을 지지하는 것으로 잘 확립되어 있다 46 mAb 요법과 관련된 내성의 적어도 2개의 메커니즘은 저해성 FcγRIIB에 의해 촉발된다( 47 에서 검토됨). 클리네스(Clynes) 5 로 나타낸 이펙터 세포 위의 저해 효과 이외에, 이는 최근 B 세포 표면 위의 양극성 항체 브릿징에 의해 리툭시맙 및 기타 유형 I hCD20 mAb가 hFcγRIIB에 연계되는 것으로 나타났고, 이는 mAb:CD20:FcγRIIB 착물의 내재화를 야기하고 13 , 23 , 48 , 이로써 중요한 Fc-의존성 이펙터 기능에 연계되는 이의 능력을 제한한다( 23 및 문헌[Tipton et al.], 출판되지 않음). 여기서, 이러한 실시예는 이러한 내성 메커니즘 둘 다를 차단할 수 있고, 따라서 기타 치료적 mAb의 완전한 가능성을 촉발시키고, 생체내 항체 요법에 대한 내성을 극복하는 것을 돕는, 완전한 인간 hFcγRIIb mAb의 생성을 설명한다.
현저하게, hFcγRIIB mAb의 공동투여는 리툭시맙-반응 환자로부터의 CLL 세포가 이식된 마우스의 객관적인 및 완전한 반응을 개선시킬 뿐만 아니라, 중요하게도 이들은 리툭시맙 또는 hCD52-표적화 mAb, 알렘투주맙에 내성이 있는 재발한/불응성 환자로부터의 CLL 세포의 mAb 치료-내성 표현형을 극복한다.
종양 세포 FcγRIIB의 역할은 미세환경을 선택하는 hCD52 mAb 요법에 내성에서 최근 제안되었다(Pallasch et al., 2014). hFcγRIIB는 더 취약한 비장 구획 및 다른 내성 조직에서 이러한 개선된 hCD52 mAb 요법에서 hFcγRIIB의 shRNA-매개된 녹다운(knock-down)과 비교하여 알렘투주맙-내성 골수 백혈병 B 세포에서 상향 조절된 것이 확인되었다. 이러한 발견들은 우리의 CLL 모델에서 만들어진 관찰과 일치하였다. 취약한 복막 구획에서 CLL 세포가 hCD20 mAb에 의해 용이하게 고갈된 반면, 내성 미세환경에서 고갈은 종양 FcγRIIB의 차단을 필요로 하였다. 높은 FcγRIIB 발현 기본이 내성 조직 구획에서 mAb 활성을 감소시키는 것과 일치하게, FcγRIIB-차단은 알렘투주맙 및 또한 CLL 모델에서 유형 II hCD20 mAb를 개선시켰다. 본 발명자들은 이전에 유형 II hCD20 mAb가 오직 FcγRIIB의 높은 수준의 존재하에 효과적으로 내재화하는 것을 보여줬다(Vaughan et al., 2014). 총괄하여, 이들 관찰은 FcγRIIB-매개된 내성이 몇몇 상이한 임상적으로 승인된 항체와 관련되었다는 것을 증명하고, 이는 hFcγRIIB mAb와 병용을 위한 넓은 치료적 가능성을 나타낸다.
이전에 유형 I CD20 mAb가 유형 II보다 표적화된 종양 세포로 내재화되는 경향이 훨씬 크다고 보이고 13 , 23 , 33 , 후자는 오직 높은 수준의 FcγRIIB의 존재하에 효과적으로 내재화되는 것으로 나타났다. 33 여기서 유형 II CD20 항체의 B 세포 고갈 활성이 생체내 6G11와 동시치료에 의해 유사하게 개선된 것으로 나타나는 발견은 따라서 흥미롭다. 헤만(Hemann)과 동료들은 최근 선택 미세환경에서 hCD52 mAb 요법에 대한 내성에서 종양 세포 FcγRIIB에 대한 역할을 지시하였다. 49 FcγRIIB는 더 취약한 비장 구획과 비교된 알렘투주맙-내성 골수, 및 다른 내성 조직에서 백혈병 세포 개선된 hCD52 mAb 치료적 효과에서 FcγRIIB의 siRNA-매개된 녹다운에서 상향 조절된 것으로 확인되었다. 이들 발견들은 우리의 CLL 모델에서 만들어진 관찰과 일치한다. 취약한 비장 구획에서 단독 CLL 세포는 hCD20 mAb 치료에 의해 용이하게 고갈되는 반면, 내성 미세환경에서 클러스터화 증식성 CLL 세포의 고갈은 종양 FcγRIIB의 차단이 필요하였다. 중요하게, 이들 관찰(본 명세서 및 33 )은 FcγRIIB-매개된 내성이 몇몇 상이한 임상적으로 승인된 항체 및 입증된 표적과 관련이 있음을 증명하고, 이는 hFcγRIIB mAb와 병용을 위하여 넓은 치료적 가능성을 나타낸다.
항체 요법에 대한 내성이 암의 몇몇 유형에서 관찰되었다. B 세포 암 중에서, CLL 및 MCL은 FL 및 DLBCL와 비교하여 hCD20 mAb-함유 계획으로 덜 우수하게 치료되고, 이는 전자에서 고유한 내성 메커니즘을 나타낸다. 추가로, FL 및 DLBCL를 갖는 개별적인 환자는 hCD20 mAb 요법에 대하여 선천적인 내성을 나타내고, 모든 B 세포 암 환자의 일정 비율은 초기에 항체-함유 면역 요법에 반응하다가 내성이 발달하고 치료로부터 더 이상 이득을 얻지 못한다. 이전 관찰( 32 , 14 및 출판되지 않은 데이터)은 FcγRIIB-매개된 항체 내재화가 이들 상이한 B 세포 암 및 개체에서 내성의 근간이 되는 일반적인 메커니즘일 수 있다는 것을 나타낸다. 여기서, 본 발명자들은 hFcγRIIB mAb와 공동투여가 생체내 CLL 및 MCL 종양 세포에 대항하는 리툭시맙 항종양 활성을 부스팅한다는 발현을 나타내고, 이는 FcγRIIB-매개된 항체 내재화가 상이한 B 세포 암에 일반적인 치료적으로 관련된 내성 메커니즘이라는 관찰과 일치한다.
이러한 실시예는 추가로 hFcγRIIB mAb가 고유한 항-종양 활성을 갖는다는 것을 증명한다. 문헌[Veri et al.]. 하지만 이전에 개발된 hFcγRIIB-특이적 mAb는 생체내 암 표적에 대항하는 이들의 활성을 검사하지 않았다. 50 문헌[Rankin et al.]. 후속적으로 악성 인간 B 세포에 대한 hFcγRIIB를 표적화가 단일요법으로서 유효할 수 있다는 것이 나타났다. 그러나, 이러한 연구 36 는 면역결핍 이종이식 시스템을 사용하고, 마우스 수용체과의 Ab 교차-반응성의 부족으로 인하여, 표적 항원은 종양에서만 발현되고 중요한 면역 이펙터 세포에서는 발현되지 않고, 이는 hFcγRIIB mAb의 총 효과의 평가를 불가능하게 만든다. 현재 작업에서, 파지-디스플레이로부터 유래된 하나의 완전한 인간 및 통상적인 융합세포 기술을 통해 유래된 하나의 뮤린인 2개의 상이한 mAb 클론을 사용하여, 본 발명자들은 hFcγRIIB가 표적 B 세포 및 이펙터 둘 다에서 발현되고, 길항성 hFcγRIIB 항체가 고유한 항종양 활성을 갖는 면역컴피턴트 공통유전자 마우스 모델을 증명한다. 중요하게, hCD20 및 hFcγRIIB 둘 다를 발현하는 이중 Tg 마우스를 사용하여, 본 발명자들은 추가로, 두 표적이 인간과 동일한 세포- 및 조직- 특이적 방식의 면역컴피턴트 호스트에서 발현되는 경우, hFcγRIIB-매개된 내재화의 mAb 차단이 리툭시맙 치료적 활성을 부스팅한다는 것을 증명한다. 흥미롭게도, 이러한 설정에서 길항성 hFcγRIIB mAb 및 CD20 mAb(리툭시맙 또는 오비누투주맙)의 공동투여의 특히 분명하고 명백한 상승작용적 효과가 존재하였다. 유사한 면역 컴피턴트 모델에서 hFcγRIIB의 유전적 결실 후에 관찰되긴 하지만 6 , 7 , 이는 향상된 활성이 이펙터 세포에서 hFcγRIIB의 면역 억제 기능의 mAb 차단을 야기한다는 추측으로 유인한다. 상관없이, 그리고 리툭시맙 치료적 활성의 hFcγRIIB mAb 부스팅의 원리 메커니즘인 FcγRIIB-매개된 저해의 방출 및 리툭시맙 내재화의 방지(직접적인 표적화가 아닌)와 일치하게, 본 발명자들은 B 세포 결실이 6G11 단독의 경우와 비교하여 AT10의 경우에 덜 효과적이지만(아마도 동형에서의 차이로 인하여), AT10와 리툭시맙의 병용은 리툭시맙 활성의 증대에 동일하게 효과가 있다는 것을 확인하였다. 흥미롭게, CLL가 더 높은 용량이 필요한 리툭시맙 51 및 기타 유형 I 항-CD20 mAb 52 , 53 으로 차선적으로 치료된다는 것이 오래동안 인식되었다. 우리의 이전 데이터 13 과 연결하여 우리의 신규한 결과는 hFcγRIIB mAb와의 병용 요법은 내성을 방지하는 방법뿐만 아니라 아마도 이러한 경우에 필요한 hCD20 mAb 용량을 감소시키는 방법일 수 있다는 것을 나타낸다.
적어도 3개의 구별되는 메커니즘은 따라서 6G11의 생체내 치료적 활성 전체에 기여할 수 있다: 고유한 세포독성; 치료적 mAb 내재화의 방지; 및 면역 세포에서 FcγRIIB-저해성 신호전달의 중화. 몇몇 관찰은 수용체 내재화의 차단 및 저해성 신호전달이 약물 내성을 극복하는데 가장 중요하다고 제시한다. 첫째로, 길항성 hFcγRIIB 및 hCD20 mAb가 마우스에 공동투여되는 경우, hFcγRIIB가 표적 및 이펙터 세포 둘 다에서 발현되는, 분명하고 명백한 상승작용적 효과가 존재하였다. 둘째로, 본 발명자들은 B 세포 결실이 AT10 단독에 의한 경우는 불충분한 반면, AT10과 리툭시맙의 병용은 리툭시맙 활성의 증대에 효과적이라는 것을 확인하였다. 가장 결정적으로, 활성제 FcγR와 연계하는 능력이 부족하고 직접적인 세포독성능을 갖지 않는 N297Q hIgG1 6G11에 관한 우리의 데이터는 FcγRIIB 활성의 차단이 이러한 접근법의 효율 뒤에 중요한 메커니즘이라는 것을 확인시켜 준다. 이는 FcγRIIB에 대한 기능-차단 mAb이 FcγRIIB의 유전적 결실 후 관찰된 향상된 항-암 mAb 반응을 재현할 수 있다는 증거를 제공한다(Clynes et al., 2000). 그러나, 여기서 본 발명자들은 활성에 대한 면역 이펙터 세포와 비교하여 표적에 대한 길항작용적 FcγRIIB 기능의 상대적인 중요성을 직접적으로 탐색하지 않았고; 이러한 연구는 진행 중인 노력의 기본을 형성한다.
중요하게, CLL은 더 높은 용량이 필요한 리툭시맙(O'Brien et al., 2001) 및 오파투무맙(Coiffier et al., 2008; Coiffier et al., 2006)으로 차선으로 처리되는 것이 오래 인식되어 왔다. 우리의 이전 데이터와 연결하여 우리의 현재 결과는 hFcγRIIB mAb와의 병용 요법이 내성을 방지하는 방식뿐만 아니라 아마도 hCD20 mAb 요법의 용량을 감소시키거나 기간을 줄이는 방식일 수 있다는 것을 나타낸다.
유의미한 활성을 제공하는 것 이외에, 치료적 mAb는 또한 반드시 용인되어야 하고 치료적으로 관련된 약동학(PK)을 가져야 한다. 98% 상동성 인간 hFcγRIIA에 대한 결합의 이의 부족, 및 독물학적 역구에서 일반적으로 사용되는 동물 종과의 무시할 만한 교차-반응성을 갖는, 6G11의 hFcγRIIB에 대한 매우 높은 특이성은 우리가 인간과 유사한 세포 유형 및 조직과 그 수준으로 인간 hFcγRIIB를 발현하는 Tg 마우스에서 안전성 파라미터 및 PK/PD를 조사하도록 하였다. 이들 연구는 6G11이 잘 용인되고 동물은 고통, 체중 감소, 독성 또는 병리. 용량-적정 실험의 어떠한 징후도 보이지 않았음을 나타냈고, 10 ㎎/㎏ 이상이 용량은 생체내 hFcγRIIB를 포화시키는데 충분하고, 등가의 B 세포 고갈을 수득하고, 수용체의 장기간 차단 또는 제거를 유지할 수 있었다는 것을 증명하였다. 대조적으로, 1 ㎎/㎏의 용량은 차선이고, 신속하게 깨끗해졌고 비장 B 세포를 적절하게 제거하지 못했다. 수용체 포화 이상의 용량에서, 6G11의 최종 반감기는 마우스에서 2 내지 4일로 추정되었다. 비인간 영장류와의 교차-반응성의 부족이 이종간 스케일링을 불가능하게 함에도 불구하고, 이러한 특징들은 인간에서 주 순서대로 반감기를 갖는 hIgG1 mAb에 전형적인 치료적으로 관련된 PK 프로파일을 나타낸다.
흥미롭게도, 인간 혈액 및 생체내 hFcγRIIB Tg 마우스 둘 다에서, 6G11-치료는 B 세포의 특이적 결실을 야기하였다. 두 시스템에서 단핵구가 hFcγRIIB를 발현함에도 불구하고, 이들은 실질적으로 제거되지 않았다. 최근 증거는 대식세포 및/또는 단핵구가 mAb 요법에서 역학을 하는 주요 이펙터 세포임을 제기하고(Beers et al., 2010); (Biburger et al., 2011; Gul et al., 2014) 따라서, 우리의 데이터는 주요 이펙터가 hFcγRIIB mAb에 의해 제거되지 않음을 나타낸다.
본 발명자들은 이전에 항-마우스 FcγRII 특이적 mAb 25 의 등가 패널을 탐색하였고, 이들은 호스트 17 의 비종양 세포에 의해 주로, 이들의 생체내 빠른 소비로 인하여 제한된 치료적 이득을 갖는 것으로 관찰되었다. 중요하게, 내재화의 유사한 속도는 초기 연구 36 와 일치하게 인간 표적 세포에서, 적어도 시험관내에서 보이지 않았다. 여기서, 본 발명자들은 이들 관찰을 확대하고, 동일한 것이 일차 인간 CLL 샘플에서 보이고 hFcγRIIB Tg 발현 마우스에서, 신속하고 과도한 mAb 소비가 관찰되지 않았다는 것을 증명하였다. 이들 데이터는 마우스 및 인간 저해성 FcγRII(B)이 내재화에 대한 이의 능력 및 항원성 싱크로서 기능에 관한 상이한 성질을 갖는다는 우리의 초기 제시를 확인시켜 주고, hFcγRIIB mAb, 예를 들면, 6G11이 인간에서 효과적으로 작동할 것임을 제시한다.
총괄하여, 이러한 실시예는 hFcγRIIB mAb가 mAb 약물에 대한 종양 세포의 고유한 및 획득된 내성을 극복하고, 재발한/불응성 CLL 세포를 극복하는 생체내 개념 입증을 증명한다. 우리의 데이터는 FcγRIIB-발현 B 세포 암의 요법을 위한 hFcγRIIB mAb의 임상적 개발을 제시한다.
이들 데이터는 FcγRIIB-발현 B 세포 암의 요법에 대한 hFcγRIIB mAb의 임상적 개발을 지지한다. 추가로, CD20 mAb의 기타 질환으로의 확산과 비슷하게 자가면역과 같은 기타 치료적 설정에서 이의 이용을 제시하는 증거가 존재하고, 여기서 FcγRIIB-발현 표적은, 예를 들면, 표적 PC가 높은 수준의 FcγRIIB를 발현하는 전신성 경쇄 아밀로이드증(Zhou et al., 2008) 및 B 세포 활성화가 FcγRIIB의 효능작용을 통해 감소할 수 있는 류마티스성 관절염(Baerenwaldt et al., 2011; Mauri and Jury, 2010)에서 조작을 받아들일 수 있다.
실시예 2 - 예시적인 약제학적 제형
본 발명의 조성물, 및/또는 항체, 및/또는 제제, 및/또는 약제는 단독으로 투여되는 것이 가능하지만, 이는 하나 이상의 허용 가능한 담체와 함께 약제학적 제형으로서 존재하는 것이 바람직하다. 담체(들)는 본 발명의 조성물, 및/또는 항체, 및/또는 제제, 및/또는 약제와 혼화성이며 이의 부형제에 해롭지 않다는 의미에서 "허용 가능"하여야 한다. 전형적으로, 담체는 무균 및 발열원-무함유일 것인 물 또는 염수일 것이다.
하기 실시예는 활성 성분이 본 발명의 항체 분자 및/또는 제제인 본 발명에 따른 약제 및 약제학적 조성물을 설명한다.
실시예 A: 정제
활성 성분 100㎎
락토스 200㎎
전분 50㎎
폴리비닐피롤리돈 5㎎
스테아르산마그네슘 4㎎
359㎎
압축 후 습식 과립화에 의해 상기 성분들로부터 정제를 제조한다.
실시예 B: 안과용 액제
활성 성분 0.5g
염화나트륨, 분석용 등급 0.9g
티오메르살 0.001g
100㎖가 될 때까지 정제수
7.5로 pH 조절
실시예 C: 정제 제형
포비돈 용액과 성분들의 습식 과립화 후, 스테아르산마그네슘의 첨가 및 압축에 의해 하기 제형 A 및 B를 제조한다.
제형 A
㎎/정제 ㎎/정제
(a) 활성 성분 250 250
(b) 락토스 B.P. 210 26
(c) 포비돈 B.P. 15 9
(d) 나트륨 전분 글리콜레이트 20 12
(e) 스테아르산마그네슘 5 3
500 300
제형 B
mg/정제 mg/정제
(a) 활성 성분 250 250
(b) 락토스 150 -
(c) 아비셀(Avicel) PH 101® 60 26
(d) 포비돈 B.P. 15 9
(e) 나트륨 전분 글리콜레이트 20 12
(f) 스테아르산마그네슘 5 3
500 300
제형 C
mg/정제
활성 성분 100
락토스 200
전분 50
포비돈 5
스테아르산마그네슘 4
359
혼합된 성분의 직접 압축에 의해 하기 제형 D 및 E를 제조한다. 제형 E에 사용된 락토스는 직접 압축 유형의 것이다.
제형 D
mg/캡슐
활성 성분 250
전호화 전분 NF15 150
400
제형 E
mg/캡슐
활성 성분 250
락토스 150
아비셀® 100
500
제형 F(제어된 방출 제형)
포비돈 용액과 성분들(하기)의 습식 과립화 후, 스테아르산마그네슘의 첨가 및 압축에 의해 제형을 제조한다.
mg/정제
(a) 활성 성분 500
(b) 하이드록시프로필메틸셀룰로스 112
(메토셀 K4M 프리미엄(Methocel K4M Premium))®
(c) 락토스 B.P. 53
(d) 포비돈 B.P.C. 28
(e) 스테아르산마그네슘 7
700
약물 방출은 약 6-8시간의 기간 동안 발생하고, 12시간 후 완료되었다.
실시예 D: 캡슐 제형
제형 A
상기 실시예 C의 제형 D의 성분을 혼합하고, 2부분 경질 젤라틴 캡슐에 채움으로써 캡슐 제형을 제조한다. 제형 B(하기)를 유사한 방식으로 제조한다.
제형 B
mg/캡슐
(a) 활성 성분 250
(b) 락토스 B.P. 143
(c) 나트륨 전분 글리콜레이트 25
(d) 스테아르산마그네슘 2
420
제형 C
mg/캡슐
(a) 활성 성분 250
(b) 마크로골(Macrogol) 4000 BP 350
600
마크로골 4000 BP를 용융시키고, 활성 성분을 용융물 중에 분산시키고, 용융물을 2부분 경질 젤라틴 캡슐에 채움으로써 캡슐을 제조한다.
제형 D
mg/캡슐
활성 성분 250
레시틴 100
땅콩 기름 100
450
활성 성분을 레시틴 및 땅콩 기름 중에 분산시키고, 분산액을 연질, 탄성 젤라틴 캡슐에 채움으로써 캡슐을 제조한다.
제형 E(제어된 방출 캡슐)
성분 a, b, 및 c를 압출기를 사용하여 압출한 후, 압출물의 구상화 및 건조로 하기 제어된 방출 캡슐 제형을 제조한다. 그 다음, 건조된 펠렛을 방출-제어 막(d)으로 코팅하고 2조각, 경질 젤라틴 캡슐을 채운다.
mg/캡슐
(a) 활성 성분 250
(b) 미세결정질 셀룰로스 125
(c) 락토스 BP 125
(d) 에틸 셀룰로스 13
513
실시예 E: 주사가능 제형
활성 성분 0.200 g
10㎖가 될 때까지 무균, 발열원 무함유 인산염 완충액(pH7.0)
활성 성분을 대부분 인산염 완충액(35 내지 40℃)에 용해시킨 다음, 용적을 만들고, 무균 미세기공 필터를 통해 무균 10 ㎖ 앰버 유리 바이알(유형 1)로 여과하고, 무균 밀폐 및 과밀봉으로 밀봉한다.
실시예 F: 근육내 주사
활성 성분 0.20 g
벤질 알코올 0.10 g
글루코푸롤 75(Glucofurol 75)® 1.45 g
3.00 ㎖가 될 때까지 충분한 양의 주사용수
활성 성분을 글리코푸롤 중에 용해시킨다. 그 다음, 벤질 알코올을 가하고 용해시키고, 물을 3 ㎖까지 가한다. 그 다음, 혼합물을 무균 미세기공 필터를 통해 여과하고, 무균 3 ㎖ 유리 바이알(유형 1) 중에 밀봉하였다.
실시예 G: 시럽 현탁액
활성 성분 0.2500 g
소르비톨 용액 1.5000 g
글리세롤 2.0000 g
분산성 셀룰로스 0.0750 g
벤조산나트륨 0.0050 g
향미제, 복숭아 17.42.3169 0.0125 ㎖
5.0000 ㎖가 될 때까지 충분한 양의 정제수
벤조산나트륨을 정제수의 일부분에 용해시키고, 소르비톨 용액을 가한다. 활성 성분을 가하고 분산시킨다. 글리세롤 중에 증점제(분산성 셀룰로스)를 분산시킨다. 2개의 분산액을 혼합하고, 정제수로 필요한 용적을 채운다. 추가의 증점은 현탁액의 추가의 쉬어링에 의해 요구되는 바와 같이 달성된다.
실시예 H: 좌제
mg/좌제
활성 성분(63 ㎛)* 250
경질 지방, BP(위텝솔 H15(Witepsol H15) 1770
-다이나마이트 노벨(Dynamit Nobel))
2020
*활성 성분을 입자의 적어도 90%가 63 ㎛ 이하의 직경을 갖는 분말로서 사용한다.
위텝솔 H15의 1/5을 최대 45℃에서 증기-재킷 팬에서 용융시킨다. 활성 성분을 200 ㎛ 체를 통해 걸러내고, 잘 섞인 분산액이 달성될 때까지 컷팅 헤드가 장착된 실베르손을 사용하여 혼합하에 용융된 베이스에 가한다. 혼합물을 45℃에서 유지하면서, 잔여 위텝솔 H15을 현탁액에 가하고, 균질한 혼합물을 보장하도록 교반한다. 전체 현탁액을 연속 교반하에 250 ㎛ 스테인리스강 스크린을 통해 통과시키고, 40℃로 냉각되도록 한다. 38℃ 내지 40℃의 온도에서 혼합물 2.02 g을 적합한 플라스틱 주형에 채운다. 좌제가 실온으로 냉각되도록 한다.
실시예 I: 페서리
mg/페서리
활성 성분 250
덱스트로스 무수물 380
감자 전분 363
스테아르산마그네슘 7
1000
상기 성분들을 직접적으로 혼합하고, 수득된 혼합물을 직접적으로 압축하여 페서리를 제조한다.
SEQUENCE LISTING <110> BioInvent International AB <120> Medicaments, uses and methods <130> BIOBX/P58047PC <140> PCT/EP2015/060744 <141> 2015-05-15 <150> GB1408673.0 <151> 2014-05-15 <160> 196 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> IgG constant region heavy (CH) <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val 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Claims (33)

  1. 약학 조성물로서,
    (i) 표적 세포의 세포 표면 항원과 특이적으로 결합하며, FcγRIIb-의존성 방식으로 표적 세포 내로 내재화될 수 있는 제1 항체 분자로서, FcγRIIb와 결합할 수 있는 Fc 도메인을 가지며, 그리고 여기서 상기 세포 표면 항원은 CD20, CD52 및 이의 혼합물로부터 선택되는 상기 제1 항체 분자를;
    (ii) FcγRIIb에 특이적으로 결합하며, 상기 표적 세포 상에 존재하는 FcγRIIb가 상기 제1 항체 분자의 상기 Fc 도메인에 대해 결합하는 것을 방지하거나 감소시키는 제2 항체 분자와 병용하여 포함하되, 상기 제2 항체 분자는 AT10, 6G11 또는 이의 혼합물을 포함하며;
    상기 약학 조성물은 대상체에서 재발한 암 또는 불응성 암의 치료에서 사용하기 위한 것이고, 상기 재발한 암 또는 불응성 암은 상기 제1 항체 분자에 대해 내성이며, 상기 대상체가 FcγRIIb를 발현하는 표적 세포를 갖는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, FcγRIIb가 상기 제1 항체의 상기 Fc 도메인에 대해 결합하는 것을 방지하거나 감소시키는 상기 제2 항체 분자가 추가로 상기 표적 세포로의 상기 제1 항체 분자의 내재화를 방지하거나 감소시키는, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 불응성 암은, 상기 대상체가 암 치료를 받았었고 반응하지 않은 경우, 또는 상기 대상체가 암 치료를 받았지만 상기 암이 상기 치료 동안 상기 대상체에서 진행된 경우, 불응성 암으로서 특징지어지는, 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 대상체가 이전에 암에 대하여 치료되었지만 부분 관해(partial remission) 미만을 도달한 경우, 상기 대상체는 반응하지 않은 것으로 특징지어지는, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 암에 대하여 이전에 치료되었고 이전에 치료에 반응하였으며 그리고 그 후에 재발한 경우, 상기 재발한 암은 재발한 암인 것으로 특징지어지는, 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 대상체가,
    (i) 치료 후 적어도 부분 관해를 달성하거나 상기 대상체가 치료 후 적어도 완전 관해를 달성하지만,
    (ii) 상기 암이 상기 치료의 중단 후 상기 대상체에서 진행되는 경우,
    상기 대상체는 그 후에 재발한 것으로 특징지어지는, 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 대상체가 상기 치료의 중단 후 1개월 이상 후에 재발하는, 약학 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 대상체가 상기 치료의 중단 후 1개월 이상, 또는 2개월 이상, 또는 3개월 이상, 또는 4개월 이상, 또는 5개월 이상, 또는 6개월 이상, 또는 7개월 이상, 또는 8개월 이상, 또는 9개월 이상, 또는 10개월 이상, 또는 11개월 이상, 또는 12개월 이상, 또는 2년 이상, 또는 3년 이상, 또는 4년 이상, 또는 5년 이상, 또는 6년 이상, 또는 7년 이상, 또는 8년 이상, 또는 9년 이상, 또는 10년 이상 후에 재발하는, 약학 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 상기 대상체가 적어도 1회, 또는 적어도 2회, 또는 적어도 3회, 또는 적어도 4회, 또는 적어도 5회, 또는 적어도 6회, 또는 적어도 7회, 또는 적어도 8회, 또는 적어도 9회, 또는 적어도 10회 재발한 암의 특징을 나타내는, 약학 조성물.
  10. 제3항에 있어서, 상기 치료는 항체 치료이며, 여기서 (i)에서 정의된 바와 같은 상기 제1 항체 분자가 (ii)에서 정의된 바와 같은 상기 제2 항체 분자의 부재하에 투여된 것인, 약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 표적 세포가 FcγRIIb 발현의 상승된 수준을 포함하는, 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 표적 세포의 상승된 FcγRIIb 발현이 대조군과 비교하여 측정되며, 여기서 상기 대조군이 비불응성 암 또는 비재발한 암을 갖는 대조군 개체의 대조군 세포를 포함하는, 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 상승된 FcγRIIb 발현이 상기 대조군과 비교 시 상기 대상체의 상기 표적 세포에서 적어도 2배 더 높은, 약학 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 표적 세포가 암 세포인, 약학 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 표적 세포가 B 세포인, 약학 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 재발한 암, 상기 불응성 암, 암 세포, 동일한 암-유형, 또는 상기 암이 비호지킨 림프종; 여포성 림프종; 미만성 거대 B 세포 림프종; 맨틀 세포 림프종; 만성 림프구성 백혈병; 및 소 림프구성 림프종을 포함하는 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
  17. 제3항에 있어서, 상기 반응하지 않았던 대상체, 대상체의 부분 관해, 대상체의 완전 관해, 또는대상체에서 진행되었던 암이 하기를 포함하는 군으로부터 하나 이상을 측정함으로써 결정되는, 약학 조성물:
    (i) 림프구 계수; (ii) 호중구 계수;
    (iii) 혈소판 계수;
    (iv) 헤모글로빈 계수;
    (v) 종양 세포의 퍼센트;
    (vi) 골수 림프구의 퍼센트;
    (vii) 순환성 림프구의 퍼센트;
    (viii) 림프구 위의 바이오마커의 존재 또는 부재;
    (ix) 암 병기;
    (x) 조직학적 검사;
    (xi) 골수 검사;
    (xii) 세포유전학적 검사;
    (xiii) 림프절 평가;
    (xiv) 신체 증상; 및
    (xv) 비장에서 암 세포의 감소.
  18. 제1항에 있어서, 상기 제2 항체 분자가 하기 CDR을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 포함하는, 약학 조성물:
    서열 번호 171 및 서열 번호 172 및 서열 번호 173.
  19. 제1항에 있어서, 상기 제2 항체 분자가 하기 CDR을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 약학 조성물:
    서열 번호 174 및 서열 번호 175 및 서열 번호 176.
  20. 제1항에 있어서, 상기 제2 항체 분자가 가변 중쇄(VH) 아미노산 서열인 서열 번호 23을 포함하는, 약학 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 상기 제2 항체 분자가 가변 경쇄(VL) 아미노산 서열인 서열 번호 47을 포함하는, 약학 조성물.
  22. 제1항에 있어서, (i)에서 정의된 바와 같은 상기 제1 항체 분자가 CD20에 특이적으로 결합하는, 약학 조성물.
  23. 제22항에 있어서, (i)에서 정의된 바와 같은 상기 제1 항체 분자가 유형 I CD20 항체인, 약학 조성물.
  24. 제22항에 있어서, (i)에서 정의된 바와 같은 상기 제1 항체 분자가 유형 II CD20 항체인, 약학 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 상기 유형 I CD20 항체가 리툭시맙, 리툭시맙 바이오시밀러, 또는 오파투무맙인, 약학 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 유형 I CD20 항체가 리툭시맙인, 약학 조성물.
  27. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은
    (i) 리툭시맙; 및
    (ii) 6G11
    을 포함하는, 약학 조성물.
  28. 제24항에 있어서, 상기 유형 II CD20 항체가 오비누투주맙 또는 토시투모맙인, 약학 조성물.
  29. 제1항에 있어서, (i)에서 정의된 바와 같은 제1 항체 분자가 CD52 항체인, 약학 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 CD52 항체가 알렘투주맙인, 약학 조성물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 불응성 암 또는 재발한 암을 갖거나, 상기 대상체가 불응성 암 및 재발한 암을 갖는, 약학 조성물.
  32. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 불응성 만성 림프구성 백혈병 또는 재발한 만성 림프구성 백혈병을 갖거나, 상기 대상체가 불응성 만성 림프구성 백혈병 및 재발한 만성 림프구성 백혈병을 갖는, 약학 조성물.
  33. (i) 표적 세포의 세포 표면 항원과 특이적으로 결합하며, FcγRIIb-의존성 방식으로 표적 세포 내로 내재화될 수 있는 제1 항체 분자로서, FcγRIIb와 결합할 수 있는 Fc 도메인을 가지며, 그리고 여기서 상기 세포 표면 항원은 CD20, CD52 및 이의 혼합물로부터 선택되는 상기 제1 항체 분자;
    (ii) FcγRIIb에 특이적으로 결합하며, 상기 제1 항체 분자의 상기 Fc 도메인에 대한 FcγRIIb 결합을 방지하거나 감소시키는 제2 항체 분자로서, 상기 제2 항체 분자는 AT10, 6G11 또는 이의 혼합물을 포함하는, 제2 항체 분자; 및
    (iii) 리툭시맙; 리툭시맙 바이오시밀러; 오파투무맙; 오비누투주맙; 알렘투주맙; 갈릭시맙; 토시투모맙; 방사성 접합된 토시투모맙; 이브리투모맙; 방사성 접합된 이브리투모맙; 항-CD40 항체; 항-CD19 항체; 항-CD37 항체; B 세포 암을 치료하는데 사용되는 치료적 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분
    을 포함하는, 대상체에서 재발한 암 또는 불응성 암의 치료에 사용하기 위한 키트로서,
    상기 키트는 대상체에서 재발한 암 또는 불응성 암의 치료에 사용하기 위한 것이고, 상기 재발한 암 또는 불응성 암은 상기 제1 항체 분자에 대해 내성이며, 상기 대상체가 FcγRIIb를 발현하는 표적 세포를 갖는 것을 특징으로 하는, 키트.
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