CN115025215A - 药物、用途以及方法 - Google Patents

药物、用途以及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115025215A
CN115025215A CN202210363874.8A CN202210363874A CN115025215A CN 115025215 A CN115025215 A CN 115025215A CN 202210363874 A CN202210363874 A CN 202210363874A CN 115025215 A CN115025215 A CN 115025215A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
cancer
kit
composition
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210363874.8A
Other languages
English (en)
Inventor
B·弗伦德修斯
英格丽德·泰格
L·玛藤松
马克·克拉格
阿里·鲁加尼安
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bioinvent International AB
Original Assignee
Bioinvent International AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioinvent International AB filed Critical Bioinvent International AB
Publication of CN115025215A publication Critical patent/CN115025215A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0034—Urogenital system, e.g. vagina, uterus, cervix, penis, scrotum, urethra, bladder; Personal lubricants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0087—Galenical forms not covered by A61K9/02 - A61K9/7023
    • A61K9/0095—Drinks; Beverages; Syrups; Compositions for reconstitution thereof, e.g. powders or tablets to be dispersed in a glass of water; Veterinary drenches
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/02—Suppositories; Bougies; Bases therefor; Ovules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2013—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A61K9/2018—Sugars, or sugar alcohols, e.g. lactose, mannitol; Derivatives thereof, e.g. polysorbates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2022—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/2027—Organic macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyvinyl pyrrolidone, poly(meth)acrylates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2022—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/205—Polysaccharides, e.g. alginate, gums; Cyclodextrin
    • A61K9/2054—Cellulose; Cellulose derivatives, e.g. hydroxypropyl methylcellulose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2022—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/205—Polysaccharides, e.g. alginate, gums; Cyclodextrin
    • A61K9/2059—Starch, including chemically or physically modified derivatives; Amylose; Amylopectin; Dextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4841—Filling excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/4858—Organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4841—Filling excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/4866—Organic macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2893—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD52
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

本发明描述了一种用于治疗难治性癌症和/或复发性癌症的组合物，所述组合物包含抗体分子和药剂；以及一种治疗难治性癌症和/或复发性癌症的方法，所述方法包括施用抗体分子和药剂。还描述了包括所述抗体分子和药剂的试剂盒。

Description

药物、用途以及方法
本申请是申请日为2015年5月15日，申请号为201580037854.X，名称为“药 物、用途以及方法”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种用于治疗难治性癌症和/或复发性癌症的组合物，所述组合物包含抗 体分子和药剂。本发明还涉及一种治疗难治性癌症和/或复发性癌症的方法，所述方法包 括施用抗体分子和药剂。还描述了试剂盒，所述试剂盒包括所述抗体分子和药剂。
背景技术
治疗性抗体已经使癌症治疗发生转变，从而通过结合免疫系统而开启了新的作用机 制。举例来说，抗体可以发挥治疗作用的机制是通过募集天然效应系统，如细胞毒性细胞 (例如巨噬细胞)和酶(例如补体)，然后所述天然效应系统靶向与抗体分子结合的细胞以刺激癌细胞和其它有害细胞的去除。
CD20特异性单克隆抗体(mAb)利妥昔单抗(rituximab)是被批准用于癌症免疫治疗的第一种抗体，并且因而已经被广泛地施用于患有表达CD20的B细胞癌症的患者，所述癌症包括滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大细胞B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性淋巴细胞性 白血病(CLL)、以及套细胞淋巴瘤(MCL)(Lim，S.H.等，《抗CD20单克隆抗体：历史 观点和未来前景(Anti-CD20 monoclonal antibodies：historical and future perspectives)》，Haematologica 95，135-143(2010)中所综述)。
尽管抗体治疗是有效的，但是在一些情况下，患者将获得对抗体治疗的抗性，这将导 致治疗变得无效以及癌症恶化。在其它情况下，癌症可能根本不对癌症治疗作出响应。
令人遗憾的是，有效的治疗性抗体治疗对于复发性癌症和/或难治性癌症来说仍是缺 乏的。随着正被开发用于治疗几种类型的癌症的抗体治疗的数量不断增加，正日益需要了 解癌细胞对这些治疗的抗性以及开发药物来克服这样的抗性。
举例来说，在利妥昔单抗响应性淋巴瘤内，一些个体在首次治疗时表现出抗性或变得 对含有利妥昔单抗的联合治疗具有抗性。除了利妥昔单抗之外，淋巴瘤还可以对其它抗体 治疗显示出抗性；例如，抗体分子奥法木单抗(ofatumumab)(它结合CD20)或阿仑单抗(alemtuzumab)(它结合CD52)。
在该背景下，本申请的发明人已经惊人地鉴定出包含抗体和阻止或减少FcγRIIb与所 述抗体分子的Fc结构域结合的药剂的治疗可以用于治疗复发性癌症和/或难治性癌症。
先前已经证实的是，抑制FcγRIIb与治疗性抗体利妥昔单抗之间的相互作用可以减少 抗体的再循环，并且提高利妥昔单抗治疗慢性淋巴细胞性白血病和套细胞淋巴瘤的功效 (Lim，S.H.等，《靶B细胞上的Fcγ受体IIb促进利妥昔单抗内化并且降低临床功效(Fcgamma receptor IIb on target B cells promotes rituximab internalization andreduces clinical efficacy)》，Blood(2011)和WO 2012/022985)。
还已知的是，治疗性抗体的活性部分地取决于它们与Fcγ受体(FcγR)的相互作用。 确切地说，它是解释了IgG的大部分治疗活性的FcγR的相对表达水平、亲和力以及活性(Nimmerjahn，F.和Ravetch，J.V.，《健康和疾病中的FcγR(FcgammaRs in health anddisease)》，Curr Top Microbiol Immunol 350，105-125(2011)；以及Nimmerjahn，F.和Ravetch， J.V.，《作为免疫应答的调节因子的Fcγ受体(Fcgamma receptors asregulators of immune responses)》，Nature reviews 8，34-47(2008)中所综述)。
发明内容
然而，本发明的发明人现在已经惊人地证实包含抗体和阻止或减少FcγRIIb与所述抗 体分子的Fc结构域结合的药剂的联合治疗可以用于治疗复发性癌症和/或难治性癌症。因 此，本发明提供了用于治疗患有复发性癌症和/或难治性癌症的患者子组的方法和用途。
换句话说，本发明的发明人已经证实包含受试者的癌症不作出响应(即具有抗性)的 抗体与阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂的组合的联合治疗可以 用于通过降低和/或克服所述癌症对所述抗体的抗性来治疗复发性癌症和/或难治性癌症。
在第一个方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含：
(i)特异性结合靶细胞的细胞表面抗原的抗体分子，所述抗体分子具有能够结合FcγRIIb的Fc结构域；以及
(ii)阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂；
特征在于所述组合物用于治疗受试者的复发性癌症和/或难治性癌症，并且所述受试 者有表达FcγRIIb的靶细胞。
在第二个方面，本发明提供了一种组合物的用途，所述组合物包含：
(i)特异性结合靶细胞的细胞表面抗原的抗体分子，所述抗体分子具有能够结合FcγRIIb的Fc结构域；以及
(ii)阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂；
特征在于所述用途是用于制造用于治疗受试者的复发性癌症和/或难治性癌症的药 物，并且所述受试者有表达FcγRIIb的靶细胞。
在第三个方面，本发明提供了一种治疗受试者的复发性癌症和/或难治性癌症的方 法，所述方法包括施用：
(i)特异性结合靶细胞的细胞表面抗原的抗体分子，所述抗体分子具有能够结合FcγRIIb的Fc结构域；以及
(ii)阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂。
特征在于所述受试者是基于其患有复发性癌症和/或难治性癌症来选择的，并且所述 受试者有表达FcγRIIb的靶细胞。
在第四个方面，本发明提供了一种用于治疗受试者的复发性癌症和/或难治性癌症的 试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)特异性结合靶细胞的细胞表面抗原的抗体分子，所述抗体分子具有能够结合FcγRIIb的Fc结构域；
(ii)阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂；
(iii)选自由以下各项组成的组的一种或多种物质：利妥昔单抗；利妥昔单抗生物仿 制药；奥法木单抗；奥比妥珠单抗(obinutuzumab)；阿仑单抗；加利昔单抗(galiximab)；托西莫单抗(tositumomab)；放射性缀合的托西莫单抗；替伊莫单抗(ibritumomab)；放射性缀合的替伊莫单抗；抗CD40抗体；抗CD19抗体；抗CD37抗 体；用于治疗B细胞癌症的治疗性抗体；
特征在于所述用途用于治疗受试者的复发性癌症和/或难治性癌症，并且所述受试者 有表达FcγRIIb的靶细胞。
在本发明的第四个方面的一个优选的实施方案中，所述一种或多种物质包括以下各项 或由以下各项组成：利妥昔单抗(或利妥昔单抗生物仿制药)和奥法木单抗；或利妥昔单 抗(或利妥昔单抗生物仿制药)和奥比妥珠单抗。
在本发明的第四个方面的一个替代性优选实施方案中，所述一种或多种物质包括以下 各项或由以下各项组成：阿仑单抗和抗CD40抗体；阿仑单抗和抗CD19抗体；阿仑单抗和 抗CD37抗体；或阿仑单抗和抗CD40抗体以及抗CD19抗体和抗CD37抗体。
在本发明的第四个方面的一个替代性优选实施方案中，所述一种或多种物质包括以下 各项或由以下各项组成：用于治疗B细胞癌症的治疗性抗体，如加利昔单抗。
抗体分子是免疫学和分子生物学领域的技术人员公知的。抗体分子是体液免疫系统的 组分，并且是由效应B细胞产生以识别和中和进入身体的异物，如细菌和病毒的蛋白质。
通常，抗体分子包含两条重链和两条轻链。抗体分子的重链包含一个可变域和三个恒 定域，并且抗体分子的轻链包含一个可变域和一个恒定域。可变域(有时统称为Fv区)与 抗体的靶标结合，并且每一个可变域包含三个环，这些环被称为互补决定区(CDR)，负责靶标结合。
因此，通过术语“抗体分子”，我们包括所有类型和类别的抗体分子以及其功能片段， 包括：单克隆抗体、或多克隆抗体、或合成抗体、或重组产生的抗体、或多特异性抗体、或双特异性抗体、或人类抗体、或人源化抗体、或嵌合抗体、或骆驼源化抗体、或单链Fv(scFv)、或单链抗体、或Fab片段、或F(ab′)片段、或二硫键连接的Fv(sdFv)、或胞内 抗体、或抗体重链、或抗体轻链、或抗体重链和/或轻链的同二聚体或异二聚体、或其抗 原结合功能片段或衍生物、或IgG、或IgG1、或IgG2、或IgG3、或IgG4、或IgA、或IgM、 或IgD、或IgE。
已知抗体分子特异性结合限定的靶分子。也就是说，抗体分子优先地和选择性地结合 它的靶标而不是非靶标的分子。
评估蛋白质结合的方法是生化和免疫学领域的技术人员已知的。本领域技术人员将了 解的是，那些方法可以用于评估抗体分子与靶标的结合和/或抗体的Fc结构域与Fc受体的 结合；以及那些相互作用的相对强度、或特异性、或抑制、或阻止、或减少。可以用于评估蛋白质结合的方法的实例是例如免疫测定、BIAcore、蛋白质印迹、放射性免疫测定(RIA)以及酶联免疫吸附测定(ELISA)(关于抗体特异性的论述，参见《基础免疫学(Fundamental Immunology)》，第2版，Raven Press，New York，第332-336页(1989))。
因此，通过“特异性结合......的抗体分子”，我们包括所述抗体分子特异性结合靶标， 但不与非靶标结合，或比靶标更弱地与非靶标结合(如以更低的亲和力)。
我们还包括以下含义，即所述抗体分子与所述靶标特异性结合的强度是与非靶标结合 的强度的至少两倍、或至少五倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少50倍、或至少100倍、或至少200倍、或至少500倍、或至少约1000倍。
此外，我们包括以下含义，即如果所述抗体分子以如下的Kd与所述靶标结合，那么所 述抗体分子与所述靶标特异性结合：至少约10-1的Kd、或至少约10-2的Kd、或至少约10-3的Kd、或至少约10-4的Kd、或至少约10-5的Kd、或至少约10-6的Kd、或至少约10-7的Kd、或至 少约10-8的Kd、或至少约10-9的Kd、或至少约10-10的Kd、或至少约10-11的Kd、或至少约10-12的Kd、或至少约10-13的Kd、或至少约10-14的Kd、或至少约10-15的Kd。
抗体分子的另一个值得注意的部分是Fc结构域(另外被称为可结晶片段结构域)，它 包含抗体分子重链中的每一条的恒定域中的两个。Fc结构域负责抗体分子与Fc受体之间的 相互作用。
Fc受体是常常存在于免疫系统的细胞的细胞表面上的膜蛋白(即Fc受体存在于靶细胞 膜上，所述膜另外被称为质膜或细胞质膜)。Fc受体的作用是经由Fc结构域结合抗体，以 及使抗体内化到细胞中。在免疫系统中，这可以产生抗体介导的吞噬作用和抗体依赖性细 胞介导的细胞毒性。
本发明中所包括的Fc受体的实例是FcγRIIb(另外被称为CD32、CD32B、CD32B1、CD32B2、FcRII、FcγRII或FcRIIB)，它是负责结合和再循环抗体的抑制性Fc受体。
因此，通过“能够结合FcγRIIb的Fc结构域”，我们包括本发明的抗体分子的Fc结构域能 够结合FcγRIIb并且优选地，所述结合的强度是所述抗体分子与另外的蛋白质、或肽、或 多肽、或Fc受体结合的强度的至少两倍、或至少五倍、或至少10倍、或至少约20倍、或至 少50倍、或至少100倍、或至少200倍、或至少500倍、或至少1000倍。
本发明的药剂阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合，这阻止或减少抗 体分子被内化到细胞中。
对于分子生物学领域的技术人员来说将容易显而易见的是，什么可以构成本发明的药 剂，以及如何能够鉴定本发明的药剂。举例来说，本发明的药剂可以通过筛选阻断 FcγRIIb的刺激或信号转导的药剂来鉴定，如通过蛋白质印迹法所检测的在细胞内免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)中酪氨酸-293的磷酸化所指示。举例来说，可以在存在 或不存在抗FcγRIIb测试剂的情况下将Raji细胞与针对细胞表面抗原的抗体分子，例如抗CD20利妥昔单抗一起培养，之后针对磷酸化的FcγRIIb进行免疫印迹法(WO 2012/022985)。
Neubig等(2003)Pharmacol.Rev.55，597-606(以引用的方式并入本文)描述了可以被 筛选以鉴定阻止或减少FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域结合的药剂的各种类别的分子。
本发明的药剂可以是小有机部分、或小无机部分、或肽、或多肽、或拟肽、或核酸、或肽核酸(PNA)、或适体、或脂质、或碳水化合物、或抗体分子。
通过“阻止或减少FcγRIIb结合的药剂”，我们包括所述药剂完全阻断FcγRIIb与抗体分 子的Fc结构域的结合、或部分阻断FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域的结合。
通过“完全阻断”，我们包括在FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域之间没有可检测的结合。 通过“部分阻断”，我们包括在所述药剂存在下在FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域之间的可检 测的结合低于在不存在所述药剂的情况下FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域之间的可检测的 结合。
所述药剂可以通过位阻、和/或通过与抗体分子结合、和/或通过与Fc结构域结合、和/ 或与FcγRIIb结合、和/或通过与抗体分子结合并且阻断与FcγRIIb接触、和/或通过与Fc结构 域结合并且阻断与FcγRIIb接触、和/或通过结合FcγRIIb并且阻断与Fc结构域接触来阻止或 减少FcγRIIb结合。
我们还包括如果在药剂存在下，FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域的结合是在不存在所 述药剂的情况下FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域的结合的少于约90％、或少于约80％、 或少于约70％、或约少于约60％、或少于约50％、或少于约40％、或少于约30％、或少于约 20％、或少于约10％、或少于约5％、或少于约1％，那么所述药剂减少FcγRIIb与所述抗体 分子的Fc结构域结合。
我们还包括如果在药剂存在下，FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域结合的强度是在不存 在所述药剂的情况下FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的强度的至多1/2、或至多 1/5、或至多1/10、或至多1/20、或至多1/50、或至多1/100、或至多1/200、或至多1/500、 或至多1/1000，那么所述药剂减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合。
我们包括如果在药剂存在下，FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域的结合是不可检测的、 或如果结合是可检测的，而所述可检测的结合是可忽略不计的，那么所述药剂阻止 FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合。
本发明中所包括的抗体分子靶标的实例是细胞表面抗原，它将是抗体分子的表位(在 这一背景下另外被称为细胞表面表位)。细胞表面抗原和表位是免疫学或细胞生物学领域 的技术人员将容易理解的术语。
通过“细胞表面抗原”，我们包括细胞表面抗原暴露在细胞膜的细胞外侧上，但是可能 只是短暂地暴露在细胞膜的细胞外侧上。通过“短暂地暴露”，我们包括细胞表面抗原可以 被内化到细胞中、或从细胞膜的细胞外侧释放到细胞外间隙中。细胞表面抗原可以通过可 以由蛋白酶介导的切割而从细胞膜的细胞外侧释放。
我们还包括细胞表面抗原可以与细胞膜连接，但是可能只是短暂地与细胞膜缔合。通 过“短暂地缔合”，我们包括细胞表面抗原可以从细胞膜的细胞外侧释放到细胞外间隙中。 细胞表面抗原可以通过可以由蛋白酶介导的切割而从细胞膜的细胞外侧释放。
我们还包括细胞表面抗原可以是肽、或多肽、或碳水化合物、或低聚糖链、或脂质；和/或存在于蛋白质、或糖蛋白、或脂蛋白上的表位。
待由本发明治疗的疾病是复发性癌症和/或难治性癌症。
复发性癌症是如下的癌症，所述癌症先前已经接受治疗并且由于该治疗，使受试者完 全或部分恢复(即所述受试者被认为是处在缓解中)，但是在停止所述治疗之后，所述癌 症复发或恶化。换句话说，复发性癌症是在治疗有效并且使受试者完全或部分恢复的一段 时间之后，已经变得对所述治疗具有抗性的癌症。
将了解的是，癌症可以由于获得性抗性而是复发性癌症、或复发性癌症和难治性癌 症。通过“获得性抗性”，我们包括所述癌症和/或所述受试者和/或所述靶细胞在第一次施 用特定治疗之前对所述治疗没有抗性，但是在至少第一次施用所述治疗之后或期间，例如 在第二次施用所述治疗之后；在第三次施用所述治疗之后；在第四次施用所述治疗之后； 在第五次施用所述治疗之后；在第六次施用所述治疗之后；在第七次施用所述治疗之后； 在第八次施用所述治疗之后；在第九次施用所述治疗之后；在第十次施用所述治疗之后； 在第十一次施用所述治疗之后；在第十二次施用所述治疗之后，变得具有抗性。
在本发明的背景下，优选的是，复发性癌症先前已经接受抗体治疗，并且已经变得对 该抗体具有抗性。如本文所论述，本发明提供了一种用于治疗患有这样的复发性癌症的患 者子组的手段，也就是说，本发明提供了一种用于治疗患有对抗体治疗具有抗性的复发性 癌症的受试者的手段。
在本发明的背景下，进一步优选的是，所述复发性癌症先前已经接受如本文所限定的 抗体分子的治疗，并且已经变得对该抗体分子具有抗性。如本文所论述，本发明提供了一 种用于治疗患有这样的复发性癌症的患者子组的手段，也就是说，本发明提供了一种用于 治疗患有对如本文所限定的抗体分子具有抗性的复发性癌症的受试者的手段。
将了解的是，本发明因此提供了一种用于治疗受试者的癌症的手段，所述手段是使用 所述癌症已经抵抗的相同的抗体分子而实现的。
难治性癌症是已经接受治疗，但是已经不对该治疗作出响应、和/或已经接受治疗， 但是已经在治疗期间进展的癌症。换句话说，难治性癌症是对治疗具有抗性的癌症。
将了解的是，癌症可以由于内在抗性而是难治性癌症。通过“内在抗性”，我们包括以 下含义，即所述癌症和/或所述受试者和/或所述靶细胞从第一次施用特定治疗时起就对所 述治疗具有抗性。
在本发明的背景下，优选的是，难治性癌症先前已经接受抗体治疗，但是对该抗体具 有抗性。如本文所论述，本发明提供了一种用于治疗患有这样的难治性癌症的患者子组的 手段，也就是说，本发明提供了一种用于治疗患有对抗体治疗具有抗性的难治性癌症的受 试者的手段。
在本发明的背景下，进一步优选的是，所述难治性癌症先前已经接受如本文所限定的 抗体分子的治疗，但是对该抗体分子具有抗性。如本文所论述，本发明提供了一种用于治 疗患有这样的难治性癌症的患者子组的手段，也就是说，本发明提供了一种用于治疗患有 对如本文所限定的抗体分子具有抗性的难治性癌症的受试者的手段。
将了解的是，本发明因此提供了一种用于治疗受试者的癌症的手段，所述手段是使用 所述癌症所抵抗的相同的抗体分子而实现的。
复发性癌症和/或难治性癌症将容易由医学领域的技术人员诊断出，并且进一步论述 于本文中。
本申请的发明人现在已经出人意料地证实用抗体分子和阻断FcγRIIB与所述抗体分子 结合的药剂进行的治疗可以用于治疗复发性癌症和/或难治性癌症。如所附的实施例中所 证实，抗体分子和本发明的药剂对于治疗难治性慢性淋巴细胞性白血病和/或复发性慢性 淋巴细胞性白血病是特别有效的。
本申请的发明人认为由于FcγRIIB通过使治疗性抗体分子内化而降低了那些抗体分子 治疗复发性癌症和/或难治性癌症的有效性，因此用抗体分子和本发明的药剂进行的治疗 发挥作用。鉴于他们的发现，本申请的发明人认为这些抗体分子和本发明的药剂将有效治 疗可以通过治疗性抗体分子治疗并且受试者的靶细胞表达FcγRIIB的任何复发性癌症和/或 难治性癌症。
应当了解的是，许多B细胞癌表达FcγRIIB，尽管是在不同的水平上。FcγRIIB表达 在慢性淋巴细胞性白血病和套细胞淋巴瘤中是最显著的，在弥漫性大B细胞淋巴瘤中是中 度显著的并且在滤泡性淋巴瘤中是最不显著的。然而，在一些情况下，患有一般表达低水 平的FcγRIIB的癌症(例如滤泡性淋巴瘤)的受试者可能具有非常高水平的FcγRIIB表达。不同类型的B细胞癌(特别是，上述那些)中FcγRIIB的表达水平与抗体分子利妥昔 单抗的内化速率相关。因此，FcγRIIB的表达和相关的抗体分子内化被认为是B细胞癌共 有的共同机制(Lim等，2011)。抗体分子的FcγRIIB依赖性内化可以由本文所公开的针 对FcγRIIB的抗体所阻断(实施例，特别是图3)。
因此，所述抗体分子和本发明的药剂可以用于治疗B细胞癌，特别是复发性套细胞淋 巴瘤和/或难治性套细胞淋巴瘤、和/或复发性滤泡性淋巴瘤和/或难治性滤泡性淋巴瘤、和/ 或复发性弥漫性大B细胞淋巴瘤和/或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤。
对于本发明治疗患有复发性癌症和/或难治性癌症的受试者，所述受试者应当有表达 FcγRIIb的靶细胞。将了解的是，FcγRIIb是细胞表面受体，并且因此将存在于靶细胞的表 面上。本领域技术人员将了解的是，不同的生物标志物可以用于评估FcγRIIb的存在；例 如FcγRIIb蛋白质和/或FcγRIIb mRNA。本领域技术人员将了解的是，存在本领域已知的用 于测量FcγRIIb蛋白质的方法；例如，免疫组织化学、蛋白质印迹法、Bradford蛋白质测 定、流式细胞术以及使用AT-10抗体进行检测。本领域技术人员将了解的是，存在本领域 已知的用于测量FcγRIIb mRNA的方法；例如RNA印迹法、RNA测序、定量PCR、以及微阵列杂交。
本领域技术人员将了解的是，为了评估FcγRIIb的存在，可能需要将靶细胞中FcγRIIb 生物标志物的水平与不表达FcγRIIb的对照细胞中FcγRIIb生物标志物的水平相比较。该对 照细胞可以是来自不表达FcγRIIb的个体的对照细胞、或来自个体的不表达FcγRIIb的对照 细胞、或来自受试者的不表达FcγRIIb的对照细胞、或已经被遗传工程化以不表达FcγRIIb 的细胞。
通过“表达FcγRIIb的靶细胞”，我们包括靶细胞表达FcγRIIb蛋白质和/或FcγRIIb mRNA。我们还包括如果靶细胞中的FcγRIIb蛋白质和/或FcγRIIb mRNA是对照细胞中的 FcγRIIb蛋白质和/或FcγRIIb mRNA的多于两倍、或多于五倍、或多于10倍、或多于20倍、 或多于50倍、或多于100倍、或多于200倍、或多于500倍、或多于1000倍，那么所述靶细 胞可以被定义为表达FcγRIIb。
对于医学领域的技术人员来说将已知的是，药物可以用不同的添加剂改性，例如以改 变所述药物由身体吸收的速率；并且可以被改性成不同的形式，例如以允许以特定的施用 途径用于身体。
因此，我们包括本发明的组合物、和/或抗体、和/或药剂、和/或药物可以与赋形剂和/ 或药学上可接受的载体和/或药学上可接受的稀释剂和/或辅料组合。
我们还包括本发明的组合物、和/或抗体、和/或药剂、和/或药物可以适用于肠胃外施 用，包括水性和/或非水性无菌注射溶液，所述溶液可以含有抗氧化剂、和/或缓冲剂、和/ 或抑菌剂、和/或使得制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；和/或水性和/或非水性无菌悬 浮液，所述悬浮液可以包括助悬剂和/或增稠剂。本发明的组合物、和/或抗体、和/或药 剂、和/或药物可以存在于单位剂量容器或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以储存在冷冻干燥(即冻干)条件下，从而只需要在即将使用之前添加无菌液体载体， 例如注射用水即可。
临时的注射溶液和悬浮液可以由先前所述种类的无菌粉剂、和/或颗粒、和/或片剂来 制备。
对于向人类患者肠胃外施用，本发明的组合物、和/或抗体、和/或药剂、和/或药物的 日剂量水平通常将是每个成人每天1pg至10mg，以单次剂量或分次剂量施用。在任何情况下，医师将确定将最适用于任何单个患者的实际剂量并且它将随具体患者的年龄、体重以及响应而变。上述剂量是平均情况的示例。当然，可以有其中需要更高或更低的剂量范围的单个情况，并且这些范围落入本发明的范围内。通常，本发明的组合物和/或药物将 含有约2mg/ml至150mg/ml或约2mg/ml至200mg/ml的浓度的本发明的抗体和/或药剂。在 一个优选的实施方案中，本发明的药物和/或组合物将含有10mg/ml的浓度的本发明的抗体 和/或药剂。
一般来说，在人类中，口服或肠胃外施用本发明的组合物、和/或抗体、和/或药剂、和/或药物是优选的途径，所述途径是最方便的。对于兽医使用来说，本发明的组合物、 和/或抗体、和/或药剂、和/或药物是作为可适当接受的制剂根据正常兽医实践来施用的， 并且兽医将确定将最适合于具体动物的给药方案和施用途径。因此，本发明提供了一种药 物制剂，所述药物制剂包含有效治疗各种病况的量的本发明的抗体和/或药剂(如上文所 述和下文进一步所述)。优选地，所述组合物、和/或抗体、和/或药剂、和/或药物适用于 通过选自包括以下各项的组的途径递送：静脉内；肌内；皮下。
本发明还包括包含本发明的多肽结合部分的药学上可接受的酸加成盐或碱加成盐的组 合物、和/或抗体、和/或药剂、和/或药物。用于制备可用于本发明中的上述碱化合物的药 学上可接受的酸加成盐的酸是形成无毒酸加成盐，即含有药理学上可接受的阴离子的盐的 那些，所述盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、 酸式磷酸盐、乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、丁二酸盐、顺丁烯二酸盐、反丁烯二酸盐、葡糖酸盐、糖酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸 盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、以及双羟萘酸盐[即1，1′-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐)]等等。药学上可接受的碱加成盐也可以用于产生根据本发明的药剂的药学上可接受的盐形式。可以用作试剂来制备具有酸性性质的本发明的药剂的药学上可接受的碱盐的化学碱是与这些化合物形成无毒碱盐的那些。这些无毒碱盐包括但不限于衍生自药理学上可接受的阳离子，如碱金属阳离子(例如钾和钠)和碱土金属阳离子(例如钙和镁)的那些；铵或 水溶性胺加成盐，如N-甲基葡糖胺-(葡甲胺)；以及药学上可接受的有机胺的低级烷醇铵和 其它碱盐等等。本发明的药剂和/或多肽结合部分可以被冻干以供储存和在使用之前在合 适的载体中复原。可以使用任何合适的冻干方法(例如喷雾干燥、滤饼干燥)和/或复原 技术。本领域技术人员将了解的是，冻干和复原可能会引起不同程度的抗体活性损失(例 如在常规的免疫球蛋白的情况下，IgM抗体倾向于比IgG抗体有更大的活性损失)并且使 用水平可能不得不被向上调整以作为补偿。在一个实施方案中，冻干(冷冻干燥)的多肽 结合部分在重新水化时损失它的活性(冻干之前)的不超过约20％、或不超过约25％、或 不超过约30％、或不超过约35％、或不超过约40％、或不超过约45％、或不超过约50％。
我们包括所述受试者可以是哺乳动物或非哺乳动物。优选地，所述哺乳动物受试者是 人类或是非哺乳动物，如马、或牛、或羊、或猪、或骆驼、或狗、或猫。最优选地，所述 哺乳动物受试者是人类。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述复发性癌症和/或难治性癌症对抗体治疗具有抗性。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述复发性癌症和/或难治性癌症对如(i)中所限定的抗体分子具有抗性。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂阻止或减少存在于靶细胞上的FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合。
如上文所述，Fc受体(包括FcγRIIb)是存在于细胞上的膜蛋白。本领域技术人员将 了解的是，存在本领域已知的用于检测蛋白质是否存在于细胞上的方法；例如免疫组织化 学、以及使标记有可检测的标记的蛋白质可视化。
通过“存在于靶细胞上的FcγRIIb”，我们包括FcγRIIb是FcγRIIb蛋白质；和/或FcγRIIb 存在于靶细胞膜上；和/或FcγRIIb存在于靶细胞膜中。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中特异性结合靶细胞的细胞表面抗原的抗体分子能够以FcγRIIb依赖性方式被内化到靶细胞 中，所述抗体分子具有能够结合FcγRIIb的Fc结构域。
如上文所述，Fc受体(包括FcγRIIb)介导抗体分子向细胞中的内化，这可以造成抗 体分子的破坏。FcγRIIb介导抗体分子向细胞中的内化的方式将是细胞生物学领域的技术 人员已知的。
通过“被内化到靶细胞中”，我们包括所述抗体分子从细胞膜被去除到靶细胞中；和/或 所述抗体分子被再循环到靶细胞中；和/或所述抗体分子被内化到靶细胞中并且被破坏； 和/或所述抗体分子被包封在靶细胞的内体中；和/或所述抗体分子被内化到靶细胞中并且 因此不再具有治疗有效性；和/或所述抗体分子被靶细胞内吞。
将了解的是，抗体分子可以在许多不同的过程中被内化到细胞中。如上文所述，本发 明的教导是抗体分子可以经由抗体分子的Fc结构域与FcγRIIb的结合而被内化。然而，将 了解的是，抗体分子可以经由另一个过程被内化，如胞饮，所述胞饮是其中细胞外分子可 以被被动地摄取到细胞中的过程。抗体分子可以被摄取到细胞中的其它过程将是细胞生物 学领域的技术人员已知的。
通过“FcγRIIb依赖性方式”，我们包括所述抗体分子以需要FcγRIIb活性的方式被内 化。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂另外阻止或减少所述抗体分子 被内化到靶细胞中。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如果受试者已经接受癌症治疗而没有响应，和/或受试者已经接受癌症治疗，但是所述受试者的癌症在所述治疗期间进展，那么所述难治性癌症被表征为是难治性癌症。
通过“受试者已经接受癌症治疗”，我们包括所述受试者先前已经接受治疗剂的治疗或 目前正接受治疗剂的治疗。
我们还包括如果所述受试者先前已经接受治疗剂的治疗，那么该治疗是在之前约一 天、或约两天、或约三天、或约四天、或约五天、或约六天、或超过约一周、或超过约两周、或超过约三周、或超过约一个月、或超过约两个月、或超过约三个月、或超过约四个 月、或超过约五个月、或超过约六个月、或超过约七个月、或超过约八个月、或超过约九 个月、或超过约十个月、或超过约11个月、或超过约一年、或超过约两年、或超过约三 年、或超过约4年、或超过约5年、或超过约10年进行的。
通过“治疗剂”，我们包括选自包括以下各项的清单的一种或多种治疗剂：利妥昔单 抗、利妥昔单抗生物仿制药、奥法木单抗、奥比妥珠单抗、阿仑单抗、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、加利昔单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、CD20抗体、CD40抗体、CD19 抗体、CD37抗体、CD52抗体、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺 (cyclophosphamide)、超分割环磷酰胺、氟达拉滨(fludarabine)、奥沙利铂 (oxaliplatin)、依鲁替尼(ibrutinib)、核苷类似物、烷化剂、苯达莫司汀 (bendamustine)、硼替佐米(bortezomib)、来那度胺(lenalidomide)、长春新碱 (vincristine)、多柔比星(doxorubicin)(也被称为阿霉素(adriamycin))、泼尼松 (prednisone)、伊达比星(idarubicin)、美法仑(melphalan)、克拉屈滨 (cladribine)、阿糖胞苷(cytarabine)、地塞米松(dexamethasone)、甲氨蝶呤(methotrexate)、美司钠(mesna)、吉西他滨(gemcitabine)、替西罗莫司 (temsirolimus)、米托蒽醌(mitoxantrone)、顺铂(cisplatin)、沙利度胺 (thalidomide)、依托泊苷(etoposide)、丙卡巴肼(procarbazine)、夫拉平度 (flavopiridol)、恩扎妥林(enzastaurin)、博来霉素(bleomycin)、长春花碱 (vinblastine)、蒽环霉素(anthracycline)、异环磷酰胺(ifosfamide)、卡铂 (carboplatin)、甲泼尼龙(methylprednisolone)以及达卡巴嗪(dacarbazine)；和/或选 自包括以下各项的清单的一种或多种治疗剂组合：氟达拉滨和环磷酰胺(FC)；环磷酰 胺、长春新碱、多柔比星、脂质体多柔比星以及泼尼松(CHOP)；环磷酰胺、长春新碱 以及泼尼松(COP，也被称为CVP)；利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱以及泼尼松(R- COP，也被称为R-CVP)；伊达比星和氟达拉滨；美法仑、苯丁酸氮芥以及泼尼松 (MCP)；利妥昔单抗和苯丁酸氮芥；利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星以及 泼尼松(R-CHOP)；利妥昔单抗、氟达拉滨以及环磷酰胺(R-FC)；美司钠、异环磷酰 胺、米托蒽醌以及依托泊苷；美司钠、异环磷酰胺、米托蒽醌、依托泊苷以及利妥昔单 抗；来那度胺和利妥昔单抗；利妥昔单抗和克拉屈滨；利妥昔单抗、美法仑、苯丁酸氮芥 以及泼尼松(R-MCP)；阿糖胞苷、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星以及泼尼松；超分割环磷酰胺、长春新碱、多柔比星以及地塞米松(hyper-CVAD)；利妥昔单抗、环磷酰 胺、长春新碱、多柔比星以及地塞米松(R-hyper-CVAD)；异环磷酰胺、卡铂以及依托 泊苷(ICE)；异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷以及利妥昔单抗；吉西他滨、地塞米松以及 卡铂；吉西他滨、地塞米松、卡铂以及利妥昔单抗；吉西他滨和奥沙利铂；吉西他滨、奥 沙利铂以及利妥昔单抗；甲氨蝶呤和阿糖胞苷；硼替佐米和吉西他滨；利妥昔单抗和硼替 佐米；氟达拉滨、环磷酰胺以及米托蒽醌(FCM)；利妥昔单抗、氟达拉滨、环磷酰胺以 及米托蒽醌(R-FCM，也被称为FCMR)；利妥昔单抗和氟达拉滨；地塞米松和吉西他 滨；地塞米松、吉西他滨以及顺铂；地塞米松、吉西他滨、顺铂以及利妥昔单抗；地塞米 松、氟达拉滨、米托蒽醌以及地塞米松(RFND)；沙利度胺和利妥昔单抗；泼尼松、依 托泊苷、丙卡巴肼以及环磷酰胺(PEP-C)；利妥昔单抗、沙利度胺、泼尼松、依托泊 苷、丙卡巴肼以及环磷酰胺；苯达莫司汀和利妥昔单抗(BR)；利妥昔单抗、环磷酰 胺、多柔比星、长春新碱、依托泊苷以及泼尼松(R-CHOEP，也被称为EPOCH-R)；阿 霉素、博来霉素、长春花碱以及达卡巴嗪(ABVD)；博来霉素、依托泊苷、阿霉素、环 磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼以及泼尼松(BEACOPP)；环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴 肼以及泼尼松(COPP)；环磷酰胺、依托泊苷、泼尼松以及丙卡巴肼(CEPP)；利妥昔 单抗、环磷酰胺、依托泊苷、泼尼松以及丙卡巴肼(RCEPP)；利妥昔单抗、环磷酰胺、 脂质体多柔比星、长春新碱以及泼尼松(RCDOP)；利妥昔单抗、环磷酰胺、米托蒽 醌、长春新碱以及泼尼松(RCNOP)；利妥昔单抗、环磷酰胺、依托泊苷、长春新碱以 及泼尼松；地塞米松、顺铂、阿糖胞苷以及利妥昔单抗(DHAP)；依托泊苷、甲泼尼 龙、阿糖胞苷、顺铂以及利妥昔单抗(ESHAP)；以及苯丁酸氮芥、长春花碱、丙卡巴肼 以及泼尼松(ChlVPP)。
除了上述治疗剂之外，医学领域的技术人员还将了解可以用于治疗癌症、和/或复发 性癌症、和/或难治性癌症的治疗剂的其它类型和组合；其实例可以见于《医疗保健研究与质量局指南摘要NGC-9392(Agency for Healthcare Research and Quality GuidelineSummary NGC-9392)》，2012年9月；《医疗保健研究与质量局指南摘要NGC-9278(Agency forHealthcare Research and Quality Guideline Summary NGC-9278)》，2012；McKay等，2012， British Journal of Haematology：12046；Hallek等，2008，Blood，111：5446-5456；Wang等， 2013，N.Engl.J.Med.，369(6)：507-516；Byrd等，N.Engl.J.Med.，369(1)：32-42；以及 《NCCN非霍奇金淋巴瘤指南(NCCN Guidelines on Non-Hodgkin′s Lymphomas)》，1.2014版 中。
通过“接受癌症治疗而没有响应”，我们包括在已经接受癌症治疗之后，所述受试者没 有表现出癌症症状的严重程度的降低；和/或所述受试者没有表现出癌症症状数目的减 少；和/或所述受试者没有改善的癌症预后；和/或所述受试者没有表现出癌症的诊断标志 物的减少。
通过“所述受试者的癌症进展”，我们包括在癌症治疗期间，所述受试者表现出癌症症 状的严重程度的增加；和/或所述受试者表现出癌症症状数目的增加；和/或所述受试者有 更差的癌症预后；和/或所述受试者表现出癌症的诊断标志物的增加。
通过“表现出”，我们包括所述受试者显示出癌症症状和/或癌症诊断标志物；和/或所 述癌症症状和/或癌症诊断标志物可以被测量、和/或被评估、和/或被定量。
对于医学领域的技术人员来说将容易显而易见的是，癌症症状和癌症诊断标志物将是 什么以及如何测量和/或评估和/或定量癌症症状的严重程度是降低还是增加、或癌症诊断 标志物是减少还是增加；以及如何可以使用那些癌症症状和/或癌症诊断标志物来形成癌 症的预后。
癌症治疗常常是作为治疗过程被施用的，也就是说，治疗剂是在一段时间内被施用 的。治疗过程的时间长度将取决于许多因素，所述因素可以包括所施用的治疗剂的类型、 所治疗的癌症的类型、所治疗的癌症的严重程度、以及受试者的年龄和健康情况等等原 因。
通过“在治疗期间”，我们包括所述受试者目前正接受治疗过程、和/或正接受治疗剂、 和/或正接受治疗剂的过程。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如果所述受试者先前已经针对癌症接受治疗，但是实现少于部分缓解，那么所述受试者被表征为没有响应。
缓解是癌症医学领域中公知的术语，该术语涉及对受试者中癌症的减轻的评估。部分 缓解也是癌症医学领域中公知的术语，该术语涉及缓解中的阶段，其中如使用特定的癌症 症状和/或癌症诊断标志物所测量的受试者的癌症与在治疗之前该特定的癌症症状和/或癌 症诊断标志物的水平相比减轻了50％。在一些情形下，对于将被分类为有部分缓解的受试 者来说，所述癌症症状和/或癌症诊断标志物的减少必须在一段特定长度的时间内被维 持。医学领域的技术人员将清楚的是，受试者是否处于癌症缓解中，以及所述受试者处在 缓解中的哪个阶段。
通过“实现少于部分缓解”，我们包括所述癌症症状或癌症诊断标志物已经基于癌症症 状的严重程度的降低、和/或癌症症状数目的减少、和/或改善的癌症预后、和/或癌症诊断 标志物的减少被评估和/或被测量和/或被定量；并且与在治疗之前所述癌症症状或癌症诊 断标志物相比减少了少于50％。
我们还包括对受试者是否实现少于部分缓解的评估和/或测量和/或定量是基于在停止 治疗之后的癌症症状和/或癌症诊断标志物与在开始治疗之前的癌症症状和/或癌症诊断标 志物、和/或在治疗期间的癌症症状和/或癌症诊断标志物之间的比较。还包括在受试者被 认为已经实现少于部分缓解之前可以进行评估和/或测量和/或定量至少一次、或至少两 次、或至少三次、或至少四次、或至少五次、或至少六次、或至少七次、或至少八次、或 至少九次、或至少十次、或至少15次、或至少20次。
我们还包括如果与在开始治疗之前的癌症症状和/或癌症诊断标志物、和/或在治疗期 间的癌症症状和/或癌症诊断标志物相比，在停止治疗之后所述癌症症状和/或癌症诊断标 志物减少了少于约1％、或少于约5％、或少于约10％、或少于约15％、或少于约20％、或少 于约25％、或少于约30％、或少于约35％、或少于约40％、或少于约45％、或少于约50％， 那么受试者实现少于部分缓解。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如果所述受试者先前已经针对癌症接受治疗并且先前已经对所述治疗作出响应，并且随后复发，那么所述复发性癌症被表征为是复发性癌症。
通过“先前已经针对癌症接受治疗”，我们包括所述受试者先前已经接受治疗剂的治 疗，但是该治疗已经停止。因此，我们包括如果用治疗剂进行的治疗在之前至少约一天、或至少约两天、或至少约三天、或至少约四天、或至少约五天、或至少约六天、或超过约 一周、或超过约两周、或超过约三周、或超过约一个月、或超过约两个月、或超过约三个 月、或超过约四个月、或超过约五个月、或超过约六个月、或超过约七个月、或超过约八 个月、或超过约九个月、或超过约十个月、或超过约11个月、或超过约一年、或超过约两 年、或超过约三年、或超过约4年、或超过约5年、或超过约10年停止，那么所述受试者先 前已经针对癌症接受治疗。
医学领域的技术人员将清楚的是，患者是否已经对治疗作出响应。
通过“先前对所述治疗作出响应”，我们包括在停止治疗之后，有经过评估和/或经过测 量和/或经过定量的癌症症状的严重程度的降低、和/或癌症症状数目的减少、和/或改善的 癌症预后、和/或癌症诊断标志物的减少。
复发是癌症医学领域中公知的术语，该术语涉及受试者的癌症在所述受试者的癌症先 前已经对治疗作出响应之后发生恶化。医学领域的技术人员将清楚的是，癌症何时已经复 发。
通过“随后复发”，我们包括在所述受试者先前已经对治疗作出响应之后，所述受试者 表现出癌症症状的严重程度的增加；和/或所述受试者表现出癌症症状数目的增加；和/或 所述受试者有更差的癌症预后；和/或所述受试者表现出癌症诊断标志物的增加。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如果所述受试者(i)在治疗之后实现至少部分缓解和/或如果所述受试者在治疗之后实现至少完全缓解，但是(ii)在停止所述治疗之后所述受试者的癌症进展，那么所述受试者 被表征为随后复发。
通过“在治疗之后完全缓解”，我们包括在停止治疗之后，没有可检测的癌症症状和/或 癌症诊断标志物。
我们还包括在一些情况下，如果所述癌症症状和/或癌症诊断标志物在停止治疗之后 至少约一天、或至少约两天、或至少约三天、或至少约四天、或至少约五天、或至少约六 天、或超过约一周、或超过约两周、或超过约三周、或超过约一个月、或超过约两个月、或超过约三个月、或超过约四个月、或超过约五个月、或超过约六个月、或超过约七个 月、或超过约八个月、或超过约九个月、或超过约十个月、或超过约11个月、或超过约一 年、或超过约两年、或超过约三年、或超过约4年、或超过约5年、或超过约10年、或约20 年、或约30年、或约40年、或约50年是不可检测的，则为在治疗之后完全缓解。最具体来 说，我们包括在一定情况下，如果所述癌症症状和/或癌症诊断标志物在停止治疗之后超 过约六个月是不可检测的，则为在治疗之后完全缓解。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述受试者随后在停止治疗之后超过约1个月复发。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述受试者随后在停止治疗之后超过约1个月、或超过约2个月、或超过约3个月、或超过 约4个月、或超过约5个月、或超过约6个月、或超过约7个月、或超过约8个月、或超过约9 个月、或超过约10个月、或超过约11个月、或超过约12个月、或超过约2年、或超过约3 年、或超过约4年、或超过约5年、或超过约6年、或超过约7年、或超过约8年、或超过约9 年、或超过约10年复发。最优选地，其中所述受试者随后在停止治疗之后超过约6个月复 发。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述受试者表现出复发性癌症的特征至少一次、或至少两次、或至少三次、或至少四次、 或至少五次、或至少六次、或至少七次、或至少八次、或至少九次、或至少十次。
通过“表现出复发性癌症的特征”，我们包括所述受试者先前已经针对癌症接受治疗并 且先前已经对所述治疗作出响应，并且随后复发。
认为癌症可能由于它已经对先前已经被用于治疗所述受试者的癌症的治疗产生抗性而 复发。因此，患有复发性癌症的受试者常常使用与先前用于治疗该受试者的癌症的治疗剂 不同的治疗剂来治疗。因此，在上文刚刚提到的实施方案中，我们包括在后续每一次受试 者表现出复发性癌症的特征时，则使用与先前已经用于治疗所述受试者的治疗剂不同的治 疗剂治疗所述受试者；和/或使用与先前已经用于治疗所述受试者的治疗剂相同的治疗剂 治疗所述受试者。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述治疗是抗体治疗，例如，如之前的实施方案的(i)中所限定的抗体分子，所述抗体 治疗是在不存在如之前的实施方案的(ii)中所限定的药剂的情况下被施用的。
通过“在不存在......的情况下施用”，我们包括在如(ii)中所限定的药剂之后和/或之 前一段时间施用如(i)中所限定的抗体分子。因此，通过“一段时间”，我们包括在如 (ii)中所限定的药剂之前和/或之后超过一小时、或超过两小时、或超过三小时、或超过六小时、或超过12小时、或超过18小时、或超过24小时、或超过两天、或超过三天、或超 过四天、或超过五天、或超过六天、或超过七天、或超过两周、或超过三周、或超过四 周、或超过五周、或超过六周、或超过七周、或超过八周、或超过三个月、或超过四个 月、或超过五个月、或超过六个月、或超过七个月、或超过八个月、或超过九个月、或超 过十个月、或超过11个月、或超过12个月、或超过1年、或超过两年、或超过三年、或超 过四年、或超过五年、或超过十年、或超过20年施用如(i)中所限定的抗体分子。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述治疗包括一种或多种治疗剂。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述靶细胞包含升高水平的FcγRIIb表达。
对于分子生物学和细胞生物学领域的技术人员来说将已知的是，升高的FcγRIIb表达 水平将是什么以及如何可以测量所述表达。举例来说，除了上述测量FcγRIIb表达的方法 之外，FcγRIIb表达水平还可以通过肿瘤活检的免疫组织化学来测量。本领域技术人员将 了解的是，存在用于测定FcγRIIb表达水平的多种技术和方法。
通过“包含升高水平的FcγRIIb表达的靶细胞”，我们包括与对照相比，所述靶细胞包含 升高水平的FcγRIIb蛋白质和/或所述靶细胞包含升高水平的FcγRIIb mRNA，如下文所述。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中靶细胞上升高的FcγRIIb表达是相对于对照来确定的。
合适的对照将是具有正常水平的FcγRIIb表达的对照。选择正确的对照以及限定FcγRIIb表达的正常水平可能取决于许多变量，如受试者、受试者的靶细胞类型的类型、以及癌症的类型。对于分子生物学或细胞生物学领域的技术人员来说将是显而易见的是，适当的对照和FcγRIIb表达的正常水平将是什么。
通过“对照”，我们包括所述对照是对照细胞；和/或所述对照是来自FcγRIIb表达水平 的数据库的信息。我们还包括所述对照细胞是与所述靶细胞不同的细胞类型，和/或是与 所述靶细胞相同的细胞类型。我们还包括所述对照细胞来自于对照个体，并且该对照个体 可能是所述受试者和/或除所述受试者以外的个体。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述对照包含患有非难治性癌症和/或非复发性癌症的对照个体的对照细胞。
通过“患有非难治性癌症和/或非复发性癌症的对照个体”，我们包括该对照个体患有不 是复发性癌症和/或难治性癌症的癌症。我们还包括该对照个体先前已经接受治疗剂治疗 至少一次。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述受试者的靶细胞中所述升高的FcγRIIb表达在与对照相比时是至少2倍。
我们还包括所述靶细胞中所述升高的FcγRIIb表达是对照的约10倍、或约20倍、或约 30倍、或约40倍、或约50倍、或约60倍、或约70倍、或约80倍、或约90倍、或约100倍、 或约200倍、或约300倍、或约400倍、或约500倍、或约600倍、或约700倍、或约800倍、 或约900倍、或约1000倍。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述靶细胞是癌细胞。
癌细胞是表现出癌症特征的细胞，也就是说，它表现出一种或多种癌症诊断标志物。 细胞生物学和肿瘤学领域的技术人员将清楚的是，所述靶细胞是否是癌细胞。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述靶细胞是B细胞。
B细胞(另外被称为B淋巴细胞)是一种类型的适应性免疫应答细胞，所述细胞与免疫系统的其它细胞的不同之处在于细胞表面上存在B细胞受体。
通过“B细胞”，我们包括血浆B细胞(也被称作效应B细胞)、和/或记忆B细胞、和/或B-1细胞、和/或B-2细胞、和/或边缘区B细胞、和/或滤泡B细胞、和/或调节性B细胞、和/ 或初始B细胞。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述复发性癌症、和/或所述难治性癌症、和/或所述癌细胞、和/或所述相同的癌症类型、和/或所述癌症选自包括以下各项的组：非霍奇金淋巴瘤；滤泡性淋巴瘤；弥漫性大B细胞淋巴瘤；套细胞淋巴瘤；慢性淋巴细胞性白血病；小淋巴细胞性淋巴瘤。
非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一组不同的淋巴瘤的集体名称，它包括：滤泡细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、MALT淋巴瘤、淋巴浆细胞性NHL(也被称为瓦尔 登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′s macroglobulinaemia))、小淋巴细胞性淋巴 瘤、慢性淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、弥漫性混合细胞淋巴瘤、伯基特氏 淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)、间变性大细胞淋巴瘤、以及弥漫性混合细胞淋巴瘤等等。
上述癌症中的每一种是公知的，并且所述症状和癌症诊断标志物是被充分描述的，用 于治疗那些癌症的治疗剂也是如此。因此，非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B 细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、以及小淋巴细胞性淋巴瘤的症状、
癌症诊断标志物、以及用于治疗它们的治疗剂将是医学领域的技术人员已知的。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述受试者没有响应、和/或受试者部分缓解、和/或受试者完全缓解、和/或受试者的癌症已经进展是通过测量来自包括以下各项的组的一个或多个来确定的：
(i)淋巴细胞计数；和/或
(ii)中性粒细胞计数；和/或
(iii)血小板计数；和/或
(iv)血红蛋白计数；和/或
(v)肿瘤细胞百分比；和/或
(vi)骨髓淋巴细胞百分比；和/或
(vii)循环淋巴细胞百分比；和/或
(viii)淋巴细胞上生物标志物的存在和/或不存在；和/或
(ix)癌症分期；和/或
(x)组织学检查；和/或
(xi)骨髓检查；和/或
(xii)细胞遗传学检查；和/或
(xiii)淋巴结评价；和/或
(xiv)身体症状；和/或
(xv)脾中癌细胞的减少。
将了解的是，(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)、 (ix)、(x)、(xi)、(xii)、(xiii)以及(xv)涉及“癌症诊断标志物”；并且 (xiv)涉及“癌症症状”。
通过肿瘤学领域中数十年的研究和创新，大量癌症的“癌症诊断标志物”和“癌症症状” 被充分表征，测量和评估癌症诊断标志物和癌症症状的方法也是如此。因此，肿瘤学领域 的技术人员将了解上述点中的每一个如何与特定的癌症相关，并且基于对特定癌症诊断标 志物或癌症症状的测量或评估，对于本领域技术人员来说将容易显而易见的是，受试者是 否没有对治疗作出响应、或受试者是否部分缓解、或受试者是否完全缓解、或受试者的癌 症是否已经进展；其实例可以见于McKay等，2012，British Journal ofHaematology：12046； Hallek等，2008，Blood，111：5446-5456；以及《NCCN非霍奇金淋巴瘤指南(NCCN Guidelines on Non-Hodgkin′s Lymphomas)》，1.2014版中。
对许多诊断癌症标志物(如“淋巴细胞计数”、“中性粒细胞计数”、“血小板计数”、“血 红蛋白计数”、“非典型细胞百分比”、“骨髓淋巴细胞百分比”、以及“循环淋巴细胞百分比”)的评估依赖于对受试者体内细胞和分子的定量。用于定量那些细胞和分子的测定是本领域公知的。
通过“肿瘤细胞”，我们包括赘生性细胞、和/或呈CD19+、CD5+以及CD23+的赘生性细胞。
许多生物标志物可以指示某些类型的癌症。举例来说，慢性淋巴细胞性白血病细胞共 表达CD5、CD19、CD20以及CD23。然而，如果与正常B细胞相比，那么CD20和CD79b的 水平是更低的。
通过“淋巴细胞上生物标志物的存在和/或不存在”，我们包括术语“存在”包括在与对照 B细胞相比时生物标志物的量增加、或有可检测的生物标志物，并且不存在包括在与对照B细胞相比时生物标志物的量减少、或没有可检测的生物标志物。我们还包括对照B细胞 可以来自“对照个体”。我们还包括淋巴细胞上生物标志物的存在和/或不存在包括CD5、和 /或CD19、和/或CD20、和/或CD23、和/或细胞周期蛋白D1、和/或BCL2、和/或FMC6、和/或CD3、和/或CD10和/或BCL6、和/或CD21、和/或CD45、和/或Ki-67、和/或 IRF4/MUM1、和/或MYC、和/或CD30、和/或CD138、和/或EBER-ISH、和/或ALK、和/或 HHV8、和/或κ/λ、和/或CD79b的存在、和/或CD20、和/或CD79b、和/或CD10、和/或 CD23、和/或BCL6的不存在。
许多癌症的诊断、预后以及进展的临床定义依赖于被称为分期的某些分类。那些分期 系统用以分类整理许多不同的癌症诊断标志物和癌症症状以提供癌症的诊断、和/或预 后、和/或进展的汇总。对于肿瘤学领域的技术人员来说将已知的是，如何使用分期系统评估癌症的诊断、和/或预后、和/或进展以及应当使用哪些癌症诊断标志物和癌症症状来这样做。
通过“癌症分期”，我们包括Rai分期，它包括0期、I期、II期、III期以及IV期；和/或Binet分期，它包括A期、B期以及C期；和/或Ann Arbour分期，它包括I期、II期、III期以 及IV期。
已知癌症可以导致细胞形态的异常。这些异常往往可重现地出现在某些癌症中，这意 味着检查形态上的这些变化(另外被称为组织学检查)可以用于癌症的诊断或预后。用于 将样品可视化以检查细胞的形态以及制备用于可视化的样品的技术是本领域公知的；例如 光学显微术或共聚焦显微术。
通过“组织学检查”，我们包括存在小的成熟的淋巴细胞；和/或存在具有细胞质的窄边 界的小的成熟的淋巴细胞；存在具有缺乏可识别的核仁的致密核的小的成熟的淋巴细胞； 和/或存在具有细胞质的窄边界并且具有缺乏可识别的核仁的致密核的小的成熟的淋巴细 胞；和/或存在非典型细胞、和/或核裂细胞、和/或幼淋巴细胞。
公知癌症是细胞的DNA中突变的结果，所述突变可以使得细胞避免细胞死亡或不受控 制地增殖。因此，检查这些突变(也被称为细胞遗传学检查)可以是用于评估癌症的诊断 和/或预后的有用的工具。这样的一个实例是染色体位置13q14.1的缺失，它是慢性淋巴细 胞性白血病的特征。用于检查细胞中的突变的技术是本领域公知的；例如荧光原位杂交(FISH)。
通过“细胞遗传学检查”，我们包括检查细胞中的DNA，特别是染色体。细胞遗传学检 查可以用于鉴定DNA的变化，这可能与难治性癌症和/或复发性癌症的存在相关。这些可以包括：染色体13的长臂中的缺失、和/或染色体位置13q14.1的缺失、和/或染色体12的三体性、和/或染色体12的长臂中的缺失、和/或染色体11的长臂中的缺失、和/或11q的缺 失、和/或染色体6的长臂中的缺失、和/或6q的缺失、和/或染色体17的短臂中的缺失、和/ 或17p的缺失、和/或t(11：14)易位、和/或(q13：q32)易位、和/或抗原基因受体重排、和/或BCL2重排、和/或BCL6重排、和/或t(14：18)易位、和/或t(11：14)易位、和/或(q13：q32)易位、和/或(3：v)易位、和/或(8：14)易位、和/或(8：v)易位、和/或t(11：14)和(q13：q32)易位。
已知患有癌症的受试者表现出某些身体症状，所述症状常常是由于癌症对身体的负担 所引起。那些症状常常在相同的癌症中重现，因此可以是疾病的诊断、和/或预后、和/或 进展的特征。医学领域的技术人员将了解哪些身体症状与哪些癌症有关以及评估那些身体 系统如何可以与疾病的诊断、和/或预后、和/或进展相关联。
通过“身体症状”，我们包括肝肿大、和/或脾肿大。
通过“受试者没有响应”，我们包括在所述受试者中，在治疗前与停止治疗后之间进行 比较时和/或在治疗期间与在停止治疗后和/或治疗期间之间进行比较时，对上文刚刚所述 的实施方案中的点(i)、和/或(ii)、和/或(iii)、和/或(iv)、和/或(v)、和/或(vi)、和/或(vii)、和/或(viii)、和/或(ix)、和/或(x)、和/或(xi)、和/或 (xii)、和/或(xiii)、和/或(xiv)、和/或(xv)的测量和/或评估没有变化，或即使发 生变化，所述变化也是可忽略不计的。
通过“受试者部分缓解”，我们包括对于“淋巴细胞计数”，与在治疗前和/或治疗期间相 比，在停止治疗后，淋巴细胞计数减少至少50％；和/或对于“淋巴结评价”，与在治疗前和 /或治疗期间相比，在停止治疗后，一个或多个淋巴结的尺寸减小至少50％、和/或没有另 外的肿大的淋巴结；和/或对于“身体症状”，与在治疗前和/或治疗期间相比，在停止治疗 后，脾的尺寸减小至少50％(与脾肿大有关)，和/或与在治疗前和/或治疗期间相比，在 停止治疗后，肝脏的尺寸减小至少50％(与肝肿大有关)；和/或对于“中性粒细胞计数”，存在不超过1500个细胞/微升；和/或对于“血小板计数”，存在不超过100,000个血小板/微升；和/或与在治疗前和/或治疗期间相比，在停止治疗后，中性粒细胞计数的数目减少至少50％；和/或对于“血红蛋白计数”，存在不超过11g/dL，和/或与在治疗前和/或治疗期间相比，在停止治疗后，血红蛋白的量减少至少50％。
通过“受试者完全缓解”，我们包括对于“淋巴细胞计数”，存在最多4000个细胞/微升的 细胞计数；和/或对于“淋巴结评价”，淋巴结的直径是最多1.5cm；和/或对于“身体症状”， 没有可检测的肝肿大、和/或没有可检测的脾肿大；和/或对于“中性粒细胞计数”，存在不 超过1500个细胞/微升；和/或对于“血小板计数”，存在不超过100,000个血小板/微升；和/ 或对于“血红蛋白计数”，存在不超过11g/dL。
通过“受试者的癌症已经进展”，我们包括对于“淋巴细胞计数”，与在治疗前和/或治疗 期间相比，在停止治疗后，淋巴细胞计数的数目增加至少50％，和/或至少超过5000个细胞 /微升；和/或对于“淋巴结评价”，淋巴结肿大到至少1.5cm的直径，和/或与治疗前和/或治 疗期间相比，在停止治疗后，淋巴结的尺寸增加至少50％；和/或对于“身体症状”，出现肝 肿大，和/或出现脾肿大，和/或与治疗前和/或治疗期间相比，在停止治疗后，脾的尺寸增 加至少50％(与脾肿大有关)，和/或与治疗前和/或治疗期间相比，在停止治疗后，肝脏 的尺寸增加至少50％(与肝肿大有关)；和/或对于“血红蛋白计数”，血红蛋白水平降低超 过20g/L，和/或血红蛋白水平降低到低于100g/L；对于“血小板计数”，与治疗前和/或治疗期间相比，在停止治疗后，中性粒细胞计数的数目减少至少50％，和/或存在最多 100,000个血小板/微升。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂包括：多肽；或抗运载蛋白(anticalin)；或肽；或抗体；或嵌合抗体；或单链 抗体；或适体；或darpin；或Fab、或F(ab′)2、或Fv、或ScFv或dAb抗体片段；或IgG2抗 体；或IgG4抗体；或IgG2和IgG4的嵌合分子；或包含N297Q突变的抗体变体；或DANA变 体抗体；或小分子；或天然产品；或亲和体；或拟肽；或核酸；或肽核酸分子；或脂质； 或碳水化合物；或基于模块化框架的蛋白质，包括锚蛋白重复序列蛋白、或犰狳重复序列 蛋白、或富含亮氨酸的蛋白质、或三十四肽重复序列蛋白、或设计的锚蛋白重复序列蛋白 (DARPin)。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如(ii)中所限定的药剂是特异性结合FcγRIIb的一种或多种抗体分子。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如(ii)中所限定的药剂是不包括能够募集效应细胞的结构域的一种或多种抗体分子。
免疫系统包含许多不同的细胞类型，这些细胞类型各自在产生、辅助或维持免疫应答 中具有不同的作用。为了发挥它在免疫中的作用，免疫系统的细胞常常将对刺激作出反 应，所述刺激常常将引起该细胞被动员到特定的身体部位或靶标(如具有信号的细胞)。免疫系统的一类细胞是效应细胞；其特征和作用将是免疫学领域的技术人员公知的。
通过“效应细胞”，我们包括效应T细胞、和/或效应B细胞(也被称为浆细胞)、和/或效应记忆T细胞、和/或效应记忆CD4+T细胞、和/或效应记忆CD8+T细胞。
通过“能够募集效应细胞的结构域”，我们包括抗体分子上将使效应细胞移动到所述抗 体分子的位置的表位和/或抗原。我们还包括能够募集效应细胞的结构域可以是抗体分子 的Fc结构域、和/或抗体分子的Fc结构域上的抗原和/或表位。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如(ii)中所限定的药剂是一种或多种抗体分子，所述抗体分子是单克隆抗体分子、和/或多克隆抗体分子、和/或双特异性抗体分子。
如上文所述，不同类型和形式的抗体被包括在本发明中，并且将是免疫学领域的技术 人员已知的。公知的是，用于治疗目的的抗体常常被改变抗体分子的特性的另外的组分修 饰。
因此，我们包括本发明的抗体分子(例如单克隆抗体分子、和/或多克隆抗体分子、和/或双特异性抗体分子)包含可检测的部分和/或细胞毒性部分。
通过“可检测的部分”，我们包括来自包括以下各项的组的一种或多种：酶；放射性原 子；荧光部分；化学发光部分；生物发光部分。所述可检测的部分允许抗体分子在体外、和/或体内、和/或离体被可视化。
通过“细胞毒性部分”，我们包括放射性部分；和/或酶，其中所述酶是胱天蛋白酶；和 /或毒素，其中所述毒素是细菌毒素或毒液；其中所述细胞毒性部分能够诱导细胞裂解。
我们还包括所述抗体分子可以呈分离形式和/或纯化形式、和/或可以被聚乙二醇化。
在以下实施方案中，SEQ ID NO指的是以下克隆中所示的序列。
如上文所述，抗体的CDR与抗体靶标结合。本文所述的每一个CDR的氨基酸分配是依 据根据Kabat EA等，1991，“有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmulogicalInterest)”，第5版，NIH出版号91-3242，第xv-xvii页的定义。
如本领域技术人员将意识到的那样，还存在用于将氨基酸分配给每一个CDR的其它方 法。举例来说，国际免疫遗传学信息系统(International ImMunoGeneTicsinformation system，IMGT(R))(http：//www.imgt.org/以及Lefranc和Lefranc，“免疫球蛋白概况(The Immunoglobulin FactsBook)”，由学术出版社(Academic Press)出版，2001)。
应当了解的是，含有三个或更少的CDR区(在一些情况下，甚至仅仅单个CDR或其部分)的分子能够保留作为所述一个或多个CDR的来源的抗体的抗原结合活性。举例来 说，在Gao等，1994，J.Biol.Chem.，269：32389-93中，描述了整个VL链(包括所有三个 CDR)对它的底物具有高亲和力。
含有两个CDR区的分子例如由Vaughan和Sollazzo 2001，《组合化学和高通量筛选(Combinatorial Chemistry&High Throughput Screening)》，4：417-430所描述。在第418页 (右栏-3我们的设计策略(Our Strategy for Design))，描述了只包括穿插在框架区内的 H1和H2 CDR高变区的微型抗体。所述微型抗体被描述为能够与靶标结合。Pessi等，1993，Nature，362：367-9和Bianchi等，1994，J.Mol.Biol.，236：649-59由Vaughan和Sollazzo引用 并且更详细地描述了H1和H2微型抗体以及它的特性。在Qiu等，2007，NatureBiotechnology，25：921-9中，证实了由两个连接的CDR组成的分子能够结合抗原。Quiocho1993，Nature，362：293-4提供了“微型抗体”技术的汇总。Ladner 2007，NatureBiotechnology， 25：875-7说明了含有两个CDR的分子能够保留抗原结合活性。
含有单个CDR区的分子描述于例如Laune等，1997，JBC，272：30937-44中，其中证实了衍生自CDR的多种六肽显示出抗原结合活性并且指出完整的单个CDR的合成肽显示出 强结合活性。在Monnet等，1999，JBC，274：3789-96中，证实了多种12聚体肽和相关的框 架区具有抗原结合活性并且论述了CDR3样肽单独能够结合抗原。在Heap等，2005，J.Gen.Virol.，86：1791-1800中，报道了“微型抗体”(含有单个CDR的分子)能够结合抗原并且 证实了来自抗HIV抗体的环肽具有抗原结合活性和功能。在Nicaise等，2004，ProteinScience，13：1882-91中，证实了单个CDR可以赋予对它的溶菌酶抗原的抗原结合活性和亲和力。
因此，具有三个或更少的CDR的分子能够保留作为它们的来源的抗体的抗原结合特 性。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂包含可变重链(VH)，所述可变重链包含以下CDR：
(i)SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52以及SEQ ID NO：53；或
(ii)SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58以及SEQ ID NO：59；或
(iii)SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64以及SEQ ID NO：65；或
(iv)SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：70以及SEQ ID NO：71；或
(v)SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76以及SEQ ID NO：77；或
(vi)SEQ ID NO：81和SEQ ID NO：82以及SEQ ID NO：83；或
(vii)SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88以及SEQ ID NO：89；或
(viii)SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：94以及SEQ ID NO：95；或
(ix)SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100以及SEQ ID NO：101；或
(x)SEQ ID NO：105和SEQ ID NO：106以及SEQ ID NO：107；或
(xi)SEQ ID NO：111和SEQ ID NO：112以及SEQ ID NO：113；或
(xii)SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118以及SEQ ID NO：119；或
(xiii)SEQ ID NO：123和SEQ ID NO：124以及SEQ ID NO：125；或
(xiv)SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：130以及SEQ ID NO：131；或
(xv)SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：136以及SEQ ID NO：137；或
(xvi)SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：142以及SEQ ID NO：143；或
(xvii)SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：148以及SEQ ID NO：149；或
(xviii)SEQ ID NO：153和SEQ ID NO：154以及SEQ ID NO：155；或
(xix)SEQ ID NO：159和SEQ ID NO：160以及SEQ ID NO：161；或
(xx)SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：166以及SEQ ID NO：167；或
(xxi)SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：172以及SEQ ID NO：173；或
(xxii)SEQ ID NO：177和SEQ ID NO：178以及SEQ ID NO：179；或
(xxiii)SEQ ID NO：183和SEQ ID NO：184以及SEQ ID NO：185；或
(xxiv)SEQ ID NO：189和SEQ ID NO：190以及SEQ ID NO：191。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂包含可变轻链(VL)，所述可变轻链包含以下CDR：
(i)SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55以及SEQ ID NO：56；或
(ii)SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61以及SEQ ID NO：62；或
(iii)SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67以及SEQ ID NO：68；或
(iv)SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73以及SEQ ID NO：74；或
(v)SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79以及SEQ ID NO：80；或
(vi)SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：85以及SEQ ID NO：86；或
(vii)SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91以及SEQ ID NO：92；或
(viii)SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：97以及SEQ ID NO：98；或
(ix)SEQ ID NO：102和SEQ ID NO：103以及SEQ ID NO：104；或
(x)SEQ ID NO：108和SEQ ID NO：109以及SEQ ID NO：110；或
(xi)SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：115以及SEQ ID NO：116；或
(xii)SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：121以及SEQ ID NO：122；或
(xiii)SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：127以及SEQ ID NO：128；或
(xiv)SEQ ID NO：132和SEQ ID NO：133以及SEQ ID NO：134；或
(xv)SEQ ID NO：138和SEQ ID NO：139以及SEQ ID NO：140；或
(xvi)SEQ ID NO：144和SEQ ID NO：145以及SEQ ID NO：146；或
(xvii)SEQ ID NO：150和SEQ ID NO：151以及SEQ ID NO：152；或
(xviii)SEQ ID NO：156和SEQ ID NO：157以及SEQ ID NO：158；或
(xix)SEQ ID NO：162和SEQ ID NO：163以及SEQ ID NO：164；或
(xx)SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：169以及SEQ ID NO：170；或
(xxi)SEQ ID NO：174和SEQ ID NO：175以及SEQ ID NO：176；或
(xxii)SEQ ID NO：180和SEQ ID NO：181以及SEQ ID NO：182；或
(xxiii)SEQ ID NO：186和SEQ ID NO：187以及SEQ ID NO：188；或
(xxiv)SEQ ID NO：192和SEQ ID NO：193以及SEQ ID NO：194。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂包含选自由以下序列组成的组的可变重链(VH)氨基酸序列：SEQ ID NO：3； SEQID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9；SEQ IDNO：10；SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO： 14；SEQ ID NO：15；SEQID NO：16；SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：19； SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；以及SEQ ID NO：26。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂包含选自由以下序列组成的组的可变轻链(VL)氨基酸序列：SEQ ID NO：27； SEQID NO：28；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33；SEQID NO：34；SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：38；SEQ ID NO：39；SEQID NO：40；SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：42；SEQ ID NO： 43；SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：45；SEQ ID NO：46；SEQ ID NO：47；SEQ ID NO：48； SEQ ID NO：49；以及SEQ ID NO：50。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂包含以下CDR氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55以及SEQ ID NO：56；或
(ii)SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60和SEQ IDNO：61以及SEQ ID NO：62；或
(iii)SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66和SEQ IDNO：67以及SEQ ID NO：68；或
(iv)SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72和SEQ IDNO：73以及SEQ ID NO：74；或
(v)SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79以及SEQ ID NO：80；或
(vi)SEQ ID NO：81和SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84和SEQ IDNO：85以及SEQ ID NO：86；或
(vii)SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88和SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90和SEQ IDNO：91以及SEQ ID NO：92；或
(viii)SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96和SEQ IDNO：97以及SEQ ID NO：98；或
(ix)SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：102和SEQ IDNO：103以及SEQ ID NO：104；或
(x)SEQ ID NO：105和SEQ ID NO：106和SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：108和 SEQID NO：109以及SEQ ID NO：110；或
(xi)SEQ ID NO：111和SEQ ID NO：112和SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：114和 SEQID NO：115以及SEQ ID NO：116；或
(xii)SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118和SEQ ID NO：119和SEQ ID NO：120和 SEQID NO：121以及SEQ ID NO：122；或
(xiii)SEQ ID NO：123和SEQ ID NO：124和SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：127以及SEQ ID NO：128；或
(xiv)SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：130和SEQ ID NO：131和SEQ ID NO：132和 SEQID NO：133以及SEQ ID NO：134；或
(xv)SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138和 SEQID NO：139以及SEQ ID NO：140；或
(xvi)SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：144和 SEQID NO：145以及SEQ ID NO：146；或
(xvii)SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：148和SEQ ID NO：149和SEQ ID NO：150和SEQ ID NO：151以及SEQ ID NO：152；或
(xviii)SEQ ID NO：153和SEQ ID NO：154和SEQ ID NO：155和SEQ ID NO：156和SEQ ID NO：157以及SEQ ID NO：158；或
(xix)SEQ ID NO：159和SEQ ID NO：160和SEQ ID NO：161和SEQ ID NO：162和 SEQID NO：163以及SEQ ID NO：164；或
(xx)SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：166和SEQ ID NO：167和SEQ ID NO：168和 SEQID NO：169以及SEQ ID NO：170；或
(xxi)SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：174和 SEQID NO：175以及SEQ ID NO：176；或
(xxii)SEQ ID NO：177和SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：179和SEQ ID NO：180和SEQ ID NO：181以及SEQ ID NO：182；或
(xxiii)SEQ ID NO：183和SEQ ID NO：184和SEQ ID NO：185和SEQ ID NO：186和SEQ ID NO：187以及SEQ ID NO：188；或
(xxiv)SEQ ID NO：189和SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：191和SEQ ID NO：192和SEQ ID NO：193以及SEQ ID NO：194。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂包含以下氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：27；或
(ii)SEQ IS NO：4和SEQ ID NO：28；或
(iii)SEQ IS NO：5和SEQ ID NO：29；或
(iv)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：30；或
(v)SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：31；或
(vi)SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：32；或
(vii)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：33；或
(viii)SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：34；或
(ix)SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：35；或
(x)SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：36；或
(xi)SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：37；或
(xii)SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：38；或
(xiii)SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：39；或
(xiv)SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：40；或
(xv)SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：41；或
(xvi)SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：42；或
(xvii)SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：43；或
(xviii)SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：44；或
(xix)SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：45；或
(xx)SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：46；或
(xxi)SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：47；或
(xxii)SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：48；或
(xxiii)SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：49；或
(xxiv)SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：50。
本发明的药剂还可以包含SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的恒定区(CH)和(CL)。
在另一个实施方案中，所述药剂能够与本文所述的本发明的药剂，例如包含上述实施 方案中所示的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1-194)的药剂竞争阻止或减少FcγRIIb与抗体 分子的Fc结构域结合。
通过“能够与如本文所限定的药剂(如抗原分子)竞争”阻止或减少FcγRIIb与抗体分子 的Fc结构域结合，我们意指所测试的药剂能够至少部分地抑制或以其它方式干扰如本文所 限定的药剂与FcγRIIb结合并且阻止或减少FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域结合。
举例来说，所述药剂可能能够将本文所述的药剂的结合抑制至少约10％；例如至少约 20％、或至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、 至少约90％、至少约95％、至少约100％和/或将所述药剂阻止或减少FcγRIIb与抗体分子的 Fc结构域结合的能力抑制至少约10％；例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少 约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约 100％。
竞争结合可以通过本领域技术人员公知的方法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)来确 定。
ELISA测定可以用于评价表位修饰抗体或阻断抗体。另外的适用于鉴定竞争抗体的方 法公开在《抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)》，Harlow和Lane(其以引 用的方式并入本文，例如参见第567至569、574至576、583以及590至612页，1988，CSHL， NY，ISBN 0-87969-314-2)中。
本发明的药剂可以包含以下恒定区(CH和CL)：
IgG1-CH[SEQ ID NO：1]
Figure RE-GSB0000199440020000231
I-CL[SEQ ID NO：2]
Figure RE-GSB0000199440020000232
本发明的药剂可以包含以下克隆的一个或多个序列：
抗体克隆：1A01
1A01-VH[SEQ ID NO：3]
Figure RE-GSB0000199440020000233
1A01-VL[SEQ ID NO：27]
Figure RE-GSB0000199440020000234
CDR区
CDRH1：DYYMN[SEQ ID NO：51]
CDRH2：LIGWDGGSTYYADSVKG[SEQ ID NO：52]
CDRH3：AYSGYELDY[SEQ ID NO：53]
CDRL1：SGSSSNIGNNAVN[SEQ ID NO：54]
CDRL2：DNNNRPS[SEQ ID NO：55]
CDRL3：AAWDDSLNASI[SEQ ID NO：56]
抗体克隆：1B07
1B07-VH[SEQ ID NO：4]
Figure RE-GSB0000199440020000235
1B07-VL[SEQ ID NO：28]
Figure RE-GSB0000199440020000241
CDR区
CDRH1：SYGMH[SEQ ID NO：57]
CDRH2：FTRYDGSNKYYADSVRG[SEQ ID NO：58]
CDRH3：ENIDAFDV[SEQ ID NO：59]
CDRL1：SGSSSNIGNNAVN[SEQ ID NO：60]
CDRL2：DNQQRPS[SEQ ID NO：61]
CDRL3：WDDRLFGPV[SEQ ID NO：62]
抗体克隆：1C04
1C04-VH[SEQ ID NO：5]
Figure RE-GSB0000199440020000242
1C04-VL[SEQ ID NO：29]
Figure RE-GSB0000199440020000243
CDR区
CDRH1：SYAMS[SEQ ID NO：63]
CDRH2：SISDSGAGRYYADSVEG[SEQ ID NO：64]
CDRH3：THDSGELLDAFDI[SEQ ID NO：65]
CDRL1：SGSSSNIGSNHVL[SEQ ID NO：66]
CDRL2：GNSNRPS[SEQ ID NO：67]
CDRL3：AAWDDSLNGWV[SEQ ID NO：68]
抗体克隆：1E05
1E05-VH[SEQ ID NO：6]
Figure RE-GSB0000199440020000244
1E05-VL[SEQ ID NO：30]
Figure RE-GSB0000199440020000245
CDR区
CDRH1：TYAMN[SEQ ID NO：69]
CDRH2：VISYDGSNKNYVDSVKG[SEQ ID NO：70]
CDRH3：NFDNSGYAIPDAFDI[SEQ ID NO：71]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQ ID NO：72]
CDRL2：DNNSRPS[SEQ ID NO：73]
CDRL3：AAWDDSLGGPV[SEQ ID NO：74]
抗体克隆：2A09
2A09-VH[SEQ ID NO：7]
Figure RE-GSB0000199440020000246
2A09-VL[SEQ ID NO：31]
Figure RE-GSB0000199440020000251
CDR区
CDRH1：NAWMS[SEQ ID NO：75]
CDRH2：YISRDADITHYPASVKG[SEQ ID NO：76]
CDRH3：GFDYAGDDAFDI[SEQ ID NO：77]
CDRL1：SGSSSNIGSNAVN[SEQ ID NO：78]
CDRL2：GNSDRPS[SEQ ID NO：79]
CDRL3：AAWDDSLNGRWV[SEQ ID NO：80]
抗体克隆：2B08
2B08-VH[SEQ ID NO：8]
Figure RE-GSB0000199440020000252
2B08-VL[SEQ ID NO：32]
Figure RE-GSB0000199440020000253
CDR区
CDRH1：DYYMS[SEQ ID NO：81]
CDRH2：LIGHDGNNKYYLDSLEG[SEQ ID NO：82]
CDRH3：ATDSGYDLLY[SEQ ID NO：83]
CDRL1：SGSSSNIGNNAVN[SEQ ID NO：84]
CDRL2：YDDLLPS[SEQ ID NO：85]
CDRL3：TTWDDSLSGVV[SEQ ID NO：86]
抗体克隆：2E08
2E08-VH[SEQ ID NO：9]
Figure RE-GSB0000199440020000254
2E08-VL[SEQ ID NO：33]
Figure RE-GSB0000199440020000255
CDR区
CDRH1：DYYMS[SEQ ID NO：87]
CDRH2：AIGFSDDNTYYADSVKG[SEQ ID NO：88]
CDRH3：GDGSGWSF[SEQ ID NO：89]
CDRL1：SGSSSNIGNNAVN[SEQ ID NO：90]
CDRL2：DNNKRPS[SEQ ID NO：91]
CDRL3：ATWDDSLRGWV[SEQ ID NO：92]
抗体克隆：5C04
5C04-VH[SEQ ID NO：10]
Figure RE-GSB0000199440020000256
Figure RE-GSB0000199440020000267
5C04-VL[SEQ ID NO：34]
Figure RE-GSB0000199440020000261
CDR区
CDRH1：NYGMH[SEQ ID NO：93]
CDRH2：VISYDGSNKYYADSVKG[SEQ ID NO：94]
CDRH3：WRDAFDI[SEQ ID NO：95]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQ ID NO：96]
CDRL2：SDNQRPS[SEQ ID NO：97]
CDRL3：AAWDDSLSGSWV[SEQ ID NO：98]
抗体克隆：5C05
5C05-VH[SEQ ID NO：11]
Figure RE-GSB0000199440020000262
5C05-VL[SEQ ID NO：35]
Figure RE-GSB0000199440020000263
CDR区
CDRH1：TYGMH[SEQ ID NO：99]
CDRH2：VISYDGSNKYYADSVKG[SEQ ID NO：100]
CDRH3：ENFDAFDV[SEQ ID NO：101]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQ ID NO：102]
CDRL2：SNSQRPS[SEQ ID NO：103]
CDRL3：AAWDDSLNGQVV[SEQ ID NO：104]
抗体克隆：5D07
5D07-VH[SEQ ID NO：12]
Figure RE-GSB0000199440020000264
5D07-VL[SEQ ID NO：36]
Figure RE-GSB0000199440020000265
CDR区
CDRH1：TYGMH[SEQ ID NO：105]
CDRH2：VIAYDGSKKDYADSVKG[SEQ ID NO：106]
CDRH3：EYRDAFDI[SEQ ID NO：107]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQ ID NO：108]
CDRL2：GNSNRPS[SEQ ID NO：109]
CDRL3：AAWDDSVSGWM[SEQ ID NO：110]
抗体克隆：5E12
5E12-VH[SEQ ID NO：13]
Figure RE-GSB0000199440020000266
Figure RE-GSB0000199440020000271
5E12-VL[SEQ ID NO：37]
Figure RE-GSB0000199440020000272
CDR区
CDRH1：SYGMH[SEQ ID NO：111]
CDRH2：VISYDGINKDYADSMKG[SEQ ID NO：112]
CDRH3：ERKDAFDI[SEQ ID NO：113]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQ ID NO：114]
CDRL2：SNNQRPS[SEQ ID NO：115]
CDRL3：ATWDDSLNGLV[SEQ ID NO：116]
抗体克隆：5G08
5G08-VH[SEQ ID NO：14]
Figure RE-GSB0000199440020000273
5G08-VL[SEQ ID NO：38]
Figure RE-GSB0000199440020000274
CDR区
CDRH1：NYGMH[SEQ ID NO：117]
CDRH2：VISYDGSNRYYADSVKG[SEQ ID NO：118]
CDRH3：DRWNGMDV[SEQ ID NO：119]
CDRL1：SGSSSNIGAGYDVH[SEQ ID NO：120]
CDRL2：ANNQRPS[SEQ ID NO：121]
CDRL3：AAWDDSLNGPWV[SEQ ID NO：122]
抗体克隆：5H06
5H06-VH[SEQ ID NO：15]
Figure RE-GSB0000199440020000275
5H06-VL[SEQ ID NO：39]
Figure RE-GSB0000199440020000276
CDR区
CDRH1：SYGMH[SEQ ID NO：123]
CDRH2：VISYDGSDTAYADSVKG[SEQ ID NO：124]
CDRH3：DHSVIGAFDI[SEQ ID NO：125]
CDRL1：SGSSSNIGSNTVN[SEQ ID NO：126]
CDRL2：DNNKRPS[SEQ ID NO：127]
CDRL3：SSYAGSNNVV[SEQ ID NO：128]
抗体克隆：6A09
6A09-VH[SEQ ID NO：16]
Figure RE-GSB0000199440020000281
6A09-VL[SEQ ID NO：40]
Figure RE-GSB0000199440020000282
CDR区
CDRH1：SYGMH[SEQ ID NO：129]
CDRH2：VTSYDGNTKYYANSVKG[SEQ ID NO：130]
CDRH3：EDCGGDCFDY[SEQ ID NO：131]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQ ID NO：132]
CDRL2：GNSNRPS[SEQ ID NO：133]
CDRL3：AAWDDSLNEGV[SEQ ID NO：134]
抗体克隆：6B01
6B01-VH[SEQ ID NO：17]
Figure RE-GSB0000199440020000283
6B01-VL[SEQ ID NO：41]
Figure RE-GSB0000199440020000284
CDR区
CDRH1：NYGMH[SEQ ID NO：135]
CDRH2：VISYDGSNKYYADSVKG[SEQ ID NO：136]
CDRH3：DQLGEAFDI[SEQ ID NO：137]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQ ID NO：138]
CDRL2：DNNKRPS[SEQ ID NO：139]
CDRL3：ATWDDSLSGPV[SEQ ID NO：140]
抗体克隆：6C11
6C11-VH[SEQ ID NO：18]
Figure RE-GSB0000199440020000285
6C11-VL[SEQ ID NO：42]
Figure RE-GSB0000199440020000286
CDR区
CDRH1：DYGMS[SEQ ID NO：141]
CDRH2：AISGSGSSTYYADSVKG[SEQ ID NO：142]
CDRH3：GDIDYFDY[SEQ ID NO：143]
CDRL1：TGSSSNFGAGYDVH[SEQ ID NO：144]
CDRL2：ENNKRPS[SEQ ID NO：145]
CDRL3：AAWDDSLNGPV[SEQ ID NO：146]
抗体克隆：6C12
6C12-VH[SEQ ID NO：19]
Figure RE-GSB0000199440020000291
6C12-VL[SEQ ID NO：43]
Figure RE-GSB0000199440020000292
CDR区
CDRH1：SYGMH[SEQ ID NO：147]
CDRH2：VISYDGSNKYYADSVKG[SEQ ID NO：148]
CDRH3：ERRDAFDI[SEQ ID NO：149]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQ ID NO：150]
CDRL2：SDNQRPS[SEQ ID NO：151]
CDRL3：ATWDSDTPV[SEQ ID NO：152]
抗体克隆：6D01
6D01-VH[SEQ ID NO：20]
Figure RE-GSB0000199440020000293
6D01-VL[SEQ ID NO：44]
Figure RE-GSB0000199440020000294
CDR区
CDRH1：SYGMH[SEQ ID NO：153]
CDRH2：VISYDGSNKYYADSVKG[SEQ ID NO：154]
CDRH3：DHSAAGYFDY[SEQ ID NO：155]
CDRL1：SGSSSNIGSNTVN[SEQ ID NO：156]
CDRL2：GNSIRPS[SEQ ID NO：157]
CDRL3：ASWDDSLSSPV[SEQ ID NO：158]
抗体克隆：6G03
6G03-VH[SEQ ID NO：21]
Figure RE-GSB0000199440020000295
6G03-VL[SEQ ID NO：45]
Figure RE-GSB0000199440020000296
CDR区
CDRH1：SYGMH[SEQ ID NO：159]
CDRH2：GISWDSAIIDYAGSVKG[SEQ ID NO：160]
CDRH3：DEAAAGAFDI[SEQ ID NO：161]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQ ID NO：162]
CDRL2：GNTDRPS[SEQ ID NO：163]
CDRL3：AAWDDSLSGPVV[SEQ ID NO：164]
抗体克隆：6G08
6G08-VH[SEQ ID NO：22]
Figure RE-GSB0000199440020000301
6G08-VL[SEQ ID NO：46]
Figure RE-GSB0000199440020000302
CDR区
CDRH1：SYGIS[SEQ ID NO：165]
CDRH2：GISGSGGNTYYADSVKG[SEQ ID NO：166]
CDRH3：SVGAYANDAFDI[SEQ ID NO：167]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQ ID NO：168]
CDRL2：GDTNRPS[SEQ ID NO：169]
CDRL3：AAWDDSLNGPV[SEQ ID NO：170]
抗体克隆：6G11
6G11-VH[SEQ ID NO：23]
Figure RE-GSB0000199440020000303
6G11-VL[SEQ ID NO：47]
Figure RE-GSB0000199440020000304
CDR区
CDRH1：SYGMH[SEQ ID NO：171]
CDRH2：VISYDGSNKYYADSVKG[SEQ ID NO：172]
CDRH3：ELYDAFDI[SEQ ID NO：173]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQ ID NO：174]
CDRL2：ADDHRPS[SEQ ID NO：175]
CDRL3：ASWDDSQRAVI[SEQ ID NO：176]
抗体克隆：6H08
6H08-VH[SEQ ID NO：24]
Figure RE-GSB0000199440020000305
6H08-VL[SEQ ID NO：48]
Figure RE-GSB0000199440020000306
CDR区
CDRH1：NYGMH[SEQ ID NO：177]
CDRH2：VISYDGSNKYYAD SVKG[SEQ ID NO：178]
CDRH3：EYKDAFDI[SEQ ID NO：179]
CDRL1：TGSSSNIGSNTVN[SEQ ID NO：180]
CDRL2：DNNKRPS[SEQ ID NO：181]
CDRL3：QAWGTGIRV[SEQ ID NO：182]
抗体克隆：7C07
7C07-VH[SEQ ID NO：25]
Figure RE-GSB0000199440020000311
7C07-VL[SEQ ID NO：49]
Figure RE-GSB0000199440020000312
CDR区
CDRH1：SYGMH[SEQ ID NO：183]
CDRH2：VISYDGSNKYYADSVKG[SEQ ID NO：184]
CDRH3：EFGYIILDY[SEQ ID NO：185]
CDRL1：SGSSSNIGSNTVN[SEQ ID NO：186]
CDRL2：RDYERPS[SEQ ID NO：187]
CDRL3：MAWDDSLSGVV[SEQ ID NO：188]
抗体克隆：4B02
4B02-VH[SEQ ID NO：26]
Figure RE-GSB0000199440020000313
4B02-VL[SEQ ID NO：50]
Figure RE-GSB0000199440020000314
CDR区
CDRH1：NHGMH[SEQ ID NO：189]
CDRH2：VISYDGTNKYYADSVRG[SEQ ID NO：190]
CDRH3：ETWDAFDV[SEQ ID NO：191]
CDRL1：SGSSSNIGSNNAN[SEQ ID NO：192]
CDRL2：DNNKRPS[SEQ ID NO：193]
CDRL3：QAWDSSTVV[SEQ ID NO：194]
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂是能够与如之前的实施方案中所限定的药剂竞争阻止或减少FcγRIIb与抗体分子 的Fc结构域结合的药剂。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂阻止或减少FcγRIIb信号转导。
Fc受体可以经由细胞信号转导来调节细胞行为。对于细胞生物学领域的技术人员来说 将已知的是，哪些下游细胞信号转导调节因子由FcγRIIb信号转导所激活和/或失活以及使 那些细胞信号转导调节因子激活和/或失活将对细胞有哪些影响。
通过“所述药剂阻止或减少FcγRIIb信号转导”，我们包括在FcγRIIb与Fc结构域结合时 阻止或减少FcγRIIb信号转导；和/或在FcγRIIb不与Fc结构域结合时阻止或减少FcγRIIb信号 转导。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂阻止或减少抗体分子被靶细胞内化。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述细胞表面抗原选自包括以下各项的组：CD19：或其部分；CD20：或其部分；CD40： 或其部分；CD52：或其部分；Thy-1(即CD90、分化簇90(Biofactors.2009年5月-6 月；35(3)：258-65))：或其部分；Ly-6(即淋巴细胞抗原6(Mol Biol Rep.2009年4 月；36(4)：697-703))：或其部分；CD59(即补体调节蛋白(Mol Immunol.2007年1 月；44(1-3)：73-81))：或其部分；Fas(即FS7相关细胞表面抗原、CD95、APO-1或 TNFRSF6(Adv Exp Med Biol.2009；647：64-93))：或其部分；EGFR(即表皮生长因子 受体(FEBS J.2010年1月；277(2)：301-8))：或其部分；Her2(即人类表皮生长因子受体2 (Clin Breast Cancer.2008年10月；8(5)：392-401))：或其部分；CXCR4(即趋化因子受 体4(Biochim Biophys Acta.2007年4月；1768(4)：952-63))：或其部分；HLA分子(即人 类白细胞抗原分子(Korean J Lab Med.2010年6月；30(3)：203))：或其部分；GM1(即神 经节苷脂、单唾液酸四己糖神经节苷脂(J LipidRes.2010年9月；51(9)：2731-8))：或其部 分；CD22(即Cheson(2008)NEJM 359(6)：613-26)：或其部分；CD23(Cheson， 2008)：或其部分；CD80(Cheson，2008)：或其部分；CD74(Cheson，2008)：或其部 分；DRD(Cheson，2008)：或其部分。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如(i)中所限定的抗体分子与CD20特异性结合。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如(i)中所限定的抗体分子是I型CD20抗体。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如(i)中所限定的抗体分子是II型CD20抗体。
存在两种类型的CD20抗体分子，它们首先在2003年由本申请的发明人限定为落入不 同的分组中(Cragg等，2003，《由抗CD20 mAb引起的补体介导的裂解与分离到脂筏中相关 (Complement-mediated lysis by anti-CD20 mAb correlates with segregationinto lipid rafts)》， Blood 101：1045-1052；以及Chan等，2003，《CD20诱导的淋巴瘤细胞死亡不依赖于胱天蛋 白酶和它重新分布到triton X-100不溶性膜筏中(CD20-inducedlymphoma cell death is independent of both caspases and its redistributioninto triton X-100 insoluble membrane rafts)》， Cancer Res 63：5480-5489)，然后随后在2004年被限定为I型和II型抗体分子(Cragg和 Glennie 2004，《抗体特异性控制抗CD20试剂的体内效应机制(Antibody specificity controls in vivo effectormechanisms of anti-CD20 reagents)》，Blood 103：2738-2743)。最初，其基础 是抗CD20mAb基于它们根除淋巴瘤异种移植物的能力分为两种不同类型的试剂：I型(例 如利妥昔单抗和1F5)利用补体；并且II型(例如B1)不利用补体。这两种类型的抗体分子 均提供优良的存活期延长作用，但是通过施用CVF耗尽补体活性会显著地减弱利妥昔单抗 和1F5的效力，但是对B1的活性没有影响。这些结果清楚地证实不同的CD20抗体分子在体 内执行不同的效应机制。此外，它们完全符合先前的研究，所述研究证实利妥昔单抗和 1F5由于使CD20易位到靶细胞膜中的脂筏而能够有效地激活补体，而B1型抗体分子却不能 做到这样(Cragg等，2003，《由抗CD20 mAb引起的补体介导的裂解与分离到脂筏中相关 (Complement-mediated lysis by anti-CD20 mAb correlates with segregation into lipidrafts)》， Blood 101：1045-1052)。与抗体分子结合补体以及诱导CD20移动到脂筏中的能力有很好的 相关性(Cragg等，2003，《由抗CD20 mAb引起的补体介导的裂解与分离到脂筏中相关(Complement-mediated lysis by anti-CD20 mAb correlates with segregationinto lipid rafts)》， Blood 101：1045-1052；以及Cragg和Glennie 2004，《抗体特异性控制抗CD20试剂的体内效 应机制(Antibody specificity controls in vivo effectormechanisms of anti-CD20 reagents)》， Blood 103：2738-2743)。因此，I型和II型的性质可以由它们使CD20移动到脂筏中的能力来 限定。这可以如下文所示来测定。还与II型抗体分子能够引出更强效的同型粘附并且引导 细胞死亡存在相关性，但是这些不能被单独用于限定I型或II型抗体分子(不同于Tx-100筏 测定；参见下文)。
因此，各种抗CD20抗体分子根据它们使CD20在质膜中重新分布的能力以及它们在各 种效应测定中的活性而被分为I型(例如利妥昔单抗、奥法木单抗)或II型(例如托西莫单 抗(B1)、GA101以及11B8)(Weng和Levy 2009.《抑制性IgG Fc受体FcγRIIb的遗传多 态性与接受利妥昔单抗治疗的患有滤泡性淋巴瘤的患者的临床结果无关(Geneticpolymorphism of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIb is not associatedwith clinical outcome in patients with follicular lymphoma treated withrituximab)》，Leuk Lymphoma 50：723-727；Chan等，2003.《CD20诱导的淋巴瘤细胞死亡不依赖于胱天蛋白酶和它重新分 布到triton X-100不溶性膜筏中(CD20-induced lymphomacell death is independent of both caspases and its redistribution into tritonX-100 insoluble membrane rafts)》，Cancer Res 63：5480-5489；以及Cragg和Glennie2004.《抗体特异性控制抗CD20试剂的体内效应机制 (Antibody specificity controlsin vivo effector mechanisms of anti-CD20 reagents)》，Blood 103：2738-2743)。I型(例如利妥昔单抗、奥法木单抗)抗CD20抗体分子诱导CD20重新 分布到大洗涤剂抗性微结构域(筏)中，而II型(托西莫单抗样)抗CD20单克隆抗体则不 诱导(Beer等，2010.Seminarsin Haematology 47(2)：第107-114页)。
如上文所述，抗CD20抗体分子可以根据它们是否使CD20重新分布到脂筏中而被指定 为I型或II型。这是通过Tx-100不溶性测定或通过蔗糖密度梯度分离和蛋白质印迹法来进行 的。这两种方法在Cragg等，Blood 2003中描述如下：
1.通过Triton X-100不溶性评估筏缔合抗原
作为对筏微结构域中抗原存在的快速评估，我们利用基于在低温下Triton X-100不溶 性的流式细胞术方法。简单地说，将细胞在RPMI/1％BSA中洗涤并且以2.5×106个/毫升重 悬。然后将细胞在37℃与10μg/ml的与FITC缀合的mAb一起孵育15分钟，在冷 PBS/1％BSA/20mM叠氮化钠中洗涤，然后将样品分成两半。将一半维持在冰上以允许计 算100％表面抗原水平，而将另一半在冰上用0.5％Triton X-100处理15分钟以确定保留在不 溶性筏级分中的抗原的比例。然后在测定的整个其余部分中将细胞维持在4℃，在 PBS/BSA/叠氮化物中洗涤一次，重悬并且通过流式细胞术评估，如上文所详述。使用间 接的检测方法获得类似的结果。为了确定靶抗原的筏缔合的组成水平，首先将细胞在冰上 用0.5％TritonX-100处理15分钟并且在PBS/BSA/叠氮化物中洗涤，之后结合FITC标记的 mAb。为了评估是否有更多的抗原可以通过另外的交联移动到Triton X-100不溶性级分 中，如前所述将细胞与FITC-mAb一起孵育，洗涤，然后分成四份。将这些样品中的两份 与山羊抗小鼠Ig F(ab′)2片段一起在冰上孵育15分钟。在洗涤后，将交联样品中的一份和非 交联样品中的一份在Triton X-100中裂解并且洗涤，如上文所详述，之后进行流式细胞 术。
2.蔗糖密度梯度分离和蛋白质印迹法——脂筏级分的制备和蛋白质印迹法
在37℃将单克隆Ab(1μg/106个细胞)添加到细胞中。在20分钟孵育之后，使细胞沉淀并且在冰冷的含1.0％Triton X-100的MES缓冲盐水(25mM MES(pH 6.5)、150mM NaCl、1mM苯甲基磺酰氟、5μg/ml抑肽酶、5μg/ml亮肽素、10mM EDTA)中裂解。然 后通过蔗糖密度梯度离心制备脂筏级分。简单地说，将裂解物与等体积的含80％蔗糖的裂 解缓冲液混合，用不连续的5％-30％蔗糖密度梯度覆盖，然后以200,000×g离心16小时。收 集级分(0.5ml)并且通过蛋白质印迹法分析。将每一个级分的15ml等分试样在2×上样缓 冲液中1∶1稀释，加热到95℃，持续5分钟并且在15％SDS-PAGE凝胶上分离，之后转移到 PVDF膜上并且与一抗(例如小鼠抗CD20、用于检测CD20的克隆7D1或用于鉴定筏级分的 抗Lyn兔多克隆抗血清(英国的Serotec公司(Serotec，UK)))孵育，继而与HRP缀合的 二抗(阿默舍姆生物科技(英国)有限公司(Amersham Biosciences UK Ltd))一起孵 育。使用ECL+plus(阿默舍姆生物科技(英国)有限公司)将印迹可视化。
抗CD20抗体分子可能需要CD20的大环中的AxP基序(奥法木单抗和其它Genmab公司 抗体则不需要)。然而，(Niederfellner，G等，2011.Blood 118，358-367)表明与I型相比， II型抗体分子与CD20环的略微不同的区域结合。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中I型CD20抗体是利妥昔单抗、或利妥昔单抗生物仿制药、或奥法木单抗。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中II型CD20抗体是奥比妥珠单抗、或托西莫单抗。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如(i)中所限定的抗体分子是CD52抗体。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述CD52抗体是阿仑单抗。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种试剂盒，其中所述组合物或试剂盒包含一 种或多种治疗剂。
优选地，本发明提供了一种用途，其中所述组合物还包含一种或多种治疗剂。
优选地，本发明提供了一种方法，其中还向所述受试者施用一种或多种治疗剂。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述受试者患有难治性癌症或复发性癌症，或所述受试者患有难治性癌症和复发性癌症。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述受试者患有难治性慢性淋巴细胞性白血病或复发性慢性淋巴细胞性白血病，或所述受试者患有难治性慢性淋巴细胞性白血病和复发性慢性淋巴细胞性白血病。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其基本上如本文参考说明书、和/或实施例、和/或附图所述和/或要求保护。
本说明书中显然是先前已公开的文件的列举或论述不应当一定被视为承认所述文件是 现有技术的一部分或是公知常识。
附图说明
现在将参考以下附图描述体现本发明的某些方面的优选的非限制性实施例：
图1(1/2)：能够区分hFcγRIIB和hFcγRIIA的mAb的产生和表征。(a)筛选与 hFcγRIIB或/和hFcγRIIA特异性结合的scFv克隆。黄点表示被选用于转化成全长IgG的对hFcγRIIB具有特异性的克隆。(b)hFcγRIIB mAb的结合分析。评估hFcγRIIB mAb与 hFcγRIIB转染的细胞(红线)或hFcγRIIA转染的细胞(蓝线)的结合。在IC(3nM，绿 线)存在下评估相同的mAb与hFcγRIIB转染的细胞的结合，从而表明mAb能够与IC竞 争结合表达hFcγRIIB的细胞。该图示出了来自一种代表性hFcγRIIB克隆的数据。(c) 通过流式细胞术确定的所产生的mAb对PBMC群体的结合谱。hFcγRIIA特异性mAb显 示出对单核细胞和中性粒细胞的强结合，而hFcγRIIB特异性mAb主要与B细胞结合，除 了还与单核细胞和中性粒细胞结合的6A09以外，因此6A09可能对hFcγRIIA和hFcγRIIB 具有双重特异性。(d)mAb与B细胞的剂量依赖性结合。添加0.1μg/ml、1μg/ml或10 μg/ml的mAb并且通过流式细胞术确定染色的强度。(e)hFcγRIIB mAb的亲和力。通过 表面等离子体共振评估所选择的hFcγRIIB特异性mAb(7C07、5C04、5C05)与各种浓度 的hFcγRIIB融合蛋白(0nM(红色)、0.16nM(绿色)、0.8nM(蓝色)、4nM(粉红 色)、20nM(青绿色)、以及100nM(棕色))的结合。传感图示出了每一种mAb的 典型结合响应。从1∶1结合模型计算KD值(参见表2)。
图1(2/2)：hFcγRII mAb(AT10)的治疗作用以及能够区分hFcγRIIB和 hFcγRIIA的特异性mAb的产生。(顶部)如箭头所示对异种移植有Daudi细胞(s.c.) 的SCID小鼠(5只/组)进行处理(i.p.)。绘制平均肿瘤重量±SEM的图并且使用非配对 t检验分析；p值比较单独的利妥昔单抗(Rit)处理组与Rit+AT10处理组 (**p≤0.005)。代表性数据(n＝2)。(底部)hFcγRIIB mAb与hFcγRIIB转染的细胞 (红线)或hFcγRIIA转染的细胞(蓝线)的结合以及对IC与hFcγRIIB转染的细胞的结 合的mAb依赖性抑制(绿线)。还参见图7和图8以及表6。
图2：hFcγRIIB mAb能够阻断利妥昔单抗(Rit)与靶细胞表面上的FcγRIIB的结合。(a)hFcγRIIB特异性mAb引起hFcγRIIB ITIM磷酸化的能力。在37℃将Raji细胞 用N297Q hFcγRIIB特异性mAb(10μg/ml)处理30分钟，之后裂解并且通过免疫印迹法 评估hFcγRIIB的磷酸化状态(pFcγRIIB)。分别使用hIgG1同种型对照(iso ctrl)和Rit 作为阴性对照和阳性对照。探测α-微管蛋白作为上样对照。(b)hFcγRIIB特异性mAb阻 断由Rit诱导的hFcγRIIB ITIM磷酸化的能力。将Raji细胞用N297Q hFcγRIIB mAb(10 μg/ml)预处理10分钟，之后在37℃添加10μg/ml的Rit，持续30分钟。将经过处理的细 胞裂解，并且通过免疫印迹法评估pFcγγRIIB和α-微管蛋白，如上所述。示出了至少3次 独立实验的代表性印迹。(c)hFcγRIIB特异性mAb阻断由Rit诱导的内化的能力。在 37℃将载体对照或hFcγRIIB转染的Ramos细胞用hFcγRIIB mAb的WT或N297Q变体 (10μg/ml)以及AF488标记的Rit(5μg/ml)处理所示的时间点。使用猝灭测定确定Rit 的内化并且表示为表面CD20表达的％。使用AF488标记的托西莫单抗作为阴性对照，这 是因为它在结合CD20后不显著内化 22 。示出了3次独立实验的平均值±SD。(d)mAb 组阻断Rit内化的能力(c中所示)与它们的相对排序亲和力有关(R2＝0.78)。(e)mAb 组阻断Rit内化的能力(c中所示)与它们阻断Rit诱导的hFcγRIIB磷酸化的能力(b)有 关，如通过Image J光密度测定软件所评估(R2＝0.79)。
图3(1/2)和图3(2/2)：hFcγRIIB mAb 6G11在体外具有强效的细胞毒性活性并且能够阻断Rit与靶CLL细胞表面上的hFcγRIIB的结合。图3(1/2)中，(a)在多种 冷冻组织上评估的hFcγRIIB mAb 7C07和6G11的IHC分析。6G11显示出与人类脾脏中 的细胞的非常特异性的结合，对非淋巴细胞几乎不存在背景染色，并且对来自食蟹猴或小 鼠的脾组织几乎没有染色，而7C07显示出不仅如所预期与淋巴细胞结合，而且还与人类 和食蟹猴组织的内皮内层结合。(b-e)在测量ADCC(b)、PCD(c)以及ADCP(d) 的测定中6G11对原代患者CLL细胞的细胞毒性能力。用6G11(10μg/ml)调理CLL细 胞；在每一个测定中添加Rit(10μg/ml)作为阳性对照。每一个点表示来自一名CLL患 者的一式三份样品的平均值。(e)使用带有高亲和力hFcγRIIIA等位基因变体或低亲和 力hFcγRIIIA等位基因变体(分别是158F和158V)的效应细胞进行的ADCC测定。在这 两种情况下，与Rit相比，6G11在诱导ADCC方面是更强效的。该图示出了来自使用三 个不同的CLL供体进行的三次独立实验的平均值±SD。(f)6G11减弱Rit从CLL细胞表 面内化的能力。在37℃将六个CLL样品用WT mAb(左图)或N297Q mAb(右图)iso ctrl或6G11(10μg/ml-20μg/ml)以及AF488标记的Rit(5μg/ml)处理最多6小时。如 上评估Rit的内化，表示为表面CD20表达％。(g)6G11保留在CLL细胞表面的能力。 将六个CLL样品用WT 6G11或N297Q 6G11(10μg/ml)处理最多6小时并且通过用抗 hF(ab′)2-PE染色间接定量hFcγRIIB表面表达。将值相对于在时间零点时在冰上进行的染 色归一化并且表示为表面hFcγRIIB表达％。数据表示为箱须图(box and Whiskers plot)；p值比较如所示的组(*p≤0.05)。图3(2/2)中，(h和i)用6G11增强 ADCP。将CFSE标记的CLL细胞在培养物中用Rit与N297Q iso ctrl或6G11的组合调理 3小时，洗涤并且以5∶1的比率添加到MDM中。在共培养后，使用-CD206-APC染色鉴定 MDM，并且通过流式细胞术分析结果。代表性点图示于(h)中并且被计算为占MDM的 比例的已经吞噬CFSE+ve CLL细胞的双阳性事件的％示于(i)中。(j)用6G11增强 ADCC。将CLL细胞用Rit与N297Q iso ctrl或6G11的组合调理3小时，然后与NK细胞 共培养。每一个点表示来自一个原代CLL样品的三份的平均值。经由配对t检验(b、c、 d、e、i以及j)t检验来分析数据；p值比较如所示的组(*p≤0.05；**p≤0.005；****p≤0.0001)。
图4(1/2)：hFcγRIIB mAb 6G11在体内具有活性并且增强CD20 mAb对B细胞的 消耗。(a和b)6G11在体内除去hFcγRIIB+ve靶细胞的能力。将分别用高水平的CFSE或 低水平的CFSE标记的hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-靶C57BL/6脾细胞和mFcγRII-/-非靶C57BL/6 脾细胞过继转移(i.v.)到WT或γKO C57BL/6小鼠体内。在24小时后，小鼠接受所示的 WT或N297Q 6G11 mAb(i.v.)；并且在16小时后，分析循环细胞(a)或脾脏细胞 (b)以确定保留的靶与非靶的比率。将数据归一化以给出1.0的ctrl(NT)靶∶非靶比 率。每一个点描绘了来自单个小鼠的结果，平均比率由水平线(±SEM)指示。数据是从 至少2次独立实验合并的。(c-e)6G11在体内增强Rit除去靶细胞的能力的能力。(c) 如上将分别用高水平的CFSE或低水平的CFSE标记的hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-靶 C57BL/6脾细胞和mFcγRII-/-非靶C57BL/6脾细胞注射(i.v.)到WT C57BL/6接受体小鼠 体内。在24小时后，小鼠接受单独的所示mAb或所示mAb的组合(5μg-10μg；i.v.)； 并且在16小时后，分析脾脏以确定靶与非靶的比率并且归一化，如上文所述。数据是从 至少3次独立实验合并的。(d)如上将CFSE+ vehCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-靶 C57BL/6脾细胞和mFcγRII-/-非靶C57BL/6脾细胞注射(i.v.)到hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/- C57BL/6接受体小鼠体内。在第1天和第2天，小鼠接受WT 6G11(500μg；i.v./i.p.)， 继而在第2天接受Rit(5μg-50μg；i.v.)；并且在16小时后，分析脾脏以确定靶与非靶 的比率并且归一化，如上所述。数据是从至少3次独立实验合并的。(e)在第0天 hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-C57BL/6小鼠接受Rit或6G11(500μg)或250μg的每一 种mAb的组合(i.v.)并且随时间推移评估循环B细胞数，如所示。条柱指示来自至少2 次独立实验的最多12只小鼠/组中相对于处理前水平归一化的循环B细胞的％的平均值 ±SEM。进行双因素方差分析统计检验以比较处理组；p值比较如所示的组(**p≤0.01；***p≤0.001)。(f-g)6G11在体内增强GA101gly除去靶细胞的能力的能力。将CFSE+ve hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-靶C57BL/6脾细胞和mFcγRII-/-非靶C57BL/6脾细胞注射 (i.v.)到WT接受体小鼠体内，随后在第1天用单独的GA101gly或6G11或它们的组合 (0.2μg；i.v.)处理，并且在16小时后，分析脾脏以确定靶与非靶的比率，并且如上文所详述来表示。数据是从3次独立实验合并的。(g)将CFSE+vehCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-靶C57BL/6脾细胞和mFcγRII-/-非靶C57BL/6脾细胞注射(i.v.)到hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-接受体小鼠体内，随后在第1天和第2天用WT iso ctrl或6G11(500μg；i.p.) 处理，继而在第2天用GA101gly(1μg；i.v.)处理，并且在16小时后，分析脾脏以确定 靶与非靶的比率，并且如上文所详述来表示。进行单因素方差分析统计检验以比较处理组 与NT/isoctrl或CD20 mAb/6G11单独处理组(a-d和f-g)；p值比较如所示的组 (*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001)。
图4(2/2)：hFcγRIIB mAb 6G11在体内具有活性并且增强CD20 mAb对B细胞的 消耗。在第0天hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠接受Rit±WT或N297Q 6G11(20 mg/kg)或10mg/kg的每一种mAb的组合并且随时间推移评估循环B细胞数。(顶部) 分析循环B细胞的代表性点图，指示了处理前和在mAb注射后的第2天。右上象限中的 数字指示与处理前水平相比的B细胞％。(底部)左侧图表指示Rit±WT 6G11对循环B 细胞的消耗；顶部右侧图表指示Rit±WT或N297Q 6G11对循环B细胞的消耗；下部右侧 图表指示Rit(m2a；4mg/kg)±6G11(mIgG1；20mg/kg)对循环B细胞的消耗。示出了 相对于处理前水平归一化的处理后循环B细胞％的平均值±SD；最多12只小鼠/组，从至 少2次独立实验合并。进行双因素方差分析。还参见图15。
图5(1/2)：hFcγRIIB mAb 6G11在体内增强Rit对患者CLL细胞的消耗。(a-b) 将原代患者CLL细胞移植到NOD/SCID小鼠体内并且在脾中形成不同的增殖簇，类似于 在人类中所观测到的那样。对小鼠进行辐照，之后静脉内接种6-10×107个原代患者CLL 细胞。在注射后4天-5天时，取出脾脏，制备切片并且(a)针对hCD19(红色)或Ki67 (绿色)的存在进行染色并且通过免疫荧光评估或(b)针对hCD20和Ki67的存在进行 染色并且通过IHC评估。(c)在注射有人类CLL细胞的小鼠中Rit、6G11或组合的抗肿 瘤活性。如上将NOD/SCID小鼠用原代人类CLL细胞接种，在接种之后4天-5天时，用 1mg/kg-10mg/kg的hCD20 mAb、hFcγRII mAb或这两者处理小鼠。在2天-3天后，小鼠 接受第二次注射，并且在最后一次处理之后2天-3天时处死，对保留在脾中的人类CLL 细胞的％进行计数并且相对于在用同种型对照mAb处理后存在的比例归一化。以这种方 式评估来自10名不同患者的CLL样品。每一个点代表一只小鼠。(d和e)然后根据上文 在(c)中所呈现的数据计算完全响应者，即在脾脏中没有检测到CLL细胞的小鼠的比例 (d)以及目标响应者，即CLL细胞有≥75％减少的小鼠的比例(e)。(f-g)难治性患者 CLL细胞在体内对处理的响应。如(c-e)中，将来自先前被指定为难治的患者(n＝4；参 见表4)的CLL细胞接种，处理并且评估。(f)指示了原始数据，其中各点代表单个小 鼠，并且(g)指示在Rit难治性患者中目标响应者的出现率。进行单因素方差分析以比较 处理组；p值比较如所示的组(*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001)。
图5(2/2)：hFcγRIIB mAb 6G11在体内增强治疗性mAb对正常和恶性靶细胞的消耗。(A-B)通过免疫荧光(A)或通过IHC(B)评估被移植有原代患者CLL细胞的 NOD/SCID小鼠的脾脏；ctrl：没有一级mAb。(C)将接受人类CLL细胞(n＝11名患 者)异种移植的小鼠用1mg/kg-10mg/kg的hCD20 mAb(Rit)、hFcγRIIB mAb (6G11)、或这两者处理，并且对保留在脾脏中的CLL细胞％进行计数并且相对于在用 iso ctrl处理后的比例归一化。(D)如(C)中对接受来自先前被指定为难治的患者 (n＝4)的CLL细胞异种移植的小鼠进行处理和评估。(E)将CFSE+hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-(靶)脾细胞和mFcγRII-/-(非靶)脾细胞注射(i.v.)到WT小鼠 体内并且用单独的GA101gly或6G11或它们的组合(0.008mg/kg)处理并且评估在脾脏中 的除去作用，如前所述。数据是从2次-3次独立实验合并的。(F)如(E)中将CFSE+ hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-(靶)脾细胞和mFcγRII-/-(非靶)脾细胞注射到 hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-接受体小鼠体内并且用WT iso ctrl或6G11(20mg/kg)处理，继而 用GA101gly(0.04mg/kg)处理并且分析。(G)如(C)中将移植有CLL细胞的小鼠 (n＝4)用GA101(0.2mg/kg)、6G11(1mg/kg)、或这两者处理并且评估。(H)如 (C)中将移植有CLL细胞的小鼠(n＝3)用阿仑单抗(Alem；1mg/kg)、6G11(1 mg/kg)或这两者处理并且评估。(C-D和G-H)饼分图代表在mAb治疗后NR(黑 色)、OR(蓝色)以及CR(绿色)的带有原代患者CLL的小鼠的数目，如表1中所限 定。(C-H)每一个点描绘了单个小鼠，平均比率由水平线指示。(E和F)使用单因素 方差分析以及(C-D和G-H)置换统计检验来分析数据。还参见图16和图17以及表8和 表4。
图6(1/2)：hFcγRIIB mAb 6G11在临床前体内和体外系统中被耐受并且不产生毒性。(a-d)6G11在单次施用后的体内功效和半衰期(图17a)。向年龄和性别匹配的 hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠(6只-7只小鼠/组)注射所示浓度的WT 6G11 mAb(i.v.或 i.p.)。(a)通过流式细胞术随时间推移评估循环B细胞的％直到第7天为止。(b)在第 7天，将小鼠处死并且通过流式细胞术定量脾脏中B细胞的数目(表示为占脾脏淋巴细胞 的％)。(c)通过MSD评估在7天时间段内血清6G11 mAb的浓度和(d)MAHA滴度 (平均值±SEM)，如材料和方法部分中所述。(e-f)在多次施用后6G11的体内功效和 半衰期。在第0天向年龄和性别匹配的hFcγRIIB Tg×mFcγRII-/-小鼠(6只小鼠/组)或 mFcγRII-/-小鼠(3只小鼠/组)注射10mg/kg的WT 6G11 mAb(i.v.)，继而在第3天、第 7天以及第10天腹膜内注射相同的剂量。在10天后(第24天)将小鼠处死并且针对毒性 评估器官(图17c)。(e)随时间推移对血液进行采样并且通过流式细胞术定量循环B 细胞(平均值±SD)。(f)如(d)中评估针对6G11 mAb的MAHA滴度(平均值 ±SEM)。(g)使用高密度预培养的人类PBMC的体外细胞因子响应。将1×107个/ml的 人类PBMC预培养48小时，之后添加PBS(NT)或10μg/ml的iso ctrl或6G11的WT或 N297Q变体，持续48小时。收集上清液并且通过MSD评估IFN-γ、IL-6、IL-10以及 TNF-α的浓度。使用最佳浓度和亚最佳浓度(分别是1μg/ml和0.02μg/ml)的CD3mAb (OKT3)作为阳性对照。数据代表了使用来自3个独立的健康供体的PBMC进行的3次 独立实验(平均值±SEM)。
图6(2/2)：hFcγRIIB mAb 6G11被良好耐受并且不产生毒性。进行体外全血消耗测定来评估Rit±WT或N297Q 6G11在消耗hFcγRIIB+血液B细胞(左侧图表)、单核细 胞(中间图表)或中性粒细胞(右侧图表)方面的效力。示出了平均值(水平线)，每一 个点代表单个供体。还参见图14、图18以及图19和表7。
图7：hFcγRII mAb(AT10)在体内增强Rit对恶性B细胞的清除。(a)将以1∶1比 率混合在基质胶中的5×106个Daudi细胞或(b)Raji细胞注射(s.c.)到SCID小鼠的侧腹 中(最多5只小鼠/组)。随后从第7天开始每周一次向荷瘤小鼠注射(i.p.)所示的mAb，最多4次，如X轴(箭头)上所示。随时间推移监测肿瘤生长并且使用以下方程式 估算：[重量＝(长度×宽度2)/2]。绘制平均肿瘤体积±测量的SE的图。示出了来自2次独立 实验的代表性数据。(c)将2.5×106个Raji细胞注射(i.v.)到SCID小鼠体内(6只小鼠/ 组)。如上，随后从第7天开始，每周一次向荷瘤小鼠注射(i.p.)所示的mAb，最多4 次。随时间推移监测小鼠并且在产生终末肿瘤发展的体征时处死。使用非配对t检验分析 数据；p值比较如所示的组(*p≤0.05；**p≤0.005)。
图8：所产生的克隆对hFcγRIIB具有高度特异性。(a)hFcγRIIA氨基酸(aa)序列(顶部)与高度同源的hFcγRIIB蛋白质(底部)相比的比对。差异用红色突出显示，指 示了IgG结合位点。(b-d)将hFcγRIIB特异性mAb与PBMC一起孵育，然后通过流式 细胞术评估与CD14+ve单核细胞(b)、CD19+veB细胞(c)或CD3+veT细胞(d)的结 合。除了2B08和2E08之外，对于所有的克隆均观测到与血液中的CD19+veB细胞的高度 和剂量依赖性结合(c)；而与CD14+ve单核细胞的结合则相反(b)。克隆6A09对单核 细胞和B细胞这两者显示出交叉反应性。(d)没有mAb对CD3+veT细胞染色。
图9：hFcγRIIB mAb的WT和N297Q变体这两者同样能够阻断Rit从靶细胞表面的内化。(A-B)WT和/或N297Q(NQ)hFcγRIIB特异性mAb(克隆6G11和6G08)分别 引起分离的人类扁桃体B细胞(A)和原代外周血液单核细胞(B)上hFcγRIIB ITIM磷 酸化(pFcγRIIB)的能力。使用α-微管蛋白、GAPDH以及hFcγRIIB作为上样对照，如所 示；示出了代表性印迹。(C)在37℃将hFcγRIIB转染的Ramos细胞用所选择的 hFcγRIIB mAb(代表拮抗剂和激动剂的选择)的WT或N297Q变体(10μg/ml)或同种型 对照(iso ctrl)以及AF488标记的Rit(Rit；5μg/ml)处理所示的时间点。使用猝灭测定 确定Rit的内化并且表示为表面CD20表达的百分比。使用AF488标记的托西莫单抗作为 阴性对照，这是因为它在结合CD20后不显著内化 22 。示出了3次独立实验的平均值 ±SD。
图10：hFcγRIIB mAb在体外的ADCC活性。(a)将用hFcγRIIB mAb预调理的 Raji细胞与从健康供体的外周血液中纯化的NK细胞一起共培养并且评估ADDC活性，如 材料和方法部分中所述。该图示出了4次独立实验的平均值±SD。(b)基于A中的结 果，在一定浓度范围内进一步测试七种hFcγRIIB特异性mAb的ADCC活性。包括Rit (Rit)作为阳性对照。所有的hFcγRIIB mAb均被证实比Rit表现得更有利，7C07和 6G11是表现最好的mAb，甚至是在更低的浓度下也是如此。示出了2次代表性实验中的 一次；数据点代表来自一式三份样品的平均值±SD。
图11：用WT或N297Q hFcγRIIB mAb染色的人类组织的IHC。将7C07或6G11的 WT或N297Q变体添加到从多种组织获得的新鲜冷冻切片中。使用酪胺信号放大(TSA； 珀金埃尔默公司(PerkinElmer))放大在没有过氧化氢封闭的情况下检测组织反应性。 (a)人类脾脏的7C07染色。显示7C07对窦状隙和血管非特异性染色。(b)将6G11的 WT或N297Q变体添加到人类脾脏切片中并且评估结合，如上文所详述。显示这两种形式 同样对该组织中的小淋巴细胞染色。(c)对来自如切片上所示的多种人类组织的冷冻保 存的横切片进行6G11(1μg/ml)染色，继而进行TSA检测。没有观测到反应性。
图12：无糖基化的N297Q 6G11变体缺乏内在的Fc依赖性效应活性并且不能在体外诱导ADDC。将原代人类CLL细胞用6G11的WT或N297Q型式或WT hIgG1同种型对 照(10μg/ml)调理，然后与NK92细胞共培养，并且评估ADDC活性，如材料和方法部 分中所述。不同于WT6G11，N297Q 6G11 mAb没有内在的Fc介导的效应功能，如通过 与iso ctrl调理的靶细胞相当的ADCC功效所说明。每一个点代表一名CLL患者； ****p≤0.0001，如通过配对斯图登氏t检验(paired student′s t test)所评估。
图13：相较于原代人类CLL细胞上的CD20，hFcγRIIB对mAb诱导的内化更具抗 性。在37℃将六个CLL样品用5μg/ml的AF488标记的Rit(灰色条柱)或AF488标记的 WT 6G11(白色条柱)处理2小时或6小时，之后评估内化，如前所述；呈现表面CD20 表达％或表面hFcγRIIB表达％。(b)将六个CLL样品用WT或N297Q AT10(10 μg/ml)处理1小时-6小时并且通过用抗hF(ab′)2-PE染色间接地定量hFcγRIIB表面表达。 将值相对于在时间零点时在冰上进行的染色归一化并且表示为表面hFcγRIIB表达％。数 据表示为箱须图，进行威氏检验(Wilcoxon test)以比较处理组；p值比较如所示的组 (*p≤0.05)。
图14(1/5)、图14(2/5)和图14(3/5)：hFcγRIIB小鼠的产生和表征。图14 (1/5)中，(a)将全长hFcγRIIB2从Raji细胞扩增并且经由重叠PCR与从相同的细胞中 分离的原生hFcγRIIB启动子连接以产生所示的构建体。(b)在阳性和阴性小鼠品系中通 过PCR扩增评估hFcγRIIB Tg的表达。(c)产生小鼠，回交并且通过用CD19-PE和 hFcγRII(AT10)-FITC mAb染色来对循环血液进行表型分析并且通过流式细胞术评估。图 14(2/5)中，(d)使用内部产生的特异性mAb(Tutt等，文稿正在准备中)对从所示的 小鼠品系产生的BMDM研究激活性和抑制性mFcγRII和/或hFcγRIIB受体的表达。数据 表明在人类转基因存在下激活性和抑制性mFcγR的谱没有补偿性变化。(e)分别对来自 所示的WT小鼠或hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠的脾脏的CD19-veCD11b+veNK1.1-veLy6G+ve中性粒细胞评估mFcγRII或hFcγRIIB的表达。示出了3次独立实验的代表性点图。如所 预期，mFcγRII在中性粒细胞上表达，但是hFcγRIIB不在中性粒细胞上表达。图14 (3/5)中，使用所示的标志物((分别是AT130-2和AT10 mAb；红色)；B细胞 (B220；顶部图(绿色))和巨噬细胞(F4/80；底部图(绿色)))，通过免疫荧光分 析来自WT或hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠脾脏的冷冻切片，并且评估hFcγRIIB Tg的表达 并且与内源性mFcγRII受体相比较。
图14(4/5)：hFcγRIIB Tg小鼠的产生和表征以及评估6G11 mAb的PK、PD、 MABEL以及CRS诱导特性。与图14相关。(D)用于对小鼠白细胞子集进行免疫表型 分析的门控策略(Rose等，2012)。(E)分别对所示的WT或hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠 和人类血液的循环(血液)和脾B细胞、单核细胞/巨噬细胞以及中性粒细胞评估mFcγRII 或hFcγRIIB的表达。示出了至少3次独立实验的代表性点图。
图14(5/5)：hFcγRIIB Tg小鼠的产生和表征以及评估6G11 mAb的PK、PD、 MABEL以及CRS诱导特性。与图14相关。(F)示出了对hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠的 循环(血液)和脾白细胞子集上和健康人类白细胞以及CLL患者和B细胞系上hFcγRIIB 表达的评估，如所示。示出了平均值±SD；每一个点代表单个供体/样品。(中间图)使用 所示的标志物((分别是AT130-2和AT10 mAb；红色)；B细胞(B220；顶部图(绿 色))和巨噬细胞(F4/80；底部图(绿色)))，通过免疫荧光分析来自WT或 hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠脾脏的冷冻切片并且评估hFcγRIIB Tg的表达并且与内源性 mFcγRII相比较。(底部图)对hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠肝脏中CD31+内皮细胞上 hFcγRIIB表达的评估。
图15：hFcγRII mAb AT10在体内具有活性并且增强Rit对B细胞的消耗。(a)将 分别用高水平的CFSE或低水平的CFSE标记的hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-靶C57BL/6脾细胞 和mFcγRII-/-非靶C57BL/6脾细胞过继转移(i.v.)到WT或γKO C57BL/6接受体小鼠体 内。在24小时后，小鼠接受所示的hFcγRII mAb AT10的WT或F(ab)2片段(i.v.； mIgG1)；并且在16小时后，分析脾细胞以确定保留的靶与非靶的比率。将数据归一化 以给出1.0的对照(NT)靶∶非靶比率。每一个点描绘了来自单个小鼠的结果，平均比率 由水平线指示。数据是从来自至少2次独立实验的4只-6只小鼠/组合并的。(b)将分别 用高水平的CFSE或低水平的CFSE标记的hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-靶C57BL/6脾 细胞和mFcγRII-/-非靶C57BL/6脾细胞注射(i.v.)到WT C57BL/6接受体小鼠体内。在24 小时后，小鼠接受单独的所示的mAb或所示的mAb的组合(10μg；i.v.)；并且在16小 时后，分析脾脏以确定靶与非靶的比率，如上所述。数据是从至少3次独立实验合并的。 (c和d)使用单独的Rit和AT10或它们的组合对B细胞的系统性消耗。在第0天 hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-C57BL/6小鼠接受500μg的Rit(Rit，hIgG1)、AT10 (mIgG1)或250μg的每一种mAb的组合(i.v.)并且随时间推移通过流式细胞术评估循 环B细胞数。(c)分析循环B细胞的代表性流式细胞术点图，指示了处理前和在mAb注 射后的第2天。(d)条柱指示在mAb注射后所示天数时循环B细胞数的平均值±SEM； 来自2次独立实验的≥6只小鼠/组，相对于处理前循环血液B细胞归一化(表示为循环B 细胞％)。进行单因素方差分析(b)和双因素方差分析(d)统计检验以比较处理组；p 值比较如所示的组(*p≤0.05；**p≤0.01；以及***p≤0.001)。
图16：CLL细胞通过与基质细胞相互作用受到保护而免受Rit依赖性消耗。
(A)将6-10×107个原代患者CLL细胞同时静脉内和腹膜内转移到免疫缺陷 NOD/SCID小鼠体内。在注射后4天-5天时，用1次或2次剂量的10mg/kg的Rit(Rit) 或同种型对照处理小鼠。在2天后，将小鼠处死并且通过流式细胞术评估脾脏和腹膜中保 留的CLL细胞的数目，之后相对于接受同种型对照的样品归一化。数据显示单次剂量的 mAb有效地除去腹膜中的CLL细胞(虚线条柱)，而即使在两次剂量的Rit后，Rit诱导 的从脾脏的消耗(实心条柱)仍是不完全的。该图示出了3只-5只小鼠/组的平均值 ±SEM。经由t检验分析数据；p值比较如所示的组(**p≤0.01；****p≤0.001)。
(B)在接受人类CLL细胞异种移植的小鼠中Rit、6G11或组合的抗肿瘤活性。用1mg/kg-10mg/kg的hCD20 mAb(Rit)、hFcγRIIB mAb(6G11)或这两者处理小鼠，并且 对保留在脾脏中的CLL细胞％进行计数并且相对于在用iso ctrl处理后的比例归一化。示 出了来自每一次独立实验的平均值，每一名患者用颜色编码(n＝11名患者)。
(C)如(B)中将来自先前被指定为难治的患者(n＝4；参见表S4)的CLL细胞异 种移植，处理并且评估。使用配对单因素方差分析检验分析数据。
图17：hFcγRIIB mAb 6G11在体内增强Rit对套细胞淋巴瘤(MCL)细胞的消耗。(a)将NOD/SCID小鼠用10×106个Jeko-1 MCL细胞接种(s.c.)，并且在肿瘤达到4 mm×4mm时，用6G11、Rit(Rit)或这两者的组合处理。随时间推移监测小鼠并且在产 生终末肿瘤发展的体征时处死。使用非配对t检验分析数据(*p≤0.05；以及 ***p≤0.001)。(b)对NOD/SCID小鼠进行辐照，然后用6-7×106个原代人类MCL细胞 接种。在接种之后4天-5天时，用1mg/kg的Rit(Rit)、6G11或这两者处理小鼠。在2 天-3天后，小鼠接受第二次注射，并且在2天-3天后处死，对保留在脾中的人类MCL细 胞的％进行计数。数据清楚地显示出这两种mAb，特别是组合除去原代人类MCL细胞的 能力。进行单因素方差分析检验以比较处理组；p值比较如所示的组(*p≤0.05； ***p≤0.001)。
(C和D)6G11在体内增强II型hCD20 mAb GA101gly除去靶细胞的能力的能力。 (C)将CFSE+hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-(靶)脾细胞和mFcγRII-/-(非靶)脾细胞 过继转移(i.v.)到WT小鼠体内并且用单独的GA101gly或6G11或它们的组合(0.008 mg/kg)处理并且评估血液，如前所述。数据是从2次-3次独立实验合并的。(D)将 CFSE+hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-(靶)脾细胞和mFcγRII-/-(非靶)脾细胞过继转移 (i.v.)到hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-接受体小鼠体内并且用iso ctrl或6G11(20mg/kg)处 理，继而用GA101gly(0.04mg/kg)处理并且分析血液，如前所述。每一个点描绘了来自 单个小鼠的结果，平均比率由水平线指示。使用单因素方差分析检验分析数据 (*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001；以及****p≤0.0001)。
图18：评估6G11在体内的PK、PD以及MABEL特性。(a和b)向年龄和性别匹 配的hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠(6只-7只小鼠/组)注射1mg/kg-100mg/kg的WT 6G11 mAb(i.v.或i.p.)并且采样，如示意图(a)中所示。在实验的第7天将小鼠处死并且针对 毒性体征评估器官。(b)随时间推移评估小鼠体重直到mAb注射后的第7天(168小 时)为止(相对于第0天体重100％归一化，然后表示为每一组的平均值±SEM)。(c和 d)在第0天向年龄和性别匹配的hFcγRIIB Tg×mFcγRII-/-小鼠(6只小鼠/组)或mFcγRII-/-小鼠(3只小鼠/组)注射10mg/kg的WT 6G11(i.v.)，继而在第3天、第7天以及第10 天腹膜内注射相同剂量的mAb，如示意图(c)中所示。在实验的第24天将小鼠处死并且 针对毒性体征评估器官。(d)在整个实验期间测量小鼠体重并且评估，如(b)中所详 述。
(底部图)在hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠(4只小鼠/组；平均值±SD)中评估WT6G11(20mg/kg)对循环单核细胞和中性粒细胞的消耗。
图19：体外全血和稀释血液(20％v/v)细胞因子释放测定。在37℃将来自3名健康志愿者的(a)新鲜的或(b)5×稀释(在无血清CTL培养基中)的肝素化的血液用10 μg/ml的所示的mAb处理24小时，之后收集上清液进行后续的分析。通过MSD定量细胞 因子(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α以及IFN-γ)。每一个点指示单个供体(n＝3)。
具体实施方式
实施例
实施例1：实验数据
概要
治疗性抗体已经使癌症治疗发生转变，从而通过结合免疫系统而开启了新的作用机 制。令人遗憾的是，治愈很少发生并且患者显示出内在抗性或获得性抗性。在此，我们证实了靶向和阻断人类(h)FcγRIIB的治疗潜能，所述FcγRIIB是牵涉到免疫细胞脱敏和肿瘤细胞对抗体药物的抗性的受体。FcγRIIB阻断抗体阻止CD20特异性抗体利妥昔单抗内化，从而使细胞表面可及性和免疫效应细胞介导的体外和体内抗肿瘤活性达到最大限度。在完全同基因的hFcγRIIB Tg小鼠模型中，hFcγRIIB mAb增强利妥昔单抗的B细胞消 耗。在评估人类慢性淋巴细胞性白血病(CLL)肿瘤细胞从易形成抗性的基质隔室的消耗 的小鼠模型中，与利妥昔单抗共同施用改善了目标响应和完全响应，包括用来自复发性/ 难治性患者的CLL细胞进行的实验。首选的候选hFcγRIIB特异性抗体6G11被证实在体 内具有良好的靶上免疫反应性、有利的药物代谢动力学并且没有不良作用而与利妥昔单抗 组合有叠加/协同活性。这些数据支持了对这种hFcγRIIB特异性mAb进行进一步临床研发 以用于B细胞淋巴增殖性病症的免疫治疗。
引言
一般来说，生物治疗，特别是单克隆抗体(mAb)是一类不断扩展的治疗剂 1 。它们使癌症治疗发生巨大变化并且已经成为除了常规化疗以外用于几种恶性肿瘤的护理标准。十多年来，我们已经知晓治疗性mAb的大部分活性取决于它们与Fcγ受体(FcγR)的相 互作用。确切地说，它是FcγR的相对表达水平、亲和力以及活性，这解释了IgG的大部 分的治疗活性( 2，3 中所综述)。更不为人所知的是对抗体药物的内在抗性或获得性抗性的 潜在机制。虽然诸如CD47的‘别吃我(don′t-eat-me)’信号已经被证实限制抗体介导的效 应细胞抗癌活性 4 ，但是它们的临床重要性的证据仍处在早期阶段。随着正被开发用于治 疗几种类型的癌症的抗体治疗的数量不断增加，正日益需要了解癌细胞对这些治疗的抗性 以及开发药物来克服它们。
由于几种抗癌mAb依赖于结合抗体依赖性免疫细胞介导的抗肿瘤机制来产生临床前 功效5-8和临床功效 9 - 11 ，因此特别需要了解和防止针对这些共同抗体效应机制的抗性机制。
人类(h)CD20特异性mAb利妥昔单抗是最先被批准用于癌症免疫治疗的，并且因而已经被广泛施用于患有表达CD20的B细胞癌的患者，所述B细胞癌包括滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大细胞B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、以 及套细胞淋巴瘤(MCL)( 12 中所综述)。有趣的是，虽然利妥昔单抗在FL和DLBCL 中是有效的，其中它改善了总体存活率，但是在CLL和MCL中只看到不太大的响应。此 外，甚至是在利妥昔单抗响应性淋巴瘤内，一些个体在首次治疗时仍显示出抗性或变得对 含有利妥昔单抗的联合治疗具有抗性，从而使得它成为研究mAb抗性机制的理想系统。
最近的研究证实抑制性Fcγ受体IIB(FcγRIIB/CD32B)促进利妥昔单抗从靶B细胞 内化 32 ， 33 。作为B细胞上表达的主要的IgG结合免疫受体，FcγRIIB似乎是通过将利妥昔单抗从B细胞表面‘吸入’来起作用，从而有效地消除所有mAb依赖性免疫细胞抗癌机制 (13和正在准备中的文稿)。相反，所谓的II型抗CD20 mAb，如最近批准的奥比妥珠单 抗(GA101)对这一过程不那么敏感，或许是因为它们不能将CD20重新分布到脂筏中 (Cragg等，2003；Lim等，2011)。FcγRIIB介导的利妥昔单抗内化与临床响应性具有相关 性并且按照顺序CLL＞MCL＞FL和DLBCL 32 ， 33 。与FcγRIIB在Ab抗性中的作用相一致， 对接受利妥昔单抗免疫化疗治疗的MCL患者的回顾性分析证实与FcγRIIB阳性肿瘤活检 相比，FcγRIIB阴性的患者中有更大的存活率 13 。在接受利妥昔单抗单药治疗的表达高水 平的FcγRIIB的FL患者中观测到类似不佳的响应(14和递交的文稿)。
以下实施例描述了能够阻断利妥昔单抗内化的针对hFcγRIIB的抗体的开发并且研究 了它们在体外和体内的治疗潜能。产生以人类细胞类型和组织特异性方式共表达hCD20 和hFcγRIIB的转基因(Tg)小鼠并且将其用于概念验证研究中以及用于评估PK/PD和毒 理学参数。然后在这些和其它独特的小鼠模型中评估单独使用或与利妥昔单抗或其它 CD20 mAb组合使用的hFcγRIIb mAb防止或克服抗性的作用，其中可以在体内在包含人类基质细胞的相关易形成抗性的组织隔室中研究人类CLL细胞(维持患者的表型，即利 妥昔单抗响应性或复发性/难治性)。
材料和方法
动物和细胞
人类(h)CD20 Tg、γ-链-/-和小鼠(m)FcγRIIB-/-小鼠先前已经被描述(Beers等，2008)，它们具有通过PCR和/或流式细胞术确认的基因型。根据内政部准则将小鼠饲养 和维持在当地的设施中。动物实验是通过当地伦理委员会批准的并且是依照内政部许可证PPL30/1269和M90-11进行的。人类(h)CD20 Tg、γ-链-/-和FcγRIIB-/-小鼠先前已经被描述 15 ，它们具有通过PCR和/或流式细胞术确认的基因型。十周至十二周大的雌性BALB/c 和C57BL/6小鼠是由哈伦英国有限公司(Harlan UK Limited)(英国牛津的布莱克索恩(Blackthorn，Oxon，UK))供应的并且被维持在当地的动物设施中。CB-17 SCID小鼠购 自查尔斯河公司(Charles River)，然后被饲养和维持在当地的动物设施中。对于用原代 肿瘤细胞进行的异种移植研究(参见下文)，6周-8周大的雌性NOD SCID小鼠是由 Taconic公司(丹麦的博姆霍尔特(Bomholt，Denmark))供应的并且被维持在当地的设施 中。
临床样品
使用临床样品的伦理批准是由南安普顿大学医院NHS信托(SouthamptonUniversity Hospitals NHS Trust)从南安普顿和西南汉普郡研究伦理委员会(Southampton and South West Hampshire Research Ethics Committee)或由斯科讷大学医院(
Figure RE-GSB0000199440020000441
University Hospital)的伦理委员会(Ethics Committee)获得的。知情同意书是根据《赫尔辛基宣言 (Declaration of Helsinki)》提供的。样品是从人体组织管理局(Human Tissue Authority)许 可的南安普顿大学(University of Southampton)癌症科学单位组织库(Cancer Science Unit Tissue Bank)发放的或经由隆德的斯科讷大学医院(
Figure RE-GSB0000199440020000442
University Hospital，Lund)的 血液科(Department of Hematology)和肿瘤科(Department of Oncology)获得的。CLL样 品和MCL样品是作为单细胞悬浮液来评估的，所述单细胞悬浮液已经经过分离、Ficoll纯 化并且冷冻保存以用于后续的分析或新鲜用于异种移植研究中。
细胞培养
在补充的RPMI(含有2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸盐、100IU/ml青霉素和链霉素 以及10％FCS[Myoclone公司]的RPMI)(苏格兰佩斯利的GIBCO BRL公司(GIBCO BRL，Paisley，Scotland))中进行细胞培养。小鼠脾B细胞是通过使用MACS B细胞分离 试剂盒(英国的美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec，UK))进行阴性选择来纯化的并 且培养在相同的培养基中。细胞系是从ECACC获得的并且维持在无抗生素的补充的 RPMI培养基中。正常人外周B细胞是通过使用MACS B细胞分离试剂盒(英国的美天旎 生物技术公司)进行阴性选择而纯化的。
单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)和骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)的产生
人类MDM是从外周血液分化的，所述外周血液是从南安普顿综合医院(Southampton General Hospital)的全国血液服务系统(National Blood Service)(英国的 南安普顿(Southampton，UK))或从哈尔姆斯塔德医院(hospital of Halmstad)或斯科讷 大学医院(瑞典)的血液中心获得的。简单地说，将贴壁CD14+单核细胞培养在含有青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)、10％FCS以及25ng/mL-100ng/mL的低内毒素 重组人类巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF；美国的R&D系统公司(R&D Systems，US)或 内部制备)的RPMI中，如先前所述 16 。每2天将一半的培养基更换成新鲜的M-CSF直到 收集为止。在培养的第7天-第10天时，在与冷PBS一起短时间孵育后收集MDM。
BMDM是由从小鼠的股骨和胫骨的骨髓中分离的细胞产生的，如先前所报道 17 。简单地说，将骨髓细胞培养在富含10％FCS、2mM谷氨酰胺和1mM丙酮酸盐、青霉素和 链霉素(各自是100μg/ml)以及20％L929细胞条件培养基(含有M-CSF)的RPMI 1640 (英国佩斯利的生命技术公司-英杰公司(Life Technologies Invitrogen，Paisley，U.K.)) 中。将细胞在使用前在37℃、5％CO2下培养10天-14天。通过形态学检查和/或针对 CD11b和F4/80的表达进行流式细胞术来常规地确认巨噬细胞分化。
抗体和试剂
mAb通常是由杂交瘤或稳定转染的CHO-k1细胞的培养上清液产生的。在蛋白A上纯化IgG，通过电泳(Beckman EP系统；贝克曼公司(Beckman))评估纯度以及通过 HPLC确认没有聚集。如先前所述产生F(ab′)2片段 18 。hFcγRII mAb AT10如先前所述 19 。 利妥昔单抗是由南安普顿综合医院肿瘤学药房赠予的或购自瑞典隆德的大学医院药房 (Universityhospital Pharmacy)。使用针对磷酸化的hFcγRIIB的抗体(克隆EP926Y) (美国的傲锐东源公司(Origene，US))和α-微管蛋白(美国的细胞信号转导公司(Cell Signaling，US))进行免疫印迹法。使用AF647标记的IgG1、抗CD3-PE、抗CD19- perCp-Cy5.5以及抗CD56-AF488(碧迪生物科技公司(BD Biosciences))标记PBMC。 对于PBMC免疫表型分析，将使用zenon标记试剂盒(分子探针公司(Molecular Probes))用PE标记的FcγRIIB mAb与抗CD3-FITC、抗CD19-PerCP-Cy5.5以及抗 CD56-APC结合使用。
流式细胞术
荧光缀合的mAb购自碧迪生物科技公司、eBiosciences公司、AbD Serotec公司或内 部制备。流式细胞术如先前所述 20 ，在FACScan、FACSCalibur或FACSCanto II上评估样品，用CellQuestPro或FACSDiva分析数据(所有均来自碧迪生物科技公司)。
hFcγRIIB mAb的产生
通过筛选
Figure RE-GSB0000199440020000451
噬菌体展示文库来鉴定hFcγRIIB mAb。使hFcγRIIB和hFcγRIIA的细胞外结构域与mIgG3-Fc融合(hFcγRIIA/B-Fc)以分别用作靶和非靶并且在瞬时转染的HEK293细胞中产生，继而在蛋白A上纯化。进行三次连续的选择。在选择1 之前进行预选择并且针对链霉亲和素Dynabead磁珠上负载的包被的小鼠IgG3κ和生物素 化的hFcγRIIA-Fc进行所述预选择。将结合噬菌体通过胰蛋白酶消化洗脱并且在板上使用 标准程序扩增 21 。使用来自选择1的扩增的噬菌体来针对被包被到蚀刻的聚苯乙烯球(美 国的Polysciences公司)的hFcγRIIB进行选择。针对过量包被的链霉亲和素进行选择2的 预选择。选择3是作为有限稀释选择进行的，例如使用不同浓度的生物素化的hFcγRIIB。 在所有的选择中使用hFcγRIIA作为竞争剂。使来自选择3的噬菌粒转化成scFv产生形式 并且用于后续的筛选测定中，其中评估与可溶性抗原或细胞结合抗原的特异性结合以及对 免疫复合物结合的抑制。使用三种不同的市售的针对hFcγRII的抗体(MCA1075XZ， AbDSerotec公司；MAB1330，R&D系统公司；AF1330，R&D系统公司)来评价重组和 细胞表面结合FcγRIIB。对于通过流式细胞术和荧光微阵列技术(FMAT)评价细胞表面 结合FcγRIIB，还使用小鼠抗hFcγRII-APC(BD Pharmingen公司)。在所有的实验中，包 括相应的同种型对照作为阴性对照。对于评价细胞结合抗原，使用FuGENE(罗氏公司 (Roche))将CHO-k1细胞用FcγRIIA-pIRO或FcγRIIB-pIRO以及pIRESpuro共转染。 使用10μg/ml的嘌呤霉素(InvivoGen公司)来选择转染的细胞。然后将经由有限稀释获 得的单个克隆用hFcγRII抗体(碧迪生物科技公司)和相应的同种型对照染色，继而进行 流式细胞术和FMAT分析以选择最高表达克隆，将所述克隆用于进一步实验。对于scFv 的初级筛选，将FcγRIIA和FcγRIIB转染的CHO-k1细胞接种到FMAT板中。添加大肠杆 菌表达的scFv，继而添加去糖基化的小鼠抗HIS抗体(R&D系统公司)和去糖基化的抗 小鼠Cy5(通用电气医疗公司(GEHealthcare))。使用8200检测系统(应用生物系统 公司(Applied Biosystems))检测染色的细胞。使来自初级筛选的阳性克隆再次重新表达 并且重新测试与FcγRIIA和FcγRIIB转染的细胞的结合。使用标准程序在CDR H1、H2以 及H3上对特异性结合FcγRIIA或FcγRIIB并且抑制IC结合的scFv克隆进行测序以鉴定 独特的克隆。在用溶酶体(西格玛公司(Sigma))由大肠杆菌中的10ml表达制备物制 备周质后，在Ni-NTA旋转柱(通用电气医疗公司)上纯化独特的克隆。将总共17种独 特的克隆转化成WT和N297Q hIgG1变体。对VH和VL进行PCR扩增并且将它们分别 插入含有抗体的重链和轻链恒定区的表达载体中。之后，使用PEI转染适于悬浮生长的 HEK 293EBNA细胞(生命技术公司)并且然后在搅拌下在37℃将细胞悬浮液孵育4小 时，之后用供给溶液(UltraPepSoy，谢菲尔德生物科学公司(SheffieldBio-Science))稀 释并且在转染后6天收集。对所收集的培养基进行无菌过滤并且施加到与
Figure RE-GSB0000199440020000461
纯化器系 统连接的填充有MabSelect(通用电气医疗公司)的柱上。将所述柱用上样缓冲液洗涤并 且用低pH值缓冲液洗脱。对洗脱的抗体进行无菌过滤并且使用Spectra/Por透析膜4(光 谱实验室公司(Spectrum Laboratories Inc))透析到适当的制剂缓冲液中。在透析之后， 对材料进行无菌过滤并且储存在4℃。然后评估纯化的IgG与转染的CHO-k1细胞以及天 然表达FcγRIIB的细胞系和PBMC的结合。
阻断免疫复合物(IC)结合
通过将对FITC具有特异性的hIgG1与FITC-BSA-生物素或FITC-BSA以10∶1的摩尔比混合形成IC。在使用前将混合物在室温预孵育1小时。将大肠杆菌表达的特异性结合 FcγRIIA和FcγRIIB的ScFv克隆的上清液(10μl)添加到表达FcγRIIA和FcγRIIB的 CHO-k1细胞中并且使其结合1小时。添加3nM的IC。使用Strep Alexa Fluor(AF)-647 (英国的生命技术公司)，继而使用流式细胞术检测结合的IC，并且将阻断定量为 AF674信号的损失。
抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
基本上如先前所详述来进行吞噬测定(ADCP) 23 。在成熟为巨噬细胞之后，使用冰冷的PBS或Accutase(西格玛公司)或胰蛋白酶/EDTA(英国的生命技术公司)收集细胞 并且以5×104个细胞/孔重新接种到96孔板中并且在37℃孵育2小时-4小时或过夜。随 后，在37℃将CLL细胞用5μM的羧基荧光素丁二酰亚胺基酯(CFSE，分子探针公司) 标记15分钟。在洗涤后，将CLL细胞与10μg/ml的一种或多种调理mAb一起孵育30分 钟并且之后以5∶1的比率添加到巨噬细胞培养物中。在1小时之后，利用刮擦收集细胞并 且在冰上用APC标记的CD206(碧迪生物科技公司)或hFcγRIII mAb(3G8，内部)染 色15分钟以区分MDM。收集细胞并且通过流式细胞术用所收集的最少5000个巨噬细胞 分析。染色双阳性的细胞的百分比被确定为吞噬潜能的量度。对吞噬作用的确认是常规地 通过共聚焦显微术提供的 23 。
以两种方式进行ADCC测定：使用从健康志愿者的外周血液中MACS分离(德国的 美天旎生物技术公司)的原代CD56+veNK细胞；或被稳定转染以表达CD16-158V等位基 因以及GFP的NK-92细胞系(购自加利福尼亚州圣地亚哥的Conkwest公司(Conkwest， San Diego，CA)) 24 。在使用原代NK细胞效应子的测定中，将靶细胞与1μg/ml-10μg/ml 的mAb一起预孵育30分钟，之后与NK细胞混合。以20∶1效应子∶靶细胞比率将细胞在 含有10mM HEPES缓冲液、1mM丙酮酸钠以及10％FBS(所有均来自Gibco公司)的 RPMI 1640+GlutaAMX培养基(生命技术公司)中孵育3小时-4小时。使用CellaTOX试 剂盒(细胞技术公司(Cell TechnologyInc))根据制造商的说明书测量裂解，并且在 Victor2V光度计中对所得的生物发光进行读数。在使用NK细胞系时，将NK细胞与靶标 一起以1∶1至5∶1过量孵育4小时并且通过流式细胞术测定裂解。简单地说，在孵育结束 时，在暗处将细胞悬浮液与9nM SYTOX红色死细胞染色剂(生命技术公司)一起孵育 20分钟，然后通过流式细胞术测定细胞。
对于研究抑制内化如何影响ADCP和ADCC，将CLL细胞与单独的利妥昔单抗或利 妥昔单抗与同种型对照或6G11的N297Q突变型变体的组合一起孵育3小时-4小时，之后 与效应子一起共培养以允许抗体内化的时间。
内化测定和AF488标记
用AF488，根据制造商的说明书(英国的生命技术公司)标记mAb。为了确定内 化，如先前所详述进行猝灭测定 23 。简单地说，将细胞样品(2-4×105个细胞/孔)与 AF488标记的mAb(5μg/ml)一起孵育给定的时间，洗涤，重悬并且在4℃在存在或不存 在抗AF488猝灭抗体(英国的生命技术公司)的情况下孵育30分钟。然后通过流式细胞 术评估样品。结果表示为表面可及的mAb％，这与内化的mAb的量成反比。
蛋白质印迹法
如先前所述进行蛋白质印迹法 26 。简单地说，将2.5-5×106个细胞处理，洗涤并且在 含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的混合物的onyx缓冲液中裂解。然后通过SDS PAGE分离样品并且将蛋白质立即转移到PVDF膜上。将膜用5％脱脂奶粉封闭，与适当稀释的 一级抗体孵育，洗涤，然后与辣根过氧化物酶缀合的抗兔IgG或抗小鼠IgG(英国的西格 玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich，UK))孵育。通过与增强化学发光剂(ECL；英国的通 用电气医疗公司)孵育并且对感光胶片(Hyperfilm ECL；英国的通用电气医疗公司)曝 光来使条带可视化。使用Image J软件，按照制造商的说明书进行光密度测定。
体内免疫治疗
过继转移测定：如先前所详述(Beers等，2010b)，将约2×107个脾细胞/毫升分别用 5μM和0.5μM的CFSE染色成靶或非靶，洗涤，以1∶1比率组合并且静脉内注射到接受 体小鼠体内(约5×106个细胞/小鼠)。然后在第1天和/或第2天对小鼠进行静脉内和/或 腹膜内注射并且在1天后处死以使用流式细胞术检查血液白细胞和脾白细胞。
过继转移：基本上如先前所详述进行过继转移测定 27 。简单地说，在室温下将来自相 关的C57BL/6小鼠的约2×107个脾细胞/毫升分别用5μM和0.5μM的CFSE染色成靶 (T)或非靶(NT)，持续10分钟，洗涤，以1∶1NT∶T比率组合并且在第-1天静脉内 (i.v.)注射到接受体小鼠体内(约5×106个脾细胞/小鼠)。然后在第0天向小鼠静脉内 注射mAb，并且在1天后处死以针对NT细胞和T细胞检查它们的血液和脾细胞。在一些 过继实验中，然后在第0天和第1天向接受体小鼠注射mAb(经由静脉内和/或腹膜内途 径)，并且在1天后处死以针对NT细胞和T细胞检查它们的血液和脾细胞。使用流式细 胞术通过FSC-H和SSC-H参数以及CD19阳性来鉴定B细胞群体。
B细胞除去：对于系统B细胞消耗测定，向具有不同基因型的小鼠静脉内给予单次剂 量的hCD20 mAb、hFcγRII mAb或这两种mAb(250μg-500μg)，然后随时间推移通过 流式细胞术或免疫组织化学(IHC)评估保留在血液或器官中的B细胞的比例，如前所述 27 。
原代人类异种移植模型：收集来自处于白血病阶段的CLL或MCL患者的血液样品并且将所述血液样品在收集的24小时内用于异种移植研究。简单地说，使用Ficoll PaquePLUS分离PBMC，并且在充分洗涤之后，将细胞以3-5×108个细胞/毫升重悬在无菌PBS 中。在静脉内注射对应于6-10×107个细胞/小鼠的200μl细胞悬浮液之前1小时-5小时， 用1Gy对小鼠进行辐照。在细胞注射之后第4天-第5天时，用1mg/kg-10mg/kg的 hCD20 mAb、hFcγRII mAb或这两者处理小鼠。在2天-3天后小鼠接受第二次注射并且在 2天-3天后处死。将脾脏分离，分成两半，一半冷冻在OCT中并且使另一半变成单细胞悬 浮液。之后，使用裂解缓冲液(Gibco公司)将血红细胞裂解，之后在冰上与细胞表面染 色mAb一起孵育30分钟。经由hCD5和hCD19染色(碧迪生物科技公司)将人类细胞鉴 定和定量为hCD45阳性和白血病细胞。
体内白细胞消耗
在向hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-C57BL/6小鼠注射20mg/kg的同种型对照或WT6G11 (i.v.)后，随时间推移通过流式细胞术评估小鼠外周血液白细胞的系统消耗。将白细胞 子集水平相对于给药前水平归一化并且表示为％。
体内PD、PK以及免疫原性
使用ECL免疫测定来测定6G11(PK)和MAHA的血清浓度。使用生物素化的抗 6G11多克隆山羊血清和链霉亲和素-磺基标签(Streptavidin-Sulfo Tag)(美国的Meso ScaleDiagnostics公司)在小鼠血清中检测6G11 mAb。通过与对于6G11产生的已知的标 准曲线相比较来对血清中mAb的水平进行定量。使用软件应用PhoenixTM WinNonlin v.6.2 (美国加利福尼亚州的Pharsight公司(Pharsight Corp，CA，US))用非隔室模型评价 6G11PK参数(Cmax、Tmax、AUC、CL(F)、Vz(F)、Vss以及t1/2)。直接从血清浓度- 时间曲线获得Cmax和Tmax。
使用定性和半定量ECL免疫测定来检测小鼠血清中针对6G11的MAHA的存在。将 样品在含有生物素和磺基-标签标记的6G11的测定缓冲液中稀释。在孵育后，将样品转移 到预封闭的链霉亲和素板中。使用基于MSD的技术评估信号，发光信号与样品中存在的 抗6G11的水平成正比。使用亲和纯化的山羊抗6G11血清来制备阳性对照样品。
体内药效动力学(PD)、药物代谢动力学(PK)、最低预期生物效应水平(MABEL)以及 免疫原性研究
单次剂量PD、PK以及MABEL：向年龄和性别匹配的hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠注 射单次剂量的1mg/kg、10mg/kg或100mg/kg的WT 6G11，从而研究以10mg/kg剂量进 行的静脉内和腹膜内这两种施用途径(图17A)。在注射后立即以及在终止前最多168小 时内采集连续的血液样品。彻底检查动物的任何痛苦、体重减轻、毒性或病变的体征。如 下研究hFcγRIIB+veB细胞的消耗(PD)和其它参数(例如6G11PK和小鼠抗人类抗体 [MAHA])。
重复剂量免疫原性：在10天的时间内，向年龄和性别匹配的hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小 鼠和mFcγRII-/-对照小鼠注射多次注射的10mg/kg WT 6G11，如图17C中所示(最初静脉 内施用，继而腹膜内递送3次剂量)。通过流式细胞术分析给药前血液样品的循环B细胞 (CD19+ve和B220+ve)。如上自始至终以及在14天后检查动物。如下测定6G11(PK)和MAHA的血清浓度。
6G11PK分析：使用ECL免疫测定来测定小鼠血清中6G11的浓度。将绵羊抗hIgG(the Binding Site公司)或山羊抗hλ(AbD Serotec公司)(在利妥昔单抗存在下)包被 到96孔MSD板上，然后使用0.45％鱼胶封闭。通过后续添加生物素化的抗6G11多克隆 山羊血清和链霉亲和素-磺基标签(Meso Scale Diagnostics公司，MSD公司)来检测6G11 mAb，从而允许任何未结合的物质被洗掉。添加含有三聚胺的读数缓冲液T(MSD公 司)，并且在施加电压时，与6G11缔合的sTag产生化学发光信号。通过与对于6G11产 生的已知的标准曲线相比较来对血清中mAb的水平进行定量。
使用软件应用PhoenixTM WinNonlin v.6.2(美国加利福尼亚州山景城的Pharsight公司 (Pharsight Corp，Mountain View，CA，US))用非隔室模型评价6G11 PK。确定PK参数 估计值，包括Cmax、Tmax、AUC、CL(F)、Vz(F)、Vss以及t1/2。直接从血清浓度-时间曲线获得Cmax和Tmax(表3)。
体外全血消耗测定
将新鲜的肝素化的人类血液在CTL培养基(德国的细胞技术有限公司(CellTechnology Limited，Germany))中5×稀释，并且与20μg/ml Rit和/或WT或N297Q 6G11一起接种到96孔板中；或保持未处理24小时，之后收集细胞并且分别用抗人类 CD3-PerCP-Cy5.5/FITC mAb、CD19-PE mAb、CD14-APC mAb以及CD66b-FITC mAb染 色以针对流式细胞术鉴定T细胞、B细胞、单核细胞以及中性粒细胞。计算白细胞子集相 对于CD3+细胞的比率。
表3
Figure RE-GSB0000199440020000491
Figure RE-GSB0000199440020000501
免疫原性测定(MAHA)：使用定性和半定量ECL免疫测定来检测小鼠血清中针对 WThIgG1 6G11的MAHA的存在。将样品在含有生物素和磺基-标签标记的6G11的测定 缓冲液中稀释。在孵育后，将样品转移到预封闭的链霉亲和素板中。添加含有三聚胺的读 数缓冲液T(MSD公司)并且使用基于MSD的技术评估信号，发光信号与样品中存在的 抗6G11的水平成正比。使用亲和纯化的山羊抗6G11血清来制备阳性对照样品。
体外细胞因子释放测定
通过Lymphoprep(挪威奥斯陆的Axis-Shield公司(Axis-Shield，Oslo，Norway))密 度离心来纯化PBMC。将细胞在高密度培养 28 (1×107个/毫升)下在24孔板中在无血清CTL培养基(德国的细胞技术有限公司)中以高密度(1.5毫升/孔)预孵育48小时。随 后将细胞洗涤，重悬在无血清CTL培养基(1×106个/毫升)中并且接种到用0.02μg/ml或 1μg/mlOKT3预包被的或未处理(NT)的96孔板(100微升/孔)中。添加10μg/ml浓度 的hFcγRIIBmAb(克隆6G11)的WT和N297Q变体或同种型匹配对照mAb(hIgG1)并 且将细胞再孵育48小时。通过MSD V-Plex测定(美国罗克维尔的Meso Scale Discovery 公司(Meso ScaleDiscovery，Rockville，USA))根据制造商的说明书在经过处理的PBMC 上清液中对细胞因子(IL-6、IL-10、IFN-γ以及TNF-α)进行定量。
免疫组织化学(IHC)
如下对人类和其它动物组织进行IHC染色。收集来自各种来源的器官，冷冻，然后切 片，之后用6G11和7C07克隆进行免疫染色。使用酪胺信号放大(TSA；珀金埃尔默公 司)放大在没有过氧化氢封闭的情况下检测组织反应性。包括抗原阴性组织以鉴定任何非 hFcγRIIB特异性结合。
统计分析
为了比较体外实验组之间的差异，进行双尾t检验分析。为了评估体内实验组之间的 存活差异，产生卡普兰-迈耶曲线(Kaplan Meier curve)并且通过对数秩次检验分析。对 于含有超过两组的体内实验，使用双因素或单因素方差分析。对于体内目标响应或完全响 应的差异，使用卡方检验。使用GraphPadPrism软件(用于Windows的版本5)进行统计 分析。
产生表达hFcγRIIB和hCD20的转基因小鼠
通过重叠PCR反应，使用靶向不同的外显子和内含子连接的引物由Raji基因组DNA和cDNA构建hFcγRIIB2转基因。表达盒包括hFcγRIIB启动子 22 、外显子1/2、内含子2-3 以及外显子3-7(2.4kb)并且最初经由NotI和XbaI位点克隆到pcDNA3(英杰公司)中 并且与载体的BGH多聚腺苷酸化序列连接。构建体(包括多聚腺苷酸化序列)是3517bp 长并且经由NotI和SmaI位点将所述构建体进一步亚克隆到载体pBC-SK(Stratagene公 司)中。通过流式细胞术，使用AT10-FITC在瞬时转染的IIA1.6细胞中确认构建体的功 能表达。将缺少载体序列的纯化的表达盒显微注射到FVB/N合子的雄性原核中。通过 PCR(扩增来自从耳廓尖提取的基因组DNA的cDNA片段的外显子3-7)或使用AT10- FITC对外周血液进行流式细胞术来筛选Tg小鼠。使所得的Tg阳性首建者与C57BL/6小 鼠或BALB/c小鼠回交＞10代。通过与小鼠FcγRIIB-/-小鼠杂交产生缺少相应的小鼠受体的 hFcγRIIB Tg小鼠。然后使所得的小鼠与hCD20 Tg小鼠杂交以产生hCD20×hFcγRIIB+/-×mFcγRIIB-/-后代。
表面等离子体共振
使用BIAcore T100分析仪(英国的通用电气医疗公司)来确定hFcγRIIB mAb的结合 亲和力，如别处所述 25 。根据制造商的说明书，使用标准胺偶联将mAb固定到CM5传感 器芯片(英国的通用电气医疗公司)上。注入可溶性hFcγRIIB(0.16nM-100nM；英国的 R&D系统公司)5分钟并且监测解离10分钟。监测与对照流动池结合的背景并且自动扣 除。使用BIAcore T100评价软件从1∶1结合模型计算KD值。
体内免疫治疗
皮下细胞系异种移值肿瘤模型：在第0天向SCID小鼠(3只-6只小鼠/组)皮下注射于生长因子减少型基质胶基质(英国的碧迪生物科技公司)中的5×106个Daudi细胞或Raji细胞，随后在第7天、第14天、第21天以及第28天每周一次用治疗性mAb处理。 在第0天向NOD.SCID小鼠皮下注射10×106个Jeko-1细胞。监测肿瘤生长并且在肿瘤达 到4mm×4mm时，将小鼠随机化并且每周两次用10mg/kg的治疗性mAb处理。随时间 推移使用卡尺监测肿瘤生长并且使用以下方程式估算肿瘤尺寸：
[重量＝(长度×宽度2)/2]
静脉内细胞系异种移值模型：在第0天向SCID小鼠(6只/组)静脉内注射2.5×106个 Raji细胞(英国的碧迪生物科技公司)，随后在第7天、第14天、第21天以及第28天每 周一次用治疗性mAb处理最多4次。通过针对任何瘫痪体征检查小鼠来定期监测肿瘤生 长。
体外细胞因子释放测定
将新鲜或5×稀释(在无血清CTL培养基中)的肝素化的血液培养在96孔板(U形底)中并且在37℃用10μg/ml mAb处理24小时，之后收集上清液以进行后续的分析。通 过MSD V-Plex测定(美国罗克维尔的Meso Scale Discovery公司)，根据制造商的说明书 在经过处理的全血上清液或稀释的血液上清液中对细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、 IL-10、IFN-γ以及TNF-α)进行定量。
荧光显微术
在干冰床上将用于切片的组织冷冻在置于异戊烷中的OCT培养基(RA Lamb，Thermo Shandon公司)中。将10μm的冷冻切片在丙酮中固定，用5％正常山羊血清封闭 并且与针对hFcγRII/CD32(克隆AT10，内部产生)、mFcγRJI/CD32(克隆AT130-2，内 部产生 29 )、B细胞(大鼠抗小鼠CD45R/B220；英国的BD Pharmingen公司)、滤泡树 突状细胞(大鼠抗小鼠FDC；英国的BD Pharmingen公司)以及巨噬细胞(大鼠抗小鼠 F4/80；英国的AbD Serotec公司)的mAb一起孵育，继而与DyLight594缀合的山羊抗 hIgG(英国剑桥的艾博抗公司(Abcam，Cambridge，UK))和AF488缀合的山羊抗大鼠 IgG(英国的生命技术公司)一起孵育。将切片封固在Vectashield(英国的载体实验室公 司(Vector Laboratories，UK))中，并且使用装备有在Cell B软件下运行的CC12彩色摄 像机的CKX41倒置显微镜反射荧光系统，使用Plan Achromat 10×0.25物镜(所有均来自 英国的奥林帕斯公司(Olympus，UK))采集图像。将RGB图像文件(TIFF)传输到 Adobe Photoshop(CS6)中，并且将红/绿图像叠加进行对比度拉伸以使用整个灰度。
中性粒细胞染色方案
从年龄和性别匹配的C57BL/6、mFcγRII-/-以及mFcγRII-/-×hFcγRIIb+/-小鼠采集血 液样品或脾脏。通过穿过100μm细胞过滤器(碧迪公司)将脾脏匀浆，然后在完全RPMI 中洗涤并且重悬在5ml的PBS中，每管使用200μl的细胞悬浮液以进行流式细胞术。将样品用10μg/ml的抗小鼠FcγRII(AT130-2F(ab′)2-FITC)、抗人类FcγRJI(AT10F(ab′)2-FITC)或无关对照(3G8 F(ab′)2-FITC)(所有均是内部产生和标记的)加上以下各项来 染色：抗小鼠CD19(1D3-PE，内部)、抗小鼠NK1.1(PK136-AlexaFluor 647)、抗小 鼠CD11b(M1/70-太平洋蓝)、抗小鼠CD11c(N418-PE-Cy7)、抗小鼠Ly-6-G(1A8- APC-Cy7)、抗小鼠Ly-6C(HK1.4-PerCP-Cy5.5；除非另有说明，否则所有均来自 BioLegend公司)。将细胞在4℃染色30分钟，然后添加1ml的红细胞裂解缓冲液(英国 的AbD Serotec公司)，将细胞离心，然后洗涤一次并且在FACs Canto上分析。排除碎片 和CD11c高细胞，中性粒细胞是CD19-CD11b+NK1.1-Ly-6G+。
结果
对hFcγRIIB的Fc结合域具有特异性的mAb的产生和表征
最近已经报道在一些淋巴瘤患者中对利妥昔单抗(一种I型CD20 mAb)的抗性可以部分地通过它由肿瘤的内化来解释并且靶B细胞表面上抑制性FcγRIIB/CD32B的表达促进这一过程 13，23 。与这一假设相一致，体内共同施用AT10与利妥昔单抗在其中hCD20和 hFcγRIIB在肿瘤上共表达的两种不同的淋巴瘤异种移植模型中产生了叠加/协同抗肿瘤响应(图7)。
hFcγRIIB的细胞外结构域与hFcγRIIA(一种关键的激活性FcγR)的细胞外结构域是 约98％同源的(图8a)。由于这两种受体介导相反的功能，因此治疗性抗体对hFcγRIIB 具有高度特异性是至关重要的。AT10不满足这一标准，这是因为它以相似的亲和力与hFcγRIIA和hFcγRIIB这两者结合 19 。此外，它是鼠类来源的(IgG1)，从而限制了它的 翻译潜能。为了产生在人类中具有治疗潜能的hFcγRIIB特异性抗体，我们使用我们专有 的人类抗体噬菌体展示文库
Figure RE-GSB0000199440020000521
针对与hFcγRIIB的结合以及防止与hFcγRIIA 的结合(或反之亦然)进行淘选以产生单特异性试剂(图1)。评估所得的mAb选择性结 合FcγRIIB(图1(1/2)的a)和阻断免疫复合物(IC)与hFcγRIIB，而不是与hFcγRIIA 的结合(图1(1/2)的b)的能力。针对与单个人类PBMC子集(中性粒细胞、单核细 胞、B细胞、T细胞以及NK细胞)、分离的B细胞(图1(1/2)的c和d；图8b-d)、 恶性人类B细胞系或来自Tg小鼠(hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-；数据未示)的脾细胞的结合进 行的筛选证实所述抗体对hFcγRIIB或hFcγRIIA的高度特异性。这些mAb对hFcγRIIB的 相对亲和力是通过ELISA确定的(表1)，通过表面等离子体共振评估的子集显示出在 2×10-6M-2×10-8M范围的与hFcγRIIB结合的KD(图1(1/2)的e和表2)。基于上述发 现，鉴定和验证了14种高度特异性hFcγRIIBmAb。尽管尚未限定每一种mAb的精细特 异性，但是它们全部均阻断IC结合并且不与FcγRIIA交叉反应，这强烈地表明了它们结 合在IgG结合槽(binding cleft)周围，其中存在高浓度的在FcγRIIA与FcγRIIB之间不同 的残基(图7和图8)。
表1：hFcγRIIA mAb和hFcγRIIB mAb EC50数据
Figure RE-GSB0000199440020000531
表2：所选择的hFcγRIIB mAb克隆的Biacore亲和力和亲合力数据
Figure RE-GSB0000199440020000532
Figure RE-GSB0000199440020000541
拮抗性hFcγRIIB mAb阻断利妥昔单抗内化
将hFcγRIIB+ve B细胞与利妥昔单抗一起孵育会经由hFcγRIIB诱导抑制性信号转导， 并且与hFcγRIIB细胞质ITIM基序的磷酸化有关 31-33 。我们基于这种受体的免疫抑制功能 推测能够阻止CD20内化并且阻断hFcγRIIB激活/磷酸化的mAb将具有治疗意义。我们因 此针对在非霍奇金淋巴瘤Raji B细胞中调节FcγRIIB磷酸化的能力对14种hFcγRIIB特异 性mAb进行筛选。为了以可变域依赖性方式评估抗体介导的作用，我们工程化了抗体变 体，所述抗体变体在它们的恒定区中携带N297Q突变，不能经由它们的恒定Fc结构域与FcγR结合(参见下文) 34 。用hFcγRIIB mAb短期处理(30分钟)Raji细胞产生了两种不 同的响应；诱导hFcγRIIB ITIM的高水平磷酸化的mAb(例如克隆5C04和6G08)以及几 乎没有作用或没有作用的mAb，如克隆6G11和7C07(图2a)。用原代CLL细胞、扁桃 体、以及单核细胞观测到类似的观测结果(图9B和9C，并且数据未示)。这些数据证实 成功地产生了能够阻断免疫复合物与hFcγRIIB结合而不激活这种受体的hFcγRIIB mAb。
随后，我们研究了hFcγRIIB mAb是否可以阻断hFcγRIIB与利妥昔单抗之间的相互作 用以及是否可以阻止所引起的利妥昔单抗内化。诸如6G08的一些mAb仍具有激动性，从 而刺激受体磷酸化。相反，在此被称为具有拮抗性的两种mAb(6G11和7C07)能够几乎 完全阻止在利妥昔单抗结合在Raji细胞和原代CLL细胞上之后所诱导的FcγRIIB磷酸化 (图2b，并且数据未示)，与AT10非常相似 32 。使用流式细胞术猝灭测定 23 ，我们确定 相同的mAb能够有效地阻断利妥昔单抗从hFcγRIIB转染的Ramos细胞表面内化(图 2c)。值得注意的是，在这些mAb存在下内化的缺乏类似于使用II型mAb托西莫单抗以 及缺少hFcγRIIB的Ramos细胞所观测到的那样(图2c)。WT和N297Q变体这两者在这 一测定中具有等同的活性，这表明了抗体可变域(Fv)依赖性作用(图9)并且证实了拮 抗作用保留在WT hIgG1形式中。后续的分析揭示了mAb组阻断利妥昔单抗内化的能力 直接与它们对hFcγRIIB的相对亲和力相关；R2＝0.78(图2d)，这进而与它们阻断在利妥 昔单抗刺激之后hFcγRIIB的磷酸化的相对排序的能力相关联；R2＝0.79(图2e)。因此， 高亲和力拮抗性hFcγRIIB mAb阻止了利妥昔单抗从靶细胞表面由hFcγRIIB介导的去除。
拮抗性hFcγRIIB mAb诱导Fc：FcγR依赖性细胞毒性并且阻断利妥昔单抗内化， 从而在体外引出强效的抗肿瘤活性
一些mAb的拮抗作用保留在与表达激活性FcγR的免疫细胞有效结合的WT hIgG1形 式中的发现表明这些mAb可能具有内在的Fc：FcγR依赖性抗肿瘤活性。我们因此针对这些作用筛选我们的hFcγRIIB mAb。将经过调理的靶Raji细胞与原代NK细胞一起孵育证 实了拮抗性mAb 7C07和6G11还具有最高的细胞毒性活性，所述细胞毒性活性大于由利 妥昔单抗本身所引出的活性(图10a和b)。在已经确定这两种克隆具有最高的亲和力、 最强的阻断利妥昔单抗内化和引出ADCC的活性的情况下，我们随后评估它们与一组已 知表达FcγR的人类和动物组织的结合。克隆7C07和6G11这两者对人类脾脏和扁桃体中 的淋巴细胞特异性染色(图3(1/2)的a，并且数据未示)。7C07和6G11均不与食蟹 猴、大鼠、兔或小鼠的淋巴细胞反应，这表明这些mAb对其它物种的FcγRIIB没有交叉 反应性(图3(1/2)的a，并且数据未示)。然而，克隆7C07还对来自人类和其它物种 的脾脏的窦状隙和淋巴结组织染色，但是6G11不是这样，这表明不希望有的交叉反应性 (图3(1/2)的a和图11a)。WT和N297QmAb被证实同等染色(图11b)，并且没有 观测到另外的意想不到的对其它人类组织的交叉反应性(图11c)。基于这一反应性谱， 选择克隆6G11作为我们的首选临床候选者。
在ADCC、PCD以及ADCP测定中，使用一组广泛的原代患者CLL样品进一步研究 6G11的内在细胞毒性活性。在每一个测定中显示出显著的活性，所述活性的水平显著大 于用利妥昔单抗所观测到的活性(图3(1/2)的b-d)。此外，在使用表达hFcγRIIIA的 高亲和力变体或低亲和力变体(分别是158V或158F)的NK细胞效应子进行的测定中， 6G11在诱导细胞死亡方面比利妥昔单抗更有效(图3(1/2)的e)。
随后，我们研究6G11阻止利妥昔单抗从CLL细胞表面内化的能力。6G11的WT和N297Q变体(本身缺乏内在的Fc依赖性效应活性；图12)这两者能够显著阻止利妥昔单 抗内化(图3(1/2)的f)。有趣的是，不同于CD20，并且如先前所报道 17 ，在直接或间 接评估时，WT或N297Q hIgG1 mAb(6G11或AT10)与CLL细胞表面上hFcγRIIB的结 合没有引起高水平的hFcγRIIB内化(图3(1/2)的g以及图13a和b)。
为了阐明6G11是否还可以通过阻止利妥昔单抗内化来增强利妥昔单抗的细胞毒性活 性，我们将原代CLL细胞与利妥昔单抗和6G11的N297Q变体一起共孵育，并且评估 MDMADCP和NK细胞ADCC。惊人的是，与单独的利妥昔单抗相比，N297Q 6G11被证 实显著促进MDM吞噬利妥昔单抗调理的CLL细胞的能力(图3(2/2)的h和i)。在使 用NK细胞进行的ADCC测定中观测到类似的活性提高(图3(2/2)的j)。NK细胞不 表达FcγRIIB，从而确认由hFcγRIIBmAb引起的任何增强作用均源于由于它们抑制利妥 昔单抗内化而对靶细胞的作用。这些数据确认阻断B细胞靶标表面上的hFcγRIIB抑制了 mAb：Ag：hFcγRIIB复合物的内化，并且增强了它们被靶向以由效应细胞除去的能力。
综上所述，这些观测结果表明6G11可以经由以下双重机制引出抗肿瘤活性，即内在 的细胞毒性活性以及经由阻止利妥昔单抗从细胞表面去除来增强利妥昔单抗的活性。
在免疫活性hCD20+vehFcγRIIb+veTg小鼠中6G11具有内在的B细胞消耗活性并且增 强利妥昔单抗的消耗作用。
如上文所述，hFcγRIIB表达在靶B细胞上，其中它介导利妥昔单抗从细胞表面的不 希望的去除；并且表达在关键的免疫效应细胞，如巨噬细胞上，其中它的功能是阻抑抗癌 抗体响应 5-7，35 。为了了解系统性靶向hFcγRIIB对相关的表达hFcγRIIB的细胞类型的影 响，我们产生了在hFcγRIIB启动子控制下表达hFcγRIIB基因的小鼠(图14(1/5)中的a和b)。hFcγRIIB在Tg小鼠中的表达和分布非常类似于在人类组织中的表达和分布，即 在B淋巴细胞、BMDM以及单核细胞上强表达，但是不在中性粒细胞上表达，这不同于 mFcγRII(图14(1/5)中的c，14(2/5)和14(3/5)，并且未示)。此外，在mFcγRII-/-背景下维持了等同的表达，从而允许我们研究在不存在来自内源性小鼠抑制性FcγR的复 杂因素的情况下hFcγRIIB的作用。重要的是，6G11的拮抗活性在这些小鼠中得到保留 (图14(5/5))。此外，内皮细胞上hFcγRJIB的表达低于WT小鼠中的表达并且更类似 于人类中的表达(图14(5/5))。
为了确定6G11治疗在体内的安全性，我们进行了剂量递增研究，用1mg/kg、10 mg/kg或100mg/kg的6G11处理hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠的群组(图18)。经过处理的 小鼠均没有遭受不良事件，如急性作用、痛苦或体重减轻(图18)。在第7天进行的组织 检查未能表明器官(肾脏、脑、脾脏、肝脏、肺)中的任何总体毒性。在高于1mg/kg的 剂量下在血液(图6(1/2)的a)和脾脏(图6(1/2)的b)中观测到hFcγRIIB+B细胞的 显著消耗，在10mg/kg组和100mg/kg组中有等同的活性。6G11是一种容易在小鼠血清 中检测的完全人类mAb，但是内在具有免疫原性，因此我们同时评估了它的半衰期和小 鼠抗人类抗体(MAHA)响应的证据。在＞1mg/kg的剂量下，克服了影响PK特征的靶标 介导的清除，在10mg/kg组和100mg/kg组中靶标结合几乎没有影响或没有影响(图6 (1/2)的c)。然而，在7天内，观测到显著的MAHA，从而引起快速的mAb清除(图 6(1/2)的d)。基于在出现显著的MAHA之前的时间点，我们估算10mg/kg和100 mg/kg剂量的mAb半衰期是大约2天-4天(图6(1/2)的c、d以及表7)。
我们还进行了重复给药研究以更好地模拟可能在临床上递送6G11的方式，在整个24 天时间内将它施用4次(图18)，如前所述检查小鼠。在接受多次剂量(10mg/kg)的 6G11注射的hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-组中观测到循环B细胞的消耗，但是在mFcγRII-/-对照组中没有观测到(图6(1/2)的e)。同样，小鼠没有遭受体重减轻(图18)或不良事件 并且没有观测到总体毒性体征(数据未示)。如前所述，在1周内在hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠中观测到显著的MAHA响应并且导致6G11从血清中快速损失(图图6 (1/2)的f)。相反，在mFcγRII-/-对照组中没有检测到MAHA，这表明MAHA的诱导需 要对异种mAb和表面抗原的共同依赖性(图6(1/2)的f)。
为了研究除B细胞以外的hFcγRIIB+细胞是否可能在6G11治疗之后被除去，进行了 用人类血液进行的全血消耗测定(图6(2/2))和用hFcγRIIB Tg小鼠进行的体内实验。B细胞，而不是单核细胞或中性粒细胞被WT 6G11 IgG1，而不是N297Q 6G11除去。在 与利妥昔单抗组合的情况下同样没有观测到单核细胞和中性粒细胞的消耗(图6 (2/2))。随后，我们使用最近开发的体外细胞因子释放综合征(CRS)测定(CRA) (Hussain等，2015)来评估6G11对已经由高密度培养而变得对刺激敏感(Romer等， 2011)的人类外周血液单核细胞(PBMC)的潜在影响，并且所述测定能够在添加先前被 强调为引出CRS的几种mAb特异性(CD3、CD28或CD52)之后检测到显著水平的IFN- γ、TNF-α和/或IL-8。将WT或N297Q 6G11施用48小时没有引起显著的细胞因子释放， 这与1/500剂量的CD3 mAb不同(图6)。使用全血或稀释血液CRA获得类似的结果 (图19)。
总的来说，这些数据没有显示出不良作用并且表明了6G11 mAb的治疗相关PK特征，从而支持了功效研究。
在免疫活性小鼠中6G11具有内在活性并且增强利妥昔单抗的消耗作用
使用hIgG1 6G11和mIgG1 AT10这两者评估单独或与利妥昔单抗组合靶向hFcγRIIB 的消耗潜能。首先，在短期过继转移测定 23 中，其中将CFSE+vehFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-脾 细胞注射到WT接受体体内并且随后用6G11(图4(1/2)的a和b)或AT10(图15a) 处理，观测到转移的细胞被有效地从循环和脾脏中消耗。有趣的是，施用低到1μg的 mAb足以引出约50％的B细胞消耗。消耗完全依赖于Fc：激活性FcγR相互作用，这是因 为在使用F(ab′)2片段和N297Q变体的情况下活性丧失；在缺乏激活性FcγR的γ链-/-小鼠 中，hFcγRIIB+ve靶标也没有被除去(图4a和B以及图15a)。这些数据确认拮抗性 hFcγRII mAb能够在体内除去靶细胞，这依赖于与免疫效应细胞上的激活性FcγR的相互 作用，如先前所示 36 。
为了将我们的分析延伸到与利妥昔单抗的联合治疗，通过杂交产生hCD20+/- 15，37 ×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠。在将靶标转移到WT接受体体内的短期测定中，与单独 的任何一种mAb相比，利妥昔单抗和6G11(或AT10)的组合引起了hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-B细胞的更高消耗(分别是图4(1/2)的c和图15b)。类似地， 在hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-接受体小鼠(在效应细胞上也表达hFcγRIIB)中，通过将利妥昔 单抗与6G11组合更显著地消耗了过继转移的hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-B细胞(图 4(1/2)的d)。
我们随后研究了所述组合在hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠模型中对循环B细胞 的作用。如前所述，与单药治疗相比，所述组合引起循环B细胞的显著更高的消耗(图4 (1/2)的e以及图15c和d)，这是首次在其中hFcγRIIB在靶细胞和效应细胞这两者上表 达的完全同基因系统中证实这种能力。将利妥昔单抗和WT hIgG1 6G11(或AT10)组合的作用大于对于叠加活性所预期的作用(分别是图4(2/2)和15)，如根据在单独施用 两倍剂量的单个mAb的情况下所观测到的响应所判断的那样。
为了评估对于该活性来说是6G11的内在作用(B细胞消耗)还是外在作用(利妥昔单抗增强)更重要，我们将N297Q 6G11用于hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠中并且 证实虽然N297Q 6G11单独在除去方面是无活性的，但是它显著增强了利妥昔单抗对B细胞的除去(图4(2/2))。用mIgG1 6G11观测到类似的结果。如所预期以及如用AT10 所观测到(图15)，mIgG1 6G11在hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠中显示出不佳的 单一药剂消耗活性(Hamaguchi等，2006)，但是类似于N297Q hIgG1 6G11，能够显著增 强利妥昔单抗的鼠类IgG2a型式消耗B细胞的能力(图15)。此外，由于它的小鼠Fc， 因此它没有被MAHA主动清除，从而有助于对组合治疗进行更长期的评估。这些数据证 实了在体内拮抗hFcγRIIB功能对于增强利妥昔单抗的消耗活性的长期有益的作用。
总之，这些研究确认了6G11在体内的双重作用机制，涉及内在抗肿瘤功能联合经由 阻止内化来增强利妥昔单抗的抗肿瘤活性。
6G11在体内增强II型hCD20 mAb介导的B细胞消耗
为了研究6G11与不在与I型CD20 mAb相同的程度上被内化 13，23，33 并且最近被批准用于CLL的II型hCD20 mAb组合是否也是有效的，我们在过继转移模型中进行了实验。 如同利妥昔单抗，在接受体WT小鼠和hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠中，GA101gly(糖基化 的奥比妥珠单抗)单药治疗和6G11单药治疗这两者均引起脾和循环靶CFSE+vehCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-B细胞的不太大的消耗，而联合治疗显著增强了脾靶细胞和循环靶 细胞这两者的消耗(图4(1/2)的f和g；并且数据未示)。这些数据表明6G11与其它 直接B细胞靶向mAb组合也将是有效的。
6G11在体内增强利妥昔单抗介导的原代CLL细胞的消耗并且改善目标和完全抗肿 瘤响应
尽管利妥昔单抗已经被成功地用于改善对几种B细胞恶性肿瘤的治疗，但是它在控制 CLL方面具有有限的活性。尽管最初在血液中有外周消耗，但是从次级淋巴组织和所谓的 增殖中心有效减灭肿瘤是不太成功的。因此，为了更好地评估6G11针对CLL细胞的抗肿 瘤活性，我们研发了一种动物模型，其中原代人类CLL细胞归巢于次级淋巴器官(脾和骨髓)，并且与支持性人类T细胞一起增殖成簇，从而严格模拟人类疾病中的情况(图5 (1/2)的a和b)。在这一模型中，利妥昔单抗有效消耗存在于腹膜腔中的CLL细胞， 但是它在消耗存在于脾脏中的增殖中心中的CLL细胞方面是不完全有效的(图16)。
在单独用利妥昔单抗或6G11处理被移植有原代CLL细胞的小鼠时，与经过同种型对 照mAb处理的动物相比，在脾脏中观测到肿瘤质量显著减小(图5(1/2)的c)。用利妥 昔单抗和6G11的组合进行的处理产生了甚至更高的消耗速率(图5(1/2)的c)。此 外，在根据响应率的标准评估这些数据时，在联合治疗后部分响应者和完全响应者的数目 显著高于经过同种型对照处理的小鼠或单药治疗(分别是图5(1/2)的d和e)。
此外，在联合治疗后目标响应者(OR；被定义为脾脏中的CLL细胞减少＞75％)和完全响应者(CR；被定义为脾脏中的CLL细胞＜0.1％)的数目显著高于经过同种型对照处 理的小鼠或单药治疗(图5(1/2)和5(2/2)以及表5)。这些数据显示在体内利妥昔单 抗/6G11联合治疗针对原代CLL细胞的功效提高。
然后，我们研究6G11治疗被移植有从利妥昔单抗、奥法木单抗(hCD20 mAb)和/或阿仑单抗(hCD52 mAb)难治性患者分离的CLL细胞的小鼠的能力(表4)。将异种移 植小鼠用作为单药治疗的6G11或利妥昔单抗处理或用这两种mAb的组合处理。如所预 期，单独用利妥昔单抗处理是低效的(图5(1/2)和5(2/2)以及表8)并且＞95％的小鼠 未能产生OR。相反，单独的6G11显示出显著的CLL细胞消耗，但是未能改善OR(图5 (1/2)和5(2/2)以及表5)。然而，值得注意的是，利妥昔单抗与6G11的共同施用引 起了稳健的消耗(图5(1/2)和5(2/2)以及表8)，有＞25％的OR(表5)。这些数据 表明除了增强利妥昔单抗在响应患者中的活性之外，6G11还可以针对治疗难治性CLL细 胞具有活性。
使用利妥昔单抗和6G11的联合治疗在体内克服了难治性CLL细胞
之后，我们研究了6G11在存在或不存在利妥昔单抗的情况下治疗被移植有从利妥昔 单抗和/或阿仑单抗(hCD52 mAb)难治性患者分离的CLL细胞的小鼠的能力(表4)。 如所预期，单独的利妥昔单抗对细胞的消耗是低效的，但是这在6G11存在下显著改善 (图5(1/2)的f)。此外，被移植有难治性CLL细胞的接受联合治疗的更高数目的小鼠 在所述组合下实现了部分响应(图5(1/2)的g)。这些数据支持了6G11可以增强利妥 昔单抗在利妥昔单抗敏感性和利妥昔单抗难治性患者组中的功效。
表4：关于在临床上被定义为利妥昔单抗难治性的患者的患者信息、先前治疗以及响 应的信息。这与体内模型中的相对响应相比较，其中经过同种型对照处理的小鼠的脾脏中 CLL细胞的数目被设定为100％±SD。
Figure RE-GSB0000199440020000581
Figure RE-GSB0000199440020000591
使用利妥昔单抗和6G11的联合治疗在体内针对原代MCL细胞具有活性
为了评价6G11靶向其它类型的恶性B细胞的能力，我们使用被移植有Jeko MCL细胞或新鲜分离的原代MCL细胞的免疫缺陷小鼠模型(分别是图17a和b)。在向小鼠移 植JekoMCL细胞时，使用6G11或利妥昔单抗的单药治疗没有引起长期存活，而所述组 合有效治愈约30％的小鼠直到100天。类似地，如同原代CLL细胞的情况一样，原代 MCL细胞对联合治疗作出有利响应(图17b)。
6G11被良好耐受，在体内具有治疗相关的药物代谢动力学并且在体外不引起细胞 因子风暴(cytokine storm)
随后，为了确定6G11 mAb治疗的安全性，我们进行了剂量递增研究，用单次注射的1mg/kg、10mg/kg或100mg/kg的6G11处理hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠的群组，从而研 究以10mg/kg剂量进行的静脉内施用途径和腹膜内施用途径这两者(图18a)。经过处理 的小鼠均没有遭受不良事件，如急性作用、痛苦或体重减轻(图17b)。在第7天进行的 组织检查未能表明器官(肾脏、脑、脾脏、肝脏、肺)中的任何总体毒性(数据未示)。 在高于1mg/kg的剂量下在血液(图6(1/2)的a)和脾脏(图6(1/2)的b)中观测到 hFcγRIIB+veB细胞的消耗，在10mg/kg组和100mg/kg组中有等同的活性，从而表明了功 效。6G11是一种容易在小鼠血清中检测的完全人类mAb，但是内在具有免疫原性，因此 我们同时评估了它的半衰期和小鼠抗人类抗体(MAHA)响应的证据(图6c和d)。这些 数据表明在高于1mg/kg的剂量下，克服了影响PK特征的靶标介导的清除，在10mg/kg 组和100mg/kg组中观测到靶标结合几乎没有影响。然而，在7天内，观测到显著的 MAHA(在10mg/kg i.v.组中，从第4天到第7天，增加了4个数量级；图6d)，从而引 起mAb的快速清除。基于在施用后在出现显著的MAHA之前的前4天，我们估算10 mg/kg和100mg/kg剂量的抗体的半衰期是约2天-4天(图6(1/2)的c和d以及表3)。
我们还进行了重复剂量研究以更好地模拟可能在临床上递送6G11的方式，将它在10 天时间内施用(最初静脉内施用，继而腹膜内递送3次剂量；图17C)，自始至终以及在 14天后(接受mAb总共24天)针对任何痛苦、体重减轻、毒性或病变体检查动物征。如 前所述，在接受多次(10mg/kg)剂量的6G11注射的hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-组中观测到循 环B细胞的消耗，但是在mFcγRII-/-对照组中没有观测到(图6(1/2)的e)。同样，小 鼠没有遭受体重减轻(图17b)，似乎没有遭受不良事件并且没有观测到总体毒性体征 (图17D；并且数据未示)。如前所述，在1周内在hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠中观测到 显著的MAHA响应并且导致6G11从血清中快速损失(图6(1/2)的f)。有趣的是，在 mFcγRII-/-对照组中没有检测到MAHA，这表明MAHA的诱导需要表面抗原的存在(图6 (1/2)的f)。
最后，我们使用了最近开发的体外细胞因子释放综合征(CRS)测定来评估6G11对已经由高密度培养而变得对刺激敏感的人类PBMC的潜在影响 28 。这一测定系统能够在添 加先前被强调为引出CRS的几种mAb特异性(CD3、CD28或CD52)之后检测显著水平 的IFN-γ、TNF-α和/或IL-8(图6(1/2)的f和正在准备中的文稿)。在这一测定中将 WT或N297Q 6G11施用48小时没有引起显著的细胞因子释放，这与1/500剂量的CD3 mAb不同(图6(1/2)的g)。使用全血细胞因子测定获得类似的结果(图18)，它们 共同表明在人类研究之前6G11具有良好的安全性特征。
6G11在体内增强其它临床相关抗体的治疗活性
最近的观测结果表明FcγRIIB依赖性内化可以构成对除利妥昔单抗之外的几种临床相 关抗体的抗性的基础(Vaughan等，2014)；(Pallasch等，2014)。我们因此研究了将6G11与最近批准的hCD20 mAb奥比妥珠单抗(GA101)和临床上充分验证的hCD52特 异性mAb阿仑单抗组合。奥比妥珠单抗对hCD20的特异性允许我们研究在同基因小鼠模 型中的作用。在WT小鼠(图5(2/2))和hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠(图6(1/2)的f 和S6G)中，GA101单药治疗和6G11单药治疗这两者引起了脾B细胞和循环B细胞的不 太大的消耗，而组合显著增强了消耗。在CLL患者异种移植小鼠模型中，将6G11与 GA101组合显著提高了脾肿瘤细胞的消耗(图5(2/2)以及表5和8)。虽然阿仑单抗对 hCD52的特异性阻碍了在同基因hCD20模型中的研究，但是在CLL小鼠模型中，在将 6G11和阿仑单抗组合时，治疗活性存在显著的提高，＞90％的经过组合处理的小鼠产生 CR(图5(2/2)以及表5和8)。
这些数据提供证据表明6G11可以针对多个靶标克服mAb药物抗性。
表5：在原代CLL患者异种移植物中对mAb处理的响应
Figure RE-GSB0000199440020000611
表6：与图1相关。如通过ELISA和/或SPR所评估的hFcγRIIA mAb和hFcγRIIB mAb的亲和力测量结果。
Figure RE-GSB0000199440020000612
anb：无结合。
bnm：未测量。
表7：与图14相关。WT 6G11 mAb在hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠中的药物代谢动力学(PK)参数估计值。
Figure RE-GSB0000199440020000621
amAb半衰期。
b与终末期相关的分布容积。
c稳态分布容积(稳态：在一定次数的施用结束时获得的平衡状态)。
d清除率；每单位时间清除血浆体积(即不再含有所关注的药物中的任一种)。
e曲线下面积；对应于药物的血浆浓度相对于确定时间间隔的积分。
f在施用之后药物的峰值血浆浓度。
g达到Cmax所耗费的时间。
表8：与图5(1/2)和5(2/2)相关。使用置换统计检验在体内患者来源的异种移植模型中比较不同的mAb治疗所分析的详细p值。
所有来者CLL患者异种移植物
Figure RE-GSB0000199440020000631
利妥昔单抗难治性CLL患者异种移植物
Figure RE-GSB0000199440020000632
MCL患者异种移植物
Figure RE-GSB0000199440020000633
NA：不适用。
讨论
癌细胞是高度增殖性的，在本质上是基因组不稳定的并且具有高的突变倾向。这些方 面为细胞在来自常规的抗癌药物的选择下进化提供了理想的环境，其中出现了遗传上不同 的治疗抗性克隆，从而导致治疗失败。这种能力在针对DNA损伤化疗 38 和靶向不同的信 号转导通路的小分子抑制剂，如伊马替尼(imatinib)、埃罗替尼(erlotinib)以及依鲁替 尼 39-43 产生的抗性机制中是清楚明显的。这些机制涉及所靶向的受体中的突变或下游信号 转导蛋白中的补偿性变化 44 。其它机制涉及经由上调药物外排泵所实现的多药抗性机制( 45 中所综述)。常规和靶向小分子抑制剂的失败已经促使寻找克服这些抗性方式的手段 以及替代治疗，包括结合免疫系统的那些。
单克隆抗体(mAb)迄今为止是这种方法的最成功的代表，用于血液学病症的Ab引领该领域。B细胞癌代表了在抗体治疗方面在临床上被最充分研究的类型的癌症。自从利妥昔单抗在1997年被批准，以及随着第二代(奥法木单抗)和第三代(奥比妥珠单抗) hCD20mAb最近被批准，这些药剂已经成为治疗B细胞癌的医疗方法中的重要支柱。然 而，很明显，mAb免疫治疗也易受内在抗性和获得性抗性这两者的影响。现在公认的是， 肿瘤通过破坏基质细胞和骨髓细胞来影响它们的周围微环境以支持它们的存活和生长 46 。 与mAb治疗有关的至少两种抗性机制是由抑制性FcγRIIB促成的( 47 中所综述)。除了由 Clynes 5 所表明的对效应细胞的抑制作用之外，最近已经证实利妥昔单抗和其它I型hCD20 mAb在B细胞表面上通过双极抗体桥联结合hFcγRIIB，从而引起mAb：CD20：FcγRIIB复 合物的内化 13，23，48 ，进而限制了它发挥关键的Fc依赖性效应功能的能力(23和未出版的 Tipton等)。在此，这个实施例描述了在体内能够阻断这两种抗性机制并且因此能够释放 其它治疗性mAb的完全潜能并且帮助克服对抗体治疗的抗性的完全人类hFcγRIIb mAb的 产生。
惊人的是，hFcγRIIB mAb的共同施用不仅改善了被移植有来自利妥昔单抗响应患者 的CLL细胞的小鼠的目标响应和完全响应，而且重要的是，它们还克服了来自对利妥昔 单抗或靶向hCD52的mAb阿仑单抗具有抗性的复发性/难治性患者的CLL细胞的mAb治 疗抗性表型。
最近提出了肿瘤细胞FcγRIIB在所选择的微环境中对hCD52 mAb治疗的抗性中的作 用(Pallasch等，2014)。发现与更敏感的脾脏隔室相比，hFcγRIIB在阿仑单抗抗性骨髓白 血病B细胞中上调，并且在这些中由shRNA介导的hFcγRIIB基因敲低在原本具有抗性的组织中改善了hCD52 mAb治疗。这些发现与在我们的CLL模型中得到的观测结果是一致 的。尽管敏感的腹膜隔室中的CLL细胞容易由hCD20 mAb消耗，但是抗性微环境中的消 耗需要阻断肿瘤FcγRIIB。与高FcγRIIB表达构成了mAb在抗性组织隔室中的活性降低的 基础相一致，在我们的CLL模型中阻断FcγRIIB增强了阿仑单抗以及II型hCD20 mAb。 我们先前证实了II型hCD20 mAb只有在高水平的FcγRIIB存在下有效内化(Vaughan等， 2014)。总的来说，这些观测结果证实了FcγRIIB介导的抗性与若干种不同的临床上批准 的抗体有关，这表明与hFcγRIIB mAb组合的广泛治疗潜能。
先前已经证实，I型CD20 mAb显示出比II型大得多的内化到所靶向的肿瘤细胞中的 倾向 13，23，33 ，后者只有在高水平的FcγRIIB存在下有效内化 33 。在此关于在体内II型CD20抗体的B细胞消耗活性似乎通过与6G11共同治疗而得到类似的改善的发现因此变得耐人寻味。Hemann和同事最近表明在所选择的微环境中肿瘤细胞FcγRIIB在对hCD52 mAb治 疗的抗性中的作用 49 。发现与更敏感的脾脏隔室相比，FcγRIIB在阿仑单抗抗性骨髓中上 调，并且在白血病细胞中由siRNA介导的FcγRIIB基因敲低在原本具有抗性的组织中提高 了hCD52 mAb的治疗作用。这些发现与用我们的CLL模型得到的观测结果是一致的。尽 管敏感的脾脏隔室中的单个CLL细胞容易由hCD20 mAb治疗消耗，但是抗性微环境中成 簇的增殖CLL细胞的消耗需要阻断肿瘤FcγRIIB。重要的是，这些观测结果(本文和33) 证实了FcγRIIB介导的抗性与若干种不同的临床上批准的抗体和验证的靶标有关，这表明 与hFcγRIIB mAb组合的广泛治疗潜能。
在几种类型的癌症中观测到对抗体治疗的抗性。在B细胞癌当中，与FL和DLBCL 相比较，含有hCD20 mAb的方案对CLL和MCL的治疗作用不太好，这表明了在CLL和 MCL中的内在抗性机制。此外，患有FL和DLBCL的单个患者对hCD20 mAb治疗显示 出内在抗性，并且最初对含有抗体的免疫治疗有响应的所有B细胞癌患者中有一定比例会 产生抗性并且不再受益于治疗。先前的观测结果(32，14和未出版的数据)表明FcγRIIB介 导的抗体内化可能是这些不同的B细胞癌和个体中的抗性的潜在共同机制。在本文中，我 们提出了以下发现：与hFcγRIIB mAb共同施用在体内增强了利妥昔单抗针对CLL肿瘤细 胞和MCL肿瘤细胞这两者的抗肿瘤活性，这与以下观测结果是一致的，即FcγRIIB介导 的抗体内化是不同的B细胞癌所共有的治疗相关抗性机制。
这个实施例还证实了hFcγRIIB mAb具有内在的抗肿瘤活性。Veri等先前研发出hFcγRIIB特异性mAb，但是没有研究它们在体内针对癌症靶标的活性 50 。Rankin等随后 证实靶向恶性人类B细胞上的hFcγRIIB作为单药治疗可以是有效的。然而，这一研究 36 使用免疫缺陷异种移植系统，其中由于缺乏Ab与小鼠受体的交叉反应性，因此靶抗原只 在肿瘤上表达，而不在关键的免疫效应细胞上表达，从而阻碍了对hFcγRIIB mAb的净作 用的评估。在目前的研究中，使用两种不同的mAb克隆，一种是由噬菌体展示产生的完 全人类克隆并且一种是经由常规的杂交瘤技术产生的鼠类克隆，我们在其中hFcγRIIB在 靶B细胞和效应子上表达的免疫活性同基因小鼠模型中证实拮抗性hFcγRIIB抗体具有内 在的抗肿瘤活性。重要的是，使用表达hCD20和hFcγRIIB这两者的双重Tg小鼠，我们 进一步证实在这两种靶标以类似于在人类中的细胞特异性方式和组织特异性方式在免疫活 性宿主中表达时，mAb阻断hFcγRIIB介导的内化增强了利妥昔单抗的治疗活性。有趣的 是，在这一背景下共同施用拮抗性hFcγRIIB mAb和CD20 mAb(利妥昔单抗或奥比妥珠 单抗)有特别显著和明显的协同作用。很容易推测到增强的活性是由mAb阻断hFcγRIIB 在效应细胞中的免疫抑制功能所引起的，这差不多就如同已经在类似的免疫活性模型中使 hFcγRIIB发生遗传缺失后所观测到的那样 6，7 。无论如何，并且与解除FcγRIIB介导的抑制 和阻止利妥昔单抗内化(而不是直接靶向)是hFcγRIIB mAb增强利妥昔单抗治疗活性的 主要机制相一致，我们发现与单独的6G11相比较，AT10对B细胞的除去不太有效(或 许是因为同种型的差异)，但是AT10和利妥昔单抗的组合在增强利妥昔单抗的活性方面 同样有效。值得注意的，长期以来已经了解的是，CLL是用利妥昔单抗 51 和其它I型抗 CD20 mAb 52，53 亚最佳治疗的而需要更高的剂量。结合我们先前的数据 13 ，我们的新结果表 明与hFcγRIIB mAb的联合治疗可能不仅是预防抗性的途径，而且或许还是降低在这些情 况下所需的hCD20 mAb剂量的途径。
至少三种不同的机制因此可能促成6G11的总体体内治疗活性：内在细胞毒性；阻止 治疗性mAb内化；以及中和免疫细胞中的FcγRIIB抑制性信号转导。若干观测结果表明阻断受体内化和抑制性信号转导对于克服药物抗性来说是最关键的。首先，在向其中 hFcγRIIB在靶细胞和效应细胞这两者上表达的小鼠共同施用拮抗性hFcγRIIB和hCD20 mAb时，有显著和明显协同作用。其次，我们发现尽管单独的AT10对于B细胞除去是低 效的，但是AT10和利妥昔单抗的组合在增强利妥昔单抗活性方面是有效的。最确定的 是，我们用缺乏结合激活性FcγR的能力并且没有直接的细胞毒性能力的N297Q hIgG1 6G11所得到的数据确认阻断FcγRIIB活性是这种方法的功效背后的关键机制。这提供证 据表明针对FcγRIIB的功能阻断性mAb可以再现在使FcγRIIB发生遗传缺失后所观测到 的增强的抗癌mAb响应(Clynes等，2000)。然而，在此我们没有直接研究拮抗靶标上的FcγRIIB功能相比于拮抗免疫效应细胞上的FcγRIIB功能对于活性来说的相对重要性；这 些研究形成了我们正在进行的努力的基础。
值得注意的，长期以来已经了解的是，CLL是用利妥昔单抗(O′Brien等，2001)和奥法木单抗(Coiffier等，2008；Coiffier等，2006)亚最佳治疗的而需要更高的剂量。结合我们先前的数据，我们当前的结果表明与hFcγRIIB mAb的联合治疗可能不仅是预防抗性的途径，而且或许还是降低hCD20 mAb治疗的剂量或缩短hCD20 mAb治疗的持续时间的途 径。
除了提供显著的活性之外，治疗性mAb还必须是可耐受的并且具有治疗相关的药物 代谢动力学(PK)。6G11对hFcγRIIB具有非常高的特异性而它不与98％同源的人类 hFcγRIIA结合，并且与通常用于毒理学研究的动物物种有可忽略不计的交叉反应性，这促 使我们在以类似于人类的水平以及在类似于人类的细胞类型和组织上表达人类hFcγRIIB的Tg小鼠中研究安全参数和PK/PD。这些研究表明6G11被良好耐受并且动物没有显示 出痛苦、体重减轻、毒性或病变的体征。剂量滴定实验证实足以在体内使hFcγRIIB饱和 的10mg/kg或更大的剂量产生等同的B细胞消耗，并且能够维持所述受体的长期阻断或 去除。相反，1mg/kg的剂量是亚最佳的，被快速清除并且没有明显除去脾B细胞。在高 于受体饱和的剂量下，在小鼠中6G11的终末半衰期被估计为2天-4天。尽管与非人类灵 长类动物物种没有交叉反应性阻碍了种间按比例缩放，但是这些数字表明了hIgG1 mAb 典型的治疗相关PK特征，在人类中半衰期约为数周。
有趣的是，在人类血液中以及在hFcγRIIB Tg小鼠体内，6G11处理引起B细胞的特异性除去。尽管在这两个系统中单核细胞表达hFcγRIIB，但是它们基本上没有被除去。当前的证据表明巨噬细胞和/或单核细胞是负责mAb治疗的关键效应细胞(Beers等， 2010)；(Biburger等，2011；Gul等，2014)，因此我们的数据表明这些关键的效应子没 有被hFcγRIIB mAb除去。
我们先前研究了一组等效的抗小鼠FcγRII特异性mAb 25 并且观测到它们具有有限的 治疗益处，这是因为它们在体内被快速消耗，主要是由宿主的非肿瘤细胞消耗 17 。重要的是，至少在体外，在人类靶细胞上没有观测到类似速率的内化，这与之前的研究是一致的 36 。在此，我们延伸了这些观测结果并且证实对原代人类CLL样品观测到相同的情况并且 在表达hFcγRIIB Tg的小鼠中，没有观测到快速和广泛的mAb消耗。这些数据确认了我们 之前的假设，小鼠和人类抑制性FcγRII(B)在它们对于内化和充当抗原汇(antigenic sink)的能力方面具有不同的特性，并且表明诸如6G11的hFcγRIIB mAb将在人类中有效 地起作用。
总的来说，这个实施例证实了以下体内概念验证，即hFcγRIIB mAb克服了肿瘤细胞 对mAb药物的内在抗性和获得性抗性，从而克服了复发性/难治性CLL细胞。我们的数据支持了临床开发hFcγRIIB mAb以用于表达FcγRIIB的B细胞癌的治疗。
这些数据支持了临床开发hFcγRIIB mAb以用于表达FcγRIIB的B细胞癌的治疗。此 外，类似于CD20 mAb向其它疾病的扩展，有证据表明了它们在其它治疗背景下的效用，如其中表达FcγRIIB的靶标可能适合于操作的自身免疫，例如其中靶PC表达高水平的 FcγRIIB的系统性轻链淀粉样变性(Zhou等，2008)以及其中B细胞激活可能经由激动 FcγRIIB而减少的类风湿性关节炎(Baerenwaldt等，2011；Mauri和Jury，2010)。
参考文献
1.Reichert，J.M.和Dhimolea，E.《作为癌症药物的抗体的未来(The future ofantibodies as cancer drugs)》，Drug Discov Today 17，954-963(2012)。
2.Nimmerjahn，F.和Ravetch，J.V.《健康和疾病中的FcγR(FcgammaRs in healthand disease)》，Curr Top Microbiol Immunol 350，105-125(2011)。
3.Nimmerjahn，F.和Ravetch，J.V.《作为免疫应答的调节因子的Fcγ受体(Fcgamma receptors as regulators of immune responses)》，Nature reviews 8，34-47(2008)。
4.Chao，M.P.等，《抗CD47抗体与利妥昔单抗协同促进吞噬并且根除非霍奇金淋巴瘤 (Anti-CD47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosis anderadicate non- Hodgkin lymphoma)》，Cell 142，699-713(2010)。
5.Clynes，R.A.，Towers，T.L.，Presta，L.G.以及Ravetch，J.V.《抑制性Fc受体调节针对 肿瘤靶标的体内细胞毒性(Inhibitory Fc receptors modulate in vivocytoxicity against tumor targets)》，Nature medicine 6，443-446(2000)。
6.Minard-Colin，V.等，《在小鼠中在CD20免疫治疗期间的淋巴瘤消耗是由巨噬细胞 FcγRI、FcγRIII以及FcγRIV介导的(Lymphoma depletion during CD20immunotherapy in mice is mediated by macrophage FcgammaRI，FcgammaRIII，andFcgammaRIV)》，Blood 112， 1205-1213(2008)。
7.Hamaguchi，Y.，Xiu，Y.，Komura，K.，Nimmerjahn，F.以及Tedder，T.F.《Fcγ受体的抗 体同种型特异性结合在CD20免疫治疗期间调节B淋巴细胞消耗(Antibody isotype-specific engagement of Fcgamma receptors regulates B lymphocyte depletionduring CD20 immunotherapy)》，The Journal of experimental medicine 203，743-753(2006)。
8.Beers，S.A.等，《抗原调节限制抗CD20抗体的功效：抗体选择的启示(Antigenicmodulation limits the efficacy of anti-CD20 antibodies：implications forantibody selection)》， Blood 115，5191-5201(2010)。
9.Dyer，M.J.，Hale，G.，Hayhoe，F.G.以及Waldmann，H.《CAMPATH-1抗体在体内在患有淋巴恶性肿瘤的患者中的作用：抗体同种型的影响(Effects of CAMPATH-1antibodies in vivo in patients with lymphoid malignancies：influence ofantibody isotype)》，Blood 73， 1431-1439(1989)。
10.Weng，W.K.和Levy，R.《两种免疫球蛋白G片段C受体多态性独立地预测 患有滤泡性淋巴瘤的患者对利妥昔单抗的响应(Two immunoglobulin G fragment C receptorpolymorphisms independently predict response to rituximab in patients withfollicular lymphoma)》，J Clin Oncol 21，3940-3947(2003)。
11.Cartron，G.等，《人源化抗CD20单克隆抗体的治疗活性以及IgG Fc受体 FcγRIIIa基因中的多态性(Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonalantibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene)》，Blood 99，754-758(2002)。
12.Lim，S.H.等，《抗CD20单克隆抗体：历史观点和未来前景(Anti-CD20monoclonal antibodies：historical and future perspectives)》，□Haematologica95，135-143 (2010)。
13.Lim，S.H.等，《靶B细胞上的Fcγ受体IIb促进利妥昔单抗内化并且降低临床功效(Fc gamma receptor IIb on target B cells promotes rituximabinternalization and reduces clinical efficacy)》，Blood(2011)。
14.Lee，C.A.-K.，Margaret；Cogliatti，Sergio；Crowe，Susanne；Cragg，Mark S；Schmitz，Shu-Fang H；Ghielmini，Michele以及Peter W Johnson.《抑制性Fc受体(FcgRIIB)的表达是滤泡性淋巴瘤(FL)中对利妥昔单抗单药治疗响应不佳的标志(Expression of Inhibitory Fc Receptor(FcgRIIB)Is a Marker of Poor Response toRituximab Monotherapy in Follicular Lymphoma(FL))》，ASH abstract 50396(2012)。
15.Beers，S.A.等，《II型(托西莫单抗)抗CD20单克隆抗体在B细胞消耗方面 胜过I型(利妥昔单抗样)试剂而与补体激活无关(Type II(tositumomab)anti-CD20monoclonal antibody out performs type I(rituximab-like)reagents in B-celldepletion regardless of complement activation)》，Blood 112，4170-4177(2008)。
16.Roghanian，A.等，《肌丝相关TSGA10蛋白在专职性抗原提呈细胞中表达并 且与波形蛋白相互作用(Filament-associated TSGA10 protein is expressed inprofessional antigen presenting cells and interacts with vimentin)》，Cellularimmunology 265，120-126 (2010)。
17.Williams，E.L.等，《靶向抑制性Fcγ受体IIB(CD32b)的免疫治疗在小鼠中 受到单克隆抗体消耗和受体内化的限制(Immunotherapy Targeting Inhibitory FcgammaReceptor IIB(CD32b)in the Mouse Is Limited by Monoclonal Antibody Consumptionand Receptor Internalization)》，J Immunol 191，4130-4140(2013)。
18.Glennie，M.J.，McBride，H.M.，Worth，A.T.以及Stevenson，G.T.《含有硫醚连接的Fab′γ片段的双特异性F(ab′γ)2抗体的制备和性能(Preparation and performanceof bispecific F(ab′gamma)2 antibody containing thioether-linked Fab′gammafragments)》，J Immunol 139，2367-2375(1987)。
19.Greenman，J.等，《新型单克隆抗FcγRII抗体AT10的表征以及它向用于募集细胞毒性效应子的双特异性F(ab′)2衍生物中的并入(Characterization of a newmonoclonal anti-Fc gamma RII antibody，AT10，and its incorporation into abispecific F(ab′)2 derivative for recruitment of cytotoxic effectors)》，MolImmunol28，1243-1254(1991)。
20.Tutt，A.L.等，《B细胞淋巴瘤的单克隆抗体治疗：肿瘤细胞上的信号转导活 性似乎比效应子的募集更重要(Monoclonal antibody therapy of B cell lymphoma：signaling activity on tumor cells appears more important than recruitment ofeffectors)》，J Immunol161， 3176-3185(1998)。
21.Olsson，N.等，《使用亲和蛋白质组学和质谱分析的蛋白质组学分析和发现(Proteomic analysis and discovery using affinity proteomics and massspectrometry)》，Mol Cell Proteomics 10，M110 003962(2011)。
22.Nishimura，T.等，《人类FcγRIIB基因启动子的表征：与不同区域结合的人类锌指蛋白(ZNF140和ZNF91)起转录阻遏因子的作用(Characterization of the human Fcgamma RIIB gene promoter：human zinc-finger proteins(ZNF140 and ZNF91)thatbind to different regions function as transcription repressors)》，Int Immunol13，1075-1084(2001)。
23.Beers，S.A.等，《抗原调节限制抗CD20抗体的功效：抗体选择的启示(Antigenic modulation limits the efficacy of anti-CD20 antibodies：implications for antibody selection)》，Blood 115，5191-5201(2010)。
24.Binyamin，L.等，《在抗淋巴瘤治疗的模型中阻断NK细胞抑制性自识别促进 抗体依赖性细胞毒性(Blocking NK cell inhibitory self-recognition promotesantibody- dependent cellular cytotoxicity in a model of anti-lymphomatherapy)》，J Immunol180，6392- 6401(2008)。
25.Williams，E.L.等，《对鼠类抑制性FcγRIIB(CD32B)具有特异性的单克隆抗体的开发和表征(Development and characterisation of monoclonal antibodiesspecific for the murine inhibitory FcgammaRIIB(CD32B))》，European journal ofimmunology(2012)。
26.Walshe，C.A.等，《CD20诱导胞质钙流依赖于B细胞抗原受体信号转导(Induction of cytosolic calcium flux by CD20 is dependent upon B Cell antigenreceptor signaling)》，The Journal of biological chemistry 283，16971-16984(2008)。
27.Beers，S.A.，Chan，C.H.，French，R.R.，Cragg，M.S.以及Glennie，M.J.《作为治疗性I型和II型单克隆抗体的靶标的CD20(CD20 as a target for therapeutic type Iand II monoclonal antibodies)》，Semin Hematol 47，107-114(2010)。
28.Romer，P.S.等，《以高细胞密度预培养PBMC提高了T细胞响应的敏感性， 揭示了由CD28超级激动剂TGN1412引起的细胞因子释放(Preculture of PBMCs at high celldensity increases sensitivity of T-cell responses，revealing cytokine releaseby CD28 superagonist TGN1412)》，Blood 118，6772-6782(2011)。
29.Williams，E.L.等，《对鼠类抑制性FcγRIIB(CD32B)具有特异性的单克隆抗体的开发和表征(Development and characterisation of monoclonal antibodiesspecific for the murine inhibitory FcgammaRIIB(CD32B))》，European journal ofimmunology 42，2109-2120 (2012)。
30.Hallborn，J.和Carlsson，R.《用于高通量产生抗体片段的自动筛选程序(Automated screening procedure for high-throughput generation of antibodyfragments)》， Biotechniques增刊，30-37(2002)。
31.Cragg MS，A.A.，O′Brien L，Tutt A，Chan HTC，Anderson VA，Glennie MJ.《CD20 mAb的相反特性(Opposing properties of CD20 mAb)》，《白细胞分型(LeukocyteTyping)》，VII 95-97(牛津的牛津大学出版社(Oxford University Press，Oxford)，2002年)。
32.Lim，S.H.等，《靶B细胞上的Fcγ受体IIb促进利妥昔单抗内化并且降低临床功效(Fc gamma receptor IIb on target B cells promotes rituximabinternalization and reduces clinical efficacy)》，Blood 118，2530-2540(2011)。
33.Vaughan，A.T.等，《抑制性FcγRIIb(CD32b)由治疗性mAb以顺式和反式 激活并且根据抗体特异性驱动内化(Inhibitory FcgammaRIIb(CD32b)becomes activated bytherapeutic mAb in both cis and trans and drives internalization according toantibody specificity)》，Blood 123，669-677(2014)。
34.Tao，M.H.和Morrison，S.L.《无糖基化的嵌合小鼠-人类IgG的研究：碳水化 合物在由人类IgG恒定区介导的结构和效应功能中的作用(Studies of aglycosylatedchimetic mouse-human IgG.Role of carbohydrate in the structure and effectorfunctions mediated by the human IgG constant region)》，J Immunol 143，2595-2601(1989)。
35.Montalvao，F.等，《通过活体成像所揭示的抗CD20介导的B细胞消耗的机制(The mechanism of anti-CD20-mediated B cell depletion revealed by intravitalimaging)》，The Journal of clinical investigation(2013)。
36.Rankin，C.T.等，《作为B细胞淋巴瘤的单克隆抗体治疗的靶标的人类抑制性Fcγ受体IIB CD32B(CD32B，the human inhibitory Fc-gamma receptor IIB，as atarget for monoclonal antibody therapy of B-cell lymphoma)》，Blood 108，2384-2391(2006)。
37.Hu，C.Y.等，《用CD20特异性抗体治疗预防和逆转小鼠的自身免疫性糖尿病(Treatment with CD20-specific antibody prevents and reverses autoimmunediabetes in mice)》，The Journal of clinical investigation 117，3857-3867(2007)。
38.Rossi，D.等，《小TP53突变的亚克隆在慢性淋巴细胞性白血病中的临床影响(Clinical impact of small TP53 mutated subclones in chronic lymphocyticleukemia)》，Blood (2014)。
39.Zhang，J.，Yang，P.L.以及Gray，N.S.《用小分子激酶抑制剂靶向癌症(Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors)》，Nat Rev Cancer 9，28-39(2009)。
40.Pao，W.等，《肺腺癌对吉非替尼或埃罗替尼的获得性抗性与EGFR激酶结构 域中的第二突变有关(Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib orerlotinib is associated with a second mutation in the EGFR kinase domain)》，PLoS Med 2，e73(2005)。
41.Yun，C.H.等，《EGFR激酶中的T790M突变通过增加对ATP的亲和力来引起 药物抗性(The T790M mutation in EGFR kinase causes drug resistance by increasingthe affinity for ATP)》，Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 105，2070-2075(2008)。
42.Shah，N.P.等，《在慢性期和急变期的慢性骨髓性白血病中多个BCR-ABL激 酶结构域突变赋予对酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(STI571)的多克隆抗性(Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosinekinase inhibitor imatinib(STI571)in chronic phase and blast crisis chronicmyeloid leukemia)》，Cancer Cell 2， 117-125(2002)。
43.Corbin，A.S.，Buchdunger，E.，Pascal，F.以及Druker，B.J.《STI571抑制Abl激酶的特异性的结构基础的分析(Analysis of the structural basis of specificity ofinhibition of the Abl kinase by STI571)》，The Journal of biological chemistry277，32214-32219(2002)。
44.Engelman，J.A.等，《MET扩增通过激活ERBB3信号转导引起肺癌中的吉非 替尼抗性(MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer byactivating ERBB3 signaling)》，Science(New York，N.Y 316，1039-1043(2007)。
45.Cragg，M.S.，Harris，C.，Strasser，A.以及Scott，C.L.《经由BH3模拟物释放致癌激酶抑制剂的功效(Unleashing the power of inhibitors of oncogenic kinasesthrough BH3 mimetics)》，Nat Rev Cancer 9，321-326(2009)。
46.Hanahan，D.和Weinberg，R.A.《癌症标志：下一代(Hallmarks of cancer：thenext generation)》，Cell 144，646-674(2011)。
47.Williams，E.L.等，《通过靶向Fc受体克服对治疗性抗体的抗性(Overcomingresistance to therapeutic antibodies by targeting Fc Receptors)》，《癌症中对免疫治疗性抗体 的抗性：克服抗性的策略(Resistance to Immunotherapeutic Antibodiesin Cancer.：Strategies to Overcome Resistance)》，Pubs.Springer出版中(2013)。
48.Vaughan，A.T.等，《抑制性FcγRIIb(CD32b)由治疗性mAb以顺式和反式激 活并且根据抗体特异性驱动内化(Inhibitory FcγRIIb(CD32b)becomes activated bytherapeutic mAb in both cis and trans and drives internalization according toantibody specificity)》，Blood (2013)。
49.Pallasch，C.P.等，《使保护性肿瘤微环境对抗体介导的治疗增敏(Sensitizing protective tumor micrroenvirronments to antibody-mediatedtherapy)》，Cell 156，590-602 (2014)。
50.Veri，M.C.等，《能够区分人类抑制性Fcγ受体IIB(CD32B)与激活性Fcγ 受体IIA(CD32A)的单克隆抗体：生化、生物学以及功能表征(Monoclonal antibodies capableof discriminating the human inhibitory Fcgamma-receptor IIB(CD32B)from theactivating Fcgamma-receptor IIA(CD32A)：biochemical，biological and functionalcharacterization)》，Immunology 121，392-404(2007)。
51.O′Brien，S.M.等，《在慢性淋巴细胞性白血病中的利妥昔单抗剂量递增试验(Rituximab dose-escalation trial in chronic lymphocytic leukemia)》，J ClinOncol 19，2165- 2170(2001)。
52.Coiffier，B.等，《在患有复发性或难治性B细胞慢性淋巴细胞性白血病的患者中完全人类单克隆抗CD20抗体奥法木单抗的安全性和功效：1期-2期研究(Safety andefficacy of ofatumumab，a fully human monoclonal anti-CD20 antibody，inpatients with relapsed or refractory B-cell chronic lymphocytic leukemia：aphase 1-2 study)》，Blood 111，1094-1100 (2008)。
53.Coiffier，B.等，《在慢性淋巴细胞性白血病中存活终点与暴露于奥法木单抗(HuMax-CD20)之间的显著相关性(Significant Correlation between SurvivalEndpoints and Exposure to Ofatumumab(HuMax-CD20)in Chronic LymphocyticLeukemia)》，ASH Annual Meeting Abstracts 108，2842-(2006)。
54.Shawn Rose，Alexander Misharin，Harris Perlman，2012，《分析小鼠脾髓样隔室的新 型基于Ly6c/Ly6G的策略(Anovel Ly6c/Ly6G-based strategy to analyse themouse splenic myeloid compartment)》，Cytometry Part A 81(4)：343-50。
55.Beers，S.A.，French，R.R.，Chan，H.T.，Lim，S.H.，Jarrett，T.C.，Vidal，R.M.，Wijayaweera，S.S.，Dixon，S.V.，Kim，H.，Cox，K.L.等，(2010).《抗原调节限制抗CD20抗体的功效：抗体选择的启示(Antigenic modulation limits the efficacy of anti-CD20antibodies： implications for antibody selection)》，Blood 115，5191-5201。
56.Biburger，M.，Aschermann，S.，Schwab，I.，Lux，A.，Albert，H.，Danzer，H.，Woigk，M.， Dudziak，D.以及Nimmerjahn，F.(2011).《负责体内免疫球蛋白G依赖性效应功能的单核细 胞子集(Monocyte subsets responsible for immunoglobulin G-dependenteffector functions in vivo)》，Immunity 35，932-944。
57.Coiffier，B.，Lepretre，S.，Pedersen，L.M.，Gadeberg，O.，Fredriksen，H.，van Oers，M.H.， Wooldridge，J.，Kloczko，J.，Holowiecki，J.，Hellmann，A.等，(2008).《在患有复发性或难治性 B细胞慢性淋巴细胞性白血病的患者中完全人类单克隆抗CD20抗体奥法木单抗的安全性 和功效：1期-2期研究(Safety and efficacy of ofatumumab，afully human monoclonal anti- CD20 antibody，in patients with relapsed orrefractory B-cell chronic lymphocytic leukemia：a phase 1-2study)》，Blood 111，1094-1100。
58.Coiffier，B.，Tilly，H.，Pedersen，L.M.，Plesner，T.，Frederiksen，H.，vanOers，M.H.J.， Wooldridge，J.，Kloczko，J.S.，Holowiecki，J.，Hellmann，A.等，(2006).《在慢性淋巴细胞性白 血病中存活终点与暴露于奥法木单抗(HuMax-CD20)之间的显著相关性(Significant Correlation between Survival Endpoints and Exposure toOfatumumab(HuMax-CD20)in Chronic Lymphocytic Leukemia)》，ASH Annual MeetingAbstracts 108，2842-。
59.Cragg，M.S.，Morgan，S.M.，Chan，H.T.，Morgan，B.P.，Filatov，A.V.，Johnson，P.W.， French，R.R.以及Glennie，M.J.(2003).《由抗CD20 mAb引起的补体介导的裂解与分离到 脂筏中相关(Complement-mediated lysis by anti-CD20 mAb correlates w ithsegregation into lipid rafts)》，Blood 101，1045-1052。
60.Gul，N.，Babes，L.，Siegmund，K.，Korthouwer，R.，Bogels，M.，Braster，R.，Vidarsson，G.，Ten Hagen，T.L.，Kubes，P.以及van Egmond，M.(2014).《巨噬细胞在单克隆抗体治疗之 后消除循环肿瘤细胞(Macrophages eliminate circulating tumor cellsafter monoclonal antibody therapy)》，The Journal of clinical investigation124，812-823。
61.Hamaguchi，Y.，Xiu，Y.，Komura，K.，Nimmerjahn，F.以及Tedder，T.F.(2006).《Fcγ 受体的抗体同种型特异性结合在CD20免疫治疗期间调节B淋巴细胞消耗(Antibodyisotype-specific engagement of Fcgamma receptors regulates B lymphocytedepletion during CD20 immunotherapy)》，The Journal of experimental medicine203，743-753。
62.Hussain，K.，Hargreaves，C.E.，Roghanian，A.，Oldham，R.J.，Chan，H.T.，Mockridge， C.I.，Chowdhury，F.，Frendeus，B.，Harper，K.S.，Strefford，J.C.等，(2015).《单核细胞上 FcγRIIb的上调是促进TGN1412的超级激动剂活性所必需的(Upregulationof FcgammaRIIb on monocytes is necessary to promote the superagonist activityof TGN1412)》，Blood 125，102- 110。
63.Lim，S.H.，Vaughan，A.T.，Ashton-Key，M.，Williams，E.L.，Dixon，S.V.，Chan，H.T.， Beers，S.A.，French，R.R.，Cox，K.L.，Davies，A.J.等，(2011).《靶B细胞上的Fcγ受体IIb 促进利妥昔单抗内化并且降低临床功效(Fc gamma receptor IIb on target Bcells promotes rituximab internalization and reduces clinical efficacy)》，Blood 118，2530-2540。
64.O′Brien，S.M.，Kantarjian，H.，Thomas，D.A.，Giles，F.J.，Freireich，E.J.，Cortes，J.， Lerner，S.以及Keating，M.J.(2001).《在慢性淋巴细胞性白血病中的利妥昔单抗剂量递增 试验(Rituximab dose-escalation trial in chronic lymphocyticleukemia)》，J Clin Oncol 19， 2165-2170。
65.Pallasch，C.P.，Leskov，I.，Braun，C.J.，Vorholt，D.，Drake，A.，Soto-Feliciano，Y.M.， Bent，E.H.，Schwamb，J.，Iliopoulou，B.，Kutsch，N.等，(2014).《使保护性肿瘤微环境对抗体 介导的治疗增敏(Sensitizing protective tumormicroenvironments to antibody-mediated therapy)》，Cell 156，590-602。
66.Romer，P.S.，Berr，S.，Avota，E.，Na，S.Y.，Battaglia，M.，ten Berge，I.，Einsele，H.以及 Hunig，T.(2011).《以高细胞密度预培养PBMC提高了T细胞响应的敏感性，揭示了由 CD28超级激动剂TGN1412引起的细胞因子释放(Preculture of PBMCs at highcell density increases sensitivity of T-cell responses，revealing cytokinerelease by CD28 superagonist TGN1412)》，Blood 118，6772-6782。
67.Vaughan，A.T.，Iriyama，C.，Beers，S.A.，Chan，C.H.，Lim，S.H.，Williams，E.L.，Shah， V.，Roghanian，A.，Frendeus，B.，Glennie，M.J.以及Cragg，M.S.(2014).《抑制性FcγRIIb (CD32b)由治疗性mAb以顺式和反式激活并且根据抗体特异性驱动内化(Inhibitory FcgammaRIIb(CD32b)becomes activated by therapeutic mAb in bothcis and trans and drives internalization according to antibody specificity)》，Blood 123，669-677。
实施例2：示例性药物制剂
虽然本发明的组合物、和/或抗体、和/或药剂、和/或药物有可能被单独施用，但是优 选的是，将它连同一种或多种可接受的载体一起作为药物制剂提供。所述一种或多种载体 必须在与本发明的组合物、和/或抗体、和/或药剂、和/或药物相容并且对其接受者无害的 意义上是“可接受的”。通常，所述载体将是将无菌和无热原的水或盐水。
以下实施例说明了根据本发明的药物和药物组合物，其中活性成分是本发明的抗体分 子和/或药剂。
实施例A：片剂
Figure RE-GSB0000199440020000731
通过湿法制粒，继而压制由上述成分制备片剂。
实施例B：眼用溶液
Figure RE-GSB0000199440020000732
实施例C：片剂制剂
通过用聚维酮溶液将成分湿法制粒，继而添加硬脂酸镁并且压制来制备以下制剂A和 B。
制剂A
Figure RE-GSB0000199440020000733
制剂B
Figure RE-GSB0000199440020000734
制剂C
Figure RE-GSB0000199440020000735
Figure RE-GSB0000199440020000741
通过直接压制混合的成分来制备以下制剂D和E。用于制剂E中的乳糖是直接压制型。
制剂D
Figure RE-GSB0000199440020000742
制剂E
Figure RE-GSB0000199440020000743
制剂F(受控释放制剂)
通过用聚维酮溶液将成分(以下)湿法制粒，继而添加硬脂酸镁并且压制来制备制剂。
Figure RE-GSB0000199440020000744
药物释放在约6小时-8小时的时间内进行，并且在12小时后完成。
实施例D：胶囊制剂
制剂A
通过将上述实施例C中制剂D的成分混合并且填充到两部分型硬明胶胶囊中来制备 胶囊制剂。以类似方式制备制剂B(下文)。
制剂B
Figure RE-GSB0000199440020000745
制剂C
Figure RE-GSB0000199440020000746
Figure RE-GSB0000199440020000751
通过使Macrogol 4000 BP熔融，将活性成分分散在熔体中并且将熔体填充到两部分型 硬明胶胶囊中来制备胶囊。
制剂D
Figure RE-GSB0000199440020000752
通过将活性成分分散在卵磷脂和花生油中并且将分散液填充到软弹性明胶胶囊中来制 备胶囊。
制剂E(受控释放胶囊)
通过使用挤出机将成分a、b以及c挤出，继而将挤出物球化并且干燥来制备以下受控释放胶囊制剂。然后将干燥的球粒用释放控制膜(d)包被并且填充到两件式硬明胶胶 囊中。
Figure RE-GSB0000199440020000753
实施例E：注射制剂
活性成分 0.200g
无菌无热原的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，达到10ml
将活性成分溶解在大部分的磷酸盐缓冲液(35℃-40℃)中，然后补足体积并且经由 无菌微孔过滤器过滤到无菌10ml琥珀色玻璃小瓶(1型)中并且用无菌闭合件和封口件密封。
实施例F：肌内注射剂
Figure RE-GSB0000199440020000754
将活性成分溶解在糖原糠醛中。然后添加苯甲醇并且溶解，并且添加水达到3ml。然 后将混合物经由无菌微孔过滤器过滤并且在无菌3ml玻璃小瓶(1型)中密封。
实施例G：糖浆悬浮液
Figure RE-GSB0000199440020000755
Figure RE-GSB0000199440020000761
将苯甲酸钠溶解在一部分的纯化水中并且添加山梨糖醇溶液。添加活性成分并且分 散。将增稠剂(可分散纤维素)分散在甘油中。将两种分散液混合并且用纯化水补足所需的体积。根据需要通过额外剪切所述悬浮液来实现进一步增稠。
实施例H：栓剂
Figure RE-GSB0000199440020000762
*活性成分是作为粉末使用的，其中至少90％的颗粒具有63μm或更小的直径。
将1/5的Witepsol H15在蒸汽夹套锅中在最高45℃下熔融。使活性成分经由200μm筛过筛并且使用装有切割头的silverson(高剪切混合器)，在混合下添加到熔融的基质中，直到实现均匀分散为止。将混合物维持在45℃，同时将其余Witepsol H15添加到悬 浮液中并且搅拌以确保均匀混合。使整个悬浮液通过250μm不锈钢筛网并且在连续搅拌 下，冷却到40℃。在38℃至40℃的温度下，将2.02g混合物填充到合适的塑料模具中。 使栓剂冷却到室温。
实施例I：子宫托
Figure RE-GSB0000199440020000763
将上述成分直接混合并且通过直接压制所得混合物来制备子宫托。
Figure RE-ISB0000199440040000011
Figure RE-ISB0000199440040000021
Figure RE-ISB0000199440040000031
Figure RE-ISB0000199440040000041
Figure RE-ISB0000199440040000051
Figure RE-ISB0000199440040000061
Figure RE-ISB0000199440040000071
Figure RE-ISB0000199440040000081
Figure RE-ISB0000199440040000091
Figure RE-ISB0000199440040000101
Figure RE-ISB0000199440040000111
Figure RE-ISB0000199440040000121
Figure RE-ISB0000199440040000131
Figure RE-ISB0000199440040000141
Figure RE-ISB0000199440040000151
Figure RE-ISB0000199440040000161
Figure RE-ISB0000199440040000171
Figure RE-ISB0000199440040000181
Figure RE-ISB0000199440040000191
Figure RE-ISB0000199440040000201
Figure RE-ISB0000199440040000211
Figure RE-ISB0000199440040000221
Figure RE-ISB0000199440040000231
Figure RE-ISB0000199440040000241
Figure RE-ISB0000199440040000251
Figure RE-ISB0000199440040000261
Figure RE-ISB0000199440040000271
Figure RE-ISB0000199440040000281
Figure RE-ISB0000199440040000291
Figure RE-ISB0000199440040000301
Figure RE-ISB0000199440040000311
Figure RE-ISB0000199440040000321
Figure RE-ISB0000199440040000331
Figure RE-ISB0000199440040000341
Figure RE-ISB0000199440040000351
Figure RE-ISB0000199440040000361
Figure RE-ISB0000199440040000371
Figure RE-ISB0000199440040000381
Figure RE-ISB0000199440040000391
Figure RE-ISB0000199440040000401
Figure RE-ISB0000199440040000411
Figure RE-ISB0000199440040000421
Figure RE-ISB0000199440040000431
Figure RE-ISB0000199440040000441
Figure RE-ISB0000199440040000451
Figure RE-ISB0000199440040000461
Figure RE-ISB0000199440040000471
Figure RE-ISB0000199440040000481
Figure RE-ISB0000199440040000491
Figure RE-ISB0000199440040000501
Figure RE-ISB0000199440040000511
Figure RE-ISB0000199440040000521
Figure RE-ISB0000199440040000531
Figure RE-ISB0000199440040000541
Figure RE-ISB0000199440040000551
Figure RE-ISB0000199440040000561
Figure RE-ISB0000199440040000571
Figure RE-ISB0000199440040000581
Figure RE-ISB0000199440040000591

Claims (53)

1.一种组合物，所述组合物包含：
(i)特异性结合靶细胞的细胞表面抗原的抗体分子，所述抗体分子具有能够结合FcγRIIb的Fc结构域；以及
(ii)阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂；
特征在于所述组合物用于治疗受试者的复发性癌症和/或难治性癌症，并且所述受试者有表达FcγRIIb的靶细胞。
2.组合物的用途，所述组合物包含：
(i)特异性结合靶细胞的细胞表面抗原的抗体分子，所述抗体分子具有能够结合FcγRIIb的Fc结构域；以及
(ii)阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂；
特征在于所述用途是用于制造用于治疗受试者的复发性癌症和/或难治性癌症的药物，并且所述受试者有表达FcγRIIb的靶细胞。
3.一种治疗受试者的复发性癌症和/或难治性癌症的方法，所述方法包括施用：
(i)特异性结合靶细胞的细胞表面抗原的抗体分子，所述抗体分子具有能够结合FcγRIIb的Fc结构域；以及
(ii)阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂，
特征在于所述受试者是基于其患有复发性癌症和/或难治性癌症来选择的，并且所述受试者有表达FcγRIIb的靶细胞。
4.一种用于治疗受试者的复发性癌症和/或难治性癌症的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)特异性结合靶细胞的细胞表面抗原的抗体分子，所述抗体分子具有能够结合FcγRIIb的Fc结构域；
(ii)阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂；
(iii)选自由以下各项组成的组的一种或多种物质：利妥昔单抗；利妥昔单抗生物仿制药；奥法木单抗；奥比妥珠单抗；阿仑单抗；加利昔单抗；托西莫单抗；放射性缀合的托西莫单抗；替伊莫单抗；放射性缀合的替伊莫单抗；抗CD40抗体；抗CD19抗体；抗CD37抗体；用于治疗B细胞癌的治疗性抗体；
特征在于所述用途是用于治疗受试者的复发性癌症和/或难治性癌症，并且所述受试者有表达FcγRIIb的靶细胞。
5.如权利要求1所述的组合物、或如权利要求2所述的用途、或如权利要求3所述的方法、或如权利要求4所述的试剂盒，其中所述复发性癌症和/或难治性癌症对抗体治疗具有抗性。
6.如权利要求1或5所述的组合物、或如权利要求2或5所述的用途、或如权利要求3或5所述的方法、或如权利要求4或5所述的试剂盒，其中所述复发性癌症和/或难治性癌症对如(i)中所限定的所述抗体分子具有抗性。
7.如权利要求1、5或6中任一项所述的组合物、或如权利要求2、5或6中任一项所述的用途、或如权利要求3、5或6中任一项所述的方法、或如权利要求4至6中任一项所述的试剂盒，其中所述药剂阻止或减少所述靶细胞上存在的FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合。
8.如权利要求1或5至7中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至7中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至7中任一项所述的方法、或如权利要求4至7中任一项所述的试剂盒，其中所述特异性结合靶细胞的细胞表面抗原的抗体分子能够以FcγRIIb依赖性方式被内化到所述靶细胞中，所述抗体分子具有能够结合FcγRIIb的Fc结构域。
9.如权利要求1、5至8中任一项所述的组合物、或如权利要求2、5至8中任一项所述的用途、或如权利要求3、5至8中任一项所述的方法、或如权利要求4至8中任一项所述的试剂盒，其中所述阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂另外阻止或减少所述抗体分子内化到所述靶细胞中。
10.如权利要求1或5至9中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至9中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至9中任一项所述的方法、或如权利要求4至9中任一项所述的试剂盒，其中如果所述受试者已经接受癌症治疗并且没有响应，和/或所述受试者已经接受癌症治疗，但是在所述治疗期间所述癌症在所述受试者中进展，那么所述难治性癌症被表征为是难治性癌症。
11.如权利要求10所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中如果所述受试者先前已经针对癌症接受治疗，但是实现少于部分缓解，那么所述受试者被表征为没有响应。
12.如权利要求1或5至9中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至9中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至9中任一项所述的方法、或如权利要求4至9中任一项所述的试剂盒，其中如果所述受试者先前已经针对癌症接受治疗并且先前已经对所述治疗作出响应，并且随后复发，那么所述复发性癌症被表征为是复发性癌症。
13.如权利要求12所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中如果所述受试者出现以下情况，那么所述受试者被表征为随后复发：
(i)在治疗后实现至少部分缓解和/或如果所述受试者在治疗后实现至少完全缓解，但是；
(ii)在所述治疗停止之后所述癌症在所述受试者中进展。
14.如权利要求13所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中所述受试者随后在所述治疗停止之后超过约1个月复发。
15.如权利要求13或14所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中所述受试者随后在所述治疗停止之后超过约1个月、或超过约2个月、或超过约3个月、或超过约4个月、或超过约5个月、或超过约6个月、或超过约7个月、或超过约8个月、或超过约9个月、或超过约10个月、或超过约11个月、或超过约12个月、或超过约2年、或超过约3年、或超过约4年、或超过约5年、或超过约6年、或超过约7年、或超过约8年、或超过约9年、或超过约10年复发。
16.如权利要求12至15中任一项所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中所述受试者表现出所述复发性癌症的特征至少一次、或至少两次、或至少三次、或至少四次、或至少五次、或至少六次、或至少七次、或至少八次、或至少九次、或至少十次。
17.如权利要求10至16中任一项所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中所述治疗是抗体治疗，例如如权利要求1至9中任一项的(i)中所限定的所述抗体分子，所述抗体治疗是在不存在如权利要求1至9中任一项的(ii)中所限定的药剂的情况下被施用的。
18.如权利要求17所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中所述治疗包括一种或多种治疗剂。
19.如权利要求1或5至18中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至18中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至18中任一项所述的方法、或如权利要求4至18中任一项所述的试剂盒，其中所述靶细胞包含升高水平的FcγRIIb表达。
20.如权利要求19所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中所述靶细胞上升高的FcγRIIb表达是相对于对照确定的。
21.如权利要求20所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中所述对照包含患有非难治性癌症和/或非复发性癌症的对照个体的对照细胞。
22.如权利要求20或21所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中所述受试者的靶细胞中所述升高的FcγRIIb表达在与所述对照相比时是至少2倍。
23.如权利要求1或5至22中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至22中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至22中任一项所述的方法、或如权利要求4至22中任一项所述的试剂盒，其中所述靶细胞是癌细胞。
24.如权利要求1或5至23中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至23中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至23中任一项所述的方法、或如权利要求4至23中任一项所述的试剂盒，其中所述靶细胞是B细胞。
25.如权利要求1或5至24中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至24中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至24中任一项所述的方法、或如权利要求4至24中任一项所述的试剂盒，其中所述复发性癌症、和/或所述难治性癌症、和/或所述癌细胞、和/或所述相同的癌症类型、和/或所述癌症选自包括以下各项的组：非霍奇金淋巴瘤；滤泡性淋巴瘤；弥漫性大B细胞淋巴瘤；套细胞淋巴瘤；慢性淋巴细胞性白血病；小淋巴细胞性淋巴瘤。
26.如权利要求10至25中任一项所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中所述受试者没有响应、和/或受试者部分缓解、和/或受试者完全缓解、和/或癌症在受试者中已经进展是通过测量来自包括以下各项的组的一个或多个来确定的：
(i)淋巴细胞计数；和/或
(ii)中性粒细胞计数；和/或
(iii)血小板计数；和/或
(iv)血红蛋白计数；和/或
(v)肿瘤细胞百分比；和/或
(vi)骨髓淋巴细胞百分比；和/或
(vii)循环淋巴细胞百分比；和/或
(viii)淋巴细胞上生物标志物的存在和/或不存在；和/或
(ix)癌症分期；和/或
(x)组织学检查；和/或
(xi)骨髓检查；和/或
(xii)细胞遗传学检查；和/或
(xiii)淋巴结评价；和/或
(xiv)身体症状；和/或
(xv)脾中癌细胞的减少。
27.如权利要求1或5至26中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至26中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至26中任一项所述的方法、或如权利要求4至26中任一项所述的试剂盒，其中所述药剂包括：多肽；或抗运载蛋白；或肽；或抗体；或嵌合抗体；或单链抗体；或适体；或darpin；或Fab、或F(ab′)2、或Fv、或ScFv或dAb抗体片段；或IgG2抗体；或IgG4抗体；或IgG2和IgG4的嵌合分子；或包含N297Q突变的抗体变体；或DANA变体抗体；或小分子；或天然产品；或亲和体；或拟肽；或核酸；或肽核酸分子；或脂质；或碳水化合物；或基于模块化框架的蛋白质，包括锚蛋白重复序列蛋白、或犰狳重复序列蛋白、或富含亮氨酸的蛋白质、或三十四肽重复序列蛋白、或设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)。
28.如权利要求1或5至27中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至27中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至27中任一项所述的方法、或如权利要求4至27中任一项所述的试剂盒，其中如(ii)中所限定的所述药剂是特异性结合FcγRIIb的一种或多种抗体分子。
29.如权利要求1或5至28中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至28中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至28中任一项所述的方法、或如权利要求4至28中任一项所述的试剂盒，其中如(ii)中所限定的所述药剂是不包括能够募集效应细胞的结构域的一种或多种抗体分子。
30.如权利要求28所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中如(ii)中所限定的所述药剂是一种或多种抗体分子，所述抗体分子是单克隆抗体分子、和/或多克隆抗体分子、和/或双特异性抗体分子。
31.如权利要求1或5至30中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至30中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至30中任一项所述的方法、或如权利要求4至30中任一项所述的试剂盒，其中所述药剂包含可变重链(VH)，所述可变重链包含以下CDR：
(i)SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52以及SEQ ID NO：53；或
(ii)SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58以及SEQ ID NO：59；或
(iii)SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64以及SEQ ID NO：65；或
(iv)SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：70以及SEQ ID NO：71；或
(v)SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76以及SEQ ID NO：77；或
(vi)SEQ ID NO：81和SEQ ID NO：82以及SEQ ID NO：83；或
(vii)SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88以及SEQ ID NO：89；或
(viii)SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：94以及SEQ ID NO：95；或
(ix)SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100以及SEQ ID NO：101；或
(x)SEQ ID NO：105和SEQ ID NO：106以及SEQ ID NO：107；或
(xi)SEQ ID NO：111和SEQ ID NO：112以及SEQ ID NO：113；或
(xii)SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118以及SEQ ID NO：119；或
(xiii)SEQ ID NO：123和SEQ ID NO：124以及SEQ ID NO：125；或
(xiv)SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：130以及SEQ ID NO：131；或
(xv)SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：136以及SEQ ID NO：137；或
(xvi)SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：142以及SEQ ID NO：143；或
(xvii)SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：148以及SEQ ID NO：149；或
(xviii)SEQ ID NO：153和SEQ ID NO：154以及SEQ ID NO：155；或
(xix)SEQ ID NO：159和SEQ ID NO：160以及SEQ ID NO：161；或
(xx)SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：166以及SEQ ID NO：167；或
(xxi)SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：172以及SEQ ID NO：173；或
(xxii)SEQ ID NO：177和SEQ ID NO：178以及SEQ ID NO：179；或
(xxiii)SEQ ID NO：183和SEQ ID NO：184以及SEQ ID NO：185；或
(xxiv)SEQ ID NO：189和SEQ ID NO：190以及SEQ ID NO：191。
32.如权利要求1或5至31中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至31中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至31中任一项所述的方法、或如权利要求4至31中任一项所述的试剂盒，其中所述药剂包含可变轻链(VL)，所述可变轻链包含以下CDR：
(i)SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55以及SEQ ID NO：56；或
(ii)SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61以及SEQ ID NO：62；或
(iii)SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67以及SEQ ID NO：68；或
(iv)SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73以及SEQ ID NO：74；或
(v)SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79以及SEQ ID NO：80；或
(vi)SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：85以及SEQ ID NO：86；或
(vii)SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91以及SEQ ID NO：92；或
(viii)SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：97以及SEQ ID NO：98；或
(ix)SEQ ID NO：102和SEQ ID NO：103以及SEQ ID NO：104；或
(x)SEQ ID NO：108和SEQ ID NO：109以及SEQ ID NO：110；或
(xi)SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：115以及SEQ ID NO：116；或
(xii)SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：121以及SEQ ID NO：122；或
(xiii)SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：127以及SEQ ID NO：128；或
(xiv)SEQ ID NO：132和SEQ ID NO：133以及SEQ ID NO：134；或
(xv)SEQ ID NO：138和SEQ ID NO：139以及SEQ ID NO：140；或
(xvi)SEQ ID NO：144和SEQ ID NO：145以及SEQ ID NO：146；或
(xvii)SEQ ID NO：150和SEQ ID NO：151以及SEQ ID NO：152；或
(xviii)SEQ ID NO：156和SEQ ID NO：157以及SEQ ID NO：158；或
(xix)SEQ ID NO：162和SEQ ID NO：163以及SEQ ID NO：164；或
(xx)SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：169以及SEQ ID NO：170；或
(xxi)SEQ ID NO：174和SEQ ID NO：175以及SEQ ID NO：176；或
(xxii)SEQ ID NO：180和SEQ ID NO：181以及SEQ ID NO：182；或
(xxiii)SEQ ID NO：186和SEQ ID NO：187以及SEQ ID NO：188；或
(xxiv)SEQ ID NO：192和SEQ ID NO：193以及SEQ ID NO：194。
33.如权利要求1或5至32中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至32中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至32中任一项所述的方法、或如权利要求4或5至32中任一项所述的试剂盒，其中所述药剂包含选自由以下序列组成的组的可变重链(VH)氨基酸序列：SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；SEQID NO：9；SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：14；SEQID NO：15；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20；SEQID NO：21；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；以及SEQ ID NO：26。
34.如权利要求1或5至33中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至33中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至33中任一项所述的方法、或如权利要求4至33中任一项所述的试剂盒，其中所述药剂包含选自由以下序列组成的组的可变轻链(VL)氨基酸序列：SEQID NO：27；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQID NO：33；SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：38；SEQID NO：39；SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：42；SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：44；SEQID NO：45；SEQ ID NO：46；SEQ ID NO：47；SEQ ID NO：48；SEQ ID NO：49；以及SEQ ID NO：50。
35.如权利要求1或5至34中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至34中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至34中任一项所述的方法、或如权利要求4至34中任一项所述的试剂盒，其中所述药剂包含以下CDR氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55以及SEQ ID NO：56；或
(ii)SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61以及SEQ ID NO：62；或
(iii)SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67以及SEQ ID NO：68；或
(iv)SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73以及SEQ ID NO：74；或
(v)SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79以及SEQ ID NO：80；或
(vi)SEQ ID NO：81和SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：85以及SEQ ID NO：86；或
(vii)SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88和SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91以及SEQ ID NO：92；或
(viii)SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：97以及SEQ ID NO：98；或
(ix)SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：102和SEQ ID NO：103以及SEQ ID NO：104；或
(x)SEQ ID NO：105和SEQ ID NO：106和SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：108和SEQ ID NO：109以及SEQ ID NO：110；或
(xi)SEQ ID NO：111和SEQ ID NO：112和SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：114和SEQ IDNO：115以及SEQ ID NO：116；或
(xii)SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118和SEQ ID NO：119和SEQ ID NO：120和SEQ IDNO：121以及SEQ ID NO：122；或
(xiii)SEQ ID NO：123和SEQ ID NO：124和SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126和SEQ IDNO：127以及SEQ ID NO：128；或
(xiv)SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：130和SEQ ID NO：131和SEQ ID NO：132和SEQ IDNO：133以及SEQ ID NO：134；或
(xv)SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138和SEQ IDNO：139以及SEQ ID NO：140；或
(xvi)SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：144和SEQ IDNO：145以及SEQ ID NO：146；或
(xvii)SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：148和SEQ ID NO：149和SEQ ID NO：150和SEQ IDNO：151以及SEQ ID NO：152；或
(xviii)SEQ ID NO：153和SEQ ID NO：154和SEQ ID NO：155和SEQ ID NO：156和SEQ IDNO：157以及SEQ ID NO：158；或
(xix)SEQ ID NO：159和SEQ ID NO：160和SEQ ID NO：161和SEQ ID NO：162和SEQ IDNO：163以及SEQ ID NO：164；或
(xx)SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：166和SEQ ID NO：167和SEQ ID NO：168和SEQ IDNO：169以及SEQ ID NO：170；或
(xxi)SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：174和SEQ IDNO：175以及SEQ ID NO：176；或
(xxii)SEQ ID NO：177和SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：179和SEQ ID NO：180和SEQ IDNO：181以及SEQ ID NO：182；或
(xxiii)SEQ ID NO：183和SEQ ID NO：184和SEQ ID NO：185和SEQ ID NO：186和SEQ IDNO：187以及SEQ ID NO：188；或
(xxiv)SEQ ID NO：189和SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：191和SEQ ID NO：192和SEQ IDNO：193以及SEQ ID NO：194。
36.如权利要求1或5至35中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至35中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至35中任一项所述的方法、或如权利要求4至35中任一项所述的试剂盒，其中所述药剂包含以下氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：27；或
(ii)SEQ IS NO：4和SEQ ID NO：28；或
(iii)SEQ IS NO：5和SEQ ID NO：29；或
(iv)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：30；或
(v)SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：31；或
(vi)SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：32；或
(vii)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：33；或
(viii)SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：34；或
(ix)SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：35；或
(x)SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：36；或
(xi)SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：37；或
(xii)SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：38；或
(xiii)SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：39；或
(xiv)SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：40；或
(xv)SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：41；或
(xvi)SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：42；或
(xvii)SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：43；或
(xviii)SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：44；或
(xix)SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：45；或
(xx)SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：46；或
(xxi)SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：47；或
(xxii)SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：48；或
(xxiii)SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：49；或
(xxiv)SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：50。
37.如权利要求1或5至30中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至30中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至30中任一项所述的方法、或如权利要求4至30中任一项所述的试剂盒，其中所述药剂是能够与如权利要求31至36中所限定的所述药剂竞争阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂。
38.如权利要求1或5至37中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至37中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至37中任一项所述的方法、或如权利要求4至37中任一项所述的试剂盒，其中所述药剂阻止或减少FcγRIIb信号转导。
39.如权利要求1或5至38中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至38中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至38中任一项所述的方法、或如权利要求4至38中任一项所述的试剂盒，其中所述药剂阻止或减少所述抗体分子由所述靶细胞内化。
40.如权利要求1或5至39中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至39中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至39中任一项所述的方法、或如权利要求4至39中任一项所述的试剂盒，其中所述细胞表面抗原选自包括以下各项的组：CD19；CD20；CD40；CD52。
41.如权利要求1或5至40中任一项所述的组合物、或如权利要求2或5至40中任一项所述的用途、或如权利要求3或5至40中任一项所述的方法、或如权利要求4至40中任一项所述的试剂盒，其中如(i)中所限定的所述抗体分子与CD20特异性结合。
42.如权利要求41所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中如(i)中所限定的所述抗体分子是I型CD20抗体。
43.如权利要求41所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中如(i)中所限定的所述抗体分子是II型CD20抗体。
44.如权利要求42所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中所述I型CD20抗体是利妥昔单抗、或利妥昔单抗生物仿制药、或奥法木单抗。
45.如权利要求43所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中所述II型
CD20抗体是奥比妥珠单抗、或托西莫单抗。
46.如权利要求40所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中如(i)中所限定的所述抗体分子是CD52抗体。
47.如权利要求46所述的组合物、或用途、或方法、或试剂盒，其中所述CD52抗体是阿仑单抗。
48.如权利要求1或5至47中任一项所述的组合物、或如权利要求4至47中任一项所述的试剂盒，其中所述组合物或试剂盒包含一种或多种治疗剂。
49.如权利要求2或5至47中任一项所述的用途，其中所述组合物还包含一种或多种治疗剂。
50.如权利要求3或5至47中任一项所述的方法，其中还向所述受试者施用一种或多种治疗剂。
51.如权利要求1或5至48中任一项所述的组合物、或如权利要求2、5至47或49中任一项所述的用途、或如权利要求1、5至47或50中任一项所述的方法、或如权利要求1或5至48中任一项所述的试剂盒，其中所述受试者患有难治性癌症或复发性癌症，或所述受试者患有难治性癌症和复发性癌症。
52.如权利要求1、5至49或51中任一项所述的组合物、或如权利要求2、5至47、49或51中任一项所述的用途、或如权利要求1、5至47、50或51中任一项所述的方法、或如权利要求1、5至48或50中任一项所述的试剂盒，其中所述受试者患有难治性慢性淋巴细胞性白血病或复发性慢性淋巴细胞性白血病，或所述受试者患有难治性慢性淋巴细胞性白血病和复发性慢性淋巴细胞性白血病。
53.一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其基本上如本文参考说明书、和/或实施例、和/或附图所述和/或要求保护。
CN202210363874.8A 2014-05-15 2015-05-15 药物、用途以及方法 Pending CN115025215A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1408673.0 2014-05-15
GB1408673.0A GB2526139A (en) 2014-05-15 2014-05-15 Medicaments, uses and methods
PCT/EP2015/060744 WO2015173384A1 (en) 2014-05-15 2015-05-15 Medicaments, uses and methods
CN201580037854.XA CN106687477B (zh) 2014-05-15 2015-05-15 药物、用途以及方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580037854.XA Division CN106687477B (zh) 2014-05-15 2015-05-15 药物、用途以及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115025215A true CN115025215A (zh) 2022-09-09

Family

ID=51134941

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580037854.XA Active CN106687477B (zh) 2014-05-15 2015-05-15 药物、用途以及方法
CN202210363873.3A Pending CN115025214A (zh) 2014-05-15 2015-05-15 药物、用途以及方法
CN202210363875.2A Pending CN114848811A (zh) 2014-05-15 2015-05-15 药物、用途以及方法
CN202210363874.8A Pending CN115025215A (zh) 2014-05-15 2015-05-15 药物、用途以及方法

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580037854.XA Active CN106687477B (zh) 2014-05-15 2015-05-15 药物、用途以及方法
CN202210363873.3A Pending CN115025214A (zh) 2014-05-15 2015-05-15 药物、用途以及方法
CN202210363875.2A Pending CN114848811A (zh) 2014-05-15 2015-05-15 药物、用途以及方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20170107293A1 (zh)
EP (2) EP3142696A1 (zh)
JP (2) JP7265310B2 (zh)
KR (2) KR20170005843A (zh)
CN (4) CN106687477B (zh)
AU (1) AU2015261422B2 (zh)
CA (1) CA2948834A1 (zh)
GB (1) GB2526139A (zh)
RU (1) RU2712283C2 (zh)
WO (1) WO2015173384A1 (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201013989D0 (en) 2010-08-20 2010-10-06 Univ Southampton Biological materials and methods of using the same
JP2019506844A (ja) 2015-12-18 2019-03-14 ノバルティス アーゲー ＣＤ３２ｂを標的とする抗体およびその使用方法
US11879014B2 (en) 2017-03-17 2024-01-23 Tusk Therapeutics Ltd. Method of treating cancer or depleting regulatory T cells in a subject by administering a human IGG1 anti-CD25 antibody
WO2018229706A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Novartis Ag Combination therapy for the treatment of cancer
WO2018229715A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Novartis Ag Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof
US20210040205A1 (en) 2017-10-25 2021-02-11 Novartis Ag Antibodies targeting cd32b and methods of use thereof
US20200362036A1 (en) * 2018-01-10 2020-11-19 Bioinvent International Ab Novel combination and use of antibodies
EP3919077A1 (en) 2020-06-04 2021-12-08 BioInvent International AB Model for prediction of tolerability issues in connection with intravenous administration of therapeutic antibodies
WO2021245233A1 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Bioinvent International Ab Improving antibody tolerabilty associated with intravenous administration

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2495251C (en) * 2002-08-14 2018-03-06 Macrogenics, Inc. Fc.gamma.riib-specific antibodies and methods of use thereof
US20090017023A1 (en) * 2002-08-14 2009-01-15 Macrogenics, Inc. FcGammaRIIB Specific Antibodies and Methods of Use Thereof
AU2003265522A1 (en) * 2003-08-18 2005-03-10 Macrogenics, Inc. FCGammaRIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
AU2005335714B2 (en) * 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
WO2008002933A2 (en) * 2006-06-26 2008-01-03 Macrogenics, Inc. Combination of fcgammariib antibodies and cd20-specific antibodies and methods of use thereof
WO2008140603A2 (en) * 2006-12-08 2008-11-20 Macrogenics, Inc. METHODS FOR THE TREATMENT OF DISEASE USING IMMUNOGLOBULINS HAVING FC REGIONS WITH ALTERED AFFINITIES FOR FCγR ACTIVATING AND FCγR INHIBITING
US20110280913A1 (en) * 2008-07-31 2011-11-17 The Ohio State University Methods and Compositions for Delivering Therapeutic Agents in the Treatment of B-Cell Related Disorders
KR101725170B1 (ko) * 2009-05-06 2017-04-10 바이오테스트 아게 Ｃｄ１３８을 표적으로 하는 면역접합체의 용도
GB201013989D0 (en) * 2010-08-20 2010-10-06 Univ Southampton Biological materials and methods of using the same

Also Published As

Publication number Publication date
GB201408673D0 (en) 2014-07-02
RU2016149132A3 (zh) 2018-12-26
EP3142696A1 (en) 2017-03-22
RU2712283C2 (ru) 2020-01-28
CA2948834A1 (en) 2015-11-19
CN115025214A (zh) 2022-09-09
WO2015173384A1 (en) 2015-11-19
CN114848811A (zh) 2022-08-05
EP4008352A1 (en) 2022-06-08
KR20170005843A (ko) 2017-01-16
AU2015261422B2 (en) 2020-10-01
JP2021113202A (ja) 2021-08-05
GB2526139A (en) 2015-11-18
CN106687477B (zh) 2022-04-26
JP2017517504A (ja) 2017-06-29
JP7265310B2 (ja) 2023-04-26
RU2016149132A (ru) 2018-06-19
KR20230128410A (ko) 2023-09-04
CN106687477A (zh) 2017-05-17
AU2015261422A1 (en) 2016-11-24
US20170107293A1 (en) 2017-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11623005B2 (en) Combined use of FcγRIIb (CD32B) and CD20 specific antibodies
CN106687477B (zh) 药物、用途以及方法
CN111683969A (zh) 抗体的新型组合和用途
RU2800035C2 (ru) Новая комбинация антител и ее применение

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40074577

Country of ref document: HK