KR20230128235A - 신규한 포말리도마이드 유도체, 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

신규한 포말리도마이드 유도체, 이의 제조방법 및 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20230128235A
KR20230128235A KR1020230024897A KR20230024897A KR20230128235A KR 20230128235 A KR20230128235 A KR 20230128235A KR 1020230024897 A KR1020230024897 A KR 1020230024897A KR 20230024897 A KR20230024897 A KR 20230024897A KR 20230128235 A KR20230128235 A KR 20230128235A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
present
acid
pomalidomide
usa
compound
Prior art date
Application number
KR1020230024897A
Other languages
English (en)
Inventor
김동석
황인호
김선
Original Assignee
주식회사 아이비스바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 아이비스바이오 filed Critical 주식회사 아이비스바이오
Publication of KR20230128235A publication Critical patent/KR20230128235A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)

Abstract

본 발명은 포말리도마이드에 비해 개선된 효과를 보이는 신규한 포말리도마이드 유도체와 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 포말리도마이드 유도체는 세레블론에 결합력이 매우 우수하고, 세포 독성이 거의 없으며, 최기형성 부작용 가능성이 낮고, TNF-α 및 전염증 사이토카인 발현을 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 산화적 스트레스를 억제하면서도 생체 내 약동학적 안정성이 우수한바, 상용화된 탈리도마이드계 약물에 비해 개선된 효과를 기대할 수 있다.

Description

신규한 포말리도마이드 유도체, 이의 제조방법 및 용도 {Novel pomalidomide derivative, manufacturing method thereof and use thereof}
본 발명은 포말리도마이드에 비해 개선된 약리 효과를 보이는 신규한 포말리도마이드 유도체와 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
탈리도마이드(Thalidomide)는 1950년대 후반부터 1960년대까지 임산부들의 입덧 방지용으로 판매된 약물이었으나, 최기형성의 부작용이 보고되면서 임산부는 물론 가임기에 있는 사람이나 임신 가능성이 있는 사람의 복용 및 취급이 금지되었다. 그러나, 탈리도마이드가 결절성 홍반(ENL) 치료와 HIV 소모성 증후군 및 다양한 암 치료에 임상적으로 효과적인 것으로 밝혀진 후 약제에 대한 관심이 다시 높아졌다.
ENL 활성에 대한 기전 연구로부터 항종양 괴사 인자 알파(항TNF-α) 작용을 확인하였는데, 구체적으로, 탈리도마이드(thalidomide)는 TNF-α RNA의 분해를 증가시켜 합성 및 분비를 저하시킨다. 추가 연구에서는 CD8+ 및 CD4+ T 세포 모두의 공동 자극제로 알려졌으며, 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 전사 인자인 NF-κB에 대한 억제제로써 혈관 신생 억제제로도 작용할 수 있음이 밝혀졌다.
TNF-α 및 그 패밀리 멤버들은 세포 증식 및 분화, 세포사멸, 면역 반응의 조절 및 염증 유도를 포함하는 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 중추적인 역할을 한다. TNF-α는 두 개의 수용체인 TNFR1과 TNFR2를 통해 작용하는데, 전자는 모든 조직에서 발현되며 TNF-α에 대한 주된 신호 수용체이다. 후자는 주로 면역 세포에서 발현되며 보다 제한된 생물학적 반응을 매개한다. 세포가 TNF-α에 노출되면 카스파제 캐스케이드(caspase cascade)가 활성화되어 세포사멸을 통해 세포가 죽을 수 있다. 실제로, 세포사멸을 개시할 수 있는 주요 세포 표면 분자는 TNF 패밀리 멤버의 리간드 및 수용체이다. 예를 들어, TNF 수용체 패밀리의 죽음을 유도하는 멤버 각각은 세포질 'death domain'(DD)을 포함하며, 이는 신호 전달 기전의 다운스트림 구성 요소에 결합하는 데 중요한 단백질-단백질 상호 작용 모티프이다.
최근 종양 괴사 인자와 관련된 세포 사멸 유도 리간드인 TRAIL은 대부분의 정상 세포가 아닌 종양 세포의 세포 사멸을 선택적으로 유도하는 것으로 나타났다. TRAIL은 흉선세포의 세포 사멸을 매개하고 자가면역질환의 유도에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 더 자주, TNF-α 수용체 결합은 전사 인자, AP-1 및 NF-κB의 활성화를 유도하고, 그 후 급성 및 만성 염증 반응에 관여하는 유전자를 유도한다. 따라서 TNF-α의 과잉 생산은 류마티스 관절염, 이식편대숙주병 및 크론병과 같은 많은 염증성 질환에 연루되어 있으며 ENL, 패혈성 쇼크, AIDS 및 알츠하이머병(AD)과 관련된 치매를 추가로 악화시키는 것으로 알려져 있다.
상용화된 탈리도마이드계 치료제로는 탈리도마이드, 보르테조밉, 레날리도마이드, 포말리도마이드가 있으며, 주사제인 보르테조밉은 꾸준히 시장을 유지하며 성장 추세이고, 경구제는 기존 탈리도마이드의 지위(position)를 레날리도마이드가 대체하며 시장에서 높은 성장세를 기록하고 있다. 레날리도마이드는 탈리도마이드의 차세대 약물로서 더 강력한 암세포 사멸과 면역 조절로 탈리도마이드보다 더 우수한 치료 효과를 보인다. 기존 치료에 재발하거나 치료 불응인 경우에 레날리도마이드와 덱사메타손을 병용하여 치료했을 때 무병생존기간이 13.4개월, 전체생존기간이 38개월로 상당히 효과적인 것으로 알려져 있다. 부작용은 기존의 탈리도마이드에서 나타났던 말초신경병증 등의 문제는 거의 없어졌으며, 단지 골수억제 부작용이 조금 더 심해졌지만, 백혈구 촉진인자 등을 투여하면 큰 문제가 없는 것으로 알려져 있다. 포말리도마이드는 2013년 미국 FDA에 의해 재발 및 내화 다발성 골수종 치료제로 승인되면서, 레날리도마이드와 보르테조밉을 포함한 적어도 2개의 종전 치료를 받은 사람들에게 마지막 치료가 완료된 후 60일 이내에도 질병이 진행되는 경우 사용된다. 포말리도마이드는 혈관 신생 및 골수종 세포 성장을 직접적으로 억제하는데, 이러한 이중 효과는 TNF-α 억제와 같은 다른 경로보다는 골수종에서의 활성이 중심이 된다. IFN-γ, IL-2 및 IL-10의 발현 강화뿐만 아니라 IL-6의 발현 억제를 통해 포말리도마이드는 항 혈관신생 및 항 골수종 활성을 나타낸다.
미국 등록특허 9,623,020에서는 탈리도마이드 유도체로 티오 화합물을 새로이 합성하였고, 이들 티오 화합물이 TNF-α 활성을 조절하고, TCR-자극 T 세포에 의한 면역 사이토카인의 발현을 변화시킬 수 있음을 확인한 바 있다.
본 발명자들은 상기 탈리도마이드의 약학적 효과를 개선하기 위한 추가적인 유도체를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, [화학식 1]의 화합물이 종래 탈리도마이드 유도체에 비해 동등 이상의 약학적 효과를 발휘하면서 생체 내에서는 약동학적 안정성이 현저히 개선될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
미국 등록특허 제9623020호
본 발명의 목적은 종래 알려진 탈리도마이드 계열 약물에 비해 개선된 약리 효과를 보이는 신규한 탈리도마이드 유도체, 이의 제조방법 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
본 발명은 또한, (a) DMSO 및 H2O 혼합 용매에 3,6'-디티오포말리도마이드를 용해시키고 가열시키는 단계;를 포함하는 상기 화합물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 혼합 용매는 DMSO : H2O 가 1 : 0.1 - 5 의 부피비로 혼합되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 가열은 80 내지 120℃에서 5 내지 30 시간 가열시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 상기 (a) 단계 이후, (b) 상기 화합물을 정제하는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 정제는 상기 (a) 단계에서 생성된 용액을 EtOAc로 희석한 후, 유기층을 건조시키고, SiO2 컬럼크로마토그래피로 정제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 염증 질환은 건선, 류마티스 관절염 및 크론병으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, [화학식 1]의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
[화학식 1]
.
본 발명은 또한, [화학식 1]의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 염증 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다:
[화학식 1]
.
본 발명은 또한, 염증 질환 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조를 위한 [화학식 1]의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다:
[화학식 1]
.
본 발명은 또한, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈관신생질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 혈관신생질환은 각박이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨성 망막증, 삼출형 가령황반변성, 당뇨병 황반부종, 신생혈관에 의한 각막질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 후수정체 섬유 증식증, 과립성 결막염, 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형, 동맥경화, 혈관유착 및 부종성 경화증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, [화학식 1]의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 혈관신생질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
[화학식 1]
.
본 발명은 또한, [화학식 1]의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 혈관신생질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다:
[화학식 1]
.
본 발명은 또한, 혈관신생질환 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조를 위한 [화학식 1]의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다:
[화학식 1]
.
본 발명에서 개발한 신규한 포말리도마이드 유도체는 세레블론에 결합력이 매우 우수하고, 세포 독성이 거의 없으며, 최기형성 부작용 가능성이 낮고, TNF-α 및 전염증 사이토카인 발현을 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 산화적 스트레스를 억제하면서도 생체 내 약동학적 안정성이 우수한바, 상용화된 탈리도마이드계 약물에 비해 개선된 효과를 기대할 수 있다.
도 1은 3-MP의 세레블론 결합 활성을 in vitro에서 경쟁적 저해 반응을 통해 포말리도마이드와 비교한 결과이다.
도 2은 포말리도마이드와 3-MP의 MM.1S 세포주에 대한 세포 독성을 평가한 결과이다.
도 3a는 포말리도마이드와 3-MP를 각각 MM.1S 세포에 처리하고, 세포 내 Ikaros, Aiolos 분해 효과를 면역 블라팅으로 비교한 결과이다.
도 3b는 포말리도마이드와 3-MP를 각각 MM.1S 세포에 처리하고, 세포 내 Ikaros, Aiolos의 시간대별 분해 효과를 면역 블라팅으로 비교한 결과이다.
도 4는 포말리도마이드와 3-MP를 각각 Tera-1 세포에 처리하고, 세포 내 SALL4 분해 정도를 면역 블라팅으로 비교한 결과이다.
도 5a는 포말리도마이드와 3-MP를 각각 PBMC 세포에 처리하고, 전-염증 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8의 생산 억제 효과를 mRNA 레벨에서 RT-PCR로 비교한 결과이다.
도 5b는 포말리도마이드와 3-MP를 각각 BV-2 세포에 처리하고, 전-염증 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 생산 억제 효과를 mRNA 레벨에서 RT-PCR로 비교한 결과이다.
도 6a는 포말리도마이드와 3-MP를 각각 RAW264.7 세포에 처리하고, 산화적 스트레스 억제 효과를 iNOS, COX-2에 대한 면역 블라팅으로 비교한 결과이다.
도 6b는 포말리도마이드와 3-MP를 각각 BV-2 세포에 처리하고, 산화적 스트레스 억제 효과를 세포 배양액 내 아질산염 함량을 측정하여 비교한 결과이다.
도 6c는 포말리도마이드와 3-MP를 각각 BV-2 세포에 처리하고, 산화적 스트레스 억제 효과를 iNOS, COX-2에 대한 면역 블라팅으로 비교한 결과이다.
도 6d는 포말리도마이드와 3-MP를 각각 BV-2 세포에 처리하고, 산화적 스트레스 억제 효과를 iNOS와 COX-2의 mRNA 레벨에서 RT-PCR로 비교한 결과이다.
도 7a는 3-MP의 혈장 안정성 분석을 위한 검량선을 나타낸다. 검량선의 선형방정식과 상관계수(r)는 그래프에 표시하였다. Y축은 표준물질의 피크 면적, X 축은 농도 (μg/mL)를 나타낸다.
도 7b는 시간에 따른 3-MP의 인간 혈장 내 안정성을 분석한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 포말리도마이드를 개량한 티오 화합물를 제조하고, 상기 신규 화합물의 약학적 효능을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명에 따른 신규 화합물은 그 모체인 포말리도마이드와 비교하여 세레블론 결합 활성이 우수하였으며, 세포 독성도 적어 생체 내 안전성이 우수한 것으로 확인되었다. 또한, 본 발명에 따른 신규 화합물은 세레블론의 기질인 Aiolos와 Ikaros와 SALL4의 분해를 포말리도마이드와 같이 강력하게 유도하지 않아 탈리도마이드계 화합물에 의해 야기되는 주요 부작용이 감소할 수 있음을 알 수 있었다.
한편, 본 발명에 따른 신규화합물은 다양한 전 염증 사이토카인 발현을 억제할 수 있었고, 산화적 스트레스를 억제하며, 정맥 내 투여, 경구 투여 및 복강 내 투여와 같이 다양한 투여 경로에서 모두 생체 내 안정성을 장시간 유지하는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 [화학식 1] 표시되는 신규 화합물에 관한 것이다:
[화학식 1]
본 발명에 있어서, [화학식 1]의 화합물은 3-티오포말리도마이드(3-thiopomalidomide)로 명명될 수 있고, C13H13N3O3S의 화학식으로 표시될 수 있으며, 분자량 289.31을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서, [화학식 1]의 화합물은 3-MP로 약칭될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 (a) DMSO 및 H2O 혼합 용매에 3,6'-디티오포말리도마이드를 용해시키고 가열시키는 단계를 포함하는 [화학식 1]의 화합물 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 혼합 용매는 DMSO: H2O 가 1: 0.1 - 5의 부피비로 혼합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 1: 0.2 - 1, 더 바람직하게는 1: 0.3 - 0.8의 부피비로 혼합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 혼합 용매 100ml당 0.1 내지 20 mmol의 3,6'-디티오포말리도마이드를 용해시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 혼합 용매 100ml 당 1 내지 10 mmol, 더 바람직하게는 혼합 용매 100ml 당 3 내지 5 mmol의 5ml 3,6'-디티오포말리도마이드를 용해시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 가열은 80 내지 120℃에서 5 내지 30시간 가열시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 온도 범위는 바람직하게는 90 내지 110℃더 바람직하게는 95 내지 105℃이고, 상기 가열 시간은 바람직하게는 10 내지 25 시간, 더욱 바람직하게는 15 내지 20시간인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 상기 (a) 단계의 가열 후, (b) 상기 화합물을 정제하는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 정제는 상기 (a) 단계에서 생성된 용액을 EtOAc로 희석한 후, 유기층을 건조시키고, SiO2 컬럼크로마토그래피로 정제하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 EtOAc로 희석된 용액은 세척될 수 있으며, 상기 세척은 H20 및/또는 염수로 세척되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 세척은 H2O로 2회 및 염수로 1회 이상 세척하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 세척 후에는 EtOAc를 첨가하여 수성층을 추출할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 수성층이 추출된 후 유기층은 합하여 건조시킬 수 있으며, 이 경우 MgSO4 상에서 건조되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 건조물은 여과 후 농축시킬 수 있으며, 잔류물을 컬럼크로마토그래로 정제하여 본 발명 화합물의 순도를 높일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 컬럼크로마토그래피는 실리카젤 (SiO2) 컬럼크로마토그래피인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 아미노 실리카젤 (NH2-SiO2) 또는 역상 실리카젤 (C18-SiO2) 실리카젤 (SiO2) 컬럼크로마토그래피인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
SiO2 컬럼크로마토그래피를 이용하여 정제하는 경우, 상기 컬럼크로마토그래피에는 아세톤과 1 ~ 5 mL 의 DMSO 혼합물에 잔류물 1 ~ 2 g을 용해시켜 코팅하고, 실리카젤과 혼합한 후, 회전 증발시킨 실리카젤을 로딩하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이후 CHCl3 : 아세톤 = 20:1 - 9:1로 혼합된 용액을 이용하여 본 발명 화합물을 분리하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 본 발명 화합물은 이후 재결정을 통해 추가 정제될 수 있으며, 이 경우, 상기 재결정법에 사용되는 용매는 CHCl3, CH2Cl2 및 EtOAc 로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 염증 질환은 건선, 류마티스 관절염 및 크론병으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
다른 양태로서, [화학식 1]의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증 질환 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다:
[화학식 1]
.
또 다른 양태로서, 본 발명은 또[화학식 1]의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 염증 질환 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다:
[화학식 1]
.
또 다른 양태로서, 본 발명은 염증 질환 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조를 위한 [화학식 1]의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다:
[화학식 1]
.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 혈관신생질환은 각박이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨성 망막증, 삼출형 가령황반변성, 당뇨병 황반부종, 신생혈관에 의한 각막질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 후수정체 섬유 증식증, 과립성 결막염, 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형, 동맥경화, 혈관유착 및 부종성 경화증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
다른 양태로서, [화학식 1]의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 혈관신생질환 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다:
[화학식 1]
.
또 다른 양태로서, 본 발명은 또[화학식 1]의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 혈관신생질환 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다:
[화학식 1]
.
또 다른 양태로서, 본 발명은 혈관신생질환 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조를 위한 [화학식 1]의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다:
[화학식 1]
.
본 발명에서, 용어 “약학적 조성물(pharmaceutical composition)”또는 약학적 제형(pharmaceutical formulation)”은 본 발명의 신규 화합물에 생체 내 또는 생체 외 진단 또는 치료 용도에 특히 적합하게 만드는 희석제 또는 담체와 같은 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 혼합물을 의미한다. 일부 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물을 포함하는 약학적 조성물은 그 필요에 따라 대상체에게 치료적 유효량으로 투여하는 방법으로 제공될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물은 인간에게 투여할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "유효량(effective amount)”또는 "치료적 유효량 (therapeutically-effective amount)"은 유익하거나 원하는 결과를 달성하기에 충분한 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 본 발명의 화합물 또는 조성물)의 양을 지칭한다. 유효량은 하나 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있으며 특정 제제 또는 투여 경로로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
　본 발명에서　“약학적으로 허용가능한 염”은　약학적으로　허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산 부가염을 형성하는 산, 예를 들어,황산,　염산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산과, 타르타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 젖산, 말론산, 말산, 살리실산, 숙신산, 옥살산, 프로피온산, 아스파르탄산, 글루탐산, 구연산 등과 같은 유기산과, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염일 수 있고, 유리 카르복시 치환체를 포함하는 본 발명에 따르는 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 상기의 산 부가염　및 나트륨, 칼슘 및 암모늄의　염일 수 있으며,　약학적으로 허용가능한 염이기 부가염, 예를 들어, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속　염과, 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등의 아미노산　염과, 디사이클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스 (하이드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린, 트리에틸 아민 등과 같은 유기염일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 통상적인 방법에 의해 그의　염으로 전환될 수 있으며,　염의 제조는 별도의 설명이 없이도 상기 화학식 1의 구조를 바탕으로 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있을 것이다.
본 발명에서 제공되는 약학적 조성물은 원칙적으로 인간에게 투여하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이지만, 통상의 기술자는 이러한 조성물이 일반적으로 모든 종류의 동물에게 투여하기 적합함을 이해할 것이다. 즉, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 수의학적 치료를 필요로 하는 동물, 예를 들어, 가축 (예: 개, 고양이 등), 농장 동물 (예 : 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험실 동물 (예 : 쥐, 생쥐, 기니피그 등)과 같은 다른 포유 동물에게도 투여될 수 있다. 다양한 동물에게 투여하기 위한 약학적 조성물의 변형을 잘 이해하고, 숙련된 수의학 약리학자는 필요하다면 단순히 통상적인 실험으로 이러한 변형을 설계 및/또는 수행할 수 있다.
본 발명에서 기술한 약학적 조성물은 약리학 분야에 알려져 있거나 이후 내용에서 전개되는 임의의 방법에 의해 제조될 수도 있다. 일반적으로, 이러한 정제용 방법은 활성 성분을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 연관시키는 단계를 포함하고, 이어서 필요하거나 원하는 경우 생성물을 원하는 단일- 또는 다중-용량 단위로 성형 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 단일 단위 용량 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로서 제조, 포장, 및/또는 포장하지 않은 채로 판매될 수도 있다. 본원에서 사용하는 바와 같이, "단위 용량"은 사전 설정된 양의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물의 개별적인 양이다. 활성 성분의 양은 대상체에게 투여되는 활성 성분의 투여량 및/또는 그러한 투여량의 편리한 분획 예컨대 예를 들어 투여량의 1/2 또는 1/3과 일반적으로 동일하다.
본 발명의 약학적 조성물 내 활성 성분, 제약상 허용되는 부형제, 및/또는 임의의 추가 성분의 상대량은 치료 대상체의 동일성, 크기, 및/또는 장애에 따라 그리고 조성물이 투여되는 경로에 따라 변할 것이다. 예로서, 조성물은 0.001％ 내지 100％ (w/w) 활성 성분을 포함할 수도 있다.
본 발명에서 사용하는 바와 같이, 제약상 허용되는 부형제는 특정한 투여 형태 목적에 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 희석제, 또는 다른 액체 비히클, 분산액 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제 등을 포함한다. 레밍턴(Remington)의 문헌[The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, (Lippincott, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD, 2006]은 약학적 조성물 조제에 사용된 다양한 부형제 및 이의 제조를 위한 공지된 기술을 개시한다. 임의의 통상적인 담체 배지가 예컨대 임의의 원하지 않는 생물학적 효과를 제공하거나 다르게는 약학적 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용함으로써 물질 또는 그 유도체와 공존할 수 없는 것을 제외하고, 그 용도는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려한다. 제약상 허용되는 부형제는 적어도 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 순수하다.
상기 부형제는 인간 및 수의학적 용도에서 승인되어 있다. 일부 실시예에서, 부형제는 미국식품의 약품국에 의해 승인되어 있다. 일부 실시예에서, 부형제는 제약 등급이다. 일부 실시예에서, 부형제는 미국 약전(USP), 유럽 약전(EP), 영국 약전, 및/또는 국제 약전(EP)의 표준을 충족한다.
약학적 조성물의 제조에 사용된 제약상 허용되는 부형제는 불활성 희석제, 분산제 및/또는 과립화제, 표면 활성제 및/또는 유화제, 붕해제, 결합제, 보존제, 완충제, 윤활제, 및/또는 오일을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
이러한 부형제는 임의로 본 발명의 제제에 포함될 수도 있다. 부형제 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스, 착색제, 코팅제, 감미제, 향미제, 및 퍼퓸제는 조제사의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다.
예시적인 희석제는 탄산칼슘, 탄산나트륨, 인산칼슘, 인산이칼슘, 황산칼슘, 칼슘 히드로겐 포스페이트, 인산나트륨 락토스, 수크로스, 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 염화나트륨, 건조 전분, 옥수수 전분, 분말형 당, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 과립화제 및/또는 분산제는 감자 전분, 옥수수 전분, 타피오카 전분, 소듐 스타치 글리콜레이트, 점토, 알긴산, 구아 검, 시트러스 펄프, 한천, 벤토나이트, 셀룰로스 및 목재 생성물, 천연 스폰지, 양이온-교환 수지, 탄산칼슘, 규산염, 탄산나트륨, 가교-결합형 폴리(비닐-피롤리돈) (크로스포비돈), 소듐 카르복시메틸전분 (소듐 스타치 글리콜레이트), 카르복시메틸 셀룰로스, 가교-결합형 소듐 카르복시메틸 셀룰로스 (크로스카르멜로스), 메틸셀룰로스, 예비젤라틴화 전분 (전분 1500), 미세결정질 전분, 수불용성 전분, 칼슘 카르복시메틸 셀룰로스, 규산알루미늄마그네슘 (비검), 소듐 라우릴 술페이트, 4급 암모늄 화합물, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 표면 활성제 및/또는 유화제는 천연 유화제 (예를 들어 아카시아, 한천, 알긴산, 알긴산나트륨, 트라가칸트, 촌드럭스(chondrux), 콜레스테롤, 크산탄, 펙틴, 젤라틴, 난황, 카세인, 양모 지방, 콜레스테롤, 왁스, 및 레시틴), 콜로이드성 점토 (예를 들어 벤토나이트 [규산알루미늄] 및 비검 [규산알루미늄마그네슘]), 장쇄 아미노산 유도체, 고분자량 알콜 (예를 들어 스테아릴 알콜, 세틸 알콜, 올레일 알콜, 트리아세틴 모노스테아레이트, 에틸렌 글리콜 디스테아레이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 및 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리비닐 알콜), 카르보머 (예를 들어 카르복시 폴리메틸렌, 폴리아크릴산, 아크릴산 중합체, 및 카르복시비닐 중합체), 카라기난, 셀룰로스 유도체 (예를 들어 카르복시메틸셀룰로스 소듐, 분말화 셀룰로스, 히드록시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스), 소르비탄 지방산 에스테르 (예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트 [트윈 20], 폴리옥시에틸렌 소르비탄 [트윈 60], 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 [트윈 80], 소르비탄 모노팔미테이트 [스팬 40], 소르비탄 모노스테아레이트 [스팬 60], 소르비탄 트리스테아레이트 [스팬 65], 글리세릴 모노올레에이트, 소르비탄 모노올레에이트 [스팬80]), 폴리옥시에틸렌 에스테르 (예를 들어 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트 [미르즈 45], 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자 오일, 폴리에톡실화 피마자 오일, 폴리옥시메틸렌 스테아레이트, 및 솔루톨), 수크로스 지방산 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스테르 (예를 들어 크레모포르), 폴리옥시에틸렌 에테르, (예를 들어 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르 [브리즈 30]), 폴리(비닐-피롤리돈), 디에틸렌 글리콜 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 올레산나트륨, 칼륨 올레에이트, 에틸 올레에이트, 올레산, 에틸 라우레이, 소듐 라우릴 술페이트, 플루로닉 F 68, 폴록사머 188, 세트리모늄 브로마이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 벤즈알코늄클로라이드, 도큐세이트 소듐, 및/또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 결합제는 전분 (예를 들어 옥수수 전분 및 전분 페이스트); 젤라틴; 당 (예를 들어 수크로스, 글루코스, 덱스트로스, 덱스트린, 당밀, 락토스, 락티톨, 만니톨); 천연 및 합성 검 (예를 들어 아카시아, 알긴산나트륨, 아이리쉬 모스의 추출물, 판워 검, 섀티 검, 이사폴 후스크스의 점액, 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 폴리(비닐-피롤리돈), 규산알루미늄마그네슘 (비검), 및 라치 아라보갈락탄); 알기네이트; 폴리에틸렌 옥시드; 폴리에틸렌 글리콜; 무기 칼슘 염; 규산; 폴리메타크릴레이트; 왁스; 물; 알콜; 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 보존제는 항산화제, 킬레이트화제, 항미생물 보존제, 항진균 보존제, 알콜 보존제, 산성 보존제, 및 다른 보존제를 포함할 수도 있다. 예시적인 항산화제는 알파 토코페롤, 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 모노티오글리세롤, 메타중아황산칼륨, 프로피온산, 프로필 갈레이트, 아스코르브산나트륨, 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 및 아황산나트륨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 킬레이트화제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 시트르산 1수화물, 이나트륨 에데테이트, 이칼륨 에데테이트, 에데트산, 푸마르산, 말산, 인산, 소듐 에데테이트, 타르타르산, 및 트리소듐 에데테이트를 포함한다. 예시적인 항미생물 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 벤질 알콜, 브로노폴, 세트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로로크실레놀, 크레졸, 에틸 알콜, 글리세린, 헥세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알콜, 페닐질산수은 (phenylmercuric nitrate), 프로필렌 글리콜, 및 티메로살을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 항진균 보존제는 부틸 파라벤, 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 벤조산, 히드록시벤조산, 칼륨 벤조에이트, 소르브산칼륨, 벤조산나트륨, 프로피온산나트륨, 및 소르브산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 알콜 보존제는 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 페놀, 페놀계 화합물, 비스페놀, 클로로부탄올, 히드록시벤조에이트, 및 페닐에틸 알콜을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 산성 보존제는 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 베타-카로틴, 시트르산, 아세트산, 데히드로아세트산, 아스코르브산, 소르브산, 및 피트산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 보존제는 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 데테록시메 메실레이트, 세트리미드, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔드 (BHT), 에틸렌디아민, 소듐 라우릴 술페이트 (SLS), 소듐 라우릴 에테르 술페이트 (SLES), 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 칼륨 술파이트, 메타중아황산칼륨, 글리단트 플러스, 페노닙, 메틸파라벤, 저몰 115, 게르마벤 II, 네올론, 카톤, 및 에욱실을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시예에서, 보존제는 항-산화제이다. 다른 실시예에서, 보존제는 킬레이트화제이다.
예시적인 완충제는 시트레이트 완충 용액, 아세테이트 완충 용액, 포스페이트 완충제 용액, 염화암모늄, 탄산칼슘, 염화칼슘, 칼슘 시트레이트, 칼슘 글루비오네이트, 칼슘 글루셉테이트, 칼슘 글루코네이트, D-글루콘산, 글리세로인산칼슘, 락트산칼슘, 프로판산, 칼슘 레불리네이트, 펜탄산, 이염기성 인산칼슘, 인산, 삼염기성 인산칼슘, 수산화칼슘 포스페이트, 아세트산칼륨, 염화칼륨, 글루콘산칼륨, 칼륨 혼합물, 이염기성 인산칼륨, 일염기성 인산칼륨, 인산칼륨 혼합물, 아세트산나트륨, 중탄산나트륨, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 락트산나트륨, 이염기성 인산나트륨, 일염기성 인산나트륨, 인산나트륨 혼합물, 트로메타민, 수산화마그네슘, 수산화알루미늄, 알긴산, 피로겐-자유수, 등장성 염수, 링거(Ringer's) 용액, 에틸 알콜, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 윤활제는 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘, 스테아르산, 실리카, 활석, 맥아, 글리세릴 베하네이트, 수소화 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 류신, 마그네슘 라우릴 술페이트, 소듐 라우릴 술페이트, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 오일은 아몬드, 살구 커넬, 아보카도, 바바수야자, 베르가모트, 흑색 커런트 종자, 보리지, 케이드, 카모마일, 카놀라, 카라웨이, 카르나우바, 카스토르, 시나몬, 코코아 버터, 코코넛, 대구 간, 커피, 옥수수, 목화 종자, 에뮤, 유칼립투스, 달맞이꽃, 생선, 아마 씨, 게라니올, 호박, 포도 종자, 개암, 히솝, 이소프로필 미리스테이트, 호호바, 쿠쿠이 넛, 라반딘, 라벤더, 레몬, 리트세아 쿠베바, 마카데미아 넛, 아욱, 망고 종자, 메도우폼 종자, 밍크, 넛멕, 올리브, 오렌지색의 오렌지색 라피, 팜, 팜핵, 복숭아 커넬, 땅콩, 양귀비 종자, 호박 종자, 평지씨, 쌀겨, 로즈마리, 홍화, 샌달우드, 사스쿠아나, 세이보리, 산자나무, 참깨, 시어 버터, 실리콘, 대두, 해바라기, 티트리, 엉겅퀴, 쓰바키, 베티버, 호두, 및 밀 배아 오일을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 오일은 부틸 스테아레이트, 카프릴산 트리글리세리드, 카프르산 트리글리세리드, 시클로메티콘, 디에틸 세바케이트, 디메티콘 360, 이소프로필 미리스테이트, 미네랄 오일, 옥틸도데칸올, 올레일 알콜, 실리콘 오일, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
경구 및 비경구 투여를 위한 액체 투여 형태는 제약상 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 활성 성분 외에, 액체 투여 형태는 본 기술분야에 공동으로 사용된 불활성 희석제 예컨대, 예를 들어, 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제 예컨대 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일 (특히, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 싹, 올리브, 아주까리, 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알콜, 소르비탄의 폴리에틸렌 글리콜 및 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 포함할 수도 있다. 불활성 희석제 외에, 경구 조성물은 아주반트 예컨대 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 감미제, 향미제, 및 퍼퓸제를 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 특정 실시예에서, 본 발명의 신규 화합물는 가용화제 예컨대 크레모포르, 알콜, 오일, 변성 오일, 글리콜, 폴리소르베이트, 시클로덱스트린, 중합체, 및 이들의 조합과 혼합된다.
주사가능한 제제, 예를 들어, 멸균 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액은 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 공지된 기술 분야에 따라 조제될 수도 있다. 멸균 주사가능한 제제는 비독성 비경구 허용되는 희석제 또는 용매, 예를 들어, 1,3-부탄디올 내 용액에서의 멸균 주사가능한 용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수도 있다. 허용되는 비히클 및 용매 중에서 채택될 수도 있는 것은 물, 링거(Ringer's) 용액, U.S.P. 및 등장성 염화나트륨용액이다. 또한, 멸균, 고정 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 채택되고 있다. 이를 위하여 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하는 임의의 무자극 고정 오일이 채택될 수 있다. 또한, 지방산 예컨대 올레산이 주사제의 제조에 사용되고 있다.
주사가능한 제제는 예를 들어 박테리아-보유 필터를 통한 여과에 의해, 또는 사용 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사가능한 배지에 용해 또는 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태인 멸균제를 포함시킴으로써 멸균될 수 있다.
약물의 효과를 연장하기 위하여, 흔히 피하 또는 근육내 주사로부터 약물의 흡수를 느리게 하는 것이 바람직하다. 이는 낮은 수용해도를 갖는 결정질 또는 무정형 물질의 액체 현탁액을 사용함으로써 이루어진다. 그러면 약물의 흡수율은 결국 결정 크기 및 결정질 형태에 좌우될 수 있는 용해율에 좌우된다. 대안으로, 비경구 투여 약물의 지연된 흡수는 오일 비히클에서 약물을 용해 또는 현탁화함으로써 이루어진다.
경구 투여를 위한 고체 투여 형태는 캡슐, 정제, 환제, 분말, 및 과립을 포함한다. 이러한 고체 투여 형태에서, 활성 성분은 하나 이상의 불활성 제약상 허용되는 부형제 또는 담체 예컨대 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘 및/또는 a) 충전제 또는 증량제 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨, 및 규산, b) 결합제 예컨대, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리디논, 수크로스, 및 아카시아, c) 함습제 예컨대 글리세롤, d) 붕해제 예컨대 한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염, 및 탄산나트륨, e) 용해 지연제 예컨대 파라핀, f) 흡수 촉진제 예컨대 4급 암모늄 화합물, g) 습윤제 예컨대, 예를 들어, 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트, h) 흡수제 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토, 및 i) 윤활제 예컨대 활석, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 술페이트, 및 이들의 혼합물과 혼합되어 있다.
캡슐의 경우, 정제 및 환제, 투여 형태는 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물은 락토스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 그러한 부형제로서 사용하는 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 채택될 수도 있다. 정제, 당의정, 캡슐, 환제, 및 과립의 고체 투여 형태는 코팅 및 쉘 예컨대 장용 코팅 및 제약 조제 분야에 잘 알려진 다른 코팅과 함께 제조될 수 있다. 이들은 임의로 불투명화제를 포함할 수도 있고, 활성 성분만을, 또는 우선적으로, 장관의 특정 부분, 임의로는 지연된 방식으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 포매 조성물의 예는 중합체 물질 및 왁스를 포함한다. 유사한 유형의 고체 조성물은 락토스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 그러한 부형제로서 사용하는 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 채택될 수도 있다.
활성 성분은 상술한 하나 이상의 부형제와 함께 마이크로-캡슐화된 형태일 수 있다. 정제, 당의정, 캡슐, 환제, 및 과립의 고체 투여 형태는 코팅 및 쉘 예컨대 장용 코팅, 방출 제어 코팅 및 제약 조제 분야에 잘 알려진 다른 코팅과 함께 제조될 수 있다. 이러한 고체 투여 형태에서 활성 성분은 하나 이상의 불활성 희석제 예컨대 수크로스, 락토스 또는 전분과 혼합될 수도 있다. 이러한 투여 형태는 보통 실시에서처럼 불화성 희석제가 아닌 추가 물질, 예를 들어, 정제 윤활제 및 다른 정제 보조제 예컨대 스테아르산마그네슘 및 미세결정질 셀룰로스를 포함할 수 있다. 캡슐의 경우, 정제 및 환제, 투여 형태는 완충제를 포함할 수도 있다. 이들은 임의로 불투명화제를 포함할 수도 있고, 활성 성분만을, 또는 우선적으로, 장관의 특정 부분, 임의로는 지연된 방식으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 포매 조성물의 예는 중합체 물질 및 왁스를 포함한다.
본 발명의 신규 화합물 또는 이를 함유하는 약학적 조성물의 국소 및/또는 경피 투여를 위한 투여 형태는 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 및/또는 패치를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 활성 성분은 멸균 장애하에서 제약상 허용되는 담체 및/또는 임의의 필요한 보존제 및/또는 요구될 수도 있는 완충제와 혼합되어 있다. 추가로, 본 발명은 흔히 활성 성분의 몸체로의 제어된 전달을 제공하는 추가 장점을 갖는 경피 패치의 사용을 고려한다. 이러한 투여 형태는 예를 들어 활성 성분을 적당한 배지에 융해 및/또는 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 비율 제어 막을 제공하고/거나 활성 성분을 중합체 매트릭스 및/또는 겔에 분산시킴으로써 비율이 제어될 수도 있다.
국소 투여를 위한 제제는 액체 및/또는 세미 액체 제제 예컨대 도찰제, 로션, 수중유 및/또는 유중수 에멀젼 예컨대 크림, 연고/또는 페이스트, 및/또는 용액 및/또는 현탁액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 활성 성분의 농축이 용매 내 활성 성분의 용해도 한계만큼 높을 수도 있지만, 국소-투여가능한 제제는 예를 들어 약 1％ 내지 약 10％ (w/w) 활성 성분을 포함할 수도 있다. 국소 투여를 위한 제제는 본원에서 기술한 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수도 있다.
본원에서 기술한 본 발명의 신규 화합물 또는 이를 함유하는 약학적 조성물은 전형적으로 쉬운 투여 및 균일한 투여를 위하여 투여 단위 형태로 제조된다. 그러나 본 발명의 조성물의 총 일일 용법은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서 담당의에 의해 결정될 것임을 이해하게 될 것이다. 임의의 특정 대상체에 대한 특정한 치료 유효 용량 수준은 질환, 장애, 또는 치료 중인 장애 및 장애의 심각도를 포함하는 다양한 인자; 채택된 특정 활성 성분의 활성; 채택된 특정 조성물; 대상체의 나이, 체중, 전반적인 건강, 성별 및 다이어트; 채택된 특정 활성 성분의 투여 시간, 투여 경로, 및 배설율; 치료 기간; 채택된 특정 활성 성분과 조합하거나 동시에 사용한 약물; 및 의료 분야에 잘 알려진 인자 등에 좌우될 것이다.
본 발명의 신규 화합물, 이의 염, 또는 이의 약학적 조성물은 임의의 경로로 투여될 수도 있다. 일부 실시예에서, 신규 화합물, 이의 염, 또는 이의 약학적 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 척수강내, 피하, 뇌실내, 경피, 피내, 직장, 질내, 복강내, 국소(분말, 연고, 크림, 및/또는 액적에 의함), 점막, 코, 입, 경장, 설하; 기관내 점적주입, 기관지 점적주입, 및/또는 흡입; 및/또는 경구 스프레이, 비강 스프레이, 및/또는 에어로졸을 포함하는 다양한 경로에 의해 투여된다. 구체적으로 고려되는 경로는 침투성 정맥내 주사, 혈액 및/또는 림프 공급을 통한 국부 투여, 및/또는 환부 부위에 대한 직접 투여이다. 일반적으로 투여의 가장 적합한 경로는 작용제의 특성(예를 들어, 위장관의 환경에서의 안정성), 및 대상체의 장애(예를 들어 대상체가 경구 투여를 참을 수 있는지 여부)를 포함하는 다양한 인자에 좌우될 것이다.
본 발명에서 어린이 또는 청소년에게 투여되는 양은 전문의 또는 본 기술분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있고, 성인에게 투여되는 것보다 적거나 동일할 수 있다. 유효량을 달성하는 데 요구되는 본 발명에 따른 화합물의 정확한 양은 예를 들어 대상체의 종, 나이, 및 전반적인 장애, 부작용 또는 장애의 심각도, 특성 화합물의 동일성, 투여 방식 등에 따라 대상체마다 다를 것이다.
본 발명의 신규 화합물 및 약학적 조성물은 조합 요법으로 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 조합 요법에 사용되기 위한 치료의 특정한 조합(치료제 또는 절차)은 달성될 목적 치료 효과 및 목적 치료제 및/또는 절차의 적합성을 고려할 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 치료 활성제와 조합(combination)하여 투여될 수 있다. "조합"의 경우, 다음 전달 방법이 본 발명의 범위에 속하긴 하지만, 작용제가 꼭 동일한 시간에 투여되어야 하고/하거나 같이 전달되기 위해 제형화되어야 한다는 것을 시사하도록 의도되진 않는다. 조성물은 하나 이상의 다른 목적 치료제 또는 의료 절차와 동시에, 그보다 먼저, 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 일반적으로, 각 작용제는 그 작용제에 대해 정해진 투여량 및/또는 시간 스케쥴로 투여될 것이다. 추가로, 본 발명은 신체 내에서 그의 생체이용률을 개선시키고, 그의 대사를 감소 및/또는 수정하고, 그의 분비를 억제하고, 및/또는 그의 분포를 수정할 수 있는 작용제와 조합하여 본 발명의 약학적 조성물을 전달하는 것을 아우른다. 이 조합에서 사용되는 본 발명의 신규 화합물 및 치료 활성제는 단일 조성물로 같이 투여되거나 상이한 조성물로 별도로 투여될 수 있다는 것이 더 이해될 것이다.
조합 요법에 사용되는 특정한 조합은 달성될 목적 치료 효과 및/또는 본 발명의 화합물을 포함하는 절차 및/또는 치료 활성제의 적합성을 고려할 것이다. 사용되는 조합은 동일한 장애에 대해 목적 효과를 달성할 수 있고(예를 들어, 본 발명의 신규 화합물은 동일한 장애를 치료하는 데 사용되는 또 다른 치료 활성제(예컨대, 제2 치료제)와 병용하여 투여될 수 있다), 및/또는 이것들은 상이한 효과를 달성할 수 있다(예를 들어, 임의의 부작용 제어)는 것이 이해될 것이다.
본원에서 사용되는, "치료 활성제"는 장애를 치료, 예방, 지연, 환원 또는 개선시키기 위한 의약으로서 사용되는 임의의 물질을 가리키고, 예방적 및 치유적 치료를 포함하는, 치료에 사용되는 물질을 가리킨다.
일부 양태에서, 병용 투여를 위한 다른 치료 활성제는 다발성 골수종을 치료하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 상기 다른 치료 활성제는 프로테아좀 억제제(proteasome inhibitor) 및/또는 면역-조절 약물(immune modifying drugs)일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 다른 치료 활성제는 덱사메타손(dexamethasone), 보르테조밉(bortezomib), 카필조밉(carfilzomib), 멜팔란(melphalan), 독소루비신(doxorubicin) 및 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 증상 또는 특징을 치료, 경감, 개선, 완화시키고, 그 개시를 지연시키고, 그 진행을 억제시키고, 그 중증도를 감소시키고, 및/또는 그 발생률을 감소시키는 데 유용한 임의의 치료 활성제 또는 절차 (예를 들어, 수술, 방사선 요법)와 조합하여 투여될 수 있다.
일 양태로서, 본 발명은 염증 질환 또는 혈관신생질환으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 질환을 앓고 있는 대상체에게 상기 질환을 치료하기 위한 키트로 제공될 수 있다.
일부 양태에서, 상기 키트는 i) 본 발명에 따른 신규 화합물 또는 약학적 조성물을 상기 질환을 앓고 있는 대상체에게 투여하기 위한 설명서 (instruction), 및 ii) 본 발명에 따른 신규 화합물 또는 약학적 조성물을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 키트는 대상체에서 상기 질환을 치료하는 데 효과적인 본 발명에 기재된 바와 같은 용량의 신규 화합물 또는 약학적 조성물을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태 (unit dosage form)를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 대상체는 인간 환자이다.
일부 양태에서, 상기 키트는 멸균 주사기, 멸균 바늘, 멸균 IV 백, 주입 펌프 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함한다.
다른 관점에서, 본 발명은 또한, [화학식 1]의 화합물을 함유하는 식품 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
.
본 발명에 있어서, 상기 식품은 염증 완화 또는 염증 개선을 위한 건강기능식품일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 식품은 혈관신생질환 치료 보조용 건강기능식품일 수 있다.
본 발명의 용어, 식품 조성물은 영양성분을 함유하는 물질을 포괄하는 넓은 의미로 사용되며, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 프리바이오틱스, 프로바이오틱스, 포스트 바이오틱스, 건강보조식품, 건강기능식품 및 건강식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 뿐만 아니라, 식품에 첨가되는 "식품 첨가제" 또는 "식품 첨가용 조성물"을 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 뇌질환을 완화하거나 개선하는 기능을 갖는 건강기능(성)식품인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, 건강기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있으며, 본 발명에 따른 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태일 수 있다.
상기 건강식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강 유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용된다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 다당체와 함께 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "약 (about)"은 대략, 가량, 대충, 또는 일정 정도의 의미로 해석될 수 있다. "약" 이라는 용어가 숫자 범위와 함께 사용되는 경우, 지정된 숫자 값의 위아래로 경계를 확장하여 해당 범위를 수정하여 해석한다. 일반적으로, 용어 "약"은 10%의 분산에 의해 명시된 값의 위와 아래의 수치 값을 수정하기 위해 본 발명에서 사용된다.
"개체 (individual)", "환자 (patient)" 및 "대상체 (subject)"는 상호 교환 적으로 사용되며 포유류, 예를 들어 마우스, 쥐, 기타 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 말, 또는 인간을 포함한 영장류를 포함하여 임의의 동물을 포함한다.
본 발명에서 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유류에 있어서 질환의 "치료" 또는 "치료요법"은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 질환의 발달을 저지시킴,
(2) 질환의 확산을 예방함,
(3) 질환을 경감시킴,
(4) 질환의 재발을 예방함 및
(5) 질환의 증상을 완화함(palliating)
본 발명에서 "예방” 이란, 달리 언급되지 않는 한, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증 질환 또는 혈관신생질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 대조군으로 사용되는 포말리도마이드는 (R,S)-4-아미노-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌-1,3-디온으로, [화학식 2]로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
[화학식 2]
본 발명에서 합성시 재료물질로 사용되는 3,6'-디티오포말리도마이드(3,6'-Dithiothalidomide)는 [화학식 3]으로 표시될 수 있다.
[화학식 3]
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
제조예
52ml의 DMSO와 24ml의 H2O 혼합액에 3,6'-디티오포말리도마이드(800mg, 2.62mmol, US 9,623,020 참조)를 용해시킨 현탁액을 100℃에서 17시간 동안 가열시키고, HPLC (254 nm) 분석 결과, 3,6'-DP(0%), 3-MP(76%), 포말리도마이드(24%)가 확인되었다. 짙은 적색 용액을 실온으로 냉각시키고 EtOAc로 희석하였다. 상기 용액을 H2O로 2회, 염수로 1회 세척하였다. 수성층을 EtOAc로 1회 추출하였다. 유기층을 합하여 MgSO4상에서 건조시키고, 여과한 후, 농축시켰다. 잔류물을 SiO2 컬럼크로마토그래피 (Loading _ 아세톤 및 최소량의 DMSO 혼합물에 잔류물을 용해시켜 코팅하고, 실리카젤과 혼합한 후, 회전 증발시킨 실리카젤 ; Elution _ CHCl3 : 아세톤 = 20:1 - 9:1)를 통하여 3-MP을 수득하였으며, CHCl3 슬러리에 이은 여과법 (600mg, 79% F005-02)을 통해 짙은 주황색 고체로 추가 정제되었다. 본 발명에서 제조된 [화학식 1]의 화합물, 즉 3-티오포말리도마이드(3-thiopomalidomide)는, 3-MP으로 약칭될 수 있다.
실시예 1. In vitro CRBN binding assay
탈리도마이드계 화합물은 E3 리가아제인 세레블론 (CRBN)에 결합하여, 그 기질로서 전사인자인 Aiolos 및 Ikaros를 분해함으로써 면역세포의 기능을 조절하고 다양한 약리학적 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다. 이에 3-MP의 세레블론 결합력을 in vitro 상에서 포말리도마이드와 비교하였다.
세레블론에 대한 결합력의 측정은 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 기반의 'AlphaScreen' 방식을 이용하였으며, 해당 시험은 PROTAC Optimization kit for BET Bromodomain-Cereblon binding 키트 (#79770, BPS bioscience, CA USA)를 사용해 키트 내 매뉴얼에 표기된 'Competitive Inhibition of the PROTAC assay'에 따라 진행하였다. 후보물질, DMSO 및 Flag/Glutathione bead (#6765300, PerkinElmer, USA)를 제외한 모든 시약은 키트 내에 포함되어 있는 것을 사용하였다.
그 결과, 도 1에서와 같이, 3-MP가 포말리도마이드에 비해 세레블론과 더 효과적으로 결합하는 것으로 확인되었으며, 구체적인 IC50값은 3-MP은 0.19μM, 포말리도마이드는 2.38μM로 약 10배 이상의 차이가 확인되었다.
실시예 2. 세포 독성 평가
인간 다발성 골수종 세포주인 MM.1S 세포주에 3-MP와 포말리도마이드를 농도별로 처리하고 세포 독성을 평가하였다.
인간 다발성 골수종 세포주인 MM.1S (CRL-2974) 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 구입하여 사용하였고, 10% 우태아 혈청 (Corning, MD, USA), 100 U/ml penicillin (Corning, MD, USA), 및 100 ㎍/ml streptomycin (Corning, MD, USA)이 보충된 RPMI1640 배지 (Corning, MD, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 세포를 1 × 104 cells/웰로 96웰 플레이트에 분주하고 24시간 배양 후, 포말리도마이드, 3-MP를 각각 0, 0.005, 0.014, 0.041, 0.123, 0.37, 1.111, 3.333, 10μM 처리하고 3일 동안 추가로 배양한 후, CCK 분석 키트 (Dojindo, Japan)를 사용하여 제조사 매뉴얼에 따라 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 2에서와 같이, 포말리도마이드의 IC50는 0.069μM, 3-MP의 IC50는 50μM 이상으로 확인되어, 3-MP는 포말리도마이드와 비교하여 세포 독성(혈액 독성)이 없다는 것을 알 수 있었다.
실시예 3. 세포 독성 감소 기전
탈리도마이드계 화합물은 E3 리가아제인 세레블론 (CRBN)에 결합하여, 그 기질로서 전사인자인 Aiolos 및 Ikaros를 분해함으로써 면역세포의 기능을 조절하는 것으로 알려져 있는바, 3-MP에 의해 Aiolos 및 Ikaros의 발현이 감소하는지 확인하고자 하였다.
이를 위하여, MM.1S 세포주를 10% 우태아 혈청 (Corning, MD, USA), 100 U/ml penicillin (Corning, MD, USA), 및 100 ㎍/ml streptomycin (Corning, MD, USA)이 보충된 RPMI 배지 (Corning, MD, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 세포를 1 × 106 cells/웰로 12 웰 플레이트에 분주하고 24시간 배양 후, 포말리도마이드와 3-MP를 각각 0.000128, 0.00064, 0.0032, 0.016, 0.08, 0.4, 2 또는 10 μM 처리하고 4시간 추가 배양한 후, 세포에 protease inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific)을 포함하는 RIPA buffer를 넣어 파쇄하고, 14,000rpm에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포추출액을 획득하였다. 세포추출액을 동일한 양 loading하여 SDS-PAGE를 이용해 분리하고, PVDF 막으로 트랜스퍼 하였다. 단백질이 트랜스퍼 된 막을 skim milk를 이용하여 블록킹하고, 1차 항체로 3시간 상온에서 인큐베이션 한 후, HRP-부착된 2차 항체로 상온에서 1시간 인큐베이션 하였다. 각 단계 사이 TBS-T로 3회 세척하였다. 검출은 chemoluminescence 시약 (Thermo Fisher Scientific)을 적용하여 수행하고 Chemidoc (iBright CL1500, Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 확인하였다. 1차 항체로 사용된 Aiolos (#15103), Ikaros (#9034), GAPDH (#2118S) 항체와 2차 항체는 Cell signaling technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
그 결과, 도 3a 에서와 같이, 포말리도마이드와 다르게, 3-MP은 세레블론의 기질인 Aiolos 및 Ikaros의 발현을 감소시키지 않는 것으로 확인되었다.
추가적으로, 3-MP에 의한 Aiolos 및 Ikaros의 발현을 시간대별로 확인하였다. MM.1S 세포를 1 × 106 cells/웰로 12웰 플레이트에 분주하고 24시간 배양 후, 포말리도마이드와 3-MP를 각각 10 μM씩 처리하고 1, 4, 8, 12 또는 24시간 추가 배양한 후, 세포에 protease inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific)을 포함하는 RIPA buffer를 넣어 파쇄하고, 14,000rpm에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포추출액을 획득하였다. 세포추출액을 동일한 양 loading하여 SDS-PAGE를 이용해 분리하고, PVDF 막으로 트랜스퍼 하였다. 단백질이 트랜스퍼 된 막을 skim milk를 이용하여 블록킹하고, 1차 항체로 3시간 상온에서 인큐베이션 한 후, HRP-부착된 2차 항체로 상온에서 1시간 인큐베이션 하였다. 각 단계 사이 TBS-T로 3회 세척하였다. 검출은 chemoluminescence 시약 (Thermo Fisher Scientific)을 적용하여 수행하고 Chemidoc (iBright CL1500, Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 확인하였다. 1차 항체로 사용된 Aiolos (#15103), Ikaros (#9034), GAPDH (#2118S) 항체와 2차 항체는 Cell signaling technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
그 결과, 도 3b에서와 같이 포말리도마이드 보다 3-MP은 세레블론의 기질인 Aiolos 및 Ikaros의 발현을 감소시키지 않는 것으로 확인되었다.
실시예 4. 생식 독성 감소 기전
탈리도마이드계 화합물과 같은 세레블론 (CRBN) 결합 치료제는 앞다리 단축 또는 단지증과 같은 심각한 선천성 기형을 유발할 수 있고, 이는 SALL4의 분해와 밀접한 연관이 있음이 보고되었다. 따라서, 3-MP의 SALL4 분해 효과를 포말리도마이드와 비교하였다.
이를 위하여, 인간 Embryonic carcinoma 세포주인 Tera-1 세포주 (HTB-105)를 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 구입하여 사용하였고, 10% 우태아 혈청 (Corning, MD, USA), 100 U/ml penicillin (Corning, MD, USA), 및 100 ㎍/ml streptomycin (Corning, MD, USA)가 보충된 DMEM 배지 (Corning, MD, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
세포를 5 × 105 cells/웰로 12웰 플레이트에 분주하고 24시간 배양 후, 포말리도마이드, 3-MP를 각각 0.000128, 0.00064, 0.0032, 0.016, 0.08, 0.4, 2 또는 10μM 처리하여 4시간 추가 배양하였다. 세포에 protease inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific)을 포함하는 RIPA buffer를 넣어 파쇄하고, 14,000rpm에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포추출액을 획득하였다. 세포추출액을 동일한 양 loading하여 SDS-PAGE를 이용해 분리하고, PVDF 막으로 트랜스퍼 하였다. 단백질이 트랜스퍼된 막을 skim milk를 이용하여 블록킹하고, 1차 항체로 3시간 상온에서 인큐베이션 한 후, HRP-부착된 2차 항체로 상온에서 1시간 인큐베이션 하였다. 각 단계 사이 TBS-T로 3회 세척하였다. 검출은 chemoluminescence 시약 (Thermo Fisher Scientific)을 적용하여 수행하고 Chemidoc (iBright CL1500, Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 확인하였다. 1차 항체로 사용된 SALL4 (#5850)와 GAPDH (#2118S) 항체 및 2차 항체는 Cell signaling technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
그 결과, 도 4에서와 같이 3-MP은 포말리도마이드와 비교하여 SALL4 분해가 더 적게 확인되는바, 3-MP는 포말리도마이드에 비해 최기형성 부작용을 더 잘 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. 염증 억제 효과
면역 조절 제제인 포말리도마이드는 T 세포-매개 면역과 자연살해 (NK)세포-매개 면역을 향상시키고, 단핵구에 의한 전 (pro)-염증 사이토카인 (예컨대, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8)의 생산을 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 3-MP의 전-염증 사이토카인 생산 억제 효과를 mRNA 레벨에서 포말리도마이드와 비교하였다.
이를 위하여, 말초 혈액 단핵세포 (PBMC, StemExpress, CA, USA)를 96 웰 플레이트 (Corning, MD, USA)에 1 × 106 cells/웰 분주하고 10% 우태아 혈청 (Corning, MD, USA) 및 100 U/ml의 penicillin/streptomycin (Corning, MD, USA) 이 포함된 RPMI1640 (Corning, MD, USA) 배지를 이용하여, 37℃, 5% CO2 배양기에서 하루 동안 배양하여 안정화하였다. 포말리도마이드 및 3-MP의 10 mM DMSO stock (Sigma, USA)을 PBMC의 배양액과 동일한 배지를 이용해 100 또는 10 μM 로 희석하여 해당하는 PBMC 웰에 넣고 (Final 10, 1 μM) 37℃, 5% CO2 배양기에서 1시간 동안 반응시켰다. 염증 비유도군을 제외한 모든 PBMC 웰에 250㎍/㎕ (5% DMSO in RPMI1640)의 PHA (Sigma, USA)를 넣고 (Final 25 ㎍/㎕), 37℃, 5% CO2 배양기에서 6시간 동안 반응시켰다.
PBMC는 RNA prep kit (Monarch Total RNA Miniprep kit, NEB, UK)을 이용하여 키트 매뉴얼에 따라 RNA prep을 수행하였으며, Nanophotometer (NP80, Implen, Germany)를 이용해 농도를 측정하였다. 각 RNA 샘플의 농도에 따라 1㎍에 해당하는 양의 RNA를 넣고 cDNA 합성 키트 (LunaScript RT SuperMix kit, NEB, UK)의 매뉴얼에 따라 cDNA를 합성하였다.
합성한 cDNA 내 각 사이토카인의 발현양을 Real-Time PCR (StepOne™Bioscience, USA) 장비를 이용해 분석 및 비교하였다. 분석을 위해 48웰 플레이트 (MicroAmp®Fast Optical 48-well plate, Applied Biosystem, USA)의 각 웰에 1㎕의 cDNA, 유전자별 10 pmol의 forward 와 reverse primer, 8㎕의 D.W. 와 10㎕의 SYBR green (Luna®Master Mix, NEB, UK)가 포함되었다. PCR 반응은 SYBR green 키트의 매뉴얼에 따라 진행되었으며, 사용된 primer의 염기서열은 표 1과 같다. Real-Time PCR을 통해 얻어진 각 샘플의 유전자별 CT 값은 각 샘플의 Internal control gene (β-actin)의 값을 통해 normalization 되었으며, 2ΔΔCT 계산에 의해 발현양을 역추산하였고, 각 군의 결과 값을 PHA 단독 처리군 대비 100분율의 값으로 상대정량하여 표기하였다.
서열번호 프라이머 명칭 서열 (5' →3')
1 TNFα Forward F: CCCAGGGACCTCTCTCTAATC
2 TNFα Reverse R: ATGGGCTACAGGCTTGTCACT
3 IL-1β Forward F: ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA
4 IL-1β Reverse R: GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT
5 IL-6 Forward F: GGCACTGGCAGAAAACAACC
6 IL-6 Reverse R: GCAAGTCTCCTCATTGAATCC
7 IL-8 Forward F: AGAGTGATTGAGAGTGGACC
8 IL-8 Reverse R: ACTTCTCCACAACCCTCTG
9 β-actin Forward F: GGATGCAGAAGGAGATCACTG
10 β-actin Reverse R: CGATCCACACGGAGTACTTG
그 결과, 도 5a에서와 같이 3-MP는 포말리도마이드와 유사한 수준의 전-염증성 사이토카인 억제 효과를 나타내었다.
또한, mRNA 레벨에서 3-MP의 전-염증 사이토카인 생산 억제 효과를 마우스 미세아교세포 (BV-2, ATCC, Manassas, VA, USA)에서 확인하였다.
BV-2를 6 웰 플레이트 (Corning, MD, USA)에 5 × 105cells/웰로 분주하고 10% 우태아 혈청 (Corning, MD, USA) 및 100 U/ml의 penicillin/streptomycin (Corning, MD, USA) 이 포함된 DMEM (Corning, MD, USA) 배지를 이용하여, 37℃, 5% CO2 배양기에서 하루 동안 배양하여 안정화하였다. 포말리도마이드 및 3-MP 10 mM DMSO stock (Sigma, USA)을 BV-2의 배양액과 동일한 배지를 이용하여 30, 10, 3.33μM 농도로 1시간 동안 전처리 하였다. 염증 비유도군을 제외한 모든 시험군에 1㎍/mL의 LPS (Sigma, USA)를 넣고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 6시간 동안 반응시켰다.
약물이 처리된 BV-2는 RNA prep kit (Monarch Total RNA Miniprep kit, NEB, UK)을 이용하여 키트 매뉴얼에 따라 RNA prep을 수행하였으며, Nanophotometer (NP80, Implen, Germany)를 이용해 농도를 측정하였다. 각 RNA 샘플의 농도에 따라 1㎍에 해당하는 양의 RNA를 넣고 cDNA 합성 키트 (LunaScript RT SuperMix kit, NEB, UK)의 매뉴얼에 따라 cDNA를 합성하였다.
합성한 cDNA내 각 사이토카인의 발현양을 Real-Time PCR (StepOne™Applied Bioscience, USA) 장비를 이용해 분석 및 비교하였다. 분석을 위해 384웰 플레이트 (PCR Plate, 384-well, Thermo Fisher, USA)의 각 웰에 1 μg의 cDNA, 유전자별 10 pmol의 forward 와 reverse primer 1 ㎕, D.W. 와 5 ㎕의 SYBR green (Luna®Master Mix, NEB, UK)가 포함되었다. PCR 반응은 SYBR green 키트의 매뉴얼에 따라 진행되었으며, 사용된 primer의 염기서열은 표 2와 같다. Real-Time PCR을 통해 얻어진 각 샘플의 유전자별 CT 값은 각 샘플의 Internal control gene (GAPDH)의 값을 통해 normalization 되었으며, 2ΔΔCT 계산에 의해 발현양을 역추산하였고, 각 군의 결과 값을 LPS 단독 처리군 대비 100분율의 값으로 상대정량하여 표기하였다.
서열번호 프라이머 명칭 서열 (5' →3')
11 Mouse TNFα Forward F: TAGCTCCCAGAAAAGCAAGC
12 Mouse TNFα Reverse R: TTTTCTGGAGGGAGATGTGG
13 Mouse IL-6 Forward F: CCGGAGAGGAGACTTCACAG
14 Mouse IL-6 Reverse R: CAGAATTGCCATTGCACAAC
15 Mouse IL-1β Forward F: GAAGAAGTGCCCATCCTCTG
16 Mouse IL-1β Reverse R: AGCTCATATGGGTCCGACAG
17 Mouse GAPDH Forward F: TTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC
18 Mouse GAPDH Reverse R: TGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT
그 결과, 도 5b에서와 같이 3-MP은 포말리도마이드 보다 전-염증성 사이토카인 억제 효과가 큰 것으로 확인되었다.
실시예 6. 산화적 스트레스 억제 효과
산화적 스트레스 억제 효과를 확인하고자, iNOS와 COX-2의 발현량을 확인하였다.
이를 위하여, 마우스 대식 세포주인 RAW264.7 세포주를 한국세포주은행 (KCLB, 한국)으로부터 구입하여 사용하였고, 10% 우태아 혈청 (Corning, MD, USA), 100 U/ml penicillin (Corning, MD, USA), 및 100 ㎍/ml streptomycin (Corning, MD, USA)가 보충된 DMEM 배지 (Corning, MD, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
RAW264.7 세포를 2.4 × 105 cells/웰로 12 웰 플레이트에 분주하고 24시간 배양 후, 각각 포말리도마이드, 3-MP을 3.33, 10, 30μM로 전처리 하였다. 1시간 경과한 후, 60ng/ml의 LPS를 처리하여 자극하였으며, 이후 24시간 추가 배양하였다. 세포에 protease inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific)을 포함하는 RIPA buffer를 넣어 파쇄하고, 14,000rpm에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포추출액을 획득하였다. 세포추출액을 동일한 양 loading하여 SDS-PAGE를 이용해 분리하고, PVDF 막으로 트랜스퍼 하였다. 단백질이 트랜스퍼 된 막을 skim milk를 이용하여 블록킹하고, 1차 항체로 3시간 상온에서 인큐베이션 한 후, HRP-부착된 2차 항체로 상온에서 1시간 인큐베이션 하였다. 각 단계 사이 TBS-T로 3회 세척하였다. 검출은 chemoluminescence 시약 (Thermo Fisher Scientific)을 적용하여 수행하고 Chemidoc (iBright CL1500, Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 확인하였다. 사용된 1차 항체로 iNOS (#13120) COX-2 (#12282) GAPDH (#2118) 항체와 이에 상응하는 2차 항체는 Cell signaling technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
그 결과, 도 6a에서와 같이 3-MP는 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하여 산화적 스트레스를 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었으며, 산화적 스트레스 억제 효과는 포말리도마이드 보다 우수한 것으로 확인되었다.
산화적 스트레스 억제 효과를 추가적으로 확인하고자, 마우스 미세아교세포 (BV-2, ATCC, Manassas, VA, USA)에서 염증반응으로 인해 방출되는 아질산염의 함량과 산화 질소 생성효소인 iNOS와 사이클로옥시게나제-2인 COX-2의 발현량을 확인하였다.
아질산염 및 iNOS, COX-2의 단백질 발현량을 확인하기 위해, BV-2를 12 웰 플레이트(Corning, MD, USA)에 1.5 × 105 cells/웰로 분주하고 10% 우태아 혈청 (Corning, MD, USA) 및 100 U/ml의 penicillin/streptomycin (Corning, MD, USA) 이 포함된 DMEM (Corning, MD, USA) 배지를 이용하여, 37℃, 5% CO2 배양기에서 하루 동안 배양하여 안정화하였다. 포말리도마이드 및 3-MP 10 mM DMSO stock (Sigma, USA)을 BV-2의 배양액과 동일한 배지를 이용하여 30, 10, 3.33 μM로 1시간 동안 전처리 하였다. 염증 비유도군을 제외한 모든 시험군에 1 ㎍/mL의 LPS (Sigma, USA)를 넣고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 반응시켰다.
세포 배양액은 아질산염의 측정을 위해 수거하였으며, 3,000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 획득하였다. Griess Reagent System (#G2930, Promega, WI, USA)의 매뉴얼에 따라 세포 배양액 내 아질산염의 농도를 마이크로 플레이트 리더기 (NEO2MALPHAB Synergy Neo-2, BioTek, CA, US)로 측정하였다.
세포 배양액을 수거한 세포에 protease inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific)을 포함하는 RIPA buffer를 넣어 파쇄하고, 14,000rpm에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포추출액을 획득하였다. 세포추출액을 동일한 양 loading하여 SDS-PAGE를 이용해 분리하고, PVDF 막으로 트랜스퍼 하였다. 단백질이 트랜스퍼 된 막을 skim milk를 이용하여 블록킹하고, 1차 항체로 3시간 상온에서 인큐베이션 한 후, HRP-부착된 2차 항체로 상온에서 1시간 인큐베이션 하였다. 각 단계 사이 TBS-T로 3회 세척하였다. 검출은 chemoluminescence 시약 (Thermo Fisher Scientific)을 적용하여 수행하고 Chemidoc (iBright CL1500, Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 확인하였다. 사용된 1차 항체인 iNOS (#13120) COX-2 (#12282) GAPDH (#2118)와 이에 상응하는 2차 항체는 Cell signaling technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
그 결과, 도 6b와 같이 3-MP는 포말리도마이드 보다 LPS로 인해 방출된 아질산염 잔존량을 효과적으로 감소시켰으며, 도 6c와 같이 산화적 스트레스와 관련된 단백질 (iNOS와 COX-2)의 발현도 효과적으로 감소시켜다. 이로써, 3-MP는 산화적 스트레스 억제 효과가 포말리도마이드 보다 우수한 것으로 확인되었다.
마지막으로, iNOS, COX-2의 mRNA 발현량을 확인하기 위해, BV-2를 6 웰 플레이트(Corning, MD, USA)에 5×105cells/웰로 분주하고 10% 우태아 혈청 Corning, MD, USA) 및 100 U/ml의 penicillin/streptomycin (Corning, MD, USA) 이 포함된 DMEM (Corning, MD, USA) 배지를 이용하여, 37℃, 5% CO2 배양기에서 하루 동안 배양하여 안정화하였다. 포말리도마이드 및 3-MP 10 mM DMSO stock (Sigma, USA)을 BV-2의 배양액과 동일한 배지를 이용하여 30, 10, 3.33μM로 1시간 동안 전처리 하였다. 염증 비유도군을 제외한 모든 시험군에 1㎍/mL의 LPS (Sigma, USA)를 넣고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 6시간 동안 반응시켰다.
약물이 처리된 BV-2는 RNA prep kit (Monarch Total RNA Miniprep kit, NEB, UK)을 이용하여 키트 매뉴얼에 따라 RNA prep을 수행하였으며, Nanophotometer (NP80, Implen, Germany)을 통해 농도를 측정하였다. 각 RNA 샘플의 농도에 따라 1 ㎍에 해당하는 양의 RNA를 넣고 cDNA 합성 키트 (LunaScript RT SuperMix kit, NEB, UK)의 매뉴얼에 따라 cDNA를 합성하였다.
합성한 cDNA내 각 산화적 스트레스 관련 유전자의 발현양을 Real-Time PCR (StepOne™Bioscience, USA) 장비를 이용해 분석 및 비교하였다. 분석을 위해 384웰 플레이트 (PCR Plate, 384-well, Thermo Fisher, USA)의 각 웰에 1μg의 cDNA, 유전자별 10 pmol의 forward 와 reverse primer 1㎕, D.W. 와 5 ㎕의 SYBR green (Luna®qPCR Master Mix, NEB, UK)가 포함되었다. PCR 반응은 SYBR green 키트의 매뉴얼에 따라 진행되었으며, 사용된 primer의 염기서열은 표 3과 같다. Real-Time PCR을 통해 얻어진 각 샘플의 유전자별 CT 값은 각 샘플의 Internal control gene (GAPDH)의 값을 통해 normalization 되었으며, 2ΔΔCT 계산에 의해 발현양을 역추산하였고, 각 군의 결과 값을 LPS 단독 처리군 대비 100분율의 값으로 상대정량하여 표기하였다.
서열번호 프라이머 명칭 서열 (5' →3')
19 Mouse iNOS Forward F: GCTATGGCCGCTTTGATGTG
20 Mouse iNOS Reverse R: TTGGGATGCTCCATGGTCAC
21 Mouse COX-2 Forward F: CTGGAACATGGACTCACTCAGTTTG
22 Mouse COX-2 Reverse R: AGGCCTTTGCCACTGCTTGT
17 Mouse GAPDH Forward F: TTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC
18 Mouse GAPDH Reverse R: TGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT
그 결과, 도 6d와 같이 3-MP는 산화적 스트레스 관련 유전자의 mRNA 발현을 효과적으로 억제할 수 있었으며, 산화적 스트레스 억제 효과가 포말리도마이드 보다 우수한 것을 확인하였다.
실시예 7. 3-MP 체내 안정성 검증
3-MP 표준물질을 다이메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide, DMSO)에 1mg/mL이 되도록 녹여 저장 샘플 (stock sample)을 준비하였다. 표준검량선을 작성하기 위하여, 저장 샘플을 125 부터 0.39μg/mL가 되도록 아세토니트릴로 1/2씩 희석하여 총 10개 샘플의 농도별 표준액을 제조하고, 도 7a와 같이 검량선을 작성하였다.
혈장 내 안정성 검증을 위한 시험약물의 경우 3-MP를 100μg/mL로 농도로 희석하여 실험을 진행하였다. 혈장 내 안정성 검증 실험은 90μL 인간 혈장에 100μg/mL 농도로 제조된 10μL 시험약물을 넣고 30초간 섞은 뒤, 첨가 직후, 15분, 30분, 60분, 120분 동안 인큐베이션하여 샘플을 준비하였다. 이후, 각 샘플에 100% 에틸아세테이트 400μL를 첨가하여 1분간 vortex mixer를 통해 추출하였다. 추출된 샘플은 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심 분리하고, 상등액을 채취하여 새로운 바이알로 옮겨 담았다. 혈장 추출 시료를 UPLC-LTQ-Orbitrap 240 (Thermo Fisher Scientific, USA)이 결합된 (coupled in-line) Hypersil GOLDTM C18 컬럼 (2.1 x 100 mm, 1.7 μm; Thermo Scientific, USA)에 주입하였다. 컬럼 온도는 25℃에서 사용하였으며, 이동상 A는 물과 포름산 혼합액 (100:0.1, v/v)과 이동상 B는 메탄올과 포름산 혼합액(100:0.1, v/v)으로 하여 초기에 이동상 B를 5%로부터 95%까지 9분까지 증가시켜 분석한 후, 이동상 B를 95%로 12분까지 유지시키고, 이후 이동상 B를 5%로 낮춘 후 평형화 상태가 된 후 다음 분석에 사용하였다. 이동상의 유속량은 0.3 mL/분, 시료 주입량은 2μL으로 분석을 진행하였으며, 질량 분석기는 ESI-양성 모드로 운영하였다. 스프레이 전압은 3.5 kV로 설정하고, 질소 (nitrogen sheath) 가스, 보조 가스, 스위프 가스의 유속은 각각 50, 10, 1 (arbitrary units)로 분석하였다. 모세관 온도는 250℃로 유지하였다. 오비트랩 (Orbitrap) 데이터는 m/z 100-1,000 범위에서 수집하였고, 분석 데이터는 엑스칼리버 4.0 소프트웨어 (Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 분석하였다.
도 7a의 검량선을 기반으로 정량하여 인간 혈장 내 3-MP 수준을 확인한 결과, 도 7b에서와 같이 3-MP는 혈장 첨가 직후인 0분에서 혈장 내 수준이 80 μg/mL로 확인되었고, 시간이 경과하며 다소간의 증감 패턴을 나타내었으나, 0분에서 120분까지 3-MP는 혈장 내 큰 변화없이 유지될 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. [화학식 1] 로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    .
  2. (a) DMSO 및 H2O 혼합 용매에 3,6'-디티오포말리도마이드를 용해시키고 가열시키는 단계;를 포함하는 제1항 화합물의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 (a) 단계의 혼합 용매는 DMSO : H2O 가 1 : 0.1 - 5 의 부피비로 혼합되어 있는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 (a) 단계의 가열은 80 내지 120℃에서 5 내지 30시간 가열시키는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 (a) 단계 이후, (b) 제1항 화합물을 정제하는 단계;를 추가로 포함하는, 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 (b) 단계의 정제는 상기 (a) 단계에서 생성된 용액을 EtOAc로 희석한 후, 유기층을 건조시키고, SiO2 컬럼크로마토그래피로 정제하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  7. 제1항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 염증 질환은 건선, 류마티스 관절염 및 크론병으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 혈관신생질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 혈관신생질환은 각박이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨성 망막증, 삼출형 가령황반변성, 당뇨병 황반부종, 신생혈관에 의한 각막질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 후수정체 섬유 증식증, 과립성 결막염, 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형, 동맥경화, 혈관유착 및 부종성 경화증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
KR1020230024897A 2022-02-25 2023-02-24 신규한 포말리도마이드 유도체, 이의 제조방법 및 용도 KR20230128235A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20220024800 2022-02-25
KR1020220024800 2022-02-25
KR20220077699 2022-06-24
KR1020220077699 2022-06-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230128235A true KR20230128235A (ko) 2023-09-04

Family

ID=87766479

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020230024897A KR20230128235A (ko) 2022-02-25 2023-02-24 신규한 포말리도마이드 유도체, 이의 제조방법 및 용도
KR1020230024898A KR20230128236A (ko) 2022-02-25 2023-02-24 신규한 포말리도마이드 유도체의 뇌질환 치료 용도

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020230024898A KR20230128236A (ko) 2022-02-25 2023-02-24 신규한 포말리도마이드 유도체의 뇌질환 치료 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (2) KR20230128235A (ko)
WO (2) WO2023163538A1 (ko)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2808646C (en) * 2003-09-17 2016-08-23 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Thalidomide analogs as tnf-alpha modulators
US8927725B2 (en) 2011-12-02 2015-01-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Thio compounds

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230128236A (ko) 2023-09-04
WO2023163538A1 (ko) 2023-08-31
WO2023163539A1 (ko) 2023-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20180008305A (ko) 사이클로 히스티딘-프롤린을 유효성분으로 포함하는 세포 보호용 조성물
JP2005538093A (ja) 抗血管形成療法のための、テトラポリアンモニウムテトラチオモリブデートおよび関連化合物
US20200384001A1 (en) Composition for prevention or treatment of neuroinflammatory disease, containing protein tyrosine phosphatase
WO2018043530A1 (ja) 抗腫瘍剤、抗腫瘍効果増強剤及び抗腫瘍用キット
EP4122495A1 (en) Treatment or prevention method for chronic heart failure
KR102116166B1 (ko) Nlrp3 억제제
KR102005887B1 (ko) 뇌종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20230128235A (ko) 신규한 포말리도마이드 유도체, 이의 제조방법 및 용도
US11066378B2 (en) Caffeic acid derivatives for anti-angiogenesis
KR20240002206A (ko) 신규한 면역조절아마이드 유도체, 이의 제조방법 및용도
KR101729078B1 (ko) 엔아미드류 화합물을 유효성분으로 함유하는 항비만 조성물
KR20240001071A (ko) 신규한 탈리도마이드 유도체 및 이의 제조방법
JP6861162B2 (ja) アポエクオリン含有組成物および神経細胞の炎症を治療するためのアポエクオリンの使用方法
EP4375278A1 (en) Immunoregulatory amide derivative with improved material properties
KR20190135378A (ko) Lgi3 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물
WO2023093837A1 (zh) 含有铂类药物或者铂类药物共晶的药物组合物及其用途
US20170360722A1 (en) 2-dodecyl-6-methoxycyclohexa-2,5-diene-1,4-dione as a cancer therapeutic
KR20190015942A (ko) 골 질환 예방 또는 치료용 화합물 및 이의 용도
KR20240147954A (ko) 세레블론 결합 활성을 가지는 저분자 화합물 및 이의 용도
KR101213598B1 (ko) 데커신 및/또는 데커시놀 안젤레이트, 또는 데커신및/또는 데커시놀 안젤레이트를 유효성분으로 하는당귀추출물을 포함하는 조혈증강제 조성물
KR101541647B1 (ko) 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR101511090B1 (ko) 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR101517414B1 (ko) 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR101499007B1 (ko) 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20240012958A (ko) Hdac 억제제를 포함하는 항비만용 조성물