KR20230127299A - 항균 폴리펩타이드 화합물, 의료 기기, 하이드로겔및 그의 응용 - Google Patents

항균 폴리펩타이드 화합물, 의료 기기, 하이드로겔및 그의 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명에는 항균 폴리펩타이드 화합물, 의료 기기, 하이드로겔 및 그의 용도에 관한 것이다. 상기 항균 폴리펩타이드 화합물은 높은 항균 활성을 가지고, 효소 가수분해 안정성이 높으며, 생물 이용율이 높고, 세포 독성이 낮다. 본 발명의 하이드로겔은 상처에 유착되지 않고, 항균 활성과 지혈 성능을 가지며, 약물 적재 및 서방에 사용될 수 있으며, 예를 들면 소염 약물 또는 표피 성장 인자, 혈관 성장 인자 등을 담지할 수 있어 상처 치유를 가속화하고 반흔 조직 섬유의 형성을 감소시킨다. 동시에, 본 발명의 하이드로겔의 제조 방법은 공정 단계가 적고 원료 종류가 간단하며 수행이 편리하다.

Description

항균 폴리펩타이드 화합물, 의료 기기, 하이드로겔 및 그의 응용
본 발명은 생화학 기술 분야에 속하며, 항균 폴리펩타이드 화합물에 관한 것으로서, 구체적으로 항균 및 지혈에 사용될 수 있는 항균 폴리펩타이드 화합물, 하이드로겔 및 그의 응용, 및 상기 항균 폴리펩타이드 화합물 또는 하이드로겔을 적용하는 의료 기기에 관한 것이다.
의료, 농업 및 식품 산업에서의 항생제의 과량 사용과 남용으로 인해, 항생제에 대한 세균의 내성은 놀라운 속도로 증가하였으며, 이에 따라 종래의 항생제의 치료 효과는 대폭적으로 낮아지고 글로벌 공중 보건 및 인류 생명 안전을 엄중히 위협하고 있다. 현재 전 세계에서 매년마다 약 70만명이 약제 내성 세균의 감염으로 인해 사망한다. 2050년에 이르러서는 매년 1000만명이 이로 인해 사망할 것이고, 경제적 손실은 수조 달러를 초과할 것으로 예측된다. 세계 보건 기구(WHO)에서는 이미 세균 약제 내성 문제를 "현재 글로벌 보건, 식품 안전 및 발전이 직면한 가장 큰 위협 중의 하나" (Chinese Journal of Biotechnology, 2018, 34 (8): 1346-1360)로 간주하고 있다. 세균 내약이 인류 건강과 생명 안전에 가져다주는 도전에 대응하기 위해, 신규 항균 약물을 연구 개발하는 것은 이미 현재 가장 긴박한 의학 문제 중의 하나로 대두되고 있다.
폴리펩타이드 분자가 저분자 약물에 비해 결합면이 더 크고, 작용 타겟이 더욱 강하고 더욱 안전하며 부작용이 더욱 작고 심각한 면역 반응을 쉽게 일으키지 않는 등의 장점을 가지고 있다. 현재 항균 폴리펩타이드 분자는 이미 신규 항균 약물 연구 개발의 인기있는 분야로 꼽히고 있다. 하지만, 천연 항균 폴리펩타이드는 흔히 항균 활성이 낮고 전신 독성이 불분명함으로 인해 그의 임상 응용을 제한하고 있다. 항균 펩타이드의 펩타이드 사슬에서의 아미노산 구성, 및 곁사슬의 변경 및 화학적 변형은 흔히 항균 활성 및 독성 등에 대해 예측 불가한 영향을 발생시킨다. 따라서, 항균 펩타이드 화합물에 대해 아미노산 변형 및 치환을 진행하는 것 역시 고효율적이고 저독성인 항균 펩타이드 유도체를 획득하는 하나의 중요한 전략이다.
근년래, 하이드로겔은 항균, 지혈, 상처 치유 촉진, 유착 방지 등을 위한 매우 전망적인 생물 재료로 간주되고 있다. 일반적으로, 하이드로겔을 제조하는 원료는 주요하게 두 가지 유형이 있으며, 한 가지 유형은 합성 고분자이고, 다른 한 가지 유형은 다당류, 단백질 및 폴리펩타이드 등과 같은 천연 생물학적 재료이다. 여기서, 폴리펩타이드 하이드로겔은 체내에서 프로테아제에 의해 아미노산으로 가수 분해되기 쉽고, 인체에 대해 부작용을 끼치지 않으며, 기존의 고분자 하이드로겔보다 부작용이 적다.
항균 폴리펩타이드 J-1 (Jelleine-1)은 최초로 꿀벌 Apismellifera 로얄 젤리로부터 유래한 천연 항균 펩타이드로서, 광범위스펙트럼의 항균 및 항진균 등 활성을 가진다 (Peptides, 2004, 25:919-928).
하지만, 항균 폴리펩타이드 J-1은 기타 천연 항균 폴리펩타이드와 동일하게 낮은 항균 활성, 낮은 생물 이용률 등의 단점이 존재하여 그의 응용을 엄중히 제한하고 있다 (Peptides, 2019, 112:56-66). 그의 생물 활성 및 임상 응용성을 향상시키기 위해, 본 발명에서는 항균 펩타이드 J-1에 기반하여 일련의 항균 펩타이드 J-1 유도체를 설계하고 합성하였다. 본 발명자들은 연구를 통해 이러한 유도체들이 항균 폴리펩타이드 J-1보다 항균 활성이 우수하고, 세포 독성이 낮으며, 효소 가수분해 안정성이 우수한 것으로 나타났으며, 모두 간단한 방법을 통해 하이드로겔을 제조할 수 있으며, 항균, 지혈, 상처 치유 촉진 등의 기능을 가진 생물학적 드레싱으로 개발될 수 있는 잠재력이 뛰어남을 발견하였다.
본 발명의 주요 목적은 항균 폴리펩타이드 화합물을 제공하는데 있으며, 상기 항균 폴리펩타이드 화합물은 높은 항균 활성을 가지고, 효소 가수분해 안정성이 높으며, 생물 이용률이 높고, 세포 독성이 낮다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서는 하기와 같은 아미노산 서열로 표시되는 모체 펩타이드를 포함하는, 항균 폴리펩타이드 화합물을 제공한다:
Pro-Xaa2-Xaa3-Leu-Xaa5-Leu-Xaa7-Leu-NH2
여기서, Xaa2=Phe, homo-Phe 또는 Trp;
Xaa3=Lys, Aib, Orn, Dab, Dap 또는 Arg;
Xaa5=Ser, Lys, Orn, Dab, Dap 또는 Arg;
Xaa7=His, Lys, Orn, Dab, Dap 또는 Arg;
그리고, Xaa2=Phe, Xaa3=Lys, Xaa5=Ser일 때, Xaa7≠His.
Xaa2가 Phe이고, Xaa3이 Lys이며, Xaa5가 Ser이면서 Xaa7이 His일 때, 표기된 아미노산 서열은 천연 항균 폴리펩타이드 J-1의 아미노산 서열이며, 상기 아미노산 서열은 본 발명의 보호 범위 내에 해당되지 않는다.
Xaa2가 Phe이고, Xaa3이 Lys이며, Xaa5가 Lys이고, Xaa7이 His일 때, 항균 폴리펩타이드 화합물은 화합물 1(서열번호 1과 관련됨)로 표기된다:
Pro-Phe-Lys-Leu-Lys-Leu-His-Leu-NH2
PFKLKLHL- NH2.
Xaa2가 Phe이고, Xaa3이 Orn이며, Xaa5가 Ser이고, Xaa7이 Lys일 때, 항균 폴리펩타이드 화합물은 화합물 2(서열번호 2와 관련됨)로 표기된다:
Pro-Phe-Orn-Leu-Ser-Leu-Lys-Leu-NH2
PF-Orn-LSLKL- NH2.
Xaa2가 Phe이고, Xaa3이 Dab이며, Xaa5가 Lys이고, Xaa7이 Lys일 때, 항균 폴리펩타이드 화합물은 화합물 3(서열번호 3과 관련됨)으로 표기된다:
Pro-Phe-Dab-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-NH2
PF-Dab-LKLKL- NH2.
Xaa2가 Phe이고, Xaa3이 Arg이며, Xaa5가 Ser이고, Xaa7이 His일 때, 항균 폴리펩타이드 화합물은 화합물 4(서열번호 4와 관련됨)로 표기된다:
Pro-Phe-Arg-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2
PFRLSLHL- NH2.
Xaa2가 Phe이고, Xaa3이 Arg이며, Xaa5가 Arg이고, Xaa7이 His일 때, 항균 폴리펩타이드 화합물은 화합물 5(서열번호 5와 관련됨)로 표기된다:
Pro-Phe-Arg-Leu-Arg-Leu-His-Leu-NH2
PFRLRLHL- NH2.
Xaa2가 Phe이고, Xaa3이 Arg이며, Xaa5가 Ser이고, Xaa7이 Arg일 때, 항균 폴리펩타이드 화합물은 화합물 6(서열번호 6과 관련됨)으로 표기된다:
Pro-Phe-Arg-Leu-Ser-Leu-Arg-Leu-NH2
PFRLSLRL- NH2.
Xaa2가 Phe이고, Xaa3이 Arg이며, Xaa5가 Arg이고, Xaa7이 Arg일 때, 항균 폴리펩타이드 화합물은 화합물 7(서열번호 7과 관련됨)으로 표기된다:
Pro-Phe-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-NH2
PFRLRLRL- NH2.
Xaa2가 Trp이고, Xaa3이 Lys이며, Xaa5가 Ser이고, Xaa7이 His일 때, 항균 폴리펩타이드 화합물은 화합물 8(서열번호 8과 관련됨)으로 표기된다:
Pro-Trp-Lys-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2
PWKLSLHL- NH2.
Xaa2가 Trp이고, Xaa3이 Orn이며, Xaa5가 Orn이고, Xaa7이 His일 때, 항균 폴리펩타이드 화합물은 화합물 9(서열번호 9와 관련됨)으로 표기된다:
Pro-Trp-Orn-Leu-Orn-Leu-His-Leu-NH2
PW-Orn-L-Orn-LHL- NH2.
Xaa2가 Trp이고, Xaa3이 Dab이며, Xaa5가 Ser이고, Xaa7이 Dab일 때, 항균 폴리펩타이드 화합물은 화합물 10(서열번호 10과 관련됨)으로 표기된다:
Pro-Trp-Dab-Leu-Ser-Leu-Dab-Leu-NH2
PW-Dab-LSL-Dab-L- NH2.
Xaa2가 Trp이고, Xaa3이 Dap이며, Xaa5가 Dap이고, Xaa7이 Dap일 때, 항균 폴리펩타이드 화합물은 화합물 11(서열번호 11과 관련됨)으로 표기된다:
Pro-Trp-Dap-Leu-Dap-Leu-Dap-Leu-NH2
PW-Dap-L-Dap-L-Dap-L- NH2.
Xaa2가 Trp이고, Xaa3이 Arg이며, Xaa5가 Ser이고, Xaa7이 His일 때, 항균 폴리펩타이드 화합물은 화합물 12(서열번호 12와 관련됨)으로 표기된다:
Pro-Trp-Arg-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2
PWRLSLHL- NH2.
Xaa2가 Trp이고, Xaa3이 Arg이며, Xaa5가 Arg이고, Xaa7이 His일 때, 항균 폴리펩타이드 화합물은 화합물 13(서열번호 13과 관련됨)으로 표기된다:
Pro-Trp-Arg-Leu-Arg-Leu-His-Leu-NH2
PWRLRLHL- NH2.
Xaa2가 Trp이고, Xaa3이 Arg이며, Xaa5가 Ser이고, Xaa7이 Arg일 때, 항균 폴리펩타이드 화합물은 화합물 14(서열번호 14와 관련됨)으로 표기된다:
Pro-Trp-Arg-Leu-Ser-Leu-Arg-Leu-NH2
PWRLSLHL- NH2.
Xaa2가 Trp이고, Xaa3이 Arg이며, Xaa5가 Arg이고, Xaa7이 Arg일 때, 항균 폴리펩타이드 화합물은 화합물 15(서열번호 15와 관련됨)으로 표기된다:
Pro-Trp-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-NH2
PWRLRLRL- NH2.
상기 화합물 1 내지 15 및 천연 항균 펩타이드 J-1의 아미노산 서열은 아래 표 1과 같이 표시된다.
화합물(서열번호:) 아미노산 서열
천연 항균 펩타이드 J-1(서열번호 16) Pro-Phe-Lys-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2
1 Pro-Phe-Lys-Leu-Lys-Leu-His-Leu-NH2
2 Pro-Phe-Orn-Leu-Ser-Leu-Lys-Leu-NH2
3 Pro-Phe-Dab-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-NH2
4 Pro-Phe-Arg-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2
5 Pro-Phe-Arg-Leu-Arg-Leu-His-Leu-NH2
6 Pro-Phe-Arg-Leu-Ser-Leu-Arg-Leu-NH2
7 Pro-Phe-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-NH2
8 Pro-Trp-Lys-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2
9 Pro-Trp-Orn-Leu-Orn-Leu-His-Leu-NH2
10 Pro-Trp-Dab-Leu-Ser-Leu-Dab-Leu-NH2
11 Pro-Trp-Dap-Leu-Dap-Leu-Dap-Leu-NH2
12 Pro-Trp-Arg-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2
13 Pro-Trp-Arg-Leu-Arg-Leu-His-Leu-NH2
14 Pro-Trp-Arg-Leu-Ser-Leu-Arg-Leu-NH2
15 Pro-Trp-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-NH2
본 발명의 다른 일 양태는 하이드로겔의 제조 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 발명자들은 대량의 실험 연구를 거쳐, 상기 하이드로겔이 항균, 지혈 성능을 나타내고, 각종 유형의 약물 또는 성장 인자를 담지할 수 있으며, 드레싱, 항균 및 지혈 기능으로 상처 치료의 기능적 치료를 구현하고, 상처 표면의 습윤 환경을 유지할 수 있음을 증명하였다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서 제공하는 하이드로겔은 상기 항균 폴리펩타이드 화합물이 완충 용액과 중합반응을 거쳐 형성된다.
본 발명의 하이드로겔의 제조방법은 다음 단계를 포함한다:
S1, 항균 폴리펩타이드 화합물을 디메틸술폭사이드 (DMSO)에 용해시켜 추가 사용을 위한 항균 폴리펩타이드 화합물의 용해액을 얻는 단계; 및
S2, 항균 폴리펩타이드 화합물의 용해액을 완충액에 첨가하고 초음파 또는 교반 조건 하에 이온 가교 결합 중합 반응을 진행하여 하이드로겔을 얻는 단계.
본 발명의 하이드로겔의 용매는 주로 물을 포함하고, 부차적으로 디메틸술폭사이드 (DMSO)를 포함하며, 여기서 디메틸술폭사이드의 부피 함량은 5% 미만이다.
본 발명의 제조 방법은, 바람직하게 다음 단계를 더 포함한다:
S3, 완충액에 약물 및/또는 성장 인자를 더 첨가하여 약물 또는 성장 인자가 담지된 하이드로겔을 획득하는 단계.
본 발명의 약물은 바람직하게 항균 약물 또는 소염 약물이고, 성장 인자는 바람직하게 상처 치유 촉진 성장 인자이다.
본 발명의 완충액은 탄산염 용액, 아황산염 용액 및 인산염 완충액 등일 수 있으며, 바람직하게는 인산염 완충액이며; 여기서 인산염 완충액은 Na2HPO4, KH2PO4, KCl 및 NaCl를 비례에 따라 탈이온수에 용해시켜 제조되고; 항균 폴리펩타이드 화합물과 인산염 완충액은 다음의 성분을 몰 비율로 포함한다: 항균 폴리펩타이드 화합물:Na2HPO4:KH2PO4:KCl:NaCl = (1-50):(1-10):(1-5):(1-5):(50-200)로 계산되고; 바람직하게는 항균 폴리펩타이드 화합물:Na2HPO4:KH2PO4:KCl:NaCl = 1-50:10:2:2.7:137이다.
바람직하게, 본 발명의 인산염 완충액의 조성은 아데노신 디포스페이트 (ADP)를 더 포함하고, 상기 인산염 완충용액 성분의 몰비는 Na2HPO4:KH2PO4:KCl:NaCl:ADP=(1-10):(1-5):(1-5):(50-200):1로 계산되며, 바람직하게 ADP와 Na2HPO4의 몰비는 1:10이다.
본 발명의 반응은 물리적 반응 또는 화학적 반응일 수 있고, 바람직하게는 이온 가교 결합 중합 반응이고, 반응 온도는 0℃ 내지 60℃이며, 반응 시간은 1분 내지 120분이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 유착 방지 약물에서의 하이드로겔의 용도를 제공하는 것이며, 상기 유착 방지 약물은 약물 또는 성장 인자가 담지된 하이드로겔 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 약용 담체 및/또는 부형제를 포함한다.
본 발명의 유착 방지 약물은 정제, 당의정제, 과립제, 적제, 분무제, 린스제, 가글제, 피부 표면에 사용되는 연고 및 페이스트, 및 주사에 사용되는 멸균 용액 중의 적어도 하나의 제형이다.
본 발명의 약물은 항균 약물 또는 소염 약물이고, 상기 성장 인자는 상처 치유 촉진 성장 인자이다.
본 발명의 하이드로겔은 직접 창상면에 대해 세정, 스프레이, 습윤 드레싱 또는 덮는 데 직접 사용될 수 있으며, 또는 사용에 편리한 분무제로 제작하여 직접 창상면에 스프레이함으로써 보호막을 형성하며, 순간적으로 지혈할 수 있고, 창상면의 습윤 상태를 유지하며, 상피 세포의 성장과 치유에 유리한 저산소 환경을 조성하고, 상처의 치유를 가속화할 수 있다. 동시에 하이드로겔에서의 항균 폴리펩타이드는 광범위-스펙트럼의 지속적인 살균 작용을 가지며, 상처가 치유된 후 항균 폴리펩타이드는 대사 가능한 아미노산으로 분해되어 유착과 잔류를 방지한다.
또한, 본 발명의 하이드로겔은 병증 또는 창상면의 위치에 따라 적절한 방법을 선택하여 상응한 적용 제형을 제작할 수 있으며; 예를 들면, 창상, 타박상, 찰과상, 수술 후 상처, 화상 및 궤양의 박리 후, 본 발명의 하이드로겔을 스프레이 및 대체 또는 습윤 드레싱하여 감쌀 수 있고; 치핵 절제술 (haemorrhoidectomy), 항문 농양 절제술 (anal abscess excision), 항문 누공 절제술 (anal fistulectomy), 균열 절제술 (fissure excision), 신경 절개술 (neostomy), 누공 (fistulation), 회음 절개술 (episiotomy) 및 중복 포경 수술 (redundant circumcision) 후 본 발명의 하이드로겔을 스프레이하거나 또는 습윤 드레싱하여 감쌀 수 있으며; 방사선 요법 전후로 본 발명의 하이드로겔로 국부적인 피부에 대해 스프레이 또는 습윤 드레싱할 수 있고; 당뇨병성 족부 (diabetic foot), 맥관염 (vasculitis) 및 노인성 욕창 (senile bedsore)으로 인한 만성 치유 불가 상처와 관련하여, 박리 후 본 발명의 하이드로겔을 환부에 스프레이할 수 있으며; 구강 냄새, 구강 수술 후 케어에서는 본 발명의 하이드로겔을 가글제로 제작하여 직접 구강에 접촉하여 양치질한 후 배출할 수 있고; 백선, 헤르페스, 여드름 등에서는 본 발명의 하이드로겔을 창상면에 스프레이하거나 또는 습윤 드레싱할 수 있으며; 피부를 자극함으로 인한 불편함, 가려움, 건조, 또는 탈피 등 현상에서는 본 발명의 하이드로겔을 직접 스프레이하거나 또는 습윤 드레싱하여 피부 건강을 개선할 수 있다.
본 발명의 하이드로겔은 각종 유형의 약물 또는 성장 인자를 담지하여 기능성 치료를 구현할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 의료 기기를 제공하는 것이며, 상기 의료 기기는 상기 항균 폴리펩타이드 화합물 또는 하이드로겔을 포함한다.
본 발명의 항균 폴리펩타이드 화합물 또는 하이드로겔은 의료 기기의 적어도 하나의 표면 상에 도포되어 재료를 형성할 수 있다.
본 발명의 의료 기기의 형식은 의학용 드레싱, 섬유, 메쉬, 분말, 마이크로스피어, 시트, 스펀지, 폼, 봉합 앵커링 기기, 도관, 스텐트, 외과 수술용 택, 플레이트 및 스크류, 약물 전달 기기, 유착 방지막 및 조직 접착제로 구성된 군 중의 어느 하나이다.
본 발명의 섬유는 직물이고, 시트는 막 또는 부목이며, 봉합 앵커링 기기는 봉합사 또는 스테이플이다.
본 발명의 항균 폴리펩타이드 화합물은 높은 항균 활성을 가지고, 효소 가수분해 안정성이 높으며, 생물 이용률이 높고, 세포 독성이 낮으며, 특정 조건 하에서 하이드로겔을 형성할 수 있다.
본 발명의 하이드로겔은 상처에 유착되지 않고, 항균 활성과 지혈 성능을 가지며, 약물의 적재 및 서방에 사용될 수 있으며, 예를 들면 소염 약물 또는 표피 성장 인자, 혈관 성장 인자 등을 담지할 수 있다; 또한, 하이드로겔은 상처 치유를 가속화하고 반흔 조직 섬유의 형성을 감소시킨다. 동시에, 본 발명의 하이드로겔의 제조 방법은 공정 단계가 적고 원료 종류가 간단하며 조작이 편리하다. 본 발명의 의료 기기는 상기 항균 폴리펩타이드 화합물 또는 하이드로겔을 포함함으로써 더욱 편리하고 고효율적인 치료를 구현하며, 임상에 광범위하게 응용될 수 있다.
이하, 도면을 참조하여 본 발명의 실시 방안에 대해 상세히 설명하고자 한다. 그 중:
도 1은 마우스 패혈성 복막염 모델에서 본 발명의 화합물 2, 8, 9, 13 및 15가 마우스 생존율에 미치는 영향을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 용혈율(hemolysis rates) 평가 결과 히스토그램을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 화합물 2, 8, 9, 13, 및 15 및 천연 항균 펩타이드 J-1의 테스트 세포 증식에 대한 영향을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 화합물 2, 8, 9, 13, 및 15 및 천연 항균 펩타이드 J-1의 대장균의 내막 및 외막 침투성에 대한 영향을 나타낸다.
도 5는 마우스 복강에 각각 화합물 2, 8, 9, 13, 및 15 (체중 1 kg 당 100 mg/kg, 300 mg/kg, 500 mg/kg, 700 mg/kg 및 1000 mg/kg)를 주사한 후, 각 군 마우스의 생존율 그래프를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 항균 폴리펩타이드 화합물의 하이드로겔 이미지 및 주사 전자 현미경 (SEM) 이미지를 나타낸다.
도 7은 마우스 간장 출혈 모델에서 본 발명의 하이드로겔의 지혈 성능을 나타낸다.
이하 실시예를 결합하여 본 발명의 실시 방안에 대해 상세히 살펴보도록 한다. 다만, 당업자들은 이하 실시예들은 단지 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐이지 본 발명의 범위에 대한 제한이 아님을 이해할 수 있을 것이다. 본 발명에서 사용한 기기는 다음을 포함한다: 워터스 코퍼레이션 (Waters Corporation, US)의 고성능 액체 크로마토그래피 (Delta 600), 준비 칼럼으로 사용된 역상 C18 칼럼 (XBridge BEH 130 Prep, 19 mm×250 mm); 분석 칼럼으로 사용된 역상 C8 칼럼 (4.6 mm×250 mm); 및 브루커막시스 (BrukerMaxis) 4G 질량 분석계. 사용한 시약은 다음을 포함한다: 수지는 Tianjin nankai hecheng 회사의 링크 아미드-MBHA-수지 (Rink-amide-MBHA-resin, 로딩: 0.43 mol/g, 200 내지 400 메쉬)이고; N-A-Fmoc 보호된 아미노산, N-하이드록시벤조트리아졸 (N-Hydroxybenzotriazole, HOBt), 옥시-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우레아-헥사플루오로인산염 (Oxy-benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethylurea-hexafluorophosphate, HBTU), 디이소프로필에틸아민 (diisopropylethylamine, DIEA) 및 트리이소프로필실란 (triisopropylsilane, TIS)은 모두 상하이 GL 바이오켐에서 구입하였으며; 디클로로메탄 (dichloromethane), N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide, DMF), 피페리딘 (piperidine), 메탄올, 트리플루오로아세트산 (TFA), 페놀 및 피리딘은 모두 천진 제2 시약 공장에서 구입하였고; 닌하이드린 (ninhydrin)은 상하이 시약 3공장에서 구입하였다. 특정 제조업체 없이 사용한 기기 또는 시약은 모두 시중에서 구입하여 획득할 수 있는 통상적인 제품이다. 실시예에서 구체적인 조건을 명시하지 않은 것은 통상적인 조건에 따르거나 제조자가 권장하는 조건에 따라 수행되었다.
1. 항균 폴리펩타이드 화합물의 제조
설명의 편의를 위해, 화합물 1 내지 15를 예로 들면, 본 발명의 항균 폴리펩타이드 화합물의 제조 방법은 다음 단계들을 포함하되 이에 제한되지 않는다:
(1) 수지 팽창 및 시험: 일정량의 링크 아미드 MBHA (Rink-amide-MBHA) 수지 (로딩: 0.45 mmol/g)를 합성 장치에 첨가하고, 적정량의 재증류 디클로로메탄을 첨가하여 30분 동안 침지 교반한 후 완전히 팽윤되도록 하며, 그 후, 재증류한 DMF로 4회 (1회당 2분) 세정한 후, 수지가 깨끗한지 여부를 확인하기 위해 닌히드린 시험을 실시하였다 (닌히드린 시험 시약은 피리딘, 닌히드린 및 페놀을 2:1:1의 비율로 사용하였다).
(2) F-moc 보호기 제거: 20% 재증류한 피페리딘+80% 재증류한 DMF (v/v)로 4회 (1회당 3분) 세척하여 F-moc 보호기를 제거하고, 다시 재증류 DMF로 4회 (1회당 2분) 세정한 후 닌히드린 테스트를 수행하여 보호기 제거를 확인하였다.
(3) 아미노산 축합 반응: 3배량의 축합제 HOBT, HBTU 및 아미노산 (N-alpha-Fmoc 보호)을 칭량하여 재증류 DMF로 용해한 후, 6배량의 개시제 DIEA를 첨가하고 균일하게 혼합한 후, (2) 단계에서 Fmoc가 없는 수지에 첨가하여 축합 반응을 시작하며, 전체 반응 과정을 아르곤 기체로 보호하고 1시간 교반 반응시킨다. 용매를 진공 건조하고, 재증류 DMF로 4회 (1회당 2분) 세정한 후, 닌히드린 테스트를 수행하여 아미노산이 완전히 축합되었는지 여부를 확인하였다. 상기 F-moc 보호 반응 공정 및 축합 반응 공정은 화합물 1 내지 15의 모든 서열의 축합이 완료될 때까지 하나의 아미노산이 합성될 때마다 수행되었다. 관련된 아미노산으로는 Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Orn(Boc)-OH, Fmoc-Dab(Boc)-OH, Fmoc-Dap(Boc)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, 및 Fmoc-Ser(tBu)-OH를 포함한다.
(4) 폴리펩타이드 사슬 절단: 마지막 아미노산이 합성 완료된 후, 20% 재증류한 피페리딘으로 세척하여 F-moc 보호기를 제거하고, 닌히드린 테스트를 거쳤으며, 재증류한 디클로로메탄 및 재증류 메탄올로 차례로 2회 (1회당 3분) 세정하였으, 수지가 완전히 건조될 때까지 3시간 동안 진공 건조를 위해 합성기를 밀봉하였다. 그 후, 절단 시약 (TFA:Tris:H2O = 95:2.5:2.5)을 첨가하여 3시간 동안 반응시킨 후, 반응 기간에 20분 간격으로 1분씩 혼합물을 교반하였고, 그런 다음 회전 증발기로 회전 건조시켜 -20℃ 냉장고에 넣어 보관하였다.
(5) 추출: 생성물을 -20℃ 냉장고에서 꺼내고, 얼음 상태의 에테르를 첨가하여 격렬하게 흔들어 10분간 정치시키고, 완전히 분층되기까지 기다린 후, 재증류수로 먼저 상층을 추출한 후, 다시 하층을 추출하며. 추출 후의 액체를 50 ml 비커에 분리하여 담고 -80℃에서 하룻밤 동안 보관한 후, 동결 건조하여 조폴리펩타이드 분말을 얻었다.
(6) 폴리펩타이드의 정제: ① 탈염 (desalination): G-25 세파덱스 (sephadex) 칼럼으로 조폴리펩타이드에 대해 탈염하여 저분자 불순물을 제거하였다. 일정량의 조폴리펩타이드 (약 40 mg)를 칭량하여 5%의 빙초산/수용액 (1 ml)으로 용해시킨 후 컬럼에 로딩하여 5%의 빙초산/수용액으로 용출시켰다. 자외선 검출기로 220 nm 파장에서 흡광도 값을 측정하여 메인 피크에 따라 액체를 수집하고, 수집한 액체를 50 ml 플라스크에 분리하여 담고 -80℃에서 밤새 보관한 다음 진공 건조하여 탈염 후의 조폴리펩타이드 분말을 얻었다. ② HPLC 샘플 제조: 일정량의 탈염 후의 조폴리펩타이드 (약 40 mg)를 칭량하여 20% 아세토니트릴/수용액 (5 ml)으로 용해시키고, 필터로 여과한 후 컬럼에 로딩하였다. 정제용 칼럼은 μ-bondapaktm 역상 C18 칼럼 (19 mm × 300 mm)이었고, 20% 내지 80% 아세토니트릴/수용액으로 구배 용리를 수행하였다. 자외선 검출기로 220 nm에서 흡광도값을 측정하여 메인 피크에 따라 액체를 수집하였고, 수집한 액체를 50 ml 플라스크에 분리하여 담고 -80℃에서 하룻밤 동안 보관한 후, 진공 건조하여 순수한 폴리펩타이드 분말을 얻었다. 합성된 화합물 1 내지 15 및 천연 항균 펩타이드 J-1의 아미노산 서열 및 질량 스펙트럼은 아래의 표 2에 나타내었다.
화합물 아미노산 서열 이론 분자량 실제 분자량
천연 항균 펩타이드 J-1 Pro-Phe-Lys-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2 993.65 994.58
화합물 1 Pro-Phe-Lys-Leu-Lys-Leu-His-Leu-NH2 993.65 994.58
화합물 2 Pro-Phe-Orn-Leu-Ser-Leu-Lys-Leu-NH2 929.62 929.65
화합물 3 Pro-Phe-Dab-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-NH2 956.68 957.62
화합물 4 Pro-Phe-Arg-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2 980.59 981.60
화합물 5 Pro-Phe-Arg-Leu-Arg-Leu-His-Leu-NH2 1049.66 1050.59
화합물 6 Pro-Phe-Arg-Leu-Ser-Leu-Arg-Leu-NH2 999.63 1000.63
화합물 7 Pro-Phe-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-NH2 1068.70 1069.70
화합물 8 Pro-Trp-Lys-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2 991.60 992.60
화합물 9 Pro-Trp-Orn-Leu-Orn-Leu-His-Leu-NH2 1008.66 1008.66
화합물 10 Pro-Trp-Dab-Leu-Ser-Leu-Dab-Leu-NH2 926.63 926.63
화합물 11 Pro-Trp-Dap-Leu-Dap-Leu-Dap-Leu-NH2 897.70 898.70
화합물 12 Pro-Trp-Arg-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2 1019.60 1020.61
화합물 13 Pro-Trp-Arg-Leu-Arg-Leu-His-Leu-NH2 1088.69 1089.68
화합물 14 Pro-Trp-Arg-Leu-Ser-Leu-Arg-Leu-NH2 1038.65 1039.65
화합물 15 Pro-Trp-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-NH2 1107.71 1108.72
2. 항균 폴리펩타이드 화합물의 최소 억제 농도의 측정
항균 폴리펩타이드 화합물의 항균 활성 및 항진균 활성 측정과 관련하여, 사용된 박테리아 균주에는 다음이 포함된다: 대장균 (E. coli, ATCC 25922), 대장균 (E. coli, ATCC 43837), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa, ATCC 27853), 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae, ATCC 700603), 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii,ATCC 29544), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus, ATCC 29213), 고초균 (Bacillus subtilis, ATCC 23857) 및 표피포도구균 (Staphylococcus epidermidis, ATCC 12228); 사용한 진균 균주로는 칸디다 알비칸스 (Candida albicans, ATCC 14053), 칸디다 글라브라타 (Candida glabrata, ATCC 2001), 칸디다 파라프실로시스 (Candida parapsilosis, ATCC 22019), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis, ATCC 750) 및 칸디다 크루세이 (candida krusei, ATCC 6258)가 있으며, 모든 균주들은 표준 균주로서 미국 균종 보존 센터 (ATCC)에서 유래한 것이다. 또한, 약제 내성 균주 S-1a, S-2a, S-3a, S-4a, E-1b, E-2b, E-3b, E-4b, E-5b, P-1c, P-2c, P-3c, P-4c, P-5c, 및 임상 분리 진균 균주 칸디다 글라브라타 (Candida glabrata) 2-1, 및 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 14-1, 14-2, 14-3가 사용되었으며, 모두 임상적으로 분리되었다.
세균 및 진균에 대한 화합물의 최소 균 억제 농도 (MIC)값은 모두 임상 검사표준연구소 (National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS)에서 권장하는 표준 2배 직렬 희석법을 적용하여 측정하였다. 간단하게, 적정량의 동결 보존된 세균 또는 진균을 신선한 MH/SD 배지에 넣고, 37℃에서 180 rpm로 하룻밤 동안 진탕 배양하였다. 얻은 균을 다시 접종하였고, 4시간 내지 5시간 동안 진탕 배양시켜 대수 성장기의 균을 얻었다. 그 후, 1×105 CFU/ml 균액을 취하여 96-웰 플레이트 내에 웰 별 100 μL씩 접종한 후, 2배 직렬 희석법의 방식에 따라 최종 농도의 2배가 되는 다양한 농도 (1 μM 내지 256 μM))의 폴리펩타이드를 웰 별 100 μL씩 첨가하였다. 음성 대조군으로 신선한 배지를 사용하였고, 각 농도에 대해 세 배의 양으로 준비하였다. 폴리펩타이드 첨가 후, 96-웰 플레이트를 37℃ 항온 항습 인큐베이터 내에 넣어 12시간 배양시켜 결과를 관찰하였다. 육안으로 관찰한 결과, 혼탁한 웰 다음의 첫번째 투명한 웰의 화합물 농도를 상기 화합물의 최소 균 억제 농도 (MIC), 즉, 세균 또는 진균에 대한 화합물의 MIC값으로 표기하였다. 표준 세균 균주에 대한 화합물 1 내지 15의 최소 균 억제 농도 결과는 표 3에 나타내었고, 진균에 대한 화합물 1 내지 15의 항균 활성 결과는 표 4에 나타내었다. 항균 폴리펩타이드 J-1, 시프로플록사신(ciprofloxacin), 및 젠타마이신(gentamicin)을 대조군으로 하여, 화합물 2, 8, 9, 13, 및 15의 약제 내성 균주에 대한 항균 활성 결과는 표 5에 나타내었다.
표 3 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 화합물 1 내지 15는 테스트한 세균 및 진균에 대해 모두 우수한 항균 활성 및 항진균 활성을 나타내었다. 여기서, 화합물 7 및 화합물 15의 항균 활성 및 항진균 활성은 천연 항균 펩타이드 J-1 대비 8배 내지 16배 향상되었고, 본 발명의 다른 화합물의 항균 활성 및 항진균 활성은 항균 펩타이드 J-1 대비 1배 내지 8배 향상되었다. 특히 언급해야 할 것은, 화합물 1 내지 15는 모두 임상 분리된 약제 내성 균주에 대해 우수한 항균 활성을 나타낸다는 점이다.
화합물 최소 균 억제 농도(MIC, μM)
C. coli
ATCC25922		 P. aerugmosa
ATCC27853		 C.sakazakii
ATCC29544		 S.aureus
ATCC29213		 B. subtilis
ATCC23857		 S.epidermidis
ATCC12228
J-1 32 32 64 128 32 64
1 32 32 32 128 32 32
2 16 8 32 64 16 16
3 32 32 32 128 16 16
4 32 32 32 128 16 32
5 16 32 32 128 16 32
6 8 32 16 64 16 16
7 8 8 32 64 8 16
8 16 16 16 64 16 32
9 8 8 16 64 16 32
10 16 32 8 32 16 16
11 16 64 16 32 16 16
12 16 32 16 32 16 8
13 8 4 8 32 8 16
14 8 8 8 32 8 16
15 4 8 8 8 4 8
화합물 최소 균 억제 농도(μM)
C. glabrata
ATCC22019		 C. albicans
ATCC14053		 C. tropicalis
ATCC750		 C. krusei
ATCC6258		 C. parapsilsis
ATCC2001
J-1 64 64 16 32 32
1 32 32 32 64 32
2 32 32 32 32 16
3 32 32 32 64 16
4 32 32 32 32 16
5 16 16 32 64 16
6 8 32 16 32 16
7 8 8 32 32 8
8 16 16 16 32 16
9 16 32 16 64 16
10 16 32 8 32 16
11 16 64 16 32 16
12 16 32 16 32 16
13 8 32 8 32 8
14 8 8 8 32 8
15 4 4 4 16 4
균주 최소 균 억제 농도(MIC, μM)
천연 항균 펩타이드 J-1 ciprofloxacin gentamicin 화합물 2 화합물 8 화합물 9 화합물 13 화합물 15
S-1a 128 -- -- 64 64 64 32 8
S-2a 128 -- -- 64 64 64 32 8
S-3a 128 -- -- 64 64 64 32 8
S-4a 128 -- -- 64 64 64 32 8
E-1b 32 25 50 16 16 8 8 4
E-2b 32 25 50 16 16 8 8 4
E-3b 32 25 50 16 16 8 4 4
E-4b 32 25 50 8 16 8 8 4
E-5b 32 25 50 8 16 8 4 4
P-1c 32 50 50 8 16 8 8 8
P-2c 32 25 50 8 8 8 4 8
P-3c 32 25 25 8 8 8 4 8
P-4c 32 50 50 8 8 8 4 8
P-5c 32 50 50 8 8 8 4 8
a는 임상 분리된 약제 내성 균주 MRSA이고; b는 임상 분리된 약제 내성 균주 ESBL이며; c는 임상 분리된 약제 내성 균주 PA이다.
3. 항균 폴리펩타이드 화합물의 생체 내 항균 평가
항균 폴리펩타이드 화합물의 생체 내 항균 활성의 측정은 세균이 감염된 마우스의 생존율을 측정함으로써 생체 내 항균 활성을 반영하는 것이다.
본 발명은 화합물 2, 8, 9, 13, 및 15를 예로 들어, 항균 폴리펩타이드 화합물의 생체 내 항균 효과를 분석하였다. 본 실험에서 사용한 마우스는 쿤밍 (Kunming) 마우스이고, 이러한 마우스들을 항온 환경 (22±1℃)에 안치시켰다. 간단하게, 36 마리의 쿤밍 마우스 (체중 18 g 내지 22 g)들을 무작위로 6 개 군으로 나누고, 1일차에 농도 3×108 CFU/mL 대장균(ATCC 25922) 0.2 ml을 복강 주사하여 마우스 패혈성 복막염 모델을 구축하였다. 세균 접종 1시간 후 생쥐에 복강 내 1차 투여하고, 그 후, 화합물 2, 8, 9, 13, 및 15를 체중의 20 mg/kg 용량으로 복강 주사하였다. 폴리믹신 B (20 mg/kg)를 양성 대조군 약물로 선택하였고, 음성 대조군에는 멸균 생리식염수를 복강 주사하였다. 7일 관찰 후, 각 투여군 및 대조군의 마우스 생존율을 계산하여 생존 그래프를 제작하였다.
도 1은 마우스 패혈성 복막염 모델에서 본 발명의 화합물 2, 8, 9, 13 및 15가 마우스 생존율에 미치는 영향을 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화합물 13을 투여한 마우스와 양성 대조군을 투여한 마우스의 생존율은 100%로서 가장 높았고; 화합물 9 내지 15를 투여한 마우스의 생존율은 90%이상으로 유사하였으며; 화합물2 내지 8을 투여한 마우스의 생존율은 70% 이상이었고; 그 다음으로 천연 항균 펩타이드 J-I를 투여한 쥐의 생존율은 약 50%이었으며; 음성 대조군 마우스의 생존율은 가장 낮은 것으로 나타났으며, 모든 마우스는 3일째에 전부 사망하였다. 음성 대조군 및 천연 항균 폴리펩타이드 J-I과 비교해볼 때, 본 발명의 화합물 2, 8, 9, 13 및 15는 20 mg/kg의 농도 하에서 마우스의 생존율을 효과적으로 향상시킬 수 있었다. 이로부터 본 발명의 항균 폴리펩타이드 화합물은 생체 내에서 높은 항균 활성을 나타낸다는 것이 입증되었다.
4. 항균 폴리펩타이드 화합물의 용혈 독성 평가
용혈 활성은 항균 폴리펩타이드 화합물로 마우스 적혈구의 용혈 농도를 측정하여 결정하였다.
본 발명에서는 화합물 1 내지 15를 예로 들어, 항균 폴리펩타이드 화합물의 용혈 독성을 분석하였다. 마우스 적혈구를 8%의 농도로 희석시키고, 적혈구 현탁액을 96-웰 플레이트 (웰별 100 μL)에 첨가한 다음, 각 웰에 화합물 100 μL를 첨가하였다.
1시간 동안 배양한 후, 각 웰의 상층액을 취하여 다른 96-웰 플레이트에 첨가한 후, ELISA 판독기를 사용하여 490 nm에서 측정 샘플 상층액의 흡광도값을 측정하였다. 본 발명에서는 PBS 및 2% Triton-X 100을 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로 사용하였다.
도 2는 본 발명의 용혈율 평가한 히스토그램을 나타낸 것으로서, 여기서, Triton X-100을 양성 대조군으로 사용하였고, 용혈율은 100%로 설정하였으며; PBS를 음성 대조군으로 사용하였고, 용혈율은 0으로 설정하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화합물 1 내지 15는 마우스 적혈구에 대해 거의 용혈 활성을 나타내지 않으며, 용혈율은 5% 미만이다. 이로부터 본 발명의 항균 폴리펩타이드 화합물은 용혈 활성이 낮다는 것이 입증되었다.
5. 항균 폴리펩타이드 화합물의 세포 독성 평가
세포 독성 측정을 위해, 인간 자궁 경부암 세포 Hela, 인간 배아 신장 상피 세포 HEK293 세포 및 마우스 단핵 대식 세포 RAW264.7의 증식에 대한 화합물의 영향을 평가하기 위해 MTT 비색법을 사용하였다.
본 발명의 화합물 2, 8, 9, 13, 및 15를 예로 들어, 항균 폴리펩타이드 화합물의 세포 독성을 분석하였다. 본 발명에서 사용한 세 가지 세포주는 인간 자궁 경부암 세포 Hela, 인간 배아 신장 상피 세포 HEK293 세포 및 마우스 단핵 대식 세포 RAW264.7이다.
Hela 세포는 10% 신생 송아지 혈청을 함유한 RPMI 1640 배지에서 배양하고, HEK293 세포 및 RAW264.7 세포는 10% 소 태아 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다. 간단하게, 세포 (1Х104 cells/well)를 96-웰 플레이트에 접종하고 37℃, 5% CO2 로 설정된 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 후 서로 다른 농도의 화합물을 첨가한 후 5% CO2 인큐베이터에 넣어 배양하였다. 24시간 후 각 웰마다 5 mg/mL인 MTT 용액 20 μL을 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 4시간 후, 배지를 제거하고 150 μL의 DMSO를 첨가하여 남보라색 포르마잔 결정을 용해시켰다. 용액을 발진기 (oscillator)로 5분간 섞어준 후 ELISA 리더기를 사용하여 570 nm에서 흡광도값을 측정한 후, 생존율을 다음의 공식으로 계산하였다: (OD 투여군/OD 대조군) × 100% (n=3).
도 3은 본 발명의 화합물 2, 8, 9, 13 및 15 및 천연 항균 폴리펩타이드 J-1의 테스트 세포 증식에 대한 영향을 나타낸다. 여기서, 왼쪽 그래프는 화합물 2, 8, 9, 13 및 15 및 천연 항균 폴리펩타이드 J-1이 Hela 세포 증식에 대한 영향을 나타내고; 가운데 그래프는 화합물 2, 8, 9, 13 및 15가 RAW 264.7 세포 증식에 대한 영향을 보여주며; 오른쪽 그래프는 화합물 2, 8, 9, 13 및 15가 HEK293 세포 증식에 미치는 영향을 보여준다. 도 3에서 나타낸 바와 같이, 화합물 2, 8, 9, 13 및 15는 테스트한 세 가지 세포에 대해 모두 억제 활성을 나타내지 않았다. 이로부터 본 발명의 항균 폴리펩타이드 화합물은 세포 독성이없다는 것이 입증되었다.
6. 항균 폴리펩타이드 화합물을 이용한 대장균 외막(OM) 침투성 평가
세균 세포 외막 (OM)의 파괴 작용은 소수성 형광 프로브 1-N-페닐나프틸아민 (NPN,1-N-phenylnaphthylamine)을 사용하여 화합물의 대장균 (ATCC 25922) 외막 침투성에 대한 영향을 확인하는 것을 통해 측정되었다.
본 발명의 화합물 2, 8, 9, 13 및 15를 예로 들어, 항균 폴리펩타이드 화합물의 존재에 따른 대장균의 외막 침투성을 분석하였다. 대장균 세포를 PBS 용액으로 두 번 세정한 후 5 mM HEPES (pH 7.2)로 재현탁시킨 후, 5×104 CFU/mL의 농도가 되도록 희석시켰다. 화합물 농도는 1×MIC 내지 8×MIC이고, 실험군: 100 μL 균액 + 50 μL Jelleine-I + 50 μL NPN (40 μM); 대조군: 100 μL 균액 + 50 μL HEPES (5 mM) + 50 μL NPN (40 μM)이다. 여기 및 방출 파장을 각각 350 nm 및 420 nm로 설정하고, 다기능 ELISA 리더기로 매분마다 한 번씩 검출하되 연속하여 15분 동안 검출하였다.
도 4는 본 발명의 화합물 2, 8, 9, 13 및 15 및 천연 항균 펩타이드 J-1의 대장균 내막, 및 외막 침투성에 대한 영향을 나타낸다. 여기서, 도 4 (A, C, E, G, I, K)는 각각 상이한 용량의 천연 항균 펩타이드 J-1 및 화합물 2, 8, 9, 13 및 15이 대장균의 외막 침투성에 대한 영향을 나타내고, 여기서 HEPES 완충액을 음성 대조군으로 사용하였다; 도 4 (A, C, E, G, I, K)의 결과로부터, 화합물 2, 8, 9, 13 및 15 및 항균 펩타이드 J-1이 용량 의존적으로 대장균 외막의 완정성 (integrity)을 파괴할 수 있음을 알 수 있다.
7. 항균 폴리펩타이드 화합물을 이용한 대장균 내막(IM) 투과성 평가
세균 외막에 대한 완정성의 효과는 ONPG(니트로벤젠-β-D-갈락토사이드)를 사용하여 대장균 ML-35(ATCC 43837) 포내 β-갈락토시다아제의 방출량을 측정하여 결정하였고, 이를 통해대장균 내막 투과성에 대한 화합물의 영향을 검출하였다.
본 발명의 화합물 2, 8, 9, 13 및 15를 예로 들어, 항균 폴리펩타이드 화합물의 존재에 따른 대장균 내막(IM) 투과성을 분석하였다. 대장균 ML-35 세포를 PBS 용액으로 두 번 세정한 후 0.9% 염화나트륨 용액으로 재현탁시켰다. 실험군의 화합물 농도는 1×MIC 내지 8×MIC의 범위였다: 100 μL 균액 + 90 μL Jelleine-I + 10 μL ONPG (30 mM); 양성 대조군: 100 μL 균액 + 90 μL 1% Triton-X100 + 10 μL ONPG(30 mM); 음성 대조군: 100 μL 균액 + 90 μL 0.5% 염화나트륨 용액 + 10 μL ONPG (30 mM)이다. 다기능 ELISA 리더기를 사용하여 90분동안 5분마다 한번씩 420nm에서 세포를 검출하였다.
도 4는 본 발명의 화합물 2, 8, 9, 13 및 15 및 천연 항균 폴리펩타이드 J-1의 대장균 내막, 및 외막 침투성에 대한 영향을 나타낸다. 도 4 (B, D, F, H, J, L)는 항균 폴리펩타이드 J-1 및 화합물 2, 8, 9, 13 및 15의 용량별 대장균의 내막 침투성에 대한 영향을 나타내고, 여기서, triton X-100을 양성 대조군으로 사용하였으며, 생리식염수를 음성 대조군으로 사용하였다. 도 4 (B, D, F, H, J, L)의 결과로부터 알 수 있듯이, 화합물 2, 8, 9, 13 및 15는 천연 항균 펩타이드 J-1과 유사하게 용량 의존적으로 대장균 세포 내막의 완정성을 파괴하는 점에서 유사하다는 것을 알 수 있다.
8. 항균 폴리펩타이드 화합물의 급성 독성 평가
화합물의 급성 독성은 각 화합물을 투여한 마우스에서 급성 독성을 측정하여 결정되었다.
본 발명은 화합물 2, 8, 9, 13 및 15를 예로 들어, 항균 폴리펩타이드 화합물이 존재할 때 대장균 내막(IM) 침투성을 분석하였다. 본 실험에서 사용한 마우스는 쿤밍 마우스이고, 이러한 마우스들은 항온 환경(22±1℃)에서 자유롭게 물과 음식을 섭취할 수 있도록 사육되었다. 간단하게, 132 마리의 건강한 쿤밍 마우스들을 무작위로 11개 군으로 나누고, 각 군에 12마리씩 (수컷과 암컷 각각 절반씩) 배치하였으며, 그 중의 5 개 군에는 서로 다른 용량의 화합물 (100 mg/kg 내지 1000 mg/kg) 0.2 ml을 복강 주사하였고, 대조군에는 생리식염수를 복강 주사하였다. 본 실험에서는 멜리틴 (melittin)을 대조 약물로 사용하였고, 다른 5개 군에는 서로 다른 용량의 멜리틴 (10 mg/kg 내지 32mg/kg)을 복강 주사하였다. 투여 2시간 후 마우스 상태를 관찰 기록하였고, 그 후 하루에 두 번씩 관찰하여 연속 14일 관찰하여 마우스 생존율을 기록하였다.
도 5는 마우스 복강에 각각 화합물 2, 8, 9, 13 및 15 (100 mg/kg, 300 mg/kg, 500 mg/kg, 700 mg/kg, 1000 mg/kg)를 주사한 후, 각 군 마우스의 생존율 그래프이다. 도 5에 표시된 바와 같이, 화합물 2, 8, 9, 13 및 15는 최고 용량 (1000mg/kg) 처리군에서 각각 1 내지 3 마리의 마우스가 사망하였고, 다른 군에서는 유의미한 행동 이상이 없었다. 카버법 (Karber's method)에 따라 계산한 멜리틴 마가이닌 (melittin magainin)의 LD50은 20 mg/kg이고, 화합물 2, 8, 9, 13 및 15의 LD50은 1000 mg/kg 이상으로, 급성 독성이 멜리틴 마가이닌보다 적어도 50 배 낮았다. 이로부터 본 발명의 항균 폴리펩타이드 화합물은 급성 독성이 낮다는 것이 입증될 수 있다.
9. 하이드로겔의 제조
본 발명의 하이드로겔은 몰 비율에 따라 다음과 같은 원료를 포함한다: 항균 폴리펩타이드 화합물: 1 mM 내지 50 mM; Na2HPO4: 1 mM 내지 10 mM; KH2PO4: 1 mM 내지 5mM; KCl: 1 mM 내지 5 mM; NaCl: 50mM 내지 200mM; 및 상기 하이드로겔 용매는 주로 물을 포함하고, 부차적으로는 디메틸술폭사이드(DMSO)를 포함하며, DMSO의 부피 함량은 5% (v/v)미만이다.
본 발명의 하이드로겔의 제조 방법은 구체적으로 다음과 같은 단계를 포함한다:
S1, 상기 화합물을 DMSO에 용해시켜 폴리펩타이드 화합물 스톡 용해액을 제조하고; 및 Na2HPO4, KH2PO4, KCl, 및 NaCl을 추가 사용을 위해 상기 농도에 따라 탈이온수에 용해시키는 단계.
S2, DMSO에 용해된 항균 펩타이드 J-1 용액을 최종 농도가 1.5 mM 내지 40 mM가 되도록 상기 식염수에 첨가하고 균일하게 교반시켜 하이드로겔을 얻는 단계.
S3, S2에서 하이드로겔을 제조하는 과정 중, 식염수에 약물 또는 성장 인자를 첨가함으로써 약물 또는 성장 인자가 담지된 하이드로겔 서방 드레싱을 제조하는 단계.
본 발명의 화합물 8을 예로 들어, 우선 화합물 8을 디메틸술폭사이드에 용해시켜 고농도 화합물 원액을 만든 후, 이를 인산 완충 용액 (PBS, pH 6.0 내지 9.0)에 첨가하여 최종 농도를 10 mM로 희석한 후 적절한 시간 동안 교반하여 하이드로겔을 얻었다.
도 6은 본 발명의 항균 폴리펩타이드 화합물의 하이드로겔 이미지 및 주사 전자 현미경 이미지를 나타낸다; 여기서, 도 6의 A는 액체 상태의 항균 폴리펩타이드이고; 도 6의 B는 본 발명의 항균 폴리펩타이드 화합물의 하이드로겔 이미지이며; 도 6의 C는 본 발명의 항균 폴리펩타이드 화합물이 탈이온수에 용해되어 실온 건조 후 나타낸 주사 전자 현미경 이미지이고; 도 6의 D는 본 발명의 하이드로겔이 실온 건조 후 나타낸 주사 전자 현미경 이미지이다.
10. 마우스 간장 출혈 모델에서 하이드로겔의 지혈 성능 측정
상기 과정으로 제조한 하이드로겔을 선택하여 지혈 성능에 대해 측정하였다. 하이드로겔을 이용한 지혈 성능을 측정하는데 사용한 마우스는 수컷 쿤밍 마우스만을 사용하였고, 체중은 18-22g이며, 이러한 마우스들은 온도가 22℃ 내지 24℃이고, 상대 습도가 45% 내지 55%인 환경 하에서 사육하였으며, 수술 12시간 전 실험용 마우스에 대해 금식을 진행하였다.
간장 출혈 모델의 구축: 실험은 도합 두 개 군으로 나누었고, 각각 대조군, 화합물 8 하이드로겔군이였으며, 각 군마다 8 마리의 마우스를 배치하였다. 체중 당 40 mg/kg 용량의 펜토바르비탈나트륨으로 마우스를 마취시킨 후, 마우스를 수술대에 고정시키고, 복부 피부를 면도한 상태로 준비하고 요오드포를 사용하여 수술 영역에 대해 소독을 진행하였다. 그 후, 복부에서 직경이 약 1.5 cm의 세로 방향 절개구를 취하고, 조직을 층에 따라 분리시켜 간장 우엽을 충분히 노출시킨 후, 사전에 칭량한 여과지를 간장 우엽 하방에 받치고, 21G의 주사 바늘로 간장 우엽 정중앙을 찔렀다. 그 후 즉시 200 ul 하이드로겔을 상처 부위에 도포하였으며 (대조군은 아무런 처리도 하지 않음), 촬영하여 간장 출혈 과정을 기록하였다.
도 7은 마우스 간장 출혈 모델에서의 본 발명의 하이드로겔의 지혈 성능을 나타낸 이미지로서; 여기서, 도 7의 A는 생리식염수 대조군이고; 도 7의 B는 본 발명의 하이드로겔 처리군이다. 도 7의 결과로부터 알 수 있듯이, 대조군과 비교해볼 때, 본 발명의 하이드로겔은 간장 출혈을 확연히 억제할 수 있다. 이로부터 본 발명의 하이드로겔은 우수한 지혈 성능을 가짐을 증명할 수 있다.
비록 본 발명은 실시예로 상기와 같이 개시되었으나 이는 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니며, 당업자들은 본 발명의 사상과 범위를 이탈하지 않으면서 본 발명에 대해 일부 변경과 수정을 실시할 수 있으며, 본 발명의 보호 범위는 첨부된 특허 청구 범위에서 정한 범위를 기준으로 해야 할 것이다.

Claims (17)

  1. 다음의 아미노산 서열로 표시되는 모체 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 폴리펩타이드 화합물:
    Pro-Xaa2-Xaa3-Leu-Xaa5-Leu-Xaa7-Leu-NH2
    여기서, Xaa2=Phe, homo-Phe 또는 Trp;
    Xaa3=Lys, Aib, Orn, Dab, Dap 또는 Arg;
    Xaa5=Ser, Lys, Orn, Dab, Dap 또는 Arg;
    Xaa7=His, Lys, Orn, Dab, Dap 또는 Arg;
    그리고, Xaa2=Phe, Xaa3=Lys, Xaa5=Ser일 때, Xaa7≠His.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항균 폴리펩타이드 화합물은 다음의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 폴리펩타이드 화합물:
    화합물 1:
    Pro-Phe-Lys-Leu-Lys-Leu-His-Leu-NH2
    화합물 2:
    Pro-Phe-Orn-Leu-Ser-Leu-Lys-Leu-NH2
    화합물 3:
    Pro-Phe-Dab-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-NH2
    화합물 4:
    Pro-Phe-Arg-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2
    화합물 5:
    Pro-Phe-Arg-Leu-Arg-Leu-His-Leu-NH2
    화합물 6:
    Pro-Phe-Arg-Leu-Ser-Leu-Arg-Leu-NH2
    화합물 7:
    Pro-Phe-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-NH2
    화합물 8:
    Pro-Trp-Lys-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2
    화합물 9:
    Pro-Trp-Orn-Leu-Orn-Leu-His-Leu-NH2
    화합물 10:
    Pro-Trp-Dab-Leu-Ser-Leu-Dab-Leu-NH2
    화합물 11:
    Pro-Trp-Dap-Leu-Dap-Leu-Dap-Leu-NH2
    화합물 12:
    Pro-Trp-Arg-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2
    화합물 13:
    Pro-Trp-Arg-Leu-Arg-Leu-His-Leu-NH2
    화합물 14:
    Pro-Trp-Arg-Leu-Ser-Leu-Arg-Leu-NH2
    화합물 15:
    Pro-Trp-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-NH2.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 항균 폴리펩타이드 화합물이 완충액과 중합 반응을 거쳐 형성된 것을 특징으로 하는, 하이드로겔.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 하이드로겔의 제조방법은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔:
    S1, 항균 폴리펩타이드 화합물을 디메틸술폭사이드에 용해시켜 추가 사용을 위한 항균 폴리펩타이드 화합물의 용해액을 얻는 단계; 및
    S2, 항균 폴리펩타이드 화합물의 용해액을 완충액에 첨가하고 초음파 또는 교반 조건 하에 이온 가교 결합 중합 반응을 진행하여 하이드로겔을 얻는 단계.
  5. 제4항에 있어서,
    다음과 같은 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔:
    S3, 완충액에 약물 및/또는 성장 인자를 더 첨가하여 약물 또는 성장 인자가 담지된 하이드로겔을 획득하는 단계.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 약물은 항균 약물 또는 소염 약물이고, 상기 성장 인자는 상처 치유 촉진 성장 인자인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 디메틸술폭사이드의 부피 함량은 5%보다 작은 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 완충액은 인산염 완충액이고; 상기 항균 폴리펩타이드 화합물과 인산염 완충액의 조성 및 배분비는 몰비로 항균 폴리펩타이드 화합물:Na2HPO4:KH2PO4:KCl:NaCl=(1-50):(1-10):(1-5):(1-5):(50-200)로 계산되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 인산염 완충액의 조성은 아데노신 디 포스페이트(ADP)를 더 포함하고, 몰비로 상기 ADP와 Na2HPO4의 비례는 1:(1-50)로 계산되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
  10. 제3항에 있어서,
    상기 반응은 이온 가교 결합 중합 반응이고, 반응 온도는 0℃ 내지 60℃이며, 반응 시간은 1분 내지 120분인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
  11. 유착 방지 약물에서의 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항의 하이드로겔의 응용에 있어서,
    상기 유착 방지 약물은 약물 및/또는 성장 인자가 담지된 상기 하이드로겔 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 약용 담체 및/또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 유착 방지 약물은 정제, 당의정제, 과립제, 적제, 분무제, 린스제, 가글제, 피부 표면에 사용되는 연고 및 페이스트, 및 주사에 사용되는 멸균 용액 중 적어도 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 용도.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 약물은 항균 약물 또는 소염 약물이고, 상기 성장 인자는 상처 치유 촉진 성장 인자인 것을 특징으로 하는 용도.
  14. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 항균 폴리펩타이드 화합물 또는 제3항 내지 제13항 중 어느 한 항의 하이드로겔을 포함하는 것을 특징으로 하는 의료 기기.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 항균 폴리펩타이드 화합물 또는 상기 하이드로겔은 상기 의료 기기의 적어도 하나의 표면 상에 도포되어 재료를 형성하는 것을 특징으로 하는 의료 기기.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 의료 기기의 형식은 의학용 드레싱, 섬유, 메쉬, 분말, 마이크로스피어, 시트, 스펀지, 폼, 봉합 앵커링 기기, 도관, 스텐트, 외과 수술용 압정, 플레이트 및 스크류, 약물 전달 기기, 유착 방지막 및 조직 접착제로 구성된 군 중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 의료 기기.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 섬유는 직물이고, 상기 시트는 막 또는 부목이며, 상기 봉합 앵커링 기기는 봉합사 또는 스테이플인 것을 특징으로 하는 의료 기기.
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