CZ307755B6 - Antimikrobiální peptidy a jejich použití pro léčbu topických infekcí - Google Patents
Antimikrobiální peptidy a jejich použití pro léčbu topických infekcí Download PDFInfo
- Publication number
- CZ307755B6 CZ307755B6 CZ2015-244A CZ2015244A CZ307755B6 CZ 307755 B6 CZ307755 B6 CZ 307755B6 CZ 2015244 A CZ2015244 A CZ 2015244A CZ 307755 B6 CZ307755 B6 CZ 307755B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- peptides
- infections
- yeast
- treatment
- lys
- Prior art date
Links
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 34
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 title claims description 28
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 title claims description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 90
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 72
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 39
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 206010065764 Mucosal infection Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims abstract description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 23
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 21
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 20
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 19
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 19
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 18
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 15
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 12
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 claims description 12
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 12
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 claims description 11
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- -1 carrier Substances 0.000 claims description 8
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 7
- 230000035876 healing Effects 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 claims description 6
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 claims description 5
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 claims description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 5
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 claims description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 3
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims description 3
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims description 3
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 claims description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 3
- 229920002818 (Hydroxyethyl)methacrylate Polymers 0.000 claims description 2
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 4-hydroxybutyrate Chemical compound OCCCC([O-])=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Polymers OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 240000005428 Pistacia lentiscus Species 0.000 claims description 2
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000005313 bioactive glass Substances 0.000 claims description 2
- 239000005312 bioglass Substances 0.000 claims description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 2
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 claims description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 claims description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 claims description 2
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 239000010456 wollastonite Substances 0.000 claims description 2
- 229910052882 wollastonite Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000004568 cement Substances 0.000 claims 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 abstract description 4
- 206010064687 Device related infection Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 abstract description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 16
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- SMGTYJPMKXNQFY-UHFFFAOYSA-N octenidine dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C1=CC(=NCCCCCCCC)C=CN1CCCCCCCCCCN1C=CC(=NCCCCCCCC)C=C1 SMGTYJPMKXNQFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 10
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 9
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 206010031252 Osteomyelitis Diseases 0.000 description 8
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 8
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 7
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 5
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 5
- OHYPPUOVSUINHM-UHFFFAOYSA-N 4-(methylamino)phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.CNC1=CC=C(O)C=C1 OHYPPUOVSUINHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 3
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 241000222126 [Candida] glabrata Species 0.000 description 3
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 3
- 239000000565 sealant Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- NBWRJAOOMGASJP-UHFFFAOYSA-N 2-(3,5-diphenyl-1h-tetrazol-1-ium-2-yl)-4,5-dimethyl-1,3-thiazole;bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1N1N(C=2C=CC=CC=2)N=C(C=2C=CC=CC=2)[NH2+]1 NBWRJAOOMGASJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000798862 Candida glabrata CBS 138 Species 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 208000008960 Diabetic foot Diseases 0.000 description 2
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 2
- ADLSWZDEMJETGK-UHFFFAOYSA-N I.I.I.I.I.I.I.I.I.I.I Chemical compound I.I.I.I.I.I.I.I.I.I.I ADLSWZDEMJETGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000029534 Infectious Bone disease Diseases 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- 241000191938 Micrococcus luteus Species 0.000 description 2
- 208000005141 Otitis Diseases 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 206010046914 Vaginal infection Diseases 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 2
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 2
- 239000012237 artificial material Substances 0.000 description 2
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 208000019258 ear infection Diseases 0.000 description 2
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 2
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N (4-methylphenyl)-phenylmethanamine Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(N)C1=CC=CC=C1 UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 1,2-ethanedithiol Chemical compound SCCS VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYUJQLYQYZDQAG-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroacetic acid tri(propan-2-yl)silane Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.CC(C)[SiH](C(C)C)C(C)C OYUJQLYQYZDQAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 5-methylphenazinium methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.C1=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000003345 AMP group Chemical group 0.000 description 1
- 102000014133 Antimicrobial Cationic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010050820 Antimicrobial Cationic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 241000256837 Apidae Species 0.000 description 1
- 241001589086 Bellapiscis medius Species 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000144583 Candida dubliniensis Species 0.000 description 1
- 241000222178 Candida tropicalis Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002064 Dental Plaque Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000001860 Eye Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000321367 Hylaeus signatus Species 0.000 description 1
- 206010065042 Immune reconstitution inflammatory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 1
- 101150118523 LYS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005230 Leg Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- SLQJJFAVWSZLBL-BJDJZHNGSA-N Lys-Ile-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN SLQJJFAVWSZLBL-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 1
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 241000235645 Pichia kudriavzevii Species 0.000 description 1
- 241000256833 Polistinae Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 208000035965 Postoperative Complications Diseases 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000558 Varicose Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000256856 Vespidae Species 0.000 description 1
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000000656 anti-yeast Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002639 bone cement Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000032343 candida glabrata infection Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004022 clotrimazole Drugs 0.000 description 1
- VNFPBHJOKIVQEB-UHFFFAOYSA-N clotrimazole Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(N1C=NC=C1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 VNFPBHJOKIVQEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000001804 debridement Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 229920006227 ethylene-grafted-maleic anhydride Polymers 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 208000011323 eye infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000022760 infectious otitis media Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002919 insect venom Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- MASXKPLGZRMBJF-MVSGICTGSA-N mastoparan Chemical group CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O MASXKPLGZRMBJF-MVSGICTGSA-N 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 1
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 1
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229960001774 octenidine Drugs 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- UQGPCEVQKLOLLM-UHFFFAOYSA-N pentaneperoxoic acid Chemical compound CCCCC(=O)OO UQGPCEVQKLOLLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 244000000040 protozoan parasite Species 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- ZFMRLFXUPVQYAU-UHFFFAOYSA-N sodium 5-[[4-[4-[(7-amino-1-hydroxy-3-sulfonaphthalen-2-yl)diazenyl]phenyl]phenyl]diazenyl]-2-hydroxybenzoic acid Chemical compound C1=CC(=CC=C1C2=CC=C(C=C2)N=NC3=C(C=C4C=CC(=CC4=C3O)N)S(=O)(=O)O)N=NC5=CC(=C(C=C5)O)C(=O)O.[Na+] ZFMRLFXUPVQYAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 239000000273 veterinary drug Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Předmětem vynálezu jsou syntetické peptidy odvozené od přírodního peptidu hylaninu a jejich pou žití k léčení infekčních onemocnění způsobených různými patogenními bakteriemi a kvasinkami rodua to především topických infekcí, jako jsou obtížně se hojící rány a kožní defekty, infekce sliznice, ale i infekce katetrů, kloubních náhrad a implantovaných materiálů, jejichž velmi častou příčinou je tvorba mikrobiálních biofilmů.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká peptidů vzorců I až XIX a jejich použití k léčbě infekčních onemocnění způsobených různými patogenními bakteriemi a kvasinkami rodu Candida, a to především topických infekcí jako jsou obtížně se hojící rány a kožní defekty, infekce sliznice, ale i infekce katétrů, kloubních náhrad a implantovaných materiálů, jejichž velmi častou příčinou je tvorba mikrobiálních biofilmů.
Dosavadní stav techniky
Infekce je závažnou komplikací hojení akutních i chronických ran. K následné chronicitě rané infekce přispívá tvorba biofilmů [Rulík a spol., 2011] vedoucí k chronické inflamaci spodiny rány zastavující hojení rány a napomáhající šíření infekce [Bjamsholt, 2013], Biofilm představuje strukturované společenství mikrobiálních kmenů přisedlých ke spodině rány nebo přisedlých na površích umělých implantátů jako jsou kloubní náhrady a osteosyntézy, materiálů jako jsou fixační tmely, nebo na katétrech zavedených do těla pacienta. Biofilm se vytváří i v souvislosti se zubním povlakem, močovými infekcemi, infekcemi očí a infekcemi zvukovodu či středního ucha. Celkově se biofilm podílí přibližně na 80 % všech infekcí ve zdravotnictví. Mikroorganismy žijící v biofilmech jsou obaleny matricí, která je tvořena extracelulámími polysacharidy, algináty a dalšími substancemi [Bjamsholt a spol., 2013], Díky této matrici jsou mikroorganismy chráněny před působením antibiotik, antiseptik, a i proti imunitnímu systému organismu. Ve stádiu zralého biofilmů, kdy mikroorganismům hrozí vyčerpání živin, se biofilm začne řízené rozpadat v menší celky, a mikroorganismy se z biofilmů uvolní a šíří se do blízkého i vzdáleného okolí, kde způsobují další závažné komplikace. Léčba topických infekcí jak chronických ran, tak i infekcí způsobených přisedlými biofilmy na umělých materiálech je velmi obtížná a následky jsou alarmující. Naše imunitní obrana vůči mikroorganismům v biofilmů není dostatečná a nevhodné použití topických antibiotik či antiseptik vede k tvorbě rezistentních kmenů, které přerůstají kmeny citlivé. Abychom dosáhli efektivní lokální terapii způsobené infekcí v biofilmů, je zapotřebí použít kombinaci mechanického debridementu a terapii účinným širokospektrým antiseptikem a dalšími látkami, které pronikají dovnitř biofilmů, kde zabíjejí bakterie či blokují tvorbu biofilmů. Jednou z možností je využití komerčně dostupných terapeutických krytí založených na lokálním působení iontů stříbra (Aquacel Ag+Extra) nebo na polymemích práškových materiálech vytvářejících v ráně ideální vlhkost, která podporuje optimální činnost buněk a regeneraci postižené tkáně (Altrazeal).
Určitou možností, jak zvýšit terapeutický potenciál lokální terapie infikované rány či zabránit usazení infekce na povrchu umělého materiálu je použití antimikrobiálních peptidů (AMP) [Zasloff, 2002], Je známo, že AMP zabíjejí bakterie zcela odlišným mechanismem než tradiční antibiotika a při tom nevytvářejí bakteriální rezistenci [Zasloff, 2002], a proto jsou uvažovány jako doplněk tradičních antibiotik nebo jejich náhrada [Hancock a Sáhl, 2006; Toke, 2005; Giuliani a spol., 2007, Zaiou, 2007; Oyston a spol., 2009; Baltzer a Brown, 2011; Yeung a spol., 2011; Čeřovský, 2014], Nyní zde předkládané, nově objevené vysoce účinné AMP se nabízejí jako vhodné, synteticky dostupné látky k eradikaci infekce, případně k prevenci vzniku infekčního ložiska, a to v kombinaci s komerčně dostupnými materiály používanými pro krytí infikovaných ran, nebo ve směsi s nosiči používanými v ortopedii pro léčbu infekcí kostí, či ve směsi se syntetickými polymemími materiály používanými například v ortopedii jako tmely (polymetylmetakrylát) pro fixaci kloubních náhrad.
Antimikrobiální peptidy byly identifikovány prakticky v celém spektru živočišné a rostlinné říše. V říši hmyzu například představují právě takové peptidy hlavní prostředek obrany proti mikroorganismům [Čeřovský, 2014; Otvos, 2000], Tyto peptidy jsou schopny velice rychle
- 1 CZ 307755 B6 zabíjet bakterie a některé další mikroorganismy jako kvasinky a plísně, a to mechanismem zcela odlišným, než jaký je znám v případě běžně užívaných antibiotik. I když zmíněný mechanismus ještě není zcela objasněn, v podstatě spočívá v narušení buněčné membrány mikroorganismů tvorbou transmembránových pórů nebo iontových kanálů, či rozpadem celé mikrobiální obálky. Následný únik metabolitů a dalších nitrobuněčných komponent způsobí zánik mikroorganismu [Oren a Shai, 1998; Yeaman a Yount, 2003; Nguyen a spol., 2011], Obecně je též známo, že antimikrobiální peptidy u bakterií nevyvolávají resistenci, která je známa u doposud používaných tradičních antibiotik. Zvláštní skupina peptidů s antimikrobiálním účinkem se nachází vjedu hmyzu řádu Hymenoptera [Kuhn-Nentwig, 2003],
V přírodě je antimikrobiální účinek peptidů isolovaných z jedu vos, včel, čmeláků a mravenců většinou sekundární, jejich hlavní úloha spočívá spíše v toxicitě či vyvolání bolesti a zánětu, jako třeba u peptidů patricích do skupiny mastoparanů [Čeřovský a spol., 2008], Nicméně antimikrobiální účinek peptidů isolovaných například z jedu primitivních včel je značný a vzhledem k tomu, že se jedná o peptidy synteticky snadno dostupné, lze uvažovat o využití takových peptidů i v praktické medicíně. V současné situaci, kdy překonávání resistence bakteriálních patogenů a kvasinek vůči tradičním antibiotikům či běžným antifungálním přípravkům vyžaduje hledání stále nových typů antimikrobiálních látek, jsou antimikrobiální peptidy velmi perspektivní.
Přírodní peptid nazvaný hylanin byl původně isolován z jedových váčků volně žijících solitérních včel Hylaeus signatus a jeho sekvence byla stanovena následovně:
H-Gly-Ile-Met-Ser-Ser-Leu-Met-Lys-Lys-Leu-Ala-Ala-His-Ile-Ala-Lys-NH2
Na základě takto stanovené sekvence byl hylanin připraven metodou syntézy na pevné fázi a poté byla testována jeho antimikrobiální aktivita.
Synteticky připravený hylanin vykazoval vysokou aktivitu proti Micrococcus luteus a Bacillus subtilis, byl ovšem málo aktivní proti patogenním bakteriím Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa, a vykazoval jen mírnou aktivitu proti kvasince Candida albicans. Současně však měl velmi nízkou hemolytickou aktivitu, která je mírou toxicity vůči eukaryotickým buňkám.
Primární funkce hylaninu v přírodě není známa, jedná se o peptid s dosud nepopsanými biologickými účinky. Je však obecně známo, že peptidy izolované z jedu hmyzu řádu Hymenoptera vykazují antimikrobiální a antifungální účinky, případně zabíjejí buňky protozoálních parazitů, nebo i některé rakovinné buňky.
Podstata vynálezu
Nyní bylo překvapivě zjištěno, že cílenou obměnou aminokyselinového složení, která zahrnuje vícero aminokyselin v sekvenci, lze získat analogy hylaninu, mající silný účinek nejen proti patogenním stafýlokokům, ale též proti Gram-negativní bakterii Pseudomonas aeruginosa, a nadto i proti kvasince Candida albicans. Některé z těchto analogů mají dobrou účinnost i vůči dalším patogenním kvasinkám rodu Candida.
Významný antimikrobiální účinek předkládaných analogů byl prokázán též během jejich působení na mikrobiální biofilmy in vitro, tvořené C. albicans, P. aeruginosa nebo S. aureus.
V těchto případech byl účinek analogů sledován jako ztráta metabolické aktivity mikrobiálních buněk uvnitř biofilmu, a to za využití sloučenin 2,3-ůri-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-2Htetrazolium-5-karboxanilid (XTT) nebo 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2Htetrazolium bromid (MTT). V případech použití některých analogů byl úbytek metabolické
-2CZ 307755 B6 aktivity mikrobiálních buněk srovnatelný s poklesem, pozorovaným po aplikaci běžně používaných antifůngálních látek či antibiotik a někdy ho dokonce převyšoval.
Předmětem vynálezu jsou peptidy odvozené od přírodního peptidů hylaninu, kterými jsou:
I [-Gly4Íe“Mei“Sťi *3c i Leu-Mct-Lys-Lys-L cu-Lyg-lys-Ile-Ilc-Ala--Ly§ -ΝΗ? (I).
01);, H-GlMle-Lw-Ser’Ser4..<ti4.^4.yx-Ey^Leu4,ys-Lys-I18“Ile-’A1a-Lj's-'Nřl2 (1Π), Ή -67v- & ř-..&r' Zes-Ze M-Zyy Zjsy -Zeiř-Zjw -ZjW/í>Zte vO«'*£ w-N Hi (1V) >
S?i·Se?-! cu Nle-Í.y< í T ť»-T I.v Aki^L·, s NH <Vl í^Sí^-Lcat-Lca-Lys-Lys-Lea-Lyš-LysOleOle-Aia-T^MIa (VI), H-Gly-Jle-M^S^Ser-T^ú-Mst^Lys-Lys-Leu-Lys-Lys-ll^lle-Lys-Lys-Nife (VII), H-Gly-ne-M^-Ser-Ser-Leu-M.st-Lys-LyířLeu-Ah-Aia-HíS-Ile-Lys-í.ys-NHs {VHOS
I- EGly-HčMct-Set~S©t-Lcu-A4i5t-I.yS;-Lys-LeU’Ahí-ÁU4te-fie-LyS“Lys-NIl2 (IX). H“(?)ly-dIe4.ieU’Ly5~Ser~Leu-Leu-Ly<S‘Lys4„ěU“Ly.s-Lys-Ilc-[lo-Ala.-Lys-bn-l2 (X), H-GIy-ne-LeU“Seř“I.;ys;-Iieu4,eu-Lys4íys442:u4.yS'Lys-Ile-Ile-AIa“Lyš“NI-h (Xík ^'“Gl^dk-Leu-SeT-SsT-Leu-Trp-Lys-Lýs-Lcu-Lys-Lys-neOl^Akr-I.ys-NHz (XH):S tfA ř--\ fA p»ť-77p-As-Jea-Ct t í.h Zť-O^-Ln-NH; (ΧΠ1), H-GIy-Ik^Tip-SBr-Ser-Lw-Leu-Ly^Lys-Leu-Lys-LysO.le-ne-Ala-T.ys-NHj (XIV). H-Ciiy41e-Lea-Ser--Ser“'np-Leu.Lys-Ly8-Leu-Lys-LyS“ne-Ua-Ah-LyS”NH2· (XV),
II- GIy4te-'Leu-Svf~8er-Lcu-Leu4..ys-I.yit-Tn>r;ys-Tys-Ils41e-'Ala-Lys-NH:3 (XVI). Η4ί1γ41ε4\βΗ-8ετ-8εΓ-Ιίδ^Τφ“Εγκ·'Εν§.'Ε®ι>1γ&-Εχδ·-Τφ“Πβ-Α13-1.5ί3-ΝΗ^ (XVH)S
II ~<Hy--Ií.e-Leu-Sef-S cr-Lcu-Leu- Lys-I..ys-I -eu-I .ys -1 .ys-Trp-Ile-Ala-Lys-N ifc (XV i U) H-GlyOle-Leu-SfiT-SeT-Ijeu-Tip-Lyií-Lys-Leu^Lys-Lys-lle-ne-.Ala-Zyí-NHs (X1X)S
Předmětem vynálezu jsou také peptidy vzorců I až XIX pro použití k léčení nebo prevenci topických infekcí způsobených patogenními bakteriemi nebo kvasinkami, zvolených ze skupiny, zahrnující obtížně se hojící rány a kožní defekty, infekce sliznic a infekční onemocnění kostí a okolních tkání, včetně těch infekcí, jejichž příčinou je tvorba mikrobiálních biofilmů.
Předmětem vynálezu jsou rovněž peptidy vzorců I až XIX pro použití k prevenci infikace či k odstranění bakteriálního nebo kvasinkového infekčního agens u katétrů, kloubních a kostních náhrad a tmelů a k prevenci bakteriální nebo kvasinkové infikace ortopedických implantátů.
Dalším předmětem vynálezu jsou peptidy vzorců I až XIX pro použití ke zvýšení účinku místně působících antibakteriálních léčiv a krycích materiálů používaných k léčení bakteriálních nebo kvasinkových infekcí.
Předmětem vynálezu jsou také peptidy vzorců I až XIX pro použití k inkorporaci do lokálních nosičů používaných v ortopedii, zvolených ze skupiny, zahrnující fosforečnan vápenatý, síran vápenatý, bioaktivní sklo, apatit-wollastonitové keramické biosklo, hydrogel, kolagen, kostní štěpy, kostní cement nebo syntetické polymery zvolené z polymetylmetakrylátu, kopolymeru metylmetakrylátu a hydroxyetylmetakrylátu, polyanhydridu, polylaktidu, polyglykolidu,
-3CZ 307755 B6 kopolymeru hydroxybutyrátu a hydroxyvalerátu, polyhydroxyalkanoátu, polykaprolaktonu či želatinové houby s glycerolem, nebo z kompozitů složených z polymerů a minerálních nosičů.
Předmětem vynálezu jsou i peptidy vzorců I až XIX pro výrobu léčiva k léčení nebo prevenci topických bakteriálních nebo kvasinkových infekcí zvolených ze skupiny, zahrnující obtížně se hojící rány a kožní defekty, infekce sliznice a infekční onemocnění kostí a okolních tkání.
Předmětem vynálezu je také farmaceutický prostředek k léčení nebo prevenci topických bakteriálních nebo kvasinkových infekcí, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství alespoň jednoho peptidů vzorce I až XIX, případně i druhou aktivní složku, jíž je antibiotikum či antifůngální agens a/nebo dezinfekční činidlo, popřípadě také alespoň jeden farmaceuticky přijatelný krycí materiál, nosič, plnivo a/nebo ředidlo.
Předmětem vynálezu je také výše uvedený farmaceutický prostředek pro použití k léčení nebo prevenci topických bakteriálních nebo kvasinkových infekcí, jejichž příčinou je tvorba mikrobiálních biofilmů.
Předmětem vynálezu je také výše uvedený farmaceutický prostředek pro použití k léčení nebo prevenci topických bakteriálních nebo kvasinkových infekcí zvolených ze skupiny, zahrnující obtížně se hojící rány a kožní defekty, infekce sliznice a infekční onemocnění kostí a okolních tkání, k prevenci infekčních komplikací po implantaci kloubních náhrad a po osteosyntézách a k léčení, vždy včetně komplikací, jejichž příčinou je tvorba mikrobiálních biofilmů.
Předmětem vynálezu je i dezinfekční prostředek vůči bakteriálním a fůngálním patogenům, který obsahuje alespoň jeden peptid vzorce I až XIX.
Předkládaný vynález tedy zahrnuje peptidy konkrétních vzorců I až XIX, použitelné k léčbě infekcí chronických ran, zejména bércových vředů, syndromu diabetické nohy a k léčbě infekcí kostí (osteomyelitidy), přičemž lokální použití antimikrobiálních peptidů zahrnuje i jejich případnou inkorporaci do lokálních nosičů používaných v ortopedii, dále k prevenci či odstraněný infekčního agens z kloubních náhrad a tmelů a k prevenci infekčních pooperačních komplikací, vznikajících po implantaci kloubních náhrad a po osteosyntézách.
Dále mohou být tyto peptidy využity při léčení infekcí vnějšího zvukovodu (otitis extema), zánětu spojivkového vaku (conjunctivitis acuta, conjunctivitis chronica), v gynekologii jako prostředek proti vaginální infekci způsobené kvasinkami, dále při léčení infikovaných ran způsobených popáleninami nebo bojovými zraněními, a to především v případech, kdy tradičně používané antiseptické prostředky či antibiotika vzhledem k mikrobiální rezistenci selhávají. Takové infekce je obtížné léčit, neboť jsou ve většině případů komplikovány výskytem biofilmů, uvnitř kterých jsou mikroorganismy ve srovnání s planktonickými buňkami k antimikrobiálním látkám až tisícinásobně rezistentní.
Výhodné se jeví i použití předkládaných peptidů v sanitárních a dezinfekčních prostředcích.
Význakem vynálezu je i to, že výše zmíněný farmaceutický prostředek je určen k léčení nebo prevenci infekcí, jejichž příčinou je tvorba mikrobiálních biofilmů.
Syntetické peptidy vzorců I až XIX lze volně zahrnout mezi hylaniny, pojmenované podle přírodního peptidů hylaninu. Vhodnou záměnou aminokyselin v jeho sekvenci, jíž byla překvapivě nutná výměna více aminokyselin ve vhodné kombinaci, bylo neočekávaně dosaženo nejen podstatného zvýšení antimikrobiální ho účinku vůči patogenním bakteriím a kvasinkám, ale zároveň i snížení jejich hemolytické aktivity. Předkládané peptidy se tak staly využitelnými i pro aplikace v přítomnosti eukaryontních buněk, což nově umožňuje jejich použití jako aktivní složky humánních či veterinárních léčiv. Sekvence takto získaných analogů a jejich molekulární hmotnosti jsou uvedeny v Tabulce 1. Antimikrobiální aktivity proti sérii bakterií vyjádřené
-4CZ 307755 B6 hodnotami MIC (minimální inhibiční koncentrace), vyplývající z provedených záměn, jsou pak uvedeny v Tabulce 2. Tabulka 2 zároveň udává i hodnoty antifungální aktivity proti kvasince Candida albicans a rovněž i hodnoty hemolytické aktivity. Další hodnoty antifungálních aktivit proti sérii kvasinek rodu Candida jsou uvedeny v Tabulce 3.
Předkládané antimikrobiálně působící peptidy mohou být složkami, zvyšujícími účinek místně působících antibakteriálních léčiv a krycích materiálů používaných k léčení topických infekcí a navržena je i jejich inkorporace do lokálních nosičů používaných v ortopedii.
Další využití nových antimikrobiálních peptidů podle tohoto vynálezu zahrnuje kromě léčení povrchových ran a kožních defektů i léčení infekčních nemocí kostí (osteomyelitid), popřípadě prevenci či eradikaci infekčních komplikací kloubních náhrad a osteosyntéz a také jejich využití v sanitárních a dezinfekčních prostředcích.
Antimikrobiální účinky předkládaných peptidů byly testovány jak na sérii mikroorganismů v planktonické formě, ale i vůči mikrobiálním biofilmům. Účinek peptidů proti mikroorganismům v planktonické formě je dále popsán v příkladech 2 a 4; získané výsledky jsou shrnuty v Tabulkách 2 a 3. Účinky peptidů proti bakteriálním a kvasinkovým biofilmům jsou popsány v příkladech 5 a 6 a získané výsledky shrnuty v Tabulkách 4 a 5.
Vybrané peptidy byly též testovány v kombinaci s antibiotiky pro ověření jejich synergického účinku vůči planktonickým formám P. aeruginosa a S. aureus, což je popsáno v příkladu 7 a výsledek je shrnut v Tabulce 6.
Vybrané peptidy byly dále testovány i v modelech indukované osteomyelitidy, což je popsáno v příkladu 8. Studium antifůngálního působení peptidů je popsáno v příkladu 9 a výsledek těchto pokusuje doložen obrázky 1 A, B.
Objasnění výkresů
Obr. 1 (A) zobrazuje účinek subinhibičních koncentrací oktenidindyhrochloridu (ODDC), peptidů II a VII samotných a kombinací těchto peptidů s ODDC na kvasinky C. glabrata ATCC 2001, změřený pomocí fluorescenční sondy diS-C3(3). Šipka označuje okamžik přidání látek k buněčným suspenzím.
Obr. 1 (B) znázorňuje vliv patnáctiminutového působení ODDC, peptidů II a VII samotných a jejich kombinací na přežívání kvasinek C. glabrata ATCC 2001.
Příklady uskutečnění vynálezu
Seznam zkratek:
Fmoc
MB HA pryskyřice TFA
TIS
HPLC
BHI médium
YPD médium
LB médium
CFU
ODDCq
9-fluorenylmethyloxykarbonyl
4-methylbenzhydrylaminová pryskyřice trifluoroctová kyselina triisopropylsilan vysoce účinná kapalinová chromatografie médium z mozkosrdcové infuze kvasnično-pepton-glukózové médium Luria Bertani médium jednotky tvořící kolonie oktenidindyhrochlorid
-5CZ 307755 B6
Příklad 1
Syntéza sloučenin vzorců (I) až (XIX)
Antimikrobiální peptidy vzorců I až XIX byly syntetizovány metodou syntézy peptidů na pevné fázi (SPPS). Syntéza byla provedena manuálně v 5 ml polypropylenových injekčních stříkačkách s polypropylenovým filtrem na dně stříkačky, za využití protokolu Fmoc-chemie [Fields a Noble, 1990], Jako pevný nosič byla použita Rink Amide MB HA pryskyřice (IRIS Biotech GmBH, Germany) o substituci 0,7 mmol/g.
Tabulka 1. Sekvence analogů odvozených od peptidů hylaninu a jejich molekulové hmotnosti
Sekvence peptidů
McietaiŠámi hwwnst _
Spočtena Nalezená l Gfe'4le-M.et’Ser-S«-Lea>-Met4.5ř$-Lya4*'!u-Lys-l.ys-Ile4ie-Ala*Lys»NH2
Π1 Gly-Ile- Leu- Ser-Scr4.j®j-!. «u-Lys- Ly^eu-Fys-Lys- tle-Ile-A Ěa-Lys-NIT
V Giy-fie-Nií-Ser-Sěr-! j^-NIe-Lys-Lys-Lcu-Lys-Lys-Ue-lle-Ala^ys-Nl·^
VI .ty,s-íte4.^--SšúSef-Leu-L«n4..j-^I.y^T,cu-Lys-l,ys.-IleUe“Ala-Ly®-Nl-Ii νπ 6ί3.'-Πι:-Μ4-§?.τ-&ϋυΒ?η-Μ.®’.ΐ2·Ί5·'ύ}’·κΑεΰ-1.ν«-Ενί-·Πβ-Ιύ·-Β>·ί-ί.^$ι-^Ι;{5
Vlil G^-He-McuSer^crJ.xsu-Me^Lj^-Lys-Leu-Ala-Ala-HisTie-L^Lys-Mfj
IX Gíy-'HS'MšLS«.r’Ser-I.«j-Mí,.-i-T,ys-L.ys>l..Bij-Ala*AIa4ie-tle-Lys-Lys-;NHi
X Giy4!s-Le'íí''Ly8'SeFLBtj-L£:iLlys-l,ys-I.t:u-T!ys-l..ys-Iíe-(le-Ala-Lys-N}L
XI ΟΙ>'-Πί;4Α1-$®·-Ε>'8.-1β0“1«1-Τ3.·8·Ι<ν>ύ««4,χ$-Ε3>·8-Β64!β·Α1ή-Ε^·ΝΈ^
XIi: Gly4te-l^i-Ser-Ser-Lsi>Trp-Ly5-i^s-L®j-Ly>Lys-E6-IlĎ^Ala-Lys-NH2
Xíll
XIV 0h'-f!e-lrp-Ser-Ser4.su-Leu-Ly8-Lys-l..eu4.ys-lys4lfí>I!e-Ala-Í.ys-NÍ-b
XV QWfe-LcM-Ssi^S^Tip-ieB.-Lys-lys-Leu-Ly^Lys-ll&Ile-Ale^ysi-NHs
XVI Gb<4fe-Leu-Se.r-Sci--í.cu-r«i)-Ě,ys4,ys-'Irír-Lys-Lys~U&4Ie-Ák-Lys-NH2
XVH Gfy'4le-Leu*Ser-Sa-Leu-Tq>Ly5-L5řs>-:L«ii-Ly5-L.ys-Tip-^©-AÍa-Ly»-NHa
X'VBI Gly-|}ie4.«i-J5at-Set-Leu-L-ei-LySLys-Lcu4.y!i-t}'8-T!Tp-Hs-A^Lys-Míj
XIX Gtydie-Lcu-Ser-SCT-Leu-Tip-Lys-Ly&.Leii-Lys-Lys-Ik-Ite-.AIarř^-NRi
1787.13
178.7.13
1751,21
1751,21
1751.21
1822,29 ¢844,18
1754,04
1787.13
1792,28 mX28
1824.2 i
1824.21
1824,21,
1824,21
1824,21
1897.20
182421
1824.21
1786.8
1787.1
175 Ϊ, ή
1731.2
1751,6
1822.2
1843.9 (754,ti
1787.2
1'7923
17933
1824.2
1824,2
1824.2
1824.2
Itó4,2 ! 897,2
1824.2
1824,2.
Aminokyseliny, jejichž aminová funkce byla chráněna pomocí Fmoc, byly kondenzovány ve 4násobném molámím přebytku v dimethylformamidu a ke kondensaci byl použit N,N’diisopropylkarbodiimid v přítomnosti 1-hydroxybenzotriazolu. Fmoc-chránicí skupina byla po každém kondenzačním stupni odštěpena roztokem 20% piperidinu v dimethylformamidu. Surové peptidy (I-XIX) byly získány odštěpením z pryskyřice a současnou deprotekcí chránících skupin působením směsi TFA/l,2-ethandithiol/H2O/thioanisol/TIS (90 : 2,5 : 2,5 : 3 : 2) po dobu 3,5 h a
-6CZ 307755 B6 následnou precipitací tert-butyl methyletherem. Pokud peptid neobsahoval methionin, byla ke štěpení použita jednodušší směs TFA/H2O/TIS (95 : 2,5 : 2,5); uvedeny jsou objemové podíly. Tímto postupem bylo získáno 100 až 120 mg surových peptidů. Část tohoto materiálu (30 mg) byla v každém případě přečištěna preparativní HPLC na koloně Vydac C-18 (250 x 10 mm) při průtoku 3,0 ml/min a s využitím gradientu od 5% acetonitril/voda/0,1% TFA do 70% acetonitriFvoda/0,1 % TFA (zde uvedené procentní údaje jsou objemová procenta). Takto bylo získáno 10 až 15 mg HPLC čistých peptidů, jejichž identita byla ověřena hmotnostní spektrometrií, jak udává Tabulka 1.
Příklad 2
Stanovení antimikrobiální aktivity
Gram-positivní bakterie (Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis a Enterococcus faecalis), Gram-negativní bakterie (Escherichia coli a Pseudomonas aeruginosa) a kvasinky (Candida albicans) byly napěstované do exponenciální fáze růstu a naředěny do čerstvého média. BHI médium od firmy Oxoid, Velká Británie, bylo použito pro Enterococcus faecalis; YPD médium obsahující kvasniční extrakt, pepton a glukózu bylo použito pro Candida albicans a LB médium od firmy Sigma, Česká republika, bylo použito pro ostatní mikroorganismy. Poté byly mikroorganismy přidány k roztokům testovaných antimikrobiálních peptidů v LB médiu v inkubačních vícejamkových destičkách připravených dvojnásobným ředěním ze zásobního roztoku (1 mmol.l-1) tak, že finální koncentrace peptidů v jamkách byla v rozmezí od 0,1 do 100 pmol.l-1. Destičky byly vloženy do přístroje Bioscreen C (Oy Growth Curves AB Ltd., Helsinki, Finland), kde byly inkubovány při 37 °C po dobu 20 hodin za stálého třepání. Absorbance při 540 nm byla měřena každých 15 minut. Z takto získaných růstových křivek pro různé koncentrace peptidů byla stanovena antimikrobiální aktivita jako tzv. minimální inhibiční koncentrace (MIC) (viz Tabulka 2). V experimentech bylo použito množství cca 105 CFU bakterií nebo kvasinek na jamku. Jako standard byl použit tetracyklin v koncentraci od 0,1 do 100 pmol.l-1.
Klinické izoláty bakterií byly získány z Fakultní nemocnice v Praze Motole a z Krajské nemocnice v Liberci. Methicilin rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA) 6271 a Pseudomonas aeruginosa 5482 byly získány ze Státního zdravotního ústavu v Praze, ostatní bakterie z České sbírky mikroorganismů Masarykovy university v Brně a Candida albicans z Lékařské fakulty Palackého university v Olomouci.
Příklad 3
Stanovení hemolytické aktivity
Peptidy v koncentraci 2- 400 pmol.l-1 byly inkubovány s 5% (obj./obj.) suspenzí lidských červených krvinek v 0,2 ml fyziologického roztoku po dobu 1 hodiny při 37 °C. Poté byly vzorky odstřeďovány 5 minut při 250 g. Absorbance supematantu byla stanovena při 540 nm. Jako kontrola pro 100% hernolýzu byl místo peptidů použit 0,2% (obj./obj.) roztok Tritonu ΧΙ00. Výsledky testování jsou uvedeny v Tabulce 2. Hemolytická aktivita je vyjádřena jako koncentrace peptidů způsobující 50% rozpad červených krvinek (hodnoty LC50).
-7 CZ 307755 B6 .? Áíifi-píkiobUJíH % ak?KiB· pvpíjJú Í'í’i ííž i.XLX) a tetr,&;yMiftží.
}/',’f tfMA' % '», Pax&w '^ň>,íl·,. '> <<, ‘Vcptá. awifjm S.v , ,v<v νί'Α<ί'^<»&' ::.í, 7<W<í.>fíW t<v/mhr·,· l· <, hťítmtbiaxcÁf,
C.í; , < AÁi· XÍ>i;^:iv·, . M ®ŠHSá;
Příklad 4
Stanovení antifůngální aktivity vůči vybrané sérii kvasinek
Kvasinky Candida albicans (Olomouc) a ATCC MYA-2876, Candida glabrata ATCC 2001 a DSY 565, Candida dubliniensis ATCC MYA-646, Candida krusei ATCC 6258 a Candida tropicalis ATCC 750 byly sterilně rozčárkovány ze zásobní kultury na Sabouradův agar, složený z 40 g glukózy (Penta, CZ), 10 g peptonu (OXOID, UK) a 17 g agaru (OXOID, UK), rozpuštěných vil destilované vody a kultivovány 24 h od při 35 °C.
Zásobní kultury kvasinek jsou kryogenicky uchovávány při teplotě -80 °C ve směsi tvořené 50 % glycerolem a kulturou kvasinek narostlých v YPD médiu, složeném z 10 g kvasničného extraktu (DIFCO, USA), 20 g peptonu (OXOID, UK) a 20 g glukózy (Penta, CZ), rozpuštěných v 1 1 destilované vody v poměru 1:1.
Pět dobře definovaných kolonií každé kvasinky bylo sterilní očkovací kličkou přeneseno do 1 ml sterilního fýziologického roztoku. Následně byla optická denzita upravena na hodnotu 0,18 při 600 nm. Kultura o požadované denzitě byla následně ředěna 1:100 do RPMI média s Lglutaminem bez NaHCCh (BioSera, FR), s 0,165 mol.F1 MOPS (Duchefa, NL) - dále jen RPMI médium. Inokulum kvasinek bylo připraveno ředěním 1:20 do RPMI média.
Do 96 jamkových destiček byly dvojkovým ředěním v RPMI médiu připraveny antimikrobiální peptidy v koncentracích 0,625 až 160 pmol.l-1. K antimikrobiálním peptidům o požadované koncentraci bylo následně přidáno inokulum v poměru 1:1. Finální koncentrace kvasinek v testovaných jamkách odpovídala hodnotám 5xl02 až 2,5xl03 CFU/ml. Destičky byly inkubovány staticky při teplotě 35 °C po dobu 48 h.
Jako negativní kontrola sloužily neinokulované jamky; jako pozitivní kontrola sloužily jamky, k nimž nebyl přidán antimikrobiální peptid; a jako kontrola kvality sloužily jamky, k nimž byl přidán amfotericin B namísto antimikrobiálního peptidu.
Následně byly destičky vizuálně vyhodnoceny a jako minimální inhibiční koncentrace (MIC) byly označeny jamky, ve kterých nebyl pozorován žádný nárůst kvasinek.
Všechny kvasinkové izoláty byly získány z Fyziologického ústavu AV ČR. Izolát Candida albicans (Olomouc) byl z Lékařské fakulty Palackého university v Olomouci.
-9CZ 307755 B6
Tabulka 3. Antifungální aktivita peptidů (I) až (XWIII) a antifůngálních látek
| Ote® | V*. ΐ V | C. fcwt | C. A TO 50 | ATft ΜΥ.Λť,4« | ATí.í.’ 2WI | ? J*“ ϊή'· | |
| I | l! (.> | α» | w | 4a íj | 883* | ||
| n | ΐΜ | Ě 5.5 | Jjs | 34.1! | 1,5.5 | 32,3 | |
| HO | 1X0 | xo | 0.8 | M0 | 44,0 | ||
| 1 | ID> | 4.5 | a 6 | ÍO.ií | 20.8 | ||
| TO | V» | 56 | w | 44.0 | |||
| ¥1 | TO | M0 | 4,8 | 05 | LL | 23.0 | n,l |
| to | M | w | 40.0 | W | |||
| Všit | TO | to | M | to | |||
| IX | TO | w | TO | í.l | 4^13· | w | 44,4 |
| X | ÍO.X | 1,Í.> | TO | 34,0 | 7M | ||
| TO | W | s.o | i,c | TO | L O | 4O..0 | |
| ΧΠ | o | ILS | 4,3 | 1.0 | 0,3 | TO | 2H) |
| XIU | to | TO | L<? | M | 6,5 | &( | B.O |
| MV | TO | 5,2 | u | TO | |||
| XV | TO | PQ | O | L? | 40.0 | ŠŠ.Ó | |
| XVI | Utř | TO | TO | 40 | w | 23 U | |
| XVfT | 45 | 55 | 3,3 | O.F | 5,0 SA | i 1.ÍJ | |
| XVB1 | O | TO | y | 1,3 | TO | 8.5 | ........ |
| MmuI | 4 Ů | 5156 | .OTO | 450 | |||
| Cfcíršssas®): | 0,3 | LI | 4.6 | 1.4 | 14,2 | TO |
Příklad 5
Stanovení antimikrobiální aktivity na modelových bakteriálních biofilmech
Inokulum S. aureus (Liberec) nebo P. aeruginosa (Liberec) napěstované přes noc v BHI médiu bylo naředěno do čerstvého BHI média s přídavkem 1% glukózy na koncentraci cca 108 CFU/ml, rozděleno po 100 μΐ do 96-jamkové polystyrénové destičky a rotačně mícháno (300 otáček/min) při 37 °C po dobu 24 h. Médium v jamkách bez baktérií sloužilo jako negativní kontrola (blank). Z každé jamky byl následně odsát supematant a narostlý biofilm na dně a stěnách jamek byl 3x opatrně promyt 300 μΐ sterilního fyziologického roztoku. Peptidy byly testovány v koncentracích 1 až 128 pmol.l-1, které byly připraveny dvojnásobným ředěním zásobních roztoků (1 mmol.l-1) v čerstvém BHI médiu a naneseny po 100 μΐ do jednotlivých jamek na vytvořené biofilmy. Následovala inkubace za podmínek popsaných výše po dobu 20 hodin. Samotné BHI médium navrstvené na biofilm bylo použito jako kontrola. Poté byly obsahy jamek odsáty a 2x promyty sterilním fýziologickým roztokem.
Pro stanovení metabolické aktivity biofilmu (stanovení množství životaschopných bakterií) bylo použito barvení pomocí MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazolium bromid). Destičky byly inkubovány se 100 μΐ BHI média a 10 μΐ MTT (5 mg/ml) na jamku po dobu 40 min při 37 °C. Poté bylo médium s MTT odsáto a vzniklé formazanové krystaly
- 10CZ 307755 B6 vytvořené redukcí MTT uvnitř biofilmu byly rozpuštěny přidáním 100 μΐ DMSO a intenzita zabarvení v jednotlivých jamkách byla odečtena jako absorbance při 540 nm na přístroji Tecan infinite M200 PRO reader (Tecan Austria GmbH). Zbytková metabolická aktivita přeživších buněk uvnitř biofilmu byla pro každou jamku vyjádřena v % podle vztahu:
% =*100.
< “ Λ/.
kde A je absorbance v případě testované látky, Abl je absorbance negativní kontroly a Ak je absorbance kontrolního biofilmu. Hodnoty zbytkové metabolické aktivity jsou uvedeny v ío Tabulce 4.
- 11 CZ 307755 B6
Tábuta 4. Učbisk vyhraných m batariálm Wtay troferó Siaitytoffim awč&g % .PmKŽwaK® (Vyjádřené· í^ydíwou ffistíjelíekím aktiviw iníkřobiáfeííeh tmažk v (%) při; dmé taieewtó peptída ( Eíetemvfe»).
12CZ 307755 B6
Příklad 6
Stanovení antimikrobiální aktivity na modelových biofilmech kvasinek C. albicans
Kvasinka Candida albicans (Olomouc) byla předpěstována přes noc v YPD médiu [10 g kvasničný extrakt (DIFCO, USA), 20 g pepton (OXOID, UK), 20 g glukóza (Penta, CZ) rozpuštěné vil destilované vody] za stálého třepání (100 otáček/minutu) při 37 °C. Druhý den ráno byla kultura naředěna v poměru 1:100 do nového YPD média a kultivována za stálého třepání (200 otáček/minutu) při 37 °C do té doby, než bylo dosaženo střední oblasti exponenciální fáze růstu. Následně byla kultura odstřeďována (5000 otáček/minutu) po dobu 5 min a následně dvakrát promyta fyziologickým roztokem [9 g/1 NaCl (Penta, CZ)]. Kvasinky byly suspendovány ve fyziologickém roztoku a byla změřena optická denzita této suspenze při 600 nm.
Kvasinkové inokulum bylo připraveno tak, aby optická denzita buněk odpovídala hodnotě 0,17 (cca 106 CFU/ml) v RPMI s L-glutaminem (BioSera, FR), NaHCCF (2 g/1; Penta, CZ) a 0,165 mol.F1 MOPS (Duchefa, NL) - dále jen RPMI médium 1. Inokulum bylo následně naneseno do 96-jamkových destiček (TPP, SW) a staticky inkubováno při 37 °C po dobu 2 hodin. Následně byly jamky sterilně dvakrát promyty dvojnásobným objemem PBS pufru (1,44 g Na2HP04, 0,24 g KH2PO4, 0,2 g KC1 a 8 g NaCl v 1 1 destilované vody, pH = 7; Penta, CZ). Do jamek bylo následně přidáno čerstvé RPMI médium 1 a destičky byly přikryty víčkem a utěsněny parafilmem a inkubovány staticky po dobu 48 h a teplotě 37 °C.
Vytvořený biofilm byl poté sterilně třikrát promyt dvojnásobným objemem PBS pufru. Do jamek bylo následně pipetováno RPMI médium 1 a testovaný antimikrobiální peptid. Antimikrobiální peptid byl dvojkově ředěn přímo v destičce s vytvořeným biofilmem. Testované koncentrace peptidů jsou v rozmezí 0,39 až 200 pmol.F1. Destičky byly opět přikryty víčkem a utěsněny parafilmem a staticky inkubovány po dobu 20 hodin při teplotě 37 °C.
U ovlivňovaného biofilmů byla následně stanovena zbytková metabolická aktivita (stanovení metabolicky aktivních kvasinek) pomocí XTT testu. Zásobní roztok PMS (fenazin methosulfát; 7,5 g/1; SIGMA, CZ) skladovaný při -20 °C byl naředěn 1:100 do PBS pufru. Naředěné PMS bylo smícháno v poměru 2:25 s XTT [XTT (2,3-ňri-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-2Htetrazolium-5-karboxanilid; 0,5 g/1; Alchimica, SK)], rozpuštěným v PBS pufru a RPMI médiu 1 v poměru 1:1. K biofilmů byl přidán shodný objem směsi XTT/PMS a směs byla inkubována staticky po dobu 90 min při 37 °C. Následně byla změřena intenzita vzniklého zbarvení při 540 nm na přístroji Tecan infinite M200 PRO reader (Tecan, AU). Metabolická aktivita byla vyjádřena v procentech kontrolního biofilmů podle vztahu:
kde A je absorbance v případě testované látky, ABL je absorbance negativní kontroly a Ak je absorbance kontrolního biofilmů.
Jako negativní kontrola sloužily neinokulované jamky; jako pozitivní kontrola sloužily jamky, k nimž nebyl přidán antimikrobiální peptid; a jako kontrola kvality sloužily jamky, k nimž byl přidán amfotericin B namísto antimikrobiálního peptidů. Hodnoty zbytkové metabolické aktivity kvasinek jsou uvedeny v Tabulce 5.
Tabulka 5. Účinek vybraných peptidů na bakteriální biofilmy tvořené Candida albicans (Olomouc) vyjádřené zbytkovou metabolickou aktivitou mikrobiálních buněk v (%) při dané koncentraci peptidů.
- 13 CZ 307755 B6
| Mmfeohcká aktivita C. itaiv | ||||||
| Pepdd | Koncentrace peptidů | |||||
| 6,25 μηιρΙ,Γ* | 1X5 pinuLF1 | 25 pmol J' | 50 pmoll'1 | 100 j.und.11 | 200 jimoLí’ | |
| 1 | 100,4 | 108,0 | 1M7 | 57,5 | 28,2 | 8,1 |
| 11 | 105,3 | 114,2 | 35,2 | 1,0 | ořo | 0,0 |
| lil | 104,7 | 1.13,6 | 87,2 | 31,1 | 28,4 | 0,0 |
| IV | 106,9 | 37/2. | 6,0 | 2J | 2,1 | 0,5 |
| v | 106,4 | 89,5 | 45,0 | 6,9 | 2,4 | 0,4 |
| VI | 98J | nu | 110,5 | :28,3 | 0,4 | 0,0 |
| vn. ....... | 104J | 116,0 | 120,7 | 31.5 | 22,0 | 0,0 |
| vin | 99f4 | 99,1 | 105,6 | 112,2 | 106,8 | 53,0 |
| IX | 93,2 | 54,3 | 2,3 | 1.5 | 1,3 | OJ: |
| X | 100,8 | 109,3 | 65,3 | 16,8 | 7,0 | 3,3 |
| XI | 97,7 | 70,3 | 79,3 | 32,8 | 7,6 | 6,1 |
| XII | 86,8 | 80,3 | 94,8 | 63,6 | 6.2 | 3,2 |
| ΧΤΠ | 78,3 | 50 | 37,2 | TO,9 | 5,8 | 43 |
| xtv : | 84,6 | W | 91,1 | 14,2 | 7S4 | 4,2 |
| XV | 92,8 | 73.8 | 65,2 | 9,4 | 3,4 | |
| XVI | 97,3 | W3 J | 68,5 | 68,1 | 44,9 | 11,4 |
| XVII | 2,4 | 0,9 | 1,3 | 2,3 | i.5 | |
| xvni | .11,5 | 2J | 3,2 | 3.2 | 3J | 2,6 |
| FlůkOMzdl | 33,5 | 30,8 | 31,7 | 30,7 | 32..4 | 29,2 |
| Clotrimazol | 39,7 | 37,6 | 34.2 | 2X4 | 21J | 2X2 |
Příklad 7
Synergismus účinku peptidů s běžně užívanými antibiotiky proti S. aureus a P. aeruginosa
Pro stanovení hodnot MIC pro různé kombinace dvojnásobných ředění peptidů a antibiotik, přípravu inokula a kultivaci byla použita shodná metodika jako v případě stanovení antimikrobiální aktivity (Příklad 2). Pro určení výsledného efektu bylo použito výpočtu tzv. FIC ío (trakční inhibiční koncentrace) indexu podle vztahu:
MIC. MIC. ' •f .At kde MICpc a MIC ac jsou MIC peptidů a antibiotika v kombinaci, v tomto pořadí, a MICp a MICa 15 jsou MIC samotného peptidů a samotného antibiotika, v tomto pořadí. Hodnoty FIC<0,5 byly považovány za synergismus, 0,5 < FIC < 2 za aditivní efekt a hodnoty FIC>2 za antagonismus. Příklady synergických účinků kombinací vybraný peptidů s tetracyklinem (TET) a rifampicinem
- 14CZ 307755 B6 (RIF) vůči P. aeruginosa (Liberec) a s amoxicilinem (AMX) vůči S. aureus (Liberec) uvádí Tabulka 6.
Tabulka 6. FIC indexy kombinací vybraných peptidů s antibiotiky oproti S. aureus (Liberec) a P. aeruginosa (Liberec).
| Peptid | FIC (frakčni inhibiáii koncentrace) indexy | kombinace s AMX proti ý asrews | |
| kombinace s ΊΤΤ prf | tti kntnbirwc s RIF proti P, oer&g&mKi | ||
| Y 1. | 0,646 | 0,427 | 0333 |
| 11 | 0,667 | 0323 | |
| m | 0,542 | 03«5 | 0,688 |
| IV | 0,750 | 0302 | řLL |
| VI | 0,708 | 0,260 | 0392 |
| VH | Ó.W5 | &36S | 0,167 |
| Dt | 0,542 | 0,417 | n.L |
| X | 0321 | 0333 | 0,542 |
| XI | 0,646 | 0344 | 0.333 |
| Xil | 0,646 | 0,438 | n.t. |
| ΧΠΙ | 0,583 | 0,292 | |
| XIV | I.M54 | 0371 | 0396 |
| XV | 0,646 | 0396 | 0375 |
| XVI | 0,583 | 03Π | rsx |
| xvn | IW | 0,292 | &,L |
| XVdi | 0,625 | 9371 | 11.L |
n.t. - netestováno; FIC<0,5 = synergismus, 0,5 < FIC < 2 = aditivní efekt, FIC>2 = antagonismus. Uvedené hodnoty jsou průměry z minimálně tří nezávislých experimentů.
Příklad 8
Působení peptidů XII a XIII na infikované ložisko v kosti v modelu indukované osteomyelitidy
Do dvou rozmražených hlavic kostí stehenních byly za sterilních podmínek vytvořeny chirurgickou lžičkou 3 návrty do spongiózní části kosti (v místě resekce) o průměru cca 5 mm a hloubky do 10 mm. Takto připravené kostní štěpy byly vloženy do kádinek a obloženy sterilními čtverci gázy, která byla navlhčena sterilním fyziologickým roztokem, aby nedocházelo k vysychání kostí. Poté byla do připravených otvorů v jednom kostním štěpu postupně aplikována suspenze namnožených bakterií S. aureus (Motol) v LB médiu (50 až 100 μΐ) o koncentraci v řádu 109 CFU/ml, a do druhého ve stejném objemu suspenze bakterií S. epidermidis (109 CFU/ml). Kádinky byly překryty sterilní Petriho miskou a kosti inkubovány po dobu 24 hodin. V průběhu experimentu byly tyto modely indukované osteomyelitidy ponechány bez přístupu světla při teplotě místnosti.
Po proběhlé inkubaci byl pro kontrolu infikace odebrán stěr z jednoho z otvorů z každé kosti pomocí sterilní navlhčené vatičky. Vatička byla vyextrahována 400 μΐ fyziologickým roztokem, provedlo se ředění extraktu v desítkové řadě, a jednotlivě naředěné suspenze byly kultivovány na
- 15 CZ 307755 B6
LB agaru v Petriho miskách. Následný den se vyhodnotil bakteriální nárůst na Petriho miskách. Další infikovaný otvor v kosti byl vyplněn směsí lokálního nosiče a směsí peptidů vzorců XII a XIII. Zbývající třetí otvor byl pro srovnání vyplněn lokálním nosičem bez peptidů. Jako nosič byl použit komerčně dostupný dvousložkový materiál dodávaný firmou Synthes pod názvem ChronOS Inject. Jeho pevná složka obsahuje fosforečnan vápenatý a aditiva, kapalnou složkou je 0,5% (obj./obj.) roztok kyseliny hyaluronové. Pro přípravu pasty pro vyplnění otvorů bylo použito 200 mg pevné složky nosiče, do něhož bylo vmícháno 8 mg peptidů XII a 4 mg peptidů XIII a poté se do této směsi vmíchala kapalná složka v množství 70 μΐ a vše bylo důkladně promícháno (pasta bez peptidů pro srovnávací experiment byla připravena stejným postupem).
Po dvou dnech byly výplně pomocí chirurgické lžičky pečlivě odstraněny a prázdné otvory vytřeny sterilní navlhčenou vatičkou, která byla extrahována do 400 μΐ fyziologického roztoku. Ten byl následně ředěn za použití desítkové řady pro kultivaci na agaru.
Výsledek pokusů byl vyhodnocen porovnáním počtu bakteriálních kolonií (CFU/ml) ze stěru z infikovaného otvoru, v nichž působily peptidy XII a XIII uvolněné z nosiče, oproti počtu kolonií ze stěru z infikovaného otvoru, který byl vyplněn pouze nosičem bez peptidů. V případě kostního štěpu infikovaného S. aureus (Motol) byl v otvoru po působení peptidů CFU/ml =1,7 x 103 zatímco v otvoru vyplněným pouze nosičem byl CFU/ml =7,2 x ΙΟ7. V případě druhého kostního štěpu infikovaného S. epidermidis byly tyto hodnoty pro otvor s peptidy 1 x 102 CFU/ml a pro otvor bez peptidů 3,7 x 107 CFU/ml.
Použité hlavice kostí stehenních byly po deaktivaci infekce v autoklávu likvidovány jako biologický odpad na patologii Fakultní nemocnice Motol.
Příklad 9
Stanovení antifůngálního účinku peptidů v kombinaci s běžně používaným biocidem ODDC vůči kvasinkám Candida glabrata
Kvasinky C. glabrata ATCC 2001 byly aerobně kultivovány přes noc při 30°C v YPD médiu (Formedium). Do čerstvého YPD média bylo přidáno takové množství inokula, aby výsledná koncentrace buněk byla 5.106 CFU/ml (odpovídající hodnota ODďoo = 0,2). Kvasinky byly dále kultivovány po dobu 4 až 5 h při 30 °C (190 otáček/min), čímž byly získány buňky v rané exponenciální fázi růstu. Kvasinkové buňky byly dvakrát promyty destilovanou vodou (1,5 min, 3000 g) a resuspendovány v MES-TEA pufru (10 mmol.F1 4-morfolinethansulfonová kyselina, pH = 6,0 upravené trietanolaminem; Sigma) na ODďoo = 0,2.
a) Stanovení okamžitého účinku peptidů na buňky kvasinek pomocí fluorescenční sondy diS-C<(fl
Fluorescenční sonda diS-C3(3) (3,3-dipropylthiokarbocyanin jodid; Sigma) byla přidána k buněčným suspenzím (3 ml) v konečné koncentraci 4.10 8 mol.F1. Emisní spektra byla měřena v plastových kyvetách (Kartell) na spektrofluorimetru ISS PCL Fluorescence byla registrována v oblasti Zem = 560 až 590 nm při excitační vlnové délce Zex = 531 nm. Rozptýlené záření bylo eliminováno oranžovým skleněným filtrem s mezní vlnovou délkou 540 nm. Antimikrobiální peptidy a ODDC (Oktenidin(di)hydrochlorid; Schůlke & Mayr) byly přidány ke kvasinkovým suspenzím 10 až 20 minut po fluorescenční sondě. Optimalizace této fluorescenční metody, umožňující měření velkého množství vzorků současně v 96 jamkových destičkách, bude brzy publikována.
Rychlost a rozsah nahromadění sondy uvnitř buněk, tzv. barvicí křivka, popisuje závislost vlnové délky fluorescenčního emisního maxima Zmax nebo intenzity Imax na čase od přidání fluorescenční sondy k buněčné suspenzi [Gášková a spol., 1998],
Účinek testovaných látek byl stanoven na základě porovnání barvicích křivek kontrolních buněk, k nimž nebyla přidána žádná látka, a buněk ovlivněných danou látkou (peptidem či ODDC), viz obr. 1A. Zvýšené barvení buněk vystavených účinku látky vypovídalo o jejich větším poškození, a to ve velmi krátké době.
- 16CZ 307755 B6
b) Stanoveni letálniho účinku peptidů na buňky kvasinek pomoci výsevového testu
Kvasinky z exponenciální fáze růstu byly dvakrát sterilně promyty destilovanou vodou (1,5 min, 3000 g) a naředěny MES-TEA pufrem na ODďoo = 0,2. Poté byla buněčná suspenze rozdělena po 1 ml do mikrozkumavek typu Eppendorf. Jeden vzorek sloužil jako kontrola, do ostatních vzorků byly přidány zkoumané látky (peptidy, ODDC) o zvolených koncentracích. Buňky byly za občasného míchání inkubovány s danými látkami 15 min, následně byly vzorky stokrát naředěny v destilované vodě a 15 μΐ těchto buněčných suspenzí bylo rozetřeno na Petriho misky (průměr 9 cm) s 2 % YPD agarem (Formedium). Vzorky byly vysévány vždy na tři misky. Po 24 h kultivace při 30 °C byl stanoven počet kolonií. Poměr počtu přeživších buněk vystavených účinku testované látky v porovnání s kontrolním vzorkem (CFU) vyjádřený v % vypovídal o letálním účinku zkoumané látky na buňky (neschopnost tvořit kolonie). Výsledek výsevového testu, který je zobrazen na obr. 1B, dokazuje vysoký antifůngální účinek peptidů II, jenž je dále zesílený v kombinaci s látkou ODDC.
Průmyslová využitelnost
Praktické použití antimikrobiálních peptidů odvozených od hylaninu bude výhodné především pro léčbu povrchových infekcí, a to jak bakteriálních, tak i kvasinkových. Jejich uplatnění se předpokládá například v pediatrii pro léčbu ran, jakými je syndrom diabetické nohy a/nebo bércové vředy, v ortopedii pro léčbu osteomyelitidy (infekčního onemocnění kostí), kde lokální použití antimikrobiálních peptidů zahrnuje i jejich inkorporaci do lokálních nosičů používaných v ortopedii a prevenci infekce ortopedických implantátů způsobené bakteriálními biofilmy. Dále mohou být tyto peptidy využity v gynekologii jako prostředek proti vaginální infekci způsobené kvasinkami, při léčení infekcí vnějšího zvukovodu (otitis extema), zánětu spojivkového vaku (conjunctivitis acuta, conjunctivitis chronica), dále pak pro léčení chronických infikovaných ran způsobených popáleninami nebo bojovými zraněními, a to především v případech, kdy tradičně používané antiseptické prostředky či antibiotika vzhledem k mikrobiální rezistenci selhávají. Tyto infekce je obtížné léčit, neboť jsou ve většině případů komplikovány výskytem biofilmů, uvnitř něhož jsou mikroorganismy v porovnání s planktonickými bakteriemi i kvasinkami až tisícinásobně rezistentní k antimikrobiálním látkám.
Citovaná literatura
1. Rulík M., Holá V., Růžička F., Votava M. a kolektiv: Mikrobiální biofilmy. Univerzita Palackého v Olomouci, Přírodovědecká fakulta, Olomouc 2011
2. Bjarnsholt T.: The role of bacterial biofilms in chronic infections.APMIS 121: 1-51 (2013)
3. Bjarnsholt T., Alhede M., Alhede M., Eickhardt-Sorensen S.R., Moser C, Kiihl M., Jensen P. 0., Hoiby N.: The in vivo biofilm. Trends Microb. 21: 466—474 (2013)
4. Zasloff M.: Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nátuře 415, 389-395 (2002)
5. Hancock R.E.W., Sáhl H.-G.: Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nátur. Bitech. 24, 1551-1557 (2006)
6. Toke O.: Antimicrobial peptides: New candidates in the fight against bacterial infection. Biopolymers (Peptide Science) 80, 717-735 (2005)
7. Giuliani A., Pirri G., Nicoletto S.F.: Antimicrobial peptides: An overview of a promising class of therapeutics. Centr. Eur. J. Biol. 2, 1-33 (2007)
8. Zaiou M.: Multifunctional antimicrobial peptides: therapeutic targets in several human diseases. J. Mol. Med. 85, 317-329 (2007)
9. Oyston P.C.F, Fox M.A., Richards S.J., Clark G.C.: Novel peptide therapeutics for treatment of infections. J. Med. Microb. 58, 977-987 (2009)
10. Baltzer S.A, Brown M.H.: Antimicrobial peptides - promising alternatives to conventional antibiotics. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 20, 228-235 (2011)
- 17 CZ 307755 B6
11. Yeung A.T.Y., Gellatly S.L., Hancock R.E.W.: Multifunctional cationic host defence peptides and their clinical applications. Cell. Mol. Life. Sci. 68, 2161-2176 (2011)
12. Čeřovský V.: Antimikrobiální peptidy izolované z hmyzu. Chem. Listy 108, 344-353 (2014)
13. Otvos L. Jr.: Antimicrobial peptides isolated from insects. J. Peptide Sci. 6, 497-511 (2000)
14. Oren Z., Shai Y.: Mode of action of linear amphipathic a-helical antimicrobial peptides. Biopolymers 47, 451-463 (1998)
15. Yeaman M.R., Yount N.Y.: Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance. Pharm. Rev. 55, 27-55 (2003)
16. Nguyen L.T., Haney E.F., Vogel H.J.: The expanding scope of antimicrobial peptide structures and their modes of action. Trends Biotech. 29,464-471 (2011)
17. Kuhn-Nentwig L.: Antimicrobial and cytolytic peptides of venomous arthropods. Cell. Mol. Life Sci. 60, 2651-2668 (2003)
18. Čeřovský V., Slaninová J., Fučík V., Hulačová H., Borovičková L., Ježek R., Bednářová L.: New potent antimicrobial peptides from the venom of Polistinae wasps and their analogs. Peptides 29, 992-1003 (2008)
19. Fields G.B, Noble R.L.: Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acid. Int. J. Pept. Protein Res. 35,161-214 (1990)
20. Gášková D., Brodská B., Heřman P., Večeř J., Malínský J., Sigler K., Benada O., Plášek J.: Fluorescent probing of membráně potential in walled cells: diS-C3(3) assay in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 14, 1189-1197 (1998)
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (10)
1. Antimikrobiální peptidy odvozené od přírodního peptidů hylaninu, kterými jsou:
- 18 CZ 307755 B6 .O (ΪΧ), (Xj.
(XI), přičemž kurzívou jsou vyznačeny aminokyseliny v konfiguraci D.
2. Peptidy vzorců I až XIX podle nároku 1, pro použití k léčení nebo prevenci topických infekcí způsobených patogenními bakteriemi nebo kvasinkami, zvolených ze skupiny, zahrnující obtížně se hojící rány a kožní defekty, infekce sliznic a infekční onemocnění kostí a okolních tkání, včetně těch infekcí, jejichž příčinou je tvorba mikrobiálních biofilmů.
3. Peptidy vzorců I až XIX podle nároku 1, pro použití k prevenci infikace či k odstranění bakteriálního nebo kvasinkového infekčního agens u katétrů, kloubních a kostních náhrad a tmelů a k prevenci bakteriální nebo kvasinkové infikace ortopedických implantátů.
4. Peptidy vzorců I až XIX podle nároku 1, pro použití ke zvýšení účinku místně působících antibakteriálních léčiv a krycích materiálů používaných k léčení topických bakteriálních nebo kvasinkových infekcí.
5. Peptidy vzorců I až XIX podle nároku 1, pro použití k inkorporaci do lokálních nosičů používaných v ortopedii, zvolených ze skupiny, zahrnující fosforečnan vápenatý, síran vápenatý, bioaktivní sklo, apatit-wollastonitové keramické biosklo, hydrogel, kolagen, kostní štěpy, kostní cement nebo syntetické polymery zvolené z polymetylmetakrylátu, kopolymeru metylmetakrylátu a hydroxyetylmetakrylátu, polyanhydridu, polylaktidu, polyglykolidu, kopolymeru hydroxybutyrátu a hydroxyvalerátu, polyhydroxyalkanoátu, polykaprolaktonu či želatinové houby s glycerolem, nebo z kompozitu složených z polymerů a minerálních nosičů.
- 19CZ 307755 B6
6. Peptidy vzorců I až XIX podle nároku 1, pro použití k výrobě léčiva k léčení nebo prevenci topických bakteriálních nebo kvasinkových infekcí zvolených ze skupiny, zahrnující obtížně se hojící rány a kožní defekty, infekce sliznice a infekční onemocnění kostí a okolních tkání.
7. Farmaceutický prostředek k léčení nebo prevenci topických bakteriálních nebo kvasinkových infekcí, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství alespoň jednoho peptidů vzorce I až XIX podle nároku 1, a případně i druhou aktivní složku, jíž je antibiotikum či antifungální agens a/nebo dezinfekční činidlo, popřípadě také alespoň jeden farmaceuticky přijatelný krycí materiál, nosič, plnivo a/nebo ředidlo.
8. Farmaceutický prostředek podle nároku 7 pro použití k léčení nebo prevenci k léčení nebo prevenci topických bakteriálních nebo kvasinkových infekcí, jejichž příčinou je tvorba mikrobiálních biofilmů.
9. Farmaceutický prostředek podle nároku 7, pro použití k léčení nebo prevenci topických bakteriálních nebo kvasinkových infekcí zvolených ze skupiny, zahrnující obtížně se hojící rány a kožní defekty, infekce sliznice a infekční onemocnění kostí a okolních tkání, a k prevenci infekčních komplikací po implantaci kloubních náhrad a po osteosyntézách, včetně těch infekcí, jejichž příčinou je tvorba mikrobiálních biofilmů.
10. Dezinfekční prostředek vůči bakteriálním a fůngálním patogenům, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden peptid vzorce I až XDC podle nároku 1.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-244A CZ307755B6 (cs) | 2015-04-10 | 2015-04-10 | Antimikrobiální peptidy a jejich použití pro léčbu topických infekcí |
| PCT/CZ2016/050009 WO2016161997A1 (en) | 2015-04-10 | 2016-04-08 | Antimicrobial peptides and their use for the treatment of topical infections |
| EP16721001.2A EP3280722B8 (en) | 2015-04-10 | 2016-04-08 | Antimicrobial peptides and their use for the treatment of topical infections |
| US15/564,035 US10160785B2 (en) | 2015-04-10 | 2016-04-08 | Antimicrobial peptides and their use for the treatment of topical infections |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-244A CZ307755B6 (cs) | 2015-04-10 | 2015-04-10 | Antimikrobiální peptidy a jejich použití pro léčbu topických infekcí |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2015244A3 CZ2015244A3 (cs) | 2016-11-09 |
| CZ307755B6 true CZ307755B6 (cs) | 2019-04-17 |
Family
ID=66096740
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2015-244A CZ307755B6 (cs) | 2015-04-10 | 2015-04-10 | Antimikrobiální peptidy a jejich použití pro léčbu topických infekcí |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10160785B2 (cs) |
| EP (1) | EP3280722B8 (cs) |
| CZ (1) | CZ307755B6 (cs) |
| WO (1) | WO2016161997A1 (cs) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017134661A1 (en) * | 2016-02-04 | 2017-08-10 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Methods for disrupting biofilms |
| WO2018160577A1 (en) * | 2017-03-02 | 2018-09-07 | The United States of America as reprsented by the Secretary of the Navy | Methods of treating fungal infections |
| US11524051B2 (en) | 2017-03-02 | 2022-12-13 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Methods of treating fungal infections |
| CN107583095A (zh) * | 2017-08-08 | 2018-01-16 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 抗菌型骨折固定石膏绷带的制作方法及其产品和应用 |
| US11090412B2 (en) | 2018-12-21 | 2021-08-17 | Zavation Medical Products Llc | Bone repair composition and kit |
| CN111228223B (zh) * | 2020-03-06 | 2021-06-18 | 同济大学 | 一种促进伤口愈合的聚合物囊泡及其制备方法和应用 |
| CN112263708B (zh) * | 2020-11-02 | 2021-09-28 | 上海交通大学 | 一种促进创面愈合的多功能气凝胶敷料及其制备方法 |
| CN114181279B (zh) * | 2020-12-30 | 2024-04-16 | 广州图微科创生物科技有限公司 | 抗菌多肽化合物、医疗器械、水凝胶及其应用 |
| CN115869459B (zh) * | 2021-09-27 | 2024-06-21 | 广州图微科创生物科技有限公司 | 促伤口愈合的多肽水凝胶及其制备方法与应用 |
-
2015
- 2015-04-10 CZ CZ2015-244A patent/CZ307755B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2016
- 2016-04-08 US US15/564,035 patent/US10160785B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2016-04-08 WO PCT/CZ2016/050009 patent/WO2016161997A1/en active Application Filing
- 2016-04-08 EP EP16721001.2A patent/EP3280722B8/en active Active
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ČEŘOVSKÝ, VÁCLAV. "ANTIMIKROBIÁLNÍ PEPTIDY IZOLOVANÉ Z HMYZU." Chem. Listy 108 (2014): 344-353 * |
| Čujová, Sabína, et al. "Interaction of a novel antimicrobial peptide isolated from the venom of solitary bee Colletes daviesanus with phospholipid vesicles and Escherichia coli cells." Journal of Peptide Science 20.11 (2014): 885-895 * |
| Nešuta, Ondřej, et al. "Antimicrobial peptide from the wild Bee Hylaeus signatus venom and its analogues: structure–activity study and synergistic effect with antibiotics." Journal of natural products 79.4 (2016): 1073-1083 * |
| Oyston, P. C. F., et al. "Novel peptide therapeutics for treatment of infections." Journal of medical microbiology 58.8 (2009): 977-987 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20180086792A1 (en) | 2018-03-29 |
| EP3280722B8 (en) | 2019-06-26 |
| EP3280722A1 (en) | 2018-02-14 |
| EP3280722B1 (en) | 2019-05-15 |
| WO2016161997A1 (en) | 2016-10-13 |
| CZ2015244A3 (cs) | 2016-11-09 |
| US10160785B2 (en) | 2018-12-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ307755B6 (cs) | Antimikrobiální peptidy a jejich použití pro léčbu topických infekcí | |
| Sahal et al. | Antifungal and biofilm inhibitory effect of Cymbopogon citratus (lemongrass) essential oil on biofilm forming by Candida tropicalis isolates; an in vitro study | |
| Mathekga et al. | Antibacterial activity of south african Helichrysum species | |
| Yang et al. | Vancomycin–chitosan composite deposited on post porous hydroxyapatite coated Ti6Al4V implant for drug controlled release | |
| US8071540B2 (en) | Virus derived antimicrobial peptides | |
| Williams et al. | In vivo efficacy of a silicone‒cationic steroid antimicrobial coating to prevent implant-related infection | |
| Guiotti et al. | Antimicrobial activity of conventional and plant-extract disinfectant solutions on microbial biofilms on a maxillofacial polymer surface | |
| De Alteriis et al. | Polymicrobial antibiofilm activity of the membranotropic peptide gH625 and its analogue | |
| JP2009137992A (ja) | 生物活性を有する短ペプチド及び該ペプチドの使用方法 | |
| Ehrlich et al. | From Koch's postulates to biofilm theory. The lesson of Bill Costerton | |
| WO2007100917A2 (en) | Antimicrobials and related methods | |
| CN112341522B (zh) | 一种抗菌肽及其应用 | |
| CN110123801A (zh) | 一种多臂aie分子在制备抗菌药物中的用途和抗菌药物 | |
| CN110078794A (zh) | 一种抗菌肽及其应用 | |
| Yu et al. | Synergistic effect of a biodegradable Mg–Zn alloy on osteogenic activity and anti-biofilm ability: an in vitro and in vivo study | |
| Coaguila‐Llerena et al. | Effects of octenidine applied alone or mixed with sodium hypochlorite on eukaryotic cells | |
| AU2012387696A1 (en) | Anti-microbial activity of synthetic peptides | |
| Kruglikova et al. | Surgical maggots and the history of their medical use | |
| CN116059311A (zh) | 一种抗菌肽在制备抗金黄色葡萄球菌感染的药物中的用途 | |
| CN108434438A (zh) | 抗菌肽在制备治疗幽门螺杆菌病的药物中的用途以及药物组合物 | |
| KR102378112B1 (ko) | 비니페린 유도체 화합물, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 폐렴균성 바이오필름에 의해 유발되는 감염증의 예방 또는 치료용 조성물 | |
| EP3570868B1 (en) | Synthetic antimicrobial peptides and their applications for the treatment and prevention of musculoskeletal infections | |
| JP6669656B2 (ja) | テンポリンＳＨａのアナログおよびその使用 | |
| Zare et al. | Evaluation of excreta/secreta of Lucilia sericata larvae as a new antibacterial candidate for treatment of MRSA ocular infection | |
| CN108272792A (zh) | 一种抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜的组合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20200410 |