KR20230123547A

KR20230123547A - 수용성 프로폴리스를 활성 성분으로 포함하는 미스트용 조성물

Info

Publication number: KR20230123547A
Application number: KR1020220020072A
Authority: KR
Inventors: 이세연; 권이성
Original assignee: 우석대학교 산학협력단
Priority date: 2022-02-16
Filing date: 2022-02-16
Publication date: 2023-08-24

Abstract

프로폴리스를 활성 성분으로 하는 미스트 제제를 만들기 위해서는 추출 용매인 에탄올의 제거, 추출 과정에서 발생하는 수지 내지 왁스와 같은 불순물의 제거, 수용화시키기 위한 공정에서 계면활성제 등과 같은 화학 물질의 불사용 등을 달성하여야 하며 프로폴리스의 본래의 기능인 항균작용, 항산화작용 등을 충분히 나타내는 수용성 프로폴리스의 함량이 높아야 하는데, 본 발명은 이와 같은 문제를 해결하여 무자극성, 무알코올, 무계면활성제 수용성 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 미스트용 조성물을 제공하는 것을 해결하고자 하는 과제로 하며, 이를 위하여 본 발명은 에탄올 추출, 탈납공정 및 농축 공정을 통하여 제조된 프로폴리스를 정제수와 혼합한 후에 75℃ 내지 85℃로 가온하고 이 가온 상태를 1 내지 5시간 동안 유지한 후 상온으로 낮추어 여과하여 제조되는 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 무자극성, 무알코올, 무계면활성제 수용성 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 미스트용 조성물을 제공한다.

Description

수용성 프로폴리스를 활성 성분으로 포함하는 미스트용 조성물{Composition for mist comprising water-soluble propolis as an active ingredient}

본 발명은 수용성 프로폴리스를 활성 성분으로 함유하는 미스트용 조성물에 관한 것 제제에 관한 것으로 구체적으로는 무자극성, 무알코올, 무계면활성제 수용성 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 미스트용 조성물에 관한 것이다.

미스트(mist)란 공기 중에 떠다닐 수 있는 0.1~100㎛ 크기의 대단히 작은 액체입자를 말하는 것으로서, 대부분 기체에서 액체로 응축되거나, 액체를 미립자 형태로 분산시킬 때 발생하게 된다. 이때의 분산은 비산(飛散)이나 분무와 같은 방법에 의해서 나타난다.

상기와 같이 미스트 기기에 의해 분무된 액체 입자인 미스트는 피부, 비강 점막, 구강 점막, 안구, 폐를 통하여 높은 흡수율로 신속하게 흡수되어 소화기관인 위장관에 의해 활성 성부의 손실이 발생하는 경구 투여보다도 현저한 높은 효율성을 보일 수 있다.

그러나 다양한 기능성을 가지는 천연물 내지 천연 추출물을 활성 성분으로 함유하는 미스트를 제조하기 위해서는 피부, 안구, 점막 등에 의한 자극성이 없어야 하며, 수용성이 아닌 경우 알코올과 같은 유기 용매를 추출 용매로 하였을 때 그 추출 용매의 제거가 확실하게 되어야 하며, 액체 미립자로 분무될 수 있도록 불순물의 제거가 완벽하게 이루어져야 한다.

따라서, 프로폴리스와 같은 활성물질을 함유하는 미스트용 조성물을 제조하기 위해서는 무자극성, 무알코올, 무계면활성제이면서 왁스 내지 수지와 같은 불순물이 없는 수용성 프로폴리스의 제조가 이루어져야 한다.

프로폴리스(Proplis)는 꿀벌이 벌통의 틈을 메워 빗물이 스며드는 것을 방지하고, 외부로부터 안전하게 벌통을 차단하는데 이용하기 위하여 수많은 식물 표피에서 수집한 수지상(樹枝狀)의 보호물질로서 유기물과 미네랄이 많이 함유되어 있으며 특히 100종류가 넘는 플라보노이드가 함유되어 있어 항균, 항산화 등의 효능이 있으며, 암을 억제하고 면역 기능을 증진하는 작용이 있고, 그 이외에도 방사선 부작용 경감. 궤양 치료, 나병치료, 조직 재생을 비롯한 의학적 효능을 기대하고 많은 연구가 진행 중에 있다.

상기한 프로폴리스의 인체 유익성에 따라 프로폴리스의 수요가 증가하는데 비하여 수불용성으로 인해 다양한 용도로 사용하는데 어려움이 있으며, 이를 수용성으로 하는 기술은 개시되어 있어 계면활성제를 사용하거나 왁스 내지 수지 성분이 잔존하고 있어 미스트용 조성물로 사용하기에 한계가 있다.

수용성 프로폴리스의 제조와 관련된 선행기술로 예를 들면, 대한민국 특허 등록 제10-1403511호에는 에탄올로 추출을 한 후 왁스, 수지 등 불순물을 제거하고 농축하여 에탄올 제거한 후에 농축물에 폴리솔베이트 트윈 20과 폴리솔베이트 트윈 80을 부가하여 수용화하는 방법이 개시되어 있는데 이는 폴리솔베이트 트윈 20과 폴리솔베이트 트윈 80과 같은 계면활성제를 사용하고 있어 미스트 제조에 사용하기에는 부적합하다.

또한, 대한민국 특허 등록 제10-1193056호에 프로폴리스 분말에 40℃에서 3시간 동안 원적외선 처리하고, 원적외선이 조사된 프로폴리스 분말과 80wt% 주정을 1 : 7.8(w/v) 비율로 넣고 40℃에서 4시간 동안 교반 추출한 다음 여과하는 제1단계와; 상기 제1단계에서 여과된 잔사에 녹차유를 0.1~5배(w/v) 넣고 0.1~5시간 교반 추출한 다음, 원심 분리하여 지용성 프로폴리스를 생산하는 제2단계와; 상기 제1 및 제2단계에서의 추출물을 혼합한 다음 5~8wt% 베타 사이클로 덱스트린으로 포접한 다음, 건조 분말 프로폴리스를 제조하는 제3단계와; 상기 제3단계에서 얻어진 프로폴리스 분말에 3~7%(w/w)의 유당을 혼합한 다음, 아스퍼질러스 뮤코를 35~40℃에 서 48~72시간 배양하여 발효물을 얻는 제4단계와; 상기 제4단계에서의 발효물을 나노화 처리 설비에서 수용성 프로폴리스를 생산하는 제5단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 수용성 프로폴리스를 제조하는 방법을 개시하고 있으나 이는 공정이 매우 복잡하여 생산성이 낮으며, 수지류, 왁스류가 완전히 제거되지 않아 사용 시에 용기에 달라붙는 현상이 발생하여 취급이 곤란한 문제점이 있을 수 있으며, 덱스트린 사용 및 세균 배양 등과 공정에서 함유될 수 있는 다양한 화학 물질에 의해 미스트로 사용하였을 경우 안전성을 담보할 수 없다.

1. 대한민국 특허 등록 제10-1403511호 2. 대한민국 특허 등록 제10-1193056호

상술한 바와 같이 프로폴리스를 활성 성분으로 하는 미스트 제제를 만들기 위해서는 추출 용매인 에탄올의 제거, 추출 과정에서 발생하는 수지 내지 왁스와 같은 불순물의 제거, 수용화시키기 위한 공정에서 계면활성제 등과 같은 화학 물질의 불사용 등을 달성하여야 하며 프로폴리스의 본래의 기능인 항균작용, 항산화작용 등을 충분히 나타내는 수용성 프로폴리스의 함량이 높아야 하는데, 본 발명은 이와 같은 문제를 해결하여 무자극성, 무알코올, 무계면활성제 수용성 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 미스트용 조성물을 제공하는 것을 해결하고자 하는 과제로 한다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은

에탄올 추출, 탈납공정 및 농축 공정을 통하여 제조된 프로폴리스를 정제수와 혼합한 후에 75℃ 내지 85℃로 가온하고 이 가온 상태를 1 내지 5시간 동안 유지한 후 상온으로 낮추어 여과하여 제조되는 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 무자극성, 무알코올, 무계면활성제 수용성 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 미스트용 조성물을 제공한다.

상술한 본 발명에 따른 수용성 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 미스트용 조성물에 있어서, 상기 농축된 프로폴리스와 정제수의 혼합 비율이 중량비율로 8:2인 것이 바람직하다.

상술한 본 발명에 따른 수용성 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 미스트용 조성물에 있어서, 상기 상온으로 낮추어 여과한 다음에 농축 공정을 더 포함하여 제조될 수 있다.

상술한 본 발명에 따른 수용성 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 미스트용 조성물에 있어서, 최종 공정으로 멸균 공정을 더 포함하여 제조될 수 있다.

상술한 본 발명에 따른 수용성 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 미스트용 조성물은 피부 트러블 온화, 안구 피로 및 건조증 완화, 입 냄새 감소 및 비염 및 축농증 완화에 사용 효과를 보이는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 수용성 프로폴리스 함유 미스트 조성물은 왁스 내지 수지 성분 등 불순물 및 추출 용매인 에탄올이 전혀 없으나 수용화 과정에서 계면활성제를 전혀 사용하지 않았으며, 고 농도로 프로폴리스를 함유하여 프로폴리스가 가지는 기능성의 활용도 현저히 높으며, 예들 들어 피부에 분무될 때는 피부 보습, 여드름과 같은 피부 트러블 완화, 안구에 분무될 때는 안구건조증 완화, 구강에 분무될 때는 구강 내 세균 제거 및 입 냄새 완화, 코에 분무될 때는 비염, 축농증 개선 효과가 있으며, 또한 폐를 통한 흡수에 의해 전신에 퍼지는 경우 소화기관인 위장관을 통한 흡수 시에 발생하는 손실의 문제가 없어 프로폴리스가 가지는 다양한 기능성의 발휘가 매우 우수하게 나타날 수 있다.

도 1은 프로폴리스 추출물의 안구 건조 동물 모델(DED)에 대한 눈물 생성 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 프로폴리스 추출물의 안구 건조 동물 모델(DED)에 대한 눈물막 파괴 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 프로폴리스 추출물의 안구 건조 동물 모델(DED)에 대한 각막 상피세포 손상 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 프로폴리스 추출물의 안구 건조 동물 모델(DED)에 대한 염증성 사이토카인 분비 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 프로폴리스 추출물의 비염 및 축농증에 대한 효과를 정리한 표 그림이다.

이하 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.

상술한 내용 중에서 에탄올 추출, 탈납공정 및 농축 공정을 통한 알코올이 포함되지 않으면서 백탁 현상이 없는 무알콜 수용성 프로폴리스의 제조는 본 발명이 이전에 널리 알려진 것으로,

그 예를 들면

프로폴리스 원괴와 음용이 가능한 에탄올을 중량 기준으로 1:4의 비율로 혼합하여 탱크의 내부에 투입하고, 교반 날개로 교반하면서 7 내지 14일간 추출 및 숙성을 하는 단계;

추출 및 숙성이 완료된 추출액을 마이크로 필터를 사용하여 1차적으로 여과하는 단계;

1차 여과가 완료된 추출액을 섭씨 영하 20도의 냉동고에서 48시간 존치시켜서 상기 추출액으로부터 지방, 왁스 및 수지성분을 분리시키는 탈랍공정을 수행하는 단계;

상기 1차 탈랍공정을 통해 분리된 지방, 왁스 및 수지성분을 추출액으로부터 제거하기 위해 상기 추출액에 대하여 마이크로 필터를 사용하여 2차 여과공정을 수행하는 단계;

상기 2차 여과공정을 수행한 추출액에 대하여 농축온도 섭씨 55도 내지 60도이고 진공도 680~720mmHg의 압력 상태에서 감압증류를 통한 농축을 실시하는 단계;

를 포함하는 공정이 있으며, 본 발명은 상술한 예에 한정되는 것은 아니며 본 발명은 특별한 제한 없이 이용 가능하다.

상술한 바와 같은 공정에 따라서 고 농도로 농축된 프로폴리스를 본 발명은 수용성 강화, 불순물 및 알코올 제거, 무자극성, 무계면활성제를 달성하기 위하여 상기 농축된 프로폴리스를 정제수와 혼합한 후에 75℃ 내지 85℃로 가온하고 이 가온 상태를 1 내지 5시간 동안 유지한 후 상온으로 낮추어 여과하는 공정을 더 추가하여 제조된 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 것을 특징으로 한다.

이와 같은 정제수 혼합, 가온, 여과 공정을 통하여 잔존하는 알코올, 수지 내지 왁스 성분과 같은 불순물은 제거되며, 수용성이 강화되고 자극성이 완화된 프로폴리스가 제조되어 미스트용 사용할 수 있게 되는 것이다.

즉 본 발명에 따르면 추출 용매인 에탄올의 제거, 추출 과정에서 발생하는 수지 내지 왁스와 같은 불순물의 제거, 수용화시키기 위한 공정에서 계면활성제 등과 같은 화학 물질의 불사용이 가능해진다.

상기 본 발명에 따른 추가 공정에서 정제수를 혼합한 후 가온하는 방법은 열을 전달할 수 있는 수단이라는 특별한 제한 없이 이용이 가능하며, 여과 역시 본 발명이 속하는 기술 분야에 널리 알려진 방법이라면 특별한 제한이 없이 이용 가능하다.

또한, 농축된 프로폴리스와 정제수의 혼합 비율은 특별한 제한이 없으나 본 발명자의 다양한 시험에 의한 결과 중량비율로 하여 2:8이 가장 적절하며, 정제수를 부가하여 희석이 되었기 때문에 필요에 따라서는 농도를 높이기 위하여 농축을 할 수 있으며, 농축 공정은 본 발명이 속하는 기술 분야에 널리 알려진 것이라면 특별한 제한 없이 이용 가능하다.

본 발명에서는 미스트 기기에 충전되기 전에 멸균 공정을 거칠 수 있는데, 이 때의 멸균을 열을 가지지 않는 방법이라면 특별한 제한이 없으며, 그 예로는 무균 여과 방법, 자외선 조사를 통한 멸균 방법을 들 수 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만 실시예의 기재에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

프로폴리스 원괴 70kg과 식용이 가능한 95% 에탄올(주정) 280리터를 중량기준 약 1:4의 비율로 혼합하여 추출탱크에 투입하여 교반날개로 교반시키면서 총 7 내지 14일 정도에 걸쳐 프로폴리스 유효성분의 추출 및 1차 숙성을 수행하고, 이어서 필터 구멍 크기(pore size)가 5 내지 6㎛인 필터로 여과하였다.

이 여과물을 냉동고에서 대략 영하 20℃를 유지하며 48시간 존치시켜 지방, 왁스 및 수지성분 물질을 분리시키는 탈랍공정을 수행한 후 다시 여과한 다음 진공도 680 내지 720mmHg의 압력의 상태에서 감압 농축기(concentrator)를 이용하여 농축을 실시하여 에탄올을 제거하는 농축공정을 수행하여 잔존하는 에탄올은 거의 전부가 제거된 점액질 상태의 프로폴리스이 제조하였다.

이어서 상기 점액질 상태의 프로폴리스에 정제수를 2:8의 중량비율로 부가한 후에 대략 80℃로 가온한 후에 이 상태를 2시간 동안 유지한 다음 이를 다시 상기 여과 방법과 동일하게 여과한 후에 상온으로 식혔다.

마지막으로 이를 다시 감압 농축기에서 진공도 680 내지 720mmHg의 압력의 상태에서 농축하여 총 플라보노이드 화합물의 함량이 3.5 내지 4.0중량%가 될 때 까지 농축하 다음 자외선 살균기로 멸균하여 본 발명에 따른 무자극성, 무알코올, 무계면활성제 수용성 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 미스트용 조성물을 제조하였다.

<조성물의 안전성 시험: 피부 자극 시험>

1. 시험대상자 선정 기준

* 20 ~ 55세 성인 남녀

* 시험의 목적, 내용 등에 대해 이해하고 자발적 참여 의사를 밝힌 자

* 발생 가능한 이상반응에 대해 이해하고 서면 동의서에 서명한 자

* 시험기간 동안 추적 관창리 가능한 지원자

2. 시험대상자 제외기준

* 습진성 피부질환이 있는 경우

* 감염성 피부질환이 있는 경우

* 알레르기성 특이 체질

* 화장품, 의약품, 일상적 일광노출에 자극이나 알레르기가 있는 경우

3. 시험 대상자 선정

* 자발적으로 모집된 시험 대상자들을 대상으로 피부과 전문의의 피부에 대한 이화학적 검사와 문진을 하여 선정기준에 부합되고 제외기준에 해당하지 않는 30명을 선정하였다.

4. 피부첩포 시험(patch test)에 의한 안전성 평가 인체 적용 시험

시험 대상자는 본 인체적용 시험 기간 중 총 4회(시험 시작 전, 첩포 제거일, 첩포 제거 후 24시간 경과 후, 48시간 경과 후) 방문하였으며, 피부과 전문의에 의해 피부자극 여부를 판정받았다.

첫 방문 시 시험대상자는 IQ 챔버(Chemotechnique Diagnostics, Sweden)를 이용하여 시험대상자의 등에 피부 첩포 시험을 하였다. 시험 대상자 각 30명을 대상으로 IQ 챔버를 이용하여 등에 척추를 중심으로 어깨뼈와 허리선 사이에 시료를 적용하였다.

시험부위를 증류수로 닦아 내고 건조시킨 다음 상기 실시예에 따라 제조한 조성물와 비교예 조성물을 35㎕씩 IQ 챔버에 적하시킨 후 시험 부위에 얹어 고정시켰다.

이때 비교예 조성물은 시판되는 수용성 프로폴리스를 농축, 여과, 멸균하여 사용하였다, 즉 정제수 부과 후 가온 공저을 실시하지 않은 것에서 실시예와 차이가 있다.

24시간 동안 피부에 첩포하였으며, 첩포를 제가한 후에는 marking pen으로 시험부위를 표시하여 각각 30분 경과 후, 24시간 경과 후, 48시간 경구 후에 시험부위를 관찰하였다.

피부 반응은 국제 접촉피부염연구회(ICDRG)의 평가 기준에 따라 자극정도를 분류하였다(표 1 참조), 평균피부반응도 계산공식에 따라 mean score를 산정한 후 피부첩포 시험 결과를 판정표(표 2 참조)에 따라 자극 유무를 판정하였다.

기호	score	피부 반응 평가 기준
-	0	무자극
±	0.5	미자국: 희미한 또는 가까스로 감지할 수 있는 가벼운 홍반
+	1	경자극: 경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진
++	2	중자극: 뚜렷한 홍반, 구진 및 소수포
+++	3	강자극: 심한 홍본 및 대수포, 가피 형성

<평균 피부반응도 계산 공식>

판정(grade)	mean score
무자극(1)	0.00 ~ 0.75
미자극(2)	0.76 ~ 1.50
경자극(3)	1.51 ~ 2.50
중자극(4)	2.51 ~ 4.00
강자극(5)	4.01~

5. 시험 결과

하기 표 3에서 보는 바와 같이 본 발명에 따른 조성물은 첩포 제거 후 30분, 24시간 및 48시간 경과 후에서 모두 반응을 관찰할 수 없어 무자극으로 판정되었으나, 비교예 조성물은 30분, 24시간 및 48시간 경과 후에서 약한 홍반이 발견되어 경자극으로 판정이 되었다.

시료명	반응자수	반응도			평균 피부 반응도
시료명	반응자수	30분	24시간	48시간	평균 피부 반응도
실시예 조성물	0	0	0	0	0
비교 샘플 1	21	2.43	2.08	1.57	2.15

본 시험 결과에 따라 본원발명에 따른 조성물은 종래의 조성물과 비교하였을 때 피부 자극이 없는 무자극 조성물임을 알 수 있으며, 종래의 조성물이 비록 경 자극이나 미스트를 피부만이 아닌 눈, 코, 구강에 사용되며 폐로도 흡수되기 때문에 사용하기 적절한 조성물이라고 보기는 어렵다.

<조성물의 여드름 완화 시험>

10대 여드름 질환자 각각 50명으로 이루어진 2 그룹에 대하여 상기 피부 자극 시험 평가에서 사용한 본 발명에 따른 조성물과 비교예 조성물을 미스트 기기에 넣고 여드름 피부 부위 하루에 한번에 20회 정도 분무를 하여 이를 총 15일 동안 실시하였다.

15일 후 사용자의 의견에 따라 효과정도를 아래의 평가기준에 따라 판정하였다. 시험결과는 표 4에 나타내었다.

매우 양호한 여드름 증상 제거효과가 있음 : 5점

상당한 여드름 증상 제거효과가 있음 : 4점

약간의 여드름 증상 제거효과가 있음 : 3점

여드름 증상 제거효과가 없으나 악화되지도 않음 : 2점

여드름 증상 제거효과가 없고 오히려 악화되었음 : 1점

	5점	4점	3점	2점	1점
실시예 인원수	25	27	7	3	0
비교예 인원수	3	5	18	22	2

상기 표 4에 나타난 바와 같이, 비교예 조성물과는 다르게 여드름 질환자 50명 중 47명이 여드름 증상이 호전되었으며, 3명은 증상이 호전되지 않았으나 악화하지도 않아 본 발명의 조성물의 피부 트러블 개선 효과를 확인할 수 있었다.

이는 본 발명의 조성물이 비교예 조성물과는 다르게 무자극성, 무알코올, 무계면활성제 수용성 프로폴리스로 제조되어 미스트 기기를 통하여 미립화하기 용이하여 피부 흡수 효율이 향상된 결과로 추론이 된다.

<조성물의 안구 피로 및 건조증 완화 시험>

1. 재료 및 방법

안구 건조증 마우스 모델(Experimental dry eye, EDE ) 및 실험과정

8주령 C57BL/6 쥐를 1일 18시간 동안 통풍장치에 노출시킨 상태에서 0.5mg/0.2ml 스코폴라민 브롬화수소산염(scopolamine hydrobromide, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 하루 3회(9시, 13시 30분 및 18시) 피하 주사하여 건성안을 유도하였다. 이때 실험공간은 30% 습도 및 25℃의 온도로 유지시켰다.

실험기간 동안에 동물의 행동, 음식 및 물 섭취는 제한되지 않았다. 마우스는 다음 6개 그룹으로 분배하였다:

미처리 대조군(untreated, UT); EDE 대조군(점안액 미투여군); 평형염(BSS, balanced salt solution; Alcon, Forth worth, TX) 처리군; 0.001% 프로폴리스 추출물 처리군; 0.01% 프로폴리스 추출물 처리군; 0.1% 프로폴리스 추출물 처리군. 이때, 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 점안액은 BSS에 희석하여 제조된 것을 사용하였다.

그 다음 안구 건조증을 유도시킨 마우스에 하루 3차례 2㎕의 프로폴리스 추출물이 포함된 점안액 또는 평형염을 처리하였다.

눈물 생성량 분석

안구 건조증을 유도한 후 프로폴리스 추출물이 포함된 점안액을 처리한 마우스의 외안각쪽 결막낭에 페놀-레드 함침 면사(Phenol-red impregnated cotton thread, Zone-quick, Oasis, Glendora, CA)를 20초 동안 접촉시켰다.

그 다음 눈물에 의해 적색으로 변한 면사의 길이를 현미경(SMZ 1500; Nikon, Melville, NY)을 이용하여 측정한다음, standard curve에 대입하여 길이를 부피로 변환하였다.

눈물막 파괴시간 분석

안구 건조증에 있어 가장 중요한 임상 인자인 눈물막의 안정성(tear film stability)을 판단하는 인자인 눈물막 파괴시간의 검사를 위해, 안구 건조증을 유도한 후 프로폴리스 추출물이 포함된 점안액을 처리한 마우스의 결막낭에 1% 형광염색액(Fluorescein) 1㎕를 점안한 후 눈을 3회 정도의 눈을 감았다가 뜨게 하고 부드럽게 벌린 다음, 코발트 블루 필터(Cobalt blue filter)가 장착된 세극등 현미경을 통해 염색된 눈물막에 첫 번째 결손이 생길 때까지의 시간(초)을 측정하였다.

각막표면의 손상 정도 분석

안구 건조증을 유도한 후 프로폴리스 추출물이 포함된 점안액을 처리한 마우스의 결막낭에 1% 형광염색액(Fluorescein) 1㎕를 점안한 후 식염수로 세척한 다음, 쥐의 각막을 세극등 현미경으로 관찰하여 상피손상 정도(형광염색이 묻어나는 정도)를 점수화하여 평가하였다. 이를 위해 각막을 4등분 한 다음, 각 등분을 아래와 같

이 0-4점까지 평가한 후 합산하였다(총 0-16점).

염증매개 사이토카인 농도 분석

안구 건조증을 유도한 후 프로폴리스 추출물이 포함된 점안액을 처리한 마우스의 결막을 수술을 통해 채취하여 단백질 분리 후 웨스턴 블럿 분석을 통해 염증을 일으킨다고 알려진 사이토카인의 수치를 정량화 하였다.

구체적으로, 안구 건조증을 유도한 후 프로폴리스 추출물이 포함된 점안액을 처리한 마우스의 결막조직을 PBS 용액으로 2회 세척한 후 용해 완충액(PRO-PREP protein extraction solution, 인트론바이오테크놀로지, 한국)을 넣고 4℃에서 10분 동안 용해시켜 수득하였다.

그 다음 상기 수득한 세포는 17,000 rpm, 4 ℃에서 20분 동안 원심분리한 후 상층액을 회수하였다. 그 다음 각 상층액 30 ㎍을 취하여 SDS 로딩 완충액(60 mM Tris, 25 % 글리세롤, 2 % SDS, 0.5 % 2-머캅토에탄올, 0.1 % 브로모페놀 블루)과 혼합한 후 10 % SDS 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에 로딩(loading)하여 전기영동하고 NCM(nitrocellulose membrane)에 전이시켰다.

이후 상기 NCM은 5 % 무지 분유가 첨가된 TBS(10 mM Tris, 100 mM Nacl, 0.1% tween 20) 용액을 넣고 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking) 시켰다. TTBS 용액으로 10분 동안 3회 세척한 후 1차 항체(Prx2, Prx4, Prx5 각 1:1000 희석)로 2시간 동안 반응시킨 다음에 TTBS 용액으로 3회 세척하였다. 그 다음 퍼옥시다제(peroxidase)가 포함된 2차 항체(goat-anti mouse 1:10,000, goat-anti rabbit 1:10,000)로 1시간 동안 반응시켰고, 항체의 검출은 Amersham ECL TM Western Blotting Detection Reagents(GE Healthcare, UK)를 이용하여 LAS(GEHealthcare,UK)로 확인하였다.

면역조직학적 분석

안구 건조증을 유도한 후 프로폴리스 추출물이 포함된 점안액을 처리한 마우스의 안구 조직을 10% 포르말린에 고정하고 파라핀 포매한 후, 4 ㎛ 두께로 박절하여 슬라이드글라스 위에 고정하였다. 그 다음 상기 슬라이드글라스를 에탄올에 침수시킨 후 BSA로 블로킹(blocking)시킨 후 항-CD11b 항체를 상온에서 3시간 동안 처리하였다.

그 다음 PBS로 세척한 후 FITC가 결합된 항-고트 2차 항체를 처리한 후, DAPI가 함유된 마운팅 용액으로 마운트 후 eXcope, X3 디지털 카메라(DIXI Optics, 한국)가 장착된 BX-40 apparatus(Olympus, 일본)으로 관찰하였다.

2. 실험결과

눈물 생성량 및 눈물막 파괴 분석

안구 건조증을 유발한 마우스 모델에 프로폴리스 추출물을 처리한 후 상기 기재한 방법으로 눈물 분비량 회복 효과와 눈물막 파괴시간 차단효과를 분석하였다. 그 결과, 도 1 및 도 2에서 보듯이, 모든 프로폴리스 추출물이 안구 건조증에 의해 감소된 눈물분비량을 촉진시키는 것으로 나타났으며, 0.1% 및 0.01% 프로폴리스 추출물이 안구건조증에 의한 눈물막 파괴효과를 억제시키는 것으로 나타났다.

각막 상피세포의 손상정도 분석

안구 건조증을 유발시킨 마우스 모델에 프로폴리스 추출물을 처리한 후 상기 기재한 방법으로 각막 상피세포 손상정도를 측정하기 위해 각막을 형광색소염색을 하였다. 그 결과, 도 3에서 보듯이, 모든 농도의 프로폴리스 추출물이 안구 건조증에 의한 각막 상피세포 손상을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.

염증매개 사이토카인 발현 분석

안구 건조증을 유발시킨 마우스 모델에 프로폴리스 추출물을 처리한 후 결막조직에서 염증반응에 의한 염증성 사이토카인 증가를 억제할 수 있는지 확인하기 위해 결막조직내에 존재하는 염증성 사이토카인 단백질 발현량 측정하였다. 그 결과, 도 4에서 보듯이 0.1% 프로폴리스 추출물이 안구 건조증에 의해 유발된 염증성 사이토카인 발현량을 효과적으로 감소시킨 것을 확인하였다.

면역조직학적 분석

안구 건조증을 유발시킨 마우스 모델에 프로폴리스 추출물을 처리한 후 각막에서 염증반응에 의한 대식세포의 침윤을 억제 할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, 도 4에서 보듯이 0.1% 프로폴리스 추출물이 안구 건조증에 의해 유발된 대식세포의 침윤을 효과적으로 억제시킨 것을 확인할 수 있었다.

상기한 시험 결과를 통해 본 발명에 따른 조성물은 안구 건조 동물모델에서 눈물생성을 촉진시키고, 눈물막 파괴시간을 지연시키며, 각막 상피세포의 손상을 지연시킬 뿐만 아니라 안구표면 및 눈물샘에서 염증성 사이토카인의 발현량을 감소시키고, 염증반응에 의한 대식세포의 침윤을 억제시킴으로써 안구 건조증을 예방 또는 치료하는 효능을 가짐을 확인할 수 있었으며, 이를 점안액이 아닌 미스트로 하여 수시로 뿌려주게 되면 더욱 그 효과는 높아질 수 있다.

<조성물의 입 냄새의 감소에 대한 시험>

보통의 입 냄새를 갖는 각각 20명의 지원자로 이루어진 2 그룹에 대하여 상기 피부 자극 시험 평가에서 사용한 본 발명에 따른 조성물과 비교예 조성물을 미스트 기기에 넣고 입 안에 20회 정도 분무를 하였다.

각 지원자의 날숨이 사용 직전과 직후 및 30분과 60분이 경과된 후에 감각적으로 훈련된 시험자에 의해 0 (무 입 냄새) 내지 5 (매우 심한 입 냄새)의 스케일로 평가한 후 사용 전의 입 냄새 세기를 100으로 한 다음에 이와 비교하여 그 정도를 표 4에 나타냈으며, 100에 가까울수록 효과가 없는 것이다.

	사용 직후	사용 30분 후	사용 60분 후
실시예 조성물	48	48	67
비교예 조성물	55	69	81

상기 표 4의 결과를 보면 비교예 조성물과 비교하여 매우 우수한 입 냄새 제거 효과를 보여 정제수 처리에 따른 효과를 알 수 확인할 수 있었으며, 또한 이오 별개로 사용자들에게 입 안에 분무하였을 때 불쾌감을 설문 조사한 것에서는 본 발명에 조성물은 냄새, 맛 등이 약해 불쾌한 느낌이 없었으나 비교예 조성물의 경우에는 특유의 냄새와 맛이 있어 사용에 불편함을 표하는 경우가 많았다.

<조성물의 비염 및 축농증 완화에 대한 생체 내 시험>

알레르기성 비염 및 축농증이 있는 중학생, 고등학생, 및 성인 남녀 100명을 대상으로 본 발명의 조성물 1일 3번 20회씩 1주간 코에 분무하도록 한 후 설문조사하였다. 그 중 95% 정도가 3일 정도에 두통 완화, 5일 정도에 코막힘 완화, 7일 정도에 후각 능력 개선의 효능을 보였다. 부작용은 전혀 관찰되지 않았으머, 도 5에 알레르기성 비염 및 축농증 환자에 적용한 실제 임상 사례의 일부 결과를 나타내었다.

도 5의 결과에 나타나듯이, 비염 및 축농증 환자에 대해 조성물을 적용한 결과 수 일 내 탁월한 증상의 개선효과를 보였으며, 사용 후 수개월이 지난 후에도 재발 또는 부작용의 발생이 보고되지 코 점막을 자극하거나 폐로 흡수되었을 때에도 어떠한 영향이 미치지 않음을 부수적으로 확인할 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명에 따른 수용성 프로폴리스 함유 미스트 조성물은 왁스 내지 수지 성분 등 불순물 및 추출 용매인 에탄올이 전혀 없으나 수용화 과정에서 계면활성제를 전혀 사용하지 않았으며, 고 농도로 프로폴리스를 함유하여 프로폴리스가 가지는 기능성의 활용도 현저히 높으며, 예들 들어 피부에 분무될 때는 피부 보습, 여드름과 같은 피부 트러블 완화, 안구에 분무될 때는 안구건조증 완화, 구강에 분무될 때는 구강 내 세균 제거 및 입 냄새 완화, 코에 분무될 때는 비염, 축농증 개선 효과가 있으며, 또한 폐를 통한 흡수에 의해 전신에 퍼지는 경우 소화기관인 위장관을 통한 흡수 시에 발생하는 손실의 문제가 없어 프로폴리스가 가지는 다양한 기능성의 발휘가 매우 우수하게 나타날 수 있다.

Claims

에탄올 추출, 탈납공정 및 농축 공정을 통하여 제조된 프로폴리스를 정제수와 혼합한 후에 75℃ 내지 85℃로 가온하고 이 가온 상태를 1 내지 5시간 동안 유지한 후 상온으로 낮추어 여과하여 제조되는 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 무자극성, 무알코올, 무계면활성제 수용성 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 미스트용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 농축된 프로폴리스와 정제수의 혼합 비율이 중량비율로 8:2인 것을 특징으로 하는 수용성 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 미스트용 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 상온으로 낮추어 여과한 다음에 농축 공정을 더 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 수용성 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 미스트용 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
최종 공정으로 멸균 공정을 더 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 수용성 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 미스트용 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조성물이 피부 트러블 온화, 안구 피로 및 건조증 완화, 입 냄새 감소 및 비염 및 축농증 완화에 사용 효과를 보이는 것을 특징으로 하는 수용성 프로폴리스를 활성 성분을 포함하는 미스트용 조성물.