KR20230121689A - 천년초 추출물 및 유산균을 포함하는 과민성장증후군개선용 신바이오틱스 조성물 - Google Patents
천년초 추출물 및 유산균을 포함하는 과민성장증후군개선용 신바이오틱스 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
락토바실러스 파라카세이 및 천년초 추출물을 포함하는 과민성장증후군 개선용 신바이오틱스 조성물을 제공한다.
Description
과민성장증후군 개선을 위한 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 천년초 추출물 및 유산균을 포함하는 과민성장증후군 개선용 신바이오틱스 조성물에 관한 것이다.
과민성장증후군(Irritable bowel syndrome: IBS)은 기질적인 질환 없이 복통 혹은 복부 불편감이 배변 습관의 변화와 동반하여 발생하는 흔한 만성 질환이다. 복통, 변비, 설사 등의 증상이 간헐적이지만 수년 동안 지속되는 것이 특징이다. 스트레스, 피로의 누적, 과도한 음주, 유전적 요인, 내장 과민성 등이 원인인 경우가 많고, 20-30대 사이에 많이 발생하며, 여성의 발병률이 남성보다 더 높은 것으로 알려져 있다. 과민성장증후군 치료 전략으로 규칙적인 식사, 충분한 양의 수분 섭취, 편식없이 다양한 종류의 음식을 섭취할 것이 우선 권고된다. 또한, 환자가 호소하는 증상 예컨대 변비, 설사, 복통에 따라 이를 경감시키기 위한 약물이 사용되기도 하나, 뚜렷한 치료법이 제시되지 못하고 있다. 따라서, 과민성장증후군을 개선할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요하다.
과민성장증후군을 비롯한 대장 관련 질환에 대해 정확한 원인과 치료법을 확실히 개발하지 못하고 있으나, 최근 보고된 바에 따르면 장내 균총(Gut microbiota)과도 매우 깊은 연관이 있는 것으로 알려지고 있으므로, 장 건강을 유지하기 위해서는 장내 미생물 균총의 균형을 유지하고 조절하는 것이 중요하다. 그런데, 과민성장증후군을 앓고 있는 대상체들은 장 내 환경이 좋지 않은 경우가 대부분이므로 유익균을 넣어주더라도 제대로 효과를 보지 못하는 경우가 많다.
본 발명자들은 장내 균총의 불균형을 바로 잡고, 장내 유익균을 증가시키며, 필요한 영양분을 함께 섭취할 수 있는 즉, 신바이오틱스(synbiotics) 효능을 가지며, 나아가 과민성장증후군 개선을 위한 조성물을 연구하였다. 이에 따라, 유산균과 천년초 추출물을 함께 포함함에 따른 과민성장증후군 (IBS) 개선에 대한 시너지 효과를 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
일 양상은 신바이오틱스 효능을 갖는 과민성장증후군 예방 또는 개선용 식품용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 일 양상은 신바이오틱스 효능을 갖는 과민성장증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 일 양상은 신바이오틱스 효능을 갖는 과민성장증후군 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
일 양상은 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 및 천년초(Opuntia humifusa) 추출물을 유효성분으로 포함하는 신바이오틱스의 과민성장증후군 예방 또는 개선용 식품용 조성물을 제공한다.
다른 일 양상은 락토바실러스 파라카세이 및 천년초 추출물을 유효성분으로 포함하는 과민성장증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 일 양상은 락토바실러스 파라카세이 및 천년초 추출물을 유효성분으로 포함하는 과민성장증후군 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 청구범위와 발명의 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
일 양상에 따른 락토바실러스 파라카세이 및 천년초 추출물을 포함하는 조성물은 장내 유익균의 증식을 촉진하고, 특히 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)의 증식을 돕고 생장 및 활성을 촉진시켜서 장내 건강 개선에 유의적인 작용을 나타내는 신바이오틱스 효능을 가질 뿐 아니라, 나아가 과민성장증후군의 예방, 개선, 또는 치료에 효과적이므로, 식품, 건강기능식품, 식이보충제, 또는 의약품으로 이용될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 천연물 유래 추출물을 유효성분으로 하므로, 부작용이나 세포 독성에 대한 문제가 없는 장점이 있다.
도 1은 본 명세서에서의 연구 디자인을 나타낸다. 대조군 [말토덱스트린]; 제1 처리군 [말토덱스트린 + L. paracasei]; 제2 처리군 [말토덱스트린 + L. paracasei + Opuntia 추출물]; 제3 처리군 [말토덱스트린 + L. paracasei + Opuntia 추출물]로 하였다.
도 2는 체중 분석 결과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM (n = 5/군)으로 표시된다.
도 3은 대변 무른정도 점수를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM (n = 5/군)으로 표시된다. *은 일원 ANOVA 및 Tukey 테스트를 사용하여 결정된 유의한 차이를 나타낸다. *p-value < 0.05, **p-value < 0.01, ***p-value < 0.001.
도 4는 대변 미생물 분석 결과를 나타낸다. 도 4에서 (A)는 L. paracasei의 상대적 풍부도(%)를 나타내고, (B)는 ACE에 의해 제시된 알파 다양성 (alpha-diversity)을 나타내고, (C)는 Good's coverage의 라이브러리를 나타내고, (D)는 unweighted UniFrac distance에 기반한 UPGMA 클로스터링을 나타낸다. 상자는 사분 범위 (IQR)를 나타내고, 평균 값은 상자 안에 선으로 표시되며, whisker는 1.5 × IQR 내에서 가장 극단적인 값으로 확장되며, 특이치(outlier)는 십자(cross)로 표시된다. *은 Wilcoxon rank-sum test를 사용하여 결정된 유의한 차이를 나타내고, *p-value < 0.05이다.
도 5는 혈청 코르티코스테론 수준을 나타낸다. 1시간 동안 구속 (restraint) 스트레스를 준 후, 코르티코스테론 수준 수준을 매주 측정하였다. 결과는 평균 ± SEM (n = 5/군)으로 표시된다. *은 일원 ANOVA 및 Tukey 테스트를 사용하여 결정된 유의한 차이를 나타낸다. *p-value < 0.05, **p-value < 0.01, ***p-value < 0.001.
도 6은 염증 매개체의 분석을 나타낸다. 도 6에서, (A)는 TNF-α, (B)는 IL-1β/1F2, (C)는 IL-6의 분석을 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM (n = 5/군)으로 표시된다. *은 일원 ANOVA 및 Tukey 테스트를 사용하여 결정된 유의한 차이를 나타낸다. *p-value < 0.05, **p-value < 0.01, ***p-value < 0.001.
도 7은 세포 접합 단백질의 발현 분석 결과를 나타낸다. 도 7은 면역 조직 화학 분석에 따른 결과를 나타내며, 면역 조직 화학적 분석 동안 얻어진 결장에서 (A) Claudin-1 및 (B) ZO-1 발현을 보여주고 (배율, 200×; a 대조군; b 제1 처리군; c 제2 처리군; d 제3 처리군); (C) Claudin-1 및 (B) ZO-1 발현을 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM (n = 5/군)으로 표시된다. *은 일원 ANOVA 및 Tukey 테스트를 사용하여 결정된 유의한 차이를 나타낸다. *p-value < 0.05, **p-value < 0.01, ***p-value < 0.001.
도 2는 체중 분석 결과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM (n = 5/군)으로 표시된다.
도 3은 대변 무른정도 점수를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM (n = 5/군)으로 표시된다. *은 일원 ANOVA 및 Tukey 테스트를 사용하여 결정된 유의한 차이를 나타낸다. *p-value < 0.05, **p-value < 0.01, ***p-value < 0.001.
도 4는 대변 미생물 분석 결과를 나타낸다. 도 4에서 (A)는 L. paracasei의 상대적 풍부도(%)를 나타내고, (B)는 ACE에 의해 제시된 알파 다양성 (alpha-diversity)을 나타내고, (C)는 Good's coverage의 라이브러리를 나타내고, (D)는 unweighted UniFrac distance에 기반한 UPGMA 클로스터링을 나타낸다. 상자는 사분 범위 (IQR)를 나타내고, 평균 값은 상자 안에 선으로 표시되며, whisker는 1.5 × IQR 내에서 가장 극단적인 값으로 확장되며, 특이치(outlier)는 십자(cross)로 표시된다. *은 Wilcoxon rank-sum test를 사용하여 결정된 유의한 차이를 나타내고, *p-value < 0.05이다.
도 5는 혈청 코르티코스테론 수준을 나타낸다. 1시간 동안 구속 (restraint) 스트레스를 준 후, 코르티코스테론 수준 수준을 매주 측정하였다. 결과는 평균 ± SEM (n = 5/군)으로 표시된다. *은 일원 ANOVA 및 Tukey 테스트를 사용하여 결정된 유의한 차이를 나타낸다. *p-value < 0.05, **p-value < 0.01, ***p-value < 0.001.
도 6은 염증 매개체의 분석을 나타낸다. 도 6에서, (A)는 TNF-α, (B)는 IL-1β/1F2, (C)는 IL-6의 분석을 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM (n = 5/군)으로 표시된다. *은 일원 ANOVA 및 Tukey 테스트를 사용하여 결정된 유의한 차이를 나타낸다. *p-value < 0.05, **p-value < 0.01, ***p-value < 0.001.
도 7은 세포 접합 단백질의 발현 분석 결과를 나타낸다. 도 7은 면역 조직 화학 분석에 따른 결과를 나타내며, 면역 조직 화학적 분석 동안 얻어진 결장에서 (A) Claudin-1 및 (B) ZO-1 발현을 보여주고 (배율, 200×; a 대조군; b 제1 처리군; c 제2 처리군; d 제3 처리군); (C) Claudin-1 및 (B) ZO-1 발현을 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM (n = 5/군)으로 표시된다. *은 일원 ANOVA 및 Tukey 테스트를 사용하여 결정된 유의한 차이를 나타낸다. *p-value < 0.05, **p-value < 0.01, ***p-value < 0.001.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.
일 양상은 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 및 천년초(Opuntia humifusa) 추출물을 유효성분으로 포함하는 신바이오틱스의 과민성장증후군 예방 또는 개선용 식품용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "신바이오틱스(synbiotics)"는 프로바이오틱스와 프리바이오틱스가 상승작용(synergism) 형태로 결합된 것을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로바이오틱스(probiotics)"는 적당량을 섭취했을 때 인체에 이로움을 주는 살아있는 미생물을 총칭하는 말로 우리 몸에 유익을 주는 균을 말한다. 프로바이오틱스는 2001년 세계보건기구(WHO)와 국제식량기구(FAO)의 합동전문가위원회에 의해 '살아있는 미생물로 적당한 양을 섭취하면, 건강에 유익한 세균'이라고 정의된 이후 인체, 동물체 등의 건강에 유익한 영향을 미치는 생균을 지칭하는 용어로 사용된다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균이며, 당류를 발효하여 에너지를 얻고 다량의 락트산을 생성하는 세균을 총칭하여 일컫으며, 젖산균이라고도 한다. 프로바이오틱스인 유산균이나 이로운 세균들은 몸 안의 위산과 담즙산에서 살아남아서 소장까지 도달하여 장에서 증식하고 정착한다. 정착한 장 안에서 건강에 이로운 효과를 나타내며, 이러한 프로바이오틱스는 독성이 없고 비병원성이어야 한다.
유산균은 형태학적으로 구균(Lactococcus, Pediococcus, Leuconostoc)과 간균(Lactobacillus, Bifidobacterium)으로 나누어지고, 그람(Gram) 양성균이다. 이 중에 Lactobacillus는 정상발효와 이상발효를 하는 2종류로 대별되는데 생육온도, 당분해, 성장, 생성 유산의 선광성 등에 따라 55균종 11아균종으로 분류되어 있다. Lactobacillus는 대표적인 유산균으로서 각종 발효식품에 사용되고 또한 장관 상재 균총으로서 사람이나 동물의 건강과 중요한 관계가 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei)"는 유제품 및 프로바이오틱스에 사용되는 그램 양성 균이고, 유산균의 기능적 이상발효종을 말하며, L. paracasei 으로 약칭한다. L. paracasei는 인간의 장 뿐만 아니라 유제품 등에서도 발견된다. 본 명세서의 L. paracas는 김치에서 유래한 것으로 Lactobacillus paracasei DKGF1 이며 균주 기탁번호는 KCTC13877BP 이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프리바이오틱스(prebiotics)"는 장내 유익한 세균, 프로바이오틱스의 생장을 돕는 영양소를 지칭한다. 프리바이오틱스는 난소화성 성분으로써 소장에서 소화가 되지 않으며, 대장으로 이동하여 유산균과 같은 박테리아의 성장이나 활성을 선택적으로 높여 인체의 건강을 증진시킨다. 프리바이오틱스는 올리고당과 같이 탄수화물로 이루어져 있는 경우가 많고, 대부분이 식이섬유의 형태로 존재한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "천년초(Opuntia humifusa)”는 선인장과 식물을 말하며, 부채선인장아과(Opuntioideae) 부채선인장속(Opuntia)으로도 지칭된다. 자단선선인장, 천년초, 백년초, 천년초 선인장으로도 지칭된다. 줄기가 손바닥처럼 평평한 것이 특징이며, 손바닥선인장으로도 불린다. 우리나라에서 자생하는 Opuntia속 선인장 중에 제주도 등지에 자생하는 것은 백년초 선인장이고, 내륙에서 월동이 가능한 것을 천년초 선인장이라 부르고 있다. 천년초와 동일한 기원, 생물학적 분류, 및 성질을 갖지만 달리 지칭되거나 이명을 갖는 선인장과 식물을 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 락토바실러스 파라카세이(L. paracasei) 및 천년초(Opuntia humifusa) 추출물을 함께 포함함에 따라 시너지 효과를 나타낸다. 상기 조성물은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)의 증식을 돕고 생장 및 활성을 촉진시켜서 장내 건강 개선에 유의적인 작용을 나타내는 신바이오틱스 효능을 가질 뿐 아니라, 나아가 과민성장증후군 개선에 효과적이다.
또한, 상기 조성물은 장내 유익균을 증가시키고, 장내 염증성 질병, 설사, 변비 등을 예방하며, 혈액 내 콜레스테롤을 감소시키고, 장내 유해균의 성장을 억제하는 등 우리 몸에 유익한 작용을 나타낼 수 있다.
일 구체예에서, 천년초 추출물은 천년초의 줄기, 뿌리, 또는 열매 추출물일 수 있다.
일 구체예에서, 천년초 추출물의 추출용매는 물, 또는 C1 내지 C4의 직쇄 또는 분지형 알코올일 수 있다.
일 구체예에서, 천년초 추출물은 온수로 추출한 것일 수 있다. 상기 온수는 60 내지 80℃일 수 있다. 상기 추출은 10 내지 14 시간 동안 2 내지 4회 추출할 수 있다. 예를 들어, 상기 추출은 60 내지 80℃의 온수로 12 시간 동안 3회 추출할 수 있다.
일 구체예에서, 천년초 추출물은 조성물 총 중량을 기준으로 5 내지 60 중량%로 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 천년초 추출물은 조성물 총 중량을 기준으로 10 내지 30 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 추출물을 얻기 위한 추출방법은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상적으로 사용되는 공지된 추출방법에 따라 제조될 수 있다. 구체적으로 냉침법, 가열 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 가압추출법, 환류추출법, 초임계 추출법, 전기적 추출법 등 통상적으로 사용되는 추출법을 사용할 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다.
또한, 필요한 경우 상기 추출 후, 당업계에 공지된 여과 및/또는 농축 및/또는 동결건조 방법을 추가적으로 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용된 추출물의 건조물 또는 농축물은 상기와 같이 공지된 방법으로 건조 또는 농축된 것을 의미한다.
일 구체예에서, 락토바실러스 파라카세이는 발효 식품에서 분리한 것일 수 있다. 상기 락토바실러스 파라카세이는 김치에서 분리한 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 부형제를 더 포함할 수 있다. 본 명세서에서 부형제는 부피가 적은 시료의 양을 증가시키기 위한 목적으로 사용된다. 예를 들어, 상기 조성물은 말토덱스트린, 프락토올리고당, 이소말토올리고당, 갈락토올리고당, 겐티오올리고당, 자일리톨, 아리비아검, 락툴로오스, 소르비톨이며, 포도당, 또는 이들의 혼합물을 더 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 말토덱스트린을 더 포함할 수 있다.
상기 추가 성분들은 조성물 중의 유산균의 생장을 위한 영양분으로 사용될 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 장내 유익균의 증식을 촉진하고 장내 유해균의 증식을 억제함과 동시에, 이를 위해 필요한 영양분을 함께 제공하는 신바이오틱스 조성물일 수 있다.
상기 조성물 중 락토바실러스 파라카세이는 프로바이오틱스로 사용되고, 천년초 추출물은 프리바이오틱스로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "과민성장증후군(Irritable bowel syndrome: IBS)"은 대변의 빈도 또는 형태의 변화와 배변에 관련된 반복적인 복통을 특징으로 하는 만성 기능성 위장 장애를 말한다. 기질적인 원인 없이 만성적 또는 반복적인 불쾌한 소화기 증상들이 나타난다. 즉 식사나 가벼운 스트레스 후 복통, 복부 팽만감, 설사 혹은 변비 등의 배변 습관의 변화가 있으며, 배변 후에도 잔변감으로 인해 불편을 느끼는 경우가 있다. 과민성 장증후군은 가장 흔한 소화기 질환 중의 하나로 전체 인구의 약 7~15% 정도에서 나타나고 있습니다. 젊은이나 중년의 성인에 주로 나타나는 질환으로 여자가 남자에 비해 많은 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대변 무른정도(stool consistency)"은 대변의 일관성 (느슨함)를 기준으로 하며, 장(bowel)의 일관성(consistency)을 평가하기 위해 임상 레이블을 사용하여 단단한 덩어리에서 완전히 변형되지 않은 액체에 이르기까지 대변의 일관성(대변의 무른정도)을 결정한다. "설사"는 대변 형태의 감소 (대변의 더 큰 느슴함)을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "코르티코스테론(corticosterone)"은 부신피질 호르몬 중 하나로서 대표적인 당질코르티코이드를 말하며, 스트레스 호르몬이라고도 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "종양괴사인자 알파(tumor necrosis factor-α: TNF-α)"는 염증 반응에 관여하는 대식세포 등에서 생산되는 사이토토카인(cytokinin)의 일종을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포 접합 단백질(tight junction protein)"은 장 투과성에 대한 회복 정도를 정량적으로 측정하기 위해 세포 접합 단백질의 발현 정도를 측정할 수 있다. 세포 접합 단백질 수준이 하향 조절될 경우 설사로 이어질 수 있다. 결장(colon) 조직의 세포 접합 단백질이 증가하는 모습으로부터 결장 조직 손상의 완화를 예측할 수 있다. 세포 접합 단백질의 대표적인 예로는 ZO-1, 클라우딘(claudin), 오클루딘(occluding)이 있다.
과민성장증후군을 앓고 있는 대상체에서는 대변 무른정도가 좋지 못하고, 스트레스 호르몬인 코르티코스테론의 수준이 높으며, 결장 조직에서 염증성 사이토카인의 수준이 높고, 세포 접합 단백질의 발현이 하향 조절되어 있는 경향이 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 대변 무른정도(stool consistency)을 개선할 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 혈청 코르티코스테론(corticosterone) 수준을 낮출 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 결장 조직에서의 TNF-α 수준을 감소시킬 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 결장 조직에서 세포 접합 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다.
상기 조성물을 투여한 결과, 대상체에서의 대변 무른정도 수치를 낮추어 대변 무른정도를 높일 수 있다. 또한, 상기 조성물을 투여한 대상체의 대변에서 L. paracasei 가 상기 조성물을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 현저히 많이 발견된다.
상기 조성물을 투여한 결과, 대상체에서의 혈청 코르티코스테론 농도를 낮추고, TNF-α 수준을 감소시키며, 세포 접합 단백질의 발현을 현저히 증가시킬 수 있다.
다른 일 양상은 락토바실러스 파라카세이 및 천년초 추출물을 유효성분으로 포함하는 과민성장증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 과민성장증후군을 예방, 개선, 또는 치료하기 위한 식품, 건강기능식품, 식이보충제, 또는 의약품으로 제공될 수 있다.
과민성대장증후군은 복부불편감과 배변양상의 변화, 이 두가지가 특징적인데, 유산균과 천년초 혼합물인 상기조성물은 배변양상을 유의한 정도로 정상화시키는 효과가 있는바, 대장질환 중에서도 특히 과민성대장증후군의 예방, 개선 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.
상기 조성물은 다른 대장 질환 예컨대 염증성 장 질환의 예방, 개선, 또는 치료를 위한 식품, 건강기능식품, 식이보충제, 또는 의약품으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 장 질환은 크론병(Crohn's disease, CD), 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC), 기타 원인이 명확히 밝혀지지 않았지만 유전적 소견, 면역과 환경적 요인 및 일부 미생물(병원균)에 의해 발병하는 질환을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 예를 들어, 정제, 환제, 분제, 엘릭서제, 현탁제, 에멀젼, 액제, 시럽제, 에어로졸, 또는 연질 및 경질 젤라틴 캡슐제로 제형화될 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오스, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오스, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 우유, 요플레 등의 각종 낙농제품, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등의 식음료, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 과자류 등의 스낵류를 포함하여, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
다른 일 양상은 락토바실러스 파라카세이 및 천년초 추출물을 유효성분으로 포함하는 과민성장증후군 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "건강기능식품"은 인체에 유용한 성분이나 원료를 제조, 가공한 식품을 말한다. 건강기능식품은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 제조된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치료(treatment)"는 숙주에 영향을 미치는 병적인 증상을 개선시키는 것을 의미한다. 용어 "개선"은 상기 식품 조성물 예컨대 건강기능식품의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 용어 "예방"은 상기 조성물의 투여(또는 도포)로 질환의 발생을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "포함하는"의 표현 및 형태는 임의의 변형 또는 부가를 배제하도록 본 발명을 제한하지 않는다. 또한, 본 명세서에서 "포함하는"이라는 용어로 기술되었지만, 본 명세서에 기재된 방법, 물질 및 조성물은 "본질적으로 이루어진" 또는 "이루어진"으로 기술될 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유효성분으로 포함"은 목적하는 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "내지"는 범위의 종점 및 이들 사이의 모든 중간점을 포함한다. 이 기술분야의 기술자는 수치적 양의 편차가 가능하다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 명세서 또는 청구의 범위에서 수치가 언급될 때마다, 그러한 수치 또는 대략 이러한 수치에 관한 부가적인 값 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 이해된다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 이하 기술된 과정은 각 단계 중 일부가 생략되거나, 혹은 반복해서 수행될 수 있으며, 경우에 따라서는 각 단계의 순서가 적절히 변경될 수도 있다.
[실시예]
본 연구에서는 Lactobacillus paracasei 와 천년초 추출물을 주성분으로 포함하는 신바이오틱스의 과민성장증후군 (IBS) 개선 효과를 생쥐모델을 사용하여 증명하였다.
실험 방법
(1) 세균 균주 및 재료
프로바이오틱스(probiotics)로 L. paracasei DKGF 1을 사용하고, 프리바이오틱스(prebiotics)로 O. humifusa 추출물을 사용하였다.
L. paracasei DKGF 1을 김치에서 분리하여 37℃ MRS (Man, Rogosa, and Sharpe; Difco Laboratories, USA) 에서 배양 및 유지하였다.
천년초라고 불리는 O. humifusa 은 한국의 남부 해안에서 널리 재배되고 있다. 수확된 Opuntia의 줄기를 세척, 동결 건조, 및 분쇄하여 재료로 하였다. 60-80℃ 온수에서 12시간 동안 3회 반복 추출한 후에, 프리바이오틱스 샘플을 수득하였다 (GF FERMENTECH에서 제조).
말토덱스트린, 프로바이오틱스, 및 프리바이오틱스는 GF FERMENTECH (GF FERMENTECH Ltd, Chungcheong, Korea)에서 제조하여 제공하였으며, 증류수에 녹여 샘플을 제조하였다.
(2) 래트 및 연구 디자인
8주령 수컷 Wistar 래트 (무게: 350 ± 50 g) (Oriental Bio Co, Seongnam, Korea)를 무균 환경에서 유지하였다. 동물을 12시간 동안 플라스틱 케이지에 넣고, 일정한 온도 및 습도에서 12시간 암기(dark cycle)로 하였고, 음식과 물에 자유롭게 접근하게 했다.
순응 1주 후, 래트를 다음과 같이 대조군, 제1 처리군, 제2 처리군, 및 제3 처리군의 각 그룹에 다섯 마리씩 무작위로 나누었다.
대조군 [말토덱스트린];
제1 처리군 [말토덱스트린 + L. paracasei (1 × 1010 cfu/g)];
제2 처리군 [말토덱스트린 + L. paracasei (1 × 1010 cfu/g) + Opuntia 추출물 (10.0 mg%, w/w)];
제3 처리군 [말토덱스트린 + L. paracasei (1 × 1010 cfu/g) + Opuntia 추출물 (30.0 mg%, w/w)]
도 1은 본 명세서에서의 연구 디자인을 나타낸다.
연구 기간 동안 래트의 체중을 매일 점검하고, 매주 마지막 날에는 대변 무른정도(stool consistency) 및 혈청 코르티코스테론(corticosterone) 수준을 평가하였다.
일차 결과는 대변 무른정도 이었고, 3 등급 점수 (0, normal; 2, loose; and 4, diarrhea)를 사용하여 평가하였다. 실험 기간이 끝날 때, 결장(colon) 조직의 대변 미생물, 염증성 사이토카인 수준, 및 세포 접합 단백질(tight junction protein)의 발현을 조사하였다.
(3) 통계 분석
데이터는 평균 ± 평균 표준 오차 (SEM)로 표현되고 GraphPad Prism 5 소프트웨어 (GraphPad, San Diego, CA, USA)를 사용하여 분석되었다. 체중은 이원(two-way) 분산 분석 (ANOVA)에 이어 post-hoc 테스트를 사용하여 분석되었다. 일원(one-way) ANOVA에 이어 Tukey post-hoc 테스트를 사용하여 결장 (colon) 조직에서 대변 무른정도, 혈청 코르티코스테론, 염증 매개체, 및 세포 접합 단백질 발현을 분석하였다.
P-value < 0.05 가 유의한 것으로 간주되었다. 알파 다양성의 유의한 차이는 Wilcoxon rank-sum 테스트를 사용하여 계산되었다. unweighted UniFrac 메트릭스를 사용하여 베타 다양성을 계산하였다.
시험예 1: 체중 측정, 대변 무른정도 평가 및 미생물 분석
(1) 체중 분석
총 4주의 연구 기간 동안 래트의 체중을 매일 점검하였다. 도 2는 체중 분석 결과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM (n = 5/군)으로 표시된다. post-hoc Bonferroni 정정과 이원 ANOVA를 사용하여 측정한 결과, 4개의 군 중 체중에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
도 2에서와 같이, 모든 군에서 실험 기간 동안 체중이 꾸준히 증가하였다. 경구 투여된 모든 샘플은 군 간에 유의한 차이를 보이지 않았다. 실험 기간 끝에, 모든 군에서의 래트 체중이 1.2% 증가한 것으로 나타났다(대조군: 396.4±9.7 g; 제1 처리군: 434.0±16.9 g; 제2 처리군: 422.4±7.9 g; 및 제 3처리군: 405.0±8.9 g, p = NS).
(2) 대변 무른정도 평가
총 4주의 연구 기간 동안 매주 마지막 날에는 래트의 대변 무른정도를 평가하였다. 대변 무른정도는 3단계로 표시하며, 0은 정상, 2는 무른변, 4는 설사변으로 판단하였다. 치료군의 대변 무른정도을 대조군에 비교하여 판단하였다.
도 3은 대변 무른정도 점수를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM (n = 5/군)으로 표시된다. *은 일원 ANOVA 및 Tukey 테스트를 사용하여 결정된 유의한 차이를 나타낸다. *p-value < 0.05, **p-value < 0.01, ***p-value < 0.001.
4주째에 모든 처리군은 대조군보다 대변 무른정도 점수가 더 낮았다(대조군: 3.8; 제1 처리군: 2.2; 제2 처리군: 0.2; 제3 처리군: 0, 모두 p < 0.001).
도 3에서와 같이, 신바이오틱스 군(제2 처리군 및 제3 처리군)은 제1 처리군 보다 점수가 낮았다(제1 처리군: 2.2; 제2 처리군: 0.2; 제3 처리군: 0, p < 0.001). 또한, 3주차에 모든 처리군은 대조군보다 유의하게 낮은 점수를 보였다(대조군: 1.8; 제1 처리군: 0.4; 제2 처리군: 0.2; 제3 처리군: 0.2, 모두 p < 0.01).
이러한 결과는 대변 무른정도를 향상시키는 L. paracasei의 효능을 보여준다. 또한, 천년초 (Opuntia) 추출물이 L. paracasei의 효과를 향상시킬 수 있음을 보여준다.
(3) 대변 샘플 수집 및 미생물 분석
4주째 마지막 날에 대변 샘플을 수집하고, 대변 샘플로부터 얻은 미생물을 분석하였다. 수집된 대분 샘플은 게놈 DNA (gDNA)수출까지 -80℃까지 보관하였다. 토양(Soil)용 FastDNA SPIN 키트 (no. 116560200; MP Biomedicals, Solon, OH)를 사용하여 DNA를 추출하였다. Illumina MiSeq 플랫폼 ChunLab Inc. (한국, 서울)을 사용하여 DNA 서열을 분석하였다.
도 4는 대변 미생물 분석 결과를 나타낸다. 도 4에서 (A)는 L. paracasei의 상대적 풍부도(%)를 나타내고, (B)는 ACE에 의해 제시된 알파 다양성 (alpha-diversity)을 나타내고, (C)는 Good's coverage의 라이브러리를 나타내고, (D)는 unweighted UniFrac distance에 기반한 UPGMA 클로스터링을 나타낸다. 상자는 사분 범위 (IQR)를 나타내고, 평균 값은 상자 안에 선으로 표시되며, whisker는 1.5 × IQR 내에서 가장 극단적인 값으로 확장되며, 특이치(outlier)는 십자(cross)로 표시된다. *은 Wilcoxon rank-sum test를 사용하여 결정된 유의한 차이를 나타내고, *p-value < 0.05이다.
도 4에서와 같이, 대변 샘플에서 L. paracasei의 상대적 풍부도 (relative abundance)가 대조군 보다 처리군에서 점진적으로 더 높은 것으로 밝혀졌다(p < 0.05). 그러나, 알파 및 베타 다양성과 관련하여, 대조군과 처리군 사이에 유의한 차이가 나타나지 않았다.
시험예 2: 혈청 코르티코스테론 수준 분석
매주 마지막 날에 혈액 샘플에서 혈청 코르티코스테론을 측정하였다. 10 μL의 EDTA를 포함하는 1.5 mL 미세 원심분리 튜브에 대략 500 μL의 전혈을 수집하였다. 냉장 원심 분리기에서 4℃ 10분 동안 원심 분리하여 혈청을 수득하고, 추가 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다. 시판 코르티코스테론 ELISA 키트 (Arigo, ARG80652, Hsinchu, Taiwan, China)를 사용하여, 제조사의 지시에 따라 혈청 코르티코스테론 수준을 측정하였다. 마이크로타이터 플레이트 리더 (microtiter plate reader)를 사용하여 450 nm에서 분광 광도법으로 흡광도를 측정하였다. 코르티코스테론의 최소 검출 농도는 대략 6.1 ng/mL이었다. 모든 샘플을 이중으로 시험하였다.
도 5는 혈청 코르티코스테론 수준을 나타낸다. 1시간 동안 구속 (restraint) 스트레스를 준 후, 코르티코스테론 수준 수준을 매주 측정하였다. 결과는 평균 ± SEM (n = 5/군)으로 표시된다. *은 일원 ANOVA 및 Tukey 테스트를 사용하여 결정된 유의한 차이를 나타낸다. *p-value < 0.05, **p-value < 0.01, ***p-value < 0.001.
도 5에서와 같이, 4주차에 제3 처리군은 대조군보다 혈청 코르티코스테론 수준이 유의하게 낮았다(대조군: 88.9 ng/ml; 제3 처리군: 35.5 ng/ml, p < 0.05). 신바이오틱스를 투여받은 제2 처리군 및 제3 처리군은 프로바이오틱스만을 투여받은 제1 처리군보다 혈청 코르티코스테론 수준이 더 낮았다(제1 처리군: 108.3 ng/ml; 제2 처리군: 55.0 ng/ml; 제3 처리군: 35.5 ng/ml, p < 0.05).
3주차에, 모든 처리군은 대조군 보다 혈청 코르티코스테론 수준이 더 낮았다 (대조군: 141.0 ng/ml; 제1 처리군: 40.2 ng/ml; 제2 처리군: 37.3 ng/ml; 제3 처리군: 19.9 ng/ml, p < 0.001). 그러나, 2주째까지 혈청 코르티코스테론 수준은 대조군과 비교하여 처리군에서 더 낮지 않았다.
시험예 3: 염증 매개체 수준 평가
결장 조직에서 인터루킨 (IL)-1β/IL-1F2, IL-6, IL-10, 인터페론 (IFN)-γ, 및 종양 괴사 인자-α (TNF-α)를 포함하는 염증 매개체의 수준을 Rat premixed Multi-Analyte kit (R&D Systems Europe, Ltd.)을 사용하여 측정하였다. 시약 및 표준 물질은 제조자의 지시에 따라 제조되었다. 플레이트를 MasterPlex QT2010 (MiraiBio, Hitachi, CA, USA)를 사용하여 보정된 Luminex® 100/200 리더에서 분석하였다. 플레이트 판독 값으로부터 농도를 결정하고 pg/ml로 표시하였다.
도 6은 염증 매개체의 분석을 나타낸다. 도 6에서, (A)는 TNF-α, (B)는 IL-1β/1F2, (C)는 IL-6의 분석을 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM (n = 5/군)으로 표시된다. *은 일원 ANOVA 및 Tukey 테스트를 사용하여 결정된 유의한 차이를 나타낸다. *p-value < 0.05, **p-value < 0.01, ***p-value < 0.001.
도 6(a)에서와 같이, 모든 처리군은 대조군보다 결장 조직에서 더 낮은 TNF-α 수준을 보여주었다(모두 p < 0.001). 그러나, 도 6(B) 및 (C)에서와 같이 IL-1β/IL-1F2 및 IL-6 수준과 관련하여, 처리군과 대조군 사이에 차이가 없었다. 본 연구에서는 IL-10 및 IFN-γ가 검출되지 않았다.
시험예 4: 결장 조직에서 세포 접합 단백질(tight junction protein) 발현 측정
세포 접합 단백질의 유형인 Claudin-1 및 zona occludens-1 (ZO-1)의 발현을 면역 조직 화학 (ICH)을 사용하여 측정하였다. 장 조직을 4 μm 두께의 섹션으로 슬라이스 하고, 자일렌 (xylene)에서 탈 파라핀화하고, 등급 알코올로 재수화시키고, 0.01 M 인산 완충 식염수 (PBS; pH 7.4)로 옮겼다. 1 X 구연산염 완충액을 사용하여 열 유도된 에피토프 (heat-induced epitope) 검색을 수행하였다. 상기 섹션을 무혈청 차단제 (Dako)로 처리하여 121℃에서 3분 동안 비특이적 결합을 차단하였다. 숨겨진 항원 에피토프를 나타내기 위해서, PBS 중 3% 내인성 과산화효소로 10분 동안 실온에서 차단하였다. PBS 완충액으로 세척한 후, 비특이적 결합을 차단하기 위해 상기 섹션을 실온에서 20분 동안 무혈청 차단 용액 (Dako)으로 처리하였다. 이어서, 상기 섹션을 1차 항체 [1:100 또는 1:500 토끼 폴리클로날 항-클로딘-1 (polyclonal anti-claudin-1) (ab140349) 또는 토끼 모노클로날 항-ZO-1 (monoclonal anti-ZO-1) (ab221547)]으로 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 이어서, 마우스 IgG (Dako) 또는 토끼 IgG (Dako)에 대한 horseradish peroxidase P-표지된 중합체 접합된 이차 항체와 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이션 하였다. 복합체는 디아미노벤지딘 (diaminobenzidine: DAB)을 사용하여 가시화하였다. 핵은 메이어의 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin)으로 가볍게 염색되었다.
장 점막 (gut mucosal)의 스트레스 반응 사이의 연관성을 확인하기 위해, 결장 조직에서 Claudin-1 및 ZO-1의 발현을 조사했다.
도 7은 세포 접합 단백질의 발현 분석 결과를 나타낸다. 도 7은 면역 조직 화학 분석에 따른 결과를 나타내며, 면역 조직 화학적 분석 동안 얻어진 결장에서 (A) Claudin-1 및 (B) ZO-1 발현을 보여주고 (배율, 200×; a 대조군; b 제1 처리군; c 제2 처리군; d 제3 처리군); (C) Claudin-1 및 (B) ZO-1 발현을 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM (n = 5/군)으로 표시된다. *은 일원 ANOVA 및 Tukey 테스트를 사용하여 결정된 유의한 차이를 나타낸다. *p-value < 0.05, **p-value < 0.01, ***p-value < 0.001.
도 7 (A) 및 (C)에서와 같이, 대조군 보다 3가지 처리군 모두에서 Claudin-1 발현이 더 높았다(P < 0.001). 또한, 도 7 (B) 및 (D)에서와 같이, 대조군 보다 처리군 모두에서 ZO-1 발현이 더 높았다(P < 0.001).
약어
EtOH (ethanol); IHC (immunohistochemistry).
ANOVA (analysis of variance); SEM (standard error of the mean).
ACE (abundance based coverage estimator); UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean).
IL (interleukin); TNF-α (tumor necrosis factor-α).
H&E (hematoxylin and eosin); ZO-1 (zona occludens-1).
Claims (15)
- 기탁번호 KCTC13877BP인 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) DKGF1 및 천년초(Opuntia humifusa) 추출물을 유효성분으로 포함하는 신바이오틱스의 과민성장증후군(Irritable bowel syndrome: IBS) 예방 또는 개선용 식품용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 천년초 추출물은 천년초의 줄기, 뿌리, 또는 열매 추출물인 것을 특징으로 하는 식품용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 천년초 추출물의 추출용매는 물, 또는 C1 내지 C4의 직쇄 또는 분지형 알코올인 것을 특징으로 하는 식품용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 천년초 추출물은 온수로 추출한 것을 특징으로 하는 식품용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 천년초 추출물을 5 내지 60 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 천년초 추출물을 10 내지 30 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 락토바실러스 파라카세이는 발효 식품에서 분리한 것을 특징으로 하는 식품용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 말토덱스트린을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 식품용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 장내 유익균의 증식을 촉진하고 장내 유해균의 증식을 억제함과 동시에, 이를 위해 필요한 영양분을 함께 제공하는 신바이오틱스 조성물인 것을 특징으로 하는 식품용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 대변 무른정도(stool consistency)을 개선하는 것을 특징으로 하는 식품용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 혈청 코르티코스테론(corticosterone) 수준을 낮추는 것을 특징으로 하는 식품용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 결장 조직에서의 TNF-α 수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는 식품용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 결장 조직에서 세포 접합 단백질의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 식품용 조성물.
- 기탁번호 KCTC13877BP인 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) DKGF1 및 천년초(Opuntia humifusa) 추출물을 유효성분으로 포함하는 과민성장증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 기탁번호 KCTC13877BP인 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) DKGF1 및 천년초(Opuntia humifusa) 추출물을 유효성분으로 포함하는 과민성장증후군 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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