KR20230116309A - 톨-유사 수용체 7 효능제를 유효성분으로 포함하는 구제역바이러스 억제용 조성물 및 이를 포함하는 아쥬반트 조성물 또는 구제역 백신 조성물 - Google Patents

톨-유사 수용체 7 효능제를 유효성분으로 포함하는 구제역바이러스 억제용 조성물 및 이를 포함하는 아쥬반트 조성물 또는 구제역 백신 조성물 Download PDF

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이경민
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Abstract

본 개시는 톨-유사 수용체 7 효능제를 유효성분으로 포함하는 구제역바이러스 억제제 및 이를 포함하는 아쥬반트 조성물 또는 구제역 백신 조성물에 관한 것으로, 본 개시에 따른 구제역바이러스 억제제 및 이를 포함하는 아쥬반트 조성물 또는 구제역 백신 조성물은 접종 초기부터 방어 항체를 신속하게 유도할 뿐 아니라, 다양한 인터페론과 사이토카인을 접종 초기부터 지속적으로 유도하여 항바이러스와 효과와 아쥬반트 효과를 복합적으로 발휘할 수 있다.

Description

톨-유사 수용체 7 효능제를 유효성분으로 포함하는 구제역바이러스 억제용 조성물 및 이를 포함하는 아쥬반트 조성물 또는 구제역 백신 조성물 {A composition for inhibiting foot-and-mouth disease virus comprising toll-like receptor 7 as an active ingredient, and an adjuvant composition or foot-and-mouth disease vaccine composition comprising the same}
본 개시는 구제역바이러스 억제용 조성물 및 이를 포함하는 아쥬반트 조성물 또는 구제역 백신 조성물에 관한 것이다.
구제역(Foot-and-mouth disease; FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스 수포성 질병으로 빠른 복제와 빠른 전파력이 특징이다. 병원체는 단일 가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데과(Piconaviridae)의 아프소바이러스(Apthovirus) 속에 속하며 7개의 다른 혈청형(A, O, C, Asia1, SAT1, SAT2, SAT3)으로 분류되고 있다.
구제역바이러스는 발생 초기의 전파억제가 매우 중요함에도 불구하고 현재 사용되고 있는 구제역바이러스 불활화 백신은 돼지에 접종했을 경우, 평균 7일 이후 구제역바이러스 감염에 대한 방어능이 형성된다(1). 돼지의 경우 배출하는 바이러스 양이 소보다 월등히 많고, 면역형성능이 소보다 떨어지는 현상이 관찰되고 있어, 구제역 백신 접종 초기에는 감염에 더욱 취약해 질 수 밖에 없다. 따라서 이에 대한 대비책으로 구제역 백신과 항바이러스제의 병용 연구들이 활발히 수행되어 왔다(2-5). 항바이러스제의 직접적인 바이러스 증식 억제 효과와 빠르고 지속적인 면역항체 유도가 동시에 일어날 수 있다면 구제역바이러스에 대한 방어에 매우 효과적인 전략일 수 있다.
구제역바이러스는 인터페론에 매우 민감한 것으로 알려져 있어 구제역바이러스에 대한 항바이러스제로서 다양한 형태의 인터페론이 제시되어 왔다(6-10). 또한 리바비린(ribavirin), 구아니딘(Guanidine)-HCl, 6-아자우리딘(azauridine)이 항바이러스 화학작용제로 제안되었고, 이러한 화학작용제가 구제역바이러스의 증식에 관여하는 단백질을 억제하는 것으로 알려져 있다(11-13).
인터페론 유도제를 구제역바이러스 억제제로 사용하려는 일부 시도가 있었으나, 일부 연구에서만 구제역바이러스 억제 효과가 있는 것으로 보고되었다(14, 15).
베사톨리모드(Vesatolimod; GS-9620)는 합성된 디하이드로프테리디논(dihydropteridinone) 유도체이며, 경구투여시 TLR7(toll-like receptor 7) 효능제(agonist)로 작용하는 것으로 알려져 있다(16). TLR7 효능제는 형질세포양 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cells; pDC)를 자극하고 pDC에서 인터페론(IFN) 알파와 같은 I형 IFN의 분비를 상승시켜 항원제시(antigen-presenting)를 촉진하는 것으로 보고되었다(17). GS-9620은 사람과 실험동물에서 경구로 투여시에 인터페론-자극 유전자(interferon-stimulated gene; ISG)의 의 발현을 유도하여 B형 만성 간염 바이러스를 억제하는 것으로 보고된 바 있다(16, 18, 19). GS-9620의 항바이러스 효과는 그 이외에도 인간 간염 바이러스 B형(HBV), 인간 간염 바이러스 C형(HCV), 인간면역결핍 바이러스(HIV), 및 엔테로바이러스 71(EV71)과 같은 인간 질병에서 보고되었다(20-22).
공개특허 제10-2021-0055310호에서는 대장균에서 발현시킨 GS-9620의 에피토프 단백질만을 투여하여, 접종 후 28일째의 방어 효과에 대해 확인한 결과를 제시하고 있으나, 톨-유사 수용체 7 효능제를 구제역 불활화 백신과 함께 사용할 경우, 구제역에 대한 초기 방어 효과를 증가시킬 수 있는지 여부에 대해서는 구체적으로 밝히고 있지 못하다. 따라서, 구제역바이러스의 전파 매개체인 돼지와 같은 목적 동물에서의 효능은 증명되어야 하는 채로 여전히 남아있다.
따라서, 백신 접종 초기부터 중화항체가를 증가시킬 수 있고, 종래 구제역 백신, 오일 아쥬반트와 혼합하여 접종하였을 때에도 우수한 면역증강 효과를 나타내는 항-바이러스 활성 물질 및 이를 포함하는 백신에 대한 요구는 여전히 존재한다.
1. 공개특허 제10-2021-0055310호 (공개일: 2021.5.17.)
본 개시는 전술한 당업계의 요구를 해결하기 위해 안출된 것으로, 접종 초기부터 방어 항체 유도 효과가 우수하고, 종래 구제역 백신 또는 오일 아쥬반트와 혼합하여 사용시에도 안전하고 우수한 면역증강 효과를 나타내는 구제역바이러스에 대한 억제용 조성물 및 이러한 조성물을 포함하는 아쥬반트 조성물 또는 구제역 백신 조성물을 제공하고자 한다.
따라서, 본 개시는 구제역바이러스-매개 질환을 예방 또는 치료하는 데 사용하기 위한 약제학적 또는 수의학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 개시는 구제역 발생시 종래 백신과 혼합하여 또는 병용하여 초기 방역에 사용할 수 있고/거나 구제역바이러스 감염 후 전파방지를 위한 목적으로 사용할 수 있는 약제학적 또는 수의학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명자들은 항바이러스 활성을 나타내는 물질들 중에서, 톨-유사 수용체 7 효능제가 접종 초기부터 목적 동물에서 구제역바이러스에 대한 방어 항체 유도 효과가 우수하고, 종래 사용되어 온 구제역 불활화 백신과 혼용시에도 신속하게 구제역바이러스 억제 활성을 나타낼 뿐 아니라, 장기간 면역력을 제공할 수 있다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 개시는 톨-유사 수용체 7 효능제를 유효성분으로 포함하는 구제역바이러스 억제용 조성물을 제공한다.
본 개시는 톨-유사 수용체 7 효능제를 유효성분으로 포함하는 구제역바이러스 억제제 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 돼지 접종용 백신 조성물을 제공한다.
본 개시는 톨-유사 수용체 7 효능제 및 오일 아쥬반트를 유효성분으로 포함하는 구제역바이러스 억제용 아쥬반트 조성물을 제공한다.
본 개시에 따른 구제역 백신 조성물은 불활화된 구제역바이러스 백신 성분, 톨-유사 수용체 7 효능제 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다.
본 개시에 따르면, TLR7 효능제는 다른 구제역바이러스 억제제, 구제역 백신 등의 병행 처리 없이 단독으로도 구제역바이러스에 대한 초기 중화항체를 유도하였으며, 구제역바이러스 감염에 대한 방어 효과를 증진시켰다.
본 개시에 따른 TLR7 효능제는 구제역바이러스 억제제로서 목적 동물, 특히 돼지에서 우수한 초기 방어 항체 유도 효과를 나타내므로, 구제역바이러스 억제 및/또는 구제역바이러스-매개 질환 또는 증상을 치료하기 위한 아쥬반트 조성물 및 구제역바이러스 백신 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 개시에 따른 TLR7 효능제를 포함하는 백신 조성물은 종래 사용되어 온 불활화 구제역 백신과 함께 상시 접종 백신으로 사용할 수 있을 뿐 아니라, 목적 동물에 접종 시 단기간 내에 높은 항체가를 유도할 수 있으므로, 구제역 발생시 현장에서 긴급 백신으로서 활용 가치가 높다.
도 1은 용량에 따른 돼지세포에서의 톨-유사 수용체 7 효능제(GS-9620)의 구제역바이러스 증식 억제효과를 확인한 그래프이다. LFBK 세포에 농도별로 GS-9620과 리바비린(양성대조)을 처리한 뒤 24시간 후 약제를 제거하고 100 TCID50의 구제역바이러스(O/SKR/Boeun/2017)을 접종하였다. 접종 48시간 후 상층액을 채취하여 RNA을 추출하고 구제역 유전자의 증식 정도를 측정하였다. 통계학적 차이는 unpaired t-test를 이용하여 분석하였다(* P<0.05, ** P<0.01).
도 2는 마우스에서의 톨-유사 수용체 7 효능제(GS-9620)의 바이러스 억제 효과를 확인한 그래프이다. 7주령 C57BL/6 마우스에 5 ㎎/㎏(A) 또는 10 ㎎/㎏(A,B) 용량으로 GS-9620 또는 구제역바이러스 증식 억제효과가 알려진 리바비린 (Ribavirin, 양성대조)을 복강으로 접종(intraperitoneal injection)하였다. 음성대조로는 PBS 100 ㎕를 복강 접종하였다. 16시간 후 250 LD50의 구제역바이러스 O/VIT/2013 바이러스를 공격접종하였다. 공격접종 후 7일간 마우스의 생존률을 관찰하였다.
도 3은 톨-유사 수용체 7 효능제(GS-9620)를 처리한 세포에서 인터페론 생산 유도 효과를 확인한 결과를 나타낸다. LFBK 세포에 625 μM의 GS-9620을 처리한 뒤 처리 48 또는 72 시간 후 상층액에서 돼지 인터페론 알파 단백질을 정량하였다. 통계학적 차이는 unpaired t-test를 이용하여 분석하였다(** P<0.01, *** P<0.005).
도 4는 톨-유사 수용체 7 효능제(GS-9620)를 처치한 마우스에서의 사이토카인 생산 유도 효과를 확인한 결과를 나타낸다. 7주령 Balb/C 마우스에 10 ㎎/㎏ 용량의 GS-9620을 복강으로 접종(Intraperitoneal injection)하였다. 접종 0, 6, 16, 24시간 후 채혈하여 혈청을 분리하였고, 마우스 IFN-α ELISA 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 마우스 IFN-γ ELISA 키트(Mybiosource, San Diego, CA, USA), 마우스 IL-12 ELISA 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), IP-10(CXCL10) 마우스 ELISA 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), IL-6 마우스 ELISA 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 혈액내 사이토카인을 정량하였다.
도 5는 톨-유사 수용체 7 효능제(GS-9620)와 오일 아쥬반트를 혼합하여 접종한 경우의 구제역바이러스에 대한 방어 효과를 확인한 결과를 나타낸다. 7주령 C57BL/6 마우스에 구제역바이러스 공격접종 1, 3, 5일 전에 ISA 206(Seppic, France) 오일 아쥬반트(양성대조) 또는 GS-9620(10 ㎎/㎏)과 ISA 206 혼합물(1:1 (v/v)로 혼합하여 100 ㎕/마리)을 근육 접종(intramuscular injection)하였다. 음성대조군에는 공격접종 1일전에 PBS를 100μl 근육 접종하였다. 공격접종은 250LD50의 구제역바이러스 O/VIT/2013 바이러스로 실시하였다. 공격접종 후 7일간 마우스의 생존률을 관찰하였다.
도 6은 톨-유사 수용체 7 효능제(GS-9620)와 구제역 불활화 백신을 혼합하여 투여한 경우, 초기 방어 효과 및 중화항체 유도 효과를 확인한 결과를 나타낸다. (6A) 7주령 C57BL/6 마우스에 구제역 공격접종 1, 3, 5일 전에 구제역바이러스 불활화 시험백신 또는 GS-9620과 구제역 불활화 시험백신(구제역 항원 0.2 ㎍, ISA 206, 10% Al(OH)3 포함) 또는 근육 접종(Intramuscular injection)하였다. 음성 대조군으로는 공격접종 1일 전에 PBS 100 ㎕를 근육 접종하였다. 공격접종은 250LD50의 구제역바이러스 O/VIT/2013 바이러스로 실시하였다. 공격접종 후 7일간 마우스의 생존률을 관찰하였다. (6B) 마우스에 구제역바이러스 불활화 시험백신(구제역 항원 1 ㎍, ISA 206, 10% Al(OH)3 포함) 또는 10 ㎎/㎏ 용량의 GS-9620과 구제역 불활화 시험백신 혼합물을 근육 접종(Intramuscular injection)하였다. 접종 1, 2, 3, 4주 후 채혈하여 혈청을 분리하고 중화항체가를 측정하였다. 통계학적 차이는 unpaired t-test를 이용하여 분석하였다(* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.005).
도 7은 톨-유사 수용체 7 효능제(GS-9620)를 혼합한 구제역 불활화 백신을 접종한 돼지에서의 증대된 항체 유도 효과를 확인한 결과를 나타낸다. 생후 9주령의 구제역 항체 음성 돼지에 구제역 불활화 시험백신(구제역 O형 항원 10 ㎍, ISA 206, 10% Al(OH)3 포함) 또는 5 mg/dose(약 200 ㎍/kg) 용량의 GS-9620과 구제역 불활화 시험백신 혼합물을 근육 접종(intramuscular injection)하였다. 2차 백신접종 없이 접종 1, 3, 5, 7주 후 채혈하여 혈청을 분리하고 중화항체가(A)와 VDpro FMDV Type O Ab b-ELISA(Median Diagnostics Inc., Republic of Korea)를 이용하여 구조단백질 항체수준(B)을 측정하였다. 중화항체가는 OIE 양성기준인 45배를 cut-off(점선)로 하고, 구조단백질 항체 수준은 0.4(점선) 이상을 양성으로 판단하였다. 통계학적 차이는 unpaired t-test를 이용하여 분석하였다(* P<0.05, ** P<0.01).
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서에서 길이, 면적, 부피, 시간(기간), 농도, 함량 등을 표현하는데 사용된 용어 "약"은 해당 수치 또는 수치 범위에서 최대 ±10%, 일반적으로는 ±5%의 허용오차가 존재한다는 것을 의미한다.
일 양태에서, 본 개시는 톨-유사 수용체 7 효능제를 유효성분으로 포함하는 구제역바이러스 억제용 조성물에 관한 것이다.
본 개시에 따른 "톨-유사 수용체 7 효능제" 또는 "TLR7 효능제"는 돼지, 특히 구제역 백신 1차 접종 시기의 돼지, 주로 생후 8 내지 10주의 돼지에서 접종 초기부터 높은 중화항체가를 유도하여, 구제역바이러스에 대한 방어 활성이 우수하며, 구제역바이러스에 대한 항바이러스제로서 유용하다.
본 개시에 따른 톨-유사 수용체 7 효능제로는 TLR7 효능제로 분류될 수 있는 화합물이면 제한없이 사용될 수 있으나, 구체적으로 당업계에 TLR7 효능제로 공지된, 예를 들어, AZD8848, 가디퀴모드(Gardiquimod), 이미퀴모드(Imiquimod), 베사톨리모드(Vesatolimod, GS-9620), 레시퀴모드(Resiquimod, R848) 또는 이들의 조합을 포함하며, 바람직하게는 베사톨리모드 단독 또는 베사톨리모드와 임의의 다른 TLR7 효능제의 조합일 수 있다.
본 개시에 따른 TLR7 효능제는 구제역바이러스에 감염될 가능성이 있거나, 이미 감염되어 있거나, 감염된 적이 있는 대상체에서 구제역바이러스의 감염을 방지하거나, 구제역바이러스의 증식, 복제, 전파를 억제할 수 있다.
본 개시에 따른 TLR7 효능제는 투여 초기부터 중화항체 유도 효율이 높게 나타나므로, 구제역바이러스-매개 질환 또는 병태, 예를 들어, 고열, 수포(물집), 침흘림, 식욕 부진, 다리를 질질 끄는 행동을 지니거나, 이를 앓고 있거나 앓은 적이 있거나, 이에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 그러한 질환 또는 병태의 증상을 억제, 완화, 개선, 치료, 및/또는 치유하는 데 특히 유용하다.
본 개시에 따른 TLR7 효능제를 투여/접종할 필요가 있는 대상체는 구제역바이러스가 감염될 수 있는 숙주 동물, 예컨대, 소, 돼지, 염소, 양, 사슴, 낙타, 기린 등을 포함하는 발굽이 둘로 갈라진 포유동물(우제류)을 포함한다. 바람직하게는 대상체는 돼지일 수 있다.
더 구체적으로, 본 개시에 따른 아쥬반트 조성물은, 오일 기반 구제역바이러스 백신 조성물, 더 구체적으로는 오일 기반 불활화된 구제역바이러스 백신 조성물과 함께 병용 또는 혼합 사용시, 백신 조성물의 효능을 감소시키지 않을 뿐 아니라, 아쥬반트 조성물 중의 TLR7 효능제의 구제역바이러스 억제 효능을 그대로 보존할 수 있다. 그에 따라, 본 개시에 따른 아쥬반트 조성물은 접종시, 결과적으로 구제역바이러스의 증식, 복제, 전파 활성을 효과적으로 억제 내지 차단할 수 있으며, 구제역바이러스 백신 조성물의 효능을 상승 내지 증가시킬 수 있다.
본 발명의 아쥬반트 조성물은 그 특성 때문에 불활성화된 구제역바이러스(들) 상에 존재하는 항원에 반응하기 위해 면역계를 자극하도록 작용할 수 있는 하나 이상의 추가적인 물질을 더 포함할 수 있다.
이러한 추가적인 물질로는 지질, 리포솜, 선천성 면역을 유발하는 불활성화 박테리아(예를 들어, 불활성화 또는 약독화 리스테리아 모노사이토제네스), 톨-유사 수용체(TLR)를 통해 선천적 면역 활성화를 매개하는 물질 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시에 따른 아쥬반트 조성물은 당업계에서 널리 알려진 오일(또는 오일 에멀젼) 및 유화제, 겔 등을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 오일(또는 오일 에멀젼)은 ISA 201, ISA 61, ISA 50, ISA 28R, ISA 206일 수 있으나, 이로만 제한되는 것은 아니다.
본 개시에 따른 아쥬반트 조성물은 알럼(aluminum hydroxide gel) 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시에 따른 아쥬반트 조성물은 ISA 206와 Al(OH)3를 둘 다 포함하는 것이 TLR7 효능제의 효능 유지, 제형화, 안정성 등의 측면에서 유리할 수 있다.
본 개시에 따른 아쥬반트 조성물은 제제화하는데 통상적으로 사용될 수 있는 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 허용가능한 또는 편리한 투약 형태를 제조하기 위한 약물, 제제 또는 결합 분자와 같은 활성 분자로 조합되는 불활성 물질을 의미한다. 약제학적으로 허용가능한 부형제는 비독성이거나, 적어도 독성이 사용된 용량 및 농도에서 대상체에게 이의 의도된 용도를 위해 허용될 수 있는 부형제이고, 약물, 제제 또는 결합 분제를 포함하는 제형화의 다른 성분과 양립가능한 것이다.
본 개시에 따른 아쥬반트 조성물에서 TLR7 효능제는 전체 조성물 중량을 기준으로 1 내지 250mg, 바람직하게는 5 내지 200 mg의 범위로 존재할 수 있으며, 1mg 미만일 경우 목적하는 효과가 나타나지 않을 수 있다.
본 개시에 따른 아쥬반트 조성물은 경구 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 동맥내 투여, 골수내 투여, 경막내 투여, 심장내 투여, 경피 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 비강내 투여, 장관 투여, 구강 및 설하는 포함하는 국소 투여, 직장 투여, 국소 투여, 진피 투여, 점막 투여, 척추내 투여 등의 방법으로 투여될 수 있으나, 이로만 제한되지 않는다.
본 개시에 따른 아쥬반트 조성물 각각의 투여 방식에 절절한 제형으로 제제화되어 투여될 수 있으며, 제제화는 당업계에서 널리 알려져 있는 방법에 의해 달성될 수 있다.
또한, 본 발명의 아쥬반트 조성물은, 단독 접종시 또는 불활화된 구제역바이러스 백신 조성물과 혼합 접종시, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 투여 후 24시간 이내에 구제역바이러스 억제 효과를 나타낼 수 있다.
관련하여, 도 5를 참조하면, 오일 아쥬반트와 혼합하여 근육 접종하였 때, GS-9620의 구제역바이러스 억제 활성이 접종 초기부터 높게 나타남을 확인할 수 있다.
또한, 현재 국내에서 일반적으로 사용되고 있는 돼지 접종용 구제역바이러스 불활화 백신은 대부분 오일 아쥬반트를 사용한 백신임을 감안할 때, 본 개시에 따른 톨-유사 수용체 7 효능제 또는 톨-유사 수용체 7 효능제를 포함하는 구제역바이러스 억제용 조성물이 오일 아쥬반트에 혼합 사용시에도 유의한 효능을 나타내므로, 오일 아쥬반트에 기반한 모든 유형의 구제역바이러스 백신과 함께 다양한 방식, 예컨대 병용 투여, 혼합 투여, 순차 투여 방식 등으로 사용할 수 있다.
또 다른 일 양태에서, 본 개시는 톨-유사 수용체 7 효능제를 포함하는 유효량의 구제역바이러스 억제용 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 개시에 따른 백신 조성물은 구제역 발생 초기에 생후 8~10주령 돼지에서 구제역바이러스 억제하는 데 사용하기에 적합할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "유효량" 또는 "유효한 양"는 백신과 함께 투여 시에, 백신의 효과를 증대시키는 유효한 톨-유사 수용체 7 효능제 및/또는 이 효능제를 포함하는 구제역바이러스 억제제의 양을 나타낸다.
본 개시에 따른 백신 조성물에서, 톨-유사 수용체 7 효능제 및/또는 이 효능제를 포함하는 구제역바이러스 억제용 조성물은 전체 백신 조성물의 부피를 기준으로, 5 내지 50 %(v/v)의 범위로 존재할 수 있으며, 50%를 초과하면 오일 아쥬반트와 백신 항원의 water in oil in water (W/O/W) 형태로의 formulation 효율이 저하될 수 있다.
본 개시의 백신 조성물에서 톨-유사 수용체 7 효능제의 투여 농도 범위는 동물의 체내에서 독성이 발생할 위험이 없거나 최소화되는 범위로 조정될 수 있다.
본 개시에 따른 백신 조성물에서, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 목적동물(숙주동물)에 대한 안전하고 적절한 투여를 위한 모든 목적으로 약제학적으로, 또는 다른 한편으로는 수의학적으로 허용가능한 임의의 용매(용액), 분산 매질, 희석제, 완충제, 등장성 작용제, 현탁액, 콜로이드, 안정화제, 방부제, 항생제(항균제, 항진균제 등), 흡착지연제, 보조제(아쥬반트), 삽입물 등을 의미한다.
일반적으로 면역원성 물질에 대한 1종 이상의 전달 비히클(vehicle)의 사용은 제약 업계의 당업자에게 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 상용성이지 않는 한, 진단, 예방 및 치료용 조성물에서의 이의 사용이 고려된다.
희석제로는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등이 포함될 수 있고, 등장성 작용제에는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨, 락토스 등이 포함될 수 있으며, 안정화제로는 알부민이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
보조제는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 특히, 보조제로서 아쥬반트로는 광물성 겔, 예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드 겔; 표면 활성 물질, 예를 들어, 라이소레시틴; 글리코사이드, 예를 들어, 사포닌 유도체, 예를 들어, 퀼 A(Quil A) 또는 GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc., 알라바마주 버밍햄); 플루론 폴리올; 다가 음이온; 비-이온성 블록 중합체, 예를 들어, 플루론 F-127(B.A.S.F., 미국); 펩타이드; 광유, 예를 들어, 몬타나이드(Montanide) ISA-206(Seppic, 프랑스), 몬타나이드 ISA-50(Seppic, 프랑스), 카보폴(Cabopol), 암피겐, 암피겐 마크 II(Hydronic, 미국), 알하이드로겔, 오일 에멀젼(예컨대, 베이올F(BayolF)/아르라셀 A(Arlacel A)와 같은 광유와 물의 유화액), 또는 식물성 오일, 물 및 레시틴과 같은 유화제의 유화액; 명반(alum); 콜레스테롤; 프로인트(Freund) 완전 및 불완전 보조제; 블록 공중합체(CytRx, 죠지 아틀란타); SAF-M(카이론(Chiron), 캘리포니 에머리빌); 암피겐(AMPHIGEN, 등록상표) 보조제; 모노포스포릴 지질 A, 애브리딘(Avridine) 지질-아민 보조제; 대장균(E. coli) 유래 열-불안정성 장 독소(재조합 등); 콜레라 독소; 뮤라밀 다이펩타이드; IMS1313(Seppic, 프랑스); 몬타나이드 01 겔(Montanide 01 gel)(Seppic, 프랑스); 및 이들 보조제의 혼합물이 포함되나, 이로만 제한되는 것은 아니다. 본 개시에 따른 구제역바이러스 백신 조성물은 바람직하게는 보조제로서 IMS1313, ISA206, 카보폴, 및 Al(OH)3로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
유화제로는, 예를 들면 TWEEN® 또는 SPAN® 생성물 라인의 다른 생성물(각각 폴리에톡시화 소르비톨의 지방산 에스테르, 및 지방산-치환된 소르비탄 계면활성제) 및 PEG-40 피마자유 또는 다른 페길화(PEGylated) 수소화 오일과 같은 다른 용해도 개선제들을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 개시에 따른 구제역바이러스 백신 조성물은 불활화된 구제역바이러스 항원과 같은 불활화된 구제역바이러스 성분, GS-9670과 같은 톨-유사 수용체 7 효능제, 및 ISA206 및/또는 Al(OH)3과 같은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다.
본 개시에 따른 불활화된 구제역바이러스 성분은 공지의 구제역바이러스 혈청형, 구제역바이러스 백신주, 또는 구제역바이러스 단백질 항원을 공지의 방법으로 불활화 처리하여 얻을 수 있다.
본 개시에 따른 구제역바이러스 백신주로는, 공개 특허 제10-2021-0012695호(2021.02.03)에 개시된 'A/ASIA/Sea-97 유전형 구제역바이러스 백신주', 공개 특허 제10-2021-0012696호(2021.02.03)에 개시된 'O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역바이러스 백신주' 등을 사용할 수 있다.
본 개시에 따른 구제역바이러스 항원은 구제역바이러스 O 혈청형, 구제역바이러스 A 혈청형, 구제역바이러스 아시아1 혈청형, 구제역바이러스 C 혈청형, 구제역바이러스 SAT1 혈청형, 구제역바이러스 SAT2 혈청형 및/또는 구제역바이러스 SAT3 혈청형, 또는 이들의 재조합 항원 등을 포함할 수 있다.
본 개시에 따른 구제역백신 조성물은 구제역바이러스 각 혈청형에 대한 방어능을 가진 백신일 수 있으며, 상기 혈청형은 A형, O형, C형, Asia1형, SAT1형, SAT2형, SAT3형을 포함할 수 있다.
공지의 불활화 처리 방법으로는, 예를 들어 바이러스 불활화에 사용되는 BEI(Binary Ethylenimine)로 처리하거나, 포르말린, 글루타알데하이드, 가열, 조사, BPL 또는 당 분야에 공지된 다른 불활화제(불활성화제)를 사용하여 불활화(불활성화)될 수 있다.
본 개시의 불활화된 구제역바이러스 백신주의 불활화 반응은 바람직하게는 26~37℃에서 48시간 동안 이루어질 수 있으며, 가장 바람직하게는 37℃의 온도에서 24시간 동안 1차 불활화시킨 후 26℃의 온도에서 24시간 동안 2차 불활화시켜 이루어질 수 있다.
본 개시에 따른 백신 조성물에 포함되는 구제역바이러스 억제제로서 톨-유사 수용체 7 효능제 또는 톨-유사 수용체 7 효능제를 포함하는 구제역바이러스 억제용 조성물과, 불활화된 구제역 백신 성분의 혼합비율은 부피 기준으로 1:1~1:39, 더 바람직하게는 1:3~1:19일 수 있다.
본 개시에 따른 백신 조성물의 투여 방식은 경구 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 동맥내 투여, 골수내 투여, 경막내 투여, 심장내 투여, 경피 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 비강내 투여, 장관 투여, 구강 및 설하는 포함하는 국소 투여, 직장 투여, 국소 투여, 진피 투여, 점막 투여, 척추내 투여 등의 방법으로 투여될 수 있으나, 이로만 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 개시에 따른 백신 조성물은, 각각의 투여 방식에 적절한 제형으로 제제화되어 투여될 수 있으며, 제제화는 당업계에서 널리 알려져 있는 방법을 통해 이루어질 수 있다.
본 개시에 따른 구제역바이러스 백신 조성물은, 바람직하게는 도즈(dose) 당 0.5 mL 내지 3mL의 양으로 투여될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1mL 내지 2mL의 양으로 투여될 수 있다.
또한, 본 개시에 따른 구제역바이러스 백신 조성물에는 1종 이상의 추가 활성 성분(들)이 또한 개시된 백신 조성물 내로 혼입될 수 있거나 또는 이와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 개시에 따른 백신 조성물은 사이토카인(예컨대, 인터류킨, 인터페론 등)과 같은 1종 이상의 면역조절제를 더 포함할 수 있다.
본 개시에 따른 백신 조성물은 목적동물(숙주동물)로서, 인간을 제외한 포유동물에서 구제역바이러스 감염에 따른 증상을 예방, 방어, 관리 또는 치료하기 위한 백신 조성물로서 본 명세서에 개시된 백신 접종 방법으로 사용할 수 있는 단일-용량 분취량 또는 다중-용량 분취량으로 제조될 수 있고, 백신 접종은 단일 접종 또는 다회 접종을 통해 달성될 수 있다.
본 개시에 따른 백신 조성물은 통상적으로 근육내 또는 피하 경로를 통해 목적동물에게 투여할 수 있으나, 다른 투여 경로, 예를 들면, 경구 투여, 비강 투여(예컨대, 에어로졸 또는 다른 무침 투여), 경피 투여 및 비경구 투여(예컨대, 정맥주사, 복강 투여, 림프절내 투여, 피내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 직장 투여, 질 투여 또는 근육내 투여), 또는 이들 투여 경로를 조합한 경로를 포함하는 공지된 경로를 통해 투여할 수 있다. 바람직한 투여 경로는 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 안구 및 뇌로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상이고, 더욱 바람직한 투여 경로는 피하 투여 또는 근육내 투여이며, 가장 바람직한 투여 경로는 목적동물의 목 부분의 근육내 투여이다.
본 개시에 따른 백신 조성물을 일반적인 주사 제형으로 투여하는 경우, 투여대상동물(목적동물: 소, 돼지, 염소, 양, 사슴, 낙타, 기린 등)의 근육, 또는 이와 인접한 부위에 투여하되, 투여대상동물의 체중 및 건강 상태를 고려하여 지정된 투여 기간 동안 1회 이상 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
본 개시에 따른 구제역바이러스 백신 조성물의 투여 후 나타나는 면역증강 효과는 면역 매개 물질 또는 세포에 의한 것일 수 있으며, 구체적으로는 체액성 면역, 세포성 면역, 점막 면역증강 효과, 또는 이들의 조합을 포함하나, 이로만 제한되는 것은 아니다.
본 개시에 따른 구제역바이러스 백신 조성물은 투여 후 24시간 이내에 면역증강 효과를 나타낼 수 있다. 뿐만 아니라, 본 개시에 따른 구제역바이러스 백신 조성물은 투여 후 장기간, 예를 들어, 5일 이상, 7일 이상 면역증강 효과를 유지할 수 있다.
관련하여, 도 6 및 도 7을 참조하면, 본 개시에 따른 톨-유사 수용체 7 효능제를 포함하는 오일 아쥬반트 기반 구제역바이러스 불활화 백신의 경우, 접종 1주째부터 증가된 중화항체가를 나타내어 접종 초기부터 우수한 면역증강 효과를 나타냄을 확인할 수 있으며, 접종 후 면역증강 효과가 장기간 지속됨을 확인할 수 있다.
이하, 본 개시에 따른 실시형태를 실시예 및 도면을 참고하여 상세히 설명한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
재료 및 방법
1. 바이러스와 세포의 준비
LFBK 세포(porcine kidney cell)는 5% Fetal bovine serum을 함유한 Dulbecco's modified eagle medium (Thermofisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 이용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. LFBK 세포는 Plum Island Animal Disease Center(Orient, NY, USA)에서 제공받았다. 세포 접종 시험에서는 농림축산검역본부에서 2017년에 분리한 구제역바이러스 O/SKR/Boeun/2017 (Genbank accession no. MG983730)을 사용하였고, 구제역바이러스 접종시험은 농림축산검역본부의 생물안전 3등급(Bio-safety level 3) 시설에서 수행하였다.
2. 통계학적 분석
통계학적 차이를 분석하기 위한 Unpaired T-test는 GraphPad Prism Software(Ver 9.0, La Jolla, Ca, USA)를 이용하여 수행하였다.
[시험예 1] Cell proliferation assay를 이용한 유효농도(CC50) 와 세포독성(EC50) 측정
GS-9620의 구제역바이러스에 대한 항바이러스 효과를 측정하기 위하여, LFBK 세포를 well 당 1×104개로 96 well 플레이트에 깔아, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 다음날 배지를 제거하고 2배 농도로 단계적으로 희석한 GS-9620(5000 μM~2.4 μM)을 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
이 후 상층액을 제거한 뒤 50% Effective concentration(EC50)를 측정하고자 하는 플레이트에는 100TCID50의 O/SKR/Boeun/2017 바이러스를 접종하였다. 바이러스 접종 1시간 뒤 배지를 교체하고 바이러스 접종 후 24시간 동안 배양하였다.
50% Cytotoxic concentration(CC50)을 측정하고자 하는 플레이트에는 바이러스 접종 없이 배지를 교체하고 24시간동안 동일하게 배양하였다. 배양 후 상층액을 제거한 뒤 CellTiter 96 AQuoeous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 MTS assay를 실시하였고, 50%의 세포생존률이 50% 감소하거나 CPE로 인한 세포사멸이 50% 감소하는 농도를 측정하여 CC50와 EC50를 측정하였다(13).
Selectivity index는 CC50/EC50의 비율로 계산하였다. Selectivity index 가 높을수록 항바이러스 효과가 우수하다고 판단할 수 있다.
GS-9620의 세포독성과 구제역바이러스에 대한 항바이러스 효과를 알아보기 위하여 CC50 와 EC50를 측정하였다. 해당 결과는 아래 표 1에 나타나있다.
표 1. GS-9620의 세포독성과 구제역바이러스에 대한 항바이러스 효과
위 표 1로부터 확인되는 바와 같이, GS-9620은 낮은 세포독성과 우수한 바이러스 억제효과를 보유하고 있음이 관찰되었다. GS-9620의 selectivity index(CC50/EC50)는 약 650.5로 구제역 항바이러스제로 잘 알려진 리바비린(Ribavirin)(11)에 비해 약 5배 더 높게 나타나, 구제역바이러스 억제제로서 높은 효능을 발휘할 수 있다는 것을 세포 수준에서 확인하였다.
[시험예 2] Real-time RT-PCR을 이용한 구제역바이러스 증식 억제 효과 확인
LFBK 세포를 well 당 1×104개로 96 well 플레이트에 깔아 배양한 후, 다음날 2500~156.2 μM 농도의 GS-9620을 처리하였다. 24시간 후 배지를 교체하고 100 TCID50의 O/SKR/Boeun/2017 바이러스를 1시간 동안 감염시키고 배지를 교체하였다. 48 시간 후 상층액을 수거하여 바이러스 RNA를 추출하였고(MagNA Pure 96 automation system(Roche, Basel, Switzerland), MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit(Roche, Basel, Switzerland)), 실시간 RT-PCR은 이전 연구의 방법을 따랐다(23).
도 1에 나타난 바와 같이, GS-9620은 용량에 비례하여 구제역바이러스 증식억제 효과를 발휘하는 것으로 확인되었다. 또한 양성대조인 리바비린에 비하여 같은 농도에서 더 우수한 바이러스 증식효과를 나타내었다(P<0.05).
[시험예 3] 마우스에서 GS-9620의 구제역바이러스 억제 효과 확인
동물에서의 GS-9620의 구제역바이러스 억제효과를 확인하기 위하여 마우스 실험을 실시하였다. 마우스 접종 시험에는 베트남에서 도입한 시료를 이용하여 농림축산검역본부에서 분리 후 마우스에 적응시킨 구제역바이러스 O/VIT/2013 (Genbank accession no. KY492067)을 사용하였다. 7주령의 C57BL/6 암컷 마우스에 그룹당 5 마리씩, 마리 당 10mg/kg 또는 5mg/kg 용량의 GS-9620 또는 10mg/kg의 Ribavirin (구제역항바이러스 효과 양성대조) 또는 PBS를 복강접종(intraperitoneal injection) 하였다. GS-9620, 리바비린 또는 PBS의 접종은 공격접종 용량별 실험(도2의 A)에서는 공격접종 16시간 전에, 지속시간 실험(도 2의 B)에서는 공격접종 1, 3, 5일 전에 실시하였다. 공격접종을 위해 250 LD50의 O/VIT/2013 바이러스를 복강접종하였고, 7일간 마우스의 생존율을 관찰하였다.
도 2A로부터 확인되는 바와 같이, GS-9620의 구제역바이러스 억제효과는 접종 16시간만에 나타나 GS-9620으로 매우 신속한 방어가 가능함을 확인하였다. 10 mg/kg의 용량을 사용했을 때 양성대조인 리바비린은 20%의 생존률(7일차 기준)을 나타낸 반면, GS-9620에서는 마우스 생존률이 100%로 나타났다. 용량을 절반으로 줄여 25 mg/kg을 투여했을 경우에도 GS-9620은 80%의 생존률을 보여주었다(7일차 기준). 따라서 마우스 공격접종 실험에서도 GS-9620은 양성대조인 리바비린보다 우수한 항바이러스 효과를 나타내었다.
또, 도 2B로부터 확인되는 바와 같이, 10 mg/kg의 GS-9620을 투여한 경우, 투여 5일째까지 생존률이 100%으로 나타나, 지속시간 또한 우수함을 확인하였다.
[시험예 3] 돼지 세포에서 GS-9620의 인터페론 유도 활성 확인
LFBK 세포를 24 well 플레이트에 깔아 배양한 후, 다음날 625 μM 농도의 GS-9620을 처리하였다. 처리 24시간 후 배지를 교체하고, 다시 24시간(처리 48시간), 48시간(처리 72시간) 후 상층액을 수거하였다. 수거된 상층액의 돼지 인터페론 알파 단백질을 Pig IFN-α ELISA kit(PBL assay science, NJ, USA)을 이용하여 정량하였다.
도 3에서 확인되는 바와 같이, GS-9620은 돼지 세포에서 IFN-α 단백질을 성공적으로 유도하였다. 구제역바이러스는 IFN-α에 매우 민감한 바이러스로 알려져 있다(6, 25). 따라서, IFN-α 유도 효과를 나타내는 GS-9620를 비롯한 TLR-7 효능제는 구제역바이러스를 매우 효과적으로 억제할 수 있다.
[시험예 4] GS-9620의 마우스에서의 사이토카인 유도 확인(도 4)
7주령 Balb/C 마우스에 10 mg/Kg 용량의 GS-9620을 복강으로 투여(Intraperitoneal injection)하였다. 투여 0, 6, 16, 24 시점에 채혈하여 혈청을 분리하였고, mouse IFN-α ELISA kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), mouse IFN-γ ELISA kit(Mybiosource, San Diego, CA, USA), mouse IL-12 ELISA kit(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), IP-10(CXCL10) mouse ELISA kit(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), IL-6 mouse ELISA kit(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 혈액내 사이토카인을 정량하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, GS-9620을 마우스에 투여하였을 때, 세포에서 확인되었던 인터페론 알파(IFN-α) 뿐만 아니라, 인터페론 감마(IFN-γ)가 또한 유도되어 나타났다. Type I 인터페론인 IFN-α와 Type II 인터페론인 IFN-γ는 구제역 항바이러스효과가 우수한 사이토카인으로 알려져 있다(6). 뿐만 아니라, 증가가 확인된 IL-12 역시 IFN-γ 생성을 촉진하고 Natural killer(NK) cell을 활성화함으로써 항바이러스 효과를 증가시키는 것으로 알려져 있다(26-28). 뿐만 아니라, IFN-α, IL-6 는 B cell의 분화를 촉진하고, IFN-γ, IP-10, IL-12는 Th1 세포의 면역에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, GS-9620를 비롯한 TLR-7 효능제는 구제역바이러스 백신과 혼용시, 아쥬반트로서도 충분한 기능을 발휘할 수 있다(29-33).
[시험예 5] 마우스에서 불활화 시험백신과 혼합한 뒤 초기 방어 효과 확인
시험백신으로서 0.2 ㎍의 O/SKR/Boeun/2017 구제역바이러스 불활화 항원(농림축산검역본부 생산), ISA 206 오일 아쥬반트(Seppic, France), 10% Al(OH)3를 포함하는 구제역 불활화 백신을 사용하였다(24).
7주령 C57BL/6 마우스에 구제역바이러스 불활화 시험백신 또는 10mg/Kg 용량의 GS-9620과 구제역바이러스 불활화 시험백신의 혼합물을 근육 투여(Intramuscular injection)하였다. 음성 대조군에는 PBS를 100 ㎕ 복강 투여하였다. 구제역 불활화 시험백신, GS-9620과 구제역 불활화 시험백신의 혼합물, PBS의 투여를 공격 접종 16시간 전에 실시하였다. 공격접종 후 7일간 마우스의 생존률을 관찰하였다.
도 5에서 확인되는 바와 같이, 구제역 불활화 백신에 가장 많이 사용되는 오일 아쥬반트인 ISA 206만을 근육내 투여한 경우, 접종 1일 후 60%, 3일 후 20%, 5일후 0%의 생존률(공격접종 7일 후 기준)을 보인 반면, ISA 206과 GS-9620을 혼합하여 투여한 경우, 접종 1,3,5일 후 공격접종하였을 때 모두 100%의 생존률이 관찰되었다. 따라서 GS-9620를 비롯한 TLR-7 효능제는 오일 아쥬반트 ISA 206과 혼합하여 근육 투여하였을 때 구제역바이러스에 대한 방어 효과를 나타낼 수 있다.
[시험예 6] 중화항체가 측정
OIE 육지동물의 진단법 및 백신: 구제역 챕터(Manual of diagnostic tests and vaccines for Terrestrial Animals: foot-and-mouth disease, Chapter 3.1.8. Foot-And-Mouth. World Organization for Animal Health (OIE), http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.08_FMD. 2018)의 중화항체가 측정 방법을 따랐다.
도 6A로부터 확인되는 바와 같이, 오일 아쥬반트를 포함한 구제역 불활화 백신만 단독으로 접종한 경우, 접종 1일 및 3일 후 공격접종 그룹이 모두 폐사한 반면, 불활화 백신과 GS-9620을 혼합하여 접종했을 때 접종 1일 및 3일 후 생존률은 각각 100%와 80%(공격접종 7일후 기준)으로 나타났다. 접종 5일 후 공격접종한 경우 백신단독 접종그룹은 20%, 백신과 GS-9620 혼합 접종 그룹은 80%의 생존률을 나타내었다. 따라서 GS-9620을 포함한 구제역 불활화 백신은 접종 초기부터 우수한 방어 효과를 나타낼 수 있다.
또, 도 6B로부터 확인되는 바와 같이, ISA 206 오일 아쥬반트를 함유한 구제역 불활화 백신에 GS-9620을 혼합하여 접종한 경우, 백신을 단독으로 사용한 경우에 비해 중화항체가가 유의적으로 증가하였다(P<0.05). 중화항체가는 접종초기인 1주부터 4주까지 지속적으로 증가하였고, 항체가의 하락은 전혀 관찰되지 않았다. 따라서, 구제역 불활화 백신에서 GS-9620를 비롯한 TLR-7 효능제는 불활화된 구제역 백신 성분에 의해 매개되는 방어 항체의 활성을 증강시킬 뿐 아니라 이를 장시간 지속시킬 수 있다.
[시험예 7] 엘라이자를 통한 구조단백질 항체 수준 측정(도7)
구제역 O형 구조단백질 특이 항체를 측정하기 위하여 VDPro FMDV type O Ab b ELISA(Median Diagnostics Inc., Republic of Korea)를 실시하였다. 실시방법은 제조사의 설명을 따랐다. Blocking ELISA의 경우, 사용법에 따라 보정된 O.D. 값이 0.6 이하이면 양성, O.6 초과이면 음성으로 판정하지만, 해석 편의를 위해 1-corrected O.D. 로 나타내어 0.4 미만으로 음성, 0.4 이상이면 양성으로 판정하였다.
도 7A로부터 확인되는 바와 같이, 오일 아쥬반트를 포함한 구제역 불활화 백신에 5 mg의 GS-9620을 혼합하여 접종하였을 때, 접종 후 3주와 5주에서 중화항체가가 증가하는 것으로 나타났다. 뿐만 아니라, O형 구조단백질 항체 ELISA를 이용하여 항체수준을 확인하였을 때 접종 3~7주의 항체 수준은 증가되었다(도 7B). 구제역 불활화 백신만을 접종한 그룹에서는 접종 3주후에는 항체 양성 개체(>0.4)가 관찰되지 않은 반면, GS-9620을 혼합 접종한 그룹에서는 접종 3주만에 접종 개체 모두에서 항체 양성(100%)이 나타났으며 접종 7주까지 지속되었다.
이 결과로부터 돼지에서 약 200 ㎍/kg 수준의 GS-9620를 비롯한 TLR-7 효능제를 구제역 불활화 백신과 혼합시, 항체가 증가 효과를 기대할 수 있음이 입증되었다.
종합
결론적으로, GS-9620으로 대표되는 TLR 7 효능제는 구제역바이러스를 효과적으로 억제하기 때문에, 1) TLR 7 효능제를 단독으로 사용하는 경우, 2) 오일 아쥬반트와 TLR 7 효능제를 혼합하여 사용하는 경우, 3) 오일 아쥬반트 기반 구제역 불활화 백신과 TLR 7 효능제를 혼합하여 사용하는 경우 모두에서 신속한 구제역 방어효과를 나타낼 수 있다.
뿐만 아니라, 구제역 불활화 백신에 의한 중화항체를 더욱 효과적으로 유도하도록 하는 아쥬반트로서 역할을 할 수 있다. 따라서 GS-9620으로 대표되는 TLR 7 효능제를 구제역 불활화 백신, 특히 오길 아쥬반트 기반 구제역 불활화 백신과 병용하였을 때 구제역에 대한 빠르고 지속적인 방어가 이루어질 수 있다. 이러한 효과는 GS-9620으로 대표되는 TLR 7 효능제가 IFN-α, IFN-γ 등 항바이러스 효과를 나타내는 인터페론 및 IL-12, IL-6, IP-10 등과 같은 사이토카인을 접종 초기부터 신속하게 또한 지속적으로 유도하여 항바이러스와 효과와 아쥬반트 효과를 복합적으로 발휘하기 때문인 것으로 판단된다.
참고문헌:

Claims (10)

  1. 톨-유사 수용체 7 효능제를 유효성분으로 포함하는 구제역바이러스 억제용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 톨-유사 수용체 7 효능제는 AZD8848, 가디퀴모드(Gardiquimod), 이미퀴모드(Imiquimod), 베사톨리모드(Vesatolimod, GS-9620), 레시퀴모드(Resiquimod, R848) 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택되는, 구제역바이러스 억제용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 톨-유사 수용체 7 효능제는 GS-9620인, 구제역바이러스 억제용 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 구제역바이러스 억제용 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 구제역바이러스에 대한 면역증강용 아쥬반트 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 ISA 201, ISA 61, ISA 50, ISA 28R 및 ISA 206으로 이루어진 그룹에서 선택되는 오일 에멀젼인, 구제역바이러스에 대한 면역증강용 아쥬반트 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 ISA 206인, 구제역바이러스에 대한 면역증강용 아쥬반트 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    알럼(aluminum hydroxide gel)을 더 포함하는, 구제역바이러스에 대한 면역증강용 아쥬반트 조성물.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 아쥬반트 조성물은 대상체에 투여시 IFN-α, IFN-γ, IL-12, IL-6 및 IP-10로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 생성을 유도하고/하거나 생성량을 증가시키는, 구제역바이러스에 대한 면역증강용 아쥬반트 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 구제역바이러스 억제용 조성물 및 불활화된 구제역바이러스 성분을 유효성분으로 포함하는 구제역바이러스 백신 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 불활화된 구제역바이러스 성분은 A, O, C, Asia1, SAT1, SAT2, 및 SAT3으로 이루어진 그룹에서 선택된 혈청형을 갖는 구제역바이러스 또는 구제역바이러스 백신주에서 유래한 항원 성분을 불활화 처리한 것인, 구제역바이러스 백신 조성물.
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