KR20230113845A - 키틴, 가수분해물, 및 효소 가수분해에 의해 곤충으로부터하나 이상의 관심 생성물을 생산하는 방법 - Google Patents
키틴, 가수분해물, 및 효소 가수분해에 의해 곤충으로부터하나 이상의 관심 생성물을 생산하는 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230113845A KR20230113845A KR1020237025133A KR20237025133A KR20230113845A KR 20230113845 A KR20230113845 A KR 20230113845A KR 1020237025133 A KR1020237025133 A KR 1020237025133A KR 20237025133 A KR20237025133 A KR 20237025133A KR 20230113845 A KR20230113845 A KR 20230113845A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- chitin
- insects
- insect
- water
- weight
- Prior art date
Links
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 191
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 94
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 title claims abstract description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 title abstract description 159
- 239000000047 product Substances 0.000 title description 19
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 title description 14
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 50
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 50
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims description 26
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 16
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 claims description 13
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 claims description 13
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 9
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 9
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 claims 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 abstract description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 86
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 67
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 67
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 67
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 65
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 65
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 65
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 48
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 47
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 35
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 33
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 33
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 33
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 30
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 21
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 16
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 15
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 15
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 15
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 12
- 206010033546 Pallor Diseases 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000254109 Tenebrio molitor Species 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 9
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 8
- 241000709785 Hermetia illucens Species 0.000 description 8
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000255896 Galleria mellonella Species 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 241000238814 Orthoptera Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 241000238818 Acheta domesticus Species 0.000 description 5
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 5
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 5
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 4
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- -1 burn treatment Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 4
- 210000000087 hemolymph Anatomy 0.000 description 4
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 4
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000257159 Musca domestica Species 0.000 description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 3
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 2
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- DBPRUZCKPFOVDV-UHFFFAOYSA-N Clorprenaline hydrochloride Chemical compound O.Cl.CC(C)NCC(O)C1=CC=CC=C1Cl DBPRUZCKPFOVDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000231785 Megacephala Species 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000253973 Schistocerca gregaria Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 2
- 241000255737 Zophobas atratus Species 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000002788 crimping Methods 0.000 description 2
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 2
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000009483 enzymatic pathway Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003311 flocculating effect Effects 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 108010009355 microbial metalloproteinases Proteins 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 2
- 239000012286 potassium permanganate Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 239000003356 suture material Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000004736 wide-angle X-ray diffraction Methods 0.000 description 2
- 108091005508 Acid proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000254032 Acrididae Species 0.000 description 1
- 241001124203 Alphitobius diaperinus Species 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010002660 Anoxia Diseases 0.000 description 1
- 241000976983 Anoxia Species 0.000 description 1
- 102000009422 Aspartic endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108030004804 Aspartic endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241001674044 Blattodea Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238366 Cephalopoda Species 0.000 description 1
- 241000191839 Chrysomya Species 0.000 description 1
- 241000202815 Chrysomya megacephala Species 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 102000003950 Cysteine Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000395 Cysteine Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 241001050985 Disco Species 0.000 description 1
- 241000698776 Duma Species 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241001414834 Ephemeroptera Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- 241000447437 Gerreidae Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 description 1
- 241001466007 Heteroptera Species 0.000 description 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 241000256602 Isoptera Species 0.000 description 1
- 238000007696 Kjeldahl method Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000254023 Locusta Species 0.000 description 1
- 241000254022 Locusta migratoria Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001124156 Mecoptera Species 0.000 description 1
- 102000006166 Metallocarboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108030000089 Metallocarboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 108090000131 Metalloendopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003843 Metalloendopeptidases Human genes 0.000 description 1
- XCOBLONWWXQEBS-KPKJPENVSA-N N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide Chemical compound C[Si](C)(C)O\C(C(F)(F)F)=N\[Si](C)(C)C XCOBLONWWXQEBS-KPKJPENVSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000692885 Nymphalis antiopa Species 0.000 description 1
- 241000819999 Nymphes Species 0.000 description 1
- 241000320508 Pentatomidae Species 0.000 description 1
- 241000083869 Polyommatus dorylas Species 0.000 description 1
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 1
- 241001078693 Rhynchophorus ferrugineus Species 0.000 description 1
- 241000256008 Samia Species 0.000 description 1
- 241000909829 Samia ricini Species 0.000 description 1
- 102000003667 Serine Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000083 Serine Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 206010053615 Thermal burn Diseases 0.000 description 1
- 241000254113 Tribolium castaneum Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 229940040526 anhydrous sodium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000007953 anoxia Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical group N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000005384 cross polarization magic-angle spinning Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000850 deacetylating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015961 delipidation Effects 0.000 description 1
- 238000005115 demineralization Methods 0.000 description 1
- 230000002328 demineralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000007882 dietary composition Nutrition 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 238000009996 mechanical pre-treatment Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000006140 methanolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 description 1
- 235000021436 nutraceutical agent Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 235000019629 palatability Nutrition 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 150000003147 proline derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000007342 radical addition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005871 repellent Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 238000006884 silylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- QPILZZVXGUNELN-UHFFFAOYSA-N sodium;4-amino-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound [Na+].OS(=O)(=O)C1=CC(O)=C2C(N)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=C1 QPILZZVXGUNELN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- YXZRCLVVNRLPTP-UHFFFAOYSA-J turquoise blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Cu+2].NC1=NC(Cl)=NC(NC=2C=C(NS(=O)(=O)C3=CC=4C(=C5NC=4NC=4[N-]C(=C6C=CC(=CC6=4)S([O-])(=O)=O)NC=4NC(=C6C=C(C=CC6=4)S([O-])(=O)=O)NC=4[N-]C(=C6C=CC(=CC6=4)S([O-])(=O)=O)N5)C=C3)C(=CC=2)S([O-])(=O)=O)=N1 YXZRCLVVNRLPTP-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000000482 two photon fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007738 vacuum evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
- C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
- C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
- C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 키틴, 가수분해물, 및 곤충으로부터 적어도 하나의 관심 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 곤충 큐티클 압착 단계에 이어서 단백질분해 효소를 사용하여 곤충 큐티클을 효소 가수분해하는 단계를 포함하는, 곤충으로부터 적어도 하나의 관심 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 곤충으로부터 적어도 하나의 관심 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 곤충 큐티클의 효소 가수분해에 의해 키틴 및/또는 키토산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이는 또한 특정 키틴 및 가수분해물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, "키틴"은 임의 유형의 키틴 유도체, 즉 N-아세틸글루코사민 단위 및 D-글루코사민 단위를 포함하는 임의 유형의 다당류 유도체, 특히 키틴-폴리펩티드 공중합체 (때때로 "키틴/폴리펩티드 복합체"로 지칭됨)를 의미한다.
키틴은 셀룰로스에 이어서 생물계에서 두 번째로 많이 합성된 중합체라고 한다. 실제로, 키틴은 생물계의 다수의 종에서 합성된다: 이는 갑각류 및 곤충의 외골격 및 진균류를 둘러싸고 이를 보호하는 측벽의 일부를 구성한다. 더욱 특히, 곤충에서, 따라서 키틴은 이의 외골격의 3 내지 60％를 구성한다.
본 발명에 따르면, "키토산"은 키틴의 탈아세틸화 생성물을 의미한다. 키토산과 키틴 사이의 일반적인 한계는 아세틸화도에 의해 결정된다: 아세틸화도가 50％ 미만인 화합물은 키토산으로 칭해지고, 아세틸화도가 50％ 초과인 화합물은 키틴으로 칭해진다.
키틴 및/또는 키토산은 수많은 용도에서 사용된다: 화장 (화장품 조성물), 의학 및 제약학 (제약 조성물, 화상 치료, 생체물질, 각막 드레싱, 봉합 물질), 영양학, 및 식품 가공, 공업 기술 (특히 물 여과 및 정제를 위한 여과, 텍스처화, 응집 또는 흡착 작용제) 등. 실제로, 키틴 및/또는 키토산은 생체적합성이고, 생체분해성이며, 비-독성인 물질이다.
전통적으로, 키틴은 갑각류로부터, 두족류로부터, 또한 더욱 이례적으로는 진균류로부터 화학적으로 추출된다. 이러한 화학 경로는 천연 상태로 존재할 때, 예를 들어, 갑각류의 껍질 내에 존재할 때의 키틴의 구조를 변성시키는 효과가 있는 다량의 시약 (예컨대 염산, 수산화나트륨 및 표백제)을 사용한다. 또한, 대부분의 화학 시약은 인간 및 환경에 해롭고, 처리되어야 할 다량의 유출물을 생성시킨다. 마지막으로, 갑각류로부터 유래된 키틴 및/또는 키토산은 민감한 사람에서 알레르기 반응을 생성시킬 수 있다.
키틴을 추출하는 또 다른 경로는 효소 경로이다. 이러한 경로는 더 순한 것으로 간주되고, 따라서 키틴 및/또는 키토산을 더 양호하게 보존하는 것을 가능하게 한다. 그러나, 이러한 경로로 수득된 키틴은 갈색을 띠어, 판매가능한 분말, 즉 백색 분말을 수득하기 위한 정제 단계를 필요로 한다. 따라서 기존의 방법은 키틴으로부터 불순물을 제거하기 위한 1회 이상의 단계, 예컨대 효소 가수분해 전에 수행되는, 산으로 무기질을 제거하는 단계, 및/또는 효소 가수분해 후에 수행되는, 키틴을 산화제로 표백하는 단계를 일반적으로 포함한다. 키틴 정제를 위한 이러한 2개의 단계는 불행하게도 키틴의 화학 구조를 변경시키는 효과가 있다.
본 발명가들의 작업은 가수분해 전의 기계적 처리 단계, 즉 곤충 큐티클을 압착하는 단계를 수행하는 것에 의해 더욱 순수하고 원래의 키틴 구조에 더욱 가까운 구조를 갖는 키틴을 수득하는 것이 가능하였음을 실연하였다.
따라서 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 곤충으로부터 적어도 하나의 관심 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다:
(i) 곤충 큐티클을 압착하는 단계, 및
(ii) 그 후, 단백질분해 효소로 곤충 큐티클을 효소 가수분해하는 단계.
"관심 생성물"은 더욱 특히 키틴 및/또는 키토산 및/또는 가수분해물을 의미한다.
"가수분해물"은 단백질의 효소 가수분해에 의해 수득가능한, 단백질, 가수분해된 단백질, 펩티드, 아미노산, 및/또는 단백질로부터 유래된 기타 화합물을 포함하는 생성물을 나타낸다.
관심 생성물 또는 생성물들은 곤충으로부터 수득된다. "곤충"은 임의의 발달 단계, 예컨대 성충, 유충 또는 약충 단계의 곤충을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 곤충은 식용성이다.
더욱 특히, 곤충은 딱정벌레목(Coleoptera), 파리목(Diptera), 나비목(Lepidoptera), 흰개미목(Isoptera), 메뚜기목(Orthoptera), 벌목(Hymenoptera), 바퀴목(Blattoptera), 노린재목(Hemiptera), 노린재아목(Heteroptera), 하루살이목(Ephemeroptera) 및 밑들이목(Mecoptera)으로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 딱정벌레목, 파리목, 메뚜기목 및 나비목으로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 곤충은 테네브리오 몰리토르(Tenebrio molitor), 헤르메티아 일루센스(Hermetia illucens), 갈레리아 멜로넬라(Galleria mellonella), 알피토비우스 디아페리누스(Alphitobius diaperinus), 조포바스 모리오(Zophobas morio), 블라테라 푸스카(Blattera fusca), 트리볼리움 카스타네움(Tribolium castaneum), 린코포루스 페루기네우스(Rhynchophorus ferrugineus), 무스카 도메스티카(Musca domestica), 크리소미아 메가세팔라(Chrysomya megacephala), 로쿠스타 미그라토리아(Locusta migratoria), 스키스토세르카 그레가리아(Schistocerca gregaria), 아케타 도메스티쿠스(Acheta domesticus) 및 사미아 리시니(Samia ricini)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더욱 바람직하게는, 곤충은 테네브리오 몰리토르, 헤르메티아 일루센스, 갈레리아 멜로넬라, 알피토비우스 디아페리누스, 조포바스 모리오, 블라테라 푸스카, 무스카 도메스티카, 크리소미아 메가세팔라, 로쿠스타 미그라토리아, 스키스토세르카 그레가리아, 아케타 모메스티쿠스 및 사미아 리시니로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 더 바람직하게는 티. 몰리토르(T. molitor)이다.
하나 이상의 곤충 종, 바람직하게는 단일 곤충 종이 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있다. 여러 종이 사용되는 경우, 유리하게는 2개의 밀접하게 관련된 종, 예를 들어 헤르메티아 일루센스 및 무스카 도메스티카가 선택될 것이다.
곤충은 자연에서 취득되기보다는 바람직하게는 사육된다. 예를 들어, 곤충이 곤충 농장에서 사육된다. 특수 농장에서 곤충을 번식시키는 것은 곤충이 보유하는 질환과 연관된 위험을 제어 및 제거할 수 있게 할 뿐만 아니라, 예를 들어 살충제의 존재로 인해 곤충으로부터 유래되는 식품의 독성과 연관된 위험을 제한할 수 있게 한다. 또한, 양식은 곤충 공급의 품질을 제어하고 공급 비용을 한정하는 것을 가능하게 한다.
"곤충 큐티클"은 곤충으로부터 분리되었을 때의 큐티클뿐만 아니라, 전체 곤충을 포함하여 곤충의 다른 구성성분 중 일부 또는 모두를 포함하는 큐티클을 또한 의미한다. 실제로, 본 발명에 따른 방법을 전체 곤충, 예컨대 분쇄된 곤충에, 또는 천연적으로 분리되고 적절한 방법으로 수집된, 큐티클을 포함하는 곤충의 일부분, 예를 들어 곤충의 허물 및/또는 탈피물에만 적용하는 것이 가능하다.
큐티클은 곤충의 표피가 분비하는 외층 (또는 외골격)이다. 일반적으로, 이는 3개의 층으로 형성된다:
- 큐티클의 가장 얇은 최외층인 에피큐티클(epicuticle) (4 ㎛ 미만); 이러한 층은 물에 대해 불투과성이고, 발수 왁스, 뿐만 아니라 더 적은 양의 단백질 및 키틴의 층을 포함한다;
- 큐티클의 중간층인 엑소큐티클(exocuticle); 이는 태닝(tanning)에 의해 경화되고 큐티클의 경직성을 담당하는 단백질, 키틴, 및 임의적인 멜라닌으로 본질적으로 구성된다; 및
- 단백질 및 키틴의 혼합물로 구성된, 얇은 가요성 층인 엔도큐티클(endocuticle).
곤충 큐티클을 압착하는 주요 목적은 지방이 풍부한 압착 주스를 제거하고/하거나, 압착 케이크에서 가수분해용 기질을 강화하는 것이다.
본 발명에 따른 방법에서, 곤충 큐티클을 압착하는 것은 20％ 이하, 바람직하게는 15％ 이하, 더욱 바람직하게는 12％ 이하, 더욱 더 바람직하게는 10％ 이하의 오일 (또는 지질) 함량을 포함하는 압착 케이크를 수득하는 것을 가능하게 한다.
본 출원에서, 값의 범위는 경계를 포함하는 것으로 이해된다. 또한, "약" 또는 "대략"이 숫자에 선행하는 경우, 이는 이러한 숫자의 값의 ± 10％와 등가이다.
마찬가지로, 압착 케이크에서 가수분해용 기질을 강화하기 위해, 곤충 큐티클을 압착하는 것은 건조물 함량이 30％ 내지 60％에 포함되고, 바람직하게는 40％ 내지 55％에 포함되며, 더욱 바람직하게는 45％ 내지 50％에 포함되는 압착 케이크를 수득하는 것을 가능하게 한다.
임의의 압착 시스템, 예를 들어, 단일-스크류 또는 이중-스크류 압착기 (앤젤(Angel) 유형의 이중-스크류), 필터-압착기 (쇼퀘네(Choquenet) 유형의 필터-압착기), 평판 압착기 등을 곤충 큐티클의 압착을 수행하는데 사용할 수 있다. 이러한 시스템들은 관련 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 기술자는 상기 언급된 오일 및/또는 물 함량을 수득하도록 압착 조건을 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 곤충 큐티클의 압착에 효소 가수분해가 이어진다.
바람직하게는, 효소 가수분해는 적어도 하나의 단백질분해 효소, 바람직하게는 프로테아제로 수행된다. 본 출원에서, "펩티다제" 및 "프로테아제"라는 명칭 또는 접미사는 단백질의 펩티드 결합의 용해를 야기하는 효소를 가리키도록 상호교환가능하게 사용된다. 유리하게는, 이는 4 내지 8시간, 바람직하게는 4 내지 5시간의 기간 동안 40 내지 60℃, 바람직하게는 45 내지 55℃의 온도에서 6 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7.5을 포함하는 pH에서 수행된다.
효소 가수분해는 단일 프로테아제로, 또는 대안적으로 적어도 하나의 프로테아제를 함유하는 효소 혼합물, 더욱 바람직하게는 여러 프로테아제를 함유하는 효소 혼합물, 예컨대 엔도프로테아제 및 엑소프로테아제, 또는 프로테아제 및 폴리사카라제를 함유하는 혼합물로 수행될 수 있다.
바람직하게는, 프로테아제는 아미노펩티다제, 메탈로카르복시펩티다제, 세린 엔도펩티다제, 시스테인 엔도펩티다제, 아스파르트산 엔도펩티다제, 메탈로엔도펩티다제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
유리하게는, 효소는 하기로부터 선택될 수 있다:
유리하게는, 가수분해에서 사용되는 효소는 아스파르트산 엔도펩티다제, 예컨대 프롤리브 NP이다. 이러한 유형의 효소는, 특히 이러한 유형의 효소가 딱정벌레목, 더욱 특히 티. 몰리토르로부터 수득되는 압착 케이크의 가수분해에서 적용되는 경우에, 수득되는 키틴의 순도 면에서 매우 양호한 결과를 수득하는 것을 가능하게 한다.
효소 또는 효소 혼합물은 추정 건조물의 0.2 내지 10 중량％, 바람직하게는 0.4 내지 8 중량％, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 2％ 범위의 양으로 도입된다. 더욱 특히 "추정 건조물의 중량"은 효소 가수분해 단계에 진입할 때 추정될 수 있는 바와 같은 곤충 또는 곤충의 일부분(들)으로부터의 건조물의 중량을 의미한다.
효소 활성의 관점에서, 도입되는 효소 또는 효소 혼합물의 양은 변환될 기질, 즉 곤충 또는 수화된 곤충의 일부분(들)의 100 g의 습윤 중량 (수분 함량 30 내지 70％) 당 2000 내지 5000 SAPU (하기 실시예 5에 기술된 "분광광도법 산 프로테아제 단위"), 바람직하게는 3000 내지 4000 SAPU에 포함되는 활성과 등가이다.
유리하게는, 효소 가수분해 단계는 물, 예컨대 신선한 물의 존재 하에 수행된다. 효소 가수분해에서 사용되는 물의 양은 하기와 같이 결정된다: 물의 부피 (mL) 대 곤충의 중량 (g)의 비가 바람직하게는 0.3 내지 10, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5, 더욱 더 바람직하게는 0.7 내지 3 내에 포함되고, 더욱 더 바람직하게는 대략 1이다. 물의 밀도는 정상적인 온도 및 압력 조건 하에 1.0 g/mL이어서, 이러한 비가 물의 중량 대 곤충의 중량의 비에 또한 상응한다는 것을 주지하여야 한다.
본 발명에 따른 방법은 순도 (또는 중량측정 순도)가 40 내지 90％, 바람직하게는 50 내지 90％, 더욱 바람직하게는 60 내지 85％에 포함되고, 더욱 더 바람직하게는 대략 80％인 키틴을 수득하는 것을 가능하게 한다 (실시예 2 및 도 2를 참조한다).
또한, 본 발명에 따른 방법은, 특히 소화성, 지질 및/또는 단백질 함량, 단백질 크기 또는 아미노산 조성의 관점에서, 몇몇 유리한 성질이 있는 가수분해물을 수득하는 것을 가능하게 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 압착 단계 전에 분쇄 단계를 포함한다.
따라서 본 발명의 특히 바람직한 실시양태는
(i) 곤충 큐티클을 분쇄하는 단계,
(ii) 곤충 큐티클을 압착하는 단계, 및
(iii) 그 후, 단백질분해 효소로 곤충 큐티클을 효소 가수분해하는 단계
를 포함하는, 곤충으로부터 적어도 하나의 관심 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
이러한 분쇄 단계는 효소 가수분해 동안 효소가 기질에 접근하는 것을 용이하게 하기 위해 큐티클 및/또는 곤충을 입자로 감소시키는 것을 목적으로 한다. 이러한 단계는 압착 단계가 이어지는 경우에 압착 주스의 제거 및 고형물의 단리를 용이하게 하는 것을 또한 가능하게 한다.
이러한 분쇄 단계는 곤충으로부터 유래되는 지질이 압착으로부터 유래되는 압착 케이크와 압착 주스 사이에서 분포되는 것을 개선하는 것을 또한 가능하게 한다. 실제로, 도 4에 나타난 바와 같이, 분쇄 및 압착 양쪽 모두를 포함하는 방법으로부터 유래되는 압착 케이크가 압착만 포함하는 방법으로부터의 압착 케이크에 비교하여 지질 함량이 감소된다.
더욱 특히, 본 발명에 따른 방법에서, 곤충 큐티클의 분쇄 및 압착은 15％ 이하, 바람직하게는 12％ 이하, 더욱 더 바람직하게는 10％ 이하의 지질 (또는 오일) 함량을 포함하는 압착 케이크를 수득하는 것을 가능하게 한다.
분쇄는 유리하게는 혼합기-분쇄기, 예컨대 칼날 분쇄기로 수행될 수 있다.
바람직하게는, 분쇄가 끝났을 때, 곤충의 입자의 크기는 1 cm 미만 (현미경을 사용하여 관찰가능한 최대 입자 크기), 바람직하게는 0.5 cm 미만이고, 더욱 더 바람직하게는 300 ㎛ 내지 0.5 cm, 바람직하게는 500 ㎛ 내지 0.5 cm, 더욱 더 바람직하게는 500 ㎛ 내지 1 mm에 포함되는 크기이다.
분쇄를 용이하게 하도록 일정량의 물이 첨가될 수 있다. 이러한 물의 양은 하기와 같이 결정된다: 물의 부피 (mL) 대 곤충의 중량 (g)의 비가 바람직하게는 0.3 내지 10, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5, 더욱 더 바람직하게는 0.7 내지 3에 포함되고, 더욱 더 바람직하게는 대략 1이다.
유리하게는, 본 발명에 따른 방법은 압착 및/또는 분쇄 단계 전에 곤충을 도살하는 단계를 또한 포함한다.
이러한 도살 단계는 냉혈 동물 및/또는 크기가 작은 동물 (갑각류, 어류, 달팽이 등)의 양식에서의 통상적인 방법, 예컨대 저온 (냉동), 고온 (탕침), 산소 결핍 등에 의해 수행될 수 있다. 유리하게는, 곤충 도살 단계는 탕침으로 수행된다. 탕침은 곤충을 도살할 뿐만 아니라, 또한 미생물 부하를 저하시키고 (악화 위험 및 건강 위험을 감소시킴), 자가분해를 유발할 수 있고, 따라서 곤충의 급속한 갈변을 유발할 수 있는 곤충의 내부 효소를 불활성화시킨다. 동물 복지를 존중하기 위해, 그리고 과학적 권고에 따라, 이러한 탕침은 가능한 한 신속하게 죽게 하는 방식으로 수행된다.
대안적으로, 블랜칭(blanching)에 의해 도살을 수행할 수 있다. 블랜칭은 상기 언급된 탕침과 동일한 장점이 있다.
유리하게는, 예를 들어 탕침 또는 블랜칭에 의해 곤충을 도살하고 나서, 분쇄한 후, 압착한다.
바람직하게는, 탕침 단계가 물, 예컨대 신선한 물에서 95 내지 105℃, 바람직하게는 대략 100℃의 온도에서 2 내지 20분, 바람직하게는 5 내지 15분의 기간 동안 수행된다.
이러한 탕침 단계 동안 도입되는 물의 양은 하기와 같이 결정된다: 물의 부피 (mL) 대 곤충의 중량 (g)의 비가 바람직하게는 0.3 내지 10, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5, 더욱 더 바람직하게는 0.7 내지 3에 포함되고, 더욱 더 바람직하게는 대략 1이다.
대안적으로, 블랜칭 단계가 80℃ 내지 130℃, 바람직하게는 90℃ 내지 120℃에 포함되는 온도에서 증기 및/또는 물로 수행된다.
본 발명에 따른 방법은 효소 가수분해 전에 곤충 큐티클을 산화제로 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서, 큐티클 처리에서 사용되는 산화제는 과산화수소, 과망간산칼륨, 오존 및 차아염소산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 과산화수소이다.
유리하게는, 산화제가 과산화수소인 경우, 곤충 큐티클을 처리하기 위해 도입되는 이러한 작용제의 양은 과산화수소 함량이 곤충의 총 중량을 기초로 1 내지 33 중량％, 바람직하게는 곤충의 총 중량을 기초로 2 내지 12 중량％에 포함되고, 바람직하게는 대략 6 중량％이도록 하는 것이다.
바람직하게는, 곤충 큐티클을 산화제로 처리하는 것은 물, 예컨대 신선한 물의 존재 하에 수행된다. 유리하게는, 큐티클 처리에서 사용되는 물의 양은 하기와 같이 결정된다: 물의 부피 (mL) 대 곤충의 중량 (g)의 비가 바람직하게는 0.3 내지 10, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5, 더욱 더 바람직하게는 0.7 내지 3에 포함되고, 더욱 더 바람직하게는 대략 1이다.
곤충 큐티클을 산화제로 처리하는 것은 하기 단계 중 하나 이상 동안 수행될 수 있다:
- 탕침과 동시에 및/또는 탕침 단계 후에, 더욱 바람직하게는 탕침과 동시에. 대안적으로, 블랜칭과 동시에 및/또는 블랜칭 단계 후에, 더욱 바람직하게는 블랜칭과 동시에. 더욱 특히, 곤충 큐티클 처리가 탕침 또는 블랜칭 동안 수행되는 경우, 유리하게는 산화제가 곤충 탕침에 사용되는 물에 첨가될 수 있다.
- 분쇄 전에, 분쇄와 동시에 및/또는 분쇄 후에. 더욱 특히, 곤충 큐티클 처리가 분쇄 동안 수행되는 경우, 유리하게는 산화제가 분쇄에 사용되는 물에 첨가될 수 있다.
- 압착 전에 및/또는 압착과 동시에.
- 곤충 큐티클의 특수 처리 단계 동안.
유리하게는, 효소 가수분해 동안 사용된 효소 또는 효소 혼합물을 불활성화시키는 목적으로 열 불활성화 단계가 효소 가수분해에 이어질 수 있다.
본 발명에 따른 방법이 끝난 후, 효소 가수분해 반응 혼합물의 압착 또는 원심분리에 의해 키틴을 회수할 수 있다. 이러한 단계에서, 키틴의 공동-생성물, 즉 가수분해물이 또한 회수된다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태가 하기에서 더욱 상세하게 기술된다.
특히, 이러한 바람직한 실시양태는 본 발명에 따른 방법을 위한 다양한 유리한 단계, 예컨대 키틴을 가볍게 정제하는 단계, 2차 압착 단계, 세정 공정 단계, 임의적인 여과 및 건조 단계를 기술한다.
마지막으로, 키틴은 일반적으로 분말 형태로 판매되기 때문에, 2차 분쇄가 또한 수행될 수 있다. 후자는 키틴으로부터 키토산을 제조하기 위해, 탈아세틸화 반응을 촉진하도록 또한 수행될 수 있다. 하기에 상세하게 기술되는 바람직한 실시양태의 단계 10에서 탈아세틸화 반응의 조건이 더욱 충분하게 기술된다.
곤충 큐티클로부터 키틴을 생산하는 특히 유리한 방법은
a) 곤충을 도살하는 단계,
b) 곤충을 분쇄하는 단계,
c) 곤충을 압착하는 단계,
d) 단백질분해 효소로 곤충 큐티클을 효소 가수분해하는 단계,
e) 키틴을 회수하는 단계
를 포함하고, 임의적으로 단계 d) 전에 곤충 큐티클이 산화제로 처리될 수 있다.
다양한 단계 a) 내지 e), 뿐만 아니라 산화제 처리의 바람직한 실시양태는 상기에 또는 하기의 바람직한 실시양태의 상응하는 단계에서 언급된 바와 같다.
본 발명은 키틴, 예컨대 본 발명에 따른 방법으로 수득가능한 키틴에 또한 관련된다. 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 순한 조건 덕분에, 이러한 키틴은 높은 순도, 예컨대 40 내지 90％, 바람직하게는 50 내지 90％에 포함되고, 더욱 바람직하게는 60 내지 85％에 포함되며, 더욱 더 바람직하게는 대략 80％인 순도를 가지면서 곤충 큐티클에서 천연 상태로 발생하는 바와 같은 키틴의 구조에 가까운 구조를 갖는다.
본 발명에 따른 키틴은 하기의 유리한 성질 중 적어도 임의의 하나를 갖는다:
- 건조물의 총 중량을 기초로 4 중량％ 미만, 바람직하게는 3.5 중량％ 미만, 더욱 바람직하게는 2.5 중량％ 이하 (특히, 키틴이 초식 곤충으로부터 제조되는 경우), 더욱 바람직하게는 2 중량％ 미만, 더욱 더 바람직하게는 1.5 중량％ 이하 (특히, 키틴이 티. 몰리토르로부터 제조되는 경우), 더욱 더 바람직하게는 1 중량％ 미만의 회분 함량,
- 40 내지 90％, 바람직하게는 50 내지 90％에 포함되고, 더욱 바람직하게는 60 내지 85％에 포함되며, 더욱 더 바람직하게는 대략 80％인 순도 (또는 중량측정 순도),
- (C-O)/(C-H) 비가 0.30 내지 0.56, 바람직하게는 0.31 내지 0.53에 포함되는 관능기의 표면 존재비,
- 건조물의 총 중량을 기초로 지질 함량 ≤14 중량％,
- 키틴이 비-비행 곤충으로부터 제조되는 경우 지질 함량 ≤5％,
- 총 아미노산 ≤45％,
- 키틴이 비행 곤충으로부터 제조되는 경우 총 아미노산 ≤16％,
- Ala, Gly, Leu, Pro, Ser, Tyr, Val로부터의 적어도 3개의 임의의 아미노산의 상대적 존재비 ≤10％,
- 키틴이 티. 몰리토르로부터 제조되는 경우 Leu, Pro, Val의 상대적 존재비 ≤10％,
- 키틴이 티. 몰리토르로부터 제조되는 경우 Ala의 상대적 존재비 ≤12％,
- 비색측정 순도 ≥40％,
- 키틴이 효소 가수분해에서 프롤리브 NP 효소를 사용하여 제조되는 경우 비색측정 순도 ≥50％,
- 차이에 의한 순도 ≥45％, 바람직하게는 ≥49％,
- 키틴이 티. 몰리토르로부터 제조되는 경우 차이에 의한 순도 ≥52％,
- 키틴이 비행 곤충으로부터 제조되는 경우 차이에 의한 순도 ≥70％,
- 아세틸화도 ≥70％ 및 결정화도 ≤0.61,
- 아세틸화도 ≥70％ 및 결정화도 ≥0.42.
키틴은 45％ 이하의 아미노산 함량, 3.5％ 이하, 바람직하게는 2.5％ 이하의 회분 함량, 및 45％ 이상, 바람직하게는 49％ 이상의 차이에 의한 순도를 포함한다.
바람직하게는, 키틴은 상기 성질을 모두 갖는다.
상기 언급된 특색의 모든 단위 및 측정 방법이 실시예, 더욱 특히 실시예 5에서 기술된다.
곤충으로부터 가수분해물을 생산하는 특히 유리한 방법은
a) 곤충을 도살하는 단계,
b) 곤충을 분쇄하는 단계,
c) 곤충을 압착하는 단계,
d) 단백질분해 효소로 곤충 큐티클을 효소 가수분해하는 단계,
e) 가수분해물을 회수하는 단계
를 포함하고, 임의적으로 단계 d) 전에 곤충 큐티클이 산화제로 처리될 수 있다.
다양한 단계 a) 내지 e), 뿐만 아니라 산화제 처리의 바람직한 실시양태는 상기에 또는 하기의 바람직한 실시양태의 상응하는 단계에서 언급된 바와 같다.
본 발명은 가수분해물, 예컨대 본 발명에 따른 방법으로 수득가능한 가수분해물에 또한 관련된다.
본 발명에 따른 가수분해물은 하기의 유리한 성질 중 적어도 임의의 하나를 갖는다:
- 건조물의 총 중량을 기초로 4 중량％ 미만, 바람직하게는 3 중량％ 미만 (특히 가수분해물이 초식 곤충으로부터 제조되는 경우)의 회분 함량,
- 95％ 초과, 바람직하게는 96％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 우수한 소화성, 특히 펩신 소화성 (펩신 소화성은 72/188/EEC 결정에 따른 방법으로 측정됨);
- 70％ 이상, 바람직하게는 71％ 이상, 더욱 바람직하게는 75％ 이상, 더욱 바람직하게는 80％ 이상 (특히, 가수분해물이 비-비행 곤충으로부터 제조되는 경우)의 단백질/펩티드 함량;
- 수용성 단백질의 총 중량을 기초로 20 중량％ 미만, 바람직하게는 18 중량％ 미만의 12,400 g/mol 초과의 수용성 단백질 함량;
- 14％ 미만, 바람직하게는 10％ 미만, 더욱 바람직하게는 5％ 이하 (특히, 가수분해물이 비-비행 곤충으로부터 제조되는 경우), 더욱 바람직하게는 2％ 이하, 더욱 더 바람직하게는 1％ 이하의 지질 함량;
- 가장 풍부한 아미노산이 프롤린, 알라닌, 류신, 아스파르트산, 글루타민 및/또는 발린인 조성. "가장 풍부한"은 아미노산의 총 중량을 기초로 5 중량％ 초과, 바람직하게는 7 중량％ 초과의 조성 내의 아미노산의 상대적인 양을 의미한다. 높은 프롤린 함량이 특히 흥미로운 것으로 판명된다;
- Asp, Glu, Ala, Gly, Leu, Pro, Tyr, Val, Lys로부터 선택된 적어도 5개의 임의의 아미노산의 상대적 존재비 ≥6％;
- Asp, Glu, Ala, Leu, Pro, Tyr, Val로부터 선택된 적어도 3개의 임의의 아미노산의 상대적 존재비 ≥8％.
더욱 특히, "수용성 단백질"은 단백질 (또는 미정제 단백질) 중에서, pH가 6 내지 8, 유리하게는 7.2 내지 7.6에 포함되는 수용액에서 가용성인 것을 의미한다.
바람직하게는, 수용액은 pH가 6 내지 8, 유리하게는 7.2 내지 7.6에 포함되는 완충제 용액이다.
바람직하게는, 완충제 용액은 pH가 7.4 ± 0.2인 포스페이트 완충 NaCl 용액이다.
가수분해물은 적어도 40％의 단백질, 최대 10％, 바람직하게는 최대 8％의 회분, 및 50％ 미만, 바람직하게는 43％ 미만의 12,400 g/mol 초과의 수용성 단백질 함량을 포함한다.
"초식 곤충"은 일상식에 동물 단백질이 없는 곤충을 의미한다. 초식 곤충의 예로 딱정벌레목, 나비목 또는 메뚜기목이 언급될 수 있다.
"비행 곤충"은, "비-비행"으로 칭해지는 곤충과 대조적으로, 성충일 때 날 수 있는 곤충을 의미한다. 비행 곤충의 예로 나비목 또는 파리목이 언급될 수 있다. 비-비행 곤충의 예로 딱정벌레목 또는 메뚜기목이 언급될 수 있다.
상기 언급된 특색의 모든 단위 및 측정 방법이 실시예, 더욱 특히 실시예 5에서 기술된다.
바람직하게는, 가수분해물은 상기 성질을 모두 갖는다.
본 발명에 따른 가수분해물이 이의 글루코사민 및/또는 이의 유도체 (바람직하게는 N-아세틸글루코사민)의 함량, 더욱 바람직하게는 가수분해물의 건조물의 총 중량을 기초로 0.01％ 이상, 바람직하게는 0.08 중량％ 이상의 함량에 의해 임의의 다른 유형의 가수분해물과 구별될 수 있다는 것이 특히 주목될 것이다.
본 출원에서, 규정 또는 지침에 대한 임의의 언급은 본 출원의 출원일에 시행 중인 바와 같은 상기 규정 또는 상기 지시에 관한 것이다.
유리하게는, 가수분해물의 영양학적 프로파일을 균형잡히게 하여 이를 상이한 유형의 동물들에게 적절하게 만들도록 가수분해물에 첨가물이 보충될 수 있다.
유리하게는, 건조 가수분해물을 수득하기 위해 가수분해물이 농축된 후 건조될 수 있다. 대안적으로, 가수분해물은 액체 형태일 수 있다. 이러한 가수분해물은 특히 동물용의 식품 또는 식품 성분으로서 사용될 수 있거나, 또는 대안적으로, 예를 들어 아미노산을 단리하기 위해, 가공될 수 있다.
곤충 큐티클로부터 키토산을 생산하는 특히 유리한 방법은
a) 곤충을 도살하는 단계,
b) 곤충을 분쇄하는 단계,
c) 곤충을 압착하는 단계,
d) 프로테아제로 곤충 큐티클을 효소 가수분해하는 단계,
e) 키틴을 회수하는 단계,
f) 회수된 키틴을 탈아세틸화하는 단계,
g) 키토산을 회수하는 단계
를 포함하고, 임의적으로 단계 d) 전에 곤충 큐티클을 산화제로 처리할 수 있다.
다양한 단계 a) 내지 g), 뿐만 아니라 산화제 처리의 바람직한 실시양태는 상기에 또는 하기의 바람직한 실시양태의 상응하는 단계에서 언급된 바와 같다.
본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 수득가능한 키토산에 또한 관련된다.
본 발명에 따른 방법으로 수득가능한 키틴 및/또는 키토산은 다양한 용도에서 유리하게 사용될 수 있다:
- 화장품, 제약, 건강기능(nutraceutical) 또는 식이요법 조성물에서,
- 화상 치료용 생체물질로서, 2차 피부로서, 각막 드레싱 또는 봉합 물질 제조용으로,
- 특히 물 여과 및 정제를 위한 여과, 텍스처화, 응집 및/또는 흡착 작용제로서.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 방법은 도 1에 개략적으로 기술된 하기의 단계들을 포함한다. 이러한 바람직한 실시양태에서 특정 단계는 임의적인 것으로 지시된다는 것을 주지하여야 한다.
이러한 도살 단계 1은 미생물 부하를 감소시키고 (악화 위험 및 건강 위험을 감소시킴), 자가분해를 유발할 수 있고, 따라서 곤충의 급속한 갈변을 유발할 수 있는 곤충의 내부 효소를 불활성화시키면서 곤충을 도살하는 것을 가능하게 한다.
도살은 탕침에 의해 수행될 수 있다.
따라서 곤충, 바람직하게는 유충을 2 내지 20분, 바람직하게는 5 내지 15분 동안 물로 탕침시킨다. 바람직하게는, 물의 온도는 95 내지 105℃를 포함하고, 바람직하게는 100℃이다.
이러한 탕침 단계 1 동안 도입되는 물의 양은 하기와 같이 결정된다: 물의 부피 (mL) 대 곤충의 중량 (g)의 비가 바람직하게는 0.3 내지 10, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5, 더욱 더 바람직하게는 0.7 내지 3에 포함되고, 더욱 더 바람직하게는 대략 1이다.
대안적으로, 블랜칭에 의해 도살을 수행할 수 있다. 바람직하게는, 80 내지 130℃, 바람직하게는 90 내지 120℃, 더욱 바람직하게는 95 내지 105℃를 포함하고, 더욱 더 바람직하게는 98℃인 온도의 증기 (증기 노즐 또는 층)로, 또는 95 내지 105℃를 포함하고, 바람직하게는 100℃인 온도의 물로 (분사 노즐에 의해), 또는 80 내지 130℃, 바람직하게는 90 내지 120℃, 더욱 바람직하게는 95 내지 105℃를 포함하는 온도에서 혼합 방식 (물 + 증기)으로 곤충을 블랜칭한다. 블랜칭 챔버에서의 체류 시간은 1 내지 15분, 바람직하게는 3 내지 7분을 포함한다.
이러한 단계에서, 하기의 중간 단계에서 지시되는 바와 같은 상세사항에 따라 산화제를 포함하는 탕침수 또는 블랜칭용 물을 사용하여 곤충 큐티클을 처리하는 것이 또한 가능하다.
큐티클을 산화제로 처리하는 특수 단계가 방법에 도입될 수 있다. 유리하게는, 이러한 중간 큐티클 처리 단계는 도살 단계 1과 분쇄 단계 2 사이에 수행된다.
이러한 중간 단계는 바람직하게는 과산화수소 (H2O2), 과망간산칼륨 (KMnO4), 오존 (O3) 및 차아염소산나트륨 (NaClO)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산화제, 더욱 바람직하게는 과산화수소로 수행된다.
제1 실시양태에 따르면, 단계 1이 끝났을 때, 후자가 탕침에 의해 수행된 경우, 임의적으로 탕침수를 대략 40 내지 60℃, 바람직하게는 대략 50℃의 온도로 냉각한 후, 산화제를 탕침 탱크 내로 직접 도입한다.
시판되는 과산화수소는 일반적으로 수용액, 예를 들어 물의 총 중량을 기초로 30 중량％의 용액의 형태이다.
이러한 처리를 위해 도입되는 과산화수소의 양은 과산화수소 함량이 곤충의 총 중량을 기초로 1 내지 33 중량％, 바람직하게는 곤충의 총 중량을 기초로 2 내지 12 중량％에 포함되고, 바람직하게는 대략 6 중량％이도록 하는 것이다.
제2 실시양태에 따르면, 곤충을 탕침 탱크로부터 제거하고, 체로 거르고, 다시 탱크 내로 도입한다.
그 후, 과산화수소를 묽은 수용액의 형태로 탱크 내로 도입하고, 과산화수소 함량은 물 중량을 기초로 1 내지 33 중량％, 바람직하게는 물 중량을 기초로 2 내지 12 중량％에 포함되고, 바람직하게는 대략 6 중량％이다.
곤충을 탕침 또는 처리 탱크로부터 또는 블랜칭 탱크로부터 제거한 후, 체로 거르고, 분쇄기, 예컨대 칼날 분쇄기에 놓아, 곤충을 입자로 감소시키는 것을 가능하게 한다.
분쇄를 용이하게 하기 위해, 일정량의 물을 첨가할 수 있다. 이러한 물의 양은 탕침 단계 1 동안 도입되는 것과 유사하다: 물의 부피 (mL) 대 곤충의 중량 (g)의 비가 바람직하게는 0.3 내지 10, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5, 더욱 더 바람직하게는 0.7 내지 3에 포함되고, 더욱 더 바람직하게는 대략 1이다. 이러한 단계를 수행하기 위해 탕침수 및/또는 중간 단계로부터 초래되는 물을 유지시키는 것이 또한 가능하다. 이러한 물은 산화제를 함유할 가능성이 있다. 이러한 경우, 큐티클 처리가 탕침 단계 1 및 분쇄 단계 2 동안 또는 중간 큐티클 처리 단계 동안 및 분쇄 단계 동안 일어날 수 있다.
바람직하게는, 분쇄 완료 시, 곤충 입자의 크기는 1 cm 미만 (현미경을 사용하여 관찰가능한 최대 입자 크기), 바람직하게는 0.5 cm 미만이다. 바람직하게는, 입자의 크기가 500 ㎛ 내지 0.5 cm, 더욱 더 바람직하게는 500 ㎛ 내지 1 mm에 포함된다.
입자의 크기를 과도하게, 예를 들어 250 ㎛ 미만의 크기로 감소시키는 것이 필수적이지 않다.
이러한 분쇄 단계 2는 효소가 이의 기질에 접근하는 것을 촉진한다.
이러한 단계에서, 이전의 중간 단계에서 지시된 바와 같은 방법에 따라 큐티클을 처리하기 위해 분쇄기 내로 산화제를 도입하는 것이 가능하다.
큐티클 처리가 분쇄와 동시에 수행되지 않는 경우, 이러한 단계 동안, 생성물 보존 및 안정성을 위해 통상적으로 사용되는 항산화제 첨가물을 첨가하는 것이 가능하다.
그 후, 분쇄 단계 2로부터 유래되는 습윤 페이스트를 압착 및 지방 분획 및 단백질 분획 양쪽 모두를 포함하는 주스의 분리를 가능하게 하는 절차에 따라 압착기 내에 놓는다.
바람직하게는, 압착 단계는 20％ 이하, 바람직하게는 15％ 이하, 더욱 바람직하게는 12％ 이하, 더욱 더 바람직하게는 10％ 이하의 오일 함량을 포함하는 압착 케이크를 수득하는 것을 가능하게 한다.
유사하게, 압착 단계는 건조물 함량이 30％ 내지 60％에 포함되고, 바람직하게는 40％ 내지 55％에 포함되며, 더욱 바람직하게는 45％ 내지 50％에 포함되는 압착 케이크를 수득하는 것을 가능하게 한다.
임의의 압착 시스템, 예를 들어, 단일-스크류 또는 이중-스크류 압착기 (앤젤 유형의 이중-스크류), 필터-압착기 (쇼퀘네 유형의 필터-압착기), 평판 압착기 등을 압착 단계를 수행하는데 사용할 수 있다. 이러한 시스템들은 관련 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 기술자는 상기 언급된 오일 및/또는 물 함량을 수득하기 위해 압착 조건을 결정할 수 있다.
분쇄 단계 2로부터의 습윤 페이스트가 산화제를 포함하는 물로 수득되었으면, 압착 단계 3 전에 이러한 산화제의 적어도 일부를 제거하는 것이 유리할 수 있다.
임의적으로 이러한 압착 단계 3은 탕침된 곤충으로부터 시작하여 분쇄 단계 2 전에 수행될 수 있다. 그러나, 압착 단계 3을 분쇄 단계 2 후에 수행하는 것이 유리하다.
따라서 이러한 압착 단계 3은 압착 주스 및 압착 케이크를 수득하는 것을 가능하게 한다.
분쇄 단계 2로부터 유래되는 습윤 페이스트 또는 압착 단계 3으로부터 유래되는 압착 케이크를 물과 함께 가수분해 탱크 내에 놓는다.
임의적으로, 그리고 하기에 기술될 바와 같이, 분리 단계 12로부터 유래되는 단백질 분획이 이를 압착 케이크와 혼합함으로서 이러한 효소 가수분해 단계 4에 재도입될 수 있다.
임의적으로, 그리고 탕침수가 산화제를 함유하지 않는 경우에, 탕침수를 회수하여 가수분해 단계에 재도입할 수 있다. 실제로, 이러한 물은 이러한 탕침 작용에 의해 가용화된 곤충 분획을 함유하고, 이를 가수분해에서 사용함으로써, 손실을 감소시키는 것이 가능하다. 임의적으로, 특정 왁스가 물에 용해되었을 수 있기 때문에 탕침으로부터의 이러한 물을 탈지시킬 수 있다.
이러한 효소 가수분해 단계 4에서 도입되는 물의 양은 탕침 단계 1에서 도입되는 것과 유사하다: 물의 부피 (mL) 대 곤충의 중량 (g)의 비가 바람직하게는 0.3 내지 10, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5, 더욱 더 바람직하게는 0.7 내지 3에 포함되고, 더욱 더 바람직하게는 대략 1이다.
효소 가수분해는 프로테아제, 예컨대 상업용 프로테아제로 4 내지 8시간, 더욱 특히 4 내지 5시간 동안 6 내지 8, 더욱 특히 6.5 내지 7.5의 pH에서 40 내지 60℃, 더욱 특히 45 내지 55℃의 온도에서 수행된다.
가수분해 단계에서 도입되는 효소의 양은 가수분해에 진입하는 건조물의 추정 총 중량을 기초로 10 중량％ 미만, 바람직하게는 6％ 미만, 더욱 바람직하게는 대략 2％이다.
단백질분해 가수분해는 펩티드, 글루코사민 및 올리고키틴을 함유하는 가용성 상, 및 키틴, 주로 키틴-폴리펩티드 공중합체로부터 형성된 고체 잔류물의 생산을 초래한다.
반응의 효소의 활성을 정지시키고 가수분해의 가용성 상을 안정화시키기 위해, 이러한 주스를 80 내지 105℃에서 10 내지 25분, 바람직하게는 15 내지 20분 동안 가열함으로써 열 불활성화를 수행한다. 한 절차에 따르면, 이러한 열 불활성화 단계 5는 농식품 산업의 일반적인 멸균 기술에 따라 수행된다. 또 다른 절차에 따르면, IR 또는 UV 조사 하에 가열함으로써 또는 마이크로파 가열에 의해 효소 불활성화가 수행된다.
주로 키틴으로 구성되는 고체 잔류물을 회수한 후, 압착액을 가용성 상 내로 재주입하기 위해, 이러한 잔류물이 최대로 탈수되도록 압착기에서 압착한다. 이렇게 형성된 압착된 잔류물은 주로 키틴-폴리펩티드 공중합체 형태인 키틴으로 본질적으로 이루어진다.
그 후, 관련 분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술에 의해 고체 잔류물을 세정하고, 여과하고, 다시 세정한 후, 건조시킨다.
유리하게는, 키틴-폴리펩티드 공중합체의 구조를 보호하도록 건조 시스템이 디자인된다: 비중측정, 환기 및 공기 조성이 제어된다. 유리하게는, 60 내지 80℃, 바람직하게는 대략 70℃의 온도의 환기 스토브에서 건조가 수행될 수 있다.
임의적으로, 이러한 단계들은 최종 지질제거 단계를 포함할 수 있다: 최종 지질 잔류물, 특히 큐티클 왁스를 제거하기 위해 고체 잔류물을 HCl로 처리한다.
다음 단계 9 내지 11은 키틴을 키토산으로 변환시키기 위한 것이고, 따라서 원하는 생성물이 키토산인 경우에만 사용된다.
그 후, 예를 들어 절단형 (칼날) 분쇄기에서, 주로 키틴을 포함하는 건조된 고체 잔류물을 분쇄한다.
탈아세틸화 반응에 의해 키틴으로부터 키토산을 생산하는 것은 키틴 입자의 크기에 크게 좌우된다. 따라서, 하기 표 1에 제시된 바와 같이, 건조된 고체 잔류물을 탈아세틸화 전에 매우 미세하게 분쇄하는 것은 탈아세틸화 반응의 수율 및 속도를 유의하게 증가시키는 것을 가능하게 한다:
<표 1>
표 1에서 보고된 테스트에서 수행된 탈아세틸화의 조건은 하기와 같다: 반응 시간 4시간, 100℃, 30 부피％의 수용액 내의 NaOH, 추정 키틴:NaOH 용액 비 = 1:20.
결과적으로, 바람직하게는 고체 잔류물을 200 ㎛ 미만, 더욱 바람직하게는 160 ㎛ 미만의 입자 크기로 분쇄한다.
그 후, 고체 잔류물 (임의적으로, 단계 9에서 분쇄됨)을 반응기 내에 놓고, 여기에 진한 수산화나트륨 용액을 4 내지 24시간, 바람직하게는 6 내지 18시간 동안 첨가한다. 30％ 내지 40％ 범위의 함량의 수용액 내의 수산화나트륨을 1:50 내지 1:10에 포함되고, 바람직하게는 대략 1:20인 분쇄된 키틴의 중량 (g) / 수용액 내의 수산화나트륨의 부피 (mL)의 비로 첨가한다. 그 후, 탱크를 가열하고, 탈아세틸화 온도는 80 내지 150℃, 바람직하게는 90 내지 120℃, 더욱 바람직하게는 100℃이다.
이렇게 하여 키토산이 분말 형태로 수득된다.
그 후, 키토산이 관능화되게 하는 관련 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 공정, 특히 라디칼 첨가 (카르복실화, 히드록실화 등)가 키토산에 진행될 수 있다.
그 후, 건조물 함량이 85％ 초과, 더욱 특히 90％ 초과인 분말을 수득하기 위해 키토산 분말을 30 내지 80℃, 바람직하게는 50 내지 70℃, 바람직하게는 약 60℃에서 건조시킨다.
다음 단계는 압착 단계 3에서 수득된 주스로부터 지방 분획 및 단백질 분획을 회수하는 것이고, 따라서 이같은 회수를 원하는 경우에만 사용된다.
지방 분획 (곤충 오일)을 단백질 분획 (곤충 혈액림프 단백질)으로부터 분리하기 위해 압착 주스에 하나 이상의 분리 단계를 진행한다. 이러한 단계들은 관련 분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 임의의 오일 분리 기술, 예컨대 원심분리, 경사분리, 역삼투에 의한 분리, 한외여과, 초임계 CO2 등, 또는 이러한 기술 중 몇몇의 조합에 의해 수행될 수 있다.
곤충 내에 매우 다양한 조성의 오일이 존재한다는 점에서 지방 분획의 분리는 복합적이고, 지방산에는 짧은 사슬 (C2-C5), 뿐만 아니라 매우 긴 사슬 (예를 들어, 왁스의 경우: > C25)이 있을 수 있다. 원심분리 동안 온도를 이러한 오일들의 융점(약 38℃)보다 높게 상승시키는 것은 이러한 크림을 가용화시킬 수 있게 하고, 지방 분획을 나머지 주스로부터 분리하는 것을 용이하게 할 수 있게 한다. 그 후, 오일 및 단백질의 최상의 가능한 분리를 위해, 원심분리가 절차에 따라 경사분리 (경사분리기 또는 트리캔터(Tricanter) 유형)로 진행된다.
이러한 단계들은 지방 분획을 수득하는 것을 가능하게 한다.
지방 분획으로부터 분리하였으면, 가수분해 단계 4 직전에 단백질 분획을 압착 단계 3으로부터 유래되는 압착 케이크와 혼합할 수 있다. 실제로, 종종 20％를 초과하는 단백질이 압착 단계 3에서 주스 내에서 손실되고, 따라서 이러한 분획을 회수하여 이를 가수분해 단계에 적용하는 것이 이롭다.
한 절차에 따라, 수성 부분의 진공 증발에 의해 농축을 수행한다. 농축물은 건조 추출물이 10％ 초과, 바람직하게는 20％ 초과이다. 이러한 공정은 건조를 용이하게 하고, 생성물 보존 및 안정성에 통상적으로 사용되는 첨가물을 이러한 단계에서 첨가할 수 있다.
마지막으로, 농축물을 관련 분야의 통상의 기술자에게 공지된 기술, 예를 들어 분사/분무에 의해 건조시키고 ("분사-건조"), 이는 펩티드 및 글루코사민이 풍부한 농축물의 추출물, 즉 건조 분말을 수득하는 것을 가능하게 하며, 특히 글루코사민은 (본질적으로) H2O2에 의한 키틴의 부분적 가수분해로부터 유래된다.
하기를 각각 나타내는 도면을 참조로, 예시의 방식으로 제공되는 하기의 실시예로부터 본 발명의 기타 특색 및 장점이 명백해질 것이다.
- 도 1은 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태의 순서도이다.
- 도 2는 1회 이상의 예비 분쇄 및 압착 단계를 포함하는 효소 방법에 의해 수득된 키틴의 순도를 비교하는 도표이다.
- 도 3은 키틴이 추출된 상이한 중간체 분획들에서 측정된 지질 함량을 비교하는 도표이다.
- 도 4는 예비 분쇄 및 압착 단계 또는 예비 압착 단계를 포함하는 효소 방법에 의해 수득된 압착 주스 및 압착 케이크 내의 지질의 분포를 나타낸다.
- 도 5는 본 발명에 따른 가수분해물 및 압착 주스 내의 단백질/펩티드의 분포를 이의 몰비 (％)에 따라 나타내는 도표이다.
- 도 6은 본 발명에 따른 가수분해물을 구성하는 아미노산의 상대적 분포를 나타내는 도표이다.
- 도 7은 키틴 내의 아미노산의 상대적 존재비를 나타내는 도표이다.
- 도 8: 압착이 가수분해물 내의 회분 함량에 미치는 효과 - 상이한 곤충.
- 도 9: 압착이 가수분해물 내의 회분 함량에 미치는 효과 - 상이한 효소.
- 도 10: 분쇄 + 압착 방법을 이용한 가수분해물 내의 회분 함량 - 상이한 곤충.
- 도 11: 프롤리브로 수행된 가수분해에 대한 상이한 방법 및 상이한 곤충에 따른 대형 단백질의 상대적 존재비.
- 도 12: 티. 몰리토르에 적용된 상이한 방법 및 상이한 효소에 따른 대형 단백질의 상대적 존재비.
- 도 13: 압착이 가수분해물의 단백질 함량에 미치는 효과 - 상이한 효소.
- 도 14: 압착이 가수분해물의 단백질 함량에 미치는 효과 - 상이한 곤충.
- 도 15: 압착이 가수분해물의 지질 함량에 미치는 효과 - 상이한 효소.
- 도 16: 압착이 가수분해물의 지질 함량에 미치는 효과 - 상이한 곤충.
- 도 17: 수득된 가수분해물의 펩신 소화성 - 조건부.
- 도 18: TM + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 19: TM + 스미자임: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 20: TM + 노보자임: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 21: TM + 뉴트라제: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 22: HI + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 23: GM + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 24: AD + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 25: 압착이 키틴 내의 회분 함량에 미치는 효과 - 상이한 효소.
- 도 26: 상이한 곤충들로부터의 키틴 내의 회분 함량.
- 도 27: 키틴 내의 지질 함량.
- 도 28: 키틴 내의 아미노산 함량.
- 도 29: TM + 프롤리브: 키틴 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 30: TM + 스미자임: 키틴 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 31: TM + 노보자임: 키틴 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 32: TM + 뉴트라제: 키틴 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 33: HI + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 34: GM + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 35: AD + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 36: 티. 몰리토르에 적용된 상이한 방법 및 상이한 효소에 따른 키틴의 중량측정 순도.
- 도 37: 프롤리브를 이용한 상이한 방법 및 상이한 곤충에 따른 키틴의 중량측정 순도.
- 도 38: 티. 몰리토르를 이용한 상이한 방법 및 상이한 효소에 따른 키틴의 비색측정 순도.
- 도 39: 프롤리브를 이용한 상이한 방법 및 상이한 곤충에 따른 키틴의 비색측정 순도.
- 도 40: 키틴의 차이에 의한 순도.
- 도 41: 티. 몰리토르에 대한 방법에 의해 수득된 키틴의 아세틸화도.
- 도 42: 프롤리브를 이용한 방법에 의해 수득된 키틴의 아세틸화도.
- 도 43: 2-광자 형광 현미경에 의한 큐티클 영상화.
- 도 44: 수득된 키틴의 결정화도.
- 도 45: 가수분해물 내의 단백질의 크기.
- 도 1은 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태의 순서도이다.
- 도 2는 1회 이상의 예비 분쇄 및 압착 단계를 포함하는 효소 방법에 의해 수득된 키틴의 순도를 비교하는 도표이다.
- 도 3은 키틴이 추출된 상이한 중간체 분획들에서 측정된 지질 함량을 비교하는 도표이다.
- 도 4는 예비 분쇄 및 압착 단계 또는 예비 압착 단계를 포함하는 효소 방법에 의해 수득된 압착 주스 및 압착 케이크 내의 지질의 분포를 나타낸다.
- 도 5는 본 발명에 따른 가수분해물 및 압착 주스 내의 단백질/펩티드의 분포를 이의 몰비 (％)에 따라 나타내는 도표이다.
- 도 6은 본 발명에 따른 가수분해물을 구성하는 아미노산의 상대적 분포를 나타내는 도표이다.
- 도 7은 키틴 내의 아미노산의 상대적 존재비를 나타내는 도표이다.
- 도 8: 압착이 가수분해물 내의 회분 함량에 미치는 효과 - 상이한 곤충.
- 도 9: 압착이 가수분해물 내의 회분 함량에 미치는 효과 - 상이한 효소.
- 도 10: 분쇄 + 압착 방법을 이용한 가수분해물 내의 회분 함량 - 상이한 곤충.
- 도 11: 프롤리브로 수행된 가수분해에 대한 상이한 방법 및 상이한 곤충에 따른 대형 단백질의 상대적 존재비.
- 도 12: 티. 몰리토르에 적용된 상이한 방법 및 상이한 효소에 따른 대형 단백질의 상대적 존재비.
- 도 13: 압착이 가수분해물의 단백질 함량에 미치는 효과 - 상이한 효소.
- 도 14: 압착이 가수분해물의 단백질 함량에 미치는 효과 - 상이한 곤충.
- 도 15: 압착이 가수분해물의 지질 함량에 미치는 효과 - 상이한 효소.
- 도 16: 압착이 가수분해물의 지질 함량에 미치는 효과 - 상이한 곤충.
- 도 17: 수득된 가수분해물의 펩신 소화성 - 조건부.
- 도 18: TM + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 19: TM + 스미자임: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 20: TM + 노보자임: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 21: TM + 뉴트라제: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 22: HI + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 23: GM + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 24: AD + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 25: 압착이 키틴 내의 회분 함량에 미치는 효과 - 상이한 효소.
- 도 26: 상이한 곤충들로부터의 키틴 내의 회분 함량.
- 도 27: 키틴 내의 지질 함량.
- 도 28: 키틴 내의 아미노산 함량.
- 도 29: TM + 프롤리브: 키틴 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 30: TM + 스미자임: 키틴 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 31: TM + 노보자임: 키틴 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 32: TM + 뉴트라제: 키틴 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 33: HI + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 34: GM + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 35: AD + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 36: 티. 몰리토르에 적용된 상이한 방법 및 상이한 효소에 따른 키틴의 중량측정 순도.
- 도 37: 프롤리브를 이용한 상이한 방법 및 상이한 곤충에 따른 키틴의 중량측정 순도.
- 도 38: 티. 몰리토르를 이용한 상이한 방법 및 상이한 효소에 따른 키틴의 비색측정 순도.
- 도 39: 프롤리브를 이용한 상이한 방법 및 상이한 곤충에 따른 키틴의 비색측정 순도.
- 도 40: 키틴의 차이에 의한 순도.
- 도 41: 티. 몰리토르에 대한 방법에 의해 수득된 키틴의 아세틸화도.
- 도 42: 프롤리브를 이용한 방법에 의해 수득된 키틴의 아세틸화도.
- 도 43: 2-광자 형광 현미경에 의한 큐티클 영상화.
- 도 44: 수득된 키틴의 결정화도.
- 도 45: 가수분해물 내의 단백질의 크기.
실시예 1: 본 발명에 따른 방법의 예
600 g의 티. 몰리토르 유충을 비커에 도입하고, 미리 끓인 600 mL의 물을 함유하는 100℃의 수조 내에 놓는다. 5분 후, 비커를 수조에서 제거하고, 유충을 탈수시킨 후, 600 mL 부피의 물과 혼합한다. 이렇게 수득된 액체를 하기 조건 하에 앤젤 유형의 이중-스크류 압착기로 압착한다:
- 속도 = 82회의 회전/분;
- W (에너지) = 3 HP (마력) 또는 2.68 × 106 J;
- 공극률 (대략적) = 제1 부분은 0.5 mm, 마지막 부분은 0.2 mm.
이렇게 하여 압착 주스 및 습윤 중량 136.49 ± 4.48 g의 압착 케이크를 수득하고, 이 중 100.22 ± 0.22 g을 다음 단계에서 사용한다. 그러나, 수분 함량 및/또는 지질 함량 면에서 실질적으로 유사한 압착 케이크를 추출 및 수득하게 한다면, 임의의 다른 유형의 압착기를 사용할 수 있다. 예를 들어, 하기 특색을 갖는 쇼퀘네 유형의 필터 압착기로 다른 테스트를 수행하였다:
- 셀의 여과 표면적 = 50 ㎠;
- 압력 = 2 내지 8 바;
- 온도 = 20 내지 80℃,
- 공극률 = 25 내지 80 ㎛;
- 여과 종료 시의 유속 = 100 내지 250 mL/h.
압착 케이크를 1％ (압착 케이크의 습윤 중량에 대해 상대적)의 프로테아제 (프롤리브 NP 농축물)의 용액 600 mL를 함유하는 삼각 플라스크로 옮기고, 전체를 4시간 동안 45℃에서 (약 6.5의 pH에서) 자기 교반한다. 그 후, 효소를 비활성화시키기 위해 삼각 플라스크를 15분 동안 90℃의 수조 내에 놓은 후, 용액을 0.45-0.5 ㎛에서 고온 여과한다. 이렇게 수득된 키틴을 24시간 동안 70℃에서 건조시킨다. 이렇게 하여, 16.99 ± 1.77 g의 키틴이 이러한 방법으로 수득된다. 이러한 조건 하에, 가수분해물 (가수분해 후에 수득된 여과액)은 건조물 함량이 5.05％인 609.98 ± 10.9 g을 나타내고, 이는 동결건조 후 30.8 ± 0.55 g의 건조 가수분해물을 수득하는 것을 가능하게 한다.
실시예 2: 효소 가수분해 이전의 기계적 단계가 수득되는 키틴의 순도에 미치는 영향
여러 유형의 기계적 전처리를 테스트하였다 - 분쇄 ("분쇄 1") 단독, 분쇄 후 압착, 분쇄 후 압착 및 2차 분쇄 ("분쇄 2"), 뿐만 아니라 압착 단독.
압착을 위해, 실시예 1에 기술된 앤젤 유형의 압착기를 사용하였다.
1. 물질 및 방법
1회의 분쇄를 이용한 키틴 생산
200 g의 티. 몰리토르 유충을 비커 내로 도입하고, 미리 끓인 200 mL의 물을 함유하는 100℃의 수조 내에 놓는다. 5분 후, 비커를 수조에서 제거하고, 유충을 탈수시킨 후, 200 mL 부피의 물과 혼합한다. 이렇게 수득된 액체를 2 g의 프로테아제 (프롤리브)를 함유하는 삼각 플라스크로 옮기고, 전체를 4시간 동안 45℃에서 (약 6.5의 pH에서) 자기 교반한다. 그 후, 효소를 비활성화시키기 위해 삼각 플라스크를 15분 동안 90℃의 수조 내에 놓은 후, 용액을 0.45-0.5 ㎛에서 고온 여과한다. 이렇게 수득된 키틴을 24시간 동안 70℃에서 건조시킨다. 이렇게 하여, 8.13 ± 0.27 g의 키틴이 이러한 방법으로 수득된다.
분쇄 후 압착을 이용한 키틴 생산
200 g의 티. 몰리토르 유충을 비커 내로 도입하고, 미리 끓인 200 mL의 물을 함유하는 100℃의 수조 내에 놓는다. 5분 후, 비커를 수조에서 제거하고, 유충을 탈수시킨 후, 200 mL 부피의 물과 혼합한다. 이렇게 수득된 액체를 이중-스크류 유형의 압착기에 통과시킨다. 이렇게 수득된 압착 케이크 30 g을 150 mL의 물 및 0.3 g의 프로테아제 (프롤리브)를 함유하는 삼각 플라스크로 옮기고, 전체를 4시간 동안 45℃에서 (약 6.5의 pH에서) 자기 교반한다. 그 후, 효소를 비활성화시키기 위해 삼각 플라스크를 15분 동안 90℃의 수조 내에 놓은 후, 용액을 0.45-0.5 ㎛에서 고온 여과한다. 이렇게 수득된 키틴을 24시간 동안 70℃에서 건조시킨다. 이렇게 하여, 4.71 ± 0.11 g의 키틴이 이러한 방법으로 수득된다.
1차 분쇄 ("분쇄 1") 후 압착 및 2차 분쇄 ("분쇄 2")를 이용한 키틴 생산
200 g의 티. 몰리토르 유충을 비커 내로 도입하고, 미리 끓인 200 mL의 물을 함유하는 100℃의 수조 내에 놓는다. 5분 후, 비커를 수조에서 제거하고, 유충을 탈수시킨 후, 200 mL 부피의 물과 혼합한다. 이렇게 수득된 액체를 이중-스크류 유형의 압착기에 통과시킨다. 이렇게 수득된 압착 케이크를 24시간 동안 70℃의 오븐에서 건조시킨 후, 250 ㎛로 분쇄한다. 이렇게 수득된 분말 10 g을 50 mL의 물 및 0.1 g의 프로테아제 (프롤리브)를 함유하는 삼각 플라스크로 옮기고, 전체를 4시간 동안 45℃에서 (약 6.5의 pH에서) 자기 교반한다. 그 후, 효소를 비활성화시키기 위해 삼각 플라스크를 15분 동안 90℃의 수조 내에 놓은 후, 용액을 0.45-0.5 ㎛에서 고온 여과한다. 이렇게 수득된 키틴을 24시간 동안 70℃에서 건조시킨다. 이렇게 하여, 4.93 ± 0.12 g의 키틴이 이러한 방법으로 수득된다.
압착 단독을 이용한 키틴 생산
200 g의 티. 몰리토르 유충을 비커 내로 도입하고, 미리 끓인 200 mL의 물을 함유하는 100℃의 수조 내에 놓는다. 5분 후, 비커를 수조에서 제거하고, 유충을 탈수시킨 후, 이중-스크류 유형의 압착기에 통과시킨다. 이렇게 수득된 압착 케이크 90 g을 450 mL의 물 및 0.9 g의 프로테아제 (프롤리브)를 함유하는 삼각 플라스크로 옮기고, 전체를 4시간 동안 45℃에서 (약 6.5의 pH에서) 자기 교반한다. 그 후, 효소를 비활성화시키기 위해 삼각 플라스크를 15분 동안 90℃의 수조 내에 놓은 후, 용액을 0.45-0.5 ㎛에서 고온 여과한다. 이렇게 수득된 키틴을 24시간 동안 70℃에서 건조시킨다. 이렇게 하여, 6.48 ± 0.28 g의 키틴이 이러한 방법으로 수득된다.
화학적 경로에 의한 키틴 생산
50 g의 티. 몰리토르 유충을 비커에 도입하고, 미리 끓인 50 mL의 물을 함유하는 100℃의 수조 내에 놓는다. 5분 후, 비커를 수조에서 제거하고, 유충을 탈수시킨 후, 60 mL 부피의 물과 혼합한다. 이렇게 수득된 액체를 1-L 용기로 옮기고, 500 mL의 1 M HCl 용액을 첨가한다. 전체를 1시간 동안 90℃에서 교반한다. 그 후, 내용물을 여과하고, 고체 잔류물을 500 mL의 1 M NaOH 용액을 함유하는 1-L 플라스크로 옮기고, 전체를 90℃에서 24시간 동안 교반한다. 그 후, 잔류물을 여과하고, 24시간 동안 70℃의 환기 스토브에 놓는다. 이렇게 하여, 0.944 ± 0.005 g의 화학적으로 정제된 키틴이 수득된다.
순도 계산
수득된 건조 잔류물의 중량을 화학적 추출로부터 초래되는 것 (최초의 건조물의 약 5％)에 비교함으로써 키틴의 순도를 결정한다.
지질 함량 측정
2 g의 샘플을 비커에 놓고, 여기에 0.2 g의 Na2SO4 및 15 mL의 CHCl3/MeOH (2/1 v/v)를 첨가한다. 전체를 20분 동안 자기 교반한 후, 용액을 여과하고, 잔류물을 다시 10 mL의 CHCl3/MeOH (2/1 v/v)가 있는 비커에 놓는다. 전체를 15분 동안 자기 교반한 후, 용액을 여과하고, 용매 상을 합치고, 일정 중량으로 증발시킨다. 샘플의 최초 중량 (2 g)에 대해 상대적인 추출-증발 후의 중량 백분율로서 지질 함량을 결정한다.
2. 결과
도 2에서 볼 수 있듯이, 수득되는 키틴의 순도에 방법이 영향을 미치고, 최소 압착으로 최상의 결과들이 수득된다. 분쇄 후 압착으로 최상의 결과가 수득되고, 즉 키틴의 순도가 78％이며, 분쇄 단독으로 최악의 결과가 수득되고, 즉, 키틴의 순도가 48％이다.
키틴이 추출된 중간체의 더 세밀한 분석은 낮은 지질 함량이 수득되는 키틴의 순도가 더 큰 것을 촉진한다는 것을 나타낸다 (도 3). "중간체"는 효소 가수분해에 진입하는, 다시 말해 가수분해 전의 마지막 단계, 즉 상기 언급된 생산 방법에 따르면 분쇄 단계 1 또는 2 또는 압착 단계로부터 유래되는 생성물을 의미한다.
실제로, 키틴 및 가수분해 주스 내의 지질 함량의 분석은 중간체 내에 존재하는 최초의 지질 함량에 따라, 키틴 내의 지질 함량은 7 내지 15％로 안정적인 반면, 가수분해물 내의 지질 함량은 11 내지 47％로 다양하다는 것을 나타낸다 (도 3).
더욱 특히, 중간체의 지질 함량이 35％면,
- 가수분해로부터 초래될 키틴이 50％만 순수할 것이고, 10％ 지질을 포함할 것이고,
- 가수분해물의 지질 함량 자체가 40％에 가까울 것이다.
그러나, 중간체의 지질 함량이 7％면,
- 가수분해 후에 수득되는 키틴이 순도가 80％일 것이고, 지질 함량이 8％일 것이며, 가수분해물 또한 대략 10％로 지질 함량이 낮을 것이다.
이는 최초의 지질 함량이 12％ 초과로 높으면, 가수분해를 담당하는 효소가 촉매 혼란(promiscuity)으로 인해 단백질뿐만 아니라 지질을 또한 가수분해하게 된다는 것을 가리킨다. 따라서, 최초의 지질이 각각 35 및 7％인 경우에 유사한 키틴 내 지질 함량, 즉 8.6 및 7.9％가 수득된다. 그러나, 이러한 경우에 키틴의 순도가 각각 48％에서 84％로 변화된다. 따라서, 한쪽의 52％의 불순물 및 다른쪽의 16％ 중에서, 평균 8％가 지질로 인한 것이고, 그러므로, 여전히 키틴에 부착되어 있는 단백질의 양이 가수분해에 적용되는 중간체에 더 많은 지질이 존재한 경우에 38포인트 더 높다.
마지막으로, 압착 이전의 분쇄의 중요성을 또한 연구할 수 있다 (도 4). 따라서, 예비 분쇄가 수행되었을 때 케이크와 압착 주스 사이의 지질 분포가 42.7 대 57.3에 대비하여 12.9 대 87.1로 훨씬 더 효과적이라는 것을 명확하게 볼 수 있다.
실시예 3: 가수분해물의 분석
실시예 1에서 수득된 가수분해물에 대해 상세 분석을 수행하였다.
1. 글루코사민 함량
가수분해물 내의 글루코사민 및 특정한 다른 당의 함량을 가메탄올분해 및 실릴화 후에 기체 크로마토그래피에 의해 분석하였다.
절차:
10 mg의 샘플 및 50 ㎍의 내부 표준물을 4시간 동안 110℃에서 (또는 24시간 동안 130℃에서) 500 ㎕의 메탄올/3N 염산 혼합물 내에 놓는다. 그 후, 혼합물을 Ag2CO3로 중화한다. 존재하는 임의의 아미노당을 다시 아세틸화시키기 위해 50 ㎕의 아세트산 무수물을 첨가한다. 주위 온도의 암실에서 하룻밤 동안 유지시킨 후, 샘플을 원심분리하고 (15분, 3000 rpm), 상청액을 증발시킨다. 그 후, 화합물을 100 ㎕의 피리딘에 용해시키고, 100 ㎕의 BSTFA (수펠코(Supelco))와 함께 주위 온도에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다. 그 후, 시약을 증발시키고, 잔류물을 700 ㎕의 CH2Cl2에 용해시키고, GC에 주입한다.
온도 프로그램: 120℃에서 1분, 180℃까지 1.5℃/분의 구배, 그 후 200℃까지 2℃/분.
검출: FID
칼럼: HP-5MS (30 m, 0.25 mm 내경)
내부 표준물: 미오-이노시톨
2가지 상이한 방식으로 다양한 함량을 측정하고 계산하였다 (표 2). 글루코사민이 0.1-0.15 중량％의 함량 및 글루코스에 대한 0.04-0.05의 비로 가수분해물 내에 존재한다는 것을 볼 수 있다.
<표 2>
2. 단백질 크기
가수분해물 내의 단백질/펩티드의 크기를 HPLC, 시마즈(Shimadzu) 20A 기기에 의해 주위 온도에서 수퍼덱스 펩티드(Superdex Peptide) 10/300 GL 칼럼 상에서 0.4 mL/분의 유속으로 아세토니트릴 (ACN) 30％, 트리플루오로아세트산 (TFA) 0.1％의 완충제에서 평가하였다. 205 nm에서 검출하였고, 주입된 샘플 부피는 20 ㎕였다.
또한, 비교 목적을 위해 실시예 1에서 제조된 압착 주스 내의 단백질/펩티드의 크기도 동일한 조건 하에 평가하였다.
압착 주스와 가수분해물 사이의 단백질 크기의 비교 (도 5)는 가수분해물 내에 존재하는 펩티드의 대부분 (76％)이 몰질량이 130 내지 900 Da에 포함된다는 것을 명확하게 나타낸다. 그러나, 소화성이 낮은 단백질 (몰질량이 1300 Da을 초과함)의 비율은 31％에서 2％로 감소된다. 유사하게, 쓴맛 특성이 있는 펩티드 (몰질량이 130 Da 미만임)의 비율이 38％에서 15％로 하락한다. 따라서, 제안된 효소 처리에 의해 소화성 및 식미(palatability)가 개선된다.
3. 소화성
가수분해물의 펩신 소화성의 수준이 총 단백질의 99.6％로 추정된다. 이는 외부 실험실에서 측정되었고, 사용된 방법은 72/199/EEC 지침에 따르며, 탈지하지 않고 수행되었다.
4. 단백질 함량
가수분해물 내의 단백질 함량이 84.8％로 추정된다. 이는 6.25의 보정 인자로 킬달(Kjeldahl) 방법에 의해 외부 실험실에서 측정되었다. 사용된 방법은 EC 규정 152/2009에 따른다.
5. 지질 함량
가수분해물 내의 지질 함량이 0.7 ± 0.5％로 추정된다. 이는 EC 규정 152/2009로부터 개조된 소위 "가수분해" 방법 (방법 B)에 의해 외부 실험실에서 측정되었다.
6. 아미노산 조성
다양한 효소로 처리한 후에 수득된 가수분해물을 이의 아미노산 조성에 대해 분석하였다 (도 6). 이는 프롤린의 대사산물이고 특정 생물, 예를 들어, 갑각류에 부재하는 아미노산인 히드록시프롤린 (HYP)의 존재와 함께 프롤린이 우세한 것을 나타낸다. 현재, 프롤린 및 이의 대사산물인 히드록시프롤린은, 특히 다른 아미노산 예컨대 아르기닌 및 글루타메이트의 합성을 허용하는 것에 의해, 대사에서 필수적인 역할을 한다. 대부분의 포유동물이 프롤린을 합성할 수 있지만, 신생아, 조류 및 어류에 의한 이러한 아미노산의 생산이 불충분하고, 이러한 이유로 특정 동물의 성장을 증가시키기 위해 프롤린 및 히드록시프롤린의 보충이 때때로 사용된다. 또한, 프롤린은 포유동물의 젖에 함유된 제1 아미노산으로, 12％의 함량으로 존재하지만, 식물 단백질 내의 이의 함량은 훨씬 적어서, 대두에서는 2.9％, 옥수수에서는 0.8％일 뿐이다. 따라서, 이러한 가수분해물은 프롤린 함량이 젖만큼 높고, 식물 단백질에서 발견되는 것보다 훨씬 더 높은 것으로 확인된다.
대량으로 존재하는 다른 아미노산은 알라닌, 류신 및 글루타메이트 (글루타민 포함)이다. 이들의 상대적 비는 9％를 초과한다. 그러나, 황-함유 아미노산 예컨대 시스테인 및 메티오닌은 대략 0.5％의 낮은 양으로 존재한다.
이러한 결과를 결정하는데 사용된 방법 (산 가수분해)는 트립토판 및 아르기닌과 같은 아미노산의 검출을 가능하게 하지 않았다. 또한, 아스파라긴은 아스파르트산으로, 글루타민은 글루탐산으로 완전히 변환되었고, Asp 및 Glu 피크 하에 관찰되는 것은 실제로는 각각 한쪽은 최초에 가수분해물 내에 존재하는 아스파르트산 및 아스파라긴의 합계이고, 다른 한쪽은 최초에 가수분해물 내에 존재하는 글루탐산 및 글루타민의 합계이다.
실시예 4: 키틴 분석
실시예 1에서 수득된 키틴에 대해 상세한 아미노산 분석을 수행하였다.
총 아미노산 함량은 공중합체 100 g 당 32.3 g이다 (아미노산의 합계로 결정됨). 존재하는 아미노산은 주로 발린, 글리신, 알라닌 및 타이로신이다 (도 7).
분석을 하청주었고, 결과는 트립토판의 경우는 NF EN ISO 13904 방법, 다른 아미노산의 경우는 NF EN ISO 13903 방법으로 수득되었다.
실시예 5: 사용된 생산 방법에 따른 가수분해물 및 키틴의 특성화
I.
물질 및 방법
a) 물질
곤충
다양한 곤충을 연구하였다:
- 딱정벌레목 곤충: 테네브리오 몰리토르 (티. 몰리토르 또는 TM),
- 나비목 곤충: 갈레리아 멜로넬라 (지. 멜로넬라(G. melonella) 또는 GM),
- 파리목 곤충: 헤르메티아 일루센스 (에이치. 일루센스(H. illucens) 또는 HI), 및
- 메뚜기목 곤충: 아케타 도메스티쿠스 (에이. 도메스티쿠스(A. domesticus) 또는 AD).
효소
다양한 효소를 가수분해 단계에서 사용하였다.
이러한 효소 활성 측정은 단백질분해 효소에 의한 카세인 가수분해 동안의 275 nm에서의 타이로신 방출 측정의 원리를 기초로 한다 (카렌 프랫(Karen PRATT)에 의한 밸리 리서치 SAPU 어세이(Valley Research SAPU Assay) 방법).
SAPU/g = 프로테아제의 분광광도법 단위
ΔA = 보정된 흡광도
i = 원점에서의 y-축
11 = 최종 반응 부피
M = 검정 곡선의 경사
30 = 반응 시간 (분)
C = 첨가된 효소 용액 내의 효소 농도 (g/mL)
1 = 첨가된 효소 용액의 1 mL 부피
포스페이트 완충제 (0.2 M, pH 7) 내의 여러 농도의 타이로신 용액의 흡광도를 측정함으로써 검정 곡선을 수득한다.
5 mL의 카세인 용액 (0.7％ w/v, 포스페이트 완충제 0.2 M, pH 7, 30분 동안 90℃에서 가열되고, 3.75 g/L용액으로 첨가됨)을 1 mL의 테스트할 효소 용액 (100 mL의 글리신 완충제, 0.05 M 내의 0.15 g)과 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 그 후, 5 mL의 TCA 용액 (18 g TCA, 11.35 g의 무수 아세트산나트륨, 21 mL의 빙초산을 무기질을 제거한 물로 1 리터의 용액으로 만듦)을 첨가하고, 와동기 상에서 혼합하고, 여과하고, 275 nm에서 흡광도를 측정한다.
대조군을 동일하게, 그러나 효소를 첨가하지 않고 제조하고, 대신 반응 부피를 동일하게 하기 위해 무기질을 제거한 물 1 mL를 첨가한다.
사용된 다양한 효소 (프롤리브 NP, 노보자임 37071, 뉴트라제 및 스미자임)에 대해 이렇게 측정된 활성이 표 3에서 열거된다.
<표 3>
b) 생산 방법
분쇄만 이용하는 생산 방법 (도면에서 "분쇄"로 표기됨)
600 g의 신선한 곤충 (티. 몰리토르, 지. 멜로넬라 또는 에이치. 일루센스의 경우는 유충; 에이. 도메스티쿠스의 경우는 귀뚜라미)을 챔버에 도입하고, 증기 (115℃, 5분)로 도살한다. 그 후, 곤충을 혼합기에 도입하고, 곤충 100 g 당 75 mL의 물을 첨가하고, 전체를 혼합한다. 그 후, 이렇게 수득된 생성물 100 g (습윤 중량)을 응축기 및 기계적 교반기가 장착된 3목 플라스크에 도입하고, 3789 SAPU에 등가인 활성의 단백질분해 효소를 첨가한다. 그 후, 반응을 4시간 동안 45℃로 가열한다. 그 후, 15분 동안 온도를 90℃로 상승시키고, 마지막으로 반응 혼합물을 여과한다 (0.40-0.45 ㎛). 잔류물을 24시간 동안 70℃에서 건조시킨다: 이렇게 하여 이는 효소 경로에 의한 정제에 의해 수득된 키틴이다; 여과액을 동결 건조시킨다: 이렇게 하여 이는 가수분해물이다.
어떤 곤충 또는 효소가 연구되든지 방법은 동일하다.
분쇄 후의 압착을 이용하는 생산 방법 (도면에서 "분쇄 + 압착"으로 표기됨)
600 g의 신선한 곤충 (티. 몰리토르, 지. 멜로넬라 또는 에이치. 일루센스의 경우는 유충; 에이. 도메스티쿠스의 경우는 귀뚜라미)을 챔버에 도입하고, 증기 (115℃, 5분)로 도살한다. 그 후, 곤충을 혼합기에 도입하고, 곤충 100 g 당 75 mL의 물을 첨가하고, 전체를 혼합하고, 압착한다 (이중-스크류 압착기, 또는 필터 압착기, 또는 기타 압착 시스템). 그 후, 이렇게 수득된 생성물 100 g (습윤 중량)을 응축기 및 자기 교반기가 장착된 3목 플라스크에 도입하고, 500 mL의 물, 뿐만 아니라 3789 SAPU에 등가인 활성의 단백질분해 효소를 첨가한다. 그 후, 반응을 4시간 동안 45℃로 가열한다. 그 후, 15분 동안 온도를 90℃로 상승시키고, 마지막으로 반응 혼합물을 여과한다 (0.40-0.45 ㎛). 잔류물을 24시간 동안 70℃에서 건조시킨다: 이렇게 하여 이는 효소 경로에 의한 정제에 의해 수득된 키틴이다; 여과액을 동결 건조시킨다: 이렇게 하여 이는 가수분해물이다.
어떤 곤충 또는 효소가 연구되든지 방법은 동일하다.
c) 분석
회분 함량 측정
2009년 1월 27일자의 EC 규정 152/2009를 기초로 하는 방법에 의해 회분 함량을 결정하였다.
단백질 크기 측정
100 mg의 샘플을 10 mL의 포스페이트/NaCl 완충제 (pH 7.4, 0.137 mM)에 도입하였다. 샘플을 1분 동안 교반하고 (와동기), 900 g에서 1분 동안 원심분리한 후, 0.45 ㎛ 막으로 여과하였다. 입체 배제 크로마토그래피 시스템에서 누클레오겔(Nucleogel) GFC-300 칼럼으로 분석을 수행하였고, 사용된 용리제는 포스페이트/NaCl 완충제 (pH 7.4, 0.137 mM)이고, 유속은 1.0 mL/분이며, 280 nm에서 UV 검출기로 검출한다.
단백질 함량 측정
표준 NF EN ISO 16634-1로부터 개조된, 변환 인자 6.25의 두마스(Dumas) 방법에 의해 단백질 함량을 수득한다.
지질 함량 측정
EC 규정 152/2009로부터 개조된 방법 - 방법 B - SN에 의해 지질 함량을 수득한다.
펩신 소화성
72/199/EC 지침에 기술된 방법에 의해 펩신 소화성을 측정한다.
아미노산의 상대적 존재비
2009년 1월 27일자의 EC 규정 152/2009로부터 유래되는 방법 - SN에 의해 아미노산의 존재비를 결정하였다. 2009년 1월 27일자의 EC 규정 152/2009로부터 개조된 방법 - SN에 의해 트립토판 함량을 별도로 결정하였다. 각각의 아미노산의 함량을 아미노산 함량에 비교함으로써 상대적 존재비를 계산하였다.
아미노산 함량
트립토판을 포함하여 각각의 아미노산에 대해 수득된 개별적인 값을 합산함으로써 아미노산 함량을 결정하였다.
중량측정 순도
수득된 건조 잔류물의 중량을 화학적 추출로부터 초래되는 것에 비교함으로써 중량측정 순도를 결정하고, 후자는 최초의 건조물의 약 5％인 것으로 평가된다.
비색측정 순도
이들의 평균이 실제 색상의 평가를 나타내는 3가지 색상인 적색, 녹색 및 청색 (RGB)에 따라 이미지제이(ImageJ) 소프트웨어를 사용하여 샘플의 사진을 분석함으로써 샘플의 색을 추정하였다. 키틴 프랑스(Chitine France)가 판매하는 새우 키틴의 샘플을 표준물 (100％ 순도)로 취하였고, 생산된 샘플의 비색측정 순도를 이러한 색상의 백분율 (샘플 색상 대 표준물 색상의 비)로서 계산하였다.
차이에 의한 순도
이러한 측정의 경우, 공지된 불순물 (아미노산, 지질 및 회분)의 양을 절대 순도의 값 (100％)으로부터 차감하여 차이에 의해 추정되는 순도의 값을 수득하였다; 즉, 이에 따라 30％ 단백질, 10％ 지질 및 1％ 회분을 함유하는 샘플에 100-30-10-1=59％의 순도를 할당한다.
결정화도
링크스아이(Lynxeye) XE 검출기가 장착된 브루커 D8 어드밴스(Bruker D8 Advance) 기기 (A25 다빈치(DaVinci) 디자인)에서 WAXS (광각 X선 산란) 기술에 따라 측정하였다. 결과를 문헌 [Loelovich, M. Res. Rev.: J. Chem. 2014, 3, 7-14]에 기술된 방법에 따라 해석하였다.
아세틸화도
800 MHz 자석이 장착된 13C NMR CP/MAS (브루커(Bruker)) 기기를 사용하여 측정하였다.
결과를 문헌 [Simionatto Guinesi, L.; Gomes Cavalheiro, E. T. Thermochimica Acta 2006, 444, 128-133] 및 [Heux, L.; Brugnerotto, J.; Desbrieres, J.; Versali, M.-F.; Rinaudo, M. Biomacromolecules 2000, 1, 746-751]에 기술된 바와 같이 분석하였다.
원자 및 관능기의 표면 존재비의 측정
RX Ka A1 광원 (1486.6 eV), 단색화장치 및 자기 렌즈가 장착된 XPS 에스코랩(Escolab) 250 (VG 사이언티픽(VG Scientific)) 기기를 사용하여 측정하였다.
미리 분말로 감소시킨 샘플을 48 내지 72시간 동안 진공 하에 놓은 후, 분석하였다.
2-광자 형광 현미경에 의한 큐티클 영상화
DISCO 기기 (싱크로트론 솔레이유(Synchrotron Soleil)) 상의 다광자 현미경.
람다 exc=810 nm, 파워 18％, 터키 블루 및 황토색 필터 406/15 (SHG), 청색 필터 460/60, 녹색 필터 550/88.
II.
가수분해물
a) 회분
어떤 곤충이 연구되든지 (도 8), 압착이 수득되는 가수분해물 내의 회분 함량에 매우 유의하게 영향을 미친다. 실제로, 회분 함량의 감소가 52％에 도달할 수 있고, 곤충에 천연적으로 무기질이 풍부하든 그렇지 않든 비례적 감소가 꽤 유사하다. 따라서, 에이치. 일루센스의 경우, 회분 함량이 분쇄를 이용하는 방법이 사용된 경우의 7.5 g/건조물 100 g에서 압착 단계가 추가된 경우의 3.8 g/건조물 100 g으로 변화되고, 즉 49％ 감소하고; 티. 몰리토르의 경우, 이는 5 g/100 g에서 2.4 g/100 g으로 변화되고, 즉 52％ 감소한다.
또한, 어떤 효소가 사용되든지 (도 9), 압착이 수득되는 가수분해물 내의 회분 함량에 매우 유의하게 영향을 미친다. 특히, 티. 몰리토르의 경우, 효소와 관계없이, 압착을 이용하는 방법이 사용된 경우 가수분해물 내의 회분 함량이 3％ 미만인 것이 주목된다.
어떤 곤충이 연구되든지 (도 10), 가수분해물 (분쇄 + 압착 방법에 의해 수득됨) 내의 회분 함량은 4 g/건조물 100 미만이다.
b) 가수분해물 내의 단백질의 크기
어떤 곤충 (도 11) 또는 효소 (도 12)가 사용되든지, 압착 단계의 사용이 단백질분해 효소의 성능을 개선하는 것을 명백하게 가능하게 한다. 따라서, 분쇄 단계만 포함하는 방법에 비해 대형 단백질의 상대적 존재비가 유의하게 하락하여, 프롤리브로 수행된 가수분해의 경우, 어떤 곤충이든지 최종 가수분해물이 이를 최대 10.3％ 초과로 포함하지 않고, 티. 몰리토르의 가수분해의 경우, 어떤 효소가 사용되든지 17.5％ 초과로 포함하지 않는다.
c) 단백질 함량
가수분해물의 단백질 함량이 사용된 방법에 고도로 의존적이다. 따라서, 분쇄만 적용된 경우, 어떤 효소가 사용되든지 (도 13), 단백질이 이렇게 수득된 티. 몰리토르로부터의 가수분해물의 건조물의 53.59 ± 1.5％만 나타낸다. 그러나, 분쇄 후에 압착되는 경우에는, 가수분해물 내의 단백질 함량이 84.58 ± 1.4％가 되고, 따라서, 사용된 효소에 따라 53-62％ 증가된다.
곤충에 원래 단백질이 빈약하였으면 이러한 증가가 더 크고, 따라서 지. 멜로넬라의 경우, 단백질 함량이 41.25％에서 71％로 변화하여 거의 86％ 증가되고, 에이치. 일루센스의 경우는 심지어 증가가 118％인데, 34.2％에서 74.5％로 변화되기 때문이다 (도 14).
d) 지질 함량
어떤 효소 (도 15) 또는 곤충 (도 16)이 연구되든지, 압착이 가수분해물의 지질 함량에 중대한 영향을 미친다. 실제로, 지질 함량이 51.4-97.7％만큼 극적으로 감소하고, 따라서 에이치. 일루센스의 경우에는 28.6％에서 13.9％로 변화하고 (51.4％ 감소), 티. 몰리토르 + 노보자임의 경우에는 33.85％에서 0.9％로 변화한다 (97.3％ 감소).
e) 펩신 소화성
어떤 효소 또는 곤충이 연구되든지 (도 17), 이렇게 수득된 가수분해물의 펩신 소화성이 96％ 초과로 매우 높다.
f) 아미노산 존재비
어떤 효소 또는 곤충이 연구되든지 (도 18-24), 압착 단계의 사용이 큐티클 내에 더 많이 존재하는 아미노산, 예컨대 알라닌 및 타이로신, 그리고 더 적은 정도로 발린, 세린 및 글리신의 더 양호한 추출을 수득하는 것을 가능하게 한다 (도 18-24). 이러한 결과들은 효소로 정제된 키틴 내에 존재하는 아미노산에 관련된 것들 (도 29-35)과 또한 비교되어야 한다.
주: 아스파르트산 및 글루타메이트를 특히 포함하여 특정 아미노산의 상대적 존재비가 감소되지만, 이들의 양은 동일하게 유지되거나 또는 심지어 특정 경우에는 약간 증가되는데, 이는 압착 단계를 이용하는 방법에 의해 추출된 아미노산의 총량이 증가하기 때문이다 (가수분해물 내의 단백질 함량 참조).
III.
키틴
a) 회분
가수분해물보다 더 적은 정도이긴 하지만, 키틴 내의 회분 함량 또한 압착 단계에 의해 영향을 받는다. 따라서, 사용된 효소에 따라 25％ 내지 28.6％ 범위의 감소가 관찰된다 (도 25).
어떤 곤충이 연구되든지 (도 26), 키틴 (분쇄 + 압착 방법에 의해 수득됨) 내의 회분 함량이 극도로 낮다. 따라서, 티. 몰리토르의 경우, 최대 회분 함량이 1.05 g/건조물 100 g이고, 심지어 천연적으로 무기질이 풍부한 곤충의 경우에도 여전히 3.5 g/건조물 100 g 미만이다.
b) 키틴 내의 지질 함량
가수분해물보다 약간 더 적은 정도이긴 하지만, 압착 단계가 방법에 추가되는 경우에 키틴 내의 지질 함량 또한 감소된다 (도 27). 효율은 본질적으로 효소에 의존적이어서, 스미자임의 경우의 15％에서 노보자임의 경우의 60％까지이다. 어떤 곤충이든지, 반응이 프롤리브로 수행되는 경우에, 이러한 감소는 에이치. 일루센스의 경우의 50％ 내지 티. 몰리토르의 경우의 58％이다.
모든 곤충에 대해, 지질 함량이 12％ 미만이고, 비-비행 곤충에 대해서는 심지어 ≤6％이다.
c) 키틴 내의 아미노산의 함량 및 상대적 존재비
압착 단계가 더 큰 비율의 키틴-부착 단백질을 제거하는 것을 가능하게 한다. 키틴의 실제 구조에 존재하는 아미드 관능기로 인해 단백질 함량의 직접적인 측정이 어려워지기 때문에, 아미노산 합계에 의해 이러한 단백질 함량의 근사값을 구하였다 (도 28). 따라서, 어떤 효소 또는 곤충이 연구되든지, 압착 단계가 방법에 추가된 경우에, 아미노산 합계가 5 내지 54％만큼 감소한다는 것을 볼 수 있다.
알라닌을 포함하는 일부 아미노산이 압착 단계가 수행되는 경우에 더 양호하게 추출되는 것으로 보이지만, 아미노산의 상대적 존재비는 압착 단계에 의해 거의 영향을 받지 않는다 (도 29 내지 35). 그럼에도 불구하고, 모든 곤충에 대해, 알라닌, 타이로신 및 프롤린, 뿐만 아니라 더 적은 정도로 발린, 글리신, 류신 및 세린이 키틴에 주로 부착되는 아미노산이고, 이들의 함량이 평균적으로 모든 아미노산의 23 내지 40％에 포함되며, 압착 단계가 방법에 추가되는 경우에 키틴에서 가장 큰 감소가 관찰되고 가수분해물 (도 18-24)에서 가장 큰 증가 (최대 7-30％에 도달함)가 관찰되는 것이 이러한 아미노산들 중에 있다고 할 수 있다.
d) 중량측정 순도
어떤 효소 (도 36) 또는 곤충 (도 37)이 연구되는지와 관계없이, 압착 단계를 사용함으로써 중량측정 순도가 개선된다. 따라서, 이는 티. 몰리토르 + 프롤리브의 경우 48.7％에서 77.1％로, 에이치. 일루센스 + 프롤리브의 경우 33.7％에서 87.9％로 변화된다.
e) 비색측정 순도
어떤 효소 또는 곤충이 연구되든지 (도 38 및 39), 압착 단계가 방법의 일부를 형성하는 경우에, 확실히 중량측정 순도에 대한 것보다 덜 현저하지만 비색측정 순도에서의 개선이 또한 관찰된다.
f) 차이에 의한 순도
압착을 이용하는 방법 후에 수득된 키틴 내의 지질, 회분 및 아미노산 함량의 감소 덕분에, 어떤 곤충 또는 효소가 연구되든지 (도 40), 이러한 키틴에 대한 차이에 의한 순도가 유의하게 증가하여, 에이치. 일루센스의 경우의 13％, 티. 몰리토르 + 프롤리브의 경우의 최대 74％만큼 증가된다.
g) 키틴의 아세틸화도
아세틸화도가 압착 단계를 방법에 추가하는 것에 유의하게 영향을 받는다 (도 41 및 42). 실제로, 혈액림프로부터의 지질 및 아미노산을 제거하는 것은 큐티클 표면에 대한 효소의 접근성이 더 크게 하고, 이는 키틴에 결합된 단백질의 펩티드 결합의 절단의 개선에 기여하지만, 촉매 혼란을 통해, 키틴의 아미드 결합의 절단의 개선에 또한 기여한다. 따라서, 이러한 방법으로부터 초래된 티. 몰리토르의 키틴의 아세틸화도는 76 내지 79％에 포함되는 반면, 압착 단계의 부재 하에서는 아세틸화도가 91％이고, 심지어 화학적 가수분해 (혹독한 조건의 온도 및 시약 하에 수행됨)는 85％의 아세틸화도에 이른다.
고려되는 다른 곤충, 특히 지. 멜로넬라 및 에이. 도메스티쿠스의 경우, 아세틸화도가 또한 방법에 영향을 받고, 따라서 한 경우에는 83에서 74％로, 다른 경우에는 100에서 95％로 각각 변화된다.
키틴의 용해도 및 가공성이 이의 아세틸화도에 매우 특히 연관되기 때문에, 키틴의 N-아세틸글루코사민 단위의 아미드 결합이 이렇게 동반적으로 가수분해되는 것은 이러한 조건 하에 수행된 효소 가수분해의 뜻밖의 긍정적인 효과이다.
h) 원자 및 관능기의 표면 존재비
정제가 진행됨에 따라, 키틴 표면 상의 원자의 분포가 상대적 산소 함량의 증가 및 상대적 탄소 함량의 감소를 나타낸다 (표 4).
또한, 표면 상의 탄소 원자의 결합이 주로 탄화수소 유형 (C-H, C-C)인 결합에서 알콜 유형 (C-O) 또는 카르보닐 유형 (C=O)의 결합으로 변하는 경향이 있다. 아미드 유형 (N-C=O)의 결합이 또한 감소된다.
그러나, 가장 대표적인 것으로 보이는 것은 알콜 결합/탄화수소 결합 비 (C-O/C-H)이고, 효소로 정제된 키틴의 상황에서, 이러한 비는 0.31 내지 0.56, 더욱 구체적으로는 0.39 내지 0.41에 포함된다.
표 4에서,
- "미가공 큐티클"은 절개에 의해 곤충으로부터 추출된 직후에 분석된, 천연 상태의 큐티클의 키틴을 의미하고;
- "효소로 정제된 키틴 (노보자임)"은 분쇄 + 압착 및 노보자임 37071 효소의 존재 하의 효소 가수분해를 포함하는 방법으로부터 초래된 키틴을 의미하고;
- "효소로 정제된 키틴 (프롤리브)"는 분쇄 + 압착 및 프롤리브 NP 효소의 존재 하의 효소 가수분해를 포함하는 방법으로부터 초래된 키틴을 의미하고;
- "효소로 정제된 키틴"은 분쇄 + 압착 및 프롤리브 효소의 존재 하의 효소 가수분해를 포함하는 방법으로부터 초래된 키틴을 의미하며;
- "순수한 키틴"은 곤충 내의 키틴의 양을 결정하기 위해 사용된 것과 동일한, 화학적 정제에 의해 수득된 키틴을 의미한다.
<표 4>
i) 2-광자 형광 현미경에 의한 큐티클 영상화
구조물 외부의 단백질 과부하를 제거하는 한편, 본 발명에 따른 방법에 의한 효소 경로에 의한 키틴의 부분적 정제는 화학적 정제에 비교하여 키틴 구조물의 단백질 "충전재"를 보존함으로써 전체적 가요성을 유지하는 것을 가능하게 한다 (도 43 참조).
도 43에서 사용된 용어는 상기 섹션 III h)에서 정의된 바와 동일하다.
j) 결정화도
어떤 곤충 또는 효소가 연구되든지, 수득되는 키틴의 결정화도, 즉 결정질 영역 및 비결정질 영역의 비는 0.42 내지 0.61에 포함된다.
일반적으로, 결정성 지수, 즉 피크 높이의 비 (면적의 비가 아님)가 문헌에서 사용된다. 이러한 치수는 실질적인 오류 위험이 있다. 그럼에도 불구하고, 비교 목적을 위해, 샘플의 결정성 지수를 또한 측정하였고, 이는 모든 곤충에 대해 88 내지 95％이고, 심지어 딱정벌레목 및 나비목의 경우는 90％를 초과한다.
실시예 6: 압착 주스로부터 유래되는 단백질 분획의 회수를 이용하는 본 발명에 따른 방법
I.
물질 및 방법
a) 물질
곤충
하기의 곤충을 연구하였다:
- 딱정벌레목 곤충: 테네브리오 몰리토르 (티. 몰리토르 또는 TM).
효소
프롤리브를 가수분해에서 사용하였다.
b) 생산 방법
분쇄 후 압착을 이용하는 생산 방법 (도면에서 "분쇄+압착"으로 표기됨)
여러 뱃치를 하기와 같이 변환시켰다: 600 g의 신선한 티. 몰리토르 유충을 챔버에 도입하고, 증기 (115℃, 5분)로 도살한다. 그 후, 곤충을 혼합기에 도입하고, 곤충 100 g 당 75 mL의 물을 첨가하고, 전체를 혼합하고, 압착한다 (이중-스크류 압착기, 또는 필터 압착기, 또는 기타 압착 시스템).
그 후, 압착 케이크를 70℃에서 하룻밤 동안 건조시킨다. 다른 한편으로, 압착 주스를 3000 g의 중력가속도로 30분 동안 원심분리하고, 고체 부분을 회수한다 - 혈액림프의 불용성 단백질.
그 후, 125 g의 압착 케이크 및 125 g (습윤 중량, 약 30％의 건조 중량)의 불용성 혈액림프 단백질을 응축기 및 자기 교반기가 장착된 3목 플라스크에 도입하고, 1250 mL의 물, 뿐만 아니라 9500 SAPU에 등가인 활성의 단백질분해 효소를 첨가한다. 그 후, 반응을 4시간 동안 45℃로 가열한다. 그 후, 15분 동안 온도를 90℃로 상승시키고, 마지막으로 반응 혼합물을 여과한다 (0.40-0.45 ㎛). 잔류물을 24시간 동안 70℃에서 건조시킨다: 이렇게 하여 이는 효소 경로에 의한 정제에 의해 수득된 키틴이다; 여과액을 동결 건조시킨다: 이렇게 하여 이는 가수분해물이다.
c) 분석
회분 함량 측정, 지질 함량 측정, 아미노산의 상대적 존재비 및 단백질 크기 측정을 실시예 5에서와 같이 수행하였다
II.
수득된 생성물의 특성화
수득된 생성물 (키틴 및 가수분해물)을 분석하고 특성화하였다 (표 5, 도 45).
<표 5>
Claims (7)
- 건조물의 총 중량을 기초로 적어도 40 중량％의 단백질, 건조물의 총 중량을 기초로 최대 10 중량％의 회분, 및 수용성 단백질의 총 중량을 기초로 50 중량％ 미만의 12,400 g/mol 초과의 수용성 단백질 함량을 포함하는, 곤충으로부터 제조된 가수분해물.
- 제1항에 있어서, 회분 함량이 4 중량% 미만인 가수분해물.
- 제1항에 있어서, 95% 초과의 펩신 소화성을 갖는 가수분해물.
- 하기 단계를 하기 순서로 포함하는, 곤충으로부터 제1항의 가수분해물을 생산하는 방법:
(i) 곤충 큐티클을 분쇄하는 단계,
(ii) 곤충 큐티클을 압착하는 단계, 그 후
(iii) 단백질분해 효소로 곤충 큐티클을 효소 가수분해하는 단계. - 제4항에 있어서, 분쇄 단계 전에 곤충을 도살하는 단계를 포함하는 방법.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 효소 가수분해 전에 곤충 큐티클을 산화제로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- a) 곤충을 도살하는 단계,
b) 곤충을 분쇄하는 단계,
c) 곤충을 압착하는 단계,
d) 단백질분해 효소로 곤충 큐티클을 효소 가수분해하는 단계,
e) 가수분해물을 회수하는 단계
를 포함하고, 임의적으로 단계 d) 전에 곤충 큐티클을 산화제로 처리할 수 있는, 곤충으로부터 제1항의 가수분해물을 생산하는 방법.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1463512A FR3031113B1 (fr) | 2014-12-31 | 2014-12-31 | Procede de production de produit(s) d'interet a partir d'insecte par hydrolyse enzymatique |
| FR1463512 | 2014-12-31 | ||
| PCT/FR2015/053781 WO2016108033A1 (fr) | 2014-12-31 | 2015-12-30 | Chitine, hydrolysat et procédé de production de produit(s) d'intérêt à partir d'insectes par hydrolyse enzymatique |
| KR1020177020949A KR102560013B1 (ko) | 2014-12-31 | 2015-12-30 | 키틴, 가수분해물, 및 효소 가수분해에 의해 곤충으로부터 하나 이상의 관심 생성물을 생산하는 방법 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020177020949A Division KR102560013B1 (ko) | 2014-12-31 | 2015-12-30 | 키틴, 가수분해물, 및 효소 가수분해에 의해 곤충으로부터 하나 이상의 관심 생성물을 생산하는 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230113845A true KR20230113845A (ko) | 2023-08-01 |
| KR102668762B1 KR102668762B1 (ko) | 2024-05-22 |
Family
ID=52737286
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020177020949A KR102560013B1 (ko) | 2014-12-31 | 2015-12-30 | 키틴, 가수분해물, 및 효소 가수분해에 의해 곤충으로부터 하나 이상의 관심 생성물을 생산하는 방법 |
| KR1020237025133A KR102668762B1 (ko) | 2014-12-31 | 2015-12-30 | 키틴, 가수분해물, 및 효소 가수분해에 의해 곤충으로부터 하나 이상의 관심 생성물을 생산하는 방법 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020177020949A KR102560013B1 (ko) | 2014-12-31 | 2015-12-30 | 키틴, 가수분해물, 및 효소 가수분해에 의해 곤충으로부터 하나 이상의 관심 생성물을 생산하는 방법 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11891459B2 (ko) |
| EP (1) | EP3240902B1 (ko) |
| JP (2) | JP7240096B2 (ko) |
| KR (2) | KR102560013B1 (ko) |
| CN (1) | CN107428849B (ko) |
| AU (2) | AU2015373263B2 (ko) |
| BR (1) | BR112017014340A2 (ko) |
| CA (1) | CA2970707C (ko) |
| ES (1) | ES2819858T3 (ko) |
| FR (1) | FR3031113B1 (ko) |
| HU (1) | HUE050766T2 (ko) |
| MX (1) | MX2017008814A (ko) |
| SG (2) | SG10201911348UA (ko) |
| WO (1) | WO2016108033A1 (ko) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108471777A (zh) | 2015-10-23 | 2018-08-31 | C-Fu食品公司 | 可食用的昆虫衍生产品及其生产方法和用途 |
| FR3060947A1 (fr) | 2016-12-28 | 2018-06-29 | Ynsect | Procede de traitement d'insectes comprenant la separation des cuticules de la partie molle des insectes puis la separation de la partie molle en trois fractions |
| RU2020116533A (ru) * | 2017-10-26 | 2021-11-26 | Геа Фуд Сольюшнс Бакел Б.В. | Обработка насекомых |
| BE1025664B9 (nl) | 2017-10-26 | 2019-06-21 | Millibeter N V | Werkwijze voor het scheiden van de biomassa van levende larven in een pulp- en een vloeibare fractie |
| CN112236458A (zh) * | 2018-06-12 | 2021-01-15 | 雾凇科技有限公司 | 磷虾来源的几丁质产品及其制备方法 |
| CN109481691A (zh) * | 2018-11-20 | 2019-03-19 | 珠海天香苑生物科技发展股份有限公司 | 吉西他滨-羧甲基多糖共轭物、制备方法及其用途 |
| FR3089759B1 (fr) | 2018-12-12 | 2021-09-24 | Ynsect | Extrait hydrosoluble et procédé d’obtention à partir de cuticules d’insectes |
| FR3091639B1 (fr) | 2019-01-11 | 2022-06-24 | Nextprotein | Procédé de préparation de nutriments à partir d’insectes |
| US12102058B2 (en) | 2019-04-10 | 2024-10-01 | Beetle Genius, SPRL | Automated insect rearing facility, container, and modules |
| KR102418178B1 (ko) * | 2019-10-28 | 2022-07-08 | 주식회사 케일 | 쌍별귀뚜라미 단백질 추출물 및 분말의 제조방법 |
| FR3105261B1 (fr) * | 2019-12-19 | 2024-08-23 | Ynsect | Procédé d’obtention de chitine et/ ou de chitosan mettant en œuvre deux hydrolyses enzymatiques |
| KR102193095B1 (ko) | 2020-07-23 | 2020-12-18 | 박지우 | 잉여농산물 및 가공부산물을 이용한 업사이클 순환농법 |
| PL448385A1 (pl) * | 2021-03-10 | 2024-08-05 | Politechnika Wrocławska | Sposób wytwarzania dodatku paszowego dla drobiu |
| PL448386A1 (pl) * | 2021-03-10 | 2024-08-05 | Politechnika Wrocławska | Sposób wytwarzania preparatu wzmacniającego strukturę włosa |
| KR102581772B1 (ko) * | 2021-03-30 | 2023-09-22 | 강원대학교 산학협력단 | 식물 및 곤충 단백질 가수 분해물을 이용한 배양육 제조를 위한 최적 배양 방법 및 그 응용 |
| NL2028514B1 (en) * | 2021-06-22 | 2022-12-29 | Ynsect Nl R & D B V | Proteinaceous powder derived from insect larvae or worms |
| TWI815363B (zh) * | 2022-03-22 | 2023-09-11 | 吳孟昆 | 甲殼粉末的酶解方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101144097A (zh) * | 2007-09-18 | 2008-03-19 | 重庆百奥帝克微生态科技有限公司 | 一种制备甲壳素及其壳聚糖和壳寡糖的方法 |
| CN101775085A (zh) * | 2010-02-04 | 2010-07-14 | 浙江省浦江县成岳种植有限公司 | 一种蝇蛆壳聚糖的制备方法 |
| CN103725742A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-16 | 赵树民 | 一种酶解法制备蜂王胚胎肽的方法 |
Family Cites Families (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4958011A (en) * | 1983-06-27 | 1990-09-18 | Bade Maria L | Ester-stabilized chitin |
| JP2870871B2 (ja) * | 1989-10-23 | 1999-03-17 | 第三化成株式会社 | 酵素を用いる甲殼類の甲殼の処理方法 |
| US6326165B1 (en) * | 1997-04-14 | 2001-12-04 | Colorado State University Research Foundation | Recombinant BHLH-PAS/JHR polypeptide and its use to screen potential insecticides |
| CN1100490C (zh) * | 1999-12-01 | 2003-02-05 | 中国科学院动物研究所 | 一种资源昆虫有效成份的分离、提取方法 |
| US20030233982A1 (en) | 2002-06-25 | 2003-12-25 | Mao Zhang | Raising fly larvae as the space food for crew |
| CN1195067C (zh) * | 2002-11-20 | 2005-03-30 | 江南大学 | 一种用酶水解法从蝇蛆中提取蛋白质的方法 |
| DK175501B1 (da) | 2002-12-02 | 2004-11-15 | Green Earth | Anlæg og fremgangsmåde til kontinuerlig hydrolyse af et proteinholdigt animalsk eller vegetabilsk råmateriale |
| RU2345139C2 (ru) | 2006-07-26 | 2009-01-27 | Общество с ограниченной ответственностью "МУСКА" | Способ переработки личинок синантропной мухи |
| US20080075818A1 (en) | 2006-09-27 | 2008-03-27 | Papadoyianis Ernest D | Production and processing of insects for transformation into protein meal for fish and animal diets |
| JP5320565B2 (ja) | 2007-03-01 | 2013-10-23 | 独立行政法人国立高等専門学校機構 | キチン分解物の製造方法 |
| CN101078023B (zh) * | 2007-05-18 | 2010-10-13 | 重庆百奥帝克微生态科技有限公司 | 一种从蚕蛹、蝇蛆的皮壳中制取甲壳素/壳聚糖的方法 |
| FR2927336B1 (fr) * | 2008-02-12 | 2010-05-21 | Cie Des Peches Saint Malo Sant | Hydrolysat de proteines de poissons presentant une activite de stimulation et de maintien du capital osseux, compositions nutraceutiques et pharmacologiques comprenant un tel hydrolysat et procede d'obtention |
| JP4384249B2 (ja) | 2008-03-28 | 2009-12-16 | 株式会社シンギー | 蜂の子加工飲食品の製造方法、及び蜂の子加工飲食品 |
| CN102048020B (zh) | 2009-11-04 | 2012-12-05 | 长沙赛邦生物科技有限公司 | 碱酶法提取黄粉虫活性蛋白的方法 |
| CN102993334B (zh) * | 2010-03-30 | 2015-01-14 | 甘肃农业大学 | 一种蝇蛆甲壳素、壳聚糖的制备工艺 |
| CN102199228B (zh) | 2010-03-30 | 2013-04-17 | 甘肃农业大学 | 一种蝇蛆甲壳素、壳聚糖的制备工艺及其在诱导深绿木酶t2菌株产生几丁质酶中的应用 |
| CN101880591A (zh) | 2010-06-13 | 2010-11-10 | 中山大学 | 家蝇蛆作为油料昆虫的应用 |
| JP2012116773A (ja) | 2010-11-30 | 2012-06-21 | Nippi:Kk | Ｉｇｆ−１値上昇剤 |
| CN102558387A (zh) * | 2010-12-13 | 2012-07-11 | 青岛中仁药业有限公司 | 一种从蝇蛆中提取甲壳素和抗菌肽的方法 |
| FR2975706B1 (fr) * | 2011-05-26 | 2017-07-21 | Ifremer (Institut Francais De Rech Pour L'exploitation De La Mer) | Extraction de chitines en une seule etape par hydrolyse enzymatique en milieu acide |
| CN102342394A (zh) | 2011-09-29 | 2012-02-08 | 山东省农业科学院农产品研究所 | 一种黄粉虫氨基酸口服液及其制备方法 |
| CN102578361B (zh) | 2012-03-28 | 2013-09-11 | 常熟市汇康食品厂 | 一种蛆复合蛋白粉 |
| NL2009044C2 (en) | 2012-06-21 | 2013-12-24 | Protix Biosystems B V | Method to convert insects or worms into nutrient streams and compositions obtained thereby. |
| CN102816808B (zh) | 2012-07-17 | 2014-05-28 | 中山火炬职业技术学院 | 一种利用虾壳制备壳聚糖的方法 |
| CN104059953A (zh) * | 2013-09-29 | 2014-09-24 | 天津天狮生物发展有限公司 | 一种几丁聚糖酶解方法 |
| US11337451B2 (en) * | 2013-11-11 | 2022-05-24 | Aaron T. Dossey | Insect products and methods of manufacture and use thereof |
| FR3031115B1 (fr) * | 2014-12-31 | 2018-03-02 | Ynsect | Production de chitine a partir d'insectes par hydrolyse enzymatique comportant une combinaison d'etapes prealables |
-
2014
- 2014-12-31 FR FR1463512A patent/FR3031113B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2015
- 2015-12-30 CA CA2970707A patent/CA2970707C/fr active Active
- 2015-12-30 SG SG10201911348UA patent/SG10201911348UA/en unknown
- 2015-12-30 WO PCT/FR2015/053781 patent/WO2016108033A1/fr active Application Filing
- 2015-12-30 AU AU2015373263A patent/AU2015373263B2/en active Active
- 2015-12-30 BR BR112017014340-2A patent/BR112017014340A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-12-30 JP JP2017535685A patent/JP7240096B2/ja active Active
- 2015-12-30 EP EP15828828.2A patent/EP3240902B1/fr active Active
- 2015-12-30 US US15/541,186 patent/US11891459B2/en active Active
- 2015-12-30 KR KR1020177020949A patent/KR102560013B1/ko active IP Right Grant
- 2015-12-30 SG SG11201705391UA patent/SG11201705391UA/en unknown
- 2015-12-30 CN CN201580077226.4A patent/CN107428849B/zh active Active
- 2015-12-30 ES ES15828828T patent/ES2819858T3/es active Active
- 2015-12-30 KR KR1020237025133A patent/KR102668762B1/ko active IP Right Grant
- 2015-12-30 MX MX2017008814A patent/MX2017008814A/es unknown
- 2015-12-30 HU HUE15828828A patent/HUE050766T2/hu unknown
-
2020
- 2020-01-20 AU AU2020200381A patent/AU2020200381B2/en active Active
- 2020-10-02 JP JP2020168003A patent/JP7204720B2/ja active Active
-
2024
- 2024-01-04 US US18/404,003 patent/US20240262935A1/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101144097A (zh) * | 2007-09-18 | 2008-03-19 | 重庆百奥帝克微生态科技有限公司 | 一种制备甲壳素及其壳聚糖和壳寡糖的方法 |
| CN101775085A (zh) * | 2010-02-04 | 2010-07-14 | 浙江省浦江县成岳种植有限公司 | 一种蝇蛆壳聚糖的制备方法 |
| CN103725742A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-16 | 赵树民 | 一种酶解法制备蜂王胚胎肽的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20240262935A1 (en) | 2024-08-08 |
| CA2970707A1 (fr) | 2016-07-07 |
| WO2016108033A1 (fr) | 2016-07-07 |
| KR102560013B1 (ko) | 2023-07-26 |
| CN107428849B (zh) | 2024-03-26 |
| BR112017014340A2 (pt) | 2018-01-02 |
| US20180016357A1 (en) | 2018-01-18 |
| US11891459B2 (en) | 2024-02-06 |
| KR20170106355A (ko) | 2017-09-20 |
| CA2970707C (fr) | 2023-06-20 |
| FR3031113B1 (fr) | 2018-03-16 |
| FR3031113A1 (fr) | 2016-07-01 |
| AU2015373263A1 (en) | 2017-08-03 |
| SG10201911348UA (en) | 2020-01-30 |
| JP7240096B2 (ja) | 2023-03-15 |
| AU2015373263B2 (en) | 2020-07-09 |
| KR102668762B1 (ko) | 2024-05-22 |
| AU2020200381A1 (en) | 2020-02-13 |
| JP7204720B2 (ja) | 2023-01-16 |
| JP2021020911A (ja) | 2021-02-18 |
| EP3240902A1 (fr) | 2017-11-08 |
| SG11201705391UA (en) | 2017-08-30 |
| AU2020200381B2 (en) | 2022-03-10 |
| JP2018502203A (ja) | 2018-01-25 |
| EP3240902B1 (fr) | 2020-07-29 |
| HUE050766T2 (hu) | 2021-01-28 |
| ES2819858T3 (es) | 2021-04-19 |
| MX2017008814A (es) | 2018-02-21 |
| CN107428849A (zh) | 2017-12-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102560013B1 (ko) | 키틴, 가수분해물, 및 효소 가수분해에 의해 곤충으로부터 하나 이상의 관심 생성물을 생산하는 방법 | |
| Errico et al. | Tenebrio molitor as a source of interesting natural compounds, their recovery processes, biological effects, and safety aspects | |
| US20180002452A1 (en) | Chitin, hydrolysate and method for the production of one or more desired products by means of enzymatic hydrolysis, including pre-treatment with an oxidising agent | |
| US10995124B2 (en) | Chitin, hydrolysate and production of at least one desired product from insects by means of enzymatic hydrolysis, comprising a combination of steps performed prior to the enzymatic hydrolysis | |
| US20240150498A1 (en) | Chitin and process for producing chitin and/or chitosan by the enzymatic and chemical pathway | |
| CN111683973A (zh) | 甲壳质和用于化学获得甲壳质和/或脱乙酰壳多糖的方法 | |
| US7297512B2 (en) | Method for producing amino acid components by enzymatic hydrolysis of fish egg skin | |
| JP2003245055A (ja) | 肌改善用食品組成物及び肌改善方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A107 | Divisional application of patent | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |