KR20230113845A

KR20230113845A - 키틴, 가수분해물, 및 효소 가수분해에 의해 곤충으로부터하나 이상의 관심 생성물을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20230113845A
Application number: KR1020237025133A
Authority: KR
Inventors: 나탈리 베레지나; 앙투안 위베르; 파브리스 베로; 장-가브리엘 레봉; 카린 르 루; 세실리아 소콜스키; 로레나 상쉐즈; 소피 로랑
Original assignee: 와이엔섹트
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2035-12-30
Also published as: KR20170106355A; MX386805B; MX2017008814A; WO2016108033A1; US20180016357A1; EP3240902A1; US20240262935A1; JP2021020911A; SG10201911348UA; JP7204720B2; SG11201705391UA; FR3031113B1; BR112017014340A2; AU2020200381B2; JP2018502203A; AU2020200381A1; KR102560013B1; EP3240902B1; JP7240096B2; CA2970707A1

Abstract

본 발명은 키틴, 가수분해물, 및 곤충으로부터 적어도 하나의 관심 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 곤충 큐티클 압착 단계에 이어서 단백질분해 효소를 사용하여 곤충 큐티클을 효소 가수분해하는 단계를 포함하는, 곤충으로부터 적어도 하나의 관심 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

키틴, 가수분해물, 및 효소 가수분해에 의해 곤충으로부터 하나 이상의 관심 생성물을 생산하는 방법{CHITIN, HYDROLYSATE AND METHOD FOR THE PRODUCTION OF ONE OR MORE DESIRED PRODUCTS FROM INSECTS BY MEANS OF ENZYMATIC HYDROLYSIS}

본 발명은 곤충으로부터 적어도 하나의 관심 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 곤충 큐티클의 효소 가수분해에 의해 키틴 및/또는 키토산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이는 또한 특정 키틴 및 가수분해물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, "키틴"은 임의 유형의 키틴 유도체, 즉 N-아세틸글루코사민 단위 및 D-글루코사민 단위를 포함하는 임의 유형의 다당류 유도체, 특히 키틴-폴리펩티드 공중합체 (때때로 "키틴/폴리펩티드 복합체"로 지칭됨)를 의미한다.

키틴은 셀룰로스에 이어서 생물계에서 두 번째로 많이 합성된 중합체라고 한다. 실제로, 키틴은 생물계의 다수의 종에서 합성된다: 이는 갑각류 및 곤충의 외골격 및 진균류를 둘러싸고 이를 보호하는 측벽의 일부를 구성한다. 더욱 특히, 곤충에서, 따라서 키틴은 이의 외골격의 3 내지 60％를 구성한다.

본 발명에 따르면, "키토산"은 키틴의 탈아세틸화 생성물을 의미한다. 키토산과 키틴 사이의 일반적인 한계는 아세틸화도에 의해 결정된다: 아세틸화도가 50％ 미만인 화합물은 키토산으로 칭해지고, 아세틸화도가 50％ 초과인 화합물은 키틴으로 칭해진다.

키틴 및/또는 키토산은 수많은 용도에서 사용된다: 화장 (화장품 조성물), 의학 및 제약학 (제약 조성물, 화상 치료, 생체물질, 각막 드레싱, 봉합 물질), 영양학, 및 식품 가공, 공업 기술 (특히 물 여과 및 정제를 위한 여과, 텍스처화, 응집 또는 흡착 작용제) 등. 실제로, 키틴 및/또는 키토산은 생체적합성이고, 생체분해성이며, 비-독성인 물질이다.

전통적으로, 키틴은 갑각류로부터, 두족류로부터, 또한 더욱 이례적으로는 진균류로부터 화학적으로 추출된다. 이러한 화학 경로는 천연 상태로 존재할 때, 예를 들어, 갑각류의 껍질 내에 존재할 때의 키틴의 구조를 변성시키는 효과가 있는 다량의 시약 (예컨대 염산, 수산화나트륨 및 표백제)을 사용한다. 또한, 대부분의 화학 시약은 인간 및 환경에 해롭고, 처리되어야 할 다량의 유출물을 생성시킨다. 마지막으로, 갑각류로부터 유래된 키틴 및/또는 키토산은 민감한 사람에서 알레르기 반응을 생성시킬 수 있다.

키틴을 추출하는 또 다른 경로는 효소 경로이다. 이러한 경로는 더 순한 것으로 간주되고, 따라서 키틴 및/또는 키토산을 더 양호하게 보존하는 것을 가능하게 한다. 그러나, 이러한 경로로 수득된 키틴은 갈색을 띠어, 판매가능한 분말, 즉 백색 분말을 수득하기 위한 정제 단계를 필요로 한다. 따라서 기존의 방법은 키틴으로부터 불순물을 제거하기 위한 1회 이상의 단계, 예컨대 효소 가수분해 전에 수행되는, 산으로 무기질을 제거하는 단계, 및/또는 효소 가수분해 후에 수행되는, 키틴을 산화제로 표백하는 단계를 일반적으로 포함한다. 키틴 정제를 위한 이러한 2개의 단계는 불행하게도 키틴의 화학 구조를 변경시키는 효과가 있다.

본 발명가들의 작업은 가수분해 전의 기계적 처리 단계, 즉 곤충 큐티클을 압착하는 단계를 수행하는 것에 의해 더욱 순수하고 원래의 키틴 구조에 더욱 가까운 구조를 갖는 키틴을 수득하는 것이 가능하였음을 실연하였다.

따라서 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 곤충으로부터 적어도 하나의 관심 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다:

(i) 곤충 큐티클을 압착하는 단계, 및

(ii) 그 후, 단백질분해 효소로 곤충 큐티클을 효소 가수분해하는 단계.

"관심 생성물"은 더욱 특히 키틴 및/또는 키토산 및/또는 가수분해물을 의미한다.

"가수분해물"은 단백질의 효소 가수분해에 의해 수득가능한, 단백질, 가수분해된 단백질, 펩티드, 아미노산, 및/또는 단백질로부터 유래된 기타 화합물을 포함하는 생성물을 나타낸다.

관심 생성물 또는 생성물들은 곤충으로부터 수득된다. "곤충"은 임의의 발달 단계, 예컨대 성충, 유충 또는 약충 단계의 곤충을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 곤충은 식용성이다.

더욱 특히, 곤충은 딱정벌레목(Coleoptera), 파리목(Diptera), 나비목(Lepidoptera), 흰개미목(Isoptera), 메뚜기목(Orthoptera), 벌목(Hymenoptera), 바퀴목(Blattoptera), 노린재목(Hemiptera), 노린재아목(Heteroptera), 하루살이목(Ephemeroptera) 및 밑들이목(Mecoptera)으로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 딱정벌레목, 파리목, 메뚜기목 및 나비목으로부터 선택될 수 있다.

바람직하게는, 곤충은 테네브리오 몰리토르(Tenebrio molitor), 헤르메티아 일루센스(Hermetia illucens), 갈레리아 멜로넬라(Galleria mellonella), 알피토비우스 디아페리누스(Alphitobius diaperinus), 조포바스 모리오(Zophobas morio), 블라테라 푸스카(Blattera fusca), 트리볼리움 카스타네움(Tribolium castaneum), 린코포루스 페루기네우스(Rhynchophorus ferrugineus), 무스카 도메스티카(Musca domestica), 크리소미아 메가세팔라(Chrysomya megacephala), 로쿠스타 미그라토리아(Locusta migratoria), 스키스토세르카 그레가리아(Schistocerca gregaria), 아케타 도메스티쿠스(Acheta domesticus) 및 사미아 리시니(Samia ricini)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

더욱 바람직하게는, 곤충은 테네브리오 몰리토르, 헤르메티아 일루센스, 갈레리아 멜로넬라, 알피토비우스 디아페리누스, 조포바스 모리오, 블라테라 푸스카, 무스카 도메스티카, 크리소미아 메가세팔라, 로쿠스타 미그라토리아, 스키스토세르카 그레가리아, 아케타 모메스티쿠스 및 사미아 리시니로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 더 바람직하게는 티. 몰리토르(T. molitor)이다.

하나 이상의 곤충 종, 바람직하게는 단일 곤충 종이 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있다. 여러 종이 사용되는 경우, 유리하게는 2개의 밀접하게 관련된 종, 예를 들어 헤르메티아 일루센스 및 무스카 도메스티카가 선택될 것이다.

곤충은 자연에서 취득되기보다는 바람직하게는 사육된다. 예를 들어, 곤충이 곤충 농장에서 사육된다. 특수 농장에서 곤충을 번식시키는 것은 곤충이 보유하는 질환과 연관된 위험을 제어 및 제거할 수 있게 할 뿐만 아니라, 예를 들어 살충제의 존재로 인해 곤충으로부터 유래되는 식품의 독성과 연관된 위험을 제한할 수 있게 한다. 또한, 양식은 곤충 공급의 품질을 제어하고 공급 비용을 한정하는 것을 가능하게 한다.

"곤충 큐티클"은 곤충으로부터 분리되었을 때의 큐티클뿐만 아니라, 전체 곤충을 포함하여 곤충의 다른 구성성분 중 일부 또는 모두를 포함하는 큐티클을 또한 의미한다. 실제로, 본 발명에 따른 방법을 전체 곤충, 예컨대 분쇄된 곤충에, 또는 천연적으로 분리되고 적절한 방법으로 수집된, 큐티클을 포함하는 곤충의 일부분, 예를 들어 곤충의 허물 및/또는 탈피물에만 적용하는 것이 가능하다.

큐티클은 곤충의 표피가 분비하는 외층 (또는 외골격)이다. 일반적으로, 이는 3개의 층으로 형성된다:

- 큐티클의 가장 얇은 최외층인 에피큐티클(epicuticle) (4 ㎛ 미만); 이러한 층은 물에 대해 불투과성이고, 발수 왁스, 뿐만 아니라 더 적은 양의 단백질 및 키틴의 층을 포함한다;

- 큐티클의 중간층인 엑소큐티클(exocuticle); 이는 태닝(tanning)에 의해 경화되고 큐티클의 경직성을 담당하는 단백질, 키틴, 및 임의적인 멜라닌으로 본질적으로 구성된다; 및

- 단백질 및 키틴의 혼합물로 구성된, 얇은 가요성 층인 엔도큐티클(endocuticle).

곤충 큐티클을 압착하는 주요 목적은 지방이 풍부한 압착 주스를 제거하고/하거나, 압착 케이크에서 가수분해용 기질을 강화하는 것이다.

본 발명에 따른 방법에서, 곤충 큐티클을 압착하는 것은 20％ 이하, 바람직하게는 15％ 이하, 더욱 바람직하게는 12％ 이하, 더욱 더 바람직하게는 10％ 이하의 오일 (또는 지질) 함량을 포함하는 압착 케이크를 수득하는 것을 가능하게 한다.

본 출원에서, 값의 범위는 경계를 포함하는 것으로 이해된다. 또한, "약" 또는 "대략"이 숫자에 선행하는 경우, 이는 이러한 숫자의 값의 ± 10％와 등가이다.

마찬가지로, 압착 케이크에서 가수분해용 기질을 강화하기 위해, 곤충 큐티클을 압착하는 것은 건조물 함량이 30％ 내지 60％에 포함되고, 바람직하게는 40％ 내지 55％에 포함되며, 더욱 바람직하게는 45％ 내지 50％에 포함되는 압착 케이크를 수득하는 것을 가능하게 한다.

임의의 압착 시스템, 예를 들어, 단일-스크류 또는 이중-스크류 압착기 (앤젤(Angel) 유형의 이중-스크류), 필터-압착기 (쇼퀘네(Choquenet) 유형의 필터-압착기), 평판 압착기 등을 곤충 큐티클의 압착을 수행하는데 사용할 수 있다. 이러한 시스템들은 관련 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 기술자는 상기 언급된 오일 및/또는 물 함량을 수득하도록 압착 조건을 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서, 곤충 큐티클의 압착에 효소 가수분해가 이어진다.

바람직하게는, 효소 가수분해는 적어도 하나의 단백질분해 효소, 바람직하게는 프로테아제로 수행된다. 본 출원에서, "펩티다제" 및 "프로테아제"라는 명칭 또는 접미사는 단백질의 펩티드 결합의 용해를 야기하는 효소를 가리키도록 상호교환가능하게 사용된다. 유리하게는, 이는 4 내지 8시간, 바람직하게는 4 내지 5시간의 기간 동안 40 내지 60℃, 바람직하게는 45 내지 55℃의 온도에서 6 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7.5을 포함하는 pH에서 수행된다.

효소 가수분해는 단일 프로테아제로, 또는 대안적으로 적어도 하나의 프로테아제를 함유하는 효소 혼합물, 더욱 바람직하게는 여러 프로테아제를 함유하는 효소 혼합물, 예컨대 엔도프로테아제 및 엑소프로테아제, 또는 프로테아제 및 폴리사카라제를 함유하는 혼합물로 수행될 수 있다.

바람직하게는, 프로테아제는 아미노펩티다제, 메탈로카르복시펩티다제, 세린 엔도펩티다제, 시스테인 엔도펩티다제, 아스파르트산 엔도펩티다제, 메탈로엔도펩티다제로 이루어진 군으로부터 선택된다.

유리하게는, 효소는 하기로부터 선택될 수 있다:

유리하게는, 가수분해에서 사용되는 효소는 아스파르트산 엔도펩티다제, 예컨대 프롤리브 NP이다. 이러한 유형의 효소는, 특히 이러한 유형의 효소가 딱정벌레목, 더욱 특히 티. 몰리토르로부터 수득되는 압착 케이크의 가수분해에서 적용되는 경우에, 수득되는 키틴의 순도 면에서 매우 양호한 결과를 수득하는 것을 가능하게 한다.

효소 또는 효소 혼합물은 추정 건조물의 0.2 내지 10 중량％, 바람직하게는 0.4 내지 8 중량％, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 2％ 범위의 양으로 도입된다. 더욱 특히 "추정 건조물의 중량"은 효소 가수분해 단계에 진입할 때 추정될 수 있는 바와 같은 곤충 또는 곤충의 일부분(들)으로부터의 건조물의 중량을 의미한다.

효소 활성의 관점에서, 도입되는 효소 또는 효소 혼합물의 양은 변환될 기질, 즉 곤충 또는 수화된 곤충의 일부분(들)의 100 g의 습윤 중량 (수분 함량 30 내지 70％) 당 2000 내지 5000 SAPU (하기 실시예 5에 기술된 "분광광도법 산 프로테아제 단위"), 바람직하게는 3000 내지 4000 SAPU에 포함되는 활성과 등가이다.

유리하게는, 효소 가수분해 단계는 물, 예컨대 신선한 물의 존재 하에 수행된다. 효소 가수분해에서 사용되는 물의 양은 하기와 같이 결정된다: 물의 부피 (mL) 대 곤충의 중량 (g)의 비가 바람직하게는 0.3 내지 10, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5, 더욱 더 바람직하게는 0.7 내지 3 내에 포함되고, 더욱 더 바람직하게는 대략 1이다. 물의 밀도는 정상적인 온도 및 압력 조건 하에 1.0 g/mL이어서, 이러한 비가 물의 중량 대 곤충의 중량의 비에 또한 상응한다는 것을 주지하여야 한다.

본 발명에 따른 방법은 순도 (또는 중량측정 순도)가 40 내지 90％, 바람직하게는 50 내지 90％, 더욱 바람직하게는 60 내지 85％에 포함되고, 더욱 더 바람직하게는 대략 80％인 키틴을 수득하는 것을 가능하게 한다 (실시예 2 및 도 2를 참조한다).

또한, 본 발명에 따른 방법은, 특히 소화성, 지질 및/또는 단백질 함량, 단백질 크기 또는 아미노산 조성의 관점에서, 몇몇 유리한 성질이 있는 가수분해물을 수득하는 것을 가능하게 한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 압착 단계 전에 분쇄 단계를 포함한다.

따라서 본 발명의 특히 바람직한 실시양태는

(i) 곤충 큐티클을 분쇄하는 단계,

(ii) 곤충 큐티클을 압착하는 단계, 및

(iii) 그 후, 단백질분해 효소로 곤충 큐티클을 효소 가수분해하는 단계

를 포함하는, 곤충으로부터 적어도 하나의 관심 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

이러한 분쇄 단계는 효소 가수분해 동안 효소가 기질에 접근하는 것을 용이하게 하기 위해 큐티클 및/또는 곤충을 입자로 감소시키는 것을 목적으로 한다. 이러한 단계는 압착 단계가 이어지는 경우에 압착 주스의 제거 및 고형물의 단리를 용이하게 하는 것을 또한 가능하게 한다.

이러한 분쇄 단계는 곤충으로부터 유래되는 지질이 압착으로부터 유래되는 압착 케이크와 압착 주스 사이에서 분포되는 것을 개선하는 것을 또한 가능하게 한다. 실제로, 도 4에 나타난 바와 같이, 분쇄 및 압착 양쪽 모두를 포함하는 방법으로부터 유래되는 압착 케이크가 압착만 포함하는 방법으로부터의 압착 케이크에 비교하여 지질 함량이 감소된다.

더욱 특히, 본 발명에 따른 방법에서, 곤충 큐티클의 분쇄 및 압착은 15％ 이하, 바람직하게는 12％ 이하, 더욱 더 바람직하게는 10％ 이하의 지질 (또는 오일) 함량을 포함하는 압착 케이크를 수득하는 것을 가능하게 한다.

분쇄는 유리하게는 혼합기-분쇄기, 예컨대 칼날 분쇄기로 수행될 수 있다.

바람직하게는, 분쇄가 끝났을 때, 곤충의 입자의 크기는 1 cm 미만 (현미경을 사용하여 관찰가능한 최대 입자 크기), 바람직하게는 0.5 cm 미만이고, 더욱 더 바람직하게는 300 ㎛ 내지 0.5 cm, 바람직하게는 500 ㎛ 내지 0.5 cm, 더욱 더 바람직하게는 500 ㎛ 내지 1 mm에 포함되는 크기이다.

분쇄를 용이하게 하도록 일정량의 물이 첨가될 수 있다. 이러한 물의 양은 하기와 같이 결정된다: 물의 부피 (mL) 대 곤충의 중량 (g)의 비가 바람직하게는 0.3 내지 10, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5, 더욱 더 바람직하게는 0.7 내지 3에 포함되고, 더욱 더 바람직하게는 대략 1이다.

유리하게는, 본 발명에 따른 방법은 압착 및/또는 분쇄 단계 전에 곤충을 도살하는 단계를 또한 포함한다.

이러한 도살 단계는 냉혈 동물 및/또는 크기가 작은 동물 (갑각류, 어류, 달팽이 등)의 양식에서의 통상적인 방법, 예컨대 저온 (냉동), 고온 (탕침), 산소 결핍 등에 의해 수행될 수 있다. 유리하게는, 곤충 도살 단계는 탕침으로 수행된다. 탕침은 곤충을 도살할 뿐만 아니라, 또한 미생물 부하를 저하시키고 (악화 위험 및 건강 위험을 감소시킴), 자가분해를 유발할 수 있고, 따라서 곤충의 급속한 갈변을 유발할 수 있는 곤충의 내부 효소를 불활성화시킨다. 동물 복지를 존중하기 위해, 그리고 과학적 권고에 따라, 이러한 탕침은 가능한 한 신속하게 죽게 하는 방식으로 수행된다.

대안적으로, 블랜칭(blanching)에 의해 도살을 수행할 수 있다. 블랜칭은 상기 언급된 탕침과 동일한 장점이 있다.

유리하게는, 예를 들어 탕침 또는 블랜칭에 의해 곤충을 도살하고 나서, 분쇄한 후, 압착한다.

바람직하게는, 탕침 단계가 물, 예컨대 신선한 물에서 95 내지 105℃, 바람직하게는 대략 100℃의 온도에서 2 내지 20분, 바람직하게는 5 내지 15분의 기간 동안 수행된다.

이러한 탕침 단계 동안 도입되는 물의 양은 하기와 같이 결정된다: 물의 부피 (mL) 대 곤충의 중량 (g)의 비가 바람직하게는 0.3 내지 10, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5, 더욱 더 바람직하게는 0.7 내지 3에 포함되고, 더욱 더 바람직하게는 대략 1이다.

대안적으로, 블랜칭 단계가 80℃ 내지 130℃, 바람직하게는 90℃ 내지 120℃에 포함되는 온도에서 증기 및/또는 물로 수행된다.

본 발명에 따른 방법은 효소 가수분해 전에 곤충 큐티클을 산화제로 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서, 큐티클 처리에서 사용되는 산화제는 과산화수소, 과망간산칼륨, 오존 및 차아염소산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 과산화수소이다.

유리하게는, 산화제가 과산화수소인 경우, 곤충 큐티클을 처리하기 위해 도입되는 이러한 작용제의 양은 과산화수소 함량이 곤충의 총 중량을 기초로 1 내지 33 중량％, 바람직하게는 곤충의 총 중량을 기초로 2 내지 12 중량％에 포함되고, 바람직하게는 대략 6 중량％이도록 하는 것이다.

바람직하게는, 곤충 큐티클을 산화제로 처리하는 것은 물, 예컨대 신선한 물의 존재 하에 수행된다. 유리하게는, 큐티클 처리에서 사용되는 물의 양은 하기와 같이 결정된다: 물의 부피 (mL) 대 곤충의 중량 (g)의 비가 바람직하게는 0.3 내지 10, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5, 더욱 더 바람직하게는 0.7 내지 3에 포함되고, 더욱 더 바람직하게는 대략 1이다.

곤충 큐티클을 산화제로 처리하는 것은 하기 단계 중 하나 이상 동안 수행될 수 있다:

- 탕침과 동시에 및/또는 탕침 단계 후에, 더욱 바람직하게는 탕침과 동시에. 대안적으로, 블랜칭과 동시에 및/또는 블랜칭 단계 후에, 더욱 바람직하게는 블랜칭과 동시에. 더욱 특히, 곤충 큐티클 처리가 탕침 또는 블랜칭 동안 수행되는 경우, 유리하게는 산화제가 곤충 탕침에 사용되는 물에 첨가될 수 있다.

- 분쇄 전에, 분쇄와 동시에 및/또는 분쇄 후에. 더욱 특히, 곤충 큐티클 처리가 분쇄 동안 수행되는 경우, 유리하게는 산화제가 분쇄에 사용되는 물에 첨가될 수 있다.

- 압착 전에 및/또는 압착과 동시에.

- 곤충 큐티클의 특수 처리 단계 동안.

유리하게는, 효소 가수분해 동안 사용된 효소 또는 효소 혼합물을 불활성화시키는 목적으로 열 불활성화 단계가 효소 가수분해에 이어질 수 있다.

본 발명에 따른 방법이 끝난 후, 효소 가수분해 반응 혼합물의 압착 또는 원심분리에 의해 키틴을 회수할 수 있다. 이러한 단계에서, 키틴의 공동-생성물, 즉 가수분해물이 또한 회수된다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태가 하기에서 더욱 상세하게 기술된다.

특히, 이러한 바람직한 실시양태는 본 발명에 따른 방법을 위한 다양한 유리한 단계, 예컨대 키틴을 가볍게 정제하는 단계, 2차 압착 단계, 세정 공정 단계, 임의적인 여과 및 건조 단계를 기술한다.

마지막으로, 키틴은 일반적으로 분말 형태로 판매되기 때문에, 2차 분쇄가 또한 수행될 수 있다. 후자는 키틴으로부터 키토산을 제조하기 위해, 탈아세틸화 반응을 촉진하도록 또한 수행될 수 있다. 하기에 상세하게 기술되는 바람직한 실시양태의 단계 10에서 탈아세틸화 반응의 조건이 더욱 충분하게 기술된다.

곤충 큐티클로부터 키틴을 생산하는 특히 유리한 방법은

a) 곤충을 도살하는 단계,

b) 곤충을 분쇄하는 단계,

c) 곤충을 압착하는 단계,

d) 단백질분해 효소로 곤충 큐티클을 효소 가수분해하는 단계,

e) 키틴을 회수하는 단계

를 포함하고, 임의적으로 단계 d) 전에 곤충 큐티클이 산화제로 처리될 수 있다.

다양한 단계 a) 내지 e), 뿐만 아니라 산화제 처리의 바람직한 실시양태는 상기에 또는 하기의 바람직한 실시양태의 상응하는 단계에서 언급된 바와 같다.

본 발명은 키틴, 예컨대 본 발명에 따른 방법으로 수득가능한 키틴에 또한 관련된다. 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 순한 조건 덕분에, 이러한 키틴은 높은 순도, 예컨대 40 내지 90％, 바람직하게는 50 내지 90％에 포함되고, 더욱 바람직하게는 60 내지 85％에 포함되며, 더욱 더 바람직하게는 대략 80％인 순도를 가지면서 곤충 큐티클에서 천연 상태로 발생하는 바와 같은 키틴의 구조에 가까운 구조를 갖는다.

본 발명에 따른 키틴은 하기의 유리한 성질 중 적어도 임의의 하나를 갖는다:

- 건조물의 총 중량을 기초로 4 중량％ 미만, 바람직하게는 3.5 중량％ 미만, 더욱 바람직하게는 2.5 중량％ 이하 (특히, 키틴이 초식 곤충으로부터 제조되는 경우), 더욱 바람직하게는 2 중량％ 미만, 더욱 더 바람직하게는 1.5 중량％ 이하 (특히, 키틴이 티. 몰리토르로부터 제조되는 경우), 더욱 더 바람직하게는 1 중량％ 미만의 회분 함량,

- 40 내지 90％, 바람직하게는 50 내지 90％에 포함되고, 더욱 바람직하게는 60 내지 85％에 포함되며, 더욱 더 바람직하게는 대략 80％인 순도 (또는 중량측정 순도),

- (C-O)/(C-H) 비가 0.30 내지 0.56, 바람직하게는 0.31 내지 0.53에 포함되는 관능기의 표면 존재비,

- 건조물의 총 중량을 기초로 지질 함량 ≤14 중량％,

- 키틴이 비-비행 곤충으로부터 제조되는 경우 지질 함량 ≤5％,

- 총 아미노산 ≤45％,

- 키틴이 비행 곤충으로부터 제조되는 경우 총 아미노산 ≤16％,

- Ala, Gly, Leu, Pro, Ser, Tyr, Val로부터의 적어도 3개의 임의의 아미노산의 상대적 존재비 ≤10％,

- 키틴이 티. 몰리토르로부터 제조되는 경우 Leu, Pro, Val의 상대적 존재비 ≤10％,

- 키틴이 티. 몰리토르로부터 제조되는 경우 Ala의 상대적 존재비 ≤12％,

- 비색측정 순도 ≥40％,

- 키틴이 효소 가수분해에서 프롤리브 NP 효소를 사용하여 제조되는 경우 비색측정 순도 ≥50％,

- 차이에 의한 순도 ≥45％, 바람직하게는 ≥49％,

- 키틴이 티. 몰리토르로부터 제조되는 경우 차이에 의한 순도 ≥52％,

- 키틴이 비행 곤충으로부터 제조되는 경우 차이에 의한 순도 ≥70％,

- 아세틸화도 ≥70％ 및 결정화도 ≤0.61,

- 아세틸화도 ≥70％ 및 결정화도 ≥0.42.

키틴은 45％ 이하의 아미노산 함량, 3.5％ 이하, 바람직하게는 2.5％ 이하의 회분 함량, 및 45％ 이상, 바람직하게는 49％ 이상의 차이에 의한 순도를 포함한다.

바람직하게는, 키틴은 상기 성질을 모두 갖는다.

상기 언급된 특색의 모든 단위 및 측정 방법이 실시예, 더욱 특히 실시예 5에서 기술된다.

곤충으로부터 가수분해물을 생산하는 특히 유리한 방법은

a) 곤충을 도살하는 단계,

b) 곤충을 분쇄하는 단계,

c) 곤충을 압착하는 단계,

e) 가수분해물을 회수하는 단계

본 발명은 가수분해물, 예컨대 본 발명에 따른 방법으로 수득가능한 가수분해물에 또한 관련된다.

본 발명에 따른 가수분해물은 하기의 유리한 성질 중 적어도 임의의 하나를 갖는다:

- 건조물의 총 중량을 기초로 4 중량％ 미만, 바람직하게는 3 중량％ 미만 (특히 가수분해물이 초식 곤충으로부터 제조되는 경우)의 회분 함량,

- 95％ 초과, 바람직하게는 96％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 우수한 소화성, 특히 펩신 소화성 (펩신 소화성은 72/188/EEC 결정에 따른 방법으로 측정됨);

- 70％ 이상, 바람직하게는 71％ 이상, 더욱 바람직하게는 75％ 이상, 더욱 바람직하게는 80％ 이상 (특히, 가수분해물이 비-비행 곤충으로부터 제조되는 경우)의 단백질/펩티드 함량;

- 수용성 단백질의 총 중량을 기초로 20 중량％ 미만, 바람직하게는 18 중량％ 미만의 12,400 g/mol 초과의 수용성 단백질 함량;

- 14％ 미만, 바람직하게는 10％ 미만, 더욱 바람직하게는 5％ 이하 (특히, 가수분해물이 비-비행 곤충으로부터 제조되는 경우), 더욱 바람직하게는 2％ 이하, 더욱 더 바람직하게는 1％ 이하의 지질 함량;

- 가장 풍부한 아미노산이 프롤린, 알라닌, 류신, 아스파르트산, 글루타민 및/또는 발린인 조성. "가장 풍부한"은 아미노산의 총 중량을 기초로 5 중량％ 초과, 바람직하게는 7 중량％ 초과의 조성 내의 아미노산의 상대적인 양을 의미한다. 높은 프롤린 함량이 특히 흥미로운 것으로 판명된다;

- Asp, Glu, Ala, Gly, Leu, Pro, Tyr, Val, Lys로부터 선택된 적어도 5개의 임의의 아미노산의 상대적 존재비 ≥6％;

- Asp, Glu, Ala, Leu, Pro, Tyr, Val로부터 선택된 적어도 3개의 임의의 아미노산의 상대적 존재비 ≥8％.

더욱 특히, "수용성 단백질"은 단백질 (또는 미정제 단백질) 중에서, pH가 6 내지 8, 유리하게는 7.2 내지 7.6에 포함되는 수용액에서 가용성인 것을 의미한다.

바람직하게는, 수용액은 pH가 6 내지 8, 유리하게는 7.2 내지 7.6에 포함되는 완충제 용액이다.

바람직하게는, 완충제 용액은 pH가 7.4 ± 0.2인 포스페이트 완충 NaCl 용액이다.

가수분해물은 적어도 40％의 단백질, 최대 10％, 바람직하게는 최대 8％의 회분, 및 50％ 미만, 바람직하게는 43％ 미만의 12,400 g/mol 초과의 수용성 단백질 함량을 포함한다.

"초식 곤충"은 일상식에 동물 단백질이 없는 곤충을 의미한다. 초식 곤충의 예로 딱정벌레목, 나비목 또는 메뚜기목이 언급될 수 있다.

"비행 곤충"은, "비-비행"으로 칭해지는 곤충과 대조적으로, 성충일 때 날 수 있는 곤충을 의미한다. 비행 곤충의 예로 나비목 또는 파리목이 언급될 수 있다. 비-비행 곤충의 예로 딱정벌레목 또는 메뚜기목이 언급될 수 있다.

바람직하게는, 가수분해물은 상기 성질을 모두 갖는다.

본 발명에 따른 가수분해물이 이의 글루코사민 및/또는 이의 유도체 (바람직하게는 N-아세틸글루코사민)의 함량, 더욱 바람직하게는 가수분해물의 건조물의 총 중량을 기초로 0.01％ 이상, 바람직하게는 0.08 중량％ 이상의 함량에 의해 임의의 다른 유형의 가수분해물과 구별될 수 있다는 것이 특히 주목될 것이다.

본 출원에서, 규정 또는 지침에 대한 임의의 언급은 본 출원의 출원일에 시행 중인 바와 같은 상기 규정 또는 상기 지시에 관한 것이다.

유리하게는, 가수분해물의 영양학적 프로파일을 균형잡히게 하여 이를 상이한 유형의 동물들에게 적절하게 만들도록 가수분해물에 첨가물이 보충될 수 있다.

유리하게는, 건조 가수분해물을 수득하기 위해 가수분해물이 농축된 후 건조될 수 있다. 대안적으로, 가수분해물은 액체 형태일 수 있다. 이러한 가수분해물은 특히 동물용의 식품 또는 식품 성분으로서 사용될 수 있거나, 또는 대안적으로, 예를 들어 아미노산을 단리하기 위해, 가공될 수 있다.

곤충 큐티클로부터 키토산을 생산하는 특히 유리한 방법은

a) 곤충을 도살하는 단계,

b) 곤충을 분쇄하는 단계,

c) 곤충을 압착하는 단계,

d) 프로테아제로 곤충 큐티클을 효소 가수분해하는 단계,

e) 키틴을 회수하는 단계,

f) 회수된 키틴을 탈아세틸화하는 단계,

g) 키토산을 회수하는 단계

를 포함하고, 임의적으로 단계 d) 전에 곤충 큐티클을 산화제로 처리할 수 있다.

다양한 단계 a) 내지 g), 뿐만 아니라 산화제 처리의 바람직한 실시양태는 상기에 또는 하기의 바람직한 실시양태의 상응하는 단계에서 언급된 바와 같다.

본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 수득가능한 키토산에 또한 관련된다.

본 발명에 따른 방법으로 수득가능한 키틴 및/또는 키토산은 다양한 용도에서 유리하게 사용될 수 있다:

- 화장품, 제약, 건강기능(nutraceutical) 또는 식이요법 조성물에서,

- 화상 치료용 생체물질로서, 2차 피부로서, 각막 드레싱 또는 봉합 물질 제조용으로,

- 특히 물 여과 및 정제를 위한 여과, 텍스처화, 응집 및/또는 흡착 작용제로서.

본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 방법은 도 1에 개략적으로 기술된 하기의 단계들을 포함한다. 이러한 바람직한 실시양태에서 특정 단계는 임의적인 것으로 지시된다는 것을 주지하여야 한다.

단계 1: 곤충 도살

이러한 도살 단계 1은 미생물 부하를 감소시키고 (악화 위험 및 건강 위험을 감소시킴), 자가분해를 유발할 수 있고, 따라서 곤충의 급속한 갈변을 유발할 수 있는 곤충의 내부 효소를 불활성화시키면서 곤충을 도살하는 것을 가능하게 한다.

도살은 탕침에 의해 수행될 수 있다.

따라서 곤충, 바람직하게는 유충을 2 내지 20분, 바람직하게는 5 내지 15분 동안 물로 탕침시킨다. 바람직하게는, 물의 온도는 95 내지 105℃를 포함하고, 바람직하게는 100℃이다.

이러한 탕침 단계 1 동안 도입되는 물의 양은 하기와 같이 결정된다: 물의 부피 (mL) 대 곤충의 중량 (g)의 비가 바람직하게는 0.3 내지 10, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5, 더욱 더 바람직하게는 0.7 내지 3에 포함되고, 더욱 더 바람직하게는 대략 1이다.

대안적으로, 블랜칭에 의해 도살을 수행할 수 있다. 바람직하게는, 80 내지 130℃, 바람직하게는 90 내지 120℃, 더욱 바람직하게는 95 내지 105℃를 포함하고, 더욱 더 바람직하게는 98℃인 온도의 증기 (증기 노즐 또는 층)로, 또는 95 내지 105℃를 포함하고, 바람직하게는 100℃인 온도의 물로 (분사 노즐에 의해), 또는 80 내지 130℃, 바람직하게는 90 내지 120℃, 더욱 바람직하게는 95 내지 105℃를 포함하는 온도에서 혼합 방식 (물 + 증기)으로 곤충을 블랜칭한다. 블랜칭 챔버에서의 체류 시간은 1 내지 15분, 바람직하게는 3 내지 7분을 포함한다.

이러한 단계에서, 하기의 중간 단계에서 지시되는 바와 같은 상세사항에 따라 산화제를 포함하는 탕침수 또는 블랜칭용 물을 사용하여 곤충 큐티클을 처리하는 것이 또한 가능하다.

중간 단계 (임의적): 큐티클의 산화제 처리

큐티클을 산화제로 처리하는 특수 단계가 방법에 도입될 수 있다. 유리하게는, 이러한 중간 큐티클 처리 단계는 도살 단계 1과 분쇄 단계 2 사이에 수행된다.

이러한 중간 단계는 바람직하게는 과산화수소 (H₂O₂), 과망간산칼륨 (KMnO₄), 오존 (O₃) 및 차아염소산나트륨 (NaClO)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산화제, 더욱 바람직하게는 과산화수소로 수행된다.

제1 실시양태에 따르면, 단계 1이 끝났을 때, 후자가 탕침에 의해 수행된 경우, 임의적으로 탕침수를 대략 40 내지 60℃, 바람직하게는 대략 50℃의 온도로 냉각한 후, 산화제를 탕침 탱크 내로 직접 도입한다.

시판되는 과산화수소는 일반적으로 수용액, 예를 들어 물의 총 중량을 기초로 30 중량％의 용액의 형태이다.

이러한 처리를 위해 도입되는 과산화수소의 양은 과산화수소 함량이 곤충의 총 중량을 기초로 1 내지 33 중량％, 바람직하게는 곤충의 총 중량을 기초로 2 내지 12 중량％에 포함되고, 바람직하게는 대략 6 중량％이도록 하는 것이다.

제2 실시양태에 따르면, 곤충을 탕침 탱크로부터 제거하고, 체로 거르고, 다시 탱크 내로 도입한다.

그 후, 과산화수소를 묽은 수용액의 형태로 탱크 내로 도입하고, 과산화수소 함량은 물 중량을 기초로 1 내지 33 중량％, 바람직하게는 물 중량을 기초로 2 내지 12 중량％에 포함되고, 바람직하게는 대략 6 중량％이다.

단계 2: 분쇄

곤충을 탕침 또는 처리 탱크로부터 또는 블랜칭 탱크로부터 제거한 후, 체로 거르고, 분쇄기, 예컨대 칼날 분쇄기에 놓아, 곤충을 입자로 감소시키는 것을 가능하게 한다.

분쇄를 용이하게 하기 위해, 일정량의 물을 첨가할 수 있다. 이러한 물의 양은 탕침 단계 1 동안 도입되는 것과 유사하다: 물의 부피 (mL) 대 곤충의 중량 (g)의 비가 바람직하게는 0.3 내지 10, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5, 더욱 더 바람직하게는 0.7 내지 3에 포함되고, 더욱 더 바람직하게는 대략 1이다. 이러한 단계를 수행하기 위해 탕침수 및/또는 중간 단계로부터 초래되는 물을 유지시키는 것이 또한 가능하다. 이러한 물은 산화제를 함유할 가능성이 있다. 이러한 경우, 큐티클 처리가 탕침 단계 1 및 분쇄 단계 2 동안 또는 중간 큐티클 처리 단계 동안 및 분쇄 단계 동안 일어날 수 있다.

바람직하게는, 분쇄 완료 시, 곤충 입자의 크기는 1 cm 미만 (현미경을 사용하여 관찰가능한 최대 입자 크기), 바람직하게는 0.5 cm 미만이다. 바람직하게는, 입자의 크기가 500 ㎛ 내지 0.5 cm, 더욱 더 바람직하게는 500 ㎛ 내지 1 mm에 포함된다.

입자의 크기를 과도하게, 예를 들어 250 ㎛ 미만의 크기로 감소시키는 것이 필수적이지 않다.

이러한 분쇄 단계 2는 효소가 이의 기질에 접근하는 것을 촉진한다.

이러한 단계에서, 이전의 중간 단계에서 지시된 바와 같은 방법에 따라 큐티클을 처리하기 위해 분쇄기 내로 산화제를 도입하는 것이 가능하다.

큐티클 처리가 분쇄와 동시에 수행되지 않는 경우, 이러한 단계 동안, 생성물 보존 및 안정성을 위해 통상적으로 사용되는 항산화제 첨가물을 첨가하는 것이 가능하다.

단계 3: 곤충 큐티클 압착

그 후, 분쇄 단계 2로부터 유래되는 습윤 페이스트를 압착 및 지방 분획 및 단백질 분획 양쪽 모두를 포함하는 주스의 분리를 가능하게 하는 절차에 따라 압착기 내에 놓는다.

바람직하게는, 압착 단계는 20％ 이하, 바람직하게는 15％ 이하, 더욱 바람직하게는 12％ 이하, 더욱 더 바람직하게는 10％ 이하의 오일 함량을 포함하는 압착 케이크를 수득하는 것을 가능하게 한다.

유사하게, 압착 단계는 건조물 함량이 30％ 내지 60％에 포함되고, 바람직하게는 40％ 내지 55％에 포함되며, 더욱 바람직하게는 45％ 내지 50％에 포함되는 압착 케이크를 수득하는 것을 가능하게 한다.

임의의 압착 시스템, 예를 들어, 단일-스크류 또는 이중-스크류 압착기 (앤젤 유형의 이중-스크류), 필터-압착기 (쇼퀘네 유형의 필터-압착기), 평판 압착기 등을 압착 단계를 수행하는데 사용할 수 있다. 이러한 시스템들은 관련 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 기술자는 상기 언급된 오일 및/또는 물 함량을 수득하기 위해 압착 조건을 결정할 수 있다.

분쇄 단계 2로부터의 습윤 페이스트가 산화제를 포함하는 물로 수득되었으면, 압착 단계 3 전에 이러한 산화제의 적어도 일부를 제거하는 것이 유리할 수 있다.

임의적으로 이러한 압착 단계 3은 탕침된 곤충으로부터 시작하여 분쇄 단계 2 전에 수행될 수 있다. 그러나, 압착 단계 3을 분쇄 단계 2 후에 수행하는 것이 유리하다.

따라서 이러한 압착 단계 3은 압착 주스 및 압착 케이크를 수득하는 것을 가능하게 한다.

단계 4: 효소 가수분해

분쇄 단계 2로부터 유래되는 습윤 페이스트 또는 압착 단계 3으로부터 유래되는 압착 케이크를 물과 함께 가수분해 탱크 내에 놓는다.

임의적으로, 그리고 하기에 기술될 바와 같이, 분리 단계 12로부터 유래되는 단백질 분획이 이를 압착 케이크와 혼합함으로서 이러한 효소 가수분해 단계 4에 재도입될 수 있다.

임의적으로, 그리고 탕침수가 산화제를 함유하지 않는 경우에, 탕침수를 회수하여 가수분해 단계에 재도입할 수 있다. 실제로, 이러한 물은 이러한 탕침 작용에 의해 가용화된 곤충 분획을 함유하고, 이를 가수분해에서 사용함으로써, 손실을 감소시키는 것이 가능하다. 임의적으로, 특정 왁스가 물에 용해되었을 수 있기 때문에 탕침으로부터의 이러한 물을 탈지시킬 수 있다.

이러한 효소 가수분해 단계 4에서 도입되는 물의 양은 탕침 단계 1에서 도입되는 것과 유사하다: 물의 부피 (mL) 대 곤충의 중량 (g)의 비가 바람직하게는 0.3 내지 10, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5, 더욱 더 바람직하게는 0.7 내지 3에 포함되고, 더욱 더 바람직하게는 대략 1이다.

효소 가수분해는 프로테아제, 예컨대 상업용 프로테아제로 4 내지 8시간, 더욱 특히 4 내지 5시간 동안 6 내지 8, 더욱 특히 6.5 내지 7.5의 pH에서 40 내지 60℃, 더욱 특히 45 내지 55℃의 온도에서 수행된다.

가수분해 단계에서 도입되는 효소의 양은 가수분해에 진입하는 건조물의 추정 총 중량을 기초로 10 중량％ 미만, 바람직하게는 6％ 미만, 더욱 바람직하게는 대략 2％이다.

단백질분해 가수분해는 펩티드, 글루코사민 및 올리고키틴을 함유하는 가용성 상, 및 키틴, 주로 키틴-폴리펩티드 공중합체로부터 형성된 고체 잔류물의 생산을 초래한다.

단계 5: 열 불활성화

반응의 효소의 활성을 정지시키고 가수분해의 가용성 상을 안정화시키기 위해, 이러한 주스를 80 내지 105℃에서 10 내지 25분, 바람직하게는 15 내지 20분 동안 가열함으로써 열 불활성화를 수행한다. 한 절차에 따르면, 이러한 열 불활성화 단계 5는 농식품 산업의 일반적인 멸균 기술에 따라 수행된다. 또 다른 절차에 따르면, IR 또는 UV 조사 하에 가열함으로써 또는 마이크로파 가열에 의해 효소 불활성화가 수행된다.

단계 6: 압착

주로 키틴으로 구성되는 고체 잔류물을 회수한 후, 압착액을 가용성 상 내로 재주입하기 위해, 이러한 잔류물이 최대로 탈수되도록 압착기에서 압착한다. 이렇게 형성된 압착된 잔류물은 주로 키틴-폴리펩티드 공중합체 형태인 키틴으로 본질적으로 이루어진다.

단계 7 및 8 (임의적): 세정 및 건조

그 후, 관련 분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술에 의해 고체 잔류물을 세정하고, 여과하고, 다시 세정한 후, 건조시킨다.

유리하게는, 키틴-폴리펩티드 공중합체의 구조를 보호하도록 건조 시스템이 디자인된다: 비중측정, 환기 및 공기 조성이 제어된다. 유리하게는, 60 내지 80℃, 바람직하게는 대략 70℃의 온도의 환기 스토브에서 건조가 수행될 수 있다.

임의적으로, 이러한 단계들은 최종 지질제거 단계를 포함할 수 있다: 최종 지질 잔류물, 특히 큐티클 왁스를 제거하기 위해 고체 잔류물을 HCl로 처리한다.

다음 단계 9 내지 11은 키틴을 키토산으로 변환시키기 위한 것이고, 따라서 원하는 생성물이 키토산인 경우에만 사용된다.

단계 9 (임의적): 분쇄

그 후, 예를 들어 절단형 (칼날) 분쇄기에서, 주로 키틴을 포함하는 건조된 고체 잔류물을 분쇄한다.

탈아세틸화 반응에 의해 키틴으로부터 키토산을 생산하는 것은 키틴 입자의 크기에 크게 좌우된다. 따라서, 하기 표 1에 제시된 바와 같이, 건조된 고체 잔류물을 탈아세틸화 전에 매우 미세하게 분쇄하는 것은 탈아세틸화 반응의 수율 및 속도를 유의하게 증가시키는 것을 가능하게 한다:

<표 1>

표 1에서 보고된 테스트에서 수행된 탈아세틸화의 조건은 하기와 같다: 반응 시간 4시간, 100℃, 30 부피％의 수용액 내의 NaOH, 추정 키틴:NaOH 용액 비 = 1:20.

결과적으로, 바람직하게는 고체 잔류물을 200 ㎛ 미만, 더욱 바람직하게는 160 ㎛ 미만의 입자 크기로 분쇄한다.

단계 10: 탈아세틸화

그 후, 고체 잔류물 (임의적으로, 단계 9에서 분쇄됨)을 반응기 내에 놓고, 여기에 진한 수산화나트륨 용액을 4 내지 24시간, 바람직하게는 6 내지 18시간 동안 첨가한다. 30％ 내지 40％ 범위의 함량의 수용액 내의 수산화나트륨을 1:50 내지 1:10에 포함되고, 바람직하게는 대략 1:20인 분쇄된 키틴의 중량 (g) / 수용액 내의 수산화나트륨의 부피 (mL)의 비로 첨가한다. 그 후, 탱크를 가열하고, 탈아세틸화 온도는 80 내지 150℃, 바람직하게는 90 내지 120℃, 더욱 바람직하게는 100℃이다.

이렇게 하여 키토산이 분말 형태로 수득된다.

그 후, 키토산이 관능화되게 하는 관련 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 공정, 특히 라디칼 첨가 (카르복실화, 히드록실화 등)가 키토산에 진행될 수 있다.

단계 11 (임의적): 건조

그 후, 건조물 함량이 85％ 초과, 더욱 특히 90％ 초과인 분말을 수득하기 위해 키토산 분말을 30 내지 80℃, 바람직하게는 50 내지 70℃, 바람직하게는 약 60℃에서 건조시킨다.

다음 단계는 압착 단계 3에서 수득된 주스로부터 지방 분획 및 단백질 분획을 회수하는 것이고, 따라서 이같은 회수를 원하는 경우에만 사용된다.

단계 12: 분리

지방 분획 (곤충 오일)을 단백질 분획 (곤충 혈액림프 단백질)으로부터 분리하기 위해 압착 주스에 하나 이상의 분리 단계를 진행한다. 이러한 단계들은 관련 분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 임의의 오일 분리 기술, 예컨대 원심분리, 경사분리, 역삼투에 의한 분리, 한외여과, 초임계 CO₂ 등, 또는 이러한 기술 중 몇몇의 조합에 의해 수행될 수 있다.

곤충 내에 매우 다양한 조성의 오일이 존재한다는 점에서 지방 분획의 분리는 복합적이고, 지방산에는 짧은 사슬 (C2-C5), 뿐만 아니라 매우 긴 사슬 (예를 들어, 왁스의 경우: > C25)이 있을 수 있다. 원심분리 동안 온도를 이러한 오일들의 융점(약 38℃)보다 높게 상승시키는 것은 이러한 크림을 가용화시킬 수 있게 하고, 지방 분획을 나머지 주스로부터 분리하는 것을 용이하게 할 수 있게 한다. 그 후, 오일 및 단백질의 최상의 가능한 분리를 위해, 원심분리가 절차에 따라 경사분리 (경사분리기 또는 트리캔터(Tricanter) 유형)로 진행된다.

이러한 단계들은 지방 분획을 수득하는 것을 가능하게 한다.

지방 분획으로부터 분리하였으면, 가수분해 단계 4 직전에 단백질 분획을 압착 단계 3으로부터 유래되는 압착 케이크와 혼합할 수 있다. 실제로, 종종 20％를 초과하는 단백질이 압착 단계 3에서 주스 내에서 손실되고, 따라서 이러한 분획을 회수하여 이를 가수분해 단계에 적용하는 것이 이롭다.

단계 13 (임의적): 농축

한 절차에 따라, 수성 부분의 진공 증발에 의해 농축을 수행한다. 농축물은 건조 추출물이 10％ 초과, 바람직하게는 20％ 초과이다. 이러한 공정은 건조를 용이하게 하고, 생성물 보존 및 안정성에 통상적으로 사용되는 첨가물을 이러한 단계에서 첨가할 수 있다.

단계 14 (임의적): 건조

마지막으로, 농축물을 관련 분야의 통상의 기술자에게 공지된 기술, 예를 들어 분사/분무에 의해 건조시키고 ("분사-건조"), 이는 펩티드 및 글루코사민이 풍부한 농축물의 추출물, 즉 건조 분말을 수득하는 것을 가능하게 하며, 특히 글루코사민은 (본질적으로) H₂O₂에 의한 키틴의 부분적 가수분해로부터 유래된다.

하기를 각각 나타내는 도면을 참조로, 예시의 방식으로 제공되는 하기의 실시예로부터 본 발명의 기타 특색 및 장점이 명백해질 것이다.
- 도 1은 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태의 순서도이다.
- 도 2는 1회 이상의 예비 분쇄 및 압착 단계를 포함하는 효소 방법에 의해 수득된 키틴의 순도를 비교하는 도표이다.
- 도 3은 키틴이 추출된 상이한 중간체 분획들에서 측정된 지질 함량을 비교하는 도표이다.
- 도 4는 예비 분쇄 및 압착 단계 또는 예비 압착 단계를 포함하는 효소 방법에 의해 수득된 압착 주스 및 압착 케이크 내의 지질의 분포를 나타낸다.
- 도 5는 본 발명에 따른 가수분해물 및 압착 주스 내의 단백질/펩티드의 분포를 이의 몰비 (％)에 따라 나타내는 도표이다.
- 도 6은 본 발명에 따른 가수분해물을 구성하는 아미노산의 상대적 분포를 나타내는 도표이다.
- 도 7은 키틴 내의 아미노산의 상대적 존재비를 나타내는 도표이다.
- 도 8: 압착이 가수분해물 내의 회분 함량에 미치는 효과 - 상이한 곤충.
- 도 9: 압착이 가수분해물 내의 회분 함량에 미치는 효과 - 상이한 효소.
- 도 10: 분쇄 + 압착 방법을 이용한 가수분해물 내의 회분 함량 - 상이한 곤충.
- 도 11: 프롤리브로 수행된 가수분해에 대한 상이한 방법 및 상이한 곤충에 따른 대형 단백질의 상대적 존재비.
- 도 12: 티. 몰리토르에 적용된 상이한 방법 및 상이한 효소에 따른 대형 단백질의 상대적 존재비.
- 도 13: 압착이 가수분해물의 단백질 함량에 미치는 효과 - 상이한 효소.
- 도 14: 압착이 가수분해물의 단백질 함량에 미치는 효과 - 상이한 곤충.
- 도 15: 압착이 가수분해물의 지질 함량에 미치는 효과 - 상이한 효소.
- 도 16: 압착이 가수분해물의 지질 함량에 미치는 효과 - 상이한 곤충.
- 도 17: 수득된 가수분해물의 펩신 소화성 - 조건부.
- 도 18: TM + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 19: TM + 스미자임: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 20: TM + 노보자임: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 21: TM + 뉴트라제: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 22: HI + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 23: GM + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 24: AD + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 25: 압착이 키틴 내의 회분 함량에 미치는 효과 - 상이한 효소.
- 도 26: 상이한 곤충들로부터의 키틴 내의 회분 함량.
- 도 27: 키틴 내의 지질 함량.
- 도 28: 키틴 내의 아미노산 함량.
- 도 29: TM + 프롤리브: 키틴 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 30: TM + 스미자임: 키틴 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 31: TM + 노보자임: 키틴 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 32: TM + 뉴트라제: 키틴 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 33: HI + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 34: GM + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 35: AD + 프롤리브: 가수분해물 내의 아미노산의 상대적 존재비.
- 도 36: 티. 몰리토르에 적용된 상이한 방법 및 상이한 효소에 따른 키틴의 중량측정 순도.
- 도 37: 프롤리브를 이용한 상이한 방법 및 상이한 곤충에 따른 키틴의 중량측정 순도.
- 도 38: 티. 몰리토르를 이용한 상이한 방법 및 상이한 효소에 따른 키틴의 비색측정 순도.
- 도 39: 프롤리브를 이용한 상이한 방법 및 상이한 곤충에 따른 키틴의 비색측정 순도.
- 도 40: 키틴의 차이에 의한 순도.
- 도 41: 티. 몰리토르에 대한 방법에 의해 수득된 키틴의 아세틸화도.
- 도 42: 프롤리브를 이용한 방법에 의해 수득된 키틴의 아세틸화도.
- 도 43: 2-광자 형광 현미경에 의한 큐티클 영상화.
- 도 44: 수득된 키틴의 결정화도.
- 도 45: 가수분해물 내의 단백질의 크기.

실시예 1: 본 발명에 따른 방법의 예

600 g의 티. 몰리토르 유충을 비커에 도입하고, 미리 끓인 600 mL의 물을 함유하는 100℃의 수조 내에 놓는다. 5분 후, 비커를 수조에서 제거하고, 유충을 탈수시킨 후, 600 mL 부피의 물과 혼합한다. 이렇게 수득된 액체를 하기 조건 하에 앤젤 유형의 이중-스크류 압착기로 압착한다:

- 속도 = 82회의 회전/분;

- W (에너지) = 3 HP (마력) 또는 2.68 × 10⁶ J;

- 공극률 (대략적) = 제1 부분은 0.5 mm, 마지막 부분은 0.2 mm.

이렇게 하여 압착 주스 및 습윤 중량 136.49 ± 4.48 g의 압착 케이크를 수득하고, 이 중 100.22 ± 0.22 g을 다음 단계에서 사용한다. 그러나, 수분 함량 및/또는 지질 함량 면에서 실질적으로 유사한 압착 케이크를 추출 및 수득하게 한다면, 임의의 다른 유형의 압착기를 사용할 수 있다. 예를 들어, 하기 특색을 갖는 쇼퀘네 유형의 필터 압착기로 다른 테스트를 수행하였다:

- 셀의 여과 표면적 = 50 ㎠;

- 압력 = 2 내지 8 바;

- 온도 = 20 내지 80℃,

- 공극률 = 25 내지 80 ㎛;

- 여과 종료 시의 유속 = 100 내지 250 mL/h.

압착 케이크를 1％ (압착 케이크의 습윤 중량에 대해 상대적)의 프로테아제 (프롤리브 NP 농축물)의 용액 600 mL를 함유하는 삼각 플라스크로 옮기고, 전체를 4시간 동안 45℃에서 (약 6.5의 pH에서) 자기 교반한다. 그 후, 효소를 비활성화시키기 위해 삼각 플라스크를 15분 동안 90℃의 수조 내에 놓은 후, 용액을 0.45-0.5 ㎛에서 고온 여과한다. 이렇게 수득된 키틴을 24시간 동안 70℃에서 건조시킨다. 이렇게 하여, 16.99 ± 1.77 g의 키틴이 이러한 방법으로 수득된다. 이러한 조건 하에, 가수분해물 (가수분해 후에 수득된 여과액)은 건조물 함량이 5.05％인 609.98 ± 10.9 g을 나타내고, 이는 동결건조 후 30.8 ± 0.55 g의 건조 가수분해물을 수득하는 것을 가능하게 한다.

실시예 2: 효소 가수분해 이전의 기계적 단계가 수득되는 키틴의 순도에 미치는 영향

여러 유형의 기계적 전처리를 테스트하였다 - 분쇄 ("분쇄 1") 단독, 분쇄 후 압착, 분쇄 후 압착 및 2차 분쇄 ("분쇄 2"), 뿐만 아니라 압착 단독.

압착을 위해, 실시예 1에 기술된 앤젤 유형의 압착기를 사용하였다.

1. 물질 및 방법

1회의 분쇄를 이용한 키틴 생산

200 g의 티. 몰리토르 유충을 비커 내로 도입하고, 미리 끓인 200 mL의 물을 함유하는 100℃의 수조 내에 놓는다. 5분 후, 비커를 수조에서 제거하고, 유충을 탈수시킨 후, 200 mL 부피의 물과 혼합한다. 이렇게 수득된 액체를 2 g의 프로테아제 (프롤리브)를 함유하는 삼각 플라스크로 옮기고, 전체를 4시간 동안 45℃에서 (약 6.5의 pH에서) 자기 교반한다. 그 후, 효소를 비활성화시키기 위해 삼각 플라스크를 15분 동안 90℃의 수조 내에 놓은 후, 용액을 0.45-0.5 ㎛에서 고온 여과한다. 이렇게 수득된 키틴을 24시간 동안 70℃에서 건조시킨다. 이렇게 하여, 8.13 ± 0.27 g의 키틴이 이러한 방법으로 수득된다.

분쇄 후 압착을 이용한 키틴 생산

200 g의 티. 몰리토르 유충을 비커 내로 도입하고, 미리 끓인 200 mL의 물을 함유하는 100℃의 수조 내에 놓는다. 5분 후, 비커를 수조에서 제거하고, 유충을 탈수시킨 후, 200 mL 부피의 물과 혼합한다. 이렇게 수득된 액체를 이중-스크류 유형의 압착기에 통과시킨다. 이렇게 수득된 압착 케이크 30 g을 150 mL의 물 및 0.3 g의 프로테아제 (프롤리브)를 함유하는 삼각 플라스크로 옮기고, 전체를 4시간 동안 45℃에서 (약 6.5의 pH에서) 자기 교반한다. 그 후, 효소를 비활성화시키기 위해 삼각 플라스크를 15분 동안 90℃의 수조 내에 놓은 후, 용액을 0.45-0.5 ㎛에서 고온 여과한다. 이렇게 수득된 키틴을 24시간 동안 70℃에서 건조시킨다. 이렇게 하여, 4.71 ± 0.11 g의 키틴이 이러한 방법으로 수득된다.

1차 분쇄 ("분쇄 1") 후 압착 및 2차 분쇄 ("분쇄 2")를 이용한 키틴 생산

200 g의 티. 몰리토르 유충을 비커 내로 도입하고, 미리 끓인 200 mL의 물을 함유하는 100℃의 수조 내에 놓는다. 5분 후, 비커를 수조에서 제거하고, 유충을 탈수시킨 후, 200 mL 부피의 물과 혼합한다. 이렇게 수득된 액체를 이중-스크류 유형의 압착기에 통과시킨다. 이렇게 수득된 압착 케이크를 24시간 동안 70℃의 오븐에서 건조시킨 후, 250 ㎛로 분쇄한다. 이렇게 수득된 분말 10 g을 50 mL의 물 및 0.1 g의 프로테아제 (프롤리브)를 함유하는 삼각 플라스크로 옮기고, 전체를 4시간 동안 45℃에서 (약 6.5의 pH에서) 자기 교반한다. 그 후, 효소를 비활성화시키기 위해 삼각 플라스크를 15분 동안 90℃의 수조 내에 놓은 후, 용액을 0.45-0.5 ㎛에서 고온 여과한다. 이렇게 수득된 키틴을 24시간 동안 70℃에서 건조시킨다. 이렇게 하여, 4.93 ± 0.12 g의 키틴이 이러한 방법으로 수득된다.

압착 단독을 이용한 키틴 생산

200 g의 티. 몰리토르 유충을 비커 내로 도입하고, 미리 끓인 200 mL의 물을 함유하는 100℃의 수조 내에 놓는다. 5분 후, 비커를 수조에서 제거하고, 유충을 탈수시킨 후, 이중-스크류 유형의 압착기에 통과시킨다. 이렇게 수득된 압착 케이크 90 g을 450 mL의 물 및 0.9 g의 프로테아제 (프롤리브)를 함유하는 삼각 플라스크로 옮기고, 전체를 4시간 동안 45℃에서 (약 6.5의 pH에서) 자기 교반한다. 그 후, 효소를 비활성화시키기 위해 삼각 플라스크를 15분 동안 90℃의 수조 내에 놓은 후, 용액을 0.45-0.5 ㎛에서 고온 여과한다. 이렇게 수득된 키틴을 24시간 동안 70℃에서 건조시킨다. 이렇게 하여, 6.48 ± 0.28 g의 키틴이 이러한 방법으로 수득된다.

화학적 경로에 의한 키틴 생산

50 g의 티. 몰리토르 유충을 비커에 도입하고, 미리 끓인 50 mL의 물을 함유하는 100℃의 수조 내에 놓는다. 5분 후, 비커를 수조에서 제거하고, 유충을 탈수시킨 후, 60 mL 부피의 물과 혼합한다. 이렇게 수득된 액체를 1-L 용기로 옮기고, 500 mL의 1 M HCl 용액을 첨가한다. 전체를 1시간 동안 90℃에서 교반한다. 그 후, 내용물을 여과하고, 고체 잔류물을 500 mL의 1 M NaOH 용액을 함유하는 1-L 플라스크로 옮기고, 전체를 90℃에서 24시간 동안 교반한다. 그 후, 잔류물을 여과하고, 24시간 동안 70℃의 환기 스토브에 놓는다. 이렇게 하여, 0.944 ± 0.005 g의 화학적으로 정제된 키틴이 수득된다.

순도 계산

수득된 건조 잔류물의 중량을 화학적 추출로부터 초래되는 것 (최초의 건조물의 약 5％)에 비교함으로써 키틴의 순도를 결정한다.

지질 함량 측정

2 g의 샘플을 비커에 놓고, 여기에 0.2 g의 Na₂SO₄ 및 15 mL의 CHCl₃/MeOH (2/1 v/v)를 첨가한다. 전체를 20분 동안 자기 교반한 후, 용액을 여과하고, 잔류물을 다시 10 mL의 CHCl₃/MeOH (2/1 v/v)가 있는 비커에 놓는다. 전체를 15분 동안 자기 교반한 후, 용액을 여과하고, 용매 상을 합치고, 일정 중량으로 증발시킨다. 샘플의 최초 중량 (2 g)에 대해 상대적인 추출-증발 후의 중량 백분율로서 지질 함량을 결정한다.

2. 결과

도 2에서 볼 수 있듯이, 수득되는 키틴의 순도에 방법이 영향을 미치고, 최소 압착으로 최상의 결과들이 수득된다. 분쇄 후 압착으로 최상의 결과가 수득되고, 즉 키틴의 순도가 78％이며, 분쇄 단독으로 최악의 결과가 수득되고, 즉, 키틴의 순도가 48％이다.

키틴이 추출된 중간체의 더 세밀한 분석은 낮은 지질 함량이 수득되는 키틴의 순도가 더 큰 것을 촉진한다는 것을 나타낸다 (도 3). "중간체"는 효소 가수분해에 진입하는, 다시 말해 가수분해 전의 마지막 단계, 즉 상기 언급된 생산 방법에 따르면 분쇄 단계 1 또는 2 또는 압착 단계로부터 유래되는 생성물을 의미한다.

실제로, 키틴 및 가수분해 주스 내의 지질 함량의 분석은 중간체 내에 존재하는 최초의 지질 함량에 따라, 키틴 내의 지질 함량은 7 내지 15％로 안정적인 반면, 가수분해물 내의 지질 함량은 11 내지 47％로 다양하다는 것을 나타낸다 (도 3).

더욱 특히, 중간체의 지질 함량이 35％면,

- 가수분해로부터 초래될 키틴이 50％만 순수할 것이고, 10％ 지질을 포함할 것이고,

- 가수분해물의 지질 함량 자체가 40％에 가까울 것이다.

그러나, 중간체의 지질 함량이 7％면,

- 가수분해 후에 수득되는 키틴이 순도가 80％일 것이고, 지질 함량이 8％일 것이며, 가수분해물 또한 대략 10％로 지질 함량이 낮을 것이다.

이는 최초의 지질 함량이 12％ 초과로 높으면, 가수분해를 담당하는 효소가 촉매 혼란(promiscuity)으로 인해 단백질뿐만 아니라 지질을 또한 가수분해하게 된다는 것을 가리킨다. 따라서, 최초의 지질이 각각 35 및 7％인 경우에 유사한 키틴 내 지질 함량, 즉 8.6 및 7.9％가 수득된다. 그러나, 이러한 경우에 키틴의 순도가 각각 48％에서 84％로 변화된다. 따라서, 한쪽의 52％의 불순물 및 다른쪽의 16％ 중에서, 평균 8％가 지질로 인한 것이고, 그러므로, 여전히 키틴에 부착되어 있는 단백질의 양이 가수분해에 적용되는 중간체에 더 많은 지질이 존재한 경우에 38포인트 더 높다.

마지막으로, 압착 이전의 분쇄의 중요성을 또한 연구할 수 있다 (도 4). 따라서, 예비 분쇄가 수행되었을 때 케이크와 압착 주스 사이의 지질 분포가 42.7 대 57.3에 대비하여 12.9 대 87.1로 훨씬 더 효과적이라는 것을 명확하게 볼 수 있다.

실시예 3: 가수분해물의 분석

실시예 1에서 수득된 가수분해물에 대해 상세 분석을 수행하였다.

1. 글루코사민 함량

가수분해물 내의 글루코사민 및 특정한 다른 당의 함량을 가메탄올분해 및 실릴화 후에 기체 크로마토그래피에 의해 분석하였다.

절차:

10 mg의 샘플 및 50 ㎍의 내부 표준물을 4시간 동안 110℃에서 (또는 24시간 동안 130℃에서) 500 ㎕의 메탄올/3N 염산 혼합물 내에 놓는다. 그 후, 혼합물을 Ag₂CO₃로 중화한다. 존재하는 임의의 아미노당을 다시 아세틸화시키기 위해 50 ㎕의 아세트산 무수물을 첨가한다. 주위 온도의 암실에서 하룻밤 동안 유지시킨 후, 샘플을 원심분리하고 (15분, 3000 rpm), 상청액을 증발시킨다. 그 후, 화합물을 100 ㎕의 피리딘에 용해시키고, 100 ㎕의 BSTFA (수펠코(Supelco))와 함께 주위 온도에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다. 그 후, 시약을 증발시키고, 잔류물을 700 ㎕의 CH₂Cl₂에 용해시키고, GC에 주입한다.

온도 프로그램: 120℃에서 1분, 180℃까지 1.5℃/분의 구배, 그 후 200℃까지 2℃/분.

검출: FID

칼럼: HP-5MS (30 m, 0.25 mm 내경)

내부 표준물: 미오-이노시톨

2가지 상이한 방식으로 다양한 함량을 측정하고 계산하였다 (표 2). 글루코사민이 0.1-0.15 중량％의 함량 및 글루코스에 대한 0.04-0.05의 비로 가수분해물 내에 존재한다는 것을 볼 수 있다.

<표 2>

2. 단백질 크기

가수분해물 내의 단백질/펩티드의 크기를 HPLC, 시마즈(Shimadzu) 20A 기기에 의해 주위 온도에서 수퍼덱스 펩티드(Superdex Peptide) 10/300 GL 칼럼 상에서 0.4 mL/분의 유속으로 아세토니트릴 (ACN) 30％, 트리플루오로아세트산 (TFA) 0.1％의 완충제에서 평가하였다. 205 nm에서 검출하였고, 주입된 샘플 부피는 20 ㎕였다.

또한, 비교 목적을 위해 실시예 1에서 제조된 압착 주스 내의 단백질/펩티드의 크기도 동일한 조건 하에 평가하였다.

압착 주스와 가수분해물 사이의 단백질 크기의 비교 (도 5)는 가수분해물 내에 존재하는 펩티드의 대부분 (76％)이 몰질량이 130 내지 900 Da에 포함된다는 것을 명확하게 나타낸다. 그러나, 소화성이 낮은 단백질 (몰질량이 1300 Da을 초과함)의 비율은 31％에서 2％로 감소된다. 유사하게, 쓴맛 특성이 있는 펩티드 (몰질량이 130 Da 미만임)의 비율이 38％에서 15％로 하락한다. 따라서, 제안된 효소 처리에 의해 소화성 및 식미(palatability)가 개선된다.

3. 소화성

가수분해물의 펩신 소화성의 수준이 총 단백질의 99.6％로 추정된다. 이는 외부 실험실에서 측정되었고, 사용된 방법은 72/199/EEC 지침에 따르며, 탈지하지 않고 수행되었다.

4. 단백질 함량

가수분해물 내의 단백질 함량이 84.8％로 추정된다. 이는 6.25의 보정 인자로 킬달(Kjeldahl) 방법에 의해 외부 실험실에서 측정되었다. 사용된 방법은 EC 규정 152/2009에 따른다.

5. 지질 함량

가수분해물 내의 지질 함량이 0.7 ± 0.5％로 추정된다. 이는 EC 규정 152/2009로부터 개조된 소위 "가수분해" 방법 (방법 B)에 의해 외부 실험실에서 측정되었다.

6. 아미노산 조성

다양한 효소로 처리한 후에 수득된 가수분해물을 이의 아미노산 조성에 대해 분석하였다 (도 6). 이는 프롤린의 대사산물이고 특정 생물, 예를 들어, 갑각류에 부재하는 아미노산인 히드록시프롤린 (HYP)의 존재와 함께 프롤린이 우세한 것을 나타낸다. 현재, 프롤린 및 이의 대사산물인 히드록시프롤린은, 특히 다른 아미노산 예컨대 아르기닌 및 글루타메이트의 합성을 허용하는 것에 의해, 대사에서 필수적인 역할을 한다. 대부분의 포유동물이 프롤린을 합성할 수 있지만, 신생아, 조류 및 어류에 의한 이러한 아미노산의 생산이 불충분하고, 이러한 이유로 특정 동물의 성장을 증가시키기 위해 프롤린 및 히드록시프롤린의 보충이 때때로 사용된다. 또한, 프롤린은 포유동물의 젖에 함유된 제1 아미노산으로, 12％의 함량으로 존재하지만, 식물 단백질 내의 이의 함량은 훨씬 적어서, 대두에서는 2.9％, 옥수수에서는 0.8％일 뿐이다. 따라서, 이러한 가수분해물은 프롤린 함량이 젖만큼 높고, 식물 단백질에서 발견되는 것보다 훨씬 더 높은 것으로 확인된다.

대량으로 존재하는 다른 아미노산은 알라닌, 류신 및 글루타메이트 (글루타민 포함)이다. 이들의 상대적 비는 9％를 초과한다. 그러나, 황-함유 아미노산 예컨대 시스테인 및 메티오닌은 대략 0.5％의 낮은 양으로 존재한다.

이러한 결과를 결정하는데 사용된 방법 (산 가수분해)는 트립토판 및 아르기닌과 같은 아미노산의 검출을 가능하게 하지 않았다. 또한, 아스파라긴은 아스파르트산으로, 글루타민은 글루탐산으로 완전히 변환되었고, Asp 및 Glu 피크 하에 관찰되는 것은 실제로는 각각 한쪽은 최초에 가수분해물 내에 존재하는 아스파르트산 및 아스파라긴의 합계이고, 다른 한쪽은 최초에 가수분해물 내에 존재하는 글루탐산 및 글루타민의 합계이다.

실시예 4: 키틴 분석

실시예 1에서 수득된 키틴에 대해 상세한 아미노산 분석을 수행하였다.

총 아미노산 함량은 공중합체 100 g 당 32.3 g이다 (아미노산의 합계로 결정됨). 존재하는 아미노산은 주로 발린, 글리신, 알라닌 및 타이로신이다 (도 7).

분석을 하청주었고, 결과는 트립토판의 경우는 NF EN ISO 13904 방법, 다른 아미노산의 경우는 NF EN ISO 13903 방법으로 수득되었다.

실시예 5: 사용된 생산 방법에 따른 가수분해물 및 키틴의 특성화

I. 물질 및 방법

a) 물질

곤충

다양한 곤충을 연구하였다:

- 딱정벌레목 곤충: 테네브리오 몰리토르 (티. 몰리토르 또는 TM),

- 나비목 곤충: 갈레리아 멜로넬라 (지. 멜로넬라(G. melonella) 또는 GM),

- 파리목 곤충: 헤르메티아 일루센스 (에이치. 일루센스(H. illucens) 또는 HI), 및

- 메뚜기목 곤충: 아케타 도메스티쿠스 (에이. 도메스티쿠스(A. domesticus) 또는 AD).

효소

다양한 효소를 가수분해 단계에서 사용하였다.

이러한 효소 활성 측정은 단백질분해 효소에 의한 카세인 가수분해 동안의 275 nm에서의 타이로신 방출 측정의 원리를 기초로 한다 (카렌 프랫(Karen PRATT)에 의한 밸리 리서치 SAPU 어세이(Valley Research SAPU Assay) 방법).

SAPU/g = 프로테아제의 분광광도법 단위

ΔA = 보정된 흡광도

i = 원점에서의 y-축

11 = 최종 반응 부피

M = 검정 곡선의 경사

30 = 반응 시간 (분)

C = 첨가된 효소 용액 내의 효소 농도 (g/mL)

1 = 첨가된 효소 용액의 1 mL 부피

포스페이트 완충제 (0.2 M, pH 7) 내의 여러 농도의 타이로신 용액의 흡광도를 측정함으로써 검정 곡선을 수득한다.

5 mL의 카세인 용액 (0.7％ w/v, 포스페이트 완충제 0.2 M, pH 7, 30분 동안 90℃에서 가열되고, 3.75 g/L_용액으로 첨가됨)을 1 mL의 테스트할 효소 용액 (100 mL의 글리신 완충제, 0.05 M 내의 0.15 g)과 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 그 후, 5 mL의 TCA 용액 (18 g TCA, 11.35 g의 무수 아세트산나트륨, 21 mL의 빙초산을 무기질을 제거한 물로 1 리터의 용액으로 만듦)을 첨가하고, 와동기 상에서 혼합하고, 여과하고, 275 nm에서 흡광도를 측정한다.

대조군을 동일하게, 그러나 효소를 첨가하지 않고 제조하고, 대신 반응 부피를 동일하게 하기 위해 무기질을 제거한 물 1 mL를 첨가한다.

사용된 다양한 효소 (프롤리브 NP, 노보자임 37071, 뉴트라제 및 스미자임)에 대해 이렇게 측정된 활성이 표 3에서 열거된다.

<표 3>

b) 생산 방법

분쇄만 이용하는 생산 방법 (도면에서 "분쇄"로 표기됨)

600 g의 신선한 곤충 (티. 몰리토르, 지. 멜로넬라 또는 에이치. 일루센스의 경우는 유충; 에이. 도메스티쿠스의 경우는 귀뚜라미)을 챔버에 도입하고, 증기 (115℃, 5분)로 도살한다. 그 후, 곤충을 혼합기에 도입하고, 곤충 100 g 당 75 mL의 물을 첨가하고, 전체를 혼합한다. 그 후, 이렇게 수득된 생성물 100 g (습윤 중량)을 응축기 및 기계적 교반기가 장착된 3목 플라스크에 도입하고, 3789 SAPU에 등가인 활성의 단백질분해 효소를 첨가한다. 그 후, 반응을 4시간 동안 45℃로 가열한다. 그 후, 15분 동안 온도를 90℃로 상승시키고, 마지막으로 반응 혼합물을 여과한다 (0.40-0.45 ㎛). 잔류물을 24시간 동안 70℃에서 건조시킨다: 이렇게 하여 이는 효소 경로에 의한 정제에 의해 수득된 키틴이다; 여과액을 동결 건조시킨다: 이렇게 하여 이는 가수분해물이다.

어떤 곤충 또는 효소가 연구되든지 방법은 동일하다.

분쇄 후의 압착을 이용하는 생산 방법 (도면에서 "분쇄 + 압착"으로 표기됨)

600 g의 신선한 곤충 (티. 몰리토르, 지. 멜로넬라 또는 에이치. 일루센스의 경우는 유충; 에이. 도메스티쿠스의 경우는 귀뚜라미)을 챔버에 도입하고, 증기 (115℃, 5분)로 도살한다. 그 후, 곤충을 혼합기에 도입하고, 곤충 100 g 당 75 mL의 물을 첨가하고, 전체를 혼합하고, 압착한다 (이중-스크류 압착기, 또는 필터 압착기, 또는 기타 압착 시스템). 그 후, 이렇게 수득된 생성물 100 g (습윤 중량)을 응축기 및 자기 교반기가 장착된 3목 플라스크에 도입하고, 500 mL의 물, 뿐만 아니라 3789 SAPU에 등가인 활성의 단백질분해 효소를 첨가한다. 그 후, 반응을 4시간 동안 45℃로 가열한다. 그 후, 15분 동안 온도를 90℃로 상승시키고, 마지막으로 반응 혼합물을 여과한다 (0.40-0.45 ㎛). 잔류물을 24시간 동안 70℃에서 건조시킨다: 이렇게 하여 이는 효소 경로에 의한 정제에 의해 수득된 키틴이다; 여과액을 동결 건조시킨다: 이렇게 하여 이는 가수분해물이다.

어떤 곤충 또는 효소가 연구되든지 방법은 동일하다.

c) 분석

회분 함량 측정

2009년 1월 27일자의 EC 규정 152/2009를 기초로 하는 방법에 의해 회분 함량을 결정하였다.

단백질 크기 측정

100 mg의 샘플을 10 mL의 포스페이트/NaCl 완충제 (pH 7.4, 0.137 mM)에 도입하였다. 샘플을 1분 동안 교반하고 (와동기), 900 g에서 1분 동안 원심분리한 후, 0.45 ㎛ 막으로 여과하였다. 입체 배제 크로마토그래피 시스템에서 누클레오겔(Nucleogel) GFC-300 칼럼으로 분석을 수행하였고, 사용된 용리제는 포스페이트/NaCl 완충제 (pH 7.4, 0.137 mM)이고, 유속은 1.0 mL/분이며, 280 nm에서 UV 검출기로 검출한다.

단백질 함량 측정

표준 NF EN ISO 16634-1로부터 개조된, 변환 인자 6.25의 두마스(Dumas) 방법에 의해 단백질 함량을 수득한다.

지질 함량 측정

EC 규정 152/2009로부터 개조된 방법 - 방법 B - SN에 의해 지질 함량을 수득한다.

펩신 소화성

72/199/EC 지침에 기술된 방법에 의해 펩신 소화성을 측정한다.

아미노산의 상대적 존재비

2009년 1월 27일자의 EC 규정 152/2009로부터 유래되는 방법 - SN에 의해 아미노산의 존재비를 결정하였다. 2009년 1월 27일자의 EC 규정 152/2009로부터 개조된 방법 - SN에 의해 트립토판 함량을 별도로 결정하였다. 각각의 아미노산의 함량을 아미노산 함량에 비교함으로써 상대적 존재비를 계산하였다.

아미노산 함량

트립토판을 포함하여 각각의 아미노산에 대해 수득된 개별적인 값을 합산함으로써 아미노산 함량을 결정하였다.

중량측정 순도

수득된 건조 잔류물의 중량을 화학적 추출로부터 초래되는 것에 비교함으로써 중량측정 순도를 결정하고, 후자는 최초의 건조물의 약 5％인 것으로 평가된다.

비색측정 순도

이들의 평균이 실제 색상의 평가를 나타내는 3가지 색상인 적색, 녹색 및 청색 (RGB)에 따라 이미지제이(ImageJ) 소프트웨어를 사용하여 샘플의 사진을 분석함으로써 샘플의 색을 추정하였다. 키틴 프랑스(Chitine France)가 판매하는 새우 키틴의 샘플을 표준물 (100％ 순도)로 취하였고, 생산된 샘플의 비색측정 순도를 이러한 색상의 백분율 (샘플 색상 대 표준물 색상의 비)로서 계산하였다.

차이에 의한 순도

이러한 측정의 경우, 공지된 불순물 (아미노산, 지질 및 회분)의 양을 절대 순도의 값 (100％)으로부터 차감하여 차이에 의해 추정되는 순도의 값을 수득하였다; 즉, 이에 따라 30％ 단백질, 10％ 지질 및 1％ 회분을 함유하는 샘플에 100-30-10-1=59％의 순도를 할당한다.

결정화도

링크스아이(Lynxeye) XE 검출기가 장착된 브루커 D8 어드밴스(Bruker D8 Advance) 기기 (A25 다빈치(DaVinci) 디자인)에서 WAXS (광각 X선 산란) 기술에 따라 측정하였다. 결과를 문헌 [Loelovich, M. Res. Rev.: J. Chem. 2014, 3, 7-14]에 기술된 방법에 따라 해석하였다.

아세틸화도

800 MHz 자석이 장착된 ¹³C NMR CP/MAS (브루커(Bruker)) 기기를 사용하여 측정하였다.

결과를 문헌 [Simionatto Guinesi, L.; Gomes Cavalheiro, E. T. Thermochimica Acta 2006, 444, 128-133] 및 [Heux, L.; Brugnerotto, J.; Desbrieres, J.; Versali, M.-F.; Rinaudo, M. Biomacromolecules 2000, 1, 746-751]에 기술된 바와 같이 분석하였다.

원자 및 관능기의 표면 존재비의 측정

RX Ka A1 광원 (1486.6 eV), 단색화장치 및 자기 렌즈가 장착된 XPS 에스코랩(Escolab) 250 (VG 사이언티픽(VG Scientific)) 기기를 사용하여 측정하였다.

미리 분말로 감소시킨 샘플을 48 내지 72시간 동안 진공 하에 놓은 후, 분석하였다.

2-광자 형광 현미경에 의한 큐티클 영상화

DISCO 기기 (싱크로트론 솔레이유(Synchrotron Soleil)) 상의 다광자 현미경.

람다 exc=810 nm, 파워 18％, 터키 블루 및 황토색 필터 406/15 (SHG), 청색 필터 460/60, 녹색 필터 550/88.

II. 가수분해물

a) 회분

어떤 곤충이 연구되든지 (도 8), 압착이 수득되는 가수분해물 내의 회분 함량에 매우 유의하게 영향을 미친다. 실제로, 회분 함량의 감소가 52％에 도달할 수 있고, 곤충에 천연적으로 무기질이 풍부하든 그렇지 않든 비례적 감소가 꽤 유사하다. 따라서, 에이치. 일루센스의 경우, 회분 함량이 분쇄를 이용하는 방법이 사용된 경우의 7.5 g/건조물 100 g에서 압착 단계가 추가된 경우의 3.8 g/건조물 100 g으로 변화되고, 즉 49％ 감소하고; 티. 몰리토르의 경우, 이는 5 g/100 g에서 2.4 g/100 g으로 변화되고, 즉 52％ 감소한다.

또한, 어떤 효소가 사용되든지 (도 9), 압착이 수득되는 가수분해물 내의 회분 함량에 매우 유의하게 영향을 미친다. 특히, 티. 몰리토르의 경우, 효소와 관계없이, 압착을 이용하는 방법이 사용된 경우 가수분해물 내의 회분 함량이 3％ 미만인 것이 주목된다.

어떤 곤충이 연구되든지 (도 10), 가수분해물 (분쇄 + 압착 방법에 의해 수득됨) 내의 회분 함량은 4 g/건조물 100 미만이다.

b) 가수분해물 내의 단백질의 크기

어떤 곤충 (도 11) 또는 효소 (도 12)가 사용되든지, 압착 단계의 사용이 단백질분해 효소의 성능을 개선하는 것을 명백하게 가능하게 한다. 따라서, 분쇄 단계만 포함하는 방법에 비해 대형 단백질의 상대적 존재비가 유의하게 하락하여, 프롤리브로 수행된 가수분해의 경우, 어떤 곤충이든지 최종 가수분해물이 이를 최대 10.3％ 초과로 포함하지 않고, 티. 몰리토르의 가수분해의 경우, 어떤 효소가 사용되든지 17.5％ 초과로 포함하지 않는다.

c) 단백질 함량

가수분해물의 단백질 함량이 사용된 방법에 고도로 의존적이다. 따라서, 분쇄만 적용된 경우, 어떤 효소가 사용되든지 (도 13), 단백질이 이렇게 수득된 티. 몰리토르로부터의 가수분해물의 건조물의 53.59 ± 1.5％만 나타낸다. 그러나, 분쇄 후에 압착되는 경우에는, 가수분해물 내의 단백질 함량이 84.58 ± 1.4％가 되고, 따라서, 사용된 효소에 따라 53-62％ 증가된다.

곤충에 원래 단백질이 빈약하였으면 이러한 증가가 더 크고, 따라서 지. 멜로넬라의 경우, 단백질 함량이 41.25％에서 71％로 변화하여 거의 86％ 증가되고, 에이치. 일루센스의 경우는 심지어 증가가 118％인데, 34.2％에서 74.5％로 변화되기 때문이다 (도 14).

d) 지질 함량

어떤 효소 (도 15) 또는 곤충 (도 16)이 연구되든지, 압착이 가수분해물의 지질 함량에 중대한 영향을 미친다. 실제로, 지질 함량이 51.4-97.7％만큼 극적으로 감소하고, 따라서 에이치. 일루센스의 경우에는 28.6％에서 13.9％로 변화하고 (51.4％ 감소), 티. 몰리토르 + 노보자임의 경우에는 33.85％에서 0.9％로 변화한다 (97.3％ 감소).

e) 펩신 소화성

어떤 효소 또는 곤충이 연구되든지 (도 17), 이렇게 수득된 가수분해물의 펩신 소화성이 96％ 초과로 매우 높다.

f) 아미노산 존재비

어떤 효소 또는 곤충이 연구되든지 (도 18-24), 압착 단계의 사용이 큐티클 내에 더 많이 존재하는 아미노산, 예컨대 알라닌 및 타이로신, 그리고 더 적은 정도로 발린, 세린 및 글리신의 더 양호한 추출을 수득하는 것을 가능하게 한다 (도 18-24). 이러한 결과들은 효소로 정제된 키틴 내에 존재하는 아미노산에 관련된 것들 (도 29-35)과 또한 비교되어야 한다.

주: 아스파르트산 및 글루타메이트를 특히 포함하여 특정 아미노산의 상대적 존재비가 감소되지만, 이들의 양은 동일하게 유지되거나 또는 심지어 특정 경우에는 약간 증가되는데, 이는 압착 단계를 이용하는 방법에 의해 추출된 아미노산의 총량이 증가하기 때문이다 (가수분해물 내의 단백질 함량 참조).

III. 키틴

a) 회분

가수분해물보다 더 적은 정도이긴 하지만, 키틴 내의 회분 함량 또한 압착 단계에 의해 영향을 받는다. 따라서, 사용된 효소에 따라 25％ 내지 28.6％ 범위의 감소가 관찰된다 (도 25).

어떤 곤충이 연구되든지 (도 26), 키틴 (분쇄 + 압착 방법에 의해 수득됨) 내의 회분 함량이 극도로 낮다. 따라서, 티. 몰리토르의 경우, 최대 회분 함량이 1.05 g/건조물 100 g이고, 심지어 천연적으로 무기질이 풍부한 곤충의 경우에도 여전히 3.5 g/건조물 100 g 미만이다.

b) 키틴 내의 지질 함량

가수분해물보다 약간 더 적은 정도이긴 하지만, 압착 단계가 방법에 추가되는 경우에 키틴 내의 지질 함량 또한 감소된다 (도 27). 효율은 본질적으로 효소에 의존적이어서, 스미자임의 경우의 15％에서 노보자임의 경우의 60％까지이다. 어떤 곤충이든지, 반응이 프롤리브로 수행되는 경우에, 이러한 감소는 에이치. 일루센스의 경우의 50％ 내지 티. 몰리토르의 경우의 58％이다.

모든 곤충에 대해, 지질 함량이 12％ 미만이고, 비-비행 곤충에 대해서는 심지어 ≤6％이다.

c) 키틴 내의 아미노산의 함량 및 상대적 존재비

압착 단계가 더 큰 비율의 키틴-부착 단백질을 제거하는 것을 가능하게 한다. 키틴의 실제 구조에 존재하는 아미드 관능기로 인해 단백질 함량의 직접적인 측정이 어려워지기 때문에, 아미노산 합계에 의해 이러한 단백질 함량의 근사값을 구하였다 (도 28). 따라서, 어떤 효소 또는 곤충이 연구되든지, 압착 단계가 방법에 추가된 경우에, 아미노산 합계가 5 내지 54％만큼 감소한다는 것을 볼 수 있다.

알라닌을 포함하는 일부 아미노산이 압착 단계가 수행되는 경우에 더 양호하게 추출되는 것으로 보이지만, 아미노산의 상대적 존재비는 압착 단계에 의해 거의 영향을 받지 않는다 (도 29 내지 35). 그럼에도 불구하고, 모든 곤충에 대해, 알라닌, 타이로신 및 프롤린, 뿐만 아니라 더 적은 정도로 발린, 글리신, 류신 및 세린이 키틴에 주로 부착되는 아미노산이고, 이들의 함량이 평균적으로 모든 아미노산의 23 내지 40％에 포함되며, 압착 단계가 방법에 추가되는 경우에 키틴에서 가장 큰 감소가 관찰되고 가수분해물 (도 18-24)에서 가장 큰 증가 (최대 7-30％에 도달함)가 관찰되는 것이 이러한 아미노산들 중에 있다고 할 수 있다.

d) 중량측정 순도

어떤 효소 (도 36) 또는 곤충 (도 37)이 연구되는지와 관계없이, 압착 단계를 사용함으로써 중량측정 순도가 개선된다. 따라서, 이는 티. 몰리토르 + 프롤리브의 경우 48.7％에서 77.1％로, 에이치. 일루센스 + 프롤리브의 경우 33.7％에서 87.9％로 변화된다.

e) 비색측정 순도

어떤 효소 또는 곤충이 연구되든지 (도 38 및 39), 압착 단계가 방법의 일부를 형성하는 경우에, 확실히 중량측정 순도에 대한 것보다 덜 현저하지만 비색측정 순도에서의 개선이 또한 관찰된다.

f) 차이에 의한 순도

압착을 이용하는 방법 후에 수득된 키틴 내의 지질, 회분 및 아미노산 함량의 감소 덕분에, 어떤 곤충 또는 효소가 연구되든지 (도 40), 이러한 키틴에 대한 차이에 의한 순도가 유의하게 증가하여, 에이치. 일루센스의 경우의 13％, 티. 몰리토르 + 프롤리브의 경우의 최대 74％만큼 증가된다.

g) 키틴의 아세틸화도

아세틸화도가 압착 단계를 방법에 추가하는 것에 유의하게 영향을 받는다 (도 41 및 42). 실제로, 혈액림프로부터의 지질 및 아미노산을 제거하는 것은 큐티클 표면에 대한 효소의 접근성이 더 크게 하고, 이는 키틴에 결합된 단백질의 펩티드 결합의 절단의 개선에 기여하지만, 촉매 혼란을 통해, 키틴의 아미드 결합의 절단의 개선에 또한 기여한다. 따라서, 이러한 방법으로부터 초래된 티. 몰리토르의 키틴의 아세틸화도는 76 내지 79％에 포함되는 반면, 압착 단계의 부재 하에서는 아세틸화도가 91％이고, 심지어 화학적 가수분해 (혹독한 조건의 온도 및 시약 하에 수행됨)는 85％의 아세틸화도에 이른다.

고려되는 다른 곤충, 특히 지. 멜로넬라 및 에이. 도메스티쿠스의 경우, 아세틸화도가 또한 방법에 영향을 받고, 따라서 한 경우에는 83에서 74％로, 다른 경우에는 100에서 95％로 각각 변화된다.

키틴의 용해도 및 가공성이 이의 아세틸화도에 매우 특히 연관되기 때문에, 키틴의 N-아세틸글루코사민 단위의 아미드 결합이 이렇게 동반적으로 가수분해되는 것은 이러한 조건 하에 수행된 효소 가수분해의 뜻밖의 긍정적인 효과이다.

h) 원자 및 관능기의 표면 존재비

정제가 진행됨에 따라, 키틴 표면 상의 원자의 분포가 상대적 산소 함량의 증가 및 상대적 탄소 함량의 감소를 나타낸다 (표 4).

또한, 표면 상의 탄소 원자의 결합이 주로 탄화수소 유형 (C-H, C-C)인 결합에서 알콜 유형 (C-O) 또는 카르보닐 유형 (C=O)의 결합으로 변하는 경향이 있다. 아미드 유형 (N-C=O)의 결합이 또한 감소된다.

그러나, 가장 대표적인 것으로 보이는 것은 알콜 결합/탄화수소 결합 비 (C-O/C-H)이고, 효소로 정제된 키틴의 상황에서, 이러한 비는 0.31 내지 0.56, 더욱 구체적으로는 0.39 내지 0.41에 포함된다.

표 4에서,

- "미가공 큐티클"은 절개에 의해 곤충으로부터 추출된 직후에 분석된, 천연 상태의 큐티클의 키틴을 의미하고;

- "효소로 정제된 키틴 (노보자임)"은 분쇄 + 압착 및 노보자임 37071 효소의 존재 하의 효소 가수분해를 포함하는 방법으로부터 초래된 키틴을 의미하고;

- "효소로 정제된 키틴 (프롤리브)"는 분쇄 + 압착 및 프롤리브 NP 효소의 존재 하의 효소 가수분해를 포함하는 방법으로부터 초래된 키틴을 의미하고;

- "효소로 정제된 키틴"은 분쇄 + 압착 및 프롤리브 효소의 존재 하의 효소 가수분해를 포함하는 방법으로부터 초래된 키틴을 의미하며;

- "순수한 키틴"은 곤충 내의 키틴의 양을 결정하기 위해 사용된 것과 동일한, 화학적 정제에 의해 수득된 키틴을 의미한다.

<표 4>

i) 2-광자 형광 현미경에 의한 큐티클 영상화

구조물 외부의 단백질 과부하를 제거하는 한편, 본 발명에 따른 방법에 의한 효소 경로에 의한 키틴의 부분적 정제는 화학적 정제에 비교하여 키틴 구조물의 단백질 "충전재"를 보존함으로써 전체적 가요성을 유지하는 것을 가능하게 한다 (도 43 참조).

도 43에서 사용된 용어는 상기 섹션 III h)에서 정의된 바와 동일하다.

j) 결정화도

어떤 곤충 또는 효소가 연구되든지, 수득되는 키틴의 결정화도, 즉 결정질 영역 및 비결정질 영역의 비는 0.42 내지 0.61에 포함된다.

일반적으로, 결정성 지수, 즉 피크 높이의 비 (면적의 비가 아님)가 문헌에서 사용된다. 이러한 치수는 실질적인 오류 위험이 있다. 그럼에도 불구하고, 비교 목적을 위해, 샘플의 결정성 지수를 또한 측정하였고, 이는 모든 곤충에 대해 88 내지 95％이고, 심지어 딱정벌레목 및 나비목의 경우는 90％를 초과한다.

실시예 6: 압착 주스로부터 유래되는 단백질 분획의 회수를 이용하는 본 발명에 따른 방법

I. 물질 및 방법

a) 물질

곤충

하기의 곤충을 연구하였다:

- 딱정벌레목 곤충: 테네브리오 몰리토르 (티. 몰리토르 또는 TM).

효소

프롤리브를 가수분해에서 사용하였다.

b) 생산 방법

분쇄 후 압착을 이용하는 생산 방법 (도면에서 "분쇄+압착"으로 표기됨)

여러 뱃치를 하기와 같이 변환시켰다: 600 g의 신선한 티. 몰리토르 유충을 챔버에 도입하고, 증기 (115℃, 5분)로 도살한다. 그 후, 곤충을 혼합기에 도입하고, 곤충 100 g 당 75 mL의 물을 첨가하고, 전체를 혼합하고, 압착한다 (이중-스크류 압착기, 또는 필터 압착기, 또는 기타 압착 시스템).

그 후, 압착 케이크를 70℃에서 하룻밤 동안 건조시킨다. 다른 한편으로, 압착 주스를 3000 g의 중력가속도로 30분 동안 원심분리하고, 고체 부분을 회수한다 - 혈액림프의 불용성 단백질.

그 후, 125 g의 압착 케이크 및 125 g (습윤 중량, 약 30％의 건조 중량)의 불용성 혈액림프 단백질을 응축기 및 자기 교반기가 장착된 3목 플라스크에 도입하고, 1250 mL의 물, 뿐만 아니라 9500 SAPU에 등가인 활성의 단백질분해 효소를 첨가한다. 그 후, 반응을 4시간 동안 45℃로 가열한다. 그 후, 15분 동안 온도를 90℃로 상승시키고, 마지막으로 반응 혼합물을 여과한다 (0.40-0.45 ㎛). 잔류물을 24시간 동안 70℃에서 건조시킨다: 이렇게 하여 이는 효소 경로에 의한 정제에 의해 수득된 키틴이다; 여과액을 동결 건조시킨다: 이렇게 하여 이는 가수분해물이다.

c) 분석

회분 함량 측정, 지질 함량 측정, 아미노산의 상대적 존재비 및 단백질 크기 측정을 실시예 5에서와 같이 수행하였다

II. 수득된 생성물의 특성화

수득된 생성물 (키틴 및 가수분해물)을 분석하고 특성화하였다 (표 5, 도 45).

<표 5>

Claims

건조물의 총 중량을 기초로 적어도 40 중량％의 단백질, 건조물의 총 중량을 기초로 최대 10 중량％의 회분, 및 수용성 단백질의 총 중량을 기초로 50 중량％ 미만의 12,400 g/mol 초과의 수용성 단백질 함량을 포함하는, 곤충으로부터 제조된 가수분해물.
제1항에 있어서, 회분 함량이 4 중량% 미만인 가수분해물.
제1항에 있어서, 95% 초과의 펩신 소화성을 갖는 가수분해물.
하기 단계를 하기 순서로 포함하는, 곤충으로부터 제1항의 가수분해물을 생산하는 방법:
(i) 곤충 큐티클을 분쇄하는 단계,
(ii) 곤충 큐티클을 압착하는 단계, 그 후
(iii) 단백질분해 효소로 곤충 큐티클을 효소 가수분해하는 단계.
제4항에 있어서, 분쇄 단계 전에 곤충을 도살하는 단계를 포함하는 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 효소 가수분해 전에 곤충 큐티클을 산화제로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
a) 곤충을 도살하는 단계,
b) 곤충을 분쇄하는 단계,
c) 곤충을 압착하는 단계,
d) 단백질분해 효소로 곤충 큐티클을 효소 가수분해하는 단계,
e) 가수분해물을 회수하는 단계
를 포함하고, 임의적으로 단계 d) 전에 곤충 큐티클을 산화제로 처리할 수 있는, 곤충으로부터 제1항의 가수분해물을 생산하는 방법.