KR20230112168A - 유산균 발효물을 포함하는 뇌기능 개선용, 뇌 질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유산균 발효물을 포함하는 뇌기능 개선 또는 뇌 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유산균 발효물을 포함하는 조성물을 사용할 경우, 뇌 세포의 분화 및 성숙도를 촉진시킬 수 있다.

Description

유산균 발효물을 포함하는 뇌기능 개선용, 뇌 질환 예방 및 치료용 조성물{Composition Comprising Lactic Acid Bacteria Fermented Product for Improving Brain Function, Preventing or Treating Brain Disease}
본 발명은 유산균 발효물을 포함하는 뇌기능 개선용, 뇌 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
2021년 2월 1일 매일 경제 신문에 따르면, 국내외적으로 유산균을 기본으로 한 기능성 제품에 대한 수요가 늘어나고 있으며, 건강 기능성 프로바이오틱스 원료의 경우 2018년에는 5,424억원, 2019년 7,415억원, 2020년 8,856억원으로 꾸준히 그 수요가 늘어나고 있다. 유산균 건강기능성 제품들의 경우 주로 면역 강화 기능, 장 건강 기능 등에 초점이 맞추어져 있는 반면, 뇌 기능에 관련된 제품들은 출시되지 않은 상태이다.
반면, 최근 국민건강보험공단에서 발간한 건강보험 통계에 따르면, 만성질환 중 고혈압 환자가 약 570만명으로 가장 많았으며, 그 다음으로 신경계질환 환자가 274만 1000명으로 그 뒤를 잇는다. 특히, 신경계질환의 경우, 만성질환 중 전년도 대비 치료 비용이 약 12% 가량 증가하며, 가장 높은 증가율을 보였다. 노령화 사회에 진입함에 따라 신경계질환 중 가장 문제시 되는 것은 바로 퇴행성 뇌신경계질환이며, 그 중 치매가 대표적인 질환이다. 치매환자 수는 지속적으로 증가하고 있으며 2024년에는 치매인구가 약 100만명에 이를 것으로 예상된다. 이에 뇌 기능에 관련된 식품 및 기능성 제품은 꾸준히 연구가 필요한 실정이다.
대한민국 등록공보 제10-1643737호(2016.07.22)
일 양상은 입국에 물을 첨가한 후, 효모균을 접종하는 제 1 담금 단계; 제 1 담금 후, 입국과 물을 덧술하고 발효하는 제 2 담금 단계; 제 2 담금 후, 멥쌀 고두밥과 물을 덧술하고 발효하는 제 3 담금 단계; 제 3 담금 후, 찹쌀 고두밥을 덧술하여 발효하는 제 4 담금 단계; 제 4 담금 후, 여과하고 유산균 및 갈락토올리고당 (GOS)을 첨가하는 유산균 첨가 단계를 포함하는 유산균 발효물 (Microbiome BalanceTM) 제조방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 유산균 발효물 (Microbiome BalanceTM)을 포함하는 뇌기능 개선용 식품 조성물, 및 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 입국에 물을 첨가한 후, 효모균을 접종하는 제 1 담금 단계; 제 1 담금 후, 입국과 물을 덧술하고 발효하는 제 2 담금 단계; 제 2 담금 후, 멥쌀 고두밥과 물을 덧술하고 발효하는 제 3 담금 단계; 제 3 담금 후, 찹쌀 고두밥을 덧술하여 발효하는 제 4 담금 단계; 제 4 담금 후, 여과하고 유산균 및 갈락토올리고당 (GOS)을 첨가하는 유산균 첨가 단계를 포함하는 유산균 발효물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 "입국"은 쌀, 보리, 밀가루를 찐 후 순수 배양한 곰팡이 종국을 접종 또는 배양한 흩임누룩을 의미하는 것이다. 상기 입국은 쌀 누룩의 일종인 발효제이며, 곰팡이가 생성한 유기산은 주모의 잡균 증식을 억제하므로 발효를 안전하게 할 수 있도록 기여한다. 또한, 바로 곰팡이를 배양하므로 발효제인 동시에 원료의 역할을 수행하는 것이다.
본 명세서에서 "덧술"은 술의 품질을 높이기 위해 1차 밑술에 2차로 겹쳐 담가 덧넣는 술밑이나 술밥을 의미하는 것이다. 곡물과 누룩을 물과 혼합하여 한번 술을 담근 후 걸러서 마시는 것을 '밑술'이라 하며, 밀술에 곡물, 물, 및 누룩을 혼합한 것을 한 번 더 넣어 담글 경우를 '덧술'이라 일컫는다.
본 발명의 유산균 발효물은 하기와 같은 방법으로 제조될 수 있다.
제 1 담금 단계는 입국에 물을 첨가한 후, 효모균을 접종하는 단계이다.
상기 입국에 물을 첨가한 후, 효모균을 접종하는 단계에서 물은 입국 1 kg 당 1L 내지 5L, 1L 내지 3L, 또는 1L 내지 2L를 첨가할 수 있으며, 예를 들면 1 내지 1.5L 일 수 있다.
상기 효모균은 사카로마이세스 세레지비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 일 수 있으며, 예를 들면, 사카로마이세스 세레지비지애 (Saccharomyces cerevisiae) KCTC11396P 일 수 있다.
상기 제 1 담금 단계는 1일 내지 10일간 이루어지는 것일 수 있으며, 예를 들면 3일 내지 7일, 4일 내지 6일 일 수 있다.
제 2 담금 단계는 제 1 담금 후, 입국과 물을 덧술하여 발효하는 단계이다. 상기 제 1 단금 후, 입국과 물을 덧술하여 발효하는 단계에서 입국(kg)과 물 (L)의 비율은 1: 1.25 내지 1:2.0 일 수 있으며, 예를 들면, 입국 1 kg 기준으로 물 1.3 L를 투입할 수 있다.
상기 제 2 담금 단계는 15℃ 내지 25℃, 15℃ 내지 18℃에서 이루어지는 것일 수 있으며, 3일 내지 10일, 3일 내지 5일동안 이루어지는 것일 수 있다.
제 3 담금 단계는 제 2 담금 후, 멥쌀 고두밥과 물을 덧술하고 발효하는 단계이다.
상기 멥쌀 고두밥과 물을 덧술하고 발효하는 제 3 담금 단계에서 멥쌀 고두밥 (kg)과 물 (L)의 비율은 1:1 내지 1:1.5 일 수 있으며, 예를 들면, 고두밥 1kg을 기준으로 물 1.2L를 덧술한 것일 수 있다.
제 4 담금 단계는 제 3 담금 후, 찹쌀 고두밥을 덧술하여 발효하는 단계이다.
상기 제 3 담금과 제 4담금 단계는 15℃ 내지 25℃, 15℃ 내지 18℃에서 이루어지는 것일 수 있으며, 3일 내지 10일, 3일 내지 5일동안 이루어지는 것일 수 있다. 상기 3담금 및 4담금의 멥쌀 및 찹쌀의 양은 각각 200 내지 400kg 일 수 있다.
유산균 첨가 단계는 제 4 담금 후, 여과한 후, 유산균 및 갈락토올리고당 (GOS)을 첨가하는 유산균 첨가 단계이다.
상기 유산균 첨가 단계는 제 4 담금 단계 후 여과를 통하여 알코올 농도의 탁주를 제조하는 것일 수 있다. 상기 알코올 농도는 3% 내지 20%, 5% 내지 18%, 또는 5% 내지 15%일 수 있으며, 예를 들면 7% 내지 12%일 수 있다.
상기 여과는 당업계에 알려진 방법, 이의 변형된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 미세 여과, 한외 여과, 중력 여과, 진공 여과, 가압 여과, 압착 여과 등일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 유산균은 생균, 사균 또는 이들의 조합 일 수 있으며, 갈락토올리고당 (GOS)를 더 첨가한 후 후숙성 저온 발효하여 유산균 발효물을 제조하는 것일 수 있다.
상기 갈라토올리고당 (GOS)은 프리바이오틱스로 유산균이 선택적으로 이용함으로써 숙주의 건강을 증진시키는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 유산균은 락토바실러스 가세리 (Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) 구성된 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 락토바실러스 가세리 (Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus)는 1:1:1:1 중량비로 배합한 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 유산균은 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius) 비피도박테리움 애니멀리스 (Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacterium breve) 종으로 구성된 것일 수 있다.
상기 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 비피도박테리움 애니멀리스 (Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacterium breve)는 같은 중량으로 배합한 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 유산균 배합을 발효액을 뇌 오가노이드에 처리하였을 때, 뇌의 초기 및 중후반기 발생에 관련된 신경세포, 성상세포 및 아교세포로의 분화를 촉진시키는 것을 확인하였으며, 상기 유산균 발효물이 독성이 없다는 점을 확인하였다.
상기 갈락토올리고당은 프리바이오틱스 역할로, 유산균의 먹이가 되어 유산균을 성장시키는 역할일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 유산균 첨가 전에 배양물을 멸균하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 비피도박테리움 애니멀리스 (Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacterium breve)를 첨가하기 전 배양물을 멸균하였을 때, 뇌 분화 유도가 더 잘 되는 것을 확인하였다.
다른 양상은 상기 제조방법에 따라 제조된 유산균 발효물을 제공하는 것이다.
상기 유산균 발효물은 1010 CFU/ml 내지 1014 CFU/ml 유산균을 포함하고 있는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 유산균 발효물을 포함하는 뇌기능 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 뇌기능은 대뇌의 기능을 의미하는 것일 수 있으며, 예를 들면, 기억, 집중, 사고, 및 언어 기능을 의미하는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 유산균 배합을 발효액을 뇌 오가노이드에 처리하였을 때, 뇌의 초기 및 중후반기 발생에 관련된 신경세포, 성상세포 및 아교세포로의 분화를 촉진시키므로 뇌 기능을 활성화 시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
상기 개선은 상기 조성물을 투여하여 기억, 집중, 사고 및 언어 등의 기능이 활성화되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하는 것으로, 통상적인 의미로서, 기능성 식품, 영양 보조제, 건강식품 및 식품 첨가제 등의 모든 형태를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 유산균 발효물을 포함할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 상기 식품에는 특수영양식품(예를 들어, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예를 들어, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예를 들어, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예를 들어, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예를 들어, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(예를 들어, 각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예를 들어, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예를 들어, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품은 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체 방어 리듬 조절, 질병 방지와 회복 등에 관한 체내 조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 상기 음료는 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭하는 것으로, 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 아울러, 상기 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 유산균 발효물의 바람직한 함량은 식품 조성물 총 중량에 대하여 식품의 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 90%, 바람직하게는 0.1 내지 50%의 비율로 포함될 수 있다.
다른 양상은 상기 유산균 발효물을 포함하는 뇌 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 뇌 질환은 대뇌의 기능이 감퇴하는 것일 수 있으며, 예를 들면, 기억력, 사고력, 집중력 등이 감퇴되는 퇴행성 뇌 질환 일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 유산균 배합을 발효액을 뇌 오가노이드에 처리하였을 때, 뇌의 초기 및 중후반기 발생에 관련된 신경세포, 성상세포 및 아교세포로의 분화를 촉진시키므로 뇌 기능을 활성화 시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
상기 예방은 상기 조성물을 개체에 투여하여 뇌 질환 발병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물을 개체에 투여하여 뇌 질환 증세가 호전되도록 하거나, 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 등 환자를 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 유산균 발효물을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에서, "약학적으로 허용되는"은 생리학적으로 허용되고, 인간에게 투여될 때 활성성분의 작용을 저해하지 않으며, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 의미한다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들어, 경구 투여 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있으며, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있다. 상기 담체에는 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있으며, 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 이외의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있으며, 이는 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여 방법으로는 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다. 경구 투여용 제제의 경우에는 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose) 또는 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있으며, 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01 ㎍ 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ㎍ 내지 500 mg일 수 있다. 다만, 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 질환에 대한 예방 또는 치료의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명에 따른 유산균 발효물 및 이를 포함하는 조성물을 사용할 경우, 뇌 세포의 분화 및 성숙도를 촉진시킬 수 있다.
도 1은 유산균 조합별(S1 내지 S7)로 발효액에 유산균을 첨가하고 배양하는 기간의 유산균 수를 확인한 데이터이다.
도 2는 대뇌 오가노이드를 제작하여 인간의 뇌와 같이 유전자 및 세포가 발현되었는지 확인하기 위하여, 성숙한 신경세포에 나타나는 마커인 MAP2와 신경줄기세포인 Sox2 positive cell을 확인한 데이터이다.
도 3A는 대뇌 오가노이드를 제작하여 인간의 뇌와 같이 유전자 및 세포가 발현되었는지 확인하기 위하여, 교세포인 성상세포에 나타나는 마커인 GFAP를 확인한 데이터이며, 3B는 GFAP 및 ClCas3의 발현 비율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 유산균 발효물(S1 내지 S7)을 4%, 10%, 20% 농도로 대뇌 오가노이드에 처리하였을 때 세포의 형태를 확인하므로 유산균 발효물의 독성을 확인한 데이터이다.
도 5는 유산균 발효물(S1 내지 S7)을 20% 농도로 처리하였을 때 뇌의 신경세포 분화 및 성숙 신경세포 분화 마커인 TUJI, NeuroD1, CAD67, GABAergic neuron 마커인 DLX1 및 DLX2, 성상세포 마커인 GFAP와 S100β의 발현과 아교세포의 마커인 MBP 발현레벨을 확인한 데이터이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 입국 제조
쌀 360kg을 3시간 이상 침미하고, 2~2.5 기압, 100℃에서 스팀하여 1시간 30분간 증미 (약증 40분, 강증 50분)한 후, 냉각기를 이용하여 40℃까지 냉각하였다. 냉각 후 50g씩 15개로 파종하여, 1시간 정도 회전하면서 혼합하였다. 혼합한 한 후, 12시간 동안 36~38℃에서 보쌈하고, 38℃를 넘지 않는 온도 에서 회전하면서 덩어리를 풀어주면서 분쇄하였다. 분쇄 후, 분사수 온도가 34℃가 되도록 식혀 입상하고, 출국하였다. 냉각 및 건조를 2시간 동안하고, 비닐봉투에 포장하여 냉장 보관하였다.
실시예 2: 발효액 제조
사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) KCTC11396P을 Potato Dextrose Broth 1L (gluecose 20g/L, potato extract 5g/L)에 접종하여 30℃에서 16시간 진탕 배양하였다. 배양한 사카로마이세스는 상기 제작한 입국 10kg에 물을 15L 가수한 1차 담금조에 접종한 후, 5일동안 발효시켜 1단 담금을 하였다. 1단 담금 후, 입국 140kg과 물 175L를 덧술하고 20℃에서 3일간 발효하므로 2단 담금을 하였다. 2단 담금 후, 멥쌀 고두밥 260kg과 물 260L를 덧술하고 20℃에서 6일간 발효하므로 3단 담금을 하였다. 3단 담금 후 찹쌀 고두밥 200kg을 덧술하고 15℃에서 7일간 발효하므로 4단 담금을 하고 여과하여 알코올 7~12% 함량의 발효액을 제조하였다.
실시예 3: 프리/파라/포스트바이오틱스 기능성 물질 분리
상기 실시예 1에서 제조한 발효액에 다양한 생균 또는 사균 형태의 유산균과 갈락토올리고당(GOS)를 첨가하여 표 1과 같이 발효액과 유산균을 조합하였다. 하기 표 1의 유산균의 구입처 및 농도는 하기 표 2와 같다.
구분 조합 및 비율 비고
S1 발효액 750ml + Lactobacillus gasseri 1g + Lactobacillus plantarum 1g + Lactobacillus casei 1g + Lactobacillus acidophilus 1g + GOS 7.5g 프로바이오틱스 + 프리바이오틱스
S2 발효액 750ml+ Bifidobacterium lactis bifidus 1g + Bifidobacterium breve bifidus 1g + GOS 7.5g 프로바이오틱스 +프리바이오틱스
S3 발효액 750ml + Lactobacillus sakei (생균) 1g + Lactobacillus sakei(사균) 1g + GOS 7.5g 파라바이오틱스
S4 발효액 750ml 대조군
S5 발효액 750ml + GOS 7.5g 프리바이오틱스
S6 발효액 750ml + Lactobacillus rhamnosus 1g+ Lactobacillus casei 1g + Lactobacillus plantarum 1g + Lactobacillus acidophilus 1g + Lactobacillus fermentum 1g + Lactobacillus salivarius 1g + Bifidobacterium animalis 1g + Bifidobacterium longum 1g + Bifidobacterium breve 1g + GOS 7.5g 프로바이오틱스
+ 프리바이오틱스
S7 멸균 발효액 750ml + Lactobacillus rhamnosus 1g + Lactobacillus casei 1g + Lactobacillus plantarum 1g + Lactobacillus acidophilus 1g + Lactobacillus fermentum 1g + Lactobacillus salivarius 1g + Bifidobacterium animalis 1g + Bifidobacterium longum 1g + Bifidobacterium breve 1g + GOS 7.5g 프로바이오틱스 + 프리바이오틱스
구분 균주 CFU/g Source
S1 Lactobacillus gaseri 1.0 x 1011 ㈜쎌바이오텍
Lactobacillus plantarum 3.0 x 1011
Lactobacillus casei 1.0 x 1011
Lactobacillus acidophilus 3.0 x 1011
S2 Bifidobacterium lactis bifidus 1.0 x 1011
㈜쎌바이오텍
Bifidobacterium breve bifidus 1.0 x 1011
S3 Lactobacillus sakei(생균체) 3.4 x 1011
㈜프로바이오닉스
Lactobacillus sakei(사균체) 1.0 x 1012
S6-S7 Lactobacillus lactis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve 2.0 x 1011 척척바이오랩(주)
유산균을 첨가한 물질들은 10℃에서 후숙성 저온 발효함으로서 프리/파라/포스트 바이오틱스 혼합물을 수득하였다. 그 후, 프리/파라/포스트 바이오틱스 혼합물의 총유산균의 변화를 관찰하기 위하여 발효액을 3일 간격으로 10배 연속 희석 배양법에 따라 최종 희석액 1ml 샘플을 유산균 확인용 Petrifilm (Lactic Acid Bacteria Count Plate, 3M)에 접종한 후 30℃에서 48시간 배양하였다. 48시간 배양 완료 후 균주의 콜로니 (Colony)를 계수하여 도 1과 같이 나타내었다.
도 1에서 보이는 바와 같이, S1, S3, S6, 및 S7이 다른 S2, S4 (C, control) 및 S5 대비 현저히 높은 양으로 유산균이 성장하는 것을 확인하였다.
실험예 1. 3D 대뇌 오가노이드 제작
프리/파라/포스트바이오틱스의 뇌기능 효능 평가를 위하여, 줄기세포주를 활용하여 3D 대뇌 생체 모델 시스템을 제작하였다. 대뇌 오가노이드를 확립하였고, 실제 인간의 뇌와 같이 정상적인 신경발생 (neurogenesis)과 신경교발생 (gliogenesis)이 이뤄지는 것을 확인하였다.
도 2에서 보이는 바와 같이, 성숙한 신경세포에 나타나는 마커인 MAP2 positive cell의 수가 오가노이드 배양 60일째부터 급격히 증가하였고, 180일까지 그 발현이 지속적으로 증가하였다. 반면, 신경줄기세포인 Sox2 positive cell들은 초기 오가노이드 20일 내지 30일에서는 90%이상 존재하다가 60일이 지나면서 급격히 감소하여 100일 내지 180일에서는 뇌 오가노이드에서 발현 확인이 어려웠다.
도 3에서 보이는 바와 같이, 줄기세포를 기반으로 한 3D 대뇌 오가노이드 시스템을 성공적으로 구축했고, 인간의 뇌와 마찬가지로 뉴런 (neuron) 세포를 지지하는 교세포인 성상세포 (astrocyte)로의 분화가 정상적으로 이뤄지고 있음을 바이오마커인 GFAP의 면역염색법을 통하여 확인하였다.
따라서 이와 같이 대뇌 오가노이드가 인간 뇌와 같은 역할을 할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 오가노이드에 프리/파라/포스트바이오틱스 혼합물 처리 효능
세포독성을 나타내는 물질을 3D 대뇌 오가노이드에 처리한 후 배양시 오가노이드가 깨어지거나 괴사되는 것과 같은 세포 독성을 형태학적으로 관찰할 수 있으므로, 프리/파라/포스트바이오틱스 혼합물을 volume/volume 농도로 3D 대뇌 오가노이드에 처리하여 보았다.
도 4에서 보이는 바와 같이, 4%, 10%, 및 20% 농도로 처리한 모든 그룹에서 형태학적인 변화가 없음을 확인하였다. 따라서 모든 프리/파라/포스트바이오틱스 혼합물이 어떠한 독성도 가지지 않음을 확인하였다.
실시예 5. 3D 대뇌 오가노이드에 프리/파라/포스트바이오틱스 혼합물 처리에 따른 분화 유도 효능 확인
혼합물을 20%로 처리한 3D 대뇌 오가노이드에서 혼합물을 처리 후 오가노이드 분화율을 qPCR 분석을 통하여 분석하였다. 신경세포 분화율로는 초기 신경세포 분화 및 성숙 신경세포 분화 마커인 TUJI, NeuroD1, CAD67을 확인하였고, GABAergic neuron 마커인 DLX1 및 DLX2를 확인하였다. 또한, 뉴런이 지지하는 세포들인 성상세포 (astrocyte)와 아교세포 (Oligodendrocyte)들의 분화는 뇌 발생의 성숙도와 관련이 있고, 뇌 발생 중 후반기에 이루어지므로, 성상세포 마커인 GFAP와 S100β의 발현과 아교세포의 마커인 MBP 발현레벨을 확인하였다.
도 5에서 보이는 바와 같이, 초기 신경세포 분화 및 성숙 신경세포 분화 마커인 TUJI, NeuroD1, CAD67에서 S1은 2배, 3.8배, 3.8배 증가하였고, S2는 3.1배, 7배, 7배 증가하였고, S7은 2.8배, 5.7배, 4.7배 증가하였다. 또한, GABAergic neuron 마커인 DLX1의 발현은 S7에서만 약 570배가 증가하였고, DLX2는 S1에서 6배, S3에서 약 3배, S5와 S6에서는 약 5배, 그리고 S7에서는 3.8배가 증가된 것을 확인하였다.
또한, 도 5에서 보이는 바와 같이, GFAP 발현은 S1에서 9배, S2에서 11.5배, S7에서는 11배 발현이 증가하였으며, S100β 발현은 S1에서 6배, S2에서 4.6배, S7에서는 3배 발현이 증가하였다. MBP 발현은 S2에서 6배, S7에서는 6.1배 증가하였다.
따라서, 뇌의 초기 및 중후반기 발생에 관련된 신경세포, 성상세포, 및 아교세포로의 분화를 공통적으로 증가시키는 혼합물을 S1, S2, 및 S7이라는 점을 확인하였고, 이 결과는 높은 유산균 성장률을 확인하였던 S1, S6, 및 S7에서 S1과 S7이 유산균 성장률도 높고, 뇌 세포의 분화 및 성숙도를 촉진시킨다는 점을 알 수 있다. 그러므로, 높은 유산균 성장률을 가지는 S1 및 S7의 제조법을 통해 형성된 혼합물이 3D 대뇌 피질 오가노이드 시스템에서 뇌 세포의 분화 및 성숙도를 촉진시키는 유효 물질이고, 뇌세포의 분화시키는 촉진시켜 뇌기능 향상에 도움이 될 수 있는 최적의 물질임을 확인하였다.

Claims (7)

  1. 입국에 물을 첨가한 후, 효모균을 접종하는 제 1 담금 단계;
    제 1 담금 후, 입국과 물을 덧술하고 발효하는 제 2 담금 단계;
    제 2 담금 후, 멥쌀 고두밥과 물을 덧술하고 발효하는 제 3 담금 단계;
    제 3 담금 후, 찹쌀 고두밥을 덧술하여 발효하는 제 4 담금 단계;
    제 4 담금 후, 여과하고 유산균 및 갈락토올리고당 (GOS)을 첨가하는 유산균 첨가 단계를 포함하는 유산균 발효물 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스 가세리 (Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) 구성된 것인,
    유산균 발효물 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 락토바실러스 가세리 (Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus)는 1:1:1:1 중량비로 배합한 것인,
    유산균 발효물 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius) 비피도박테리움 애니멀리스 (Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacterium breve)으로 구성된 것인,
    유산균 발효물 제조방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따라 제조된 유산균 발효물.
  6. 제 5항의 유산균 발효물을 포함하는 뇌기능 개선용 식품 조성물.
  7. 제 5항의 유산균 발효물을 포함하는 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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