KR20230100252A - 신규한 화합물을 포함하는 생리 식염수 - Google Patents

Abstract

본 발명은 N,N,N-트리메틸 키토산을 포함함으로써, 항균 또는 지혈효과가 우수함은 물론이고, 유착방지 효과 또한 우수한 이점이 있는 생리 식염수에 관한 것이다.

Description

신규한 화합물을 포함하는 생리 식염수{PHYSIOLOGICAL SALINE CONTAINING THE NOVEL COMPOUND}

본 발명은 신규한 화합물을 포함하는 생리 식염수에 관한 것이다.

생리 식염수는 인간의 체액을 0.9% NaCl용액으로 생각하여 이와 농도를 유사하게 조정하여 제조한 등장액을 의미하는 것으로, 일반 물과 달리 혈관 내에 직접 투입되어도 삼투압의 변화를 일으키지 않으며, 수술 및 상처 처치 시 수술부위 또는 상처부위의 소독, 세척 등을 위해 주로 사용된다. 이와 같이, 수술이나 상처 부위의 소독 또는 세척 등에 사용되는 경우 상처 부위의 감염을 막기 위해 생리 식염수 내에 항생제 또는 계면활성제가 포함되는 것이 필수 요소로 여겨져 왔다.

하지만 최근 항생제 내성균의 증가로 인한 문제가 지속적으로 제기되고 있으며, 항생제 또는 계면활성제를 포함하지 않는 생리 식염수에 대한 연구가 필요한 실정이다.

이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-0785441호에는 항균 작용이 있는 해양 심층수 원수의 역삼투압법에 의한 농축수, 역삼투압법에 의한 여과수, 전기 투석법에 의한 농축수, 전기 투석법에 의한 여과수 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 해양 심층수에 대하여 개시되어 있다.

이와 같이 항생제를 대체하기 위한 물질로서 주목받고 있는 물질들 중 하나인 키토산은 생분해성, 비독성, 항균성이 우수한 장점이 있으며, 최근 연구를 통해 살균 및 상처회복에 효과가 있다는 사실이 밝혀지고 있고, 실제로 이와 같은 효과를 이용한 창상회복제 종류의 제품 출시 또한 증가하고 있는 실정이다.

하지만, 일반적인 키토산의 경우 산성 환경에서 녹는 성질이 있어, 이를 사용하기 위해 산성 물질에 용해시켜 사용하게 되는데, 이 때 상기 산성 물질을 인체에 그대로 적용하게 될 경우 알레르기 반응을 유발할 수 있기 때문에 인체에 사용하기에 적합하지 않은 문제가 있다.

공개특허 제10-0785441호(2007.12.06)

상기와 같은 문제를 해결하기 위해 본 발명은 N,N,N-트리메틸 키토산을 포함함으로써, 항균 또는 지혈효과가 우수함은 물론이고, 유착방지 효과가 우수한 생리 식염수를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명의 생리 식염수는 N,N,N-트리메틸 키토산을 포함하는 것을 그 특징으로 한다.

본 발명의 생리 식염수는 N,N,N-트리메틸 키토산을 포함함으로써, 항균 또는 지혈효과가 우수하고, 유착방지 또한 효과가 우수하여 수술이나 상처부위의 감염 또는 유착을 효과적으로 방지할 수 있으며, 이에 따라 회복성이 우수한 이점이 있다.

도 1은 본 발명의 제조예에서 제조한 N,N,N-트리메틸 키토산의 ¹H-NMR 데이터이다.
도 2는 본 발명의 실험예 1의 그람 양/음성균에 대한 살균력 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 실험예 2의 지혈기능 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 3의 (a)는 실험예 2의 진행과정에 대한 모식도 및 펀칭 전/후의 이미지이며, (b)는 실험예 2에서 비교예 및 실시예 2 각각의 생리 식염수 처리에 따른 출혈 시간 및 출혈량 결과를 나타낸 도이고, (c)는 실험예 2에서 비교예 및 실시예 1 각각의 생리 식염수 처리에 따른 시간 별 출혈량을 보여주는 여과지 이미지이다.
도 4 및 5는 본 발명의 실험예 3의 상처 회복 기능 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 4의 (a)는 각 기간별 상처 회복 정도를 확인한 결과이며, (b)는 각 기간별 상처 회복 정도에 따른 상처 영역을 도식화한 것이고, (c)는 각 기간별 상처회복 정도 확인을 위한 상처 부위 주변 세포를 확인한 결과이다.
도 5는 각 기간별 세포 염색을 실시한 결과이다.
도 6은 본 발명의 실험예 4의 유착 방지 기능 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 6의 (a)는 마우스의 복막에 스크래치를 만드는 과정 및 상기 복막에 비교예 및 실시예 2를 투입하는 과정 중 일 장면을 나타낸 것이며, (b)는 비교예 및 실시예 2의 생리 식염수 투여 후 유착 정도를 점수화하여 상기 점수화된 결과의 퍼센트(%)를 그래프화 한 결과이고, (c)는 비교예 및 실시예 2의 생리 식염수 투여 후 유착 정도를 점수화한 결과이며, (d)는 유착 정도 평가를 위한 영상 촬영 중 유착 부분을 확인한 결과이다.

본 발명에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 한 양태는 N,N,N-트리메틸 키토산을 포함함으로써, 항균 또는 지혈효과가 우수함은 물론이고 유착방지 효과 또한 우수하여 상처 회복성이 현저히 향상되는 생리 식염수이다.

본 발명에서 생리 식염수란 기본적으로 항생제 또는 계면활성제 등의 별도의 첨가물이 포함되지 않은 상태의 것을 의미하며, 인체와 등장이 되도록 조정된 무기염 용액을 의미하고 또한 완충 기능을 갖고 있을 수도 있다. 본 발명에서 생리 식염수의 종류를 특별히 한정하는 것은 아니나, 염화 나트륨을 0.9w/v% 함유하는 식염수, 인산 완충 식염수 또는 트리스 완충 식염수 등을 들 수 있다.

상기 N,N,N-트리메틸 키토산은 천연 고분자인 키토산에 3차례의 N-메틸레이션을 통해 제조한 양전하 키토산으로, 종래 키토산 자체가 이미 양전하성 고분자로 널리 알려져 있으나, 3차례의 N-메틸레이션을 통한 4차아민 양전하를 통해 수술 또는 상처 부위의 살균효과가 우수하고, 지혈 효과 또한 보다 우수한 이점이 있다. 또한, 일반적인 키토산의 경우 산성 환경에서 녹는 성질이 있어, 인체에 적용하기 위해서는 산성 물질에 용해시켜 사용하게 되는데, 이 때 상기 산성 물질을 인체에 적용하게 되면 알레르기 반응 등을 일으킬 우려가 있어 인체에 적용하기 어려운 문제가 있었으나, 본 발명의 생리 식염수는 상기 키토산에 3차례의 N-메틸레이션을 거침으로써 중성 물질에 용해가 가능하고, 이를 통해 인체에 적용 가능한 이점이 있다.

또한, 상기 생리 식염수는 N,N,N-트리메틸 키토산을 포함함으로써, 별도의 항생제 또는 계면활성제를 포함하지 않더라도, 항균 또는 살균 효과가 우수하여, 항생제 등에 따른 부작용(예를 들면, 항생제 내성) 등의 문제를 방지할 수 있으며, 지혈 효과가 우수하고, 비용적인 측면에서도 보다 효율적인 이점이 있다. 특히, 일반적으로 수술 후 유착방지를 위해 염증 발생을 억제하는 항염제를 별도로 사용하거나, 물리적 장벽을 만드는 방법을 사용하고 있으나, 상기 N,N,N-트리메틸 키토산의 경우 항염 효과가 우수하여 별도의 항염제를 추가로 사용하지 않더라도 항염 효과가 우수할 뿐만 아니라, 체내 분해 시간이 길어 유착방지를 위한 장벽의 기능 또한 수행함으로써 유착 방지 효과가 우수한 이점이 있다.

본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 N,N,N-트리메틸 키토산은 영구적 양전하 상태일 수 있는데, 이는 상기 키토산에 3차례의 N-메틸레이션을 진행함으로써 이루어질 수 있는 결과로서, 상기 N,N,N-트리메틸 키토산이 영구적 양전하의 상태일 경우, 상처 부위에 적용 시 음전하의 활성 혈소판을 정전기적 인력에 의해 끌어당김으로써 상처 부위 주변에 활성 혈소판을 응집시킬 수 있으며, 이를 통해 지혈 효과가 보다 향상될 수 있는 이점이 있다.

본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 상기 생리 식염수는 체내 또는 체외 도포용일 수 있다. 이와 같이, 상기 생리 식염수가 체내 또는 체외 도포용으로 사용되는 경우, 체내 또는 체외의 상처부위의 살균작용을 통해 감염을 효과적으로 방지할 수 있으며, 우수한 지혈효과를 통해 상처 회복력이 보다 향상될 수 있는 이점이 있다.

본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 상기 N,N,N-트리메틸 키토산의 함량은 생리 식염수 100중량부를 기준으로 2 내지 20중량부 일 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 20중량부일 수 있다. 상기 N,N,N-트리메틸 키토산의 함량이 상기 범위 미만인 경우 항균, 지혈 또는 유착방지 효과가 저하될 수 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우 생리 식염수에 대한 용해도가 저하될 수 있으며, 상기 생리 식염수의 점성이 증가하는 문제가 발생할 수 있다.

본 발명이 일 실시형태에 따르면 상기 생리 식염수는 본 발명의 효과를 저해하지 않는 범위 내에서 사용자의 필요에 따라 항생제 또는 계면활성제를 더 포함할 수도 있다.

상기 항생제란 통상적으로 항미생물제를 총칭하는 것으로, 특히 세균에 대한 항균작용을 하는 물질, 구체적으로는 세균이 세포벽이나 단백질 등을 합성하는 시스템을 저해시킴으로써 항균작용을 하는 물질 또는 이러한 물질로부터 제조된 것을 의미할 수 있다. 이 때 사용될 수 있는 항생제의 종류는 사용자의 필요에 따라 적절히 선택될 수 있는 것으로 본 발명에서 그 종류를 특별히 한정하지는 않으나, 일 예를 들면, 페니실린 또는 메티실린 등을 들 수 있다.

상기 계면활성제는 당 업계에서 사용되는 것을 특별한 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 구체적인 종류는 사용자의 필요에 따라 적절히 선택될 수 있는 것이므로, 본 발명에서는 이를 특별히 한정하지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당 업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다. 이하의 실시예 및 비교예에서 함량을 나타내는 "%" 및 "부"는 특별히 언급하지 않는 한 중량 기준이다.

제조예: N,N,N-트리메틸 키토산을 포함하는 분말 조성물의 제조

키토산(10% w/v)과 요오드 나트륨(20% w/v)을 NaOH(15% w/v) 수용액에 녹였다. 그 후 메틸요오드(1:8)와 1-메틸-2-피롤리딘(1:6) 용액을 각 비율로 넣고 60℃ 수조에서 90분간 섞었다. 그후 에탄올을 첨가하고 4℃, 100,000x g로 30분간 원심분리하였다. 원심분리 후 침전된 N-메틸키토산 요오드를 모은 후 60℃로 가열하여 에탄올을 제거하였다. N-메틸키토산 요오드에 요오드 나트륨과 NaOH 수용액(15% v/v), 메틸요오드를 넣고 60℃에서 60분간 섞었다. 섞어주는 동안 요오드를 치환하기 위해 NaCl 수용액(10% v/v)을 넣었다. 그 후 에탄올을 첨가하고 4℃ 10,000x g로 30분간 원심분리하였다. 침전된 N,N-디메틸키토산(DMC)을 모았다. 그 후 드라이 오븐에서 에탄올을 제거하였다. 상기 DMC를 요오드 나트륨과 NaOH 수용액(15% v/v), 메틸 요오드를 넣고 60℃에서 60분간 섞었다. 섞어주는 동안 요오드를 치환하기 위해 NaCl 용액 (10% v/v)을 넣었다. 그 후 에탄올을 첨가하고 4℃ 10,000x g로 30분간 원심분리하였다. 침전된 N,N,N-트리메틸키토산(TMC)을 모은다. 그 후 동결 건조를 진행하여 분말을 얻었다.

이와 같이 얻어진 N,N,N-트리메틸키토산의 합성 여부를 확인하기 위하여, ¹H NMR 분석을 수행하였다. 분석기기는 Bruker 사의 AVANCE 600(600MHz)를 사용하였으며, 용매는 중수(Deuterium Oxide)를 사용하였다. 샘플은 약 2.9%(0.02g/0.7ml) 농도로 사용하였다. 측정한 결과를 도 1에 나타내었다. 질소에 부착된 3개의 메틸기를 확인하여 N,N,N-트리메틸키토산이 원활하게 합성되었음을 확인할 수 있었다.(도 1 참조)

실시예

실시예 1(TMC-5%)

0.9% NaCl 생리 식염수에 상기 제조예의 N,N,N-트리메틸키토산 분말 조성물의 농도가 5중량%가 되도록 투입하여 용해시킴으로써, 실시예 1을 제조하였다.

실시예 2(TMC-10%)

0.9% NaCl 생리 식염수에 상기 제조예의 N,N,N-트리메틸키토산 분말 조성물의 농도가 10중량%가 되도록 투입하여 용해시킴으로써, 실시예 1을 제조하였다.

실시예 3(TMC-20%)

0.9% NaCl 생리 식염수에 상기 제조예의 N,N,N-트리메틸키토산 분말 조성물의 농도가 20중량%가 되도록 투입하여 용해시킴으로써, 실시예 1을 제조하였다.

실험예 1: 그람 양/음성균에 대한 살균력 평가

박테리아 성장 억제 및 살균 효과를 측정하기 위해 균주 확산 억제 실험(Inhibition zone assay)를 수행하였다. 이 때, 사용된 균주는 그람 양성균에서 methicillin sensitive Staphylococcus aureus(MSSA, KCCM :40881, ATCC 29213)를, 그람 음성균에서는 Escherichia coli(E. coli, KCCM 11234)를 사용하였다. 50ml LB 배지(Luria-bertani broth, LB broth)에 0.5g 아가로스를 넣고 전자렌지를 이용하여 녹인 후 60℃이하가 되었을 때, 상기 그람 양성균 또는 그람 음성균 각각을 상기 LB 배지 각각에 흡광도(OD₆₀₀)값이 0.01이 되도록 희석한 균 400ul를 상기 LB배지에 넣은 후, 이와 같이 균을 포함하는 LB배지를 페트리 디쉬에 8ml씩 넣고 응고시켰다. 그 후 약 2mm의 구멍을 뚫고 상기 실시예 1 내지 3에서 제조된 각각의 생리 식염수와 비교예(대조군)으로서, N,N,N-트리메틸키토산 분말을 넣지 않은 0.9% NaCl의 생리 식염수를 상기 구멍에 4 ul씩 처리 후 37℃에서 24h 배양하였다. 배양 후 클리어 존을 확인하기 위해 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 용액을 30분간 처리 후 결과를 확인하였으며, 이를 도 2에 기재하였다. 이 때, 도 2에서 CTRL은 비교예, TMC-5%는 실시예 1, TMC-10%는 실시예 2, TMC-20%는 실시예 3의 생리 식염수를 의미한다.

도 2를 참고하면, 본 발명의 실시예 1 내지 3이 그람 양성 및 음성균 모두에서 그 저항성이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 지혈기능 평가

마취된 BALB/c 마우스를 바늘을 이용해 스티로폼 보드에 고정시켜 약 45도로 기울였다. 상기 쥐의 복부를 절개한 후 간 좌측 측엽을 노출시켰다. 그리고 상처 부위에 후에 설치할 여과지 이외의 혈액 흡수를 막기 위해 파라필름 5 × 5 cm²를 간엽 아래에 두었다. 상처는 3mm 생검 펀치를 이용해 로브 중간에 생성시켰다. 자유출혈을 5초간 허용하였으며, 출혈이 진행되는 동안 상기 실시예 2에서 제조된 생리 식염수와 비교예(대조군)으로서, N,N,N-트리메틸키토산 분말을 넣지 않은 0.9% NaCl의 생리 식염수 각각을 50μl씩 왼쪽 간엽에 바르고 간 아래에 여과지를 두었다. 60초마다 여과지를 교체하고 교체 즉시 젖은 여과지의 무게를 재어 총 출혈량과 응고 시간을 파악하였다. 이 때, 도 3에서 TMC 및 TMC-10은 상기 실시예 2의 생리 식염수를 의미하고, CTRL은 상기 비교예의 생리 식염수를 의미한다. 구체적으로, 상기 도3의 (a)는 본 실험 과정의 모식도 및 상처 펀칭 전/후의 이미지이며, (b)는 펀칭 이후 지혈이 완료된 최종 시간 및 상기 자유출혈 5초 이후 출혈이 진행되는 동안 1분 간격으로 교체한 여과지들의 총합에 대한 평균값을 나타낸 도이다. 도 3의 (c)는 각 시간별(1분, 2분 및 3분) 교체된 여과지의 이미지이다.

도 3을 참고하면, 본 발명의 실시예 2를 사용하는 경우 비교예보다 지혈 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 상처회복 기능 평가

비교예 및 실시예 2의 생리 식염수에 대한 실험을 위하여 BALB/c 마우스를 무작위로 선택하고, 3일, 7일 14일 경과 관찰을 진행하였다. 구체적으로, 상기 선택된 쥐들에 창상유도를 위해 시험 전날 각각의 쥐의 등 쪽 털을 제모크림과 면도기를 이용하여 제거하였다. 상기 쥐들의 빠른 마취 유도와 회복을 위해 이소플루란을 사용하여 호흡마취를 진행하였으며, 창상 유도 전 피부 표면을 70%(v/v) 에탄올로 소독하였다. 등쪽 피부를 척추를 기준으로 접은후 4mm 생검 펀치로 절개 창상을 유도하였다. 6㎜ 구멍이 뚫린 실리콘 링(두께 0.5㎜)을 접착제(독일 록타이트, 헨켈)를 이용해 상기 유도된 창상 부분에 부착한 후 봉합으로 추가로 고정함으로써 수축에 의한 창상 회복을 방지하였다. 이와 같이 유도된 창상 부분에 상기 실시예 2 및 비교예(대조군)으로서, N,N,N-트리메틸키토산 분말을 넣지 않은 0.9% NaCl의 생리 식염수 각각을 마우스의 서로 다른 창상 부위에 50 ul씩 발라주는 방식으로 치료를 진행하였으며, 치료를 진행한 후, 상처는 테가덤(6 × 7cm, 3M)을 이용해 꼼꼼히 감쌌고, 상기 마우스들의 움직임을 제한하지 않도록 하면서 탄력밴드로 더욱 고정했다. 이와 같은 치료는 1일 1회의 과정으로, 3일 동안 총 3회 실시하였으며, 그 경과를 3일, 7일, 14일째에 확인하였다. 이 때, 경과를 확인하기 위한 창상 부위의 시료 채취시에는 CO₂를 흡입시킴으로써 마우스들을 희생시킨 후 시료를 채취하였고, 관찰 결과를 도 4 및 도 5에 기재하였다. 이 때, 도 4 및 도 5에서 CTRL은 비교예, TMC는 실시예 1의 생리 식염수를 의미하며, D3, D7 및 D14는 각각 3일, 7일, 14일 경과 후를 의미한다. 구체적으로, 도 4의 (a)는 각 기간별 상처 회복 정도를 확인한 결과이며, (b)는 각 기간별 상처 회복 정도에 따른 상처 영역을 도식화한 것으로써, 이 때 상기 상처 영역에 대한 값은 하기 수학식 1로 계산하였다. 도 4의 (c)는 각 기간별 상처 회복 정도 확인을 위한 상처 부위 주변 세포를 확인한 결과이며, 이 때 세포 확인은 BX53 현미경(OLYMPUS사 제)을 이용하였다. 도 5는 각 기간별 세포 상태를 확인하기 위해 Masson's trichrome stain법을 적용하여 세포 염색을 실시한 결과이다.

[수학식 1]

[(초기 상처 면적 - 잔존하는 상처 면적) / 초기 상처 면적] × 100

도 4 및 도 5를 참고하면, 본 발명의 실시예 2를 사용하는 경우 비교예보다 상처부위의 회복력이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4: 유착 방지 기능 평가

BALB/c 마우스 복부를 절개한 후, 왼쪽 복막에 수술용 칼을 이용하여 3회 긁어 스크래치를 만들었다. 이와 같이 스크래치를 만든 복막 부위에 동일한 용량의 용액(실시예 2의 생리 식염수, 비교예로서 N,N,N-트리메틸키토산 분말을 넣지 않은 0.9% NaCl의 생리 식염수 및 타우로리딘(taurolidine, TAU))을 각각 50 ul씩 투여하고 절개 부위를 봉합하였다. 처치 7일 후 복강 내 복막 유착 평가를 위해 영상 녹화를 하고 유착 분리 난이도를 6명의 실험자 각각이 점수화 하여 평가하였으며, 유착 없음이 0점, 날카로운 도구를 이용하여 분리가 필요한 심각한 유착을 3점으로 하여 블라인드 평가를 진행하였고, 그 결과를 도 6에 기재하였다. 구체적으로, 도 6의 (a)는 마우스의 복막에 스크래치를 만드는 과정이며, (b)는 상기 스크래치가 생긴 복막에 비교예 및 실시예 2의 생리 식염수를 투여하는 모습이다. 도 6의 (c)는 비교예 및 실시예 2의 생리 식염수 투여 후 유착 정도를 점수화하여 상기 점수화된 결과의 퍼센트(%)를 그래프한 결과이다. 이 때, 상기 (c)에서 None은 0점, Few는 1점, Moderate는 2점, Severe는 3점을 의미하며, 본 발명의 실시예 2의 생리 식염수를 사용한 TMC의 경우, 전체 6명(100%)의 실험자 중 3명(50%)의 실험자가 유착이 전혀 발생하지 않음(None - 0점)으로 평가하였다. (d)는 유착 정도 평가를 위한 촬영 중 유착이 일어난 부분을 확인하여 표시한 것이다.

도 6을 참고하면, 본 발명의 실시예 2의 생리 식염수를 사용하는 경우 비교예보다 유착방지 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

Claims (4)

1. N,N,N-트리메틸 키토산을 포함하는 생리 식염수.
2. 제1항에 있어서,
   상기 N,N,N-트리메틸 키토산의 함량은 생리 식염수 100중량부를 기준으로 2내지 20중량부인 것을 특징으로 하는 생리 식염수.
3. 제1항에 있어서,
   상기 N,N,N-트리메틸 키토산은 영구적 양전하 상태인 것을 특징으로 하는 생리 식염수.
4. 제1항에 있어서,
   상기 생리 식염수는 체내 또는 체외 도포용인 것을 특징으로 하는 생리 식염수.
   

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