JP2019521121A - 抗菌性組成物およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

グラム陽性およびグラム陰性菌の広いスペクトルを処理するために使用することができる組成物であって、該菌は非制限的にバイオフィルムの形のものを含み、繊毛を含む領域、たとえば鼻腔穴および中耳／内耳の中で使用でき、繊毛消失がないかあるいはごく最小である組成物。そのようなターゲットとされた処理領域はバイオフィルムを含み、組成物は影響を受けた組織からバイオフィルムを取り除くこと、および分離することを支援することができる。組成物の多くの実施態様が生物学的適合である。

Description

関連出願の相互参照
この国際出願は２０１６年６月３０日出願の米国仮特許出願番号６２／３５７，１４７、および２０１７年６月２４日出願の米国仮特許出願番号６２／５２４，５２２に対して優先権を主張する。両方の出願は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み入れられる。

背景的事項
微生物は、しばしば高濃度で、事実上どこにも見つかり、かなりの量の疾病および感染症の原因である。対象とされた組織からこれらの微生物を除去することは多くの場合望ましく、時々非常に重要である。

バクテリアはいくつかのフォーム、たとえばプランクトン生物またはバイオフィルムで見つけることができる。それらの様々な自己保存機構は、それらを非常に処理および／または根絶することを困難にする。例えば、バイオフィルム中のバクテリアは、下方制御（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）（固着性：ｓｅｓｓｉｌｅ）されて活発に分裂しない。これによりそれらは彼らのライフサイクルの活性時期、例えば細胞分裂の間にのみ効果を有する抗菌剤の大多数の攻撃に対して抵抗性となる。

バイオフィルムでは、微生物（たとえばバクテリアまたは菌類）は表面と相互作用し、表面に付着し、コロニーを形成する。このコロニーは成長し続ける。
バクテリアはエキソ多糖類（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＥＰＳ）および／または細胞外多糖類（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ−ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＥＣＰＳ）巨大分子を生産する。これは表面へのバクテリアの付着を維持し、多くの形の攻撃に対して有効な保護バリアを形成する。ＥＰＳ／ＥＣＰＳ巨大分子のマトリックス内のフローチャンネルの小さな直径は、下層に存在する微生物に達することができる分子のサイズを制限する。さらにＥＰＳ／ＥＣＰＳ巨大分子のマトリックスとの相互作用により抗菌剤を消費し、内部に含まれる微生物の分泌物および廃棄物は、恐らく防護バリア機能の役割を果たす。

巨大分子マトリクス、またはそれらの下方制御により与えられる保護のため、バイオフィルム中のバクテリアは処理するのが非常に難しい。この形態のバクテリアを処理するために有効な殺生物剤および殺菌薬のタイプは、しばしば強酸性又はアルカリ性であり、しばしばハロゲン原子、酸素原子、または両方を含んでいることにより酸化性である。そのような化学物質の多量投与は、バイオフィルムまたは胞子に長時間接触することを許容するものであり、これは多くの用途で非実用的である。

危険にさらされた動物／ヒト組織に関する使用を意図した組成物であって、バイオフィルム・マトリックスを溶媒和でき、それをすすぐかまたは他の方法で感染した組織から取り除くことができる組成物は、例えば米国特許番号７，９７６，８７３、７，９７６，８７５、７，９９３，６７５および７，９５９，９４３に記載されている。同様の成分に基づいているが、他の用途が意図された組成物は、米国特許番号８，９４０，７９２および９，３１４，０１７、ならびに米国特許公開番号２０１０／００８６５７６、２０１４／０２４２１８８および２０１６／００７３６２８に記載されている。

しかしながら、動物試験は、たとえば前節に述べられた組成物は、細毛を持った組織、たとえば鼻腔穴および内耳に適用された時、繊毛消失（ｄｅｃｉｌｉａｔｉｏｎ）、つまり、真核細胞のボッド（ｂｏｄ）で見られ、ボットから突き出る、比較的太い突起細胞器官である繊毛の除去またはその機能の損傷に帰着する傾向がある。鼻腔穴繊毛は鼻腔のクリアランスを促進する一方、耳の中のものは音の受容器として働く。

試験は、繊毛消失に寄与する要因が、イオン性界面活性剤の存在、高い有効な溶質濃度およびｐＨを含むことを示唆する。不運にも、前節にリストされたドキュメントに述べられていた組成物はすべて、少なくとも０．２％（ｗ／ｗ）の界面活性剤を要求する。また、多数が低いｐＨおよび非常に高い有効な溶質濃度（つまり浸透性）を要求するか、好む。

バイオフィルム繊毛消失が組織に影響を与えるので、また鼻腔内の繊毛は数日内に再生長することができるので、鼻腔穴のクリアランスを妨害しない程度の繊毛消失は、耳管によって内耳に接続されない鼻腔穴で用いるための製品の受容可能な副作用かもしれない。しかしながら、内耳繊毛は再生長しないので回復不能な難聴に帰着するため、鼓膜（あるいは内耳に接続される鼻腔穴を扱う）の内部を治療する際に用いるための組成物は、繊毛消失に帰着することは許されない。

望ましいものは、承諾しがたいレベルの繊毛消失に帰着せずに、繊毛を含んでいるエリア（たとえば鼻腔穴および中間／内耳）に存在する微生物、特にはバイオフィルム形式の微生物を有効に処理することができる組成物である。上記の目的を達成することができ、影響を受けた組織からバイオフィルムの分離をさらに引き起こすか促進することが特に望ましい。

そのような抗菌性組成物は様々な粘性の中で提供することができ、１つを超える供給ルート経由でターゲットとされたエリアへ導入することができることが、特に望ましい。

さらに望ましいのは、例えば、塩水のすすぎのような、注水の使用を介しての除去を要求しないように十分に生物学的適合性の組成物である。

要約
本発明は、バイオフィルムの形でのバクテリアを含むが、これらに限定されない微生物を処理するために使用することができる組成物に関する。用語「処理」は、殺すこと、不活性化することおよび／または除去を含んでいる。

本発明による組成物は、広いスペクトルのグラム陽性およびグラム陰性菌に対して有効で、他の微生物（たとえばウィルス、菌類、かびおよびイースト）への致死性を示す。

有利には、この組成物は繊毛が存在するエリア（たとえば鼻腔穴および中間／内耳）の中にある微生物を有効に殺すことができ、バイオフィルム形式の微生物さえ殺すことができ、繊毛消失を全く起こさないか、または最小にするものである。そのようなターゲットとされた処理領域としては、バイオフィルムを含み、組成物は影響を受けた組織からバイオフィルムの分離することができ、除去を支援することができる。

組成物は、水に似ている粘性がある液体として典型的に提供されるが、種々の形態で提供するために一定範囲の粘度を有することができる。さらに、それは様々な現在利用可能な装置を使用する技術によって供給することができる。

組成物の実施態様はすべて生物学的適合性である。その一方で多くの実施態様が繊毛親和性（ｃｉｌｉａｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）である。

組成物は、ほぼ中立のｐＨ、典型的には６−８のｐＨを持っており、適度の浸透性の活性な溶質を含んでおり、しばしば々４００ ｍＯｓｍ／Ｌ以下、一般には２５０ ｍＯｓｍ／Ｌ以下、およびより一般に２００ ｍＯｓｍ／Ｌ以下の有効な溶質濃度を有する。鼻腔穴で用いるための実施態様は、１．０、０．８、０．７あるいは０．５％（ｗ／ｖ）以下の１つ以上の陰イオン界面活性剤を含むことができ、一方、中耳または内耳で用いるための他の実施態様は界面活性剤を含まないことができる。上限は組成物の意図した最終用途によって決定されるが、組成物は１つ以上の非水性の液体を少なくとも２％（ｗ／ｖ）で含んでいる。組成物は、さらに６≦ｐＨ≦８で活性の１つ以上の酵素の少なくとも０．００５％（ｗ／ｖ）を含んでいる。これは、細胞壁中の分子内または分子間の化学結合の切断を触媒するか、および／または切断を容易にすることにより、微生物の細胞壁破裂を促進するためである。（酵素は化学構造およびターゲットの有用性の点から非常に多岐にわたるので、上限はしばしば具体的な酵素の量に基づき、もしあるとすれば、それは特別の最終用途には承諾しがたいと認められる繊毛毒性のレベルに帰着する。）

組成物は、バイオフィルムのマトリックス中でのイオン性架橋を中断するか壊すことに有効であり、これは溶質、界面活性剤（存在する場合）、および酵素のマトリックスを通って、その内部に同伴され、それにより保護されている微生物（例えばバクテリア）への通過を容易にする。組成物は、バイオフィルム防御を回避しかつ／または不能にし、保護されていた微生物がアクセスされ殺されることを許容し、典型的には細胞融解に導くバクテリア中の細胞膜漏出を引き起こすことを含むプロセスによって行われる。

さらに、影響を受けたエリアに非固体の組成物を適用することを含む、影響を受けたエリアを処理する方法を提供する。もし適所に残されることが意図されれば、組成物は非流動性であることができる。もし処理領域一帯に流れることや、その処理領域に浸透することが意図される場合には、組成物は液体であることができる。

組成物の実施態様は慢性中耳炎、コレステリン腫および他のバクテリアによる耳の症状、慢性の副鼻腔炎、および他のバクテリアによる鼻炎症状を治療するために使用することができる。

多くの場合、流動可能な形態の組成物は、影響を受けたエリア上で行なわる手術中または手術後に導入される。
例えば、組成物は、鼓膜切開チューブの挿入の直後または早期に鼓膜切開チューブを介して中耳へ導入することができる。あるいは、望ましい場合には、手術後のフォローアップ評価中に導入することができる。

以下に記載される様々な実施態様の理解を助けるために、用語の定義が以下に示される。これらは、もし周囲のテキストが明示的に反対の企図を示さなければ、全体に当てはまるように意図される：
「含む」は、リストされた成分またはステップを非制限的に含むことを意味する；
「から成る」は、リストされた成分（またはステップ）のみを含むことをいうが、不活性な添加物またはアジュバンドの少量は含むことができる。
「本質的に成る」は、リストされた成分のみを含み、少量（２％、１％、０．５％、０．２５％または０．１％未満、すべてｗ／ｖ）の他の成分であって、殺菌活性を補助するか、および／または意図した最終用途に望ましい副次的効果（例えば防曇性、汚れ除去、傷洗浄など）を提供する成分、および／または不活性な添加物またはアジュバンドを含むことを意味する。
「微生物」は、非制限的にバクテリア、ウイルス、菌類、ウイロイド、プリオンなどを含む、任意のタイプの微生物を意味する。
「抗菌物質」は、１つ以上の微生物の数の９０％（１ ｌｏｇ）よりも大きい低減を示す能力を持っている物質を意味する。
「活性な抗菌物質」は、生活環の活性な部分（例えば微生物の細胞分裂）にのみ、または主として有効な抗菌物質を意味する。また、その活性は細胞プロセスの破壊を含む。
「バイオフィルム」は、細菌のコミュニティーを意味し、特にはバクテリアと菌類のコミュニティーを意味し、コミュニティーメンバーとともに自己発生高分子マトリクス中にあるか、またはそれにより守られているか、表面に付着している。
「確固としたバイオフィルム」は、２日以上の成長期の後に定常状態の塊に達したバイオフィルムをいう；
「バッファー」は加えられた溶液のｐＨを比較的狭い範囲内で維持する能力を持っている化合物または化合物の混合物を意味する；
「バッファー前駆物質」は、酸または塩基を含んでいる混合物に加えられた時、バッファーに帰着する化合物を意味する；
「ポリ酸」は、少なくとも２つのカルボキシル基を有する化合物を意味し、ジカルボン酸、トリカルボン酸などを含んでいる；
「溶媒和」は、液体の中に溶液として固形物を取り込むプロセスを意味する；
「封鎖剤」は、化合物の溶媒和を助け、かつその化合物の溶媒和された形態から化合物が溶液から出て来るのを防ぐことを支援する化学物質を意味する；
「金属イオン封鎖剤」は、１つ以上の金属イオン（特にアルカリ金属、アルカリ土類金属）とともに作用する封鎖剤を意味する；
「慢性中耳炎」は滲出性中耳炎あるいは再発性中耳炎を意味する；
「ソイルロード（ｓｏｉｌ ｌｏａｄ）」は、体分泌物、用便などの存在をシミュレートするために、供試生物のサスペンジョンに加えられた、１つ以上の有機物質および／または無機物質の溶液を意味する；
「接種材料」は、バクテリア、成長溶液（例えばトリプシンソイブロス）およびタンパク質ソイルロードを含んでいる溶液を意味する；
官能基についての「置換された」は、対象の基の意図した目的の邪魔をしないヘテロ原子または官能基（例えばヒドロカルビル基）を含むものをいう。
「滞留時間」は、抗生物質とバクテリアのバイオフィルムとの接触が許容される時間をいう；
「生物学的適合性」は、哺乳類の種において、著しい長期的な有害な影響を示さないことをいう；
「繊毛毒性（ｃｉｌｉｏｔｏｘｉｃ）」とは、繊毛の顕著な分裂あるいは繊毛の機能の喪失に帰着することを意味する；また
「繊毛親和性」とは、繊毛毒性を有しないことを意味する。

液体のｐＨ値は、適切にキャリブレートされた電極を使用する任意の電位差計技術から得ることができる。有効溶質濃度は、適切にキャリブレートされたＤＳＣの、対象の液体組成物の融解温度を含む温度領域にわたり得られた走査から計算された溶融潜熱によって好ましくは決定される。

ここに使用されるどんな数の制限も、特にその数の制限と共に使用される数に基づいて適切な程度の不確実性を含んでいる。
例えば、「５．０まで」は「５まで」より低い絶対的上限を規定すると解釈することができる。

図１は、最小バイオフィルム殺菌濃度（ｍｉｎｉｍｕｍ ｂｉｏｆｉｌｍ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＭＢＥＣ）ハイスループットスクリーニング分析で使用されたタイプの、分解されたマルチウエルアレイの単純化された概要図である。

図２は本発明の処理組成物の試験で使用された８×１２のマルチウエルアレイの平面図である。

図３は、本発明の処理組成物の試験で使用されたチャレンジプレート・マトリックスの平面図である。

図４および５は、鼻腔治療組成物のための空気−液体インターフェース（ＡＬＩ）モデルの繊毛毒性試験結果を示す。図４では時間に対して活性繊毛エリア（ａｃｔｉｖｅ ｃｉｌｉａ ａｒｅａ）がプロットされた。 図５では時間に対し繊毛ビート周波数（ｃｉｌｉａ ｂｅａｔ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）がプロットされた。

図６は、８匹のモルモットについての、聴覚しきい値（ｈｅａｒｉｎｇ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）データの平均ベースラインを示す。

図７は、液体の注入の７日後に集められたデータに基づいている。 図８は、液体の注入の２８日後に集められたデータに基づいている。

先に述べられた組成物は、バイオフィルムを破壊、除去、および／または分裂させるために使用することができる。有利には、動物、特には哺乳動物の中耳または内耳に位置した、あるいは鼻腔穴内のバクテリアのバイオフィルムに使用できる。デリケートな組織、およびそれらのエリアの構造中またはその周囲で使用するために、組成物は生物学的適合性で安全である。なぜなら、組成物はそのような組織あるいは構造を傷つける可能性があるか、または長期的に聴覚を危険にさらす可能性のある構成材料を含まないからである。

組成物の実施態様は、供給のための技術（たとえばスプレー適用、洗浄、噴霧、塗布、ウィッキング（ｗｉｃｋｉｎｇ）および滴下）を可能にするために十分に低い粘度を持っている。これらおよび他の組成物の実施態様では、吸収を許容するように十分に生物学的適合であるが、適用の後のフラッシング、すすぎ、およびドレイニング等により処理部位から容易に取り除くことができる。

理論によって拘束されるものではないが、組成物中の金属イオン封鎖剤は、金属イオンと錯体を形成するか、または他の方法で金属イオンと結合し、バイオフィルムのＥＰＳ／ＥＣＰＳマトリックス中のポリマー鎖を架橋し、ブリッジし、または他の態様で結合を補助する。その後、組成物の他のコンポーネントは、結合されていないポリマー鎖またはフラグメントを取り囲み、マトリックスを破壊し、架橋されていないポリマー鎖あるいはフラグメントを溶媒和し、それらを溶液またはサスペンジョンにし、例えば、追加の溶媒和システムあるいは別個のリンス剤を使用して、処理エリアからフラッシュまたは他の方法で除去することができるようにされる。

組成物は溶剤と溶質のコンポーネントを含んでいる。

組成物の溶剤コンポーネントは水および少なくとも１つの非水性の液体を含んでいる。

水は高い溶質保持能力、良好な湿潤特性、優れた生物学的適合性、環境へのやさしさおよび低コストを持っている。あらかじめの処理がなくてもバクテリアが比較的ないものが好しいが、本質的に、任意の水を使用することができる。蒸留、脱イオン化はされる必要は無いが、そのような処理は除外されない。特に使用される水が、意図される組成物の目的を妨害するかもしれない望ましくない溶質を含むかもしれない場合にはそのような処理は除外されない。組成物の他のコンポーネントの１つ以上の可溶性を増加するために、水を加熱することができる。

１つ以上の非水性の液体は典型的には水よりも大きなδｐ値を有しない。ここで「δｐ」はダイポール分子内力ハンセン溶解パラメータ（ＨＳＰ）である。ＨＳＰ値は１つの物質が他の物質に溶けて溶液を形成するか否かを予測する最も一般的な方法である。最も一般的に使用される溶剤に対するＨＳＰ値は文献に記載されている。

混合物または組成物での成分はそれぞれ３つのＨＳＰを有する：分散力、ダイポール・ダイポール（極性）相互作用および水素結合。これらのパラメーターは、極座標を使用して視覚化されるＨＳＰ特性表記と共に、三次元の座標として一般に扱われる：３Ｄ座標は、球の中心と、球の半径（Ｒ_０あるいは「相互作用半径（”ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｒａｄｉｕｓ）」）を有し、これは溶剤または溶質との「よい」相互作用についての許容される親和性の極大差を示す。言いかえれば、許容可能な溶剤は相互作用半径内に位置し、許容しがたいものはその外側に位置する。

２つの物質のＨＳＰの間の距離である、いわゆるハンセン・スペース（Ｒａ）は、下記式によって計算することができる。

式中、δｄは分子間の分散性力からのエネルギー、δｐはダイポール・ダイポール分子間力からのエネルギー、δｈは分子間の水素結合からのエネルギーである。

単純な組成物親和性パラメーター（相対的なエネルギー差（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＥＤ））は、相互作用半径（Ｒ_０）に対する計算されたＨＳＰ差（Ｒａ）の比（つまりＲＥＤ＝Ｒ_ａ／Ｒ_０）を表わす。ＲＥＤ＜１．０の場合、分子の可溶性は十分に類似しており、一方が他方を溶解する。ＲＥＤ＜１．０の場合には、分子の可溶性は、一方が他方を溶かすために十分には類似していない。ＲＥＤがほぼ１．０、の場合、部分的な溶解が可能である。

具体的な溶剤または混合物の双極子間相互作用ハンゼンの溶解パラメーターは、下記式によって計算することができる：

δｄｉは、溶剤ｉについてのダイポール相互作用からのエネルギー、ｘｄｉは組成物の溶剤部分中の溶剤ｉのパーセンテージ、ｎは溶剤成分の総数である。

所定の溶剤または溶剤の組み合わせについてのδｐ値は、室温で決定される。なぜなら、溶解性は典型的には温度上昇とともに増加するので、巨大分子のマトリックスおよび細菌細胞壁タンパク質の溶解度が増加し、本発明の組成物の効果はより高い温度ではより大きくなると期待されるからである。また、ｐＨ値は、適切にキャリブレートされた電極を使用する様々な電位差測定法のうちの任意の物で得ることができる。

ＨＳＰおよび関連する概念に関するより多くの詳細が米国特許出願２０１６／００７３６２８に記載されている。

組成物の溶剤成分は、少なくとも１つの非−水性液体を含み、典型的には水（δｐはほぼ１６．０ ＭＰａ^１／^２）より低いδｐ値を備えた非−水性液体を含む。
鼻腔適用用途で用いるための例示的な組成物は、５−２０％（ｗ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を使用し、全体のδｐがほぼ１６．０ ＭＰａ^１／^２であることができる。耳の適用用途で用いるための典型的な組成物は５−１５％（ｗ／ｖ）のエタノールを使用し、全体のδｐがほぼ１５．４ ＭＰａ^１／^２であることができる。

ある実施態様では、水に高溶解性であり、繊毛親和性である有機溶剤、またはそうすることができる有機溶剤が好ましく使用される。
さらに、意図した使用量で安全で、「不活性」と考えられる（規制団体によって）あらゆる有機液体が好ましく使用される。

組成物は、１つ以上の非水性の（有機）液体を少なくとも２％（ｗ／ｖ）で含んでいる。上限は組成物の意図した最終用途によってほぼ決定され、鼻腔適用用途での上限は、恐らく耳適用用途のそれより高い。ある実施態様では、下限は、ｗ／ｖで、２．１、２．２、２．３、２．４あるいは２．５％である。例示的な範囲は、ｗ／ｖで２．２５−１５％（鼻腔用）または２．０−１０％（耳用）であり、典型的な範囲は２．５−１３％（鼻腔用）または２．１−９％（耳用）であり、好ましい範囲は２．５−１２．５％（鼻腔用）または２．２−８％（耳用）である。

溶剤コンポーネントに加えて、組成物は、さらに主成分として最低２つの追加成分、少なくとも１つの金属イオン封鎖剤解離生成物と少なくとも１つの有効な酵素を含むことができる溶質コンポーネントを含んでいる。耳への適用を意図していない実施態様では、陰イオン界面活性剤も含むことができる。さらに１つ以上の塩類の解離生成物を、有効な溶質濃度を増加させるために含むことができる。先の成分の各々は、一般に生物適合性であると考えられる。

金属イオン封鎖剤は、バイオフィルムのＥＰＳ／ＥＣＰＳマトリックス中の１つ以上の金属イオンと錯体を形成するか、他の態様で反応することのできる酸または塩基であることができる。特別に関心の持たれる金属イオンは、ターゲットとされたバイオフィルムへの有効な関与により、ナトリウム、カルシウムおよび鉄を含む。金属イオン封鎖剤は、望ましくは水に可溶であり、無毒であり、そして長期的な難聴を悪化させないものである。

どちらのタイプの封鎖剤も使用することができるが、酸は一般に塩基よりも好ましい。生物学的に適合性の金属イオン封鎖剤が好ましい。あるいは、またはさらに、バイオフィルムの巨大分子のマトリックスとの架橋に寄与する、金属の陽イオンとキレート結合することができる金属イオン封鎖剤が好ましい。金属イオン封鎖剤は好ましくは酸化剤であるとは認められず、特にそれが酸である場合にそうである。さらに、意図した使用量で安全で、「不活性」と考えられる（規制団体によって）酸および塩基が特に好ましい。

酸性度は１つ以上の酸を水に加えること（あるいは逆）により達成することができる。強い（鉱）酸、たとえばＨＣ１、Ｈ_２ＳＯ_４、Ｈ_３ＰＯ_４、ＨＮＯ_３、Ｈ_３ＢＯ_３などが好ましく、より好ましくは弱酸、特には有機酸、特に有機ポリ酸が使用される。有機酸の例としては、一塩基酸、たとえばギ酸、酢酸および置換された変成物、プロパン酸および置換された変成物（例えば乳酸、ピルビン酸など）、様々な安息香酸変成物（例えばマンデル酸、クロロマンデル酸、サリチル酸など）、グルクロン酸など；二塩基酸、たとえばシュウ酸および置換された変成物（例えばオキサミド酸）、ブタンジオン酸および置換された変成物（例えばリンゴ酸、アスパラギン酸、酒石酸、シトラマル酸など）、ペンタン二酸および置換された変成物（例えばグルタミン酸、２−ケトグルタル酸など）、ヘキサン二酸および置換された変成物（例えば粘液酸）、ブタン二酸（シス−、トランスアイソマーの両者）、イミノ二酢酸、フタル酸、ケトピメリン酸など、三塩基酸、たとえばクエン酸、２−メチルプロパン−ｌ，２，３−トリカルボン酸、ベンゼントリカルボン酸、ニトリロ三酢酸など；四塩基酸、たとえばプレーニト酸、ピロメリット酸など；またさらに高度の酸、例えば、ペンタ、ヘキサ、ヘプタ塩基酸などがあげられる。ここでトリ−、テトラ−、あるいはより高度の酸が使用される場合、カルボキシルプロトンの１つ以上は同じかまたは異なるカチオン性原子あるいは基（例えばアルカリ金属イオン）で置換することができる。好ましい酸はモノ−、ジ−またはトリ−プロトン酸、クエン酸、酢酸、オクタン酸およびグルタミン酸である。

塩基度は１つ以上の塩基を水に加えることにより、またはその逆により達成される。塩基としては、制限するものではないが、以下があげられる。酢酸塩、フルメート（ｆｕｌｍａｔｅｓ）、乳酸塩、リン酸塩およびグルタミン酸塩を含む弱酸のアルカリ金属塩；アルカリ金属硝酸塩；特にはＮａＯＨおよびＫＯＨであるアルカリ金属水酸化物；特にはＭｇ（ＯＨ）_２であるアルカリ土類金属水酸化物；アルカリ金属ホウ酸塩；ＮＨ_３；およびアルカリ金属次亜塩素酸塩（例えばＮａＣｌＯ）および重炭酸塩（例えばＮａＨＣＯ_３）。水に可溶性であるかまたは可用性にすることができるもの、および生物学的適合性である化合物が好ましい。

水に加えられる金属イオン封鎖剤の濃度は比較的重要ではない。なぜなら、目標とされる有効溶質濃度および水素イオン濃度が６≦ｐＨ≦８だからである。したがって、強酸または強塩基の使用は、大量のその酸／塩基の添加に不利に作用する。さらに、比較的中程度の有効溶質濃度範囲（以下に議論される）は著しい量のバッファー先駆物質をもたらさない。反対に、非常に弱い酸あるいは塩基の使用は、非常に大量の酸／塩基および／または非常に低減された量のバッファー先駆物質の添加を許容する。

米国特許８，９４０，７９２および９，３１４，０１７、および米国特許公開
２０１０／００８６５７６、２０１４／０２４２１８８および２０１６／００７３６２８は、ｐＨの減少または増加（酸か塩基が使用されるかに依存して）が一般に増強された効能に対応することを示唆する。しかしながら、本発明の組成物が生物学的適合で、最小の繊毛毒性を持つことが望まれるので、ターゲットとされたｐＨ範囲も中性から両側へ１ｌｏｇ単位である。したがって、それらの先の教えからの重要な効能を増強する変数は、本発明の組成物において利用可能ではない。本発明の組成物の目標ｐＨ（ｔ）は、ｔ＝６．５±ｖあるいはｔ＝７．５±ｖで、ｖは０．４、０．３、０．２５、０．２、０．１５、０．１あるいは０．０５に相当するものである。

与えられたｔ値に達するのに必要な酸または塩基の量は、使用した具体的な酸または塩基の強さに依存するだろう。弱い酸あるいは塩基と考えられる化合物の少量の添加さえ、組成物のｐＨを、それぞれ上記のｔ値の下または上に調節するので、溶質コンポーネントは希望のｔ値を持っている組成物を提供するように十分な量のバッファー先駆物質者（以下に議論される）を含んでいる。

金属イオン封鎖剤に加えて、前節の中で示された文献の各々は、中から高いレベルの１つ以上の界面活性剤を要求する。本発明の組成物が、繊毛が存在する状態の中で使用されることを意図する。多くのタイプの界面活性剤が繊毛毒性であると知られているので、界面活性剤の包含は禁忌である。耳への適用を意図した組成物の実施態様については、別途の界面活性剤の添加は避けられるか、または厳密に制限される（例えば０．５％未満、０．４１％未満、０．３３％未満、０．２５％未満、０．２１％未満、０．１７％未満、０．１３％未満、０．０９％未満あるいは０．０５％未満、すべてｗ／ｖ）。一方、鼻腔への適用を意図した実施態様については、非常に制限された量の１以上の陰イオン界面活性剤を含むことができる。これは前述の教えからの効能を増強するオプションが、本発明の組成物において利用可能ではない（あるいはほとんど利用可能でない）ことを意味する。

鼻腔への適用に用いるための実施態様においては、含有される陰イオン界面活性剤の量は、すべてｗ／ｖで、一般に１．０％未満、通常０．７５％未満、典型的には０．５％未満、好ましくは０．４％未満、より好ましくは０．３５％未満、および最も好ましくは０．３％未満である。１つ以上の陰イオン界面活性剤が鼻腔をターゲットとする組成物に含まれる場合、存在する総量は、すべてｗ／ｖで、一般に０．０２から０．６７％、通常０．０３から０．５５％、典型的に０．０４から０．４２％、好ましくは０．０５から０．３９％、より好ましくは０．０６から０．３６％、およびさらに好ましくは０．０８から０．３３％までである。

限定するものではないが、潜在的に有用な陰イオン界面活性剤としては以下が含まれる。米国特許６，６１０，３１４の中で述べられたナトリウム チェノデオキシ（ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙ）−コール酸塩、Ｎ−ラウロイルサルコシン（ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ）ナトリウム塩、リチウム硫酸ドデシル、１−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、ナトリウム・コール酸塩水化物、デオキシコール酸ナトリウム、硫酸ドデシルナトリウム、ナトリウムグリコデオキシコール酸塩、ラウリル硫酸ナトリウム、およびアルキルリン酸塩。

溶質コンポーネントの酵素サブコンポーネントは、触媒により微生物の細胞壁の破壊を容易にするか、および／または細胞壁内の分子または分子間に存在する化学結合の破壊を容易にする任意の化合物であることができる。特に有効であると考えられる１つのカテゴリーはグリコシダーゼ（特にリゾチーム種）である。現在までのテストは、リゾチームは８０ｐｐｍ（つまり組成物の１ｋｇ当たり０．０８ｇのリゾチーム）でも幾分かの効能を示すことを示した。一般に使用される酵素の量は、少なくとも１００ｐｐｍ、少なくとも１２５ｐｐｍおよび少なくとも１５０ｐｐｍである。典型的な範囲は８５から５００ｐｐｍ、９０から４５０ｐｐｍ、９５から４００ｐｐｍ、１００から３５０ｐｐｍ、１０５から３００ｐｐｍ、１１０から２７５ｐｐｍ、１１５から２５０ｐｐｍ、１２０から２２５ｐｐｍ、１２５から２００ｐｐｍ、１３０から１９０ｐｐｍ、１３５から１８５ｐｐｍおよび１４０から１８０ｐｐｍである。

組成物の効能は、一般に少なくとも中程度の有効溶質濃度の存在により増加し、一般に使用される溶質サブコンポーネントの量に比例して増加する。しかしながら、それらのサブコンポーネントのうちの２つ（金属イオン封鎖剤と界面活性剤）の量は、厳しく制限される。

組成物の有効溶質濃度（浸透性）を増加させるために、１つ以上のタイプの他の水可溶性化合物を溶質コンポーネントに含むことができる。そのような化合物は、解離した際に、水素イオンと水酸化物イオンのモル濃度への大きな影響なしに、組成物中の溶質の有効な量を増加させる。

組成物の有効な溶質濃度は、大量のイオン化合物（特に電解質）を加えることにより増加させることができる；例えば米国特許７，０９０，８８２を参照。本質的に、水中で少なくとも部分的に解離する任意の化合物および／または溶剤コンポーネントの中で使用された有機液体が、この結果を達成するために使用されることができる。非制限的な例示化合物としては、リン酸塩、酢酸塩、および注射液、ゲル、クリーム、ローションおよび／または軟膏において政府の規制により「不活性成分」と考えられる任意の化合物があげられる。

組成物の浸透力を増加させる好ましい方法は、溶質コンポーネントのサブコンポーネントとしてバッファー先駆物質を使用することである。例えば、溶質コンポーネントが１つ以上の酸を含んでいる場合、それらあるいは他の酸の１つ以上の塩類を、組成物の浸透力を増加させることに加えて、ｐＨバッファーを供給するために溶質サブコンポーネントとして使用することができる。酸のｘモルが溶質コンポーネントのサブコンポーネントとして使用される場合、その酸の１つ以上の塩類の過剰（例えば２ｘ−８ｘ）を、別個のサブコンポーネントとして含むことができる。（塩基性組成物についても同じことが言える。）酸性塩の対カチオン（あるいは塩基性塩の対アニオン）の同一性は特に重要ではない。ポリ酸の塩がバッファー先駆物質として使用される場合、すべてまたはより少ない数のカルボキシル水素原子を置換することができる；例えば、モノ、ジ−、およびトリナトリウムクエン酸塩は潜在的に有用なバッファー前駆物質として使用できる。しかし、理論的には最後のものが他の２つよりも大きいバァッファー能力を有する。（再び、ポリ塩基の塩類も同じことが言える。）

どのように達成されたかにかかわらず、組成物の浸透性は適度に高く、一般的には１００から３００ Ｏｓｍ／Ｌ、典型的には２００±１０ ｍＯｓｍ／Ｌの有効溶質濃度を有する。組成物の実施態様は、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５あるいは１８０ ｍＯｓｍ／Ｌの最小溶質濃度、および２７５、２６０、２５０、２４５、２４０、２３５、２３０、２２５、２２０、２１５、２１０、２０５、２００、１９５、１９０あるいは１８５ ｍＯｓｍ／Ｌの最大溶質濃度の示す場合がある。それぞれの最小および最大に基づく範囲は、非制限的に、１１０から２７５、１２５から２５０、１５０から２５０、１６０から２４０、１６０から２２５、１７５から２５０、１７０から２４０、１７０から２３０、１８０から２４０、１８０から２３５、および１８０から２２０ ｍＯｓｍ／Ｌであることができる。

不必要で典型的な禁忌物質ではないが、具体的な最終用途において実質的にその効能に否定的に作用しない組成物を作るために、溶質成分は様々な添加物および補剤を含むことができる。非制限的な例としては、香水、色素、染料、精油、起泡剤、風味剤、防腐剤（例えば酸化防止剤）があげられる。

溶質コンポーネントは、典型的には６から８のほぼ中性のｐＨおよび２５０ ｍＯｓｍ／Ｌ以下、一般に２００ ｍＯｓｍ／Ｌ以下の有効な溶質濃度を有する適度の浸透活発な溶質を含む組成物を提供することができる。いくつかの実施態様では、１つ以上の陰イオン界面活性剤を０．５％（ｗ／ｖ）以下で含む。一方、他のものは加えられた界面活性剤を含んでいない。組成物はさらに比較的少量の１つ以上の有効な酵素を含んでいる。以下の表に、加えることのできるサブコンポーネントおよびそれらの量が示される。

本発明の様々な実施態様は例として示され、制限を与えるものではない。先の表から明白なように、好ましい特徴、範囲、数値制限および実施態様は、実現可能なものであり、妨げまたは非互換性がない限り、他の一般に好ましい特徴、範囲、数値制限および実施態様と組み合わせることができることが企図される。

組成物は多くの方法で調製することができる。典型的な方法は以下のとおりである。

酵素以外の溶質サブコンポーネントの各々が計算された希望の体積の６０−９０％を構成するように、十分な水に加えることができる。もし望まれればこの溶液は攪拌され、および／または加熱することができる。その後、希望の量の有機液体および酵素を加えることができる。使用する場合には攪拌が完全に為された後、十分な水が加えられ、計算された浸透力およびｐＨ値を有する組成物とする。有利には、特殊な条件またはコンテナーは長期間で組成物を貯蔵するためには必要ではない。もし望まれれば冷凍を使用することができる。

組成物は溶液として提供することができる。ある最終用途に望ましい場合には他の形でも提供できる。したがって、組成物は可溶性のパウダー（後の稀釈のため、輸送費を下げることができるオプション）、スラリーあるいはエマルション、あるいはより粘度の高い形態、たとえばゲル（ヒドロゲル、オルガノゲルおよびゼロゲル（ｘｅｒｏｇｅｌｓ）を含む）、あるいはペースト（つまり有機物ベース、たとえば脂肪酸中のサスペンジョン）として提供されることができ、いずれも増加した滞留時間を提供するのに有用である。後者については、組成物は追加の成分（例えば、造膜助剤、たとえばポリビニルピロリドン）を含むことができる。軟膏、エアゾール、泡およびサスペンジョンの形態も可能である。

ここに記述された組成物の利点は、それらが付着する組織からバイオフィルムを分離する能力である。これが生じるかどうかにかかわらず、組成物は、影響を受けた組織、あるいはその組織のまわりに存在する生存細菌の数を著しく減らすことができる。

組成物の使用がバイオフィルムの分離に帰着しない場合でも、組成物の実施態様は非常に短い滞留時間でさえ、バクテリアの数の大きな減少を提供することができる。例えば、３、４、５、７、８、９、あるいは１０分の滞留時間でさえ、バイオフィルム中に侵入しているバクテリアの数の１、２、３あるいは４ｌｏｇ（９９．９９％）の減少が可能である。

組成物はバイオフィルムの巨大分子のマトリックス中のイオン架橋を中断するか壊し、マトリックスを通って溶質および界面活性剤の、マトリックスに同伴されるかおよび／またはそれにより保護されているバクテリアへの通過を容易にするように作用する。巨大分子のマトリックスの破壊は、さらにバイオフィルムの分離に帰着することができ、あるいはまたはさらにマトリックス中に同伴されているバクテリアの処理に帰着することができる。

大多数の先の議論は、バイオフィルム（特にバクテリアのバイオフィルム）に集中していた。鼻腔および耳の問題の大多数がバクテリアに由来することは驚くべきことではない。しかしながら、組成物は、バイオフィルム以外のバクテリアの形式、およびバクテリア以外の微生物に対する効能を示す。有利には、組成物は、それらのライフ・サイクルの過程にかかわらず、微生物を殺しかつ／またはその成長を防ぐことができる。

バクテリアに関して、バクテリアのライフ・サイクルの誘導期（代謝タンパク質生産）、対数期（再生）および静止期（ほぼ等しい量のバクテリアの死、代謝および再生）の各々は、技術的に「活発な」過程を構成する。個々のバクテリアが休止しているか再生しているか、代謝しているかどうかにかかわらず、組成物はそれを殺すか、あるいはそれが成長するのを防ぐことができる。

しばしばバイオフィルムの一部であるバクテリアは休止している（代謝または再生しない）。また、この細胞プロセスの欠如（不活発）は、活発な代謝あるいは再生を必要とする抗生物剤および他の活性な抗菌剤に対する耐性をしばしば提供する。

再生のためのホストを要求するので、ウィルスは技術的には生きている微生物ではない。しかしながら、組成物は、ウィルス上のタンパク質コーティングを分裂、浸透しかつ／または溶かすことができる。これらの保護構造を攻撃する能力は、細胞への感染の後に再生する能力を常に達成する前に、組成物がウィルスに対する効能を示すことを意味する。

繊毛毒性は、一般に界面活性剤濃度の増大、浸透力の増大および／または中性のｐＨからの逸脱に伴い増加する。先の記述によれば、当業者は、バイオフィルムの形の微生物に対する有効性を保持したまま繊毛親和性の組成物を提供することができる。

組成物５様々な方法で使用することができる。

耳への適用については、それは、耳のターゲットとされたエリアに、手術の間および／または手術後に供給することができる。これは鼓膜の外側表面を洗うかすすぐ（例えば外科的処置を行う時に実施する）のと同じくらい単純である。（そのような場合、組成物が鼓膜を通るとは予想されない。より中性から離れたｐＨおよび浸透力を備えた組成物を使用することができる。）中耳／内耳のアクセスに関する手続きについては、組成物は鼓膜切開チューブを通って、あるいは穿孔か切開により鼓膜に挿入された注射器によって供給することができる。両方の場合に、液体の逆流が観察されるまで、医学の専門家は組成物を注入し続けることができる。（典型的な人間の中耳は、たとえば、１から１．５ｍＬの液体を保持する。）

鼻腔への適用については、組成物は外科的技術（たとえば穿孔術）により、あるいは遠隔の排出機構によって鼻腔穴へ導入することができる。遠隔の排出機構としては、例えばＨｙｄｒｏｄｅｂｒｉｄｅｒ（登録商標）の内視鏡検査法の鼻腔供給システム、（メドトロニック； ミネアポリス、ミネソタ）、Ｒｅｌｉｅｖａ Ｖｏｒｔｅｘ（登録商標）鼻腔供給カテーテル（Ａｃｃｌａｒｅｎｔ社； アーヴィン、カリフォルニア）があげられる。供給機構にかかわらず、出てくる液体が視覚的に清浄になるまで、医療専門家はターゲットとされた穴部分に組成物を供給し続けることができる。

使用される場所にかかわらず、組成物は数秒から数時間までの滞留時間であることができる。ターゲットとされた滞留時間は、典型的には患者の状態（例えば長い滞留時間を許すのに十分な動かない能力）、治療されるエリアの生理学的状態（例えば、そのエリアへ導入された液体が流出するかまたは貯まるか）に依存する。

以前に言及されたように、治療部位をフラッシュするかすすぐことは典型的に必要ではないが、液体（たとえば食塩溶液）での洗浄は可能である。

さらにあるいは二者択一で抗菌性組成物は、手術前および後の物品（たとえばスポンジ、局所用ワイプ、包帯、パッド、ガーゼ、外科用パッキング）を清浄化するために使用することができ、特に繊毛を含む組織と接触するまたはその恐れのある場合に使用される。

殺菌された移植用医療機器、たとえば鼓膜切開チューブのようなものは、移植前または移植中に周囲またはヘルスケア労働者から、またはより一般的には患者自身の皮膚上に存在するバクテリアによりコロニー形成される。挿入の後に、これらの移植物は、移植物表面が宿主免疫防御によって保護されないので、バイオフィルム成長のための表面を提供する移植物に接触するバクテリアによりコロニー形成される場合がある。さらに、現在使用されている殺菌技術は、ＥＰＳ／ＥＣＰＳを除去することは目指していない。その存在は、バイオフィルムの構成を非常に促進する。したがって、適切に移植される殺菌された装置／物品さえ、以前の接触によりその表面にＥＰＳ／ＥＣＰＳを持つことがある。

バイオフィルムが移植組織に形成される場合、現在利用可能な処置はそれを根絶することができない。抗生物質は、ＥＰＳ／ＥＣＰＳによる固有の保護、移植された物品の表面での制限のある血液供給により、そのような感染に対して効果がない。

前述の抗菌性組成物は局所的処置に有効であり、移植される装置または物品に適用されて使用することができ、感染した移植物および周囲の組織を洗うために使用することができ、バイオフィルムボディおよび／またはバイオフィルムを生ずる材料（たとえばＥＰＳ／ＥＣＰＳ）を除去するために使用することができる。

移植組織があるか、あった場合、鼓膜は以前に記述された組成物で処理することができる。これは、最初の移植（つまり物品の挿入の直後）の時に行うことができ、すすぎ／注水、吸引、あるいは両方を続いて行うことができる。

言及されたように、繊毛消失は、鼻腔穴および特に中耳内耳での使用を意図するあらゆる組成物に対する重要な懸念である。繊毛消失が好ましくはすべて回避される一方、鼻腔への適用で用いるための組成物には、約２０％未満、好ましくは約１５％未満、より好ましくは約１０％未満が受容可能である。耳用の組成物については、受容可能な上限は測定可能な難聴に帰着するものである。繊毛消失はより完全に以下に記述されるように、電子顕微鏡検査を走査することおよび／または聴力検査の試験によって決定することができる。

任意の参考文献として載せられた特許および／または公表された特許出願の適切な部分は、参照されここに組込まれる。

実施例
処理組成物の相対的効力は、ＭＢＥＣハイスループットスクリーニング分析（ＡＳＴＭ Ｅ２７９９−１２：ＭＢＥＣ分析を使用する緑膿菌バイオフィルムに対する消毒剤の効能をテストするための標準テスト方法）に記載される方法に類似する方法を使用して決定された。分析は、図１に示されるタイプのマルチウエルアセンブリ１０を使用した。それは、多数のペグ１８を有する蓋１６、および多数のウェル１４を有するプレート１２を含んでいる。各々のプレート１２および蓋１６はプラスチック（ポリスチレンまたはポリカーボネート）からなる。

プレート１２が無菌のパッケージングから取り出された直後に、バクテリアは多数のウェル１４の１つ以上の中で繁殖される。次の例において、図２に表わされるように、プレートは８列および１２カラムの９６のウェルを含んでいた。Ｘと指定されたウェルの６９の各々は、１０^５稀釈接種原の１５０μＬを受け取った。ウェルＡ１２−Ｃ１２が殺菌コントロールとして使用のために取っておかれた一方、９−１１カラムのウェルのどれも使用されなかった。Ｄ１２−Ｈ１２によって表わされる５つのウェルは、細菌増殖コントロールとして使用した。

使用されるバクテリアは、黄色ブドウ球菌、ＡＴＣＣ ３３５９２（ＭＲＳＡ）および緑膿菌（ＡＴＣＣ １５４４２）だった。適切な寒天培地の表面に、各バクテリアの最近成長した保存培養物が接種された。分離されたコロニーは、プレートから無菌的に撤去され、ソイビーン カゼイン ダイジェスト培地の２００ｍＬに接種された；フラスコは、連続希釈法によってチェックさたターゲットとされている≧１０^８ ＣＦＵ／ｍＬの生存バクテリア密度で３５℃±２℃および１５０±１０ｒｐｍ（ブドウ球菌では１８−２４時間、シュードモナスでは１６−１８時間）で培養された。成長培地の１００ｍＬ部分に、各培養フラスコからの１０μＬのアリコートがピペットで移され、１０^５ＣＦＵ／ｍＬにバクテリア密度が調節された。これらは均質な分配を達成するために撹拌された。
先の接種物の１０倍連続希釈法は、３回繰り返して行なわれた。連続希釈物の２０μＬのアリコートが、１０^０−１０^−７から適切な寒天プレート上でスポット培養され、３５℃±２℃（ブドウ球菌では１８−２４時間、シュードモナスでは１６−１８時間）でプレートを培養した。

蓋１６はプレート１２の上に置かれた。また、アセンブリ１０はラベルされ、１１０±１０ｒｐｍにセットされたオービタルインキュベーター／シェイカーに置かれた。各バクテリア・タイプに適切なものとして先に示された時間で３５℃±２℃でインキュベーター／シェイカーを作動させた。

細菌増殖ペグ（図２の中のＤ１２−Ｈ１２）は、蓋１４に対して水平な状態を保った、炎で殺菌されたブライヤーで壊された。それらの５本のペグの各々は、１．０ｍＬリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を備えた個別の無菌のマイクロ遠心チューブに入れられた。その後、マイクロ遠心チューブは、超音波処理装置の中心に浮かされたステンレス鋼トレーに置かれた；トレーは、超音波で１８００±３００秒間、処理された。超音波処理の後、マイクロ遠心チューブ中の溶液は、０．９ｍＬのＰＢＳを含む新しい無菌のマイクロ遠心チューブへ０．１ｍＬを転送することにより連続的に薄められた。稀釈液はテストされている具体的なバクテリアに適切な寒天上でスポット培養された。

「チャレンジプレート」と名付けた１枚のプレートが、図３に描かれる。ここでシンボルは下記を表わす：
＠ リゾチーム含有組成物
＃ リゾチーム非含有組成物
＾ 食塩水
＝ 無菌の中和剤
◆ 無菌のブロス
★ ＰＢＳ
＆ ５０：５０、リゾチーム含有組成物／無菌の中和剤
＊ ５０：５０リゾチーム非含有組成物／無菌の中和剤
＋ ５０：５０食塩水／無菌の中和剤

プレートのウェルＡ１２に、２００μＬの無菌のブロスを添加し、装置無菌状態のコントロールとして使用した。次に、２００μＬの無菌の中和剤が、カラム７の各ウエル（中和剤毒性コントロール）、およびウエルＢ１２（中和剤殺菌性コントロール）に加えられた。カラム６内のウエル（中和剤有効性コントロール）に１００μＬの無菌の中和剤が加えられ、次いで１００μＬのテスト組成物が加えられた：列Ａ−Ｃはリゾチーム含有組成物、列Ｄ−Ｆはリゾチーム非含有組成物、列Ｇ−Ｈは生理食塩液。カラム８の各ウエル（非処理コントロール）、ウエルＣ１２（ＰＢＳ殺菌性コントロール）に２００μＬのＰＢＳが加えられた。カラム１−５については、各ウエルには試験組成物の２００μＬが加えられた：列Ａ−Ｃはリゾチーム含有組成物、列Ｄ−Ｆはリゾチーム非含有組成物、列Ｇ−Ｈは生理食塩液。

チャレンジプレートは、少なくとも６０分間、３６℃±１℃でセットされた、湿潤インキュベーターに入れられた。

さらに、各テストのためにリンスプレート（各々のウエル中に２００μＬのＰＢＳ）、リカバリープレート（各々のウエル中に２００μＬの無菌の中和剤）および定量化プレート１−３（列Ａはそれぞれ１００μＬの無菌の中和剤、および列Ｂ−Ｈはそれぞれ１８０μＬのＰＢＳが提供された。

チャレンジプレートはインキュベーターから取り出された。成長プレートペグ蓋は約１０秒間すすがれ、すべてのプランクトン微生物が除去され、チャレンジプレートに移され、コンビネーションが上に記述された適切な時間で３６℃±１℃でインキュベートされた。その後、ペグ蓋はリカバリープレートに移された。

チャレンジプレートから、列Ａの各ウエルから１００μＬの内容物が定量化プレート１の対応する列Ａのウェルの中へ転送された。列Ｄの各ウエルから１００μＬの内容物が定量化プレート２の対応する列Ａのウェルの中へ転送された。列Ｇの各ウエルから１００μＬの内容物が定量化プレート３の対応する列Ａのウェルの中へ転送された。

リカバリープレートは超音波処理装置のステンレス鋼トレーに置かれ、１８００±３００秒で超音波処理された。

稀釈プレート１−３は、新しい９６ウェルのマルチウエルの列Ｂ−Ｈのウェルへ１８０μＬのＰＢＳを加えることにより調製された。超音波処理に続いて、リカバリープレートの列Ｂの各ウエルから１００μＬの内容物が、稀釈プレート１の列Ａの対応するウェルへ転送された。連続希釈法（１０^０−１０^７）は８つの列の各々を下って２０μＬを転送することにより達成された。例えば、セルＡ１からの２０μＬがＢ１に入れられ薄められ混合されて、セルＢ１からの２０μＬがＣ１に入れられ薄められ混合され、以下繰り返された。稀釈プレート１の各ウエルの内容物は、ピペットに出し入れすることにより混合した。ピペットチップは各列を混合した後に廃棄された。稀釈プレート１からの稀釈シリーズは下記に述べられた生菌カウント用の適切な寒天上でスポット平板培養された。

同様に、リカバリープレートの列Ｅの各ウエルからの１００μＬの内容物が、稀釈プレート２の列Ａへ転送された。リカバリープレートの列Ｈの各ウエルからの１００μＬの内容物が、稀釈プレート３の列Ａへ転送された。稀釈プレート１でのように、各々のための稀釈およびスポット培養が行なわれた。

各々の定量化プレート１−３は稀釈プレート１−３と同様に処理された。

寒天プレートはすべて、適切な温度で、および試験されているバクテリアのタイプを考慮した適切な時間で培養された。

各プレートはそれぞれ視覚的に検査された。他のコロニーとは視覚的に区別できるすべてのコロニーをコロニー形成単位（ＣＦＵ）として数え、様々な濃度での組成物の相対的効力を決定するために下記式の中で使用された：
ｌｏｇ_１０［１０^ｘ（ＣＦＵ／Ｖ_ｐｌ）（Ｖ_ｗ／Ａ_ｐｇ）］
Ｖ_ｐｌはμＬでの培養物体積、Ｖ_ｗは培養ウエルの体積（ここでは２００μＬ）、Ａ_ｐｇは蓋ペグの面積（ここでは４６．６３ｍｍ^２）、ｘはプレート列を示す整数（つまり列Ａは１、列Ｂは２、列Ｃは３、等など）である。１−５カラムの各々に対する平均値が決定され、ｌｏｇ低減が、処理していないペグの平均から処理されたペグの平均を引くことにより決定された。

確認のため、ペグＡ１２−Ｃ１２はそれらがきれいであることを保証するためにチェックされた。ペグＤ１２−Ｈ１２は回収された微生物の１０^４−１０^６のＣＦＵ／ｍｍ^２の存在を保証するためにチェックされた。カラム６は中和剤の有効性を保証するためにチェックされた。カラム７は中和剤の非毒性を保証するためにチェックされた。またカラム８は微生物の成長を保証するためにチェックされた。

例１：
耳用組成物
中耳の洗浄のためのおよそ１Ｌの溶液が、以下の組成物で調製された。
０．８ｇ／ｌの無水クエン酸、１９．１ｇ／ｌのトリナトリウムクエン酸塩二水和物、５０ｇ／ｌのエタノールおよび０．１５ｇ／ｌのリゾチーム。組成物は約２００ ｍＯｓｍ／Ｌの有効溶質濃度を有すると計算され、その測定されたｐＨは６．５だった。

ＭＢＥＣバイオフィルム・リアクターの中でテストした時に、５分の静的な適用時間で、この組成物は黄色ブドウ球菌で０．８ｌｏｇの低減および緑膿菌で２．２ｌｏｇの低減を示した。

例２：
鼻腔用組成物
鼻腔の中への導入のためのおよそ１Ｌの溶液が、以下の組成物で調製された。
０．７５ｇ／ｌの無水クエン酸、１４．２５ｇ／ｌのトリナトリウムクエン酸塩二水和物、１００ｇ／ｌのＤＭＳＯ、０．１５ｇ／ｌのリゾチーム、および５ｇ／ｌのラウリル硫酸ナトリウム。組成物は約２００ ｍＯｓｍ／Ｌの有効溶質濃度を有すると計算され、その測定されたｐＨは７．０だった。

ＭＢＥＣバイオフィルム・リアクターの中でテストした時に、５分の静的な適用時間で、この組成物は黄色ブドウ球菌で３ｌｏｇの低減を示した。

例３：
繊毛毒性試験（鼻腔） − 人間の副鼻腔の上皮細胞
培地中に沈められた浸透性のフィルターサポート上で成長された上皮組織を使用するＡＬＩモデルが、例２で使用された組成物が顕著な繊毛毒性を示すか否かを決定するためスクリーニングテストとして使用された。

副鼻腔の手術中に得られた臨床材料から得た粘膜の標本は、氷の上に置かれた食塩水中へ移された。ＡＬＩ培地は、例えばＭ．Ｒａｍａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，”Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｈｉｎｏｓｉｎｕｓｉｔｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ．”Ａｍ．Ｊ．Ｒｈｉｎｏｌ．，ｖｏｌ．２１，ｐｐ．３７３−７７（２００７）に記載された手順を使用して、ヒト組織から酵素的に分離された人間の副鼻腔の上皮細胞から作られた。

培地は適切な増殖ミディアムで組織培養フラスコ（７５ ｍＬ）中でコンフルーエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に育てられ、５日後に皮膜組織を分化させた。

Ｍ．Ｂ．Ａｎｔｕｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｕｒｉｎｅ Ｎａｓａｌ Ｓｅｐｔａ ｆｏｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ａｉｒ−Ｌｉｑｕｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，”ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｎｏ．４３，ｐｐ．１９５−２０４（２００７）に述べられた手続きによって調製された粘膜のサンプルは、グラス散布チェンバー内に置かれた。

各サンプルの端にある繊毛のビートが、水液浸６３倍の対物レンズおよび微分干渉顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．； Ｂａｎｎｏｃｋｂｕｒｎ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を使用して、エアテーブル上にセットされたライカＤＭＬＦＳＡ顕微鏡を使用して識別された。一旦繊毛のビートが観察されたならば、１００フレーム／秒のサンプリングレートでビデオが２秒間、高速モノクロデジタル・ビデオ・カメラ（Ｂａｓｌｅｒ ＡＧ； Ａｈｒｅｎｓｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で撮影され、圧縮と記憶のためにＰＣワークステーションへ送られた。このプロセスは１分間隔で繰り返された。５分のベースラインビート速度が決定され、例２の組成物の２０μＬが粘膜のサンプルの頂点の表面上にピペットで加えられ、ビデオ撮影が継続された。イメージ・ファイルは繊毛のビートを分析するためにカスタマイズされた仮想計測ソフトウェア（ｖｉｒｔｕａｌ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）で分析された。（この種のビデオ画像分析技術についてより詳細はＪ．Ｈ．Ｓｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ａｌｌ−ｄｉｇｉｔａｌ ｉｍａｇｅ ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ ｗｈｏｌｅ−ｆｉｅｌｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｉｌｉａｒｙ ｂｅａｔ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ，”Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｖｏｌ．２１１，ｐｐ．１０３−１１（２００３）を参照。

ターゲットとされた結果は、組成物はサンプルへの３０分間の暴露を通じて繊毛の少なくとも５０％がビートを続けた（活発なエリアで測定された）という発見だった。

試験の実際の結果は図４に示される。
ベースライン期間について、活発なエリアのメジアンは約２４．３％だった。一方、３０−３３分で測定された活発なエリアのメジアンは約１６．４％だった。従って、例２からの組成物はＡＬＩスクリーニングテストに合格したと認められた。

例２からの組成物に暴露した間の繊毛のビート周波数（ｂｅａｔ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）がさらに測定された。結果が図５に示される。ベースライン試験について繊毛ビートのメジアン周波数は約４６７０Ｈｚだった。その一方で３０−３３分間の暴露の溶液のメジアンは約３１６０Ｈｚだった。図５は、さらに繊毛ビート周波数が暴露の後に増加し続けることを示す。

例４：
繊毛毒性試験（鼻腔） − 外植片
例２からの鼻腔処理組成物は、３つの収穫されたマウス鼻中隔上でテストされた。（前記のＭ．Ｂ．Ａｎｔｕｎｅｓらに記述されたようにして収穫は行なわれた。）

収穫された隔膜の外植片はそれぞれ無菌のＰＢＳ内に保持された。グラス散布チェンバー （Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ； Ｈａｍｄｅｎ， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）内に置かれ、その後ナイロン・グリッド（１．５ｍｍ）で適所に保持された。その外側フレームは、散布チェンバーの内側へスナップ止めされた。外植片はそれぞれ２７．５℃から２８．５℃でテストされた。

３分のベースラインビート速度が決定された。外植片サンプルがそれぞれ例２からの鼻腔処理組成物へ３分間暴露された。

再び例３において使用されたビデオ画像分析技術が使用された。ベースライン期間および暴露後２７−３０分の繊毛ビート周波数のメジアンが下の表に示される。

暴露後の繊毛ビート周波数値は暴露前より大きく、外植片サンプルの繊毛への衰弱ダメージがないことを示した。

例５：
繊毛毒性試験（鼻腔） − 生体内
例２からの鼻腔処理組成物は、Ｓａｏ Ｐａｏｌｏ大学で生きたウサギの鼻腔中の繊毛の粘膜の表面上でテストされた。

Ｔａｍａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，”Ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ／ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｃｌｅａｎｓｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｎ ｒａｂｂｉｔ ｓｉｎｕｓ ｍｕｃｏｓａ，”Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｒｈｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ａｌｌｅｒｇｙ，ｖｏｌ．２３，ｎｏ．６，ｐｐ．５９７−６０１（２００９）に記載された方法を使用して、留置カテーテルが雌のニュージーランドホワイトラビットの上顎洞に入れられ、１０ｍＬの０．９％の生理食塩液あるいは１０ｍＬの例２からの処理組成物を、０．３３ｍＬ／秒の速度で上顎洞に入れ、その後吸引した。

テスト・ウサギは麻酔をかけられ、処理後１日あるいは７日のいずれかで殺した。７日間の時間枠は可能な長期的な繊毛消失の評価を許容する。１日間の時間枠は即時の繊毛消失の可能性を調べる一方、６日間での再生を評価する。（鼻腔繊毛は、失われてから４８時間以内にしばしば再生長する。）

左および右の上顎洞からの粘膜が収穫された。皮膜組織の形態的完全について電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）の走査により各粘膜サンプルが評価された。

ＳＥＭイメージの分析は、例２からの処理組成物の繊毛毒性が、１日および７日の後において生理食塩液のそれと同等か低いことを示した。

例６：
繊毛毒性試験、中耳
耳毒性試験はフロリダ大学医学部の中の耳咽頭学部によって、内部の動物取り扱い／試験手順の承認下に行われた。これは、実験動物の取り扱いおよび試験の国立衛生研究所のガイドラインに一致するものである。

少なくとも５日の順応期間の後に、８匹の成熟しているアルビノオスのモルモット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ； Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を、鈍い２７ゲージの無菌の針により鼓膜切開術を行った。十分な液体が注入され動物の中耳スペース（約０．２ｍＬ）を満たした。一方の耳はコントロール用の０．９％の食塩溶液で満たされ、他方の耳は例１からの処理組成物で満たされた。注入の後、各動物の背側頭骨が優しく軽く打たれ、動物の中耳および内耳の全体の完全な液体との接触を保証した。

試験動物のどれも、研究の間に前庭神経症の証拠を示さなかった。

各動物の蝸牛活動電位（Ｃｏｃｈｌｅａｒ ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）は、溶液注入の前、注入後の７日、注入後の２８日に測定された。Ｔ．Ｍ． Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，”Ｈｅａｒｉｎｇ ｌｏｓｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｐｅｄｏｔｏｍｙ ａｎｄ ｔｒｅａｔｅｄ ｏｔｉｔｉｓ ｍｅｄｉａ，” Ｏｔｏｌａｙｎｇｏｌ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．，ｖｏｌ．１３４（４），ｐｐ．６７４−７９（Ａｐｒｉｌ ２００６）に記述された蝸電図法（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｃｈｌｅｏｇｒａｐｈｙ）を使用した。蝸電図法のしきい値は、Ｔｕｃｋｅｒ−Ｄａｖｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ， Ｆｌｏｒｉｄａ）からのタッカー−デイビス・テクノロジーズからのソフトウェアおよび静電気スピーカー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｐｅａｋｅｒｓ）を使用して、聴覚の電気生理現象ワークステーションによって生成された、キャリブレートされたトーン・バーストについて測定された。刺激は動物の外耳道に置かれた挿入ヘッドホーンによって導入された。４ｋＨｚ、８ｋＨｚ、１６ｋＨｚおよび２４ｋＨｚの周波数のトーン・バーストが示された。１００ｄＢで始まって、可聴しきい値は、波形の消失まで５ｄＢのディクリメントで刺激強度を減少させることにより評価された。波形はそれぞれの試験された周波数／振幅の組み合わせで５１２のトーン・バーストへの応答について平均された。

各耳の聴力しきい値は、ペアの両側ｔ−検定（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．； Ｃａｒｙ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）を使用して比較された。有意水準はｐ＜０．０５で決定された。

これらの実験用において顕著な難聴は１０ｄＢの差であると考えられた。

液体の注入に先立った試験動物の平均の聴力しきい値は、図６に示される。
試験動物の液体注入の後の７日および２８日の間の平均聴力しきい値の変動は図７と８に示される。（棒は標準誤差を表わす。）

各場合では、処理間の聴力しきい値は、すべての頻度（ｐ＞０．０５）で異なっていなかった。

最終のヒアリング評価の後、外部の有毛細胞（ＯＨＣ）ロスを評価するために、ＳＥＭによってそれらの蝸牛殻を検査することができるように、動物はそれぞれ安楽死させられた。可能な場合、蝸牛殻は３つのすべてからイメージされた、つまり、基礎、中間、そして頂点。

複数のイメージの完全な分析は、コントロール食塩水を注入された耳と例１からの処理組成物を注入された中耳のＯＨＣロスの本質的な差がないことを明らかにした。

相対的なヒアリング・データおよびＳＥＭ分析の両方に基づいて、その報告書は、例１において使用された処理組成物は耳毒性を引き起こさないと結論を下した。確認のためにチンチラを使用する後続の研究を進めるために、この結果は、十分に信頼できると考えられた。

単純な組成物親和性パラメーター（相対的なエネルギー差（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＥＤ））は、相互作用半径（Ｒ_０）に対する計算されたＨＳＰ差（Ｒａ）の比（つまりＲＥＤ＝Ｒ_ａ／Ｒ_０）を表わす。ＲＥＤ＜１．０の場合、分子の可溶性は十分に類似しており、一方が他方を溶解する。ＲＥＤ＞１．０の場合には、分子の可溶性は、一方が他方を溶かすために十分には類似していない。ＲＥＤがほぼ１．０の場合、部分的な溶解が可能である。

Claims (20)

1. 動物の体の繊毛を含む領域への導入に適している抗菌性組成物であって、
   ａ） 水、および１つ以上の非水性の液体の少なくとも２％（ｗ／ｖ）を含む溶剤成分、および
   ｂ） 金属イオン封鎖剤、１％（ｗ／ｖ）以下の１つ以上の陰イオン界面活性剤、６≦ｐＨ≦８で活性な少なくとも１つ以上の酵素を含む溶質成分
   および、任意にバッファー前駆物質を含み、
   ６から８のｐＨを有し、４００ ｍＯｓｍ／Ｌ以下の有効溶質濃度を有する抗菌性組成物。
2. 前記組成物が２５０ ｍＯｓｍ／Ｌ以下の有効溶質濃度を有する、請求項１記載の組成物。
3. 前記組成物が２００ ｍＯｓｍ／Ｌ以下の有効溶質濃度を有する、請求項１記載の組成物。
4. 前記金属イオン封鎖剤が有機酸である、請求項１記載の組成物。
5. 前記金属イオン封鎖剤が有機ポリ酸である、請求項４記載の組成物。
6. 前記金属イオン封鎖剤がクエン酸である、請求項５記載の組成物。
7. 前記バッファー先駆物質が存在し、酸の塩を含む、請求項１記載の組成物。
8. 前記酸の塩がクエン酸のナトリウム塩である、請求項７記載の組成物。
9. 前記溶質コンポーネントが１つ以上の陰イオン界面活性剤を０．８％（ｗ／ｖ）以下で含む、請求項１記載の組成物。
10. 前記溶質コンポーネントが１つ以上の陰イオン界面活性剤を０．７％（ｗ／ｖ）以下で含む、請求項１から９のいずれか１項記載の組成物。
11. 前記溶質コンポーネントが１つ以上の陰イオン界面活性剤を０．５％（ｗ／ｖ）以下で含むことを特徴とする請求項１０記載の組成物。
12. 前記溶質コンポーネントが、陰イオン界面活性剤を含まない、請求項１１記載の組成物。
13. 前記１つ以上の酵素がリゾチームである、請求項１０記載の組成物。
14. 前記非水性の液体がＤＭＳＯを含む、請求項１から９のいずれか１項記載の組成物。
15. 前記１つ以上の酵素がリゾチームである、請求項１４の組成物。
16. 前記１つ以上の非水性液体がエタノールを含む、請求項１から９のいずれか１項記載の組成物。
17. 前記１つ以上の酵素がリゾチームである、請求項１６記載の組成物。
18. 前記１つ以上の酵素がリゾチームを含む、請求項１から９のいずれか１項記載の組成物。
19. 前記１つ以上の酵素がリゾチームである、請求項１から９のいずれか１項記載の組成物。
20. 動物の体の繊毛を含む領域への導入に適している抗菌性組成物であって、
    ａ） 水、およびエタノールとＤＭＳＯから選択される有機溶剤の少なくとも２％（ｗ／ｖ）からなる溶剤成分、および
    ｂ）有機ポリ酸、有機ポリ酸の塩、１％（ｗ／ｖ）以下の１つ以上の陰イオン界面活性剤、少なくとも０．００５％（ｗ／ｖ）のリボソームからなる溶質成分から本質的になり、
    ６から８のｐＨを有し、２５０ ｍＯｓｍ／Ｌ以下の有効溶質濃度を有する抗菌性組成物。