CN115279362A

CN115279362A - 用于手术部位感染和慢性创伤愈合的杀菌清创组合物

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Publication number: CN115279362A
Application number: CN202180020114.0A
Authority: CN
Inventors: M·比克拉姆-莱尔斯; C·弗洛雷克; D·A·阿姆布鲁斯特; S·谢赫; K·沃洛斯楚克
Original assignee: DePuy Synthes Products Inc
Current assignee: DePuy Synthes Products Inc
Priority date: 2020-03-09
Filing date: 2021-03-05
Publication date: 2022-11-01
Also published as: JP2023519168A; WO2021181234A1; US11826333B2; EP4117651A1; US20210275483A1; BR112022017985A2; EP4117651B1; CA3174713A1; AU2021233221A1

Abstract

本文提供了用于治疗生物膜来源的感染的组合物，该组合物包含浓度在约100ppm(份每百万份)至约1000ppm范围内的溶解于溶剂中的顺式‑单不饱和脂肪酸，其中组合物被构造成在将组合物施用于由细菌形成的生物膜时产生杀菌作用，该杀菌作用被测量为至少1.0的细菌的菌落形成单位(CFU)的对数下降。还提供了用于治疗生物膜来源的感染的部位的方法，该方法包括将如本文所公开的组合物施用于该部位。

Description

用于手术部位感染和慢性创伤愈合的杀菌清创组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求提交于2020年3月9日的美国临时申请62/986,997的优先权权益，该美国临时申请的全部内容以引用方式并入本文。

技术领域

本公开涉及对细菌生物膜具有杀菌作用的组合物。组合物包含浓度在约100ppm至1000ppm范围内的顺式-单不饱和脂肪酸，诸如顺式-2-链烯酸。组合物还可包含一种或多种抗生素药物。本公开另外描述了使用这些组合物进行治疗的方法。

背景技术

由于在身体中形成细菌生物膜引起的感染是巨大医疗费用和高发病率的原因。

矫形植入物相关感染的主要细菌诱因之一是金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，该金黄色葡萄球菌在植入的装置以及周围组织上均形成生物膜。医疗装置上的已建立的生物膜可能具有有害作用，该有害作用包括手术干预和继发性并发症。生物膜相关感染通常耐受全身性水平的抗微生物剂。

慢性创伤是在3个月后上皮不会再生的创伤(参见Pourmoussa,A.等人(2016).Anupdate and review of cell-based wound dressings and their integration intoclinical practice.Annals of Translational Medicine,4(23),457-66)。在美国，超过400万名患者罹患慢性创伤，费用超过500亿美元。慢性创伤的病理生理学包括持续性感染、失控性炎症、耐药性微生物生物膜和真皮和/或表皮细胞响应于修复性刺激的能力的损失。

在这两种情况下，细菌感染导致细菌附着到装置或创伤的表面，这最终导致生物膜的形成。生物膜本质上耐受抗生素，并且已经报道了对于生物膜表型中的细菌，需要比其浮游对应物高10倍至1000倍的治疗浓度来根除病原体，这在临床上是无法达到的，因为此类剂量水平极大地超出那些药物的最大有效浓度(MEC)(参见Olsen I.(2015).Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance.Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.,34(5),877-886)。因此，除抗生素之外，通常需要手术干预来治疗受感染的部位。生物膜内的细胞嵌入水合保护性细胞外聚合物(EPS)内。一种治疗细菌感染的方法是尝试和拆除EPS/生物膜并将内在物分散到其浮游状态，从而恢复其对处于低于MEC的可接受范围内的全身性治疗水平的抗微生物剂的易感性。

已经尝试通过清创和分散剂来破坏生物膜。清创是一种促进创伤愈合和管理的方式。清创是从创伤中去除碎片(非活体材料、异物、可见生物膜和不良愈合组织)，从而促进成粒、收缩、上皮形成和愈合的过程(参见Payne,W.G.等人(2008).Enzymatic DebridingAgents Are Safe in Wounds With High Bacterial Bioburdens and StimulateHealing.EPlasty-Journal of Plastic Surgery,8(e7),151-156)。因此，清创的过程可有助于破坏来自感染部位的生物膜以促进组织愈合。

清创的最常见形式是手术切除，这可能受到不良患者候选人的限制。另选的清创选项可包括机械清创，诸如湿到干敷料或压力冲洗；自溶清创，其中封闭敷料允许创伤蛋白酶液化坏死组织；生物清创，诸如蛆虫疗法；和酶促清创，该酶促清创利用诸如胶原酶或木瓜蛋白酶-尿素的药剂。

可单独使用或与清创结合使用的另一种方法是使用细菌分散剂，该细菌分散剂可以生物化学方式破坏生物膜以从其保护性环境释放细菌并帮助修复抗微生物易感性。可提供细菌分散的一类化合物是顺式-单不饱和脂肪酸，诸如顺式-2-链烯酸。属于已证实为有效生物膜破坏剂的这类顺式-单不饱和脂肪酸的脂肪酸包括顺式-2-癸烯酸、顺式-9-十八碳烷酸(油酸)和顺式-11-甲基-2-十二碳烯酸(参见Rabin,N.等人(2015).Agents thatinhibit bacterial biofilm formation.Future Medicinal Chemistry,7(5),647-71；Worthington,R.J.等人(2012).Small molecule control of bacterial biofilms,OrgBiomol Chem.,10(37),7457-7474)。已证实油酸通过抑制细菌粘附来抑制金黄色葡萄球菌的生物膜形成(参见Stenz,L.等人(2005).Impact of oleic acid(cis-9-octadecenoicacid)on bacterial viability and biofilm production in Staphylococcusaureus.FEMS Microbial.Lett.,287(2),149-155)。顺式-2-癸烯酸由铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)产生并且已证实能在包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和酵母白色念珠菌(C.albicans)在内的许多细菌物种和界中使已建立的生物膜分散(参见Rabin,N.等人(2015)—引用以上全文)。并且已证实顺式-11-甲基-2-十二碳烯酸通过野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)分解细胞絮凝物(参见Dow,JM等人(2003).Biofilm dispersalin Xanthomonas campestris is controlled by cell-cell signaling and isrequired for full virulence to plants.Proc.Natl.Acad.Sci.,100(19),10995-1000)。此外，研究已证实，浓度低至约2.5nM的顺式-2-癸烯酸也能够分散生物膜(参见Davies,D.G.和Marques,C.N.(2009).A fatty acid messenger is responsible forinducing dispersion in microbial biofilms.J Bacteriol.,191,1393-1403)。

然而，尽管这些选项，由于病理生理问题，创伤护理管理仍然是一项挑战，并且因此开发生物膜感染的新的且有效的治疗仍然是医疗保健的需要。

发明内容

本公开中描述的组合物是独特的，因为它们旨在靶向生物膜相关细菌而不是浮游细菌。生物膜来源的感染仍然是创伤清创和愈合的主要挑战。目前，存在有限的清创助剂，该清创助剂能够有效地靶向生物膜相关且多药物耐药性细菌，并且因此本公开的组合物可代表对当前护理标准的改进。

因此，本公开涉及用于抑制和治疗生物膜来源的感染的新杀菌组合物。根据本公开的实施方案，用于治疗生物膜来源的感染的组合物包含浓度在约100ppm(份每百万份)至约1000ppm范围内的溶解于溶剂中的顺式-单不饱和脂肪酸，其中组合物被构造成在将组合物施用于由细菌形成的生物膜时产生杀菌作用，该杀菌作用被测量为至少1.0的细菌的菌落形成单位(CFU)的对数下降。在某些实施方案中，本文所述的组合物可另外包含一种或多种抗生素药物。

根据本公开的另外的实施方案，描述了一种治疗生物膜来源的感染部位的方法，该方法包括以下步骤：识别包括生物膜的部位，以及将本公开的杀菌组合物施用于该部位。

根据本公开的附加的实施方案，描述了一种在创伤或手术部位处抑制生物膜形成的方法，该方法包括以下步骤：识别易受生物膜来源的感染的创伤或手术部位，以及施用本公开的杀菌组合物。

附图说明

图1提供了脂肪酸分散剂对浮游细菌和生物膜细菌的作用的示意图。

图2A至图2C提供了在316L不锈钢基尔希纳钢丝上生长的48小时生物膜在50倍(图2A)、500倍(图2B)和5000倍(图2C)放大率下的SEM图像。

图3A示出了不同浓度的CDA对浮游细菌的作用的测试结果，其中将几种不同浓度(800ppm、400ppm、200ppm、100ppm、50ppm、25ppm、12.5ppm和6.25ppm)的CDA放置在盛有浮游金黄色葡萄球菌的小瓶中。

图3B描绘了其中将10μL标记为“800”(参见图3A)的管接种到TSA-L琼脂板上的程序的结果，该程序示出在将管温育24小时后菌落的生长。

图3C提供了在生长48小时的金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)生物膜的24小时治疗后CDA的剂量-响应数据。

图4提供了在生长48小时的金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)生物膜的24小时治疗后CDA的呈条形图形式的剂量-响应数据。

图5A至图5B和图6A至图6B描绘了研究的结果，该研究涉及在具有生长48小时的成熟生物膜的基尔希纳钢丝上测量与庆大霉素、头孢唑啉和万古霉素组合的浓度为400ppm的CDA的活性。

具体实施方式

在本文档中，除非另外指明，否则术语“一个”或“一种”用于包括一个/种或多于一个/种，并且术语“或”用于指非排他性的“或”。此外，应当理解，本文所采用的措辞或术语在未以另外的方式定义的情况下，仅用于描述的目的而非进行限制。当表示值的范围时，另一个实施方案包括从一个具体的值和/或到其他具体的值。相似地，当前面用“约”将值表示为近似值时，应当理解，该值的具体值构成了另一个实施方案。所有范围均包括端值在内并且可组合。另外，对范围中所述的值的引用包括该范围内的每一个值。还应当理解，为了清楚起见，本文在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。相反地，本发明的各种特征为简明起见在单个实施方案的上下文中进行了描述，也可以分开提供或以任何子组合形式提供。

如本文所用，“对数下降”或其变型意指未经处理的生物膜和已施用测试组合物的生物膜之间的菌落形成单位(CFU)数的对数值差异。换句话讲，对数下降＝log CFU(生物膜)–log CFU(经处理的生物膜)。

根据本公开的实施方案，用于治疗生物膜来源的感染的组合物包含浓度在约100ppm至约1000ppm范围内的溶解于溶剂中的顺式-单不饱和脂肪酸，其中组合物被构造成在将组合物施用于由细菌形成的生物膜时产生杀菌作用，该杀菌作用被测量为至少1.0的细菌的菌落形成单位(CFU)的对数下降。预期本文所述的组合物对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌两者以及某些真菌(特别是酵母，诸如白色念珠菌)有效。

根据本公开的优选实施方案，顺式-单不饱和脂肪酸是顺式-2-链烯酸。根据仍另外的优选实施方案，顺式-2-链烯酸是顺式-2-癸烯酸(CDA)、顺式-9-十八碳烷酸(油酸)或顺式-11-甲基-2-十二碳烯酸或它们的任何组合。在一个最优选的实施方案中，顺式-2-链烯酸是CDA或包括CDA的组合。

根据本公开的实施方案，顺式-单不饱和脂肪酸溶解于溶剂中。用于溶解顺式-单不饱和脂肪酸的合适的溶剂是已知的，并且可由本领域技术人员容易地确定。优选的溶剂是美国食品和药物管理局已经批准为安全地用于人类中的溶剂。示例性溶剂可包括二甲基亚砜(DMSO)和乙醇。

根据本公开的实施方案，组合物中的顺式-单不饱和脂肪酸的浓度在约100ppm至约1000ppm的范围内。ppm的使用意在指示组合物中的溶质的浓度。例如，浓度可在约100ppm至约800ppm、约200ppm至约800ppm、约200ppm至约500ppm、约200ppm至约400ppm、约400ppm至约500ppm、约400ppm至约800ppm、约400ppm至约1000ppm、约500ppm至约1000ppm和约500ppm至约800ppm的范围内，并且包括以上列出范围的起点或终点中的任一者的特定浓度。

根据本公开的实施方案，组合物可另外包含一种或多种抗生素药物。抗生素药物可以下列浓度存在：约1ppm至约15ppm的浓度范围，例如在约1ppm至约10ppm、约1ppm至约5ppm、约5ppm至约10ppm或约10ppm至15ppm范围内的浓度，包括以上列出范围的起点或终点中的任一者的特定浓度。

根据某些实施方案，抗生素药物来自氨基糖苷类、头孢菌素类或糖肽类抗生素或它们的组合，诸如例如庆大霉素、头孢唑啉、万古霉素或它们的组合。

根据本公开的某些实施方案，组合物在其包含抗生素药物时的对数下降比包含抗生素药物但不存在顺式-单不饱和脂肪酸的组合物的对应对数下降大在2.0至6.5范围内的值。

根据某些实施方案，所治疗的感染部位包括已经生长至少48小时的成熟生物膜。不受任何特定理论的束缚，据信生物膜的稳健性(即其对传统全身性抗生素治疗的抗性)与生物膜的成熟度成正比。在某些实施方案中，生物膜附着到活组织(例如，骨骼、肌肉、皮肤、筋膜等)的表面。在某些附加的实施方案中，一个或多个植入式医疗装置位于感染部位处，并且生物膜附着到植入式医疗装置的外表面。

根据本公开的实施方案，组合物产生在至少约4.0至约8.0范围内，例如在约4.0至6.0、约6.0至约8.0、约4.0至约5.0、5.0至约8.0、约5.0至约6.0范围内的对数下降，包括以上列出范围的起点或终点中的任一者的特定对数下降值。在某些实施方案中，对数下降值为至少4.5。

根据某些实施方案，对数下降值是在生物膜已经暴露于本公开的组合物达至少12小时之后的对数下降值。在某些另外的实施方案中，对数下降值是在生物膜已经暴露于本公开的组合物达至少24小时之后的对数下降值。在某些实施方案中，对数下降值是在生物膜已经暴露于本公开的组合物达至少1小时之后的对数下降值。

所提出的作用机制

基于当前文献，所公开的组合物对生物膜的杀菌作用是意料不到的结果。不受任何特定理论的束缚，并且如将在以下实施例中所示，本发明人提出以下作用机制，由此脂肪酸在单独地和作为与抗生素组合的辅助剂两种情况下均表现出杀菌作用。

在浮游表型或野生型表型中，Mirani等人已证实，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)表达一种被命名为脂肪酸修饰酶(FAME)的细胞外酶(参见Mirani Z.A.等人(2016).Antibacterial fatty acids destabilize hydrophobic and multicellularaggregates of biofilm in S.aureus.The Journal of Antibiotics,1-7)。FAME通过这些脂肪酸在温育6小时至12小时时酯化为胆固醇而使这些脂肪酸的杀菌活性失活。然而，在至少48小时的稳健成熟生物膜中，可能由于先前浮游细菌在生物膜内处于休眠状态而不能使FAME失活的事实，因此未检测到FAME。因此，它们变得更易受本文所述类型的脂肪酸的抗菌作用的影响。

此外，已知脂肪酸由于其两亲性结构而具有洗涤剂样特性(参见Desbois,A.P.和Smith,V.J(2010).Antibacterial free fatty acids:activities,mechanisms ofaction and biotechnological potential.Applied Microbiol.Biotechnol.,85(6),1629-42)。该生物化学结构使得脂肪酸能够与细胞膜相互作用以产生具有可变大小的孔，该孔可能是暂时的或永久性的，这可增强对抗生物膜的传统抗生素功效。另外，在高浓度下，这些脂肪酸可溶解可能导致裂解的膜。可有助于细菌在生物膜中的细胞抑制或死亡的另外的设想作用机制包括生成毒性过氧化产物和自氧化产物、抑制酶活性和营养物质摄入受损。

因此，在浮游状态下，FAME由能够将脂肪酸诸如CDA转化为不对细菌有害的胆固醇的非活性分子的细菌产生。这在图1中示意性地表示。另外，研究已证实使脂肪酸作用于浮游细菌的相对高的最小抑制浓度(MIC)数据。然而，在生物膜状态中，细菌不会产生FAME并且自身无法免受脂肪酸的影响。本发明人已经发现，在生物膜相关细菌的存在下，脂肪酸在某些有利的浓度范围内可杀菌。在抗生素的存在下，该作用可被扩大，例如在由脂肪酸在细菌的细胞壁中产生孔的情况下，该细胞壁使得抗生素能够进入，并由此允许脂肪酸充当辅助剂。

在本公开的某些实施方案中，组合物可作为溶液施用，或者可以组合物被包封在脂质体或胶束中的形式施用。

根据本公开的另外的实施方案，公开了一种用于在感染部位处治疗生物膜来源的感染的治疗方法，该治疗方法包括识别包括生物膜的部位，以及将如本公开中所述的组合物施用于该部位。所述方法可包括将组合物一次性施用于感染部位。另选地，该方法可包括将组合物多次施用于感染部位。

根据某些实施方案，该方法还可包括对生物膜的至少一部分进行清创。清创技术是本领域已知的，并且上文已经描述了此类技术的示例。

在某些实施方案中，感染部位是慢性创伤感染的部位或手术部位。示例性手术部位可包括例如其中团块诸如囊肿或肿瘤已被切除或以其他方式去除的部位，或者可以是其中已经插入植入式医疗装置的部位，并且包括其中皮肤已经打开，从而将组织暴露于环境并且因此暴露于潜在病原体的任何普通手术切口部位。

在感染部位处包括植入式医疗装置的实施方案中，该方法还可包括将组合物施用于医疗装置的外表面，并且包括将组合物施用于医疗装置周围的组织。

在本公开的实施方案中，施用组合物的步骤可包括首先将组合物施用于吸收性材料(诸如例如，纱布、创伤敷料、海绵等)，并且然后，将吸收性材料随后施用于感染部位或以其他方式与感染部位接触。另选地，可首先将吸收性材料放置在感染部位处，并且然后，可例如通过常见冲洗技术将组合物随后施用于吸收性材料。吸收性材料的使用可通过在感染部位处提供组合物的贮存器来提供某些优点，并且防止例如因冲洗技术或因流向感染部位的血流量增加而可能发生的组合物远离感染部位快速迁移。

根据本公开中所述的实施方案，另一种附加治疗方法可包括在预防性步骤中，诸如例如，在特定创伤或手术部位处于被生物膜来源的感染而感染的风险的情况下利用组合物。此类方法涉及在创伤或手术部位处抑制生物膜形成，而不是进行治疗。这些方法可包括识别易受生物膜来源的感染的创伤或手术部位，以及施用如本公开中所述的组合物的实施方案。

根据涉及手术部位的某些实施方案，手术部位被设计成接纳植入式医疗装置，并且该方法还包括将医疗装置植入手术部位的步骤。在某些实施方案中，可在装置植入之前，或者另选地在装置已经植入之后，将组合物施用于该部位。该方法还可包括将组合物施用于医疗装置的外表面。在某些实施方案中，在将医疗装置植入手术部位之前，将组合物施用于医疗装置的外表面，并且在另选的实施方案中，在将装置植入手术部位之后，将组合物施用于医疗装置的外表面。

实施例

利用矫形植入物的示例性临床清创程序

本公开的杀菌组合物可与手术清创过程组合使用。在矫形植入后识别出感染时，外科医生可执行手术或锐器清创，从而以无差别的方式切除坏死组织，该手术或锐器清创去除如本领域中已知的死组织和活组织两者(参见Demidova-Rice,T.A.ET AL.(2012).Acute and Impaired Wound Healing:Pathophysiology and Current Methods forDrug Delivery,Part 1:Normal and Chronic Wounds:Biology,Causes,and Approachesto Care.Adv Skin Wound Care,25(7),304-314)。本公开的组合物可用作清创助剂，以清洗手术区域并增强组织中和组织周围生物膜的靶向清创。例如，CDA可用于特异性靶向生物膜相关细菌以及对健康组织具有有限毒性的多药物耐药性细菌。

示例性脂肪酸

在以下实施例中，除非另有说明，否则顺式-2-癸烯酸(CDA)作为来自先前描述的一类已示出为可能的细菌分散剂的顺式-2-链烷酸的代表性化合物用于测试。CDA作为分散剂或清创助剂单独测试，并且也与抗微生物药物组合测试。在接种有成熟生物膜的代表性医疗装置上进行测试。以下测试的目的是测量单独的CDA以及辅助剂与常见一线抗生素的作用。

成熟生物膜生长

在以下实施例中，除非另有说明，否则对生长48小时的金黄色葡萄球菌(ATCC25923)的成熟生物膜进行测试。生物膜的示例性制备如下：

通过在250rpm下的37℃振荡器中温育，在20mL的商业胰酶大豆液体培养基(TSB)中制备浓度为10⁹CFU/mL的金黄色葡萄球菌的过夜种菌；

读取过夜培养物的稀释储备液的OD600读数，以采用吸光度方法确定储备液浓度；

用血清移液管用力地上下抽吸以打碎菌落团块，使用0.3％(重量/体积)TSB将细菌浓度从储备液浓度调整至10⁵CFU/mL；

在TSA-L板上一式三份接种以下稀释液，以确定细胞的初始储备液浓度：10²CFU/mL；

使用血清移液管将7mL种菌添加到每个含有基尔希纳钢丝的15ml管中，确保在添加之前再次用力地上下抽吸；

将管放置在30℃下的旋转器上；

8小时后，将盖子拧开，并用缝合线将盖子转移至盛有7mL的0.3％TSB的新管中，并在振荡器-温育箱中再温育44小时，以使生物膜在40RPM培养下生长；

在此期间，通过将盖子拧开并转移至盛有7mL TSB的新管中，每天更换培养基2次。

基尔希纳钢丝制备

在以下实施例中，除非另有说明，否则316L不锈钢基尔希纳钢丝用作示例性植入式医疗装置。

用#600砂纸(沿长度约10倍)使新的基尔希纳钢丝变粗糙，然后用去离子水冲洗。然后将经冲洗的基尔希纳钢丝完全浸入约49℃下的10％柠檬酸(重量/体积)浴中达20分钟，以钝化不锈钢的表面，以防止后续的腐蚀。从浴中取出后，然后用去离子水冲洗基尔希纳钢丝。然后洗涤基尔希纳钢丝并通过高压灭菌法灭菌。

在基尔希纳钢丝上形成生物膜的准备和后续CFU计数方法

将基尔希纳钢丝固定到管盖，并且放置在以初始种菌浓度(10⁵CFU/mL)接种并且生长24小时至48小时的管中。大概每隔8小时更换培养基。生长后，所接种的基尔希纳钢丝可供测试。

在暴露时间结束后，处理孔样品和清创的基尔希纳钢丝两者，并且将剩余的细菌细胞接种并计数。对于孔中的培养基，将样品以3000rpm离心10分钟并去除上清液。将细胞重悬于10mL 1×PBS缓冲液中。将此洗涤步骤重复第2次，并且再次将细胞重悬于最终体积为1.5mL的中和缓冲液中，稀释并且用凝集素(TSA-L)琼脂板接种在胰酶大豆琼脂上。对于基尔希纳钢丝，把将基尔希纳钢丝固定在管中的盖取下并转移至盛有10mL1×PBS的管中，并且将管倒置。将具有基尔希纳钢丝的盖再次转移至盛有PBS的另一管中，并且重复该步骤。在将基尔希纳钢丝洗涤2次后，将它们转移至盛有中和缓冲液的管中并涡旋，然后超声处理达10分钟。然后将细胞稀释并接种在TSA-L琼脂板上。

基尔希纳钢丝上的示例性成熟生物膜

图2A至图2C描绘了根据上文概述的程序在基尔希纳钢丝上生长的成熟生物膜在扫描电镜(SEM)下的表征形态。

对成熟生物膜的全身性庆大霉素测试

作为初步测试，使根据上文概述的程序生长的成熟生物膜经受大约10ppm(10mcg/ml)剂量的庆大霉素，该剂量是普遍认可并接受的最大全身性浓度1mcg/ml的大约10倍。[数据未示出]。测试示出，成熟生物膜耐受庆大霉素剂量。

CDA对浮游细菌的作用

作为附加测试，将几种不同浓度(800ppm、400ppm、200ppm、100ppm、50ppm、25ppm、12.5ppm和6.25ppm)的CDA放置在盛有浮游金黄色葡萄球菌的小瓶中。小瓶可见于图3A中。两个对照在右侧上且未标记(分别为细菌/无脂肪酸和无脂肪酸/无细菌)。文献报告，浓度≥500ppm的CDA抑制MRSA的生长，并且125ppm的CDA抑制生物膜形成(参见Jennings J.A.等人(2012).Cis-2-decenoic Acid Inhibits S.aureus Growth and Biofilm In Vitro:APilot Study.Clin Orthop Relat Res.,470,2663–2670)。该测试是定性的，并且基于测试小瓶中是否存在可观察到的细菌。在图3A中，可以看出，仅盛有800ppm CDA的测试小瓶含有透明流体，而其他管都是浑浊的，指示活性细菌的存在。该测试结果表明，对于浮游细胞，CDA的最小抑制浓度(MIC)为800ppm，显著高于文献中所提出的。

另外，即使在该升高的浓度下，也发现CDA是抑菌的，而不是杀菌的。这在其中将10μL标记为“800”(图3A)的管接种到TSA-L琼脂板上的后续程序中得以证实，该后续程序示出在将管温育24小时后菌落的生长，如图3B所示。

因此，即使在800ppm的MIC下，CDA也未示出为杀菌的，而是相对于浮游细菌抑菌的。此外，CDA浓度为400ppm的CDA样品示出在管中具有可见的生长，这表明对金黄色葡萄球菌无毒性或具有有限的毒性。

CDA分散剂对成熟生物膜的作用

如前所述，文献表明，浓度低至2.5nM的CDA在分散生物膜方面是有效的。然而，在当前测试方案的成熟生物膜经受浓度比文献中所提出的大100倍(约0.05ppm，310nM)的CDA时，未观察到所观察到的生物膜分散。该测试表明，如文献中报道的CDA和可能的其他已知分散剂的所认可作用部分地由所处理的生物膜的稳健性决定。

实施例1(CDA剂量响应)

用在5％DMSO溶液中具有各种浓度的CDA对成熟生物膜进行剂量响应研究。CDA以50ppm、100ppm、200ppm、300ppm和400ppm的浓度进行测试。在24小时的时间段内将成熟生物膜暴露于CDA以测量脂肪酸的功效。

图3C中的条示出了在暴露于CDA 24小时后的细菌连同a)仅生物膜和b)生物膜+5％DMSO的对照的Log CFU计数/ml，以便说明DMSO的任何作用。图3C中的线表示CFU计数的对数下降(生物膜对照的Log CFU计数-CDA样品的Log CFU计数＝对数下降)。图4还示出了相同的对数下降值，但以条形图形式示出。

令人惊讶的是，数据示出CDA不仅充当分散剂，而且实际上对生物膜具有杀菌作用。甚至更出乎意料的是，在浓度大于100ppm时CDA的杀菌作用中存在明显的峰值，并且在浓度为200ppm或更大时CFU的对数下降大于4倍。

实施例2(CDA+抗生素)

基于来自实施例1的结果，在具有生长48小时的成熟生物膜的基尔希纳钢丝上测量与庆大霉素、头孢唑啉和万古霉素组合的浓度为400ppm的CDA的活性。

生长后，将生物膜洗涤并用脂肪酸和/或抗微生物剂处理以确定剂量响应和辅助剂作用。此后，将样品的孔稀释并接种以确定与对照相比的分散水平。将基尔希纳钢丝洗涤，超声处理以去除任何残留细胞，并且接种样品以确定CFU/mL。如在图5A至图5B中可见，用辅助剂处理基尔希纳钢丝在医疗装置上产生分别与庆大霉素、头孢唑啉和万古霉素组合的细菌的4.9、5.9和4.7的对数下降。此外，如图6A至图6B所示，对于庆大霉素、头孢唑啉和万古霉素，脂肪酸辅助剂分别导致孔中的细菌的6.3、7.8和5.3的显著对数下降。

实施例3(1小时CDA/头孢唑啉)

本研究的目标是确定利用CDA的辅助杀伤作用和治疗药物浓度，CDA和头孢唑啉的组合是否可快速地对受污染的清创创伤部位起作用。使生物膜在30℃下生长，并在本研究中使用用于先前研究中的相同0.3％(重量/体积)培养基。使生物膜生长48小时，然后经历机械“清创”过程。进行这种清创以模拟受感染创伤部位的清创。在物理去除可视生物膜之后，将基尔希纳钢丝暴露于400ppm CDA、10ppm头孢唑啉或两者的组合，达一小时(相比于其中暴露达24小时的先前研究)。单独地，使用较高浓度(大约800ppm)的CDA对未经处理的(即未清创的)生物膜进行测试。如上文在先前实施例中所述的，该CDA浓度被确定为ATC 25923浮游细胞的MIC值。

将孔的内容物和基尔希纳钢丝上的细菌稀释并接种以确定CFU/mL。简而言之，将基尔希纳钢丝固定到管盖，并且放置在以初始种菌浓度(10⁵CFU/mL)接种并且生长24小时至48小时的管中。大概每隔8小时更换培养基。生长后，将生物膜暴露于CDA和头孢唑啉的组合达60分钟。

在暴露时间结束后，处理孔样品和清创的基尔希纳钢丝两者，并且将剩余的细菌细胞接种并计数。对于孔中的培养基，将样品以3000rpm离心10分钟并去除上清液。将细胞重悬于10mL 1×PBS缓冲液中。将此洗涤步骤重复第二次，并且再次将细胞重悬于最终体积为1.5mL的中和缓冲液中，稀释并且用凝集素(TSA-L)琼脂板接种在胰酶大豆琼脂上。对于基尔希纳钢丝，把将基尔希纳钢丝固定在管中的盖取下并转移至盛有10mL1×PBS的管中，并且将管倒置。将具有基尔希纳钢丝的盖再次转移至盛有PBS的另一管中，并且重复该步骤。在将基尔希纳钢丝洗涤2次后，将它们转移至盛有中和缓冲液的管中并涡旋，然后超声处理达10分钟。然后将细胞稀释并接种在TAS-L琼脂板上。

下面是更详细概述的程序。

程序：

通过在250rpm下的37℃振荡器中温育，在20mL的商业TSB中制备浓度为10⁹CFU/mL的金黄色葡萄球菌的过夜种菌。

读取过夜培养物的稀释储备液的OD600读数，以采用吸光度方法确定储备液浓度。

使用0.3％(重量/体积)TSB将细菌浓度从储备液浓度调整至10⁵CFU/mL，确保用血清移液管用力地上下抽吸以打碎菌落团块。

在TSA-L板上一式三份接种以下稀释液，以确定细胞的初始储备液浓度：10²CFU/mL。

使用血清移液管将7mL种菌添加到每个含有基尔希纳钢丝的15ml管中，确保在添加之前再次用力地上下抽吸。

将管放置在30℃下的旋转器上。

8小时后，将盖子拧开，并用缝合线将盖子转移至盛有7mL的0.3％TSB的新管中，并在振荡器-温育箱中再温育44小时，以使生物膜在40RPM培养下生长。

在此期间，通过将盖子拧开并转移至盛有7mL TSB的新管中，每天更换培养基2次。生长48小时后，继续进行生物膜的清创和暴露。

暴露于CDA和/或头孢唑啉：

将基尔希纳钢丝转移至盛有10mL 1×PBS的新管中，将其倒置两次，并重复相同的步骤并通过倒置2次重复又一次PBS洗涤，总共2次洗涤。

洗涤后：

将具有清创生物膜的盖转移至盛有仅10mL的0.1％_TSB与DMSO的新管中。

将具有清创生物膜的盖转移至盛有10mL的0.1％TSB+400ppm浓度的CDA+5％DMSO的新管中。

将具有清创生物膜的盖转移至盛有10mL的0.1％TSB+10ppm浓度的头孢唑啉的新管中。

将具有清创生物膜的盖转移至盛有10mL的0.1％TSB+10ppm浓度的头孢唑啉+400ppm CDA+5％DMSO的新管中。

将具有全生物膜的盖转移至盛有10mL的0.1％TSB+10ppm浓度的头孢唑啉+800ppmCDA+5％DMSO的新管中。

将所有盖和管在设定为40RPM的旋转器上(水平地)在21℃下温育达60分钟。选择较低的培养基浓度和室温以降低样品的孔中的浮游细胞增殖，以便更好地分离分散剂的作用。

用铝箔覆盖样品，因为CDA是光敏的。如果位于旋转器上，则用箔覆盖整个振荡器-温育箱。

在暴露时间之后，将具有钢丝的盖转移至盛有1×PBS的新管中，并且洗涤2次以去除任何CDA。

对于基尔希纳钢丝，转移至盛有中和缓冲液的管中，涡旋达10秒。在冰上超声处理达15分钟。使用橡胶刮棒从基尔希纳钢丝的表面去除所有生物膜。用1mL中和缓冲液冲洗每根基尔希纳钢丝，然后用另外1mL中和缓冲液冲洗橡胶刮棒。稀释细菌并接种细胞以确定CFU/mL。

对于孔，将管以3000rpm离心达10分钟。去除上清液并将细胞重悬于10mL 1×PBS中。重复离心和细胞重悬于10mL 1×PBS中，并且然后最终将细胞重悬于1.5mL中和缓冲液中。然后稀释细菌并接种细胞以确定CFU/mL。结果在下表1和表2中示出。

表1：基尔希纳钢丝测试

表2：孔测试

Claims

1.一种用于治疗细菌生物膜介导的感染的组合物，所述组合物包含：

顺式-单不饱和脂肪酸，所述顺式-单不饱和脂肪酸溶解于溶剂中并且具有在约100ppm至约1000ppm范围内的浓度；

其中所述组合物被构造成在将所述组合物施用于由所述细菌形成的生物膜时产生杀菌作用，所述杀菌作用被测量为至少1.0的细菌的菌落形成单位(CFU)的对数下降。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述顺式-单饱和脂肪酸的浓度在约200ppm至约500ppm的范围内。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述顺式-单饱和脂肪酸的浓度在约200ppm至约400ppm的范围内。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述顺式-单饱和脂肪酸的浓度在约400ppm至约800ppm的范围内。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述顺式-单饱和脂肪酸的浓度为约400ppm。

6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述顺式-单饱和脂肪酸是顺式-2-链烯酸。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述顺式-2-链烯酸是顺式-2-癸烯酸(CDA)、顺式-9-十八碳烷酸(油酸)或顺式-11-甲基-2-十二碳烯酸或它们的组合。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述顺式-2-链烯酸是CDA。

9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述组合物包含CDA和以下中的至少一种的组合：顺式-9-十八碳烷酸(油酸)或顺式-11-甲基-2-十二碳烯酸。

10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述溶剂是二甲基亚砜(DMSO)、氯仿、二甲基甲酰胺(DMF)或乙醇或它们的混合物。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述溶剂是DMSO。

12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物还包含抗生素药物。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物中的所述抗生素药物的浓度在约1ppm至约15ppm的范围内。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述抗生素药物的组成在约5ppm至约10ppm的范围内。

15.根据权利要求12所述的组合物，其中所述抗生素药物是氨基糖苷、头孢菌素或糖肽类抗生素或它们的组合。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述抗生素药物是庆大霉素、头孢唑啉或万古霉素或它们的组合。

17.根据权利要求12至16中任一项所述的组合物，其中所述组合物的对数下降相比于包含所述抗生素药物但不存在所述顺式-单饱和脂肪酸的组合物的对数下降在大于2.0至大于6.5的范围内。

18.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述生物膜是已经生长约48小时的成熟生物膜。

19.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述生物膜附着到植入式医疗装置的外表面。

20.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述对数下降在所述生物膜已经暴露于所述组合物达在12小时至36小时范围内的时间段之后为至少4.0。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述对数下降为至少4.5。

22.根据权利要求20所述的组合物，其中所述组合物具有在至少约4.0至约8.0范围内的对数下降。

23.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物被包封在脂质体或胶束中。

24.一种治疗生物膜来源的感染部位的方法，所述方法包括：

识别包括生物膜的部位；以及，

将根据权利要求1至23中任一项所述的组合物施用于所述部位。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述部位是慢性创伤感染部位。

26.根据权利要求24所述的方法，其中所述部位是手术部位。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述手术部位包括植入式医疗装置。

28.根据权利要求27所述的方法，其中施用的步骤包括将所述组合物施用于所述医疗装置的外表面。

29.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中所述施用的步骤包括将所述组合物施用于吸收性材料并且使所述吸收性材料与所述部位接触。

30.根据权利要求24至29中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述感染部位对所述生物膜的至少一部分进行清创的步骤。

31.根据权利要求24至30中任一项所述的方法，其中所述施用的步骤能够包括将所述组合物施用于所述部位多于一次。

32.一种在创伤或手术部位处抑制生物膜形成的方法，所述方法包括：

识别易受生物膜来源的感染的创伤或手术部位；以及，

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述手术部位是用于接纳植入式医疗装置的手术部位，并且其中所述方法还包括将所述医疗装置植入所述手术部位的步骤。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述施用的步骤包括将所述组合物施用于所述植入式医疗装置的外表面。

35.根据权利要求34所述的方法，其中在将所述装置植入到所述手术部位中之前将所述组合物施用于所述植入式医疗装置的所述外表面。

36.根据权利要求34所述的方法，其中在将所述装置植入到所述手术部位中之后将所述组合物施用于所述植入式医疗的所述外表面。