KR20230094991A - 불활화된 백일해 균주를 포함하는 백신 조성물 및 상기 백신 조성물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 출원은 불활화된 백일해 균주를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

불활화된 백일해 균주를 포함하는 백신 조성물 및 상기 백신 조성물의 제조방법{VACCINE COMPOSITION COMPRISING INACTIVATED BORDETELLA PERTUSSIS AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 출원은 백일해균으로 인해 유발된 질환에 대한 백신 조성물에 관한 것이다.

최근 코로나바이러스를 비롯한 감염 질환 유행으로 인해 백신의 중요성이 강조되고 있으며 특히 기후 온난화로 인해 백신 생산 경비 절감, 수송 및 보관 시의 백신 안정성에 대한 관심이 고조되고 있다.

이런 의학적 필요성을 위해 상온 안정한 백신 제형이 개발되고 있으나 대부분은 바이러스 백신이고, 일부 바이러스 백신 제조 과정에서 균주 자체는 내열성이어도 최종 백신 제제는 냉장이 요구된다(Osman 등, 2021). 세균 또한 불활화되면 다시 생존할 수 없고, 많은 단백질이 관여하는 세균은 상온 안정성을 구현하기 어려워 세균 백신도 상온에서 장기간 안정성을 달성하지 못한다.

따라서, 세균을 이용한 백신 제조시, 균을 불활화시켜 균체 백신(whole cell vaccine)으로 사용하고 있으나(Pace 등, 1998) 이러한 사균 백신 제품들은 불활화시, 단백질이 변성되고 세포막이 붕괴되어 병원균이 죽게 되므로 모두 냉장 또는 냉동 보관해야 한다는 문제가 있다.

한편, 바이러스나 세균과 같은 미생물이 침입하면 식균작용 (phagocytosis)으로 미생물 병원체를 섭취하여 미생물을 분해하면서 항원기(epitope)를 면역세포에 제시하여 선천성 면역 방어 및 항상성을 유지하게 된다(Lee 등, 2020). 식균작용으로 세균을 포획하면 phagosome(endosome)을 형성하고 phagosomes은 일련의 '성숙'단계를 거쳐 점차 산성화되어 결국 리소좀(lysosome)과 융합하여 포식 용해소체(phagolysosomes, endolysosome)로 발달하여 침입하는 병원체를 효과적으로 제거한다. 이런 기전을 통해 대식세포, 호중구 및 수지상 세포를 포함하는 식세포는 미생물 병원체 처리뿐만 아니라 T 세포에 항원을 제시함으로써 후천면역 반응을 시작한다. 따라서 식균작용은 선천면역과 후천면역 사이의 교량 역할을 한다 (Lee 등, 2020).

수지상세포, 대식세포와 같은 항원 제시세포 (antigen-presenting cells: APCs)는 항원제시 세포 타입에 관계없이 표면에 항원 특이적인 특정 T 세포 수용체를 발현하는 특이한 T 세포 subset 와 상호작용(interaction)한다. MHC 클래스 II는 엔도솜과 리소솜에서 자기 (self)와 비자기 (non-self) 단백질이 분해되어 생성된 항원성 펩타이드와 결합하여, 항원 특이적 CD4⁺ T 세포에 펩타이드를 제시한다. CD4⁺ T 세포에 의해 펩타이드-MHC 클래스 II가 인식되면 T 헬퍼 세포 subset 으로 활성화 및 분화가 촉진되면서, 항원 특이적 B 세포와 T 헬퍼 세포 간의 상호 작용을 매개한다. 수지상세포 상의 class I 복합체가 펩타이드-MHC 클래스 I 콤플렉스를 CD8⁺ T 세포에 의해 인식되면 CD8⁺ T 세포가 세포독성 T 세포 (cytotoxic T cell)로 분화되도록 촉진시킨다 (Ewanchuk 와 Yates, 2018)

바이러스는 결정화 시킨 후 다시 영양분이 보충되면 생장 가능하지만 병원균은 일단 불활성화 되면 다시 생존할 수 없다. 바이러스 또는 항원성 단백질을 이용한 subunit 백신은 몇 개의 단백질이 관여하지만 많은 단백질이 관여하는 세균은 상온 안정성을 구현하기 어렵다. 즉 병원균은 생장온도가 일정하기 때문에 일정 온도 이상이 되면 사멸하게 된다. 따라서 바이러스 백신과는 대조적으로 세균 백신은 어느 것도 상온에서 장기간 안정성을 달성하지 못했다. 따라서 세균을 이용한 사균 백신 제조 시 가열하거나 알코올, 아세톤 등의 용매 처리, 또는 glutaraldehyde 등을 이용하여 균을 불활성화시켜 균체 백신 (whole cell vaccine) 으로 사용하고 있으나(Pace 등, 1998) 이런 사균 백신 제품들은 모두 냉장 또는 냉동 보관하고 있다.

따라서, 냉장 또는 냉동 보관하지 않고, 상온에서 장기간 안정성을 달성할 수 있는 세균 백신의 개발이 필요하였다.

Osman N, Goovaerts D, Sultan S, Salt J, Grund C. Vaccine Quality Is a Key Factor to Determine Thermal Stability of Commercial Newcastle Disease (ND)Vaccines. Vaccines (Basel). 2021 Apr 9;9(4):363. Pace JL, Rossi HA, Esposito VM, Frey SM, Tucker KD, Walker RI. Inactivated whole-cell bacterial vaccines: current status and novel strategies. Vaccine. 1998 Oct;16(16):1563-74. Lee HJ, Woo Y, Hahn TW, Jung YM, Jung YJ. Formation and Maturation of the Phagosome: A Key Mechanism in Innate Immunity against Intracellular Bacterial Infection. Microorganisms. 2020 Aug 25;8(9):1298. Ewanchuk BW, Yates RM. The phagosome and redox control of antigen processing.Free Radic Biol Med. 2018 Sep;125:53-61.

본 출원이 해결하고자 하는 과제는 불활화된 백일해 균주를 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원이 해결하고자 하는 과제는 상온 및 실온에서 보관 안정 상태를 유지할 수 있는 백신 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 출원이 해결하고자 하는 과제는 상온 및 실온에서 보관 안정 상태를 유지할 수 있는 불활화된 백일해 균주의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 출원이 해결하고자 하는 과제는 상온 및 실온에서 보관 안정 상태를 유지할 수 있는 불활화된 백일해 균주를 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 하나의 실시예는, 하기 수학식 1을 만족하도록 불활화된 백일해 균주를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

[수학식 1]

(상기 수학식 1에서, A는 불활화되기 전의 균주에서 측정한 소수성 형광 값이고, B는 불활화된 균주에서 측정한 소수성 형광 값이다.)

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 균주의 세포 내 단백질 응집도는, 하기 수학식 2를 만족하는 것일 수 있다.

[수학식 2]

(상기 수학식 2에서, PA는 세포의 단면에서 응집된 단백질의 강도이고, PT는 세포 단면의 전체 면적이다.)

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 균주는, 55℃ 내지 70℃에서 30분 내지 90분 동안 처리하여 불활화된 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 백신 조성물은, 1℃ 내지 65℃의 온도에서 24개월 이상 보관 안정 상태를 유지될 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 조성물은, 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 보존제, 안정화제, 완충액 및 면역 보조제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 안정화제는, 알라닌, 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 글리신 및 프롤린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 안정화제일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 보존제는, 트레할로스(Trehalose), 탈지유(Skim milk), 소르비톨(Sorbitol), 덱스트란(Dextran), 아스코르브산(Ascorbic acid) 및 홍삼 엑기스(Red ginseng extract)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 백신 조성물은, 복강 내, 점막 내, 근육 내, 진피 내, 피하, 정맥 내, 직장 내, 폐 내, 경막 내, 경구, 경피 또는 비강 내로 투여하기 위한 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예는, 상기 불활화된 균주에, 조성물 총 중량을 기준으로 5 내지 10중량% 트레할로오스, 5 내지 15중량% 스킴밀크, 2 내지 5중량% 소르비톨 및 3 내지 5중량% 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상; 및 0.1 내지 10중량%의 아스코르브산;을 더 포함하는 보존제를 첨가하는 단계; -80℃ 내지 -70℃에서 24시간 내지 48시간 동안 동결시키는 단계; -50℃ 내지 -40℃, 15 Pa 내지 30 Pa 조건하에서 48시간 내지 60시간 동안 동결건조하는 단계;를 포함하는 백신 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예는, 상기 백일해 균주를 배양하는 단계; 및 상기 균주를 하기 수학식 1을 만족하도록 불활화시키는 단계; 를 포함하는 불활화된 백일해 균주의 제조방법을 제공한다.

[수학식 1]

(상기 수학식 1에서, A는 불활화되기 전의 균주에서 측정한 소수성 형광 값이고, B는 불활화된 균주에서 측정한 소수성 형광 값이다.)

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 불활화시키는 단계는, 상기 균주를 55℃ 내지 70℃에서 30분 내지 90분 동안 처리하여 불활화시킬 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예는, 상기 제조방법으로 제조한 불활화되고 상기 수학식 1을 만족하는 백일해 균주를 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예는, 상기 수학식 1을 만족하도록 불활화된 백일해 균주를 포함하는 백신 조성물이 그 백일해균 감염으로 유발된 백일해 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예는, 상기 수학식 1을 만족하도록 불활화된 백일해 균주 또는 그를 포함하는 백신 조성물이 백일해 질환을 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예는, 상기 수학식 1을 만족하도록 불활화된 백일해 균주 또는 그를 포함하는 백신 조성물을 투여하여, 투여 대상과 백일해균에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 균주는 상기 수학식 2를 만족하는 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에 따른 불활화된 백일해 백신 조성물은 독성과 증식력이 없고 우수한 면역 반응을 유도하면서도 상온에서 보관 안정성을 유지하는 효과가 있다.

도 1은 생균 및 불활화된 백일해 균주의 소수성 형광 값을 형광분광광도계를 이용하여 측정하여 나타낸 것이다.
도 2는 생균 및 불활화된 백일해 균주의 단백질 불활화 정도를 Transmission Electron Microscope(TEM)으로 측정한 사진이다.
도 3은 도 2의 TEM 사진으로 단백질 불활화 정도를 세포 내 단백질 응집도로 나타낸 것이다.
도 4는 불활화된 백일해 균주 접종에 의한 specific IgG 항체 역가 효능을 나타낸 것이다.
도 5는 불활화된 백일해 균주 접종에 의한 TNF-a 유도 수준을 나타낸 것이다.

이하, 본 출원을 보다 상세히 설명한다.

이하의 특정한 구조 내지 기능적 설명들은 단지 본 출원의 개념에 따른 실시예를 설명하기 위하여 예시된 것으로, 본 출원의 개념에 따른 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본 명세서에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

본 출원의 개념에 따른 실시예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시예들은 본 명세서에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 출원의 개념에 따른 실시예들을 특정한 개시 형태에 한정하려는 것이 아니며, 본 출원의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로 본 출원을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.

본원 명세서의 용어, "예방"이란 백신 조성물의 투여에 의해 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본원 명세서의 용어, "치료"란 백신 조성물의 투여에 의해 이미 유발된 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

본원 명세서의 용어, "백신"이란 세균의 감염 또는 세균성 질환을 예방하기 위한 면역을 위하여 쓰이는 항원으로써, 불활화시킨 박테리아 균주로 제조되며, 특정 감염증에 대해 인공적으로 면역원성을 획득하기 위하여 약화시키거나 사멸시킨 병원성 미생물을 개체 내에 투여하는 것을 의미한다. 백신에 의해 자극을 받으면 개체 내의 면역 시스템이 작동하여 항체를 생성하게 되고, 그 감수성을 유지하다가 재감염이 일어나는 경우, 빠른 시간 내에 항체를 효과적으로 생성함으로써 질환을 극복할 수 있게 된다. 다만 본 출원에 따른 불활화된 백일해 균주를 포함하는 백신은 면역관용 원리에 의하여 기존의 백신과 달리 특정 항원 성분에 대한 방어만이 아니라 그 세균성 질환을 일으킬 수 있는 2차 세균 감염성 질환을 포함하는 광범위한 질병의 예방 및 치료 효과를 가질 수 있다.

본 명세서의 용어, "불활화"란 독성 있는 균주가 변형 전보다 증식 능력이 상실되는 조건을 의미하고, 사균을 포함한다. 상기 불활화된 균주는 숙주 안에서 복제 분열이 불가능한 상태를 말한다.

상기 불활화된 백일해 균주는 하기 수학식 1을 만족하도록 불활화된 것일 수 있고, 불활화 방법은 제한되지 않는다.

[수학식 1]

(상기 수학식 1에서, A는 불활화되기 전의 균주에서 측정한 소수성 형광 값이고, B는 불활화된 균주에서 측정한 소수성 형광 값이다.)

본 명세서의 용어, "소수성 형광 값"란 단백질의 비극성 부분에 대한 형광 탐침(probe)으로 백일해 균주의 불활화 조건에 따른 소수성 정도를 anisotropy로 측정한 형광 값이다. 불화화된 백일해 균주의 소수성 형광 값이 상기 수학식 1의 범위를 만족할 때 면역 효과가 우수하다.

상기 불활화된 균주의 세포 내 단백질 응집도는, 하기 수학식 2를 만족하는 것일 수 있다.

본 명세서의 용어, “세포 내 단백질 응집도”란 세포 내 전체 면적에 대한 세포 내에서 응집된 단백질의 면적 대비 강도의 비율을 의미하고, 하기 수학식 2로 나타낸다.

[수학식 2]

(상기 수학식 2에서, PA는 세포의 단면을 기준으로 할 때 응집된 단백질의 강도이고, PT는 세포의 단면을 기준으로 할 때 전체 면적이다.)

본 출원의 용어 “세포 내 단백질”은 균주 세포 내 존재하는 모든 단백질을 의미한다. 세포의 단면은 가장 큰 직경을 가지는 단면을 의미할 수 있다. 세포 내 단백질 응집도가 상기 수학식 2의 범위를 만족할 때 면역 효과가 우수하다.

상기 수학식 2의 범위 내의 응집도를 가지는 불활화된 백일해 균주는 독성과 증식력을 없애면서 불활화되기 전의 균주처럼 우수한 항체 역가를 나타내 면역 효과가 우수하며 백신 효능을 향상시킬 수 있다는 장점이 있다.

상기 수학식 1을 모두 만족하는 불활화된 백일해 균주가 면역 효과가 우수하다. 또한, 상기 수학식 1과, 수학식 2의 값을 모두 만족하는 불활화된 균주가 면역 효과가 우수하다.

상기 불활화된 균주는 상기 균주를 55℃ 이상, 70℃ 이하, 60℃ 이하의 온도에서 30분 내지 90분 동안 처리하여 불활화시킨 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 균주가 55℃ 미만의 온도에서 처리하거나, 30분 미만으로 처리하면 일부 변이 생균이 불활화되지 않을 수 있어, 생균이 검출되는 문제가 있다. 상기 균주가 70℃ 초과, 65℃ 초과, 60℃ 초과의 온도에서 처리하거나, 90분을 초과하여 처리하면 단백질 변성으로 균체의 소수성 값이 높아지고, 세포 내 단백질의 응집도도 높아지는 문제가 있다. 그래서 항체 역가가 낮아져서 백신의 면역 효과가 좋지 않은 문제가 있다.

상기 불활화된 균주는 상기 균주를 55℃에서 90분, 56℃에서 30분, 60℃에서 30분, 70℃에서 30분 동안 열처리하였을 때 완전히 불활화될 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 상기 수학식 1, 또는 수학식 2를 만족시키는 범위에서 적절히 온도와 시간을 조절할 수 있다.

본 출원의 상기 백신 조성물은, 상온, 실온, 미온, 냉장 또는 냉동에서 보관 안정 상태를 유지할 수 있다. 본 명세서에서, 상온은 15~25℃, 실온은 1~35℃를 의미한다. "실온에서의 안정성"은 더운 지방에서는 일반적인 실온보다 더 높은 온도 범위에서의 안정성을 의미하며, 예를 들어, 이탈리아 또는 텍사스에서는 28℃ 내지 32℃의 범위를 의미한다.

구체적으로, 상기 백신 조성물은, 냉동 온도, 0℃ 이상, 1℃ 이상, 5℃ 이상, 15℃ 이상, 25℃ 이상, 35℃ 이상, 40℃ 이상, 50℃ 이상, 60℃ 이상, 65℃ 이상의 온도에서도 보관 안정 상태를 유지할 수 있다. 상기 백신 조성물은, 상기 온도에서 1개월 이상, 3개월 이상, 6개월 이상, 12개월 이상, 24개월 이상, 36개월 이상의 기간에서 보관 안정 상태를 유지할 수 있다.

구체적으로, 상기 백신 조성물은 0℃ 이상의 온도에서 24개월 이상 보관 안정 상태를 유지될 수 있고, 상기 백신 조성물은 1℃ 이상의 온도에서 24개월 이상 보관 안정 상태를 유지될 수 있다. 상기 백신 조성물은 5℃ 이상의 온도에서 24개월 이상 보관 안정 상태를 유지될 수 있으며, 상기 백신 조성물은 15℃ 이상의 온도에서 24개월 이상 보관 안정 상태를 유지될 수 있다. 상기 백신 조성물은 25℃ 이상의 온도에서 24개월 이상 보관 안정 상태를 유지될 수 있으며, 상기 백신 조성물은 35℃ 이상의 온도에서 24개월 이상 보관 안정 상태를 유지될 수 있다. 상기 백신 조성물은 40℃ 이상의 온도에서 24개월 이상 보관 안정 상태를 유지될 수 있으며 상기 백신 조성물은 50℃ 이상의 온도에서 24개월 이상 보관 안정 상태를 유지될 수 있고, 상기 백신 조성물은 60℃ 이상의 온도에서 24개월 이상 보관 안정 상태를 유지될 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 백신 조성물은, 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 보존제, 안정화제, 완충액 및 면역 보조제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

상기 안정화제는, 제제의 안정성에 기여하는 아미노산 안정화제를 함유할 수 있으며, 안정화제는 비-이온성 및 염기성 아미노산로 이루어진 군 중 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 안정화제는, 알라닌, 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 글리신 및 프롤린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 안정화제일 수 있다.

비-극성 및 염기성 아미노산의 예시로 알라닌, 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 오미틴, 이소류신, 발린, 메티오닌, 글리신 및 프롤린을 포함하며, 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, 아미노산 안정화제는 글리신 또는 프롤린, 전형적으로는 글리신일 수 있다. 또한, 상기 안정화제는 단일 아미노산이거나 2 또는 그 이상 아미노산의 조합일 수 있다. 아미노산 안정화제는 천연 아미노산, 아미노산 유사체, 변형 아미노산 또는 아미노산 등가물일 수 있다. 일반적으로, 아미노산은 L-아미노산일 수 있다. 예를 들어, 프롤린이 안정화제로 사용될 경우, 이는 일반적으로 L-프롤린일 수 있으며, 아미노산 등가물, 예를 들어, 프롤린 유사체를 사용하는 것도 가능하다.

상기 아미노산 안정화제는 적어도 100 mM의 양으로 존재한다. 구체적으로, 아미노산 안정화제는 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM의 양 또는 적어도 그 이상으로 존재한다. 또한, 상기 안정화제의 아미노산 순도는 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 또는 그 이상이 되어야 한다.

상기 보존제는, 트레할로스(Trehalose), 탈지유(Skim milk), 소르비톨(Sorbitol), 덱스트란(Dextran) 및 아스코르브산(Ascorbic acid)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

상기 보존제는, 상기 백신 조성물이 동결 건조되는 경우 동결보존제로서의 역할을 할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "동결건조"는 세포, 조직, 기관, 유기체 등의 생물학적 재료가 0℃ 미만, 구체적으로는 고체 이산화탄소를 이용해 동결시킨 온도인 -80℃ 미만, 더욱 구체적으로는 액체 질소를 이용해 동결시킨 온도인 -130℃ 미만을 갖는 환경에서 건조되는 방법을 지칭한다.

생물학적 재료는 전형적으로 비조절된 생화학적 동역학에 의해 야기되는 손상에 민감하다. 동결건조 절차 동안, 냉각 또는 동결에 의해 건조되는 생물학적 재료는 전형적으로 하나 이상의 동결보존제와 접촉될 수 있다. 동결건조는 본 출원의 분야에 공지된 임의의 동결건조 절차에 의해 얻어질 수 있으며, 이는 본 출원의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 느린 동결 및 다-단계 유리화 및 1-단계 유리화와 같은 과정을 포함한다.

본 명세서의 용어 "생물학적 재료"는 세포, 세포 집합체, 조직 샘플, 기관, 생물학적 유체, (다)세포 유기체 및 임의의 다른 막(예를 들어, 리포좀), 뉴클레오시드(DNA 또는 RNA), 뉴클레오시드(바이러스), 지질 또는 단백질성 개체를 의미한다.

따라서, 상기 동결보존제를 사용하면 균주를 동결보존 또는 건조하는 데 있어서 그 광학/물리적 양태를 변경하지 않고 높은 효율을 가지는 효과가 있으며, 이의 표준화 및 품질 제어가 가능하다는 효과가 있다.

상기 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 담체로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 면역 보조제로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 면역 보조제가 제한 없이 사용될 수 있으며, cholera toxin binding unit, aluminum salts, lipid emulsion (MF-59), synthetic detergent (Tween), microspheres, liposomes, mucoadhesive polymers 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 백신 조성물은 완충액을 더 포함할 수 있다. 완충액은 어떤 특정 성분으로 국한되지는 않으며 필요에 따라 의약학적으로 허용되는 다양한 완충액 중 어느 하나 또는 그 이상을 사용할 수 있다. 상기 완충액은 구체적으로는 식염수, 정제용 완충액 (예컨대 0.01M PBS), 완충식염수, 덱스트로스, 물, 글리세린, 등장 수성 완충액 및 이들의 조합일 수 있다.

상기 백신 조성물은 pH 조절제, 계면활성제 등을 더 포함할 수 있다

상기 백신 조성물의 제형은, 예를 들어 겔제(젤리제), 크림제, 연고제, 경고제 등의 반고형제, 액상 제제, 산제, 세립제, 과립제, 필름제, 정제, 좌제, 패치제, 마이크로니들용 제제, 구강 내 붕해정 등의 고형 제제, 에어졸제 등의 점막용 스프레이제, 및 흡인제 등으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 또한, 상기 약제학적 조성물이 인간 또는 동물의 점막에 투여되는 경우, 상기 반고형 제제 및 고형 제제는 체액 및/또는 체온에 의하여 용해되는 것일 수 있다.

백신 조성물의 제제는 경구 투여를 위한 제제이거나 비경구 투여 제제일 수 있다.

상기 경구형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 제형으로 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 비고형 제제에는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 비경구형 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제, 멸균 주사제, 패치 제제, 스프레이 제제가 포함될 수 있으며, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 백신 조성물은, 복강 내, 점막 내, 근육 내, 진피 내, 피하, 정맥 내, 직장 내, 폐 내, 경막 내, 경구, 경피 또는 비강 내로 투여하기 위한 것일 수 있다.

상기 점막의 위치는 특별히 제한되지 않으며, 당업계에서 점막 투여를 위해 사용되는 신체 위치들. 예를 들어 코 점막, 비강 점막, 구강 내 점막, 눈 점막, 귀 점막, 생식기 점막, 인후 점막, 인두 점막, 기도 점막, 기관지 점막, 폐 점막, 위 점막, 장관 점막, 직장 점막 등으로부터 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.

백신의 비강 내 투여는 세균이 상(上)기도 및/또는 하(下 )기도의 점막 표면으로부터 숙주로 감염되는 특정 세균 감염증에 대해서 면역을 증강함에 유리하다는 효과가 있다.

백신의 경피 투여는 복수의 미소 돌기를 구비하는 패치, 마이크로니들 패치(microneedle patch) 또는 무-바늘성 패치(needle-free patch)를 통해 투여될 수 있다.

상기 백신 조성물은 사용 직전 재구성하는 것이 가능한 동결 건조 분말의 형태일 수 있으며, 안정성이 증대되고 미생물의 증식이 억제되는 효과가 있다.

상기 백신 조성물을 투여할 수 있는 개체는 제한이 없으며, 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본상기 백신 조성물의 유효 투여량의 범위는 성별, 체표면적, 체중, 질환의 종류 및 중증도, 연령, 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 배출비율, 투여시간, 치료기간, 표적세포, 발현 수준, 상기 백신 조성물을 단일 약제로 사용하는지 보조 약제로 사용하는지, 병리학적 상태에 따른 발병 진행도를 비롯하는 등 기타 의학 분야에 잘 알려진 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 백신 조성물은 몇 차례 또는 다수 회 투여할 수 있다. 예를 들면, 본 출원의 백신 조성물을 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 이상 투여할 수 있다. 투여는 약 1주간~ 약 16주간 간격, 어느 특정의 실시 형태에서는 약 1주간~ 약 4주간 간격일 수 있다. 본 발명의 백신이 표적으로 하는 특정의 세균에 의해 반복 감염 또는 2차 감염되는 경우, 정기적으로 재투여할 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예는, 박테리아 균주를 상기 수학식 1을 만족하도록 불활화시키는 단계; 를 포함하는 불활화된 균주의 제조방법을 제공한다. 상기 수학식 1과 상기 불활화된 균주에 대한 설명은 상술한 바와 같다.

상기 제조방법에서 상기 불활화시키는 단계는, 55℃ 내지 60℃의 온도에서 30분 내지 90분 동안 처리되어 불활화시킬 수 있다.

이하 본 발명을 실시예 및 비교예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 비교예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예> 불활화된 백일해 균주 제조

살아있는 백일해 균주(비교예 1)를 하기 온도의 항온 수조에서 각각의 시간별로 처리하여 실시예 1 내지 4의 불활화시킨 백일해 균주를 제조하였다. 백일해 균주로 보르데텔라 페르투씨스(Bordetella pertussis) 균주를 ATCC(기탁번호 BAA-589)에서 구입하여 사용하였다. 각각의 온도와 처리시간을 하기 표 1에 나타내었다.

	온도	처리 시간 (분)
실시예 1	55℃	90
실시예 2	56℃	30
실시예 3	60℃	30
실시예 4	70℃	30

<실험예 1> 불활화된 백일해 균주의 anisotropy 확인

상기 실험에서 대조군인 비교예 1의 생균과 실험군인 실시예 1 내지 4의 백일해 균주가 Bis-ANS 시약과 반응한 형광 정도를 형광분광광도계를 이용하여 소수성 형광 값을 측정하였다.

구체적으로, 각각의 조건에서 불활화 된 1 x 10⁸ 내지 1 x 10⁹ 개의 백일해 균주와 10 μM Bis-ANS (4,4′-Dianilino-1,1′-binaphthyl-5,5′-disulfonic acid dipotassium salt, Sigma Chemical Co., USA)를 최종 용량 2 ml이 되도록 PBS를 첨가하고 1시간 동안 상온에서 교반하여 반응시켰다.

각각의 균주를 1시간 동안 Bis-ANS와 반응시킨 후 형광 강도를 측정하기 위해, 반응시킨 용액을 형광광도계용 석영 셀/큐벳에 옮겨 담은 후 형광분광광도계(Cary eclipse flouorescence spectrophotometer, Agilent Technologies Co., USA)를 이용하여 형광 값을 측정하였다. 이때 현광분광광도계 스캔 조건 중 excitation 파장은 350 nm, emission 파장 범위는 400 nm 내지 690 nm로 설정하였다. 형광분광광도계를 이용하여 스캔 후 485 nm 내지 505 nm 사이에서 나타나는 최대 수치를 측정하여 소수성(hydrophobicity intensity) 형광 값을 도 1과 표 2에 나타내었다.

그 결과, 상기 생균인 비교예 1의 균체의 소수성 형광값은 25 이었다. 실시예 1 내지 4와 같이 불활화된 백일해 균주의 소수성 형광값은 각각 201, 146, 179, 247 로 수학식 1의 범위를 만족하는 것을 확인할 수 있었다.

도 1을 참조하면, 상기 수학식 1에 따른 B/A(A는 불활화되기 전의 균주에서 측정한 소수성 형광 값이고, B는 불활화된 균주에서 측정한 소수성 형광 값)가 5.5 내지 10의 범위에 있음을 확인할 수 있다.

<실험예 2> 불활화된 백일해 균주의 Transmission Electron Microscope (TEM) 분석 및 단백질 응집도 확인

상기 제조예들에서 불활화된 백일해 균주의 1 x 10⁸ 내지 1 x 10⁹ 개 농도로 resin에 중합하여 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM) 사진과 단백질 응집도를 수치화하여 도 2 및 3에 나타내었다.

구체적으로, 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscope, TEM))을 이용하여 불활화된 백일해 균주의 특성 및 구조를 파악하기 위하여 비드 외 표면과 절단한 단면을 영상화하였으며, Image J를 이용하여 불활화된 백일해 균주 내부의 불활화된 단백질 조성비를 측정하였다. 이때, 불활화된 백일해 균주를 1차 고정, 2차 고정, 탈수 및 resin과의 중합과정을 거쳐 초박절편하여 단면 특성 분석 및 단백질 불활화 정도를 측정하였다.

각각 균체의 세포 내에서 단백질이 응집된 강도를 측정하기 위해 세포 단면을 기준으로 세포 내 단백질이 응집된 정도인 PA 값을 측정하였고, 이를 세포 단면의 전체 면적인 PT 값으로 나누었다. 각각의 불활화된 균체의 단백질이 응집된 강도인 PA값은 세포 단면 전체 면적의 응집된 단백질 강도를 의미한다. 단 이때, 불활화된 단백질의 면적 값에서 생균의 densitometer 측정시 나타나는 backgroud 값을 제거하였다. 생균의 경우 세포 내 단백질 응집이 일어나지 않았기에 응집된 단백질의 강도를 0으로 하였다. 그룹 간의 면적의 평균값을 비교하여 density로 나타내었고, 이를 토대로 단백질 응집도의 강도를 정량화하여 나타내었다. 각각 균체의 단백질 응집도 측정 시 n 수를 20 이상으로 하였다.

그 결과, 생균인 비교예 1은 세포 내부 구조를 확인하였을 때 단백질 변성이 없어서 세포 내 단백질 응집도(intracellular protein aggregation density)인 상기 수학식 2의 PA/PT(PA는 세포의 단면에서 응집된 단백질의 강도, PT는 세포 단면의 전체 면적)값이 0 이었다. 실시예 1 내지 4의 불활화된 백일해 균주의 경우 PA/PT값은 각각 0.05, 0.047, 0.032와 0.017 인 것을 확인할 수 있었다.

	소수성 형광 값	단백질 응집도
비교예 1	25	0
실시예 1	201	0.05
실시예 2	146	0.047
실시예 3	179	0.032
실시예 4	247	0.017

<실험예 3> 불활화된 백일해 균주 접종에 의한 항체역가 증가 효능 확인

1. 준비

생쥐 복강에 3 x 10⁷ 개의 비교예 1의 생균 또는 실시예 1 내지 4와 같이 불활화된 백일해 균주 3 x 10⁷ 개를 1주 간격으로 2회 접종하였다. 최종 접종 7일 후 실험동물을 CO₂로 질식시켜 희생시키고 개복하여 복대정맥에서 채혈하여 혈청을 얻어 -80℃에서 ELISA 할 때까지 보관하였다. 백일해 생균(OD₆₀₀=1.0) 1 ml을 PBS washing 후 1/10로 희석하여 96 well immunoplate (SPL)의 모든 well에 100 ul씩 첨가하여 4℃ overnignt 배양한다. plate를 wash buffer로 3번 washing 한 후 blocking buffer를 이용하여 상온에서 1시간 배양하였다. 2번 washing 후 1/100으로 희석하여 준비한 serum sample을 plate 가장 위 A행에 125 ul씩 분주하고, 나머지 행에 blocking buffer를 100 ul씩 분주하였다. A행에서 H행까지 1/5 serial dilution한 뒤 상온에서 두 시간 배양하였다. 3번 washing 후 모든 well에 Secondary antibody (Goat anti mouse IgG HRP, BIO-RAD)를 100 ul씩 첨가 후 상온에서 1시간 배양하였다. 3번 washing 후 TMB substrate solution(R&D System)을 100 ul 씩 첨가 후 15분 배양하였다. 모든 well에 Stop solution (2N H₂SO₄, Duksan)을 50 ul 씩 첨가한 후 Micro plate spectrophotometer에 plate를 넣고 OD₄₅₀을 측정하였다.

2. 결과

3 x 10⁷ 개의 비교예 1의 생균과 3 x 10⁷ 개의 실시예 1 내지 4의 불활화된 백일해 균주로 2회 면역화한 마우스 serum 내의 백일해 균주에 대한 IgG 항체 역가를 측정하여 도 4에 나타내었다.

그 결과, 실시예 1 내지 4의 불활화된 백일해 균주 접종군의 항체 역가는 생균 접종군과 동등한 수준으로 대조군보다 유의하게 증가되었다.

실시예 1 내지 4를 살펴보면, 수학식 1에 따른 B/A(A는 불활화되기 전의 백일해 균주에서 측정한 소수성 형광 값, B는 불활화된 변이 균주에서 측정한 소수성 형광 값)가 5.5 내지 10의 범위에 있음을 확인할 수 있고, 수학식 2에 따른 PA/PT(PA는 세포의 단면에서 응집된 단백질의 강도이고, PT는 세포의 단면의 전체 면적)도 0.02 내지 0.07의 범위에 있음을 확인할 수 있다.

<실험예 4> 불활화된 백일해 균주 접종에 의한 TNF-a 유도 확인

1. 생균 및 불활화된 백일해 균주의 접종

총 3 x 10⁷ CFU/100 ul 의 비교예 1의 생균과 실시예 1 내지 4 의 불활화된 백일해 균주를 1주 간격으로 2회 복강 접종하였다.

2. 비장 세포 분리

비장을 적출하기 하루 전에 T 림프구를 자극하기 위해 항-CD3e(1 μg/ml; BioLegend) 및 항-CD28(3 μg/ml; BioLegend) 항체를 사용하여 비장 세포를 분주할 플레이트를 코팅하였다. 최종 접종 1주일 후 비장을 적출하고 차가운 PBS로 세척하여 시약이 맑아질 때까지 세척 하였다. 세척한 비장조직을 여과기(70 μm cell strainer)를 이용하여 부스러뜨린 후 ACK buffer(Gibco, A10492-01)로 조직에 있는 적혈구(RBC)를 제거하였다. 배양 배지로 세척 후 비장 세포를 5 x 10⁵/ml로 희석하여 항-CD3e(1 μg/ml; BioLegend) 및 항-CD28(3 μg/ml; BioLegend) 항체로 코팅 된 12 well plate의 각 well에 2 ml 씩 분주하였다. 비장 세포가 분주 된 well에 백일해 균 각각 1.25 x 10⁷ 개를 처리하였다. 6시간 배양 후 수확하여, 배양 배지의 사이토카인 수준을 측정하였다.

3. 사이토카인 측정

비장 세포에서 종양괴사인자-a (Tumor necrosis factor-alpha: TNF-a)을 측정하였고, TNF-a의 농도는 시판중인 효소 결합 면역 흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 킷(Invitrogen, mouse TNF-a ELISA KIT)를 사용하여 제조사의 지시대로 측정하였다.

면역관용 반응을 뒷받침하기 위해 생쥐의 비장 세포에서 TNF-a 사이토카인 수치의 변화를 시간별로 측정하여 도 5에 나타내었다. 비장세포에 백일해 균주로 24시간 감염시키고 음성대조군에 비해 비교예 1의 생균과, 실시예 1 내지 4의 불활화된 백일해 균주 접종군의 비장세포에서 TNF-a 양이 약 14배 이상 증가하였다.

그러나 불활화되기 전의 생균과 불활화된 백일해 균주 접종군 사이에서 유의미한 변화는 관찰되지 않았다. 실시예 1의 불활화된 백일해 균주 접종으로도 비교예 1의 생균 접종에 의한 TNF-a 유도 수준과 동등한 수준의 TNF-a가 유도됨을 확인하였다.

실시예 1을 살펴보면, 수학식 1에 따른 B/A(A는 불활화되기 전의 변이 균주에서 측정한 소수성 형광 값, B는 불활화된 변이 균주에서 측정한 소수성 형광 값)는 8.04로 5.5 내지 10의 범위에 있고, 수학식 2에 따른 PA/PT(PA는 세포의 단면에서 응집된 단백질의 강도이고, PT는 세포의 단면의 전체 면적)는 0.017로 0.02 내지 0.07의 범위에 있음을 확인할 수 있다.

이상으로 본 출원의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 출원의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (14)

1. 하기 수학식 1을 만족하도록 불활화된 백일해 균주를 포함하는 백신 조성물.
   [수학식 1]
   

   

   
   (상기 수학식 1에서, A는 불활화되기 전의 균주에서 측정한 소수성 형광 값이고, B는 불활화된 균주에서 측정한 소수성 형광 값이다.)
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 균주의 세포 내 단백질 응집도는,
   하기 수학식 2를 만족하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   [수학식 2]
   

   

   
   (상기 수학식 2에서, PA는 세포의 단면에서 응집된 단백질의 강도이고, PT는 세포 단면의 전체 면적이다.)
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 균주는,
   55℃ 내지 70℃에서 30분 내지 90분 동안 처리하여 불활화된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 백신 조성물은,
   1℃ 내지 65℃의 온도에서 24개월 이상 보관 안정 상태를 유지하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 조성물은,
   약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 보존제, 안정화제, 완충액 및 면역 보조제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
6. 청구항 6에 있어서,
   상기 안정화제는,
   알라닌, 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 글리신 및 프롤린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 아미노산 안정화제인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
7. 청구항 6에 있어서,
   상기 보존제는,
   트레할로스(Trehalose), 탈지유(Skim milk), 소르비톨(Sorbitol), 덱스트란(Dextran) 및 아스코르브산(Ascorbic acid)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
8. 청구항 1에 있어서,
   상기 백신 조성물은,
   복강 내, 점막 내, 근육 내, 진피 내, 피하, 정맥 내, 직장 내, 폐 내, 경막 내, 경구, 경피 또는 비강 내로 투여하기 위한 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 백신 조성물의 제조방법으로,
   상기 불활화된 백일해 균주에, 조성물 총 중량을 기준으로
   5 내지 10중량% 트레할로오스, 5 내지 15중량% 스킴밀크, 2 내지 5중량% 소르비톨 및 3 내지 5중량% 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 및
   0.1 내지 10중량%의 아스코르브산;을 더 포함하는 보존제를 첨가하는 단계;
   -80℃ 내지 -70℃에서 24시간 내지 48시간 동안 동결시키는 단계; 및
   -50 ℃ 내지 -40℃, 15 Pa 내지 30 Pa 조건하에서 48시간 내지 60시간 동안 동결건조하는 단계;를 포함하는 불활화된 백일해균 백신 조성물의 제조방법.
   
10. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 불활화된 백일해 균주를 제조하는 방법에 있어서,
    상기 균주를 배양하는 단계; 및
    상기 균주를 하기 수학식 1을 만족하도록 불활화시키는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 불활화된 백일해 균주의 제조방법.
    [수학식 1]
    

    

    
    (상기 수학식 1에서, A는 불활화되기 전의 균주에서 측정한 소수성 형광 수치이고, B는 불활화된 균주에서 측정한 소수성 형광 수치이다.)
    
11. 청구항 10에 있어서,
    상기 균주의 세포 내 단백질 응집도는,
    하기 수학식 2를 만족하는 것을 특징으로 하는 불활화된 백일해 균주의 제조방법.
    [수학식 2]
    

    

    
    (상기 수학식 2에서, PA는 세포 내에서 응집된 단백질의 강도이고, PT는 세포 단면의 전체 면적이다.)
    
12. 청구항 10에 있어서,
    상기 불활화시키는 단계는,
    백일해 균주를 55℃ 내지 70℃에서 30분 내지 90분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 불활화된 백일해 균주의 제조방법.
    
13. 청구항 10의 제조방법으로 제조한 것을 특징으로 하는 불활화된 백일해 균주.
    
14. 청구항 13에 있어서,
    상기 균주의 세포 내 단백질 응집도는,
    하기 수학식 2를 만족하는 것을 특징으로 하는 불활화된 백일해 균주.
    [수학식 2]
    

    

    
    (상기 수학식 2에서, PA는 세포의 단면에서 응집된 단백질의 강도이고, PT는 세포 단면의 전체 면적이다.)

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