KR20230092921A - 콜라겐 함량을 측정하기 위해 콜라겐 하이브리드화 펩티드를 사용하기 위한 방법 - Google Patents
콜라겐 함량을 측정하기 위해 콜라겐 하이브리드화 펩티드를 사용하기 위한 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 공개는 콜라겐 하이브리딩 펩타이드를 사용하여 콜라겐 함량을 결정하는 방법을 제공합니다. 본 공개는 손상된 콜라겐 (예: 삼중 나선 구조가 손상된 콜라겐/collagen with disrupted triple helicity) 및/또는 총 콜라겐의 양을 측정하는 방법을 제공합니다. 본 공개는 손상된 콜라겐 (예: 삼중 나선 구조가 손상된 콜라겐)의 양을 총 콜라겐의 일부로 측정하는 방법을 제공합니다.
Description
연방 정부 후원 연구에 대한 성명/연방 정부가 후원하는 연구에 관한 진술
[0001] 본 발명은 미국 보건인간서비스부 국립보건원(National Institutes of Health)이 부여한 2R44OD021986-02의 정부 지원 하에 개발되었습니다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있습니다.
분야
[0002] 본 발명은 손상된 콜라겐 및 콜라겐 함량을 측정하는 방법에 관련됩니다.
바탕
[0003] 세포외 기질 (Extracellular matrix, ECM)은 정상 및 병리적인 생물 과정을 규제하는 데 기본적인 역할을 합니다. ECM에서 가장 풍부하게 발현되는 성분은 콜라겐입니다. 콜라겐의 삼중 나선 구조는 고도로 보존되어 있지만, 특정한 병리적 조건에서는 콜라겐의 삼중 나선 구조가 깨질 수 있습니다. 많은 경우, 이러한 깨진 콜라겐의 정도나 양과 질병의 심각성이 연관될 수 있습니다. 기존의 콜라겐 깨짐 정도를 측정하는 기술은 몇 일이나 몇 주가 소요되거나 복잡한 염색 절차가 필요할 수 있습니다. 게다가 기술을 올바르게 수행하더라도, 훈련을 받은 병리학자나 기술자가 결과를 분석해야 할 수 있어 분석의 인간 간 또는 내부적인 가변성을 도입할 수 있습니다. 이에 따라, 시료 내의 손상된 콜라겐 또는 전체 콜라겐 함량을 빠르고 신뢰성 있게 측정할 수 있는 자동화된 기술이 필요한 상황이 있습니다.
참조 조항에 의한 편입
[0004] 본 문서에 포함된 모든 출판물, 특허 및 특허 출원은 개별 출판물, 특허 또는 특허 출원이 개별적으로 참조되었다는 것과 동일한 범위로 참조에 포함됩니다. 참조에 포함된 용어와 본 문서의 용어 간에 충돌이 발생하는 경우, 본 문서의 용어가 우선합니다.
간단한 그림 설명 (BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS)
[0005] FIG. 1은 콜라겐 하이브리다이징 펩타이드 (CHPs)로 처리된 조직 샘플에서 변성된 콜라겐 함량(왼쪽)과 전체 콜라겐 함량(오른쪽)을 결정하는 예시적인 과정을 보여줍니다. 이를 통해 상대적으로 변성된(손상/리모델링) 콜라겐의 함량을 계산할 수 있습니다.
[0006] FIG. 2A-C는 섬유성 인간 간 조직의 면역조직화학 이미지를 보여줍니다. (A)는 heat-induced epitope retrieval (HIER)이 없는 건강한 간 조직의 이미지를 보여주며, 50ms 노출 시간에서 CHP로 처리하여 관찰할 수 있는 콜라겐 신호를 생성하지 않습니다. (B)는 HIER 처리된 섬유화된 간 조직의 1배 확대 이미지(왼쪽)와 HIER 없이 처리된 이미지(오른쪽; 원본)를 보여줍니다. (C, 위)는 panel B에서 확인된 섬유화된 간 조직의 작은 부분에 대한 5배 확대 이미지를 보여줍니다. 이 이미지는 HIER로 처리된 것(왼쪽)과 HIER 없이 처리된 것(오른쪽)을 보여줍니다. (C, 아래)는 panel C 상단 행에서 확인된 섬유화된 간 조직의 20배 확대 이미지를 보여줍니다. 이 이미지는 HIER로 처리된 것(왼쪽)과 HIER 없이 처리된 것(오른쪽)을 보여줍니다. HIER로 처리된 샘플은 해리된 콜라겐에 해당하는 Cy5 신호가 증가합니다.
[0007] FIG. 3A-B는 인간의 섬유화된 간 조직의 면역조직화학 이미지를 보여줍니다. (A)는 HIER로 처리된 섬유화된 간 조직의 1배 확대 이미지를 보여줍니다. 이 이미지는 CHPs 처리 이후에 헤마톡실린-에오신 (HE)으로 염색된 섬유화된 간 조직과 Masson's trichrome (Masson)으로 염색된 섬유화된 간 조직을 포함합니다. (B, 위)는 panel A에서 확인된 섬유화된 간 조직의 작은 부분에 대한 5배 확대 이미지를 보여줍니다. 이 이미지는 HIER로 처리된 것(왼쪽), HE 염색된 것(가운데), Masson's trichrome으로 염색된 것(오른쪽)을 보여줍니다. (B, 아래)는 panel B 상단 행에서 확인된 섬유화된 간 조직의 20배 확대 이미지를 보여줍니다. 이 이미지는 HIER로 처리된 것(왼쪽), HE 염색된 것(가운데), Masson's trichrome으로 염색된 것(오른쪽)을 보여줍니다.
[0008] FIG. 4은 heat induced epitope retrieval 후 20 μM R-CHP로 염색된 다른 두께의 정상적인 토끼 피부 절편을 보여줍니다. 조직 절편의 두께가 증가함에 따라 더 많은 CHP 강도가 관찰됩니다. ImageJ/FIJI를 사용한 신호 정량화는 조직 두께와 신호 강도 사이에 거의 선형적인 상관 관계를 보여줍니다.
[0009] FIG. 5은 다섯 가지 다른 방법(Masson's Trichrome (MT), Herovici's Stain, Picrosirius red (PSR), 콜라겐 I 및 콜라겐 III 항체 혼합물 (Col I/III), 그리고 biotin labeled CHPS (B-CHPs))을 사용하여 색칠된 마우스 간의 대표적인 현미경 사진입니다. 건강한 (control) 마우스 간에서 (A-E)와 CCl4 주사 후 8주가 된 섬유화된 마우스 간에서 (F-J) 연속적인 절편이 취해졌습니다. 모든 사진에서 화살표로 표시된 콜라겐은 MT에서는 파란색으로, PSR에서는 분홍색/빨간색으로, Herovici의에서는 성숙한 콜라겐은 분홍색/빨간색으로, 젊은 콜라겐은 파란색으로, Col I/III 혼합물에서는 짙은 갈색부터 연한 갈색까지, CHP 염색에서는 짙은 갈색으로 염색됩니다 (총 콜라겐). 기타 관심 있는 특징들은 다음과 같이 레이블이 지정되었습니다: C-중심 정맥, H-간세포, P-간 동맥과 담즙관이 모인 부분. 확대율은 40배이며, 스케일 바는 200 μM입니다.
[0010] FIG.6는 이미지 분석 소프트웨어를 사용한 콜라겐의 양적 분석 결과를 보여줍니다. 모든 샘플에서 콜라겐이 검출되었으며, 초기 샘플에서는 전반적으로 낮은 수준의 콜라겐이 검출되었고, 질환성 샘플에서는 유의하게 높은 양의 콜라겐이 검출되었습니다.
[0011] FIG. 7은 자동화된 이미지 분석을 사용하여 섬유성 간 샘플 (CCl4, 8주)에서 검출된 콜라겐의 대표적인 현미경 사진을 보여줍니다. 모든 이미지에서 녹색 점선은 조직의 바깥쪽 가장자리를 나타내고 검은색 점선은 분석에서 제외된 영역을 나타냅니다. 상단 행의 이미지는 분석 이전의 이미지이며, 하단 행의 이미지는 이미지 분석에 의해 강조된 콜라겐을 보여줍니다 (PSR은 빨간색으로, 기타 모든 색상은 밝은 녹색으로 표시됨).
[0012] FIG. 8은 Biotin labeled CHPs (B-CHPs) 를 사용하여 간 생검 조직을 염색한 대표적인 사진을 보여줍니다. 피험자는 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)의 병리학자에 의해 점수가 매겨졌습니다. B-CHPs는 빠른 진행자와 평균 및 느린 진행자 환자 간의 질환 리모델링으로 인한 변성된 콜라겐 함량의 차이를 모든 NAFLD 단계에서 검출할 수 있었습니다. 이러한 차이는 수정된 H 점수를 사용한 반정량적 평가에서 통계적으로 유의미하게 나타났습니다. 수정된 H 점수는 면적의 양성x강도를 곱하는 방식으로 계산됩니다.
[0013] FIG. 9은 B-CHP로 처리된 인간 간 생검 조직에서의 총 콜라겐 (상단 행) 과 질환 진행에 따른 리모델링된 콜라겐 (하단 행)을 나타내는 대표적인 사진을 보여줍니다. 대응되는 간 생검은 NAFLD 스펙트럼에서 얻어졌으며 변호사 독립 제127033-5001-WO -4-에 의해 점수가 매겨졌습니다. CHPs를 통한 총 콜라겐 염색을 사용하여, 병리학자들은 stage 1, 2, 3 및 stage 4 사이의 차이를 구별할 수 있었습니다. stage 1과 stage 4 (p 값 = 0.00001), stage 2와 stage 4 (p 값 = 0.237), 그리고 stage 3과 stage 4 (p 값 = 0.0197) 사이에서 총 콜라겐과 리모델링된 콜라겐의 비율을 계산함으로써 이를 확인할 수 있었습니다.
[0014] 상술한 도면은 현재 개시된 실시예를 설명하지만, 논의에서 언급된 바와 같이 다른 실시예도 고려된다. 본 개시는 제한이 아닌 표현을 통해 예시적인 실시예를 제공한다. 현재 개시된 실시예의 원리의 범위 및 사상 내에 속하는 다수의 다른 수정 및 실시예가 당업자에 의해 고안될 수 있다.
자세한 설명
Overview
[0015] 총 콜라겐 함량의 평가는 기존의 방법으로 수행될 수 있습니다. 예를 들어, 트립신-하이드록시프롤린 검사를 사용하여 수행될 수 있습니다. 그러나 이 방법은 번거롭고, 몇 일에 걸쳐 완료되며, (예: 다량의 파이펫팅으로 인한 오차) 오류에 취약합니다. 또한 이 방법은 샘플을 완전히 파괴하므로 샘플 내에서 변성된 콜라겐의 분포에 대한 공간적 정보를 제공할 수 없습니다. 이와 대조적으로, 여기에 기술된 특정 방법들은 콜라겐 하이브리다이징 펩타이드(CHPs)를 사용하여 조직 샘플 내의 총 콜라겐 함량을 빠르고 쉽게 결정하면서도 조직의 파괴를 최소화합니다. CHPs는 예를 들어 미국 특허 출원 번호 2013/0164220에 상세히 기재되어 있으며, 이를 참조하여 본 전체에 통합되어 삽입합니다. Lin et al., "Microplate assay for denatured collagen using collagen hybridizing peptides," J. Orthopaedic Research, 2018년 11월 26일에 발표된 논문에 따르면 CHPs는 트립신-하이드록시프롤린 검사와 동등한 능력으로 손상된 또는 변성된 콜라겐 농도를 감지할 수 있습니다.
[0016] 현재 비알코올성 지방간병(NAFLD), 비알코올성 지방간염(NASH), 만성 신장질환(CKD), 특발성 폐섬유화(IPF)와 같은 질환에서 섬유증의 심각성을 판단하는 현재의 표준은 생검을 수행하고 조직을 조직병리학적 또는 면역조직화학(IHC) 기술을 사용하여 평가하는 것입니다. 조직 생검 내에서 콜라겐을 식별하기 위해 여러 가지 염료가 사용될 수 있습니다(예: Picrosirius red (PSR)/Fast green, Masson's trichrome, Herovici's 염색). 손상된 콜라겐은 염료의 부재 또는 훈련받은 병리학자에 의한 색도적 평가를 통해 확인될 수 있습니다. 앞서 언급된 염료들은 콜라겐 손상의 간접적인 지표일 뿐만 아니라 복잡한 염색 절차와 다양한 단계를 필요로 하며, 일부는 특수한 이미징 장비(편광광)의 사용이 필요하며, 콜라겐 함량을 평가하는 객관적인 이미지 분석 방법이 존재하지 않습니다. Trichrome staining (Masson's or Mallory's)은 콜라겐 함량을 과소평가하는 것으로 알려져 있습니다. 이 방법은 세 가지 다른 염료를 사용하여 세포 핵, 콜라겐 단백질 및 세포질을 염색합니다. 손상되지 않은 콜라겐은 파란색이나 초록색으로 염색되며, 케라틴과 근육 섬유는 빨간색으로 염색되고, 세포질은 분홍색으로 염색되며, 세포 핵은 갈색이나 검은색으로 염색됩니다. 손상된 콜라겐은 구조가 손상되어 사용 가능한 색상들 사이에서 혼합되기 때문에 객관적인 이미지 분석 방법이 올바른 영역을 식별하는 것이 어렵습니다. Sirius Red/Fast Green 염색은 Trichrome 염색의 문제를 극복하고 편광광에 의한 더 나은 시각화를 제공하기 위해 개발되었습니다. 이 방법은 콜라겐 섬유와 번들을 빨강색으로 염색하고, 비콜라겐 단백질 (예: 파이브로넥틴, 라민인)은 녹색/노란색으로 염색합니다. 이 염색 절차는 편광광을 사용하여 특이성, 감도, 그리고 해상도를 향상시킵니다. 그러나 손상된 콜라겐은 손상된 콜라겐 섬유의 방향성이 없기 때문에 어두운 영역으로 나타날 수 있습니다. Picrosirius red는 길게 빛의 이중굴절을 가지는 분자로서 조직 내에서 다양한 분자에 결합할 수 있습니다. 그러나 콜라겐에 결합할 경우, 이 분자는 콜라겐 섬유와 평행하게 배치되어 콜라겐의 자연스러운 이중굴절을 크게 증가시킵니다. 따라서, 복잡한 섬유상 콜라겐/시리우스 레드는 시리우스 레드와 다른 단백질로 만들어진 복합체보다 이분극성이 높습니다. 시리우스 레드에 결합된 섬유상 콜라겐은 이후 이분극성 광선 아래에서 밝게 나타나며 주변 조직의 어두운/검은색과 선명한 대비를 이룹니다. 콜라겐이 손상되면 이분극성이 없어집니다. 마지막으로, 헤로비치 염색은 type I 및 type III 콜라겐뿐만 아니라 젊은 또는 오래된 콜라겐을 구별할 수 있습니다. 젊은 콜라겐은 파란색으로 염색되고, 성숙한 콜라겐은 빨간색으로 염색되며, 세포 핵은 파란색/검은색으로 염색됩니다. 그러나 콜라겐이 변성된 조직에서는 높은 변동성을 가지고 있으며 다양한 색의 염료를 사용하는 것으로 인해 변동성 있는 결과를 얻을 수 있습니다.
[0017] 이러한 염색물질의 평가는 조직의 색칠을 평가하는 경험이 풍부한 병리학자가 필요할 수 있으며, 각 염색물질의 색칠은 쉽게 잘못 해석될 수 있어 관찰자 간 및 관찰자 내 간의 변이가 발생할 수 있습니다. 이는 손상된 콜라겐이 구조화되지 않은 단백질이기 때문에 대다수의 염료나 항체가 구조화되지 않은 3D 에피토프를 대상으로 하는 데 어려움이 있기 때문일 수도 있습니다. 이로 인해 일부 지역이 부분적으로 염료로 색칠되거나 완전한 염색이 이루어지지 않을 수 있습니다. 따라서 이러한 염색 방법을 사용할 때, 병리학자들은 (예: Masson's Trichrome staining) 염색이 되지 않은 영역을 기준으로 손상된 콜라겐의 영역을 식별합니다.
[0018] 조직을 염색하는 또 다른 방법은 IHC에 대한 항체를 이용하는 것입니다. 항체는 높은 특이성을 가지고 있기로 알려져 있지만, 주로 다양한 차단, 세척, 항원 회수 단계를 거쳐 적합하게 적용하기 위한 특정 또는 비특정적인 배경을 극복해야 하는 것이 주요 어려움 중 하나입니다. 게다가 항체는 성공적으로 결합하기 위해서는 정의된, 온전한 3D 에피토프 항원을 필요로 하므로, 변성된 콜라겐과 같은 손상된 비구조화 단백질에 결합하는 것은 종종 불가능합니다. 상업적으로 사용 가능한 항체 중 하나는 C1,2C Antibody (Col 2 3/4C short Antibody) Rabbit Polyclonal Antibody (Ibex Pharmaceuticals; Montreal, CA)로, 절단된 콜라겐 Type I 또는 Type II 세그먼트를 검출할 수 있습니다. 더 구체적으로, 이 항체는 Type II 콜라겐의 3/4 조각에 대한 탈산화기(MMP-1, MMP-8 및 MMP-13)에 의한 절단으로 생성된 약 8개의 아미노산 서열 (GPPGPQG)을 포함하는 α chain fragment를 인식합니다. 그러나 효소의 빠른 절단 운동학 때문에 다른 MMPs나 기타 효소에 의해 펩타이드가 항체의 결합 전에 더 절단될 수 있으며, 단편이 해당 지역에서 제거되는 가능성도 있어 이 fragment를 검출하는 것은 일관성이 없으며 손상의 전체 범위를 전달하지 않을 수 있습니다. 현재의 방법에서 CHPs는 α-체인 이차 구조 모티프를 인식하기 때문에 (Gly-X-Y)3 이상의 서열을 가진 어떤 섹션과도 하이브리다이즈할 수 있습니다 (예: (Gly-X-Y)4). 또한, 여기에 기술된 CHPs는 조직 섹션 내의 콜라겐 손상을 감지하기에 매우 우수하며, 콜라겐 유형 (즉, 1, 2, 3, 4 등)이나 손상의 메커니즘 (열, 기계적, 화학적 또는 효소적인)과는 상관없이 하이브리다이즈할 수 있습니다.
[0019] CHP를 직접 사용함으로써 기존 기술과 관련된 문제를 해결할 수 있습니다. 현재의 개시에 따르면, CHP를 기반으로 한 단일 단계에서 모든 종류의 손상된 콜라겐을 고도의 특이성을 가지고 직접 염색할 수 있으며, 조직 염색의 색상 평가 없이 손상된 콜라겐의 지역을 정량화하거나 총 콜라겐 함량을 결정하기 위한 객관적인 이미징 분석 방법을 제공합니다. 바이오틴으로 표지(labeled)된 CHP는 (예: 병리학자들이 이미징 및 점수 매기기에 사용하는 현재의 장비) 형광 강도를 읽기 위해 광학 현미경이나 형광 현미경과 함께 사용될 수 있습니다. 또한, CHP 기반의 방법은 다른 염색 방법 (예: Masson's trichrome)에서 필요한 여러 단계와 염색제와 비교하여 single staining reagent을 사용할 수 있습니다.
[0020] 또 다른 측면에서, 현재의 개시에 따른 방법은 heat-mediated staining process을 통해 손상된 콜라겐 및 전체 콜라겐을 모두 염색하여, 다른 염색 방법 (예: 피크로시리우스 레드)에서 볼 수 있는 무결하고 완전한 염색의 불완전 또는 부분적인 염색을 피할 수 있습니다. 또한, 현재의 개시에 따른 방법은 CHPs를 사용하여 조직 절편에서 총 콜라겐 함량을 염색하고, 소프트웨어 (예: ImageJ)를 사용하여 형광 강도를 평가하는 방법을 보여줍니다. 일부 실시예에서는 의사들이 섬유증상의 진행을 모니터링하기 위해 질병 진행 중 다양한 시간 지점에서의 총 콜라겐 함량을 비교할 수 있습니다. 또한, 일부 실시예에서는 CHP 염색 기술을 사용하여 tissue section 내 모든 콜라겐 유형을 완전하게 측정하는 방법을 설명합니다. 일부 실시예에서는 CHPs를 사용하여 tissue section내의 손상된 콜라겐 함량을 신속하고 정확하게 식별하고, 조직 내의 손상 비율을 결정합니다 (예: 총 콜라겐 함량을 100% 손상으로 가정).
Definitions
[0021] 여기에서 "콜라겐"이란 용어는 모든 조직 유형(예: 뼈, 피부, 힘줄, 인대 등)에서 얻어진 것이 될 수 있습니다. 콜라겐은 폴리프로린 II와 유사한 구조를 가진 알파 체인 세 개가 삼중 나선 형태로 접힌 분자를 가리킬 수 있습니다. 또한, 이 용어는 콜라겐 유형 I-XXVIII 및 박테리아 콜라겐을 포함한 삼중 나선 영역을 포함하는 모든 단백질에 적용될 수 있습니다. 여기에서 "콜라겐"이란 용어는 인공 콜라겐 및 가공 또는 그 외에 수정된 콜라겐을 포함한 모든 형태의 콜라겐을 가리킬 수 있습니다. 일부 실시예에서는 콜라겐이 type I collagen, type II collagen, type III collagen, type IV collagen, type V collagen, type VI collagen, type VII collagen, type VIII collagen, type IX collagen, type X collagen, type XI collagen, type XII collagen, type XIII collagen, type XIV collagen, type XV collagen, type XVI collagen, type XVII collagen, type XVIII collagen, type XIX collagen, type XX collagen, type XXI collagen, type XXII collagen, type XXIII collagen, type XXIV collagen, type XXV collagen, type XXVI collagen, type XXVII collagen, type XXVIII collagen또는 그 조합 중에서 선택될 수 있습니다.
[0022] 여기에서 "콜라겐 함량"이란 용어는 콜라겐이 함유된 시료(예: 조직) 내의 콜라겐의 양을 가리킬 수 있습니다. 콜라겐 함량은 시료 내의 콜라겐의 무게, 시료 내의 콜라겐의 부피, 시료 내의 특정 유형의 콜라겐(예: 손상된 또는 변성된 콜라겐)이 시료 내의 전체 콜라겐 양에 대한 분율 등을 가리킬 수 있습니다. 일부 실시예에서는 콜라겐 함량을 결정하는 것이 시료 내의 총 콜라겐 양을 결정하는 것(예: 원래의 콜라겐을 의도적으로 변성시켜서)을 포함할 수 있습니다. 다른 실시예에서는 콜라겐 함량을 결정하는 것이 시료 내의 손상된 콜라겐의 양(예: 총 콜라겐 양에 대한 분수로)을 결정하는 것을 포함할 수 있습니다. "변성된" 콜라겐은 더 이상 삼중 나선 형태가 아닌 콜라겐을 가리킵니다.
[0023] 여기에서 "시료"란 생물학적 생체의 일부를 나타낼 수 있습니다. 시료는 세포, 조직, 장기, 또는 신체 부위일 수 있습니다. 시료는 생물학적 생체에서 취득되거나 분리될 수 있으며 (즉, ex vivo), 예를 들어 환자에서 제거된 종양 샘플 등이 있습니다. 예시 생물학적 시료로는 피부 샘플, 근육 샘플, 뼈 샘플, 신경 샘플, 결합 조직 샘플, 장기 조직 샘플 (예: 뇌, 폐, 간, 방광, 신장, 심장, 위, 장 등), 종양 샘플, 암성 샘플, 생체 유체 (예: 혈청 샘플 또는 요 샘플) 등이 있습니다. "시료"라는 용어는 또한 위에서 언급한 시료의 혼합물도 포함합니다. 또한 "시료"라는 용어는 처리되지 않은 또는 처리된(또는 사전 처리된) 생물학적 시료도 포함합니다. 일부 구현에서는 시료가 주체로부터 얻은 하나 이상의 세포로 구성될 수 있습니다. 일부 구현에서는 시료가 대부분 또는 완전히 원래 조직과 유사한 모양을 가지고 있는 것으로 정의됩니다. 다른 구현에서는 시료가 처리(예: 분쇄 또는 균질화하여 용액으로 만든 것)된 것일 수도 있습니다. 또 다른 구현에서는 시료가 인공적 또는 합성적인 것일 수도 있습니다.
[0024] 본 문맥에서 "콜라겐 함유 샘플" 또는 "콜라겐 함유 조직"은 콜라겐이 포함된 포유류 몸에서 분리된 피부, 근육 등을 나타낼 수 있습니다. "콜라겐 함유 샘플" 이라는 용어는 또한 콜라겐이나 콜라겐 함유 물질이 몸 외부에서 조립되거나 제조된 "인공적으로" 생성된 조직 (예: 인공 조직)도 포함합니다. "콜라겐 함유 샘플"은 균일한 용액으로 유화된 샘플 (예: 조직 샘플 또는 혈청 또는 요로 유체와 같은 생물학적 유체)을 나타낼 수도 있습니다.
[0025] 본원에 사용된 "disrupted collagen (손상된/깨진/혼란된 콜라겐)"은 콜라겐 분자 또는 그 행렬 중에서 적어도 일부가 서열이 접어지기를 시사하는 지역에서 삼중 나선형을 형성하지 않는 콜라겐 단백질의 세 개 알파 체인을 가리킬 수 있다. "Disrupted collagen"은 또한 콜라겐 분자 또는 그 행렬 중에서 적어도 일부가 풀려난 세 개의 알파 체인 콜라겐 단백질을 가리킬 수 있다. 이러한 방식으로 혼란된 콜라겐은 혼란된 전체 길이 콜라겐이나 콜라겐 단편일 수 있다. 콜라겐 단편은 전체 길이 콜라겐 서열보다 짧은 어떤 콜라겐 서열이라도 될 수 있다. 단편은 또한 중요한 원래 구조를 가지지 않거나 중요한 나선형이 없는 지역을 가지고 있어 그 크기가 작을 수 있다.
[0026] 본원에 사용된 "denatured collagen (변성된 콜라겐)"이란 열, 기계적, 화학적, 효소, 산도 또는 기타 효과로 인해 원래의 삼중 나선 구조가 손상된 콜라겐을 의미합니다. 이러한 denatured collagen은 denatured full-length collagen 또는 collagen fragment가 될 수 있습니다. Collagen fragment란 full-length collagen sequence보다 짧은 어떤 콜라겐 서열이 될 수 있습니다. Fragment(단편)들은 중요한 원형 구조가 없거나 원형의 삼중 나선 형태가 없는 영역이 있는 크기일 수도 있습니다.
[0027] 본원에 사용되는 "콜라겐 하이브리다이징 펩타이드(Collagen Hybridizing Peptide, CHP)"는 Sm-(Gly-X-Y)3-20 시퀀스를 갖는 펩타이드를 말합니다. 여기서 S는 스페이서 분자를 나타내고, m은 0에서 10까지의 정수이며, Gly는 글리신을 나타냅니다. X와 Y 중 하나 이상은 프롤린, 수정 프롤린, 및/또는 하이드록시프롤린입니다. 예를 들어, CHP는 Sm-(Gly-X-Hyp)9일 수 있으며, 여기서 S는 스페이서 분자이고, m은 0에서 10까지의 정수이며, X는 프롤린 또는 수정 프롤린, Gly는 글리신을 나타내고, Hyp는 하이드록시프롤린을 나타냅니다.
[0028] 본원에 사용된 "스페이서 분자"는 검출 가능한 모이어티 및/또는 CHP에 연결된 하나 이상의 분자 또는 아미노산을 지칭할 수 있습니다. 일반적으로, 스페이서는 검출 가능한 모이어티 또는 CHP와 결합되어 있는 하나 이상의 분자 또는 아미노산으로 구성됩니다. 한 실시예에서, 스페이서는 Sm으로 지정된 하나 이상의 아미노산 또는 그의 유도체입니다. 이때, m은 0에서 10까지의 정수입니다.
[0029] 한 측면에서, CHP는 검출 가능한 모이어티로 표시될 수 있다. 본원에서 "detectable moiety (검출 가능한 모이어티)"는 CHP가 대상에 결합될 때 검출 신호를 생성할 수 있는 CHP에 결합된 분자를 가리킨다. 검출 신호는 광학 이미징 시스템을 사용하여 이미지화할 수 있는 광학 신호가 될 수 있다. 광학 신호는 하나 이상의 광 파장의 광 강도 변화로 인해 발생될 수 있다. 검출 가능한 모이어티는 CHP에 직접적으로 또는 간접적으로 결합되거나, 하이브리다이즈(directed hybridization), 획득(Conjugation) 또는 공유결합(covalent link)될 수 있다. 일부 구현에서, 검출 가능한 모이어티는 형광 분자 또는 화학 발광 분자일 수 있다. CHP는 검출 가능한 모이어티를 통해 광학적으로 감지될 수 있다. 결합은 공유결합 또는 비공유결합(이온 상호작용, 반 더 발스력 등을 통해)일 수 있다. 공유결합이 구현될 경우, 검출 가능한 모이어티는 링커(linker)를 통해 CHP에 결합될 수 있다. 경우에 따라, 링커는 광전해가능한(자외선 빛 하에서 가용성이 있는), 화학전해가능한(예: 환원제인 dithiothreitol(DTT), tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) 등을 통해 전해) 또는 효소적으로 전해가능한(에스테르아제, 리파아제, 펩티아제 또는 프로테아제를 통해) 링커일 수 있다. 일부 구현에 따르면, 라벨이 부착된 CHP는 다음의 Formula I을 포함할 수 있다:
L-Sm-(Gly-X-Y)3-20 (Formula I)
여기서, L은 하나 이상의 감지 가능한 결합체이며, S는 스페이서 분자이고, m은 0에서 10 사이의 정수이다. Gly는 글리신을 나타내며, X와 Y 중 적어도 하나는 프롤린, 변형 프롤린 및/또는 하이드록시프롤린 중 하나이다. 일부 구현에 따르면, m은 0이 아니다. 일부 구현에 따르면, m은 1이다. 일부 구현에 따르면, m은 2이다. 일부 구현에 따르면, m은 3이다.
[0030] 본 발명에서, "항원"이란 항체 분자나 T-세포 수용체와 같은 특정 유체면역 또는 세포면역의 생성물에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 화합물, 조성물 또는 물질을 가리킨다. 항원은 예를 들어 하프텐, 단순 중간 대사산물, 당 (예: 올리고당/ oligosaccharides), 지질 및 호르몬과 같은 분자일 수 있으며, 복합 탄수화물 (예: 다당류/ polysaccharides), 인지질, 핵산 및 단백질과 같은 대형 분자를 포함한 어떤 유형의 분자든 될 수 있다.
[0031] 본 발명에서, "고정 샘플"이란 생물체로부터 샘플을 취하기 전에 존재하던 세포 및 구조물의 형태학적 및/또는 생화학적 특징을 보존하는 데 도움이 되도록 처리된 샘플을 가리킨다. 고정 샘플은 포름알데히드, 파라포름알데히드 또는 글루타랄데히드와 같은 알데하이드 고정제로 샘플을 처리하여 제조될 수 있다. 또한, 메탄올, 에탄올 또는 아세트산을 포함하는 알코올 기반 고정제로 샘플을 처리하여 고정 샘플을 제조할 수도 있다. 또는, 오스미움 테트라옥사이드나 과망간산칼륨과 같은 산화제로 샘플을 처리하여 고정 샘플을 제조할 수도 있으며, 수은 염 또는 피크릭산과 같은 금속 기반 고정제를 사용하여 고정 샘플을 제조할 수도 있다. 특정 구현에서는, 세포를 포함하는 샘플을 중성 버퍼 포름알린(NBF) 용액과 접촉하여 고정 샘플을 제조하는 것이다. 이 경우 NBF 용액은 일반적으로 약 2%에서 6%, 또는 약 3.7% 포름알린(10% 포름알데히드와 1% 메탄올)인 용액으로 사용된다.
[0032] 본원에 사용되는 "슬라이드(slide)"는 생물학적 시료를 분석하기 위해 생물학적 시료가 놓이는 모든 기판(예: 유리, 석영, 플라스틱, 실리콘 등으로 만들어진 기판)을 의미하며, 특히 표준 3 inch (7.62 cm) by 1 inch (2.54 cm) 미세조직학 슬라이드 또는 표준 75mm Х 25mm 미세조직학 슬라이드와 같은 "현미경 슬라이드(microscope slide)"를 의미합니다.
[0033] 본원에 사용되는 단수형 용어인 "a", "an", "the"는 문맥이 명백하게 반대를 나타내지 않는 한 복수 대상을 포함합니다. 마찬가지로, "or"는 문맥이 명백하게 반대를 나타내지 않는 한 "and"를 포함하는 것을 의도합니다.
[0034] 본 명세서와 청구항에서 사용되는 구문 "at least one" (적어도 하나)는 하나 이상의 요소 목록에 대한 것으로, 요소 목록에서 명시적으로 나열된 모든 요소 중 적어도 하나를 포함하는 것을 의미합니다. 그러나 요소 목록 내의 각 요소 중 하나 이상을 반드시 포함하거나, 요소 목록 내의 요소 조합을 제외하지 않습니다. 이 정의는 명시적으로 식별된 요소 이외에도 "적어도 하나" 구문이 참조하는 요소 목록 내의 요소와 관련이 있거나 관련이 없는 요소가 선택적으로 존재할 수 있다는 것도 허용합니다. 따라서 비제한적인 예를 들면, "A와/과 B 중 적어도 하나"(또는 동등한 의미로 "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는 "A 또는/또는 B 중 적어도 하나")는 한 구현 예에서 B가 없는 적어도 하나의 A (B 이외의 요소를 포함하여 선택적으로 더 많은 A를 포함할 수도 있음), 다른 구현 예에서 A가 없는 적어도 하나의 B (A 이외의 요소를 포함하여 선택적으로 더 많은 B를 포함할 수도 있음), 또 다른 구현 예에서는 적어도 하나 이상의 A(선택적으로 더 많은 A를 포함할 수 있음)와 적어도 하나 이상의 B(선택적으로 더 많은 B를 포함할 수 있음)를 포함하는 것 등이 될 수 있습니다.
[0035] "Comprising," "including," "having," 그리고 이와 유사한 용어는 서로 교환 가능하며 동일한 의미를 가집니다. 마찬가지로, "comprises," "includes," "has," 그리고 이와 유사한 용어는 서로 교환 가능하며 동일한 의미를 가집니다. 구체적으로, 이러한 용어 각각은 "다음을 포함하는 것 이상"을 의미하는 개방 용어로 정의되며, 추가적인 기능, 제한, 측면 등을 배제하지 않는 것으로 해석됩니다. 예를 들어, "구성 요소 a, b, c를 가진 장치"는 장치가 적어도 구성 요소 a, b, c를 포함한다는 것을 의미합니다. 마찬가지로 "a, b, c 단계를 포함하는 방법"이라는 구문은 적어도 단계 a, b, c를 포함한다는 것을 의미합니다. 또한 단계와 과정은 여기서 특정한 순서로 설명될 수 있지만, 특정한 순서가 명확하게 표시되지 않는 한 단계와 과정의 순서는 달라질 수 있다는 점에 숙련된 기술자는 인식할 것입니다.
[0036] 본원에 사용되는 "약"(about)이란 숫자 값(예: 정수, 분수, 백분율 등)을 나타내며, 명시적으로 명시되지 않은 경우도 포함합니다. "About"이란 용어는 일반적으로 숫자 값의 범위 (예: 기재된 값의 +/- 5, 6, 7, 8, 9, 10% 등)을 나타내며, 이 값은 해당 기재된 값과 동일한 기능이나 결과를 갖는 것으로 평가되는 범위를 의미합니다. 경우에 따라 "약" 용어는 반올림된 숫자 값을 포함할 수 있습니다.
[0037] 본 명세서에 사용된 "실질적으로(substantially)"라는 용어는 흥미로운 특성 또는 속성의 전체적이거나 근접한 전도도 또는 정도를 나타내는 정성적인 상태를 말합니다. 일부 구현에서는 "실질적으로"는 대략 20% 내외를 의미합니다. 일부 구현에서는 "실질적으로"는 대략 15% 내외를 의미합니다. 일부 구현에서는 "실질적으로"는 대략 10% 내외를 의미합니다. 일부 구현에서는 "실질적으로"는 대략 5% 내외를 의미합니다.
콜라겐 하이브리딩 펩타이드 (CHP) 및 이를 사용하는 방법
[0038] 콜라겐은 인체의 거의 모든 조직에서 발견되는 주요 구조 단백질입니다. 자연적인 조직 홈오스테이시스를 위해 콜라겐 대사가 필요하기 때문에, 변성된 콜라겐은 기초 수준에서 존재합니다. 그러나 지나친 콜라겐 리모델링(분해 또는 합성)은 많은 인간 질병 및 손상과 연관되어 있습니다. 일부 구현 예에서, CHPs는 손상된, 분해된, 리모델링된 또는 풀린 콜라겐에 특이적으로 결합할 수 있는 짧은 반복 트라이펩타이드를 포함합니다. CHPs는 손상된 콜라겐을 구별하기 위해 구조 모티브(예: 알파 체인의 폴리-프롤린 II 유사 나선구조)를 인식함으로써 정상적인 콜라겐 분자에는 사용할 수 없는 것으로 구별할 수 있습니다. 그런 다음 CHPs는 고도로 안정적이고 오래 지속되는 결합을 형성함으로써 하이브리다이제이션을 통해 콜라겐 삼중 나선 구조를 재구성합니다. 일부 구현 예에서, 본 출원은 CHPs를 사용하여 조직 내의 총 콜라겐 함량 및 손상된 콜라겐의 백분율을 직접 결정하는 방법을 제공합니다.
[0039] Fig. 1 (그림 1)은 CHPs를 사용하여 병리 조직 샘플에서 분해된 콜라겐의 함량을 추정하는 현재 개시의 예시 방법을 보여줍니다. 그림 1은 CHPs를 사용하여 열 변성으로 전체 콜라겐량 (오른쪽)을 찾은 다음, 전체 콜라겐의 함수로 샘플 내 분해된 콜라겐의 분율을 결정하는 방법의 도식을 보여줍니다. 간단히 말해서, 파괴된 콜라겐의 양을 결정하기 위해 조직 샘플은 유리에 준비되고 CHPs로 염색하며, 파괴된 콜라겐 부위에 위치합니다. 조직 샘플은 형광 현미경을 사용하여 촬영하고 형광 강도를 측정합니다(그림 1, 왼쪽). 전체 콜라겐량을 결정하기 위해 직렬 조직 단면 또는 샘플은 유리에 준비되고 열 변성 및/또는 항원 회수 (예: 열 유도 에피토프 리트리벌; HIER)에 노출됩니다. 이후, 샘플은 파괴된 콜라겐이 측정되는 샘플과 동일하게 처리됩니다. 구체적으로, 샘플은 CHPs로 염색되고 촬영됩니다(그림 1, 오른쪽). 샘플이 HIER을 사용하여 처리되었기 때문에 샘플 내 콜라겐이 완전히 파괴되어 CHPs가 결합하여 샘플 내 전체 콜라겐에 해당하는 광학 신호를 제공합니다.
[0040] 그림 2A-C는 섬유화된 인간 간 조직의 면역조직화학 이미지를 보여줍니다. 본 발명의 방법은 섬유화 조건을 평가하는 연구자에게 유용할 수 있으며, 조건이 더 심각할수록 총 콜라겐 양이 증가하므로 질병 진행에 대한 통찰력을 제공하거나 진단에 대한 추가 바이오마커로 사용될 수 있습니다. 콜라겐의 총 양은 HIER 후 CHPs로 염색하여 찾을 수 있습니다. HIER 없이 (열처리하지 않은, non-HIER) 150ms 노출 시간으로 처리된 건강한 간 조직의 이미지 (A)에서는 관찰 가능한 콜라겐 신호가 없습니다. (B)는 (왼쪽; HIER)과 (오른쪽; Native) HIER 처리가 있는 섬유화된 간 조직의 1배율 이미지를 보여줍니다. (C, 상단)은 CHPs 처리 후 HIER 여부에 따라 확인된 섬유화된 간 조직의 삽입 영역의 5배율 이미지를 보여줍니다. (왼쪽)과 (오른쪽)은 각각 HIER가 있는 경우와 없는 경우입니다. (C, 하단)은 (왼쪽)과 (오른쪽) 각각 HIER가 있는 경우와 없는 경우에 대해 확인된 섬유화된 간 조직의 삽입 영역의 20배율 이미지를 보여줍니다. HIER로 처리된 샘플은 변성된 콜라겐에 해당하는 Cy5 신호가 증가합니다.
[0041] 그림 3A-B는 본 발명의 방법을 사용하여 열융해 에피토프 검색 (HIER), 헤마톡실린과 이오신 (HE), 또는 Masson's trichrome(Masson)으로 염색한 섬유화된 간 조직의 면역 조직화학 영상 비교를 보여줍니다. (A)는 HIER (상단)로 염색한 섬유화된 간 조직의 1배 확대 영상을 보여줍니다. 이어서 CHP 처리를 한 것, 헤마톡실린과 이오신으로 염색한 섬유화된 간 조직, Masson's trichrome으로 염색한 섬유화된 간 조직을 보여줍니다. (B, 상단)는 HIER로 염색한 CHP 처리된 섬유화된 간 조직 (왼쪽), HE 염색으로 식별된 섬유화된 간 조직 (중간), Masson's trichrome으로 식별된 섬유화된 간 조직 (오른쪽)을 보여줍니다. (B, 하단)은 HIER로 염색한 CHP 처리된 섬유화된 간 조직 (왼쪽), HE 염색으로 식별된 섬유화된 간 조직 (중간), Masson's trichrome으로 식별된 섬유화된 간 조직 (오른쪽)을 보여줍니다. CHP 염색(HIER)과 H&E 및 Masson's trichrome염색을 비교하면 간의 섬유성 콜라겐을 CHP 염색(HIER)으로 더 명확하고 쉽게 시각화할 수 있습니다.
[0042] 일부 구현 예에 따르면, 본 발명의 방법은 열 매개 항원 회수(heat mediated antigen retrieval)/열 유도 에피톱 회수(HIER) 방법 중 CHP 응용을 포함합니다. 이 방법은 조직 단면 내의 콜라겐을 완전히 변성시키며, 두께가 다른 건강한 토끼 피부 조직에서 성공적으로 적용되었으며, 결과는 콜라겐 함량과 CHP 신호 강도 사이에 거의 선형적인 상관 관계가 있는 것으로 나타났습니다(Fig. 4).
[0043] 본 발명의 일부 측면에서는 시료 내 전체 콜라겐 함량을 측정하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 전체 콜라겐 함량은 콜라겐이 포함된 샘플(예: 조직) 내 전체 콜라겐 양을 나타낼 수 있다. 콜라겐 함량은 샘플 내 콜라겐의 무게, 샘플 내 콜라겐의 부피, 특정 유형의 콜라겐(예: 파괴된 또는 변성된 콜라겐)의 샘플 내 총 콜라겐 양 대비 비율을 나타낼 수 있다. 일부 실시 예에서는 콜라겐 함량을 결정하기 위해(원래의 콜라겐을 의도적으로 변성시켜) 샘플 내 전체 콜라겐의 양을 결정하는 것을 포함한다. 다른 실시 예에서는 콜라겐 함량을 결정하기 위해(전체 콜라겐의 일부로서) 샘플 내 파괴된 콜라겐의 양을 결정하는 것을 포함한다.
[0044] 일부 구현 예에서는 질환을 가진 대상체에서 조직 샘플을 획득합니다. 일부 구현 예에서는 조건은 GSD II (글리코겐 저장 질환 제 3형), GSD VI (글리코겐 저장 질환 제 6형), GSD IX (글리코겐 저장 질환 제 9형), 비알코올성 지방간염 (NASH), 간경화증, 간염, 경화증, 알코올성 지방간 질환, 비알코올성 지방간 질환, 아테로스클러로시스, 천식, 섬유화, 심장 섬유화, 장기 이식 섬유화, 근육 섬유화, 췌장 섬유화, 골수 섬유화, 간 섬유화, 간 및 담낭의 경화증, 비장 섬유화, 신장 섬유화, 폐 섬유화, 특발성 폐 섬유화, 확산성 조직성 폐 질환, 특발성 간질성 섬유화, 확산성 간질성 섬유화, 조직성 폐렴, 탈세포성 폐렴, 호흡기 브로키올리티스, 조직간 폐 질환, 만성 간질환, 급성 간질성 폐렴, 과민성 폐염, 비특이성 간질성 폐렴, 알레르기성 폐질환, 폐석면증, 폐기종, 조직성 폐 질환, 사르코이도시스, 매개신경 섬유증, 심장 섬유증, 미각판 섬유증, 내막근섬유증, 심근 경색, 신장 섬유증, 만성 신장 질환, 2형 당뇨병, 황반 변성, 노인성 황반변성, 켈로이드 병소, 비대증성 흉터, 신경성 체계 섬유증, 주사 섬유증, 수술 합병증, 섬유성 만성 이식혈관병증 및/또는 이식된 장기의 만성 거부, 허혈-재관류 손상과 관련된 섬유화, 후천적 거증증후군, 류머티스 관절염과 관련된 섬유화, 관절섬유화, 디뷔트렌 질환, 피부근염-다근염, 혼합 결합조직질환, 구강 내 섬유성 증식 병변, 섬유성 장폐색증, 크론병, 신경교감상 강화, 류막성 섬유화, 수막염, 전신성 루푸스, 방사선 노출로 인한 섬유화, 유방 낭종 파열로 인한 섬유화, 골수섬유증, 복강후 섬유화, 진행성 거대 섬유화, 상처, 상처 치유, 노화된 피부, 골관절염, 또는 그 증상 또는 후유증, 또는 세 가닥 나선형 콜라겐의 교란 등, 세포외 기질 구성 요소의 파괴로 인한 기타 질환 또는 상태가 포함될 수 있습니다.
[0045] 일부 구현 사례에서는 시료가 조직 시료이며, 이 조직 시료의 두께는 약 1 마이크로미터(μm)에서 약 100 μm 사이입니다. 일부 구현 사례에서는 시료가 조직 시료이며, 이 조직 시료의 두께는 약 1 μm, 약 2 μm, 약 3 μm, 약 4 μm, 약 5 μm, 약 6 μm, 약 7 μm, 약 8 μm, 약 9 μm, 약 10 μm, 약 11 μm, 약 12 μm, 약 13 μm, 약 14 μm, 약 15 μm, 약 16 μm, 약 17 μm, 약 18 μm, 약 19 μm, 약 20 μm, 약 25 μm, 약 30 μm, 약 35 μm, 약 40 μm, 약 45 μm, 약 50 μm, 약 60 μm, 약 70 μm, 약 80 μm, 약 90 μm, 약 100 μm, 약 200 μm, 약 300 μm, 약 400 μm, 약 500 μm, 약 600 μm, 약 700 μm, 약 800 μm, 약 900 μm, 약 1 밀리미터(mm), 약 1.2 mm, 약 1.4 mm, 약 1.6 mm, 약 1.8 mm, 약 2 mm, 약 2.2 mm, 약 2.4 mm, 약 2.6 mm, 약 2.8 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm 또는 해당하는 두 값의 범위일 수 있습니다.
[0046] 본 글에서 "생물학적 생물" 또는 "대상"은 인간이나 동물, 세균, 또는 이전에 언급된 그룹 중 어떤 것이든지 포함될 수 있습니다. 동물의 비제한적인 예로는 영장류, 쥐류, 가축, 또는 야생 동물 등 척추동물이 포함됩니다. 영장류에는 침팬지, 흰수염원숭이, 거미원숭이 및 유인원숭이(Rhesus)가 포함됩니다. 쥐류에는 생쥐, 쥐, 목도리곰, 페레트, 토끼 및 햄스터가 포함됩니다. 가축과 야생 동물에는 소, 말, 돼지, 사슴, 미국 들소, 버팔로, 암사슴, 고양이 종(가정 고양이 등) 및 개 종(개, 여우, 늑대 등)이 포함됩니다. 상어류(연골어류) 및 뼈어류도 포함됩니다. 특정 구현 예에서는 생물학적 생물 또는 대상이 조명어로 참조되는 장마디어가 될 수 있습니다. 대상은 포유류일 수 있습니다. 포유류는 인간, 비인간 영장류, 생쥐, 쥐, 개, 고양이, 말, 소 등이 포함될 수 있지만 이에 국한되지는 않습니다. 또한 여기에서 묘사된 방법은 가축 또는 애완동물을 진단하고/또는 치료하는 데 사용될 수 있습니다. 이 용어는 특정 연령이나 성별을 지칭하지 않습니다. 따라서 남성이나 여성, 성인 및 신생아, 태아도 이 용어의 범위에 포함될 것입니다.
[0047] 대상자는 이전에 치료가 필요한 상태로 진단되었거나, 해당 상태에 대한 고통을 호소하고 있거나, 해당 상태와 관련된 하나 이상의 합병증이 확인된 대상자가 될 수 있습니다 (예 : 섬유화, 상처 / 상처 치유, 특발성 폐섬유화증 (IPF), 노화된 피부, 간 섬유화, 비알코올성 스테아토간염 (NASH), 비알코올성 지방간질환 (NAFLD), 알코올성 지방간질환 (AFLD), 신장 섬유화, 변기 공항증, 노화성 근골격계 질환, 각막원추라는 등). 일부 구현에서는 간 섬유화 상태일 수 있습니다. 일부 구현에서는 비알코올성 스테아토헤파티티스(NASH) 상태일 수 있습니다. 일부 구현에서는 비알코올성 지방간질환 (NAFLD) 상태일 수 있습니다. 일부 구현에서는 알코올성 지방간질환 (AFLD) 상태일 수 있습니다. 대상자는 해당 상태나 하나 이상의 합병증에 대해 이미 치료를 받은 경우가 있을 수 있습니다.
[0048] 어떤 경우에는, 여기서 설명한 방법들은 환자의 질병의 발생 또는 진행을 결정하는 데 사용될 수 있습니다. 일부 경우에는, 총 콜라겐 함량과 손상된 콜라겐 함량을 조합하여, 특정 샘플 그룹에 정규화된 손상된 콜라겐의 목적적 측정값으로 사용할 수 있는 비율로 결합됩니다. 어떤 경우에는, 이 비율은 질병 상태의 진행 또는 해결의 예측적 생체 표지자(biomarker)로 사용될 수 있습니다.
[0049] 어떤 실시예에서는, 본 발명에서 서술된 방법은 환자로부터 다른 샘플에서 총 콜라겐 함량을 감지하는 것을 더 포함할 수도 있습니다. 어떤 실시예에서는, 라벨링된 CHP를 비삼중나선 콜라겐에 접촉시켜 동일한 샘플 또는 환자로부터 얻은 다른 샘플에서 비삼중나선 콜라겐을 감지할 수도 있습니다. 비삼중나선 콜라겐은 콜라겐을 해열하는 과정 없이, 삼중나선 콜라겐을 감지하는 방법과 동일한 절차로 감지됩니다. 추가적인 실시예에서는, 본 방법은 감지된 콜라겐 함량(예: 총 콜라겐, 비삼중나선 콜라겐, 또는 둘 다)을 샘플에서 다른 샘플 또는 제어 함량 값과 비교하는 것을 더 포함할 수도 있습니다.
[0050] 대안적으로, 대상자는 이전에 상태를 진단받은 사람이나 해당 상태와 관련된 하나 이상의 합병증이 있는 것으로 확인된 사람이 될 수 있습니다. 예를 들어, 대상자는 해당 상태나 합병증의 하나 이상의 위험 요소를 나타내는 사람이 될 수 있습니다. 대상자는 위험 요소를 나타내지 않을 수도 있습니다. "치료 필요 대상"은 특정한 상태에 대한 의심 환자, 해당 상태를 진단받은 환자, 이미 해당 상태를 치료받았거나 치료 중인 환자, 해당 상태를 치료받지 않은 환자 또는 해당 상태를 발병할 위험이 있는 환자일 수 있습니다.
[0051] 본 발명에서 서술된 방법과 시스템은 인간 및 침팬지, 기타 유인원 및 원숭이 종, 소, 양, 돼지, 염소, 말과 같은 가축, 개 및 고양이와 같은 가축동물, 쥐, 쥐너구리, 기니피그, 제브라피쉬와 같은 실험동물을 비롯한 다양한 주체의 샘플을 이미징하는 데 사용될 수 있습니다. 샘플은 주체로부터 분리된 것일 수도 있으며(즉, ex vivo), 다른 경우에는 주체의 일부분(즉, in vivo 또는 in situ)일 수도 있습니다.
[0052] 일부 실시예에서는, 본 방법은 시료 내의 콜라겐을 변성시킨다. 전문가에게 알려진 모든 방법이 시료를 변성시키는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 시료 내의 콜라겐을 변성시키는 것은 시료 내의 콜라겐의 삼중 나선 구조를 붕괴시킬 수 있다는 것을 의미한다.
[0053] 일부 실시예에서는 항원 회수(antigen retrieval)를 통해 샘플 내의 콜라겐을 변성하여 변성 샘플을 생성합니다. 일부 실시예에서는 회수제(retrieval agent)가 수, 버퍼, 효소, 촉매성 시약, 금속 착불제, 핵영합체, 산화제, 유기산/염기 쌍, 루이스 산 등의 하나 이상을 포함하는 항원 회수제인 경우가 있습니다. 일부 실시예에서는 항원 회수제가 수, 버퍼, 효소, 촉매성 시약, 금속 착불제, 핵영합체, 산화제, 유기산/염기 쌍, 루이스 산 등의 최소한 두 가지를 포함하는 경우가 있습니다. 일부 실시예에서는 항원 회수제가 수, 버퍼, 효소, 촉매성 시약, 금속 착불제, 핵영합체, 산화제, 유기산/염기 쌍, 루이스 산 등의 최소한 세 가지를 포함하는 경우가 있습니다. 일부 실시예에서는 항원 회수제가 버퍼 (예: TRIS)를 포함하며, pH가 약 6에서 약 9까지 범위 내에 있습니다.
[0054] 일부 구현 예에 따르면, 본 방법은 시료를 열에 노출함으로써 시료 내의 콜라겐을 변성시키는 것을 포함합니다. 일부 구현 예에 따르면, 본 방법은 시료를 마이크로파에 노출함으로써 시료 내의 콜라겐을 변성시키는 것을 포함합니다. 일부 구현 예에 따르면, 본 방법은 시료를 초음파에 노출함으로써 시료 내의 콜라겐을 변성시키는 것을 포함합니다. 일부 구현 예에 따라, 시료는 약 50도 섭씨 (℃에서 약 160℃사이로 가열됩니다. 일부 구현 예에 따라, 시료는 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 약 70℃, 약 75℃, 약 80℃, 약 85℃, 약 90℃, 약 95℃, 약 100℃, 약 105℃, 약 110℃, 약 115℃, 약 120℃, 약 125℃, 약 130℃, 약 135℃, 약 140℃, 약 145℃, 약 150℃, 약 155℃, 약 160℃ 또는 해당하는 두 값 사이의 범위로 가열될 수 있습니다. 일부 구현 예에 따라, 시료가 가열될 때, 항원 회수제(antigen retrieval agent)의 증발을 최소화하거나 항원 회수제의 끓음을 완화하거나 방지하기 위해 압력을 유지할 수 있습니다.
[0055] 어떤 경우에는, 해당 방법은 샘플을 열에 노출하여 콜라겐을 변성시키는 것을 포함하며, 샘플은 약 10초에서 45분 사이로 가열됩니다. 어떤 경우에는, 해당 방법은 샘플을 열에 노출하여 콜라겐을 변성시키는 것을 포함하며, 샘플은 약 10초 (s), 약 20초, 약 30초, 약 40초, 약 50초, 약 1분 (min), 약 1.5분, 약 2분, 약 2.5분, 약 3분, 약 3.5분, 약 4분, 약 4.5분, 약 5분, 약 5.5분, 약 6분, 약 6.5분, 약 7분, 약 7.5분, 약 8분, 약 8.5분, 약 9분, 약 9.5분, 약 10분, 약 11분, 약 12분, 약 13분, 약 14분, 약 15분, 약 16분, 약 17분, 약 18분, 약 19분, 약 20분, 약 21분, 약 22분, 약 23분, 약 24분, 약 25분, 약 26분, 약 27분, 약 28분, 약 29분, 약 30분, 약 31분, 약 32분, 약 33분, 약 34분, 약 35분, 약 36분, 약 37분, 약 38분, 약 39분, 약 40분, 약 41분, 약 42분, 약 43분, 약 44분, 약 45분 또는 두 값 사이의 범위로 가열됩니다.
[0056] 일부 실시예에서, 본 방법은 샘플에 전자기파를 노출하여 샘플 내의 콜라겐을 변성시키는 것을 포함합니다. 일부 실시예에서, 전자기파의 파장은 약 10 nm에서 약 400 nm (자외선) 사이입니다. 일부 실시예에서, 전자기파의 파장은 약 200 nm에서 약 400 nm 사이입니다. 일부 실시예에서, 전자기파는 UVA 방사선(약 315 nm에서 약 400 nm의 파장을 가지는), UVB 방사선(약 280 nm에서 약 315 nm의 파장을 가지는) 및 UVC 방사선(약 100 nm에서 약 280 nm의 파장을 가지는) 중 하나 이상을 포함합니다. 노출 시간은 약 10분에서 약 2시간, 약 10분에서 약 1시간 또는 약 20분에서 약 45분일 수 있습니다. 파워는 UVA의 경우 약 1 J/cm2 에서 약 25 J/cm2, 약 5 J/cm2 에서 약 15 J/cm2, 또는 약 9 J/cm2 에서 약 12 J/cm2 일 수 있으며, UVB의 경우 약 100 mJ/cm2 에서 약 1 J/cm2, 약 200 mJ/cm2 에서 약 500 mJ/cm2, 또는 약 250 mJ/cm2 에서 약 350 mJ/cm2 일 수 있습니다.
[0057] 일부 실시예에서, 이 방법은 상기에서 설명한 방법을 사용하여 콜라겐을 변성시키는 것을 포함하며, 이 방법은 항원 회수도 포함한다. 일부 실시예에서, 변성 및 항원 회수는 동시에 수행된다. 일부 실시예에서, 변성 및 항원 회수는 순차적으로 수행된다. 일부 실시예에서, 항원 회수 전에 변성이 수행된다. 일부 실시예에서, 항원 회수 후에 변성이 수행된다.
[0058] 어떤 경우에는, 상기에 설명된 방법을 사용하여 콜라겐을 변성시키고, 또한 레이블된 콜라겐 하이브리다이징 펩타이드(CHP)를 변성된 콜라겐에 접촉시키는 단계를 포함한다. 어떤 경우에는, 변성과 레이블된 콜라겐 하이브리다이징 펩타이드(CHP)의 접촉은 동시에 수행된다. 어떤 경우에는, 변성과 레이블된 콜라겐 하이브리다이징 펩타이드(CHP)의 접촉은 순차적으로 수행된다. 어떤 경우에는, 변성은 레이블된 콜라겐 하이브리다이징 펩타이드(CHP)를 변성된 콜라겐에 접촉시키기 전에 수행된다. 어떤 경우에는, 변성은 샘플에 레이블된 콜라겐 하이브리다이징 펩타이드(CHP)를 접촉시킨 후 수행된다(예: CHP를 포함하는 용액에서 샘플을 처리한 후, 이를 가열하여 콜라겐을 변성시킨다). 하나의 구현 방법에서, 현재 고지에 따른 방법은, 표지되지 않은 샘플에 레이블된 콜라겐 하이브리다이징 펩타이드(CHP)를 접촉시키고 동시에 이미징 및 가열하여, 원래 샘플에서 깨어진 콜라겐의 양과 전체 콜라겐 양 간 차이에 해당하는 형광 강도 변화를 (실시간으로) 얻는 단계를 포함할 수 있다.
[0059] 일부 구현 방법에서는, 샘플 내의 총 콜라겐 함량을 결정할 때, 방법은 레이블된 콜라겐 하이브리다이징 펩타이드(CHP)를 변성된 콜라겐과 접촉시키는 것을 포함합니다(예: 샘플 내의 콜라겐을 변성한 후 CHP로 샘플에 접촉). 일부 구현 방법에서는, 원래 샘플 내에서 손상된 콜라겐의 양을 결정할 때, 방법은 변성하지 않은 샘플 내의 콜라겐에 레이블된 콜라겐 하이브리다이징 펩타이드(CHP)를 접촉시키는 것을 포함합니다(예: 샘플 내의 콜라겐을 변성하지 않고 CHP로 샘플에 접촉).
[0060] 콜라겐 함량(전체 콜라겐 함량 또는 원래 샘플에서 손상된 콜라겐 양)은 CHP의 라벨(label)에서 방출되는 광학적으로 감지 가능한 신호의 강도(또는 강도 변화)를 감지하여 측정할 수 있습니다.
[0061] 본 발명은 탐지 가능한 모이티(예: 라벨 또는 태그(a label or tag))를 포함하는 CHPs를 활용하는 방법 및 조성물을 사용합니다. 라벨 또는 태그는 라벨 또는 태그가 있는 CHPs를 감지할 수 있게 해줍니다. 라벨 또는 태그는 라벨 또는 태그가 있는 CHPs에 결합될 때 샘플 내 교란된 콜라겐 (예: CHP 대상)의 감지를 가능하게 합니다. 라벨이란 직접적으로 (즉, 기본 라벨) 또는 간접적으로 (즉, 이차 라벨) 검출될 수 있는 분자를 의미하며, 예를 들어 라벨은 시각화되고/또는 측정 또는 기타 방법으로 확인할 수 있으므로 그 존재 여부를 알 수 있습니다. 라벨 또는 태그가 있는 CHP는 샘플 내 교란된 콜라겐 (예: CHP 대상)의 감지를 가능하게 합니다. 화합물은 라벨에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있으며, 라벨은 검출 가능한 신호를 제공합니다. 이러한 라벨에는 방사성 동위원소, 형광 염료, 엔자임, 항체, 자석 입자 등이 포함될 수 있습니다.
[0062] 라벨(label)의 비제한적인 예시로는 다음과 같은 것들이 있다: a) 방사성 또는 중량 동위원자일 수 있는 동위원소 라벨(isotopic labels); b) 자기 라벨, 전기 라벨, 열 라벨; c) 색상 라벨, 루미네센트, 인광 및 형광 염료 또는 모이티 (moiety)를 포함한 광학 라벨; d) 결합 파트너(binding partners). 라벨은 효소 (예: 말갈즙 과산화효소(horseradish peroxidase)와 같은) 및 자성 입자(magnetic particles)도 포함한다.
[0063] 라벨은 형광 염료 또는 부분 구조물 같은 광학적 라벨을 포함합니다. 형광체는 "소분자" 형광체 또는 단백질 형광체 (예: 녹색 형광 단백질 (green fluorescent proteins) 및 모든 이에 해당하는 변형체)로 구성됩니다.
[0064] 적합한 형광 라벨에는 fluorescein, rhodamine, tetramethylrhodamine, eosin, erythrosin, coumarin, methyl-coumarins, pyrene, Malacite green, stilbene, Lucifer Yellow, Cascade Blue??, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705 및 Oregon green 등이 포함됩니다. 적합한 광학 염료(optical dyes)는 Richard P. Haugland의 1996 Molecular Probes Handbook에 설명되어 있습니다. 적합한 형광 라벨로는 GFP (Chalfie 등, Science 263 (5148) : 802-805, 1994) 및 EGFP (Clontech-Genbank Accession Number U55762), BFP (Quantum Biotechnologies, Inc., Stauber, R. H. Biotechniques 24 (3) : 462-471 (1998); Heim, R. and Tsien, R. Y. Curr. Biol. 6:178-182 (1996)), EYFP (Clontech Laboratories, Inc.), Luciferase (Ichiki 등, J. Immunol. 150 (12): 5408-5417 (1993)), β-galactosidase (Nolan 등, Proc Natl Acad Sci USA 85 (8): 2603-2607 (April 1988)) 및 Renilla (WO 92/15673, WO 95/07463, WO 98/14605, WO 98/26277, WO 99/49019, US Pat. No. 5,292,658, US Pat. No. 5,418,155, US Pat. No. 5,683,888, US Pat. No. 5,741,668, US Pat. No. 5,777,079, US Pat. No. 5,804,387, US Pat. No. 5,874,304, US Pat. No. 5,876,995 및 US Pat. No. 5,925,558) 등이 포함됩니다.
[0065] 일부 실시예에서는, 라벨은 다음과 같다: Alexa-Fluor dyes 염료 (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow and R-phycoerythrin (PE) (Molecular Probes) (Eugene, Oreg.), FITC, Rhodamine, and Texas Red (Pierce, Rockford, Ill.), cyanine 3 (Cy3), Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5(Amersham Life Science, Pittsburgh, Pa.), SulfoCyanine 3, Sulfo-Cyanine 5, Sulfo-Cyanine 5.5, Sulfo-Cyanine 7, Sulfo-Cyanine 7.5 (Lumiprobe, Hunt Valley, MD.). Cy5PE, Cy5.5PE, Cy7PE, Cy5.5APC, Cy7APC에 대한 Tandem conjugate 프로토콜이 알려져 있다. BD Biosciences, Beckman Coulter, AnaSpec, Invitrogen, Cell Signaling Technology, Millipore, eBioscience, Santa Cruz Biotech, Abcam, LiCor 및 Sigma-Aldrich와 같은 상업적인 출처에서 추가적인 라벨이 제공된다.
[0066] CHP에 부착된 형광 라벨은 한 파장의 빛(예: 파란색 또는 녹색)으로 자극된 빛으로 발광 스펙트럼의 다른 파장으로 방출되는 면역형광을 위해 선택된 염료들을 포함할 수 있습니다. 가장 일반적인 형광 염료는 초록색 빛을 방출하는 플루오레신, 빨간색 빛을 방출하는 텍사스 레드 및 페리딘 엽록소 단백질 (PerCP), 그리고 주황색/빨간색 빛을 방출하는 로다민 및 피코에리스린 (PE)입니다. 선택적 필터를 사용하여 형광 현미경에서 사용한 염료 또는 형광 염료에서 나오는 빛 만 감지할 수 있습니다. 이 기술은 샘플에서 균열난 콜라겐 (예 : CHP 대상)을 감지하는 데 사용될 수 있습니다.
[0067] 컴퓨터 지원 기술을 이용하여 세포 또는 조직의 초박막 광학 단면을 생성하는 형광 공초경(Confocal fluorescent microscopy)은 복잡한 시료 준비가 필요 없이 매우 고해상도의 면역 형광 현미경 영상을 제공합니다. 저강도 조명을 사용하여 형광 염료를 활성화하기 위해서는 두 개의 광자가 필요하므로 공초경의 해상도를 더욱 높일 수 있습니다. 펄스 레이저 빔을 사용하며, 형광을 활성화하기에 충분한 강도는 현미경의 초점면에 집중될 때만 생성됩니다. 이러한 방법으로 형광 방출은 광학 단면에 제한됩니다. 일부 구형광 공초경을 사용하여 시료 준비 없이 샘플을 분석할 수 있습니다.
[0068] 본 발명의 CHPs에 라벨로 사용될 수 있는 하나의 형광약물 그룹은 3,6-디하이드록시-9-페닐잔틴하이드롤 및 레사민에서 유래된 fluorescein 및 3,6-다미노-9-페닐잔틴하이드롤과 lissanime rhodamine B에서 유래된 rhodamine을 포함하는 xanthene 염료입니다. 9-오카르복시페닐잔틴하이드롤의 로다민 및 플루오레세인 유도체에는 9-오카르복시페닐기가 있습니다. 아미노 및 이소시아네이트 기 같은 반응성 결합 기를 가진 플루오레세인 이소시아네이트 및 플루오레스카민과 같은 화학기를 가진 플루오레세인 화합물은 쉽게 구할 수 있습니다. 다른 형광 화합물 그룹으로는 α- 또는 β-위치에 아미노기가 있는 나프틸아민이 있습니다. 일부 측면에서는 Goding, J. W. (Monoclonal Antibodies: Principles And Practice. New York: Academic Press (1983) pp 208-249)에서 설명한 절차에 따라 형광염료 또는 색소로 CHP를 표시합니다.
[0069] 일부 실시예에서는 루시페린과 같은 화학 발광체가 CHP에 부착될 수 있습니다 (예: U.S. Pat. No. 5,098,828 참조, 합성 및 감지 방법).
[0070] 어떤 경우에는 CHPs가 2차 검출가능한 라벨을 포함하는 경우가 있습니다. 2차 라벨 (secondary label)은 간접적으로 감지되는 라벨입니다. 예를 들어, 2차 라벨은 감지를 위해 주(primary) 라벨과 결합하거나 반응할 수 있으며, 추가적인 생성물에 대해 주 라벨을 생성하기 위해 작용할 수 있습니다(예: 효소). 2차 라벨은 바인딩 파트너 쌍 중 하나, 화학적으로 변형 가능한 모이어티, 누클레아제 억제제, 말린 염기인 효소 (예: 호스팅 과산화효소, 알카리 인산효소, 루시페라아제 등) 등이 포함됩니다.
[0071] 일부 실시예에서는, 2차 라벨은 결합 파트너 페어(binding partner pair)입니다. 한 가지 측면에서, 라벨은 바인딩 파트너를 결합시킬 합텐(hapten) 또는 항원(antigen)입니다. 예를 들어, 적합한 바인딩 파트너 페어에는 아래와 같은 것들이 포함됩니다: 단백질(펩타이드 포함)과 작은 분자를 포함한 항원과 항체(FAbs 등 포함한) ; 단백질과 작은 분자, 생물틴/스트렙타비딘을 포함한; 효소와 기질 또는 억제제; 다른 단백질-단백질 상호작용 페어; 수용체-리간드; 탄수화물 및 그들의 결합 파트너. 핵산-핵산 결합 단백질 페어도 고려됩니다. 바인딩 파트너 페어에는, 생물틴(또는 이미노-생물틴)과 스트렙타비딘, 그리고 디게옥신과 항체(Abs) 등이 포함됩니다.
[0072] 일부 실시예에서는, 2차 라벨은 화학적으로 수정 가능한 모이어티(모이어티는 화학 분자 내에서 다른 분자와 결합하여 새로운 분자를 형성하는 기능 단위를 의미합니다)입니다. 일부 실시예에서는 라벨을 담고 있는 분자에 반응성 기능 기기(reactive functional groups)가 포함됩니다. 그리고 그 기능 기기는 후속적으로 (어세이 이전이나 이후에) 주 라벨(primary label)로 표지됩니다. 적합한 기능성 기기에는, 아미노기, 카복시기, 말레이미드기, 옥소기 및 티올기 등이 포함됩니다. 예를 들어, 아미노기를 포함한 주 라벨은 알려진 링커(linker)를 사용하여 아미노기를 포함한 2차 라벨에 부착됩니다. 링커는 홈오- 또는 헤테로비펑셔널링크(homo- or hetero-bifunctional linker) 등이 포함됩니다.
[0073] 일부 실시예에서, 본 문서에서 공개된 방법 및 조성물에서는 여러 개의 형광 라벨이 사용됩니다. 일부 실시예에서는 각 라벨이 서로 구별되고 다른 라벨과 구별 가능합니다.
[0074] 일부 구현 예에서는 Chattopadhyay 등이 공개한 대로 양자점으로 CHPs를 표지/라벨합니다. Chattopadhyay, P. K. et al. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nat. Med. 12, 972-977 (2006).
[0075] 일부 구현 예에서는 CHPs가 Tanner et al. 공개한 대로 ICP-MS (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer)에 적합한 태그로 표지됩니다. Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy, 2007 March; 62(3):188-195; Ornatsky et al, Translational Oncogenomics (2006):1, 1-9; Ornatsky et al, Multiple Cellular Antigen Detection by ICP-MS, J. Imm. Methods 308 (2006) 68-76; and Lou et al., Polymer-Based Elemental Tags for Sensitive Bioassays, Angew. Chem. Int. Ed., (2007) 46, 6111-6114.
[0076] 한 측면에서, CHPs는 효소 라벨을 포함합니다. 여기서 효소 라벨이란 검출 가능한 생성물을 생성하는 라벨 효소 존재하에서 반응할 수 있는 효소를 의미합니다. 효소 라벨에는, 하지만 이에 국한되지 않는, CHPs와 공유결합된 인산화효소 또는 과산화물화효소 등이 포함됩니다. 적합한 효소 라벨로는 대두과매 peroxidase, 알카리성 인산화효소 및 포도당 산화효소 등이 있습니다. 효소 라벨의 존재는 일반적으로 라벨 효소 기질과의 반응에 의해 효소의 촉매작용으로 나타납니다. 이는 감지 및 측정되는 식별 가능한 생성물을 생성합니다. 이러한 생성물은, 눈으로 관찰되거나 분광기 기술을 통해 감지되는 색 변화일 수 있으며, 또한 기질을 생성물로 전환하여 형광으로 감지되는 신호가 될 수도 있습니다. 이러한 생성물은 tetramethyl benzidine과 대두과매 peroxidase 반응과 같이 불투명 할 수도 있으며 다양한 색상을 띌 수 있습니다. 피어스 화학사에서 구매할 수 있는 Luminol과 같은 다른 라벨 효소 기질도 형광 반응 생성물을 생산합니다. 라벨 효소 기질을 사용하여 라벨 효소를 식별하는 방법은 잘 알려져 있으며, 다양한 상업적 키트가 제공됩니다. 다양한 라벨 효소의 사용 예 및 방법은 Savage et al., Previews 247:6-9 (1998), Young, J. Virol. Methods 24:227-236 (1989)에서 설명되어 있습니다.
[0077] 한 가지 측면에서, CHPs는 방사성 동위원소/방사성 표지를 포함할 수 있다. 방사성 동위원소란 어떠한 방사능 분자도 포함한다. 적합한 방사성 동위원소로는 14C, 3H, 32P, 33P, 35S, 125I, 131I, 13N, 15O, 18F, 57Co, 99mTc, 51Cr 등이 있으며, 방사성 동위원소는 공유 결합으로 CHP에 부착된다. 한 측면에서, CHP는 방사성 동위원소를 포함한다. 이 경우, 신시감지 측정법을 사용한다. 이 경우, 방사성 동위원소로 표지된 CHP에 노출된 샘플을 분리하고 결합된 리간드의 방사능을 측정한다.
[0078] 어떤 경우에는 어떤 리간드에 양성자 방출 톰그룹이 결합되어 양성자 방출 단층 촬영기(PET)로 감지될 수 있다. 양성자 방출 톰을 방출하는 동위원소 예시로는 11C (약 20분), 13N (약 10분), 15O (약 2분) 및 18F (약 110분) 등의 짧은 반감기를 가지는 방사성 동위원소가 있다. 펩타이드에 라벨링하는 방법은 기술에 의해 잘 알려져 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 Ohta et al. (1999) Molec. Cell 3:535-541에서 찾을 수 있다. 어떤 경우에는 CHPs가 19F 원자, 15N 원자 또는 이러한 원자들의 다수로 이루어진 NMR 활성 동위원소 라벨(NMR-active isotope label)로 표시된다.
[0079] 어떤 구현예에 따르면, 본 개시의 방법은 CHP를 사용하는 것을 포함한다. 일반적으로, CHP는 Formula I로 표시되는 서열을 포함한다:
L-Sm-(Gly-X-Y)3-20 (Formula I).
L은 하나 이상의 감지 가능한 모이(예: 라벨)이며; S는 스페이서 분자이며; m은 0에서 10까지의 정수이며; 그리고 (Gly-X-Y)3-20은 Gly가 글리신인 반복 부분을 나타내며, X와 Y 중 적어도 하나는 프롤린, 수정 프롤린 및/또는 하이드록시프롤린입니다. 일부 실시 예에 따르면, 본 개시의 방법은 L-Sm-(Gly-X-Y)3로 나타낼 수 있는 서열을 포함하는 CHP를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 또한, L-Sm-(Gly-X-Y)4로 나타낼 수 있는 서열, L-Sm-(Gly-X-Y)5로 나타낼 수 있는 서열, L-Sm-(Gly-X-Y)6로 나타낼 수 있는 서열, L-Sm-(Gly-X-Y)7 로 나타낼 수 있는 서열, L-Sm-(Gly-X-Y)8 로 나타낼 수 있는 서열, L-Sm-(Gly-X-Y)9로 나타낼 수 있는 서열, L-Sm-(Gly-X-Y)10 로 나타낼 수 있는 서열, L-Sm-(Gly-X-Y)11 로 나타낼 수 있는 서열, L-Sm-(Gly-X-Y)12 로 나타낼 수 있는 서열, L-Sm-(Gly-X-Y)13로 나타낼 수 있는 서열, L-Sm-(Gly-X-Y)14로 나타낼 수 있는 서열, L-Sm-(Gly-X-Y)15로 나타낼 수 있는 서열, L-Sm-(Gly-X-Y)16 로 나타낼 수 있는 서열, L-Sm-(Gly-X-Y)17로 나타낼 수 있는 서열, L-Sm-(Gly-X-Y)18로 나타낼 수 있는 서열, L-Sm-(Gly-X-Y)19로 나타낼 수 있는 서열, L-Sm-(Gly-X-Y)20로 나타낼 수 있는 서열을 포함하는 CHP를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 여기서, L은 하나 이상의 감지 가능한 결합체이며(예: 라벨) , S는 스페이서 분자이고, m은 0에서 10 사이의 정수이다. Gly는 글리신을 나타내며, X와 Y 중 적어도 하나는 프롤린, 변형 프롤린 및/또는 하이드록시프롤린 중 하나이다. 일부 구현에 따르면, m은 0이 아니다. 일부 구현에 따르면, m은 1이다. 일부 구현에 따르면, m은 2이다. 일부 구현에 따르면, m은 3이다.
[0080] 일부 구현 예에 따르면, 본 발명의 방법은 SEQ ID NO.: 1-337 중 선택된 서열을 가진 CHP와 샘플을 접촉시키는 것을 포함할 수 있습니다(예: 표 1 (Table 1) 참조).
| Identifier | Sequence (One-Letter Amino Acid Symbols) |
| SEQ ID NO:1 | Biotin-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:2 | 5(6)-Carboxyfluorescein-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:3 | Alexa Fluor-350-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:4 | Alexa Fluor-430-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:5 | Alexa Fluor-488-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:6 | Alexa Fluor-546-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:7 | Alexa Fluor-568-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:8 | Alexa Fluor-594-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:9 | Alexa Fluor-633-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:10 | Alexa Fluor-660-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:11 | Alexa Fluor-680-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:12 | Cyanine 3-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:13 | Cyanine 5-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:14 | Cyanine 5.5-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:15 | Cyanine 7-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:16 | Cyanine 7.5-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:17 | Cyanine 3-phycoerythrin-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:18 | Cyanine 5-phycoerythrin-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:19 | Cyanine 5.5-phycoerythrin-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:20 | Cyanine 7-phycoerythrin-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:21 | Cyanine 7.5-phycoerythrin-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:22 | Rhodamine-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:23 | Sulfo-Cyanine3-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:24 | Sulfo-Cyanine5-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:25 | Sulfo-Cyanine5.5-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:26 | Sulfo-Cyanine7-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:27 | Sulfo-Cyanine7.5-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:28 | Texas Red-GGG-GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPO-NH2 |
| SEQ ID NO:29 | Biotin-GGG-GfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfO-NH2 |
| SEQ ID NO:30 | 5(6)-Carboxyfluorescein-GGG-GfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfO-NH2 |
| SEQ ID NO:31 | Alexa Fluor-350-GGG-GfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfO-NH2 |
| SEQ ID NO:32 | Alexa Fluor-430-GGG-GfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfO-NH2 |
| SEQ ID NO:33 | Alexa Fluor-488-GGG-GfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfO-NH2 |
| SEQ ID NO:34 | Alexa Fluor-546-GGG-GfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfO-NH2 |
| SEQ ID NO:35 | Alexa Fluor-568-GGG-GfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfO-NH2 |
| SEQ ID NO:36 | Alexa Fluor-594-GGG-GfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfO-NH2 |
| SEQ ID NO:37 | Alexa Fluor-633-GGG-GfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfO-NH2 |
| SEQ ID NO:38 | Alexa Fluor-660-GGG-GfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfO-NH2 |
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| SEQ ID NO:47 | Cyanine 5.5-phycoerythrin-GGG-GfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfO-NH2 |
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| SEQ ID NO:49 | Cyanine 7.5-phycoerythrin-GGG-GfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfO-NH2 |
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| SEQ ID NO:239 | Cyanine 5.5-GGG- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:240 | Cyanine 7-GGG- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:241 | Cyanine 7.5-GGG- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:242 | Cyanine 3-phycoerythrin-GGG- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:243 | Cyanine 5-phycoerythrin-GGG- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:244 | Cyanine 5.5-phycoerythrin-GGG- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:245 | Cyanine 7-phycoerythrin-GGG- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:246 | Cyanine 7.5-phycoerythrin-GGG- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:247 | Rhodamine-GGG- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:248 | Sulfo-Cyanine3-GGG- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:249 | Sulfo-Cyanine5-GGG- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:250 | Sulfo-Cyanine5.5-GGG- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:251 | Sulfo-Cyanine7-GGG- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:252 | Sulfo-Cyanine7.5-GGG- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:253 | Texas Red-GGG- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:254 | Biotin-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:255 | 5(6)-Carboxyfluorescein-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:256 | Alexa Fluor-350-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:257 | Alexa Fluor-430-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:258 | Alexa Fluor-488-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:259 | Alexa Fluor-546-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:260 | Alexa Fluor-568-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:261 | Alexa Fluor-594-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:262 | Alexa Fluor-633-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:263 | Alexa Fluor-660-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:264 | Alexa Fluor-680-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:265 | Cyanine 3-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:266 | Cyanine 5-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:267 | Cyanine 5.5-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:268 | Cyanine 7-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:269 | Cyanine 7.5-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:270 | Cyanine 3-phycoerythrin-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:271 | Cyanine 5-phycoerythrin-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:272 | Cyanine 5.5-phycoerythrin-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:273 | Cyanine 7-phycoerythrin-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:274 | Cyanine 7.5-phycoerythrin-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:275 | Rhodamine-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:276 | Sulfo-Cyanine3-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:277 | Sulfo-Cyanine5-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:278 | Sulfo-Cyanine5.5-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:279 | Sulfo-Cyanine7-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:280 | Sulfo-Cyanine7.5-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:281 | Texas Red-Ahx- GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP -NH2 |
| SEQ ID NO:282 | Biotin-GGG-GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF-NH2 |
| SEQ ID NO:283 | 5(6)-Carboxyfluorescein-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:284 | Alexa Fluor-350-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:285 | Alexa Fluor-430-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:286 | Alexa Fluor-488-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:287 | Alexa Fluor-546-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:288 | Alexa Fluor-568-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:289 | Alexa Fluor-594-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:290 | Alexa Fluor-633-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:291 | Alexa Fluor-660-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:292 | Alexa Fluor-680-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:293 | Cyanine 3-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:294 | Cyanine 5-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:295 | Cyanine 5.5-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:296 | Cyanine 7-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:297 | Cyanine 7.5-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:298 | Cyanine 3-phycoerythrin-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:299 | Cyanine 5-phycoerythrin-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:300 | Cyanine 5.5-phycoerythrin-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:301 | Cyanine 7-phycoerythrin-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:302 | Cyanine 7.5-phycoerythrin-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:303 | Rhodamine-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:304 | Sulfo-Cyanine3-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:305 | Sulfo-Cyanine5-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:306 | Sulfo-Cyanine5.5-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:307 | Sulfo-Cyanine7-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:308 | Sulfo-Cyanine7.5-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:309 | Texas Red-GGG- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:310 | Biotin-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:311 | 5(6)-Carboxyfluorescein-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:312 | Alexa Fluor-350-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:313 | Alexa Fluor-430-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:314 | Alexa Fluor-488-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:315 | Alexa Fluor-546-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:316 | Alexa Fluor-568-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:317 | Alexa Fluor-594-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:318 | Alexa Fluor-633-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:319 | Alexa Fluor-660-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:320 | Alexa Fluor-680-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:321 | Cyanine 3-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:322 | Cyanine 5-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:323 | Cyanine 5.5-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:324 | Cyanine 7-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:325 | Cyanine 7.5-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:326 | Cyanine 3-phycoerythrin-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:327 | Cyanine 5-phycoerythrin-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:328 | Cyanine 5.5-phycoerythrin-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:329 | Cyanine 7-phycoerythrin-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:330 | Cyanine 7.5-phycoerythrin-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:331 | Rhodamine-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:332 | Sulfo-Cyanine3-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:333 | Sulfo-Cyanine5-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:334 | Sulfo-Cyanine5.5-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:335 | Sulfo-Cyanine7-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:336 | Sulfo-Cyanine7.5-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
| SEQ ID NO:337 | Texas Red-Ahx- GPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPFGPF -NH2 |
[0081] Table 1에 제공된 일부 서열에서 'GGG'는 트리플 글리신 링커를 나타냅니다. Table 1에 제공된 일부 서열에서 'NH2'는 아미드화된 C-종단을 나타냅니다. Table 1에 제공된 일부 서열에서 'GfO' 서열의 'f'는 2S, 4S-4-플루오로프롤린(cis 구조)을 나타냅니다. Table 1에 제공된 일부 서열에서 'Ahx'는 6-아미노헥산 링커를 나타냅니다. Table 1에 제공된 일부 서열에서 'GcO' 서열의 'c'는 2S, 4S-4-클로로프롤린(cis 구조)을 나타냅니다. Table 1에 제공된 일부 서열에서 'GPF' 서열의 'F'는 2S, 4R-4-플루오로프롤린(trans 구조)을 나타냅니다.
[0082] 일부 실시예에서, 본 개시 방법은 GGG 또는 AHX spacer 분자를 포함하지 않고 Table 1에서 나열된 SEQ ID NO .: 1-337 중 선택된 서열을 가지는 CHP로 샘플을 접촉하는 것을 포함할 수 있습니다. 일부 실시예에서는, 서열은 S가 스페이서 분자이고 m이 0 인 CHP의 Formula 1, L-Sm-(Gly-X-Y)3-20을 포함할 수 있습니다.
[0083] 본 발명의 일부 실시예에서는 CHP의 서열에 (Gly-X-Y)3-20 반복 부분이 포함되고, 상기 CHP의 반복부분의 서열이 테이블 2의 SEQ ID NO.: 338-349 중에서 선택된 CHP와 상호작용하도록 시료를 처리하는 방법이 포함될 수 있습니다.
[0083] 이 발명의 일부 실시예에서는, CHP가 포함되는 샘플에 노출될 수 있는 방법을 포함할 수 있으며, 이때 CHP 시퀀스는 (Gly-X-Y)3-20 반복 부분을 포함하며, CHP의 반복 부분은 SEQ ID NO.: 338-349 중에서 선택된 시퀀스를 갖는다. (예: 표 2 (Table 2) 참조)
| Identifier | Sequence (One-Letter Amino Acid Symbols) | |
| SEQ ID NO:338 | (GPO)3-20, where G = glycine, P = proline, O = hydroxyproline | |
| SEQ ID NO:339 | (GfO)3-20 where G = glycine, f = cis-fluoroproline (2S,4S-4-fluoroproline), O = hydroxyproline | |
| SEQ ID NO:340 | (GOP)3-20 where G = glycine, P = proline, O = hydroxyproline | |
| SEQ ID NO:341 | (azGPO)3-20 where azG = aza-Glycine, P = proline, O = hydroxyproline | |
| SEQ ID NO:342 | (azGfO)3-20 where azG = aza-Glycine, f = cis-fluoroproline (2S,4S-4-fluoroproline), O = Hydroxyproline | |
| SEQ ID NO:343 | (GPF)3-20 where G = Glycine, P = Proline, F = trans-fluoroproline (2S,4R-4-fluoroproline) | |
| SEQ ID NO: 344 | (GPP)3-20, where G = glycine, P = proline, P = proline | |
| SEQ ID NO: 345 | (azGPP)3-20, where azG = aza-glycine, P = proline, P = proline | |
| SEQ ID NO: 346 | (azGcO)3-20, where azG = aza-glycine, c = cis-chloroproline (2S,4S-4-chloroproline), O = trans-hydroxyproline (2S, 4R-hydroxyproline) | |
| SEQ ID NO: 347 | (GcO)3-20, where G = glycine, c = cis-chloroproline (2S,4S-4-chloroproline), O = trans-hydroxyproline (2S, 4R-hydroxyproline) | |
| SEQ ID NO:348 | (azGOP)3-20 where azG = aza-Glycine, P = proline, O = hydroxyproline | |
| SEQ ID NO:349 | (azGPF)3-20 where azG = aza-Glycine, P = Proline, F = trans-fluoroproline (2S,4R-4-fluoroproline) | |
[0084] 기타 실시예 및 동등물은 Table 1 및 2에 나열된 각 서열의 이중형 버전(dimeric version)을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 일부 실시예에서, 이중형 서열은 Table 1 및 2에서 제공된 아미노산 서열로부터 1개의 아미노산, 2개의 아미노산, 3개의 아미노산, 4개의 아미노산, 5개의 아미노산, 6개의 아미노산, 7개의 아미노산, 8개의 아미노산, 9개의 아미노산, 10개의 아미노산 또는 10개 이상의 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 이중형 서열은 글리신 오프셋과/또는 리신 분기점을 포함할 수 있다.
[0085] 또 다른 측면에서, 본 발명은 환자의 샘플에서 비 삼중 나선 콜라겐 함량을 검출하여 환자의 상태의 존재 또는 진행 여부를 결정하는 방법에 관한 것으로, 상기 라벨링된 CHP를 비 삼중 나선 콜라겐에 접촉시켜 환자의 샘플에서 비 삼중 나선 콜라겐 함량을 검출하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 상기 상태는 섬유증, 상처 치유, 특발성 폐 섬유화(IPF), 노화된 피부, 간 섬유화, 비 알코올성 지방간염(NASH), 비 알코올성 지방간질환 상태(NAFLD), 알코올성 지방간질환(AFLD), 신장 섬유화, 심근경색(MI), 연령 관련 황반변성(AMD), 골관절염(OA) 및 각막톱니증으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 일부 구현에서, 상기 상태는 간 섬유화일 수 있다. 일부 구현에서, 상기 상태는 비 알코올성 지방간염(NASH)일 수 있다. 일부 구현에서, 상기 상태는 비 알코올성 지방간질환(NAFLD)일 수 있다. 일부 구현에서, 상기 상태는 알코올성 지방간질환(AFLD)일 수 있다. 일부 구현에서, 상기 방법은 환자의 다른 샘플에서 비 삼중 나선 콜라겐 함량을 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 추가적인 구현에서, 상기 방법은 검출된 샘플의 비 삼중 나선 콜라겐 함량을 상기 다른 샘플 또는 제어 함량 값과 비교하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
[0086] 여기서 사용된 섹션 제목은 조직적인 목적으로만 사용되며, 기술된 주제 내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 됩니다.
[0087] 본 설명서에 사용된 용어는 특정 구현 사항을 설명하는 것으로 제한되지 않으며, 다양한 방법론, 프로토콜, 대상 및 염기서열 기술을 사용할 수 있습니다. 본 설명서의 내용은 특정 구현 사항을 설명하기 위한 것으로 이를 제한하기 위한 것이 아닙니다. 또한 여기에 사용된 용어는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니라, 첨부된 클레임에 의해서만 제한될 것입니다. 본 발명의 몇몇 구현 사항은 여기서 설명된 것처럼 제공되었지만, 이는 단지 예시일 뿐입니다. 본 발명에 이탈하지 않는 범위 내에서 많은 변형, 변경 및 대체 수단이 숙련자들에게 가능할 것입니다. 본 발명서에 기재된 구현 예시들은 본 발명의 일부를 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 실제 구현에 있어서 다양한 대안이 적용될 수 있음을 인식해야 합니다. 본 발명의 범위는 다음 클레임에서 정의되고 있으며, 해당 클레임의 방법과 구조, 그리고 이들과 동등한 것들이 본 발명서의 범위에 포함될 것입니다.
[0088] 여러 측면은 예시 응용 프로그램을 참조하여 설명되었습니다. 특별히 명시되지 않은 경우, 어떤 구현도 다른 어떤 구현과 결합될 수 있습니다. 본 문서에서 설명된 기능을 완전히 이해하기 위해 많은 구체적인 세부 정보, 관계 및 방법이 제시되었지만, 숙련된 장인은 이러한 기능을 특정 세부 사항 중 하나 이상 없이 또는 다른 방법으로 실시할 수 있습니다. 여기서 기술된 기능은 행위 또는 사건의 그림으로 나타내는 순서에 제한을 받지 않습니다. 또한, 모든 행위 또는 사건이 설명된 기능을 구현하기 위해 필요한 것은 아닙니다. 더 나아가, 본 문서의 방법이 여러 단계의 특정 순서에 의존하지 않는 경우, 해당 순서를 제한으로 간주해서는 안 됩니다. 본 문서의 방법에 대한 어떤 청구도 작성된 순서대로 단계를 수행하는 것으로 제한되어서는 안 되며, 기술의 정신과 범위 내에서 단계를 다양하게 변형할 수 있다는 점을 숙련된 장인이 쉽게 이해할 수 있어야 합니다.
[0089] 일부 실시예가 본 명세서에서 설명되었지만, 그러한 실시예는 예시로 제공된 것일 뿐입니다. 본 발명의 실시예가 명세서에서 제공된 구체적인 예시로 제한되지 않도록 의도됩니다. 본 명세서에서 설명된 일부 실시예는 언급된 것과 같이 기술되었지만, 이러한 실시예의 설명과 그림은 제한적인 의미로 해석되어서는 안 됩니다. 수많은 변형, 변경 및 대체가 본 발명에서 벗어나지 않으면서 이제 그들은 전문가들에게 발생합니다.
[0090] 또한, 본 발명의 실시 예에 대해 구체적으로 묘사된 특정한 그림, 구성 또는 상대적 비율은 다양한 조건과 변수에 따라 제한되지 않음을 이해해야 합니다. 본 발명에 대한 다양한 대안이 가능하며, 이러한 대안, 수정, 변형 또는 동등물은 본 발명의 범위에 적용될 수 있습니다. 따라서 다음 청구항은 적어도 일부로서 발명의 범위를 정의하도록 의도되었으며, 이러한 청구항의 범위 및 이들의 동등물에 해당하는 방법 및 구조가 이를 포함합니다.
[0091] 위에 보여지고 설명된 실시 예에 대한 변경이 가능하다는 것은 이러한 광범위한 발명 개념을 벗어나지 않고도 이루어질 수 있다는 것을 전문가들이 인정할 것입니다. 따라서 이 발표는 위에 보여지고 설명된 실시 예에 한정되지 않지만, 청구항에 정의된 것과 같이 본 발표의 영역과 범위 내에서 변형을 포함하고 있음을 이해해야 합니다. 예를 들어, 실시 예의 구체적인 특징은 클레임된 발명의 일부이거나 그렇지 않을 수 있으며, 공개된 실시 예의 다양한 특징은 결합될 수 있습니다. "오른쪽", "왼쪽", "아래", "위"와 같은 단어는 그림에서 참조되는 방향을 지정합니다. 여기에 명시적으로 설정되지 않은 한, "a", "an" 및 "the"와 같은 용어는 하나의 요소로 한정되지 않고, 대신 "적어도 하나"라는 의미로 읽어야 합니다.
[0092] 본 문서에서 언급된 범위는 해당 범위 내의 모든 값들을 포함하여 간략하게 표현된 것으로 이해됩니다. 예를 들어, 1부터 50까지의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 중 어떤 수, 수의 조합 또는 하위 범위를 포함한다는 것을 의미합니다.
[0093] 해당 발명에 대한 그림과 설명 중 일부는 발명을 명확히 이해하기 위해 관련성이 있는 요소에 초점을 맞추고, 발명의 명확성을 위해 일부 요소는 제외하여 간소화되었음을 이해하시기 바랍니다. 그러나 해당 요소들은 기술자들이 발명의 일부를 이룰 수 있다는 것을 일반적인 기술자들이 알기 때문에 그림을 설명하지 않습니다. 또한 해당 요소들이 발명의 이해를 돕지 않을 수 있으므로 본 문서에서는 그에 대한 설명을 제공하지 않습니다.
EXAMPLES - 예시
[0094]
Example 1 - CHP를 사용하여 조직 내 파괴된 콜라겐의 상대적 함량을 결정하는 방법
[0095] 같은 질환을 가진 쥐 심장 조직의 두 인접 섹션을 사용하여 실험을 수행합니다. 한 섹션은 완전한 열반전 처리를 받았으며(예: 냉동 섹션의 경우 90°C 온수 욕조에서 10분 처리 또는 95°C에서 5분 동안 열 매개 항원 회수(heat-mediated antigen retrieval)를 2회 수행), 다른 섹션은 전혀 처리하지 않았습니다. 두 섹션 모두 5-FAM 또는 biotin-dimeric CHP(diCHP)로 동일한 조건으로 염색을 진행합니다. 완전히 열반전된 섹션에서의 diCHP 신호는 총 콜라겐 함량을 나타내며, 처리되지 않은 섹션에서의 신호는 질환 조건에서 자연적으로 분해된 콜라겐에서 나옵니다. 두 슬라이드 내에서 동일한 관심 영역에서 검출된 형광 신호 간의 비율은 해당 지역에서 분해된 콜라겐의 비율을 추정하는 데 사용됩니다.
[0096] 형광 신호는 ImageJ 기반 프로토콜을 사용하여 정량화할 수 있습니다. 조기 및 지연 MI 후(1주 vs. 3주) 수확된 심장의 분해된 콜라겐 함량은 음성 대조군인 정상 심장과 비교됩니다. 각 시간 지점별로 각 그룹에서는 5개의 심장이 분석되며, 각 심장마다 10개의 냉동 섹션(frozen sections)과 10개의 파라핀 섹션(Paraffin sections)을 염색하여 통계 분석이 가능합니다. 이 방법의 정확성을 확인하기 위해, 냉동 섹션을 사용하여 MI 심장 조직의 분해된 콜라겐 수준과 트립신-하이드록시프롤린 분석(Trypsin-hydroxyproline assay)을 수행합니다. 섹션은 분해된, 펼쳐진 콜라겐(the degraded, unfolded collagen)을 선택적으로 용해시키는 트립신 용액으로 처리되며, 트립신 용액 내의 콜라겐 함량과 잔여 조직 섹션의 콜라겐 함량은 표준 하이드록시프롤린 분석(standard hydroxyproline assay)을 통해 정량화되며, 조직에 원래 존재하는 프로테아제 분해된 콜라겐(Protease-degraded collagen)의 백분율을 계산할 수 있습니다. 트립신 분석(trypsin assay)은 고정되지 않은 크라이오 섹션(unfixed cryosections)에서만 작동하며 전체 섹션을 평균적으로 측정하므로, 트립신 분석 결과는 di-CHP로 염색된 냉동 슬라이드(frozen slides)의 전체 섹션 검사에서 양적으로 측정된 백분율과 비교됩니다.
[0097]
Example 2 - 다른 염색 기술과 비교하여 CHP를 사용하여 총 콜라겐 함량 결정
[0098] 직접 염색 비교 연구가 진행되었으며, PSR, MT, Herovici's stain, 그리고 콜라겐 I 및 콜라겐 III 항체(antibodies)를 사용하여 마우스 간피브로시스 모델(fibrotic mouse liver model)에서 총 콜라겐을 감지하고 이를 바이오틴으로 표지된 CHP (B-CHP)와 비교하였습니다. 모든 염색과 이미지 분석은 제3자 계약 연구기관인 HistoTox Labs에서 수행되었으며, 평가에서 편견을 방지하고 모든 염색이 올바르게 이루어졌음을 보장하기 위해 이루어졌습니다. 각 슬라이드의 섬유증 심각도는 수의학 병리학자에 의해 점수화되었습니다.
[0099] FIGS. 5A - 5J는 다섯 가지 다른 방법을 사용하여 염색된 마우스 간의 대표적인 현미경 사진을 보여줍니다. 연속된 절편은 건강한(대조군/control) 마우스 간(Figure 5A - 5E)과 CCl4 주입 후 8주 동안 섬유화가 일어난 마우스 간(Figure 5F - 5J)에서 채취되었습니다. 모든 사진에서 화살표로 표시된 콜라겐은 MT에서 파란색으로 염색되며, PSR에서 분홍색/빨강색으로, Herovici's에서 성숙한 콜라겐은 분홍색/빨강색으로, 어린 콜라겐은 파란색으로 염색됩니다. Col I/III cocktail에서는 어두운 갈색부터 밝은 갈색으로, CHP 염색에서는 어두운 갈색으로 염색됩니다. 관심 있는 다른 특징들은 다음과 같이 레이블이 지정되었습니다: C-중심정맥(C-cenral vein), H-간세포(H-hepatocytes), P-포털삼중체(P-portal triads). 확대율은 40배(Magnification was 40X)이며, 척도 막대는 200 μm(scale bar = 200 μm)입니다.
[00100] FIGS 5A - 5J의 사진들에서 확인할 수 있듯이, B-CHP는 다른 모든 염색법과 비교하여 아주 좋거나, 더 나은 성능을 보여줍니다. CHP와 다른 모든 염색법, Col I/III cocktail 항체를 비교해보면, CHP는 콜라겐을 더 쉽게 시각화할 수 있게 하며, 병리과 의사들은 색상의 변화를 해석할 필요 없이 손쉽게 콜라겐을 식별할 수 있었습니다. 또한, B-CHP는 레티큘린 섬유(reticulin fibers)를 식별한 유일한 염색법이었으며, 이는 CHP가 레티큘린 섬유에 대한 은 염색법(예: 고모리의 레티큘린 염색(Gomori's reticulin stain), 고든과 스윗의 레티큘린 염색(Gordon and Sweet's reticulin stain), 또는 모바트 펜타크롬 염색(Movat Pentachrome stain)) 대신 사용될 수도 있다는 것을 나타냅니다. 레티큘린 염색은 간 아키텍처(hepatic architecture)의 변화(간세포의 손실, 간괘의 두께증가, 속아감 변화, 섬유화/경화 등)를 식별하는 데 가장 유용합니다.
[00101] 표준 조직학 평가 외에도, 각 슬라이드는 자동화된 이미지 분석을 사용하여 각 샘플에서 색칠된 콜라겐 면적을 정량화하는 데 사용되었습니다. 모든 이미지에 대해 간 조직을 포함하고 (접힘, 찢어짐 등) 아티팩트, 큰 혈관 및 비간 조직은 제외하는 관심 영역이 생성되었습니다. 그런 다음 관심 영역에 여러 이미지 필터를 적용하여 양성으로 색칠된 영역을 음성 영역과 분리했습니다. 양성 면적이 정량화되고, 그런 다음 관심 영역의 총 면적과 비교되었습니다.
[00102] PSR 염색에서는 콜라겐이 밝은 빨강색으로 나타나며, 남은 조직은 옅은 노랑색입니다. 이러한 이미지는 양성과 음성 영역 사이의 높은 대조로 인해 자동화된 이미지 분석을 통해 쉽게 특성화되었습니다. Masson's Trichrome에서는 콜라겐이 파란색으로, 세포는 빨간색으로 나타납니다. 그러나 일부 내피세포는 세포질에서 약한 파란색 염색을 나타내어 신중한 임계값 설정 후에도 자동화된 이미지 분석으로 일시적으로 감지되었습니다. 이로 인해 정량화 과정에서 콜라겐의 과감지가 발생한 것으로 생각됩니다. Herovici 염색 조직은 성숙 콜라겐을 위해 분홍색/빨강색 염색을 나타내며, 젊은 콜라겐은 옅은 파란색으로 나타납니다. 간세포 세포질은 옅은 분홍색에서 분홍-보라색으로 염색되었으며, 미네랄 영역은 진한 보라색에서 검정색으로 염색되었습니다. 전반적으로 Herovici 염색된 조직의 대조는 매우 낮았으며, 결과적으로 이미지 분석은 젊은 콜라겐을 음성으로 색칠된 영역과 구별할 수 없어 성숙 콜라겐 (분홍색/빨강색)에 대해서만 수행할 수 있었습니다.
[00103] CHP로 염색된 조직은 콜라겐 섬유의 연한 갈색 염색을 보였습니다 (B-CHP의 DAB 염색). 음성 영역은 세포질의 연한 파란색에서 회색으로 염색되었으며, (헤마톡실린 반염색(hematoxylin counterstain)으로 인해) nuclei은 진한 파란색으로 염색되었습니다. 이미지 분석은 일반적으로 CHP로 라벨링된 콜라겐 섬유에 특이적이었으나, 일부 고배경 염색 지역은 알고리즘이 CHP로 염색된 영역을 약간 과소 감지하도록 요구했습니다.
[00104] FIG. 6는 이미지 분석에 의한 콜라겐 정량을 보여줍니다. 모든 샘플에서 콜라겐이 감지되었으며, 초기 샘플에서는 전반적으로 낮은 콜라겐 양이 감지되었으며, 질병 샘플에서는 상당히 높은 양의 콜라겐이 감지되었습니다. 초기 샘플에서는 모든 샘플 및 염색 방법에서 전체적인 콜라겐이 낮았습니다. 그러나 질병 조직 샘플에서는 염색 간에 상당한 차이가 관찰되었습니다. 가장 많은 콜라겐은 Masson's Trichrome을 사용하여 감지되었습니다. 그러나 위에서 언급한대로, 간세포 세포질의 약한 파란색 염색이 특이적인 분석에 방해가 되어 콜라겐의 양이 과대 추정될 가능성이 있습니다.
[00105] PSR와 HIER가 적용된 CHP는 매우 유사하며 전체 콜라겐 함량을 정확하게 평가하는 것으로 판단됩니다. Herovici의 염색은 이미지 분석으로 정확하게 평가하기 어려웠으며 감지된 콜라겐의 면적이 가장 작았습니다. 또한, CHP의 denatured 콜라겐에 대한 특이성을 고려하면, HIER를 받지 않은 조직 절편에서는 콜라겐이 적게 감지되었으며, 이는 피브로틱 조직(fibrotic tissue)에서 정상적인 콜라겐과 변성된 콜라겐 모두 상승하였음을 나타냅니다. 피브로틱 샘플(fibrotic sample)의 대표적인 이미지와 분석은 FIG. 7에 나타나 있습니다.
[00106]
Example 3 - 인간 간 생검 시료에서 총 콜라겐과 손상된 콜라겐을 감지하는 방법
[00107] 실험은 (i) CHP가 기존의 조직화학적 접근법과 콜라겐 비율 면적에 대한 평가에서 신뢰할 수 있는 레이블로 사용될 수 있는지, 그리고 (ii) CHP가 간질성 손상 평가에 추가적인 임상적 중요 정보를 제공하여 간관련 결과를 예측할 수 있는지를 평가하기 위해 수행되었습니다.
[00108]
Methods (방법론)
[00109] 76명의 잘 특징화된 NAFLD 환자의 경피 생검물(Percutaneous biopsies)과, 활동성 및 비활동성 경변증을 포함한 네크로시스(necrosis)와 섬유화된 조직들의 연속적인 조직검체를 사용하였습니다. 조직 슬라이드는 손상된 콜라겐을 감지하기 위해 생물소재로 표시된 CHPs로 룸 온도에서 처리되었으며, 80°C로 사전 가열된 슬라이드는 총 콜라겐 함량을 분석하는 데 사용되었습니다. 표지의 강도와 면적은 (i) 반정량적 지수를 사용하여 평가되었고, (ii) QuPath를 사용하여 스캔된 슬라이드에서 분석되었습니다. 손상된 콜라겐 대 총 콜라겐의 비율이 계산되었습니다. 임상적인 매개변수 및 질병의 등급(grade)과 단계 (NIH CRN 점수 체계)와의 상관관계를 조사하였습니다.
[00110]
Results and discussion
[00111] CHPs는 일상적으로 처리된 인간 간 조직 생검에서 손상된 콜라겐과 총 콜라겐을 신뢰할 수 있는 도구로 제공하며, 후자의 경우 전통적인 조직화학적 접근법보다 일관성이 더 높을 수 있습니다. NAFLD에서 손상된 콜라겐 대 총 콜라겐의 비율은 질병의 CRN 단계와 유의하게 상관관계를 가지고 있습니다 (단계 1 대 단계 4, p<0.00001). 또한, 손상된 재구성 콜라겐의 양은 빠른 진행자에 비해 진행 속도가 느린/중간인 환자에서 유의하게 낮은 수준을 보여주므로 (p=0.023), 이러한 결과는 예후 및 임상 시험에서 매우 가치가 있을 수 있습니다.
[00112] FIG. 8는 모든 NAFLD 단계에서 얻은 B-CHP 처리된 말초 조직(explant tissues)의 대표적인 사진을 보여줍니다 (단계 2와 단계 4 NAFLD가 표시됨). 진행 속도가 느린/중간인 환자의 수정된 H-점수는 15.16 (평균/mean)이었고, 빠르게 진행하는 환자의 경우 29.29 (평균)였으며, t-값(t-value)은 -2.3397이고 p-값(p-value)은 0.023입니다. 따라서, 재구성 콜라겐에 대한 CHP 염색은 NAFLD 진행 예후의 예측에 유용합니다.
[00113] FIG. 9는 NAFLD의 모든 단계에서 얻은 B-CHP 처리된 말초 조직에서 총 콜라겐과 손상된 콜라겐을 보여주는 대표적인 사진을 보여줍니다 (단계 1, 단계 2 및 단계 4 NAFLD가 표시됨). 이미지에서 결정된 총 콜라겐 대 손상된 콜라겐 비율 (TDR)은 다음과 같습니다: 단계 1 - 17.14 (평균/mean); 단계 2 - 8.3 (평균); 단계 4 - 11.12 (평균). 단계 1과 단계 4 (p <0.00001), 단계 2와 단계 4 (p = 0.237) 및 단계 3과 단계 4 (표시되지 않음) (p = 0.0197) 사이의 TDR 비교는 질병의 다른 단계 간에 통계적으로 유의한 표지자를 제공한다는 것을 나타냅니다. TDR은 HIER mediated CHP staining과 non HIER mediated CHP staining을 사용하여 계산됩니다.
[00114] 또한, CHP 프로브(CHP probes)를 다른 만성 섬유화 조건(chronic fibrotic conditions)에서 더 탐구함으로써 유사한 진단/예후 정보를 제공할 수 있습니다.
[00115] Example 4 - ImageJ/FIJI를 사용하여 formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) 조직 슬라이드에서 총 콜라겐 함량을 결정합니다
[00116]
Total Collagen Content (총 콜라겐 함량)
[00117] CHP를 사용하여 FFPE 조직 슬라이드에서 총 콜라겐 함량을 평가하기 위해서는 CHP가 모든 이용 가능한 콜라겐에 바인딩될 수 있도록 콜라겐을 완전히 변성시켜야 합니다. 파라핀 제거 (deparaffinization) 후, 조직 슬라이드는 열을 가하여 콜라겐을 열적으로 변성시킵니다. 실험 결과, 열유발 에피토프 리트리벌 (HIER) 방법에서 사용되는 장기간 가열은 샘플 내의 콜라겐을 완전히 변성시키는 데 충분하다는 것을 나타냅니다 (사용된 버퍼에 관계없이). 여기서 보여지는 조직 슬라이드는 95-100 °C에서 45분 동안 조직 스티머에 50 mL 시트르산 버퍼에 놓였습니다. 또는 얼음에 보관된 조직 슬라이드의 콜라겐 함량을 변성시키기 위해 밀봉된 50 mL 튜브에 DI 수를 넣고 85 °C 이상의 온도로 가열하는 물 bath를 사용할 수 있습니다. 가열 후, 뜨거운 DI 수(DI water)를 슬라이드에 피펫으로 넣고 5분 동안 방치합니다 (10번 반복).
[00118]
Experimental Protocol (실험 프로토콜)
[00119] FFPE 슬라이드: CHP 염색 전에 파라핀 제거를 위해 다음 순서로 자일렌(xylenes), 100% 에탄올, 95% 에탄올, 50% 에탄올 및 DI 수에 각각 2회씩 5분 동안 잠금 처리하여 디파라핀화(deparaffinization)를 수행합니다.
[00120] HIER를 수행하거나 조직을 열 처리하여 총 콜라겐 함량을 결정합니다.
[00121] CHP 분말(powder)을 1Х PBS에 녹여서 농도가 5-20 μM 범위 내에 있는 CHP 염색 용액(solution)을 만드세요. 정확한 농도는 조직 절편 및 필요한 용량에 대한 최적화 매개변수에 따라 다를 수 있습니다.
[00122] CHP 용액을 80 °C로 가열하세요. CHP는 시간이 지남에 따라 용액 내에서 동종삼량체(homotrimers)로 자체조립(self-assemble)될 수 있으며 (예: 4 °C에서 저장 중), 콜라겐 하이브리다이제이션을 위한 원인을 상실할 수 있습니다. 따라서 삼량체 형태인 CHP는 80 °C에서 짧은 시간 동안 가열하여 단일 가닥으로 열방출되어야 합니다.
[00123] 열이 발생한 CHP 용액을 사용하기 전에 빠르게 얼음물 욕조에 담가 식히세요 (약 30-90초). 이렇게 함으로써 조직 내의 펼쳐진 콜라겐에 결합하기 위함입니다.
[00124] 얼음물로 식힌 CHP 용액을 조직 슬라이드에 바르게 도포하세요. CHP 염색 용액을 조직 슬라이드 전체에 완전히 덮으며, 습도 조절된 상자에서 4°C에서 하룻밤 동안 결합이 이루어지도록 하세요.
[00125] 1Х PBS 또는 1Х Tween-20로 3회 5분 동안 섹션을 세척하세요.
[00126] 커버슬립을 장착하고 이미지를 촬영하세요. (Mount coverslips and image).
[00127] 남은 CHP 용액을 세척한 후 조직을 촬영하고, 이미지를 ImageJ/FIJI로 가져와 형광 신호를 정량화할 수 있습니다. 신호 강도는 샘플 내의 콜라겐 양과 관련이 있습니다. 조직 섹션이 더 두껍게 되면 더 많은 콜라겐이 포함되므로 CHP가 변성된 콜라겐 가닥에 결합하는 신호 강도가 높아질 것으로 예상됩니다. 그림 4(Fig. 4)에서 볼 수 있듯이, 조직이 두꺼워질수록 CHP 신호는 더 강하게 나타나며, 이는 CHP 신호가 총 콜라겐 함량과 관련이 있다는 것을 확인합니다. 신호 강도는 배경을 제거한 후 이미지된 전체 영역의 평균 픽셀 강도를 측정하여 결정되었습니다. 이 방법을 통해 연구자들은 조직 섹션 내의 총 콜라겐 함량을 쉽게 시각화하고 정량화할 수 있습니다.
[00128]
Discussion
[00129] 적절한 이미징 설정을 찾은 후, CHP 염색은 다양한 조직 샘플에서의 총 콜라겐 함량을 쉽게 확인할 수 있습니다. 이는 섬유화 조직(fibrotic tissues)에서의 총 콜라겐 함량을 조사하는 데 유용하며, 콜라겐 리모델링은 다양한 병리적 질환 및 건강한 조직 유지에 관련되어 있기 때문에 상처 치유나 질병 진행 상태를 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 형광 강도(fluorescent intensity)는 ImageJ/FIJI 플랫폼을 사용하여 정량화할 수 있습니다.
Claims (24)
- 샘플 내의 총 콜라겐 함량을 측정하기 위한 방법으로, 열 또는 항원 회수법(heat or antigen retrieval)을 사용하여 샘플 내의 콜라겐을 변성시켜 변성된 샘플을 생성하고, 표지된 콜라겐 하이브리다이징 펩타이드 (CHPs)를 변성된 콜라겐에 접촉시킨 후, 표지된 CHPs로부터의 신호를 측정하여 샘플 내의 총 콜라겐 함량을 결정하는 방법.
- 주장 1에 따른 방법으로, 변성은 샘플을 60°C에서 160°C까지의 온도로 가열하는 것을 포함한다.
- 주장 1 또는 2에 따른 방법으로, 변성되지 않은 콜라겐에 선호적으로 라벨(labeled)된 콜라겐 하이브리다이징 펩타이드 (CHPs)를 샘플에 접촉시키고, labeled CHPs로부터의 신호를 측정하여 변성된 전체 콜라겐 함량을 결정하는 것을 더 포함한다.
- 앞서 언급된 주장 중 하나에 해당하는 방법에서, CHPs는 형광(fluorescent) 또는 비오틴(biotin) 염료로 표지된다.
- 앞서 언급된 주장 중 하나에 해당하는 방법에서, 샘플은 용액이다 (예: homogenizing 조직 샘플, ECM 등).
- 앞서 언급된 주장 중 하나에 해당하는 방법에서, 샘플은 조직 단면이다 (예: 골 단면/bone section).
- 앞서 언급된 주장 중 하나에 해당하는 방법에서, 샘플은 인공 조직 단면(artificial tissue section)이다.
- 앞서 언급된 주장 중 하나에 해당하는 방법에서, 조직 단면은 적어도 1-100 μm의 두께를 갖는다.
- 주장에 따른 방법 중 어느 하나에 따른, 각각의 labeled CHPs는 다음과 같이 나타내는 공식 I (formula I)로 표시된 서열을 포함한다:
L-Sm-(Gly-X-Y)3-20 (Formula I)
여기서 L은 하나 이상의 detectable moieties을 나타내며, S는 스페이서 분자이고 m은 0에서 10까지의 정수이다. Gly는 글리신을 나타내며, X와 Y 중 적어도 하나는 프롤린, 변형된 프롤린, 그리고/또는 하이드록시프롤린 중 하나이다. - 앞서 언급된 주장 중 하나에 해당하는 방법에서 각각의 CHP는 SEQ ID NO: 1-118 중 하나의 서열을 포함한다.
- 앞서 언급된 주장 중 하나에 해당하는 방법에서샘플은 간 섬유증(liver fibrosis)을 가진 환자로부터 얻은 것이다.
- 앞서 언급된 주장 중 하나에 해당하는 방법에서는 트립신-하이드록시프롤린 검사(trypsin-hydroxyproline assay)가 제외된다.
- 앞서 언급된 주장 중 하나에 해당하는 방법에서는 피크로시리우스 빨강(picrosirius red)과 편광 빛(polarized light)이 제외된다.
- 앞서 언급된 주장 중 하나에 해당하는 방법은 3일 미만 소요된다.
- 앞서 언급된 주장 중 하나에 해당하는 방법은 2일 미만 소요된다.
- 환자의 상태의 존재 또는 진행을 결정하는 방법은 다음을 포함한다. 주장 1-15 중 어느 하나에 따라 환자로부터의 샘플에서 총 콜라겐 함량을 검출하는 것이다. 이때 상태는 섬유증, 상처 치유, 특발성 폐 섬유증 (IPF), 노화된 피부, 간 섬유증, 비알코올성 지방간염 (NASH), 비알코올성 지방간질환 (NAFLD), 알코올성 지방간질환 (AFLD), 신장 섬유증, 심근 경색증 (MI), 연령 관련 황반변성 (AMD), 골관절염 (OA), 및 각막톱 (keratoconus)으로 구성된 그룹 중 하나 이상이다.
- 주장 중 16에 따른 방법에서는, 전체 콜라겐 함량과 손상된 콜라겐 함량을 비율로 결합하여 특정 샘플 그룹에 정규화된 손상된 콜라겐의 객관적인 측정치로 사용한다.
- 주장 중 17에 따른 방법에서는, 해당 비율을 질병 상태의 진행 또는 호전의 예측적 생체 표지자(biomarker)로 사용한다.
- 주장 중 16에서 18까지의 어느 하나에 따른 방법에서는, 해당 상태가 간 섬유화, 비알코올성 지방간염(NASH), 비알코올성 지방간병증(NAFLD) 또는 알코올성 지방간병증(AFLD)인 경우에 적용된다.
- 주장 중 16에서 19까지의 어느 하나에 따른 방법에서는, 환자로부터 다른 샘플에서도 총 콜라겐 함량을 감지하는 단계를 더 포함한다.
- 주장 중 16에서 20까지의 어느 하나에 따른 방법에서는, 환자로부터 다른 샘플에서도 총 콜라겐 함량을 감지하는 단계에 더하여, 레이블된 CHP를 비삼중나선형 콜라겐(non-triple helical collagen)에 접촉시켜 환자의 다른 샘플에서 비삼중나선형 콜라겐을 감지하는 단계를 추가로 포함한다.
- 환자의 샘플에서 비삼중나선형 콜라겐 함량(non-triple helical collagen contenet)을 레이블된 CHP를 비삼중나선형 콜라겐에 접촉시켜 감지하는 단계를 포함하는, 환자의 상태의 존재 또는 진행 여부를 결정하는 방법이다. 이때, 상태는 진행 또는 해소로 구성된 그룹 중 하나 이상을 선택하여, 섬유증, 상처 치유, 특발성 폐 섬유증 (IPF), 노화된 피부, 간 섬유증, 비알코올성 지방간염 (NASH), 비알코올성 지방간질환 (NAFLD), 알코올성 지방간질환 (AFLD), 신장 섬유증, 심근경색증 (MI), 연령 관련 황반변성 (AMD), 골관절염 (OA) 및 각막편평을 포함한다.
- 조항 22에 따른 방법에서, 상태는 간 섬유증, 비알코올성 지방간염 (NASH), 비알코올성 지방간질환 (NAFLD) 또는 알코올성 지방간질환 (AFLD) 중 하나이다.
- 조항 22 또는 23에 따른 방법에서, 환자의 다른 샘플에서 비삼중나선형 콜라겐 함량을 감지하는 단계를 더 포함한다.
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