KR20230089541A

KR20230089541A - 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트, 그 제조방법, 이를 이용한 관형 생체조직 제조방법 및 그 방법으로 제조된 관형 생체조직

Info

Publication number: KR20230089541A
Application number: KR1020220163090A
Authority: KR
Inventors: 김민균; 김서연; 남상균; 이희경
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2021-12-13
Filing date: 2022-11-29
Publication date: 2023-06-20

Abstract

본 발명은 혈관이나 신경 도관 등 관형의 생체조직 제조기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 구성성분이 상이하여 다른 물성을 갖는 2개의 용액으로 구성된 바이오잉크조성물키트를 준비하고, 동축 노즐의 쉘 부분 및 코어부분에 서로 다른 물성의 바이오잉크조성물을 사용함으로써 다양한 형상을 갖는 관형의 생체조직을 용이하게 제조할 수 있는 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트, 그 제조방법, 이를 이용한 관형 생체조직 제조방법 및 그 방법으로 제조된 관형 생체조직에 관한 것이다.

Description

관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트, 그 제조방법, 이를 이용한 관형 생체조직 제조방법 및 그 방법으로 제조된 관형 생체조직{Bioinkcomposition for manufacturing a biological conduit tissue structure and methodfor manufacturing a biological conduit tissue structure}

본 발명은 혈관이나 신경 도관 등 관형 생체조직 및 그 제조방법과 관련된 기술로서, 보다 구체적으로는 관형 생체조직을 형성하기 위해 구성성분이 상이하여다른 물성을 갖는 2개의 용액 즉 내측중심부인 코어부를 형성하는 희생물용액과 상기 코어부를 둘러싸는 관형구조물을 형성하는 도관형성하이드로겔로 구성된 바이오잉크조성물키트를 준비하고, 상기 바이오잉크조성물키트를 이용하여 3D프린터에 구비된 2개의 헤드를 각각 다른 공정조건으로 동시 구동시켜 다양한 형상을 갖는 관형의 생체조직을 용이하게 제조할 수 있는 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트, 그 제조방법, 이를 이용한 관형 생체조직 제조방법 및 그 방법으로 제조된 관형 생체조직에 관한 것이다.

관형의 생체조직은 장기 부위에 따라 지름, 길이, 형상, 굴곡도, 직경의 변화, 구성 세포 등이 상이하며, 단일층 구조 뿐만 아니라 2 겹, 3 겹 등 다중층 조직구조로 이루어진 관형 등 다양하다.

기존에는 다중층 관형 생체 조직을 만드는 것이 어렵기 때문에, 몰드 등에 점도가 높은 생체 적합성 재료를 담지하고, 희생가능한 조성물을 이용해 여러 선형 구조를 제작해 포매한 후, 희생 조성물을 제거한 후 남은 강 내부 구조에 각종 세포를 코팅하는 방법을 사용하였다.

최근에는 동축 노즐을 이용하여 혈관 등을 제조하는 방법이 떠오르고 있다. 이 방법은 직경이 큰 노즐 속에 직경이 작은 노즐을 넣은 상태에서 가장 내부에 위치한 노즐(코어)에는 제거 가능한 바이오잉크를 출력하는 한편 노즐과 노즐 사이 간극(쉘)에는 경화 가능한 바이오잉크를 출력함으로써 관 형상을 즉시 제작할 수 있다. 또한, 직경이 서로 다른 여러 개의 노즐을 겹쳐 사용함으로써 단일층 내지 다중층 관 형상을 다양하게 제조할 수 있다는 장점이 있다

하지만, 기존 동축 노즐 기반 관형 생체조직 제조 방법은 출력 및 경화 후 하이드로젤의 기계적 물성이 약해 형상유지능력 (self-standing ability)이 떨어진다. 이렇게 형상유지능력이 떨어지면 정원형의 관형 단면 형상 유지의 어려움, 곡관 형상 제작시 수율 저하, 관형 생체 조직의 배양을 위한 관류액 연결의 어려움 등을 초래한다.

따라서, 이러한 문제점을 해결할 수 있는 관형 생체조직 제조 기술이 개발될 필요성이 존재한다.

국내특허등록번호 제10-2097784호

본 발명자들은 다수의 연구결과 기계적 물성이 향상된 관형 생체조직 제조기술을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 구성성분이 상이하여 다른 물성을 갖는 2개의 용액 즉 내측중심부인 코어부를 형성하는 희생물용액과 코어부를 둘러싸는 관형구조물을 형성하는 도관형성하이드로겔이 분리되어 포장된 바이오잉크조성물키트 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 바이오잉크조성물키트를 이용하여 3D프린터에 구비된 2개의 헤드를 각각 다른 공정조건으로 동시 구동시켜 다양한 형상을 갖는 관형의 생체조직을 3D프린터로 용이하게 형성할 수 있어 다양한 곡관 형상 제작시 수율도 증가될 수 있는 3D프린팅을 이용한 관형 생체조직 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 기계적 물성이 증가되어 형상유지능력 (self- standing ability)이 우수하므로 출력 및 경화 후 정원형의 관형 단면 형상 유지가 쉽고, 관형 생체 조직의 배양을 위한 관류액 연결이 용이한 관형 생체조직을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 먼저, 본 발명은 LithiumPhenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate(LAP) 0.03 내지 0.07 중량%, Gelatin methacrylate(GelMA) 5 내지 15중량% 및 알지네이트 2 내지 3중량% 를 포함하는 도관형성하이드로겔; 및 0.05 내지 0.15N 염화칼슘 및 30 내지 50중량%의 pluronic F-127를 포함하는 희생물형성하이드로겔;을 포함하는 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트를 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 도관형성하이드로겔은 phosphate buffered saline(PBS)를 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 도관형성하이드로겔과 상기 희생물형성하이드로겔은 분리포장되어 냉장보관된다.

또한, 본 발명은 도관형성하이드로겔 준비단계; 및 희생물형성하이드로겔 준비단계;를 독립적으로 수행하는 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트 제조방법을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 도관형성하이드로겔 준비단계는 LithiumPhenyl(2,4,6-trimethyl benzoyl)phosphinate(LAP)를 PBS에 첨가한 후 용해시켜 0.05 내지 0.15 중량%의 LAP 용액을 준비하는 단계; 상기 LAP용액에 Gelatin methacrylate(GelMA)를 넣고 용해시켜 15 내지 25중량%의 GelMA하이드로겔을 준비하는 단계; 증류수에 알지네이트를 넣고 용해시켜 4 내지 5.5중량%의 알지네이트하이드로겔을 준비하는 단계; 및 상기 GelMA하이드로겔과 상기 알지네이트하이드로겔을 1:1의 부피비로 혼합하여 도관형성하이드로겔을 준비하는 단계;를 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 용해는 vortexing, 37±0.5℃ water bath 보관, 180±0.5℃에서 중탕 중 하나 이상을 선택적으로 반복수행하여 이루어진다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 GelMA하이드로겔과 상기 알지네이트하이드로겔의 혼합은 37±0.5℃ water bath 보관 및 vortexing을 반복 수행하여 이루어진다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 희생물형성하이드로겔 준비단계는 염화칼슘을 증류수에 첨가하여 0.05 내지 0.15N 염화칼슘용액을 준비하는 단계; 및 상기 0.05 내지 0.15N 염화칼슘용액에 30 내지 50중량%의 pluronic F-127을 넣고 혼합하는 단계;를 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 혼합하는 단계는 저온보관 및 vortexing을 반복 수행하여 이루어진다.

또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트 또는 상술된 어느 하나의 제조방법으로 제조된 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트의 도관형성하이드로겔과 희생물형성하이드로겔을 3D프린터에 로딩시키는 단계; 상기 3D프린터에 구비된 2개의 헤드를 각각 다른 공정조건으로 동시 구동시켜 상기 희생물형성하이드로겔로 코어부인 희생물을 형성하고 상기 도관형성하이드로겔로 상기 코어부를 둘러싸는 관형구조물을 형성하여 이루어진 파이프라인 구조체를 출력하는 단계; 상기 파이프라인 구조체의 표면을 UV조사하여 상기 관형 구조물을 경화시키는 단계; 및 상기 경화된 파이프라인 구조체의 양단부를 절단한 후 상기 코어부가 중공을 형성하도록 상기 희생물을 제거하는 단계;를 포함하는 3D프린팅을 이용한 관형 생체조직 제조방법을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 출력하는 단계에서 상기 도관형성하이드로겔로 상기 관형구조물을 출력하는 헤드의 공정조건은 26±0.5℃, 220~230kPa이고, 상기 희생물형성하이드로겔로 상기 희생물을 출력하는 헤드의 공정조건은 35±0.5℃, 120~130kPa이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 UV조사는 상기 파이프라인 구조체의 표면에 도달하는 광량이 65 내지75mW/㎠이 되도록 150초 내지 210초 동안 수행된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 희생물을 제거하는 단계는 절단된 파이프라인 구조체의 일단부에 PBS 또는 증류수를 주입하여 상기 희생물을 녹이는 단계; 및 상기 파이프라인 구조체의 중공에 존재하는 액체를 흡입하는 단계;를 포함하여 수행된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 파이프라인 구조체에서 중공의 크기 및 관형 구조물의 두께는 상기 3D프린팅시 사용되는 노즐의 직경에 따라 결정된다.

또한, 본 발명은 상술된 제조방법으로 제조된 관형 생체조직을 제공한다.

상술된 본 발명의 바이오잉크조성물키트는 구성성분이 상이하여 다른 물성을 갖는 2개의 용액 즉 내측중심부인 코어부를 형성하는 희생물용액과 코어부를 둘러싸는 관형구조물을 형성하는 도관형성하이드로겔이 분리되어 포장되므로 물성이 잘 유지되고 사용이 편리하다.

또한, 본 발명의 3D프린팅을 이용한 관형 생체조직 제조방법은 바이오잉크조성물키트를 이용하여 3D프린터에 구비된 2개의 헤드를 각각 다른 공정조건으로 동시 구동시켜 다양한 형상을 갖는 관형의 생체조직을 3D프린터로 용이하게 형성할 수 있어 다양한 곡관 형상 제작시 수율도 증가될 수 있다.

또한, 본 발명의 관형 생체조직에 의하면 기계적 물성이 증가되어 형상유지능력 (self-standing ability)이 우수하므로 출력 및 경화 후 정원형의 관형 단면 형상 유지가 쉽고, 관형 생체 조직의 배양을 위한 관류액 연결이 용이하다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1a 내지 도 1d는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 바이오잉크조성물키트 제조방법에서 도관형성하이드로겔 준비단계 중 수행되는 LAP 용액을 준비하는 단계의 일 구현예를 보여 주는 사진이다.
도 2a 내지 도 2d는 GelMA용액을 준비하는 단계의 일 구현예를 보여 주는 사진이다.
도 3a 내지 도 3c는 알지네이트용액을 준비하는 단계의 일 구현예를 보여 주는 사진이다.
도 4a 내지 도 4c는 도관형성하이드로겔을 준비하는 단계의 일 구현예를 보여 주는 사진이다.
도 5는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 바이오잉크조성물키트 제조방법에서 희생물형성하이드로겔 준비단계의 일 구현예를 보여주는 사진이다.
도 6a는 도 4a 내지 도 4c에 따라 준비된 도관형성하이드로겔이 UV조사에 의해 경화되는 것을 보여주는 사진이고, 도 6b는ㄴ UV조사가 없으면 경화되지 않음을 보여주는 사진이다.
도 7은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 3D프린팅을 이용한 관형 생체조직 제조방법의 구현원리를 도시한 개략도이다.
도 8a는 본 발명의 제조방법으로 제조된 출력물이 핀셋으로 집어 올릴 수 있는 내구성을 보여주는 사진이고, 도 8b 내지 도 8d는 본 발명의 제조방법으로 제조된 다양한 형태의 관형 생체조직을 보여주는 사진이다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 제조방법으로 제조된 일자 도관의 관류 성능을 평가한 결과사진이다.
도 10a 내지 도 10c는 본 발명의 제조방법으로 제조된 U자도관의 관류 성능을 평가한 결과사진이다.

본 발명에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 발명의 설명에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안된다. 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성 요소는 제2 구성 요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성 요소도 제1 구성 요소로 명명될 수 있다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

구성 요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.

시간 관계에 대한 설명일 경우, 예를 들어, '~후에', '~에 이어서', '~다음에', '~전에' 등으로 시간 적 선후관계가 설명되는 경우, '바로' 또는 '직접'이 사용되지 않는 이상 연속적이지 않은 경우도 포함한다.

이하, 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 발명 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

본 발명의 기술적 특징은 내측중심부인 코어부를 형성하는 희생물용액과 코어부를 둘러싸는 관형구조물을 형성하는 도관형성하이드로겔이 분리되어 포장되므로 물성이 잘 유지되고 사용이 편리한 바이오잉크조성물키트, 이를 이용하여 3D프린터에 구비된 2개의 헤드를 각각 다른 공정조건으로 동시 구동시켜 다양한 형상을 갖는 관형의 생체조직을 3D프린터로 용이하게 형성할 수 있어 다양한 곡관 형상 제작시 수율도 증가될 수 있는 3D프린터를 이용한 관형 생체조직 제조방법 및 기계적 물성이 증가되어 형상유지능력 (self-standing ability)이 우수하므로 출력 및 경화 후 정원형의 관형 단면 형상 유지가 쉽고, 관형 생체 조직의 배양을 위한 관류액 연결이 용이한 관형 생체조직에 있다.

즉, 본 발명은 기존 동축 노즐 기반 관형 생체조직 제조 방법이 갖는 출력 및 경화후 하이드로젤의 기계적 물성이 약해 형상유지능력(self-standing ability)이 떨어지는 단점을 보완할 수 있는 새로운 조성의 바이오잉크조성물키트를 개발했기 때문이다.

따라서, 본 발명의 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트는 LithiumPhenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate(LAP) 0.03 내지 0.07 중량%, Gelatin methacrylate(GelMA) 5 내지 15중량%, 알지네이트 2 내지 3중량% 및 잔량의 용제를 포함하는 도관형성하이드로겔; 및 0.05 내지 0.15N 염화칼슘 용액 및 30 내지 50중량%의 pluronic F-127 수용액을 포함하는 희생물형성하이드로겔;을 포함한다.

여기서, 도관형성하이드로겔에 포함된 알지네이트 등은 경화 전 점도를 증진한다. 특히, 알지네이트는 이온 첨가에 의해 작은 크기의 달걀 박스(egg-box) 구조를 만드는 경화가 가능하므로, 뒤이어 광반응성 생체재료인 GelMA의 광경화 반응 시 두 가지 재료가 서로 교차하는 IPN (interpenetrated network)를 형성함으로써, 기계적 강도를 더욱 증대시킬 수 있다.

도관형성하이드로겔은 phosphate buffered saline(PBS)을 포함할 수 있는데, PBS는 공지된 구성의 인산수소이나트륨 및 염화나트륨을 함유하는 수용성 염용액이거나, 염화칼륨 및 인산이수소칼륨을 함유하는 수용성 염 용액일 수 있다.

희생물형성하이드로겔은 3D프린터로 출력이 가능하고 출력된 상태에서 수성용매에 단시간 용해될 수 있는 특성을 가져야 하므로, 0.05 내지 0.15N 염화칼슘 용액 및 30 내지 50중량%의 pluronic F-127을 포함하도록 구현하였다. 특히, 희생물형성하이드로겔에 포함된 염화칼슘(CaCl₂)은 도관형성하이드로겔에 포함된 알지네이트의 이온성 경화를 출력 즉시 일으킬 수 있다.

도관형성하이드로겔과 희생물형성하이드로겔은 분리포장되어 냉장보관될 수 있다.

다음으로, 본 발명의 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트 제조방법은 도관형성하이드로겔 준비단계; 및 희생물용액 준비단계;를 독립적으로 수행한다.

먼저, 도관형성하이드로겔 준비단계는 LithiumPhenyl(2,4,6-trimethyl benzoyl)phosphinate(LAP)를 PBS에 첨가한 후 용해시켜 0.05 내지 0.15 중량%의 LAP 용액을 준비하는 단계; 상기 LAP용액에 Gelatin methacrylate(GelMA)를 넣고 용해시켜 15 내지 25중량%의 GelMA하이드로겔을 준비하는 단계; 증류수에 알지네이트를 넣고 용해시켜 4 내지 5.5중량%의 알지네이트하이드로겔을 준비하는 단계; 및 상기 GelMA하이드로겔과 상기 알지네이트하이드로겔을 1:1의 부피비로 혼합하여 도관형성하이드로겔을 준비하는 단계;를 포함한다.

각 단계에서 수행되는 용해는 vortexing, 37±0.5℃ water bath 보관, 180±0.5℃에 중탕 중 하나 이상을 선택적으로 반복수행하여 이루어질 수 있다. 즉, 도 1a 내지 도 3c에 도시된 바와 같이, 일 구현예로서, LAP 용액을 준비하는 단계는 vortexing만 수행되고, GelMA하이드로겔을 준비하는 단계는 vortexing 및 37±0.5℃ water bath 보관을 번갈아서 GelMA가 완전히 용해될 때까지 반복 수행될 수 있으며, 알지네이트하이드로겔을 준비하는 단계는 vortexing 후 180±0.5℃에서 중탕이 수행될 수 있다.

또한, 도관형성하이드로겔을 준비하는 단계에서 GelMA하이드로겔과 알지네이트하이드로겔의 혼합은 도 4a 내지 도 4c에 도시된 바와 같이 37±0.5℃ water bath 보관 및 vortexing을 반복 수행하여 이루어질 수 있다.

희생물형성하이드로겔 준비단계는 염화칼슘을 증류수에 첨가하여 0.05 내지 0.15N 염화칼슘용액을 준비하는 단계; 및 상기 0.05 내지 0.15N 염화칼슘용액에 30 내지 50중량%의 pluronic F-127을 넣고 혼합하는 단계;를 포함하여 수행될 수 있다. 여기서, 혼합하는 단계는 도 5에 도시된 바와 같이 저온보관 및 vortexing을 반복 수행하여 이루어질 수 있다.

다음으로, 본 발명의 3D프린팅을 이용한 관형 생체조직 제조방법은 상술된 어느 하나의 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트 또는 상술된 어느 하나의 제조방법으로 제조된 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트의 도관형성하이드로겔과 희생물형성하이드로겔을 3D프린터에 로딩시키는 단계; 상기 3D프린터에 구비된 2개의 헤드를 각각 다른 공정조건으로 동시 구동시켜 상기 희생물형성하이드로겔로 내측중심부인 희생물을 형성하고 상기 도관형성하이드로겔로 상기 내측중심부를 둘러싸는 관형구조물을 형성하여 이루어진 파이프라인 구조체를 출력하는 단계; 상기 파이프라인 구조체의 표면을 UV조사하여 상기 관형 구조물을 경화시키는 단계; 및 상기 경화된 파이프라인 구조체의 양단부를 절단한 후 상기 내측중심부가 중공을 형성하도록 상기 희생물을 제거하는 단계;를 포함한다.

도관형성하이드로겔과 희생물형성하이드로겔을 3D프린터에 로딩시키는 단계는 2개의 시린지에 각각 도관형성하이드로겔과 희생물형성하이드로겔을 투입하고, 희생물형성하이드로겔을 투입한 시린지에 동축노즐을, 도관형성하이드로겔을 투입한 시린지에 플라스틱노즐을 장착한 뒤 3D프린터 헤드에 각각 장착하여 수행될 수 있다.

출력하는 단계는 3D프린터에 구비된 2개의 헤드가 동시 구동되어 연결된 동축 노즐을 통해 코어부와 관형구조물로 이루어진 파이프라인 구조체를 출력하는 단계로서, 도관형성하이드로겔로 관형구조물을 출력하는 헤드의 공정조건은 26±0.5℃, 220~230kPa이고, 희생물형성하이드로겔로 희생물을 출력하는 헤드의 공정조건은 35±0.5℃, 120~130kPa일 수 있다.

경화시키는 단계에서 UV조사는 파이프라인 구조체의 표면에 도달하는 광량이 65 내지 75mW/㎠이 되도록 150초 내지 210초 동안 수행될 수 있다.

희생물을 제거하는 단계는 절단된 파이프라인 구조체의 일단부에 PBS 또는 증류수를 주입하여 상기 희생물을 녹이는 단계; 및 상기 파이프라인 구조체의 중공에 존재하는 액체를 흡입하는 단계;를 포함하여 수행될 수 있다.

상술된 구성을 갖는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 3D프린팅을 이용한 관형 생체조직 제조방법의 구현원리가 도 3에 도시되어 있다. 도 7에 도시된 바와 같이, 3D printer에 구비된 2개의 헤드를 각각 다른 공압, 다른 온도로 동시에 사용하여 내, 외부 재료가 다른 긴 원통형 관을 printing 할 수 있는데, 특히, Alginate와 Ca 이온이 만나면 경화되는 성질을 이용하여, 도관의 내벽에서는 CPF-127(Pluronic F127/CaCl₂)에의한 경화가 이루어지고 도관의 외벽은 UV에 의한 경화가 이루어지는 것을 알 수 있다.

마지막으로 본 발명의 관형 생체조직은 상술된 제조방법으로 제조되므로 후술하는 실험예를 통해 알 수 있듯이, 기계적 물성이 증가되어 형상유지능력 (self-standing ability)이 우수하므로 출력 및 경화 후 정원형의 관형 단면 형상 유지가 쉽고, 관형 생체 조직의 배양을 위한 관류액 연결이 용이하다.

실시예 1

1.도관형성하이드로겔 준비단계

(1)LAP 용액을 준비하는 단계

50mL 코니컬 튜브에 1X PBS 40mL와 LAP 0.04g을 넣고 호일로 감싼 뒤 LAP가 완전히 녹을 때까지 vortexing하여 0.1중량% LAP용액을 준비하였다.

(2)GelMA하이드로겔을 준비하는 단계

0.1중량% LAP solution 20mL에 GelMA 4g을넣고 vortexing하였다. 37℃ water bath에 30분씩 넣어뒀다가 vortexing하였다. GelMA가 완전히 녹을 때까지 상기 과정을 반복하여 20중량% GelMA 하이드로겔을 준비하였다.

(3)알지네이트하이드로겔을 준비하는 단계

50mL 코니컬 튜브에 DW 20mL와 Alginate 0.96g을 넣고 vortexing한 후, 180℃ 핫 플레이트에서 약 4시간 중탕하여 4.8중량% Alginate하이드로겔을 준비하였다.

(4)도관형성하이드로겔을 준비하는 단계

준비된 4.8중량% Alginate 하이드로겔 20mL에 20중량% GelMA 하이드로겔 20mL을 추가하여 최종 농도가 알지네이트 2.4중량%, LAP 0.05중량% 및 GelMA 10중량%를 포함하는 도관형성하이드로겔을 다음과 같이 제조하였다. 37℃ water bath에 30분씩 넣어뒀다가 vortexing하는 과정을 반복하여 Alginate 하이드로겔과 GelMA 하이드로겔이 덩어리를 보이지 않고 완전히 섞일 때까지 반복하였는데, 섞는 과정에서 rotater가 사용되었다.

2. 희생물형성용하이드로겔 준비단계

염화칼슘을 DW에 희석하여 0.1N CaCl₂ 제조하였다. 0.1N CaCl₂ 용액에 40% Pluronic F-127을 넣고 vortexing하였다. 냉장고에서 저온 보관하며 완전히 섞일 때까지 vortexing 반복하여 희생물형성용하이드로겔을 준비하였다. 필요한 경우, 섞는 과정에서 rotater를 사용할 수 있다.

실시예 2

1.프린팅 준비단계

3ㅇ3/16 실리콘튜브는 9cm씩 잘라서 50mL 코니컬 튜브에 70% 에탄올과 함께 담아서 보관하고, 17/21G 동축노즐과 15G 플라스틱노즐을 준비하였다. 3D프린터는 ㈜티앤알바이오팹의 3D바이오프린터를 사용하였고, 준비된 실리콘튜브를 동축노즐의 측면 돌출부와 플라스틱노즐 사이에 연결시켜 설치하였다.

2.도관형성용액과 희생물형성용액을 3D프린터에 로딩시키는 단계

3D프린더에 구비된 2개의 헤드에 각각 실시예 1에서 준비된 도관형성용하이드로겔과 희생물형성용하이드로겔을 로딩시켰다. 한편, 도관형성용하이드로겔에 포함된 GelMA는 고온에서 액체 상태이고 냉장보관시 고체에 가깝게 굳어져 있고, 희생물형성용하이드로겔은 저온에서 액체상태로 존재하므로 syringe에 담은 각각의 hydrogel이 printing 가능한 젤리 같은 상태로 변할 때까지 30~1시간 정도 프린터 헤드 온도에 적응하는 과정을 두었다.

3.파이프라인 구조체를 출력하는 단계

도관형성용하이드로겔이 로딩된 헤드의 공정조건은 26℃, 220~230kPa이고, 희생물형성용하이드로겔이 로딩된 헤드의 공정조건은 35℃, 120~130kPa로 조절하였다. 그 후 3D프린터를 구동시켜 파이프라인 구조체를 출력하였다.

4.경화시키는 단계

출력된 파이프라인 구조체의 표면에 도달하는 광량이 70mW/㎠이 되도록 180초 동안 UV조사를 수행하였다.

도 8a와 같이 printing 출력물로서 원하는 형상의 도관을 얻을 수 있는데, 경화 후 핀셋으로 집어올릴 수 있는 충분한 내구성을 갖는 것을 알 수 있다.

5.희생물을 제거하는 단계

경화된 파이프라인 구조체 즉 도관의 양 끝을 가위로 잘라낸다. 도관을 비스듬히 세우고 희생물형성용하이드로겔(CPF-127)이 채워진 부분에 pipet aid로 수차례 1X PBS 또는 DW를 흘려보내 CPF-127을 제거하였다. 도관 내부의 액체를 전부 제거하기 위해 suction pipet으로 액체를 흡입하였다.

상술된 방법으로 도 8b 내지 도 8d에 도시된 구조의 관형 생체조직은 물론 도 9a에 도시된 일자 도관 등 다양한 형태의 관형 생체조직을 얻을 수 있다.

실험예 1

실시예 1에서 얻어진 도관형성용하이드로겔의 UV경화여부를 확인하기 위해 2개의 코니컬 튜브에 도관형성용하이드로겔을 넣고 하나는 광량이 70mW/㎠이 되도록 180초 동안 UV조사를 수행하고, 다른 하나는 UV조사를 하지 않았다.

그 결과 도 6a에 도시된 바와 같이 UV조사가 수행되면 경화가 일어나고, 도 6b와 같이 UV조사가 없으면 경화가 되지 않는 것을 확인할 수 있다.

실험예 2

실시예 2에서 제조된 관형 생체조직의 관류성능을 Syringe pump를 이용해 다음과 같이 평가하고 그 결과를 도 9a 내지 도 10c에 나타내었다.

속이 빈 도관 끝에 시린지 펌프에 연결된 노즐을 연결하고 일정한 유속으로 유색의 액체를 흘려보내주었다.

도 9a에 도시된 바와 같이, 일자 도관의 일단부에 노즐을 연결하여 관류 가능성을 확인했고, 도 10a에 도시된 바와 같이 U-shape 도관의 양 끝에 노즐을 연결하여 관류 가능성을 확인했다.

도 9b와 도 10b 및 도 10c에 도시된 바와 같이, 관류성능이 매우 우수함을 알 수 있다.

도시하지는 않았지만, 각각 다른 도관으로 수차례 관류 성능을 시험한 결과 유색의 액체가 도관벽으로 새어나오지 않고 반대편 도관 끝까지 흘러나오는 모습을 확인할 수 있었다.

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims

LithiumPhenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate(LAP) 0.03 내지 0.07 중량%, Gelatin methacrylate(GelMA) 5 내지 15중량% 및 알지네이트 2 내지 3중량% 를 포함하는 도관형성하이드로겔; 및
0.05 내지 0.15N 염화칼슘 및 30 내지 50중량%의 pluronic F-127를 포함하는 희생물형성하이드로겔;을 포함하는 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트.
제 1 항에 있어서,
상기 도관형성하이드로겔은 phosphate buffered saline(PBS)를 포함하는 것을 특징으로 하는 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트.
제 1 항에 있어서,
상기 도관형성하이드로겔과 상기 희생물형성하이드로겔은 분리포장되어 냉장보관되는 것을 특징으로 하는 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트.
도관형성하이드로겔 준비단계; 및
희생물형성하이드로겔 준비단계;를 독립적으로 수행하는 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트 제조방법.
제 4 항에 있어서, 상기 도관형성하이드로겔 준비단계는
LithiumPhenyl(2,4,6-trimethyl benzoyl)phosphinate(LAP)를 PBS에 첨가한 후 용해시켜 0.05 내지 0.15 중량%의 LAP 용액을 준비하는 단계;
상기 LAP용액에 Gelatin methacrylate(GelMA)를 넣고 용해시켜 15 내지 25중량%의 GelMA하이드로겔을 준비하는 단계;
증류수에 알지네이트를 넣고 용해시켜 4 내지 5.5중량%의 알지네이트하이드로겔을 준비하는 단계; 및
상기 GelMA하이드로겔과 상기 알지네이트하이드로겔을 1:1의 부피비로 혼합하여 도관형성하이드로겔을 준비하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트 제조방법.
제 5 항에 있어서,
상기 용해는 vortexing, 37±0.5℃ water bath 보관, 180±0.5℃에서 중탕 중 하나 이상을 선택적으로 반복수행하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트 제조방법.
제 5 항에 있어서,
상기 GelMA하이드로겔과 상기 알지네이트하이드로겔의 혼합은 37±0.5℃ water bath 보관 및 vortexing을 반복 수행하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트 제조방법.
제 4 항에 있어서, 상기 희생물형성하이드로겔 준비단계는
염화칼슘을 증류수에 첨가하여 0.05 내지 0.15N 염화칼슘용액을 준비하는 단계; 및
상기 0.05 내지 0.15N 염화칼슘용액에 30 내지 50중량%의 pluronic F-127을 넣고 혼합하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트 제조방법.
제 8 항에 있어서,
상기 혼합하는 단계는 저온보관 및 vortexing을 반복 수행하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트 제조방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트 또는 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 관형 생체조직용 바이오잉크조성물키트의 도관형성하이드로겔과 희생물형성하이드로겔을 3D프린터에 로딩시키는 단계;
상기 3D프린터에 구비된 2개의 헤드를 각각 다른 공정조건으로 동시 구동시켜 상기 희생물형성하이드로겔로 코어부인 희생물을 형성하고 상기 도관형성하이드로겔로 상기 코어부를 둘러싸는 관형구조물을 형성하여 이루어진 파이프라인 구조체를 출력하는 단계;
상기 파이프라인 구조체의 표면을 UV조사하여 상기 관형 구조물을 경화시키는 단계; 및
상기 경화된 파이프라인 구조체의 양단부를 절단한 후 상기 코어부가 중공을 형성하도록 상기 희생물을 제거하는 단계;를 포함하는 3D프린팅을 이용한 관형 생체조직 제조방법.
제 10 항에 있어서,
상기 출력하는 단계에서 상기 도관형성하이드로겔로 상기 관형구조물을 출력하는 헤드의 공정조건은 26±0.5℃, 220~230kPa이고, 상기 희생물형성하이드로겔로 상기 희생물을 출력하는 헤드의 공정조건은 35±0.5℃, 120~130kPa인 것을 특징으로 하는 3D프린팅을 이용한 관형 생체조직 제조방법.
제 10 항에 있어서,
상기 UV조사는 상기 파이프라인 구조체의 표면에 도달하는 광량이 65 내지75mW/㎠이 되도록 150초 내지 210초 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 3D프린팅을 이용한 관형 생체조직 제조방법.
제 10 항에 있어서, 상기 희생물을 제거하는 단계는
절단된 파이프라인 구조체의 일단부에 PBS 또는 증류수를 주입하여 상기 희생물을 녹이는 단계; 및
상기 파이프라인 구조체의 중공에 존재하는 액체를 흡입하는 단계;를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 하는 3D프린팅을 이용한 관형 생체조직 제조방법.
제 10 항에 있어서,
상기 파이프라인 구조체에서 중공의 크기 및 관형 구조물의 두께는 상기 3D프린팅시 사용되는 노즐의 직경에 따라 결정되는 것을 특징으로 하는 3D프린팅을 이용한 관형 생체조직 제조방법.
제 10 항의 제조방법으로 제조된 관형 생체조직.