CN105194738A - 一种用作骨修复材料的自矿化温度敏感水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用作骨修复材料的自矿化温度敏感水凝胶，由水溶液中的磷酸化星型嵌段共聚物发生物理性交联形成，所述聚合物以磷酸化的亲水聚合物嵌段为内段，温度敏感聚合物嵌段为外段，构成由中心发散的内外层的星型分子结构。本发明所公开的自矿化温度敏感水凝胶通过其星型的分子拓扑结构使每个臂向外伸展，利于分子间物理交联的形成，提高了水凝胶的稳定性。该水凝胶在模拟体液浸泡和SD大鼠背部注射后组织切片都观察到明显的磷灰石生成，其自我诱导矿化可用于加速骨修复。

Description

一种用作骨修复材料的自矿化温度敏感水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于高分子功能材料领域，具体涉及一种可用于骨修复的自矿化温度敏感水凝胶。

背景技术

水凝胶是水溶胀的聚合物网络，在涂层、化妆品、药物递送、组织工程和传感等领域广泛应用。刺激相应嵌段共聚物是制备溶液/凝胶(sol-gel)转换形成水凝胶的主要途径，最常见的是刺激相应嵌段-亲水嵌段-刺激相应嵌段组成的ABA型三嵌段共聚物。《JournaloftheAmericanChemicalSociety》杂志2012年7月13日发表的文章“EfficientFormationofMulticompartmentHydrogelsbyStepwiseSelf-AssemblyofThermoresponsiveABCTriblockTerpolymers”指出线型ABA型结构的分子容易形成分子环(“loop”)构象，所形成的凝胶力学性能较差，应用前景不佳。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于磷酸化星型嵌段共聚物的自矿化温度敏感水凝胶骨修复材料，一方面克服了ABA线型嵌段共聚物水凝胶力学性能差的缺点，另一方面加速骨修复材料诱导成骨过程。

具体地说，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种用作骨修复材料的自矿化温度敏感水凝胶，由水溶液中的磷酸化星型嵌段共聚物发生物理性交联形成，所述聚合物以磷酸化的亲水聚合物嵌段为内段，温度敏感聚合物嵌段为外段，构成由中心发散的内外层的星型分子结构。

上述结构的水凝胶，由于形成了星型结构，所有臂往外伸展，容易和周边的其他星型分子形成物理缠结，所形成的凝胶力学性能更好。

同时，上述的水凝胶在结构基团上采用了磷酸化的亲水聚合物嵌段，其在体液和人体环境中可以有效吸收矿物离子形成羟基磷灰石，促进骨的形成和修复，具有广泛的医学用途。

本发明水凝胶所用的聚合物，由4个臂组成中心向外发散的4臂星型聚合物的分子结构。

作为一种具体的工艺实现，本发明公开了一种典型可用的4臂星型聚合物，

其基本结构单元如下结构式所示：

由于本发明水凝胶基本结构单元的结构特性，本发明还公开了所述自矿化温度敏感水凝胶在骨修复中的应用，具体的应用形式包括两种，一种是作为药物或辅助药物制剂加入在体液中浸泡形成磷灰石矿物；另一种是作为辅料，通过悬浮间充质干细胞形成负载细胞的凝胶支架。

上述的第一种用途有助于骨损伤的修复，第二种用途则使得细胞在材料上具有正常的黏附和增殖行为，可用于任何所需的医学应用。

附图说明

图1是本发明所述星型嵌段共聚物Star-PAA(PEA)-PNIPAM的流变性质。弹性模量G′和损耗模量G″随温度变化曲线，Star-PAA(PEA)-PNIPAM浓度分别为0.5,1.0,1.5和2.0wt％。

图2是Star-PAA(PEA)-PNIPAM凝胶在模拟体液SBF浸泡8周(b)和未浸泡(a)的扫描电镜图片(标尺100μm)。左上角为放大图，标尺500nm。

图3是Star-PAA(PEA)-PNIPAM水凝胶矿化前后和羟基磷灰石粉末的XRD。

图4是CCK-8测定BMSCs在凝胶内增殖，以比孔板表面为对照。

图5是SD大鼠背部注射Star-PAA(PEA)-PNIPAM溶液一周剃毛后照片(a)和表皮切开后照片(bc)。凝胶被皮下组织包裹。

图6为大鼠皮下注射后一周(abc)、四周(def)和八周(ghi)后组织样品的H&E染色图片。adg为凝胶和周边组织(×40)，beh为凝胶与纤维膜界面处(×100)，cfi为凝胶内部(×400)。

具体实施方式

为了说明本发明技术方案的具体实现，以4臂星型聚合物为例，本发明公开了其具体的制备工艺和应用效果。

在下述制备过程中，各成分的用量和反应时间选择旨在实现反应效率的最优化，降低原料浪费，本领域技术人员可以理解，如下所示反应条件并非限制性的，更改各成分的用量和反应条件同样能保证本发明反应的顺利进行，只是产率略有变化。

本发明的水凝胶所采用的聚合物是采用原子转移自由基聚合方法得到星型嵌段共聚物，其化学反应原理为通过制备星型多官能的引发剂，先引发亲水单体或可转化成亲水的单体聚合得到大分子引发剂，后引发温度敏感单体聚合得到星型嵌段共聚物，最后进行磷酸化改性内段。

所称的4臂星型聚合物，化学结构如下所示：

上述聚合物的合成过程详述如下：

(1)多官能的星型引发剂的合成

以四官能引发剂4Br的合成为例，季戊四醇(1g，7.34mmol)和无水三乙胺(7.5mL，53.96mmol)加入到无水15mL四氢呋喃中，于冰水浴中搅拌溶解。取2-溴-2-甲基丙酰溴BiBB(5.95mL，48.14mmol)溶解于15mL四氢呋喃中，逐滴加入，立即形成大量白色絮状物。滴加完毕后，加入4-二甲氨基吡啶(5mg，0.041mmol)，并转移到室温反应24h。反应接受后过滤去除白色针状沉淀，滤液蒸干，加入适量N,N-二甲基甲酰胺溶解，转移到透析袋(MWCO＝8000-14000)中透析两天，过滤析出的白色沉淀，冻干，得到5.21g，产率97％。

上述化学反应过程如下化学反应式I所涵盖：

(2)大分子引发剂的合成

四双官能引发剂4Br(14.6mg，0.02mmol)、溶剂苯甲醚(2.78mL，40％oftBA)、配体N,N,N’,N”,N”-五甲基二亚乙基三胺PMDETA(33μL，0.16mmol)和单体丙烯酸叔丁酯tBA(6.96mL，48mmol)加入到带三通阀门的茄形反应瓶中，搅拌溶解，移入-20℃低温反应槽中。用水泵(真空度0.09MPa)将反应瓶抽真空，随后充入氮气，重复3次，接着以针头将氮气通入液面下，鼓泡20min。逆着氮气流，加入新制CuBr(23mg，0.16mmol),并将反应瓶密封。移入65℃油浴中反应24h。加入亚铜后，溶液从无色变成亮绿色，随着反应逐渐加深。

反应完成后，加入四氢呋喃终止反应，敞口搅拌过夜。得到的溶液过Al₂O₃柱去除催化剂，并旋蒸浓缩。浓缩液滴入甲醇/水(1:1v/v)的混合沉淀剂，得到白色发粘固体，干燥后收得白色固体4.0g，即Star-PtBA-Br。

上述化学反应过程如下化学反应式II所涵盖：

(3)共聚物Star-PtBA-PNIPAM的合成

带三通阀门的茄形反应瓶中，大分子引发剂Star-PtBA-Br(1g，0.005mmol)，第二单体N-异丙基丙烯酰胺NIPAM(4.56g，40mmol)，配体三(2-二甲氨基乙基)胺(Me6TREN，99％)Me6TREN(109μL，0.4mmol)溶解于7.6mL溶剂N,N-二甲基丙烯酰胺中，移入-20℃低温反应槽中。用水泵(真空度0.09MPa)将反应瓶抽真空，随后充入氮气，重复3次，接着以针头将氮气通入液面下，鼓泡20min。逆着氮气流，加入新制CuCl(40mg，40mmol)，并将反应瓶密封。移入35℃油浴中反应48h。

加入DMF终止聚合，敞口搅拌过夜。得到的溶液移入透析袋中(MWCO＝8000-14000)，袋内加入适量水稀释溶液，透析三天，除去杂质。样品冻干收得2g。

上述化学反应过程如下化学反应式III所涵盖：

(4)共聚物Star-PAA-PNIPAM的合成

Star-PtBA-PNIPAM(1.8g，7.6mmoltBA)溶解在二氯甲烷DCM30mL中，加入三氟乙酸(10.8mL，146mmol)，在25℃搅拌24h。旋蒸浓缩后，滴入过量蒸馏水中沉淀，得白色絮状产物，过滤收集后冻干，收得白色固体Star-PAA-PNIPAM1.1g。

上述化学反应过程如下化学反应式IV所涵盖：

(5)共聚物Star-PAA(PEA)-PNIPAM

0℃冰水浴搅拌下，将Star-PAA-PNIPAM(0.8g，11.1mmol)和NHS(1.532g，13.32mmol)溶解于15mLDMF，加入DCC(4.584g，22.22mmol)。反应半小时后，升温到室温反应24h。以油泵抽真空小心旋蒸去除DMF，得到活化酯粗产物。

将氢氧化钠小心逐渐地加入乙醇胺磷酸酯PEA(1.565g，11.1mmol)的25mL甲醇的悬浮液中，恰好得到澄清溶液。将上述溶液加入活化酯粗产物中，剧烈搅拌，室温反应48h。两天后完全蒸干甲醇，加入蒸馏水30mL，剧烈搅拌过夜。离心(10000r/min，20min)取上清液，以透析袋(MWCO＝8000-14000)透析2天，过滤后再透析2天，冻干后得到终产物Star-PAA(PEA)-PNIPAM1.3g。

上述化学反应过程如下化学反应式V所涵盖：

为了说明本发明所得4臂星型共聚物水凝胶的效果，申请人进行了下述试验。

(1)凝胶流变测试

Star-PAA(PEA)-PNIPAM溶解于PBS溶液中，用少量NaOH和稀HCl调节pH到中性。数据由MARSIII流变仪(HAAKE公司)，使用35mm平板(P35TiL)和200μm间距测得。测试前，固定频率，分别在20℃和50℃以振荡场剪切，剪切应变从0.001到0.5。在所有样品的20℃和50℃下共同的线性粘弹性区间中，确定最佳的剪切频率为0.8Hz和最佳的剪切应变为0.4。在该频率和应变下，振荡升温扫描，温度从20℃到50℃，2℃/min速率升温。

(2)模拟体液浸泡验证凝胶矿化能力

模拟体液(simulatedbodyfluid，SBF)：NaCl(7.996g/L)，NaHCO₃(0.350g/L)，KCl(0.224g/L)，K2HPO₄·3H₂O(0.228g/L)，MgCl₂·6H₂O(0.305g/L)，HCl(1mol/L，40mL)，CaCl₂(0.278g/L)，Na₂SO₄(0.071g/L)和三羟甲基氨基甲烷(Tris,6.057g/L)。得到溶液pH为7.25。

聚合物Star-PAA(PEA)-PNIPAM溶解于PBS中，配制成2.0wt％2mL。装入透析袋(MWCO＝8000-14000)內。透析袋放置于聚乙烯塑料杯中(100mL容积，圆柱形，直径5cm，高5.6cm)，并加入100mLSBF完全浸没透析袋。塑料杯以保鲜膜仔细封口，静置放置于37℃水浴中。每天更换SBF时，需预热30min。矿化2周后，透析袋取出，浸没于37℃的1L蒸馏水12h以去除凝胶内的离子。小心用液氮冻住样品，转移到冻干机冻干，得到矿化凝胶。

(3)SD大鼠皮下注射验证凝胶矿化能力

取Star-PAA(PEA)-PNIPAM于玻璃小瓶中，高温高压灭菌。冷却后，加入适量α-MEM培养基，配制成20mg/mL聚合物溶液。取200±5gSD雌性大鼠8只，背部中央左右两侧分别注射聚合物溶液0.75mL。分别在第1、2、3、4、6、8周断颈法处死后，切取注射部位的组织做组织切片分析。

(4)负载于凝胶的间充质干细胞的增殖

细胞负载于Star-PAA(PEA)-PNIPAM凝胶：称取聚合物于离心管，每管120mg，以锡箔纸封口，高温高压灭菌。冷却后各加入6mLL-DMEM培养基，得到20mg/mL聚合物溶液。空气摇床(静置)37℃加热使之形成凝胶，快速取出后各加入6mL，再放空气摇床(静置)孵化。过夜后，上层培养基由红变黄，凝胶由无色变黄色后红色。每隔两天更换6mL培养基，直到加入的培养基不变色，此时凝胶和培养基达到离子平衡，pH为7左右。悬浮BMSCs细胞于离心管中，计数并调节使每隔离心管内有细胞1.8×105个，1300r/min离心后，小心倒出培养基，加入6mL配好的聚合物溶液，重新悬浮细胞。将细胞悬液加到12孔板中，1mL/孔。孔板放入培养箱孵化2小时，使之成胶后取出，再加入1mL/孔新鲜培养基。每两天更换一次上层培养基。

12孔板一半孔为凝胶负载细胞的实验组，一半为无凝胶但接种细胞的对照组。共设4个孔板，对应取样时间。分别在接种后的第1、3、5、7天，在更换培养基后，加入200μL/孔CCK-8测试液，放入培养箱孵化2h后，小心吸取上层培养基100μL，测定吸光值。

上述试验的结果如参考附图所示，可以看出本发明的水凝胶流变特性良好，具有显著的自矿化能力，诱导矿化生成的矿物质为羟基磷灰石，并能有效促进间充质干细胞的增殖。

Claims (6)

1.一种用作骨修复材料的自矿化温度敏感水凝胶，其特征在于由水溶液中的磷酸化星型嵌段共聚物发生物理性交联形成，所述聚合物以磷酸化的亲水聚合物嵌段为内段，温度敏感聚合物嵌段为外段，构成由中心发散的内外层的星型分子结构。

2.根据权利要求1的用作骨修复材料的自矿化温度敏感水凝胶，其特征在于该聚合物4个臂组成中心向外发散的分子结构。

3.根据权利要求1的用作骨修复材料的自矿化温度敏感水凝胶，其特征在于所述共聚物为4臂星型聚合物，其基本结构单元如下结构式所示：

4.权利要求3的用作骨修复材料的自矿化温度敏感水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)基于化学反应I合成四官能引发剂4Br：

2)基于化学反应II合成大分子引发剂Star-PtBA-Br：

3)基于化学反应III合成共聚物Star-PtBA-PNIPAM：

4)基于化学反应IV合成共聚物Star-PAA-PNIPAM：

5)基于化学反应V合成共聚物Star-PAA(PEA)-PNIPAM：

5.权利要求1的用作骨修复材料的自矿化温度敏感水凝胶的应用，包括在体液中浸泡形成羟基磷灰石矿物。

6.权利要求1的用作骨修复材料的自矿化温度敏感水凝胶的应用，包括悬浮间充质干细胞形成负载细胞的凝胶支架。