CN103923224A - 一种光照-镁离子双交联海藻酸盐水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种光照-镁离子双交联海藻酸盐水凝胶的制备方法。将可光交联的藻酸盐溶液、光引发剂、具有生物活性的镁离子作为前体溶液，通过离子反应和紫外光照双交联反应制成。本发明将镁离子通过离子交联的方式引入到支架中，简单有效地改良了支架的生物学特性；同时通过光交联形成主体骨架，保证了支架的稳定性；紫外光引发以及镁离子的慢速交联特性，还保证了支架良好的可控性。本发明制备方法简单，无需引入其他材料，通过调控镁离子的浓度，能有效调整水凝胶的理化性能和生物性能，便于实际应用时的需要。

Description

一种光照-镁离子双交联海藻酸盐水凝胶及其制备方法

 

技术领域    

本发明属于生物医学领域，涉及一种海藻酸盐水凝胶及其制备方法，具体涉及一种光照-镁离子双交联海藻酸盐水凝胶及其制备方法。

背景技术

由创伤、肿瘤、感染、发育异常等原因导致的骨缺损一直是临床治疗的难点。骨移植是重建缺损骨组织的主要方法，但采用自体骨移植时，自体骨的来源较少，且会给病人带来一定痛苦；采用异体骨移植时又存在感染、排斥反应等问题。组织工程学的发展为研制理想的骨移植物提供了一条全新的思路。支架是骨组织工程的三要素之一，除了无毒、无免疫原性、可降解和良好的机械性能之外，支架还应能有效促进种子细胞的粘附、增殖以及定向分化，从而引导组织再生。

海藻酸是从可再生资源如褐藻或细菌中提取出的天然线性分子多糖，具有无毒、无免疫原性，来源丰富、价格低廉、易塑形、可降解等一系列优势。作为骨组织工程支架，藻酸盐水凝胶可通过注射的方法进行应用，从而减小了手术创伤，适用于形状复杂的骨缺损。但海藻酸盐水凝胶支架仍然存在一些不足。比如，海藻酸盐水凝胶采用离子交联制备时，聚合速率常常过快，导致水凝胶结构不均匀；凝胶中的二价阳离子也容易与周围环境发生离子交换，进而导致凝胶溶解，失去凝胶特性。当海藻酸盐水凝胶采用光交联制备时，虽然具备良好的理化性能，但水凝胶的高度亲水性导致细胞粘附性能较差，且单纯的水凝胶支架缺乏骨诱导性（Jeon, O., et al. Biomaterials, 2009. 30(14): p. 2724-34）。

近年来，大量体内、外研究表明：某些二价阳离子具有一些潜在的生物学作用，能有效调控细胞的增殖、分化，甚至组织形成。在支架材料中引入适量具有生物活性的二价阳离子已成为改善材料生物性能的新途径。比如，Place等利用离子交联的方式将锶、锌离子引入到海藻酸盐水凝胶支架中，通过离子交换，将生物活性离子缓释出来促进种子细胞的分化（Place, ES., et al. Tissue Eng Part A. 2011 Nov;17(21-22):2713-22)。镁离子是人体内含量第四丰富的阳离子，是维持健康骨生长、发育和稳定的必需元素，被证实具有广泛的生物学效应。除了与锶、锌离子相似的、在促进细胞增殖及分化方面的作用外，镁离子还被证实能促进前成骨细胞在支架上的粘附（Park, J.W., et al. Clin Oral Implants Res. 2010 Nov;21(11): 1278-87）。通过引入镁离子对支架进行改性，不仅成本低，还具有较好的稳定性，不像载细胞因子、蛋白、药物时存在变性失效的风险。

过去，镁离子一直被认为不能使海藻酸盐发生离子交联。最近，Topuz证实单独使用镁离子也可制备出海藻酸盐水凝胶，只是交联时所用的离子浓度较高，交联时间更长 (Topuz, F., et al. Soft Matter , 2012, 8, 4877-4881)。然而，仅用镁离子交联形成的海藻酸盐水凝胶结合力较弱，易溶胀破裂，稳定性差。因此，单独镁离子交联的海藻酸盐水凝胶不能直接应用于组织工程。

基于以上论述，我们选择采用光照-离子双交联的方法将镁离子引入到海藻酸盐水凝胶上。以光交联为主，保证了支架的稳定性；以离子交联为辅，通过镁离子的慢速交联特性保证海藻酸盐水凝胶的可控性。当凝胶在体内通过离子交换释放镁离子时，则赋予支架一定的生物学活性。

发明内容

本发明为了克服离子交联海藻酸盐水凝胶稳定性差和光交联海藻酸盐水凝胶生物活性差的不足，提供一种具有稳定性、可控性、生物活性的光照-镁离子双交联海藻酸盐水凝胶及其制备方法。

一种光照-镁离子双交联海藻酸盐水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

将可光交联海藻酸盐溶解到含有光引发剂的去离子水中，再与MgSO₄溶液充分混匀，形成凝胶前体溶液，凝胶前体溶液中可光交联海藻酸盐的浓度为2g/100mL，光引发剂的浓度为0.05g/100mL，MgSO₄的浓度为1~500 mM；将凝胶前体溶液滴入模具中，然后将模具置于紫外灯下，照射时间为5~60 min，得到双交联海藻酸盐水凝胶。

所述的光引发剂为I2959。

所述的紫外灯，其波长为365 nm，强度为8 mW/cm²。

所述的照射时间为10 min。

所述的可光交联海藻酸盐的制备方法，包括以下步骤：将4 g海藻酸盐溶解于400 mL氯化钠/ 2-（N-吗啡啉）乙磺酸溶液（氯化钠浓度为0.5 M、2-（N-吗啡啉）乙磺酸浓度为50 mM）中，磁力搅拌过夜，制成1 % (w/v)的海藻酸盐溶液；在室温下，用5 M 氢氧化钠溶液滴定海藻酸盐溶液至pH=6.5，然后加入N-羟基-硫代琥珀酰亚胺和1-乙烷基-(二甲基氨丙基)-含碳硝化甘油来活化海藻酸盐上的羧基，静置5 min后，加入15.8 g 2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐；其中，N-羟基-硫代琥珀酰亚胺: 1-乙烷基-(二甲基氨丙基)-含碳硝化甘油: 2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐的摩尔比为 1: 2: 1；室温下反应1 天后，将反应液倒入1600 mL丙酮中使产物甲基丙烯酰化海藻酸盐沉淀，再将其倒入布氏漏斗进行真空抽滤，然后将沉淀物溶解到400 mL去离子水中；待沉淀物完全溶解后，将溶解液分装到截留分子量为3500的透析袋中，置入盛有去离子水的透析缸内透析3 天，去离子水每隔12 h更换一次；透析完成后用孔径为0.22 μm的滤膜过滤，冷冻干燥，即得到可光交联海藻酸盐。

一种根据上述制备方法得到的光照-镁离子双交联海藻酸盐水凝胶。

本发明通过将两种常用的交联方式光交联和离子交联结合起来，制备出一种含镁离子的海藻酸盐水凝胶：以光交联为主，保证水凝胶支架的稳定性；以镁离子慢速交联为辅，保证支架的可控性；同时，离子交换释放的镁离子能够赋予支架一定的生物活性。

本发明提供的光照-镁离子双交联海藻酸盐水凝胶的制备方法具有以下有益效果：

（1）将离子交联和光交联两种海藻酸盐交联方法巧妙结合，阐述了一种新型的、简单易行的双交联方法，制得的水凝胶在理化性能和生物性能上都具备潜在的优势。

（2）引入镁离子后光交联海藻酸盐的溶胀降低，降解速率减慢；通过调整镁离子的引入量，双交联海藻酸盐水凝胶的溶胀降解可在一定范围内得以调整，便于适应实际应用时的需要。

（3）随着镁离子引入量的增加，两种交联网络使支架更致密，支架的力学强度得以明显提高，扩大了水凝胶的适应证，可能成为需要耐压的骨缺损部位的良好选择。

（4）随着镁离子引入量的增加，水凝胶表面接种细胞的粘附增强，支架的生物性能得到改善，有利于种子细胞的增殖、分化以及组织形成。

附图说明

图1为本发明双交联海藻酸盐水凝胶的制备过程示意图。

图2为本发明的双交联水凝胶与光交联水凝胶的扫描电镜图；其中，图2-a、图2-b、图2-c、图2-d分别代表Mg-0、Mg-1、Mg-10、Mg-100的扫描电镜图，标尺为100μm。

图3为本发明的双交联水凝胶与光交联水凝胶的X射线能谱分析图谱；其中，图3-a、图3-b、图3-c、图3-d分别代表Mg-0、Mg-1、Mg-10、Mg-100的X射线能谱分析图谱。

图4为本发明的双交联水凝胶与光交联水凝胶的溶胀降解变化趋势图；其中，图4-A为制备完成时水凝胶的尺寸变化图；图4-B为去离子水中溶胀24 h后水凝胶的尺寸变化图；图4-C为水凝胶在去离子水中浸泡3w的溶胀变化曲线图；图4-D为水凝胶在去离子水中浸泡3w的降解曲线图。

图5为本发明镁离子含量不同的双交联水凝胶与光交联水凝胶的弹性模量对比图。

图6为本发明镁离子含量不同的双交联水凝胶与光交联水凝胶接种MC3T3-E1细胞4h后的粘附率对比图。

图7为本发明的双交联水凝胶与光交联水凝胶接种MC3T3-E1细胞4天后的细胞形态图。

具体实施方式

下面结合优选实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明绝不限于下述实施例。

实施例中由光交联海藻酸盐、100 mmol/L 镁离子前体溶液制备的双交联水凝胶，此实例中简称Mg-100；以此类推，镁离子浓度为0 mmol/L 、1 mmol/L、10 mmol/L的凝胶前体溶液制备的双交联水凝胶分别简称为Mg-0、Mg-1、Mg-10。

实施例1 

（1）首先根据文献（Jeon, O., et al. Biomaterials, 2009. 30(14): p. 2724-34）中报道的方法制备可光交联海藻酸盐：将4 g海藻酸盐溶解于400 mL 氯化钠/ 2-（N-吗啡啉）乙磺酸溶液（氯化钠浓度为0.5 M、2-（N-吗啡啉）乙磺酸浓度为50 mM）中，磁力搅拌过夜，制成1 % (w/v)的海藻酸盐溶液；在室温下，用5 M 氢氧化钠溶液滴定海藻酸盐溶液至pH=6.5，然后加入N-羟基-硫代琥珀酰亚胺和1-乙烷基-(二甲基氨丙基)-含碳硝化甘油来活化海藻酸盐上的羧基，静置5 min后，加入15.8 g : 2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐；其中，N-羟基-硫代琥珀酰亚胺: 1-乙烷基-(二甲基氨丙基)-含碳硝化甘油: 2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐加入的摩尔比为 1: 2: 1；室温下反应1 d后，将反应液倒入1600 mL丙酮中使产物甲基丙烯酰化海藻酸盐沉淀，再将其倒入布氏漏斗进行真空抽滤，然后将甲基丙烯酰化海藻酸盐沉淀物溶解到400 mL去离子水中；待甲基丙烯酰化海藻酸盐完全溶解后，将溶解液分装到截留分子量为3500的透析袋中，置入盛有去离子水的透析缸内透析3 天，去离子水每12 h更换一次；透析完成后用孔径为0.22 μm的滤膜过滤，冷冻干燥后，即得到可光交联海藻酸盐。经¹H核磁共振检测，海藻酸盐上甲基丙烯酸酯基团的接枝率约为22%。

（2）配制Mg-100的凝胶前体溶液: 将可光交联海藻酸盐按2.5%（w/v）的比例溶解于含0.0625%（w/v）光引发剂I2959的去离子水中；配制浓度为500 mmol/L的MgSO₄溶液，MgSO₄溶液按1：4的体积比与上述海藻酸盐溶液混合均匀，即得到凝胶前体溶液，各组分的浓度如下：可光交联海藻酸盐，2%（w/v）；I2959，0.05%（w/v）；MgSO₄，100 mmol/L。

（3）将凝胶前体溶液滴入模具中，静置30 min，然后置于波长为365 nm、强度为8 mW/cm²的紫外灯下照射10 min，即得到光照-镁离子双交联海藻酸盐水凝胶（Mg-100）。其操作示意图如图1所示。

MA上接枝的碳碳双键在紫外线和光引发剂的共同作用下断裂，发生共价交联。此外，若经步骤（3）的离子交联尚未达到饱和状态，离子交联可同步进行，更多镁离子可在此阶段结合到海藻酸盐上。

实施例2

（1）配制Mg-1的凝胶前体溶液: 将可光交联海藻酸盐按2.5%（w/v）的比例溶解于含0.0625%（w/v）光引发剂I2959的去离子水中；配制浓度为5 mmol/L的MgSO₄溶液，MgSO₄溶液按1：4的体积比与上述海藻酸盐溶液混合均匀，即得到凝胶前体溶液，各组分的终浓度如下：可光交联海藻酸盐，2%（w/v）；I2959，0.05%（w/v）；MgSO₄，1 mmol/L。

（2）将凝胶前体溶液滴入模具中，静置30 min，然后置于波长为365 nm、强度为8 mW/cm²的紫外灯下照射10 min，即得到光照-镁离子双交联海藻酸盐水凝胶（Mg-1）。

实施例3

（1）配制Mg-10的凝胶前体溶液: 将可光交联海藻酸盐按2.5%（w/v）的比例溶解于含0.0625%（w/v）光引发剂I2959的去离子水中；配制浓度为50 mmol/L的MgSO₄溶液，MgSO₄溶液按1：4的体积比与上述海藻酸盐溶液混合均匀，即得到凝胶前体溶液，各组分的终浓度如下：可光交联海藻酸盐，2%（w/v）；I2959，0.05%（w/v）；MgSO₄，10 mmol/L。

（2）将凝胶前体溶液滴入模具中，静置30 min，然后置于波长为365 nm、强度为8 mW/cm²的紫外灯下照射10 min，即得到光照-镁离子双交联海藻酸盐水凝胶（Mg-10）。

性能测试

结合图2～图7的结果，双交联海藻酸盐水凝胶Mg-1和Mg-10的溶胀、降解、压缩、粘附性能皆介于光交联海藻酸盐水凝胶Mg-0及实施例1中的Mg-100之间，其递变趋势与镁离子的引入量相关。

1.表面结构及组成的检测

将制备完成的水凝胶置于37℃大量去离子水中溶胀24 h，使其达到溶胀平衡。经冷冻干燥、喷金后于扫描电镜下观察其表面结构，同时进行X射线能谱分析观察其组成的变化。扫描电镜结果如图2所示，光交联海藻酸盐水凝胶（Mg-0）及光照-镁离子双交联海藻酸盐水凝胶（Mg-1、Mg-10、Mg-100）均显示出良好的三维多孔结构；镁离子的引入使凝胶中的交联网络更致密，孔径减小。X射线能谱分析图谱如图3所示，Mg-10、Mg-100可检测到一定量的镁离子（分别为2.76 wt%、3.53wt%）；此外，钠离子的含量（3.66 wt%、0.59wt%）对比Mg-0（7.47wt%）大幅度下降，提示海藻酸钠中的钠离子与镁离子发生了置换反应。

2.溶胀及降解性能测试

将水凝胶制备成直径6 mm、高度2 mm的圆柱状水凝胶，冷冻干燥后称重为W_i。将水凝胶置于4 mL去离子水于37℃温箱中溶胀3周，每3天更换一次浸泡液。在设定的时间点将水凝胶取出后用滤纸吸干表面，称重为Ws，按下式计算溶胀率：Q=Ws/Wi。随后冷冻干燥至恒重，称重为Wd，其降解率按公式(W_i-W_d) /W_i ×100%来计算。由图4-A、图4-B、图4-C可见Mg-0、Mg-1在浸泡24 h后溶胀明显，在3 w的观察期内溶胀率不断变化，总体呈先上升后下降的趋势；Mg-10、Mg-100溶胀不明显，Mg-100在3 w的溶胀期始终保持较稳定的状态。图4-D为降解结果：截止至3 w时，Mg-10、Mg-100仅有少量降解，而光交联海藻酸盐及Mg-1则大部分发生降解。

3.压缩性能测试

将水凝胶制备成直径6 mm、高度6 mm的圆柱状水凝胶，用万能拉力测试仪在室温下以1 mm/min的变形速率检测其压缩性能。图5为压缩测试的结果，镁离子的引入明显提高了水凝胶的力学性能。其中，Mg-100的弹性模量达7.55±0.69 kPa，对比Mg-0提高了90%。 

4.粘附性能测试

将水凝胶制备成1 mm厚的凝胶块，溶胀24 h后切割成1 cm×1 cm大小的小片，将前成骨MC3T3-E1按10000个/cm²的密度接种到凝胶表面。粘附4 h后用PBS洗去未粘附的细胞，加入到培养基中培养4 h，然后用胰酶消化凝胶表面的细胞，细胞计数板下计数。早期粘附率计算公式如下：早期粘附率=粘附细胞量/接种细胞量×100%。培养4 d时取出水凝胶，用二乙酸荧光素处理后，置荧光显微镜下观察细胞的粘附伸展状况。图6显示：Mg-0与Mg-1之间细胞粘附率无明显差异；Mg-10、Mg-100较Mg-0粘附性能有显著改善，细胞早期粘附率增加。图7显示Mg-100在4 d时大部分细胞均伸展良好。 

Claims (6)

1.一种海藻酸盐水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

将可光交联海藻酸盐溶解到含有光引发剂的去离子水中，再与MgSO₄溶液充分混匀，形成凝胶前体溶液，凝胶前体溶液中可光交联海藻酸盐的浓度为2g/100mL，光引发剂的浓度为0.05g/100mL，MgSO₄的浓度为1~500 mM；将凝胶前体溶液滴入模具中，然后将模具置于紫外灯下，照射时间为5~60 min，得到海藻酸盐水凝胶。

2.根据权利要求1所述的海藻酸盐水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的光引发剂为I2959。

3.根据权利要求1所述的海藻酸盐水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的紫外灯，其波长为365 nm，强度为8 mW/cm²。

4.根据权利要求1所述的海藻酸盐水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的照射时间为10 min。

5.根据权利要求1所述的海藻酸盐水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的可光交联海藻酸盐的制备方法，包括以下步骤：将4 g海藻酸盐溶解于400 mL氯化钠/ 2-（N-吗啡啉）乙磺酸溶液（氯化钠浓度为0.5 M、2-（N-吗啡啉）乙磺酸浓度为50 mM）中，磁力搅拌过夜，制成1 % (w/v)的海藻酸盐溶液；在室温下，用5 M 氢氧化钠溶液滴定海藻酸盐溶液至pH=6.5，然后加入N-羟基-硫代琥珀酰亚胺和1-乙烷基-(二甲基氨丙基)-含碳硝化甘油来活化海藻酸盐上的羧基，静置5 min后，加入15.8 g 2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐；其中，N-羟基-硫代琥珀酰亚胺: 1-乙烷基-(二甲基氨丙基)-含碳硝化甘油: 2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐的摩尔比为 1: 2: 1；室温下反应1 天后，将反应液倒入1600 mL丙酮中使产物甲基丙烯酰化海藻酸盐沉淀，再将其倒入布氏漏斗进行真空抽滤，然后将沉淀物溶解到400 mL去离子水中；待沉淀物完全溶解后，将溶解液分装到截留分子量为3500的透析袋中，置入盛有去离子水的透析缸内透析3 天，去离子水每隔12 h更换一次；透析完成后用孔径为0.22 μm的滤膜过滤，冷冻干燥，即得到可光交联海藻酸盐。

6.一种根据权利要求1~5所述制备方法得到的海藻酸盐水凝胶。