KR20230089050A - 피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물은, 쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하거나 또는 쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀과 쑥 캘러스 배양액 유래 배양세포 추출물 혼합한 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 피부 미백능을 높여줌과 동시에 피부주름개선효능도 갖는 화장료 조성물 및 이의 제조방법이 제공된다.

Description

피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법{A Cosmetic for whitening or wrinkle improvement of skin and manufacturing method thereof}
본 발명은 피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀과 쑥 캘러스 배양액 유래 배양세포 추출물을 유효성분으로 포함하여 피부 미백능을 높여줌과 동시에 피부주름개선효능도 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.
주름이 형성되는 원인은 자연적 노화에 의한 주름의 생성과 자외선 노출(광노화)에 의한 주름의 생성으로 크게 나눌 수 있는데, 두 가지 원인에 의한 주름 형성 메커니즘은 아직까지 정확하게 밝혀져 있지 않은 상태이다.
자연적 노화와 광노화에 의한 피부변화와 관련되어 발견되는 공통적인 현상은 진피 내의 주 구성단백질인 콜라겐 및 엘라스틴의 감소 및 변형이 있으며, 이는 주름의 생성 및 피부의 탄력저하에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다.
또한, 사람의 피부색은 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)에 의해 결정되며, 이 멜라노사이트에서 타이로시나제 등의 여러 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 흑색색소는 유전적 요인 호르몬 분비 및 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선 조사 등과 같은 환경적 요인에 영향을 받는다.
멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하는 중요한 기능을 가지고 있지만, 멜라닌이 과잉 생산됨으로써 기미 또는 주근깨 등을 형성할 뿐 아니라 피부 노화를 촉진하며 피부암 유발에도 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
멜라닌의 주요한 기능은 이러한 유해라디칼을 제거하여 이에 의한 손상으로부터 피부를 보호하는 것이다. 따라서 멜라닌의 양이 많다는 것은 물리적 또는 화학적 독성 물질로부터 피부를 보호할 수 있는 효과적인 대응 체계를 가지고 있다는 것을 의미한다.
이렇듯, 기미 주근깨 또는 색소 침착 등과 같은 피부 색소 이상 침착 증상과 자외선 노출 등에 의해 발생된 과도한 멜라닌 색소 침착을 치료 또는 경감시켜 주기 위해서, 이전부터 아스코르빈산, 코지산, 알부틴, 하이드로퀴논, 글루타치온 또는 이들의 유도체 타이로시나제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합 사용하여 왔는데, 이들은 불충분한 미백효과, 피부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합시 제형 및 안정성 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.
따라서, 인체에 무해하면서 피부미백효과 및 피부주름개선효과가 극대화된 새로운 화장료 조성물 개발이 더욱 필요한 실정이다.
1. 대한민국 등록특허공보 제10-2257524호 '피부 진정 및 재생효과를 지니는 병풀 유래 엑소좀 함유 피부 개선용 화장료 조성물' 2. 대한민국 등록특허공보 제10-2329247호 '분산성 및 안정성이 우수한 쇠비름 유래 엑소좀의 정제방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물'
본 발명의 목적은 피부 미백능을 높여줌과 동시에 피부주름개선효능도 갖는 화장료 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물은, 쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하거나 또는 쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀과 쑥 캘러스 배양액 유래 배양세포 추출물 혼합한 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것이 특징이며, 상기 쑥은 개똥쑥, 강화약쑥, 인진쑥 중 어느 하나 이상인 것이 특징이다.
또한, 상기 쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀과 쑥 캘러스 배양액 유래 배양세포 추출물은 10 : 0.5~1 중량비로 혼합구성되는 것이 특징이며, 보다 바람직하게는 상기 조성물에 참마 추출물을 더 포함하는 것이 특징이다.
또 다른 본 발명인 피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물의 제조방법, 쑥잎을 20~25℃, 암조건하에 고체배지에 배양하여 캘러스 세포주를 제조하는 제1단계, 상기 캘러스 세포주를 액상배지에 접종한 후 20~25℃, 암조건하에 배양하여 캘러스 배양액을 제조하는 제2단계, 상기 제2단계의 캘러스 배양액을 원심분리하여 얻은 상등액을 필터를 통해 여과시켜 걸러져 나온 엑소좀을 획득하는 제3단계, 상기 제2단계의 캘러스 배양액을 원심분리한 후 얻은 하층물은 에탄올로 추출한 후 농축하여 배양세포 추출물을 제조하는 제4단계 및, 상기 제3단계의 엑소좀과 상기 제4단계의 배양세포 추출물을 혼합한 혼합물을 포함하는 피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물을 제조하는 제5단계를 포함하는 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 피부 미백능을 높여줌과 동시에 피부주름개선효능도 갖는 화장료 조성물 및 이의 제조방법이 제공된다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 화장료 조성물의 제조공정도를 나타낸 도면이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예 및 실험예를 상세하게 설명하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.
본 발명의 피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물은, 쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀과 쑥 캘러스 배양액 유래 배양세포 추출물을 유효성분으로 포함하는 것이 특징이다.
설명하면, 통상 세포배양액으로부터 수득한 엑소좀은 세포의 필수 구성성분 및 세포와 세포 조직과 세포에 신호를 전달하여 생화학적 반응을 유도하는 주요물질들로서 주름 개선 및 미백효과등을 목적으로 화장품 뿐만 아니라 피부재생등을 목적으로 하는 치료등 여러 용도로 사용되고 있다.
그러나, 종래 이들 엑소좀들은 일부 식물 배양액만 상업적으로 사용되고 있으며, 다양한 식물을 적용한 소재에 대한 개발이 미진한 상태이다.
또한, 식물을 재배해서 원료로 사용할 경우 유래가 불분명한 원료의 유입과 표준화 되지 않은 성분함량으로 인하여 효능의 재현성이 확보되지 않는 문제도 있으며, 다량 및 큰 부피의 원재료를 원료화 하는 과정에서 다량의 유기용매 사용으로 오히려 피부에 자극을 줄 수 있는 문제점이 있다.
이에, 본 발명에서는 상기와 같은 문제점은 해결하면서 주름개선능 및 미백효능이 높은 식물배양액 유래 엑소좀을, 초원심분리를 이용한 순수정제 기술을 도입하는 것이 가장 적합함을 확인하였으며, 이를 통해 도출해 낸 쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀과 쑥 캘러스 배양액 유래 배양세포 추출물을 유효성분으로 한 화장품 조성물을 제시한다.
또한, 상기 쑥은 그 종류별로 혼합적용하는 것을 특징으로, 그 종류로는 개똥쑥, 강화약쑥, 인진쑥 중 어느 하나 이상을 사용하는 것이 적합하다.
여기서 상기 개똥쑥(Artemisia annua)은 국화과 쑥속에 속하는 한해살이풀로써, 개똥쑥을 손으로 뜯어서 비벼 보면 '개똥 비슷한 냄새가 난다'고 하여 '개똥쑥'이라고 부르게 되었고 북한에서는 잎이 자잘하게 갈라진다고 하여 '잔잎쑥' 이라고 부르며, 그 효능으로는 항암작용, 항산화 작용, 항균 작용, 피부 진균 억제 작용 등 다양한 것이 알려져 있다.
상기 강화약쑥(Artemisia princeps)은 강화 지역에서만 자생하는 특산물로 사자발쑥과 싸주아리쑥이 이에 속한다. 강화약쑥은 주로 약용으로 사용되며 일반 쑥에 비해 약효가 탁월한 것으로 알려져 있다. 강화약쑥에는 유파틸린, 자세오시딘, 아피게닌, 유파폴린, 아밀라아제, 콜린, 아르데모즈, 유칼립톨, 정유 성분, 비타민류, 단백질, 칼슘, 마그네슘, 철분, 칼륨 및 인 등이 함유되어 있으며, 그 효능으로는 소염, 진통, 강심, 진해 작용 등이 알려져 있다.
상기 인진쑥(Artemisia capillaris)은 우리나라에서 자생하는 식물로 국화과(compositae)의 다년생 초본 식물이며, 더위지기, 애탕쑥이라고도 불린다. 인진쑥은 주로 어린순이 사용되며, 항염, 항균, 항여드름, 항산화, 이뇨제, 황달 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
이와 같이 상기와 같은 효능을 갖는 여러 쑥들은 각기 다른 기능성 성분들을 포함함에 따라, 본 발명의 최대효능을 나타내는 최적조건으로 혼합비율이 중요하게 작용하게 된다. 이에, 보다 바람직하게는 상기 개똥쑥, 강화약쑥, 인진쑥은 1 : 2~10 : 0.5~1 중량비로 혼합구성되는 것이 가장 좋다. 즉, 상기 중량비를 벗어날 경우 본 발명이 목적하는 피부 미백능 및 피부주름개선효능이 다소 낮게 나타나기 때문이다.
또한, 본 발명에는 상기 쑥들 이외에 참마추출물을 더 포함하는 것을 특징으로, 여기서 참마는 마과(Dioscoreaceae)에 속한 참마(Dioscorea japonica)의 근경을 의미하는 것으로, 갑산성종, 심장염 및 해독·건위·화상·동상·요통·유종 등의 약재와 강장제 및 지사제로도 쓰인다. 이러한 참마의 주성분인 뮤신과 성분이 보습효과를 강화시켜 상기 쑥 엑소좀 효능에 시너지 효과를 나타내도록 한다. 이에, 본 발명에서는 상기와 같은 효능을 나타내는 참마를 화장료 소재로 사용하기 위해, 80~100%(v/v) 에탄올 용매로 추출하여 얻은 참마 추출물을 적용하는 것이 좋다.
이하, 상기 피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물의 제조방법에 관하여 도 1의 내용을 토대로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
<본 발명의 피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물의 제조공정>
1. 제1단계; 캘러스 세포주 제조(S10)
본 단계에서는 쑥잎을 20~25℃, 암조건하에 고체배지에 배양하여 캘러스 세포주를 제조하는 것이 특징이다.
설명하면, 본 발명에서는 흔히 사용되는 쑥을 소재로 적용하긴 하였으나, 쑥은 알러지 개선효능 및 항여드름 효능에 대해서는 알려져 있으나, 미백 및 주름개선에 대해서는 전무한 것이 사실이다.
이에, 본 발명의 발명자들은 여러 연구를 한 결과, 쑥으로 부터 캘러스 세포주를 획득하고 이를 초원심분리를 이용한 순수정제 기술을 도입하여 얻은 엑소좀과 배양세포 추출물을 유효성분으로 적용할 경우 피부 미백 및 피부 주름개선 효과를 얻을 수 있음을 확인한 것이다.
이에, 본 단계에서는 먼저 쑥으로부터 캘러스 세포주를 획득하기 위해 무균상태의 쑥잎을 고체배지에 넣고 배양하되, 20~25℃, 암조건하에 배양하며, 2주마다 계대하여 생장기 활성을 유지시켜 캘러스 세포주를 제조하는 것이 특징이다.
이때, 상기 20℃미만에서 배양할 경우 세포주 생성이 더디며 25℃를 초과할 경우에는 세포주 생성이 잘 이루어지지 않게 되며, 반드시 암조건하에 배양이 이루어저야 캘러스 세포주를 획득할 수 있게 된다.
2. 제2단계; 캘러스 배양액 제조(S20)
본 단계에서는 상기 캘러스 세포주를 액상배지에 접종한 후 20~25℃, 암조건하에 배양하여 캘러스 배양액을 제조하는 것이 특징이다.
설명하면, 상기 캘러스는 배양액 형태로 제조하기 위해 상기 캘러스 세포주를 액상배지에 접종하여 배양하는 것으로써, 이때 상기 세포주와 상기 액상배지는 1 : 10~15 중량비로 이루어지는 것이 좋으며, 배양이 제대로 이루어지기 위해서는 반드시 20~25℃, 암조건하에 배양하는 것이 좋다.
아울러, 상기 배양액은 2주에 1회 계대를 통하여 확보하여 세포증식을 유지하는 것이 좋다.
3. 제3단계; 엑소좀 제조(S30)
본 단계에서는 상기 제2단계의 캘러스 배양액을 원심분리하여 얻은 상등액을 필터를 통해 여과시켜 걸러져 나온 엑소좀을 획득하는 것이 특징이다.
설명하면, 상기 컬러스 배양액으로 부터 엑소좀을 획득하기 위해 초원심분리방법을 도입하여 정제하는 것으로, 보다 바람직하게는 2000~3000g에서 30~40분동안 초원심분리하여 엑소좀을 획득한다.
이때, 상기 원심분리 조건에서 2000g 미만 또는 30분 미만으로 처리할 경우 정제가 제대로 이루어지지 않아 엑소좀과 세포의 완전분리가 어렵게 되며 3000g 미만 또는 40분을 초과할 경우 오히려 엑소좀의 형태를 일부 파괴시킬 우려가 있게 된다.
4. 제4단계; 배양세포 추출물 제조(S40)
본 단계에서는 상기 제2단계의 캘러스 배양액을 원심분리한 후 얻은 하층물은 에탄올로 추출한 후 농축하여 배양세포 추출물을 제조하는 것이 특징이다.
설명하면, 에탄올은 순수 배양세포를 추출해내는데 적용하는 용매로써, 사용되는 에탄올로는 80~90%(v/v)를 적용하는 것이 추출양이 많고 피부자극도가 가장 적게 된다.
이때, 상기 하층물과 에탄올은 1:10~15 중량비로 혼합하여 적용하며, 80~90℃에서 1~2시간동안 추출하는 것이 가장 바람직하다.
다시말해, 상기 하층물과 에탄올의 중량비가 1: 10 중량비 미만으로 구성될 경우 에탄올의 함량이 너무 적어 배양세포 추출양이 적게 되며 1:15 중량비를 초과하여 구성될 경우에는 에탄올의 함량이 너무 많아 오히려 피부자극도를 발생할 우려가 있게 된다.
5. 제5단계; 피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물 제조(S50)
본 단계에서는 상기 제3단계의 엑소좀과 상기 제4단계의 배양세포 추출물로 구성된 혼합물을 포함하는 피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물을 제조하는 것이 특징이다.
이때, 상기 엑소좀과 상기 배양세포 추출물은 10 : 0.5~1 중량비로 혼합하여 혼합물로 구성되는 것을 특징이며, 이렇게 구성된 혼합물은 5~100 중량%로 포함되며 나머지 정제수로 이루어져 본 발명의 피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물을 제조하기도 하는데 이때 상기 DNA 단편 복합체의 함량이 5 중량% 미만으로 함유될 경우에는 본 발명이 목적하는 피부미백효과 또는 피부 주름개선효과는 다소 미흡하게 나타나 적합하지 않게 된다.
또한, 상기 엑소좀 10 중량을 기준으로 상기 배양세포 추출물 0.5 중량비 미만으로 혼합될 경우 상기 배양세포 추출물의 함량이 적어 보다 개선된 미백효과 또는 주름개선효과를 얻기 어려우며 상기 엑소좀 10 중량을 기준으로 상기 배양세포 추출물 1 중량비를 초과하여 혼합될 경우 너무 묽어 제형화 하기 어렵게 된다.
또한, 본 단계에서는 상기 혼합물 외에도 추가적으로 참마추출물을 더 포함하는 것을 특징으로, 이때 상기 참마 추출물의 함량은 상기 배양세포 추출물의 함량과 동량으로 적용하는 것이 좋다.
여기서 참마 추출물은 뮤신이 다량 함유되어 있는 추출물이며, 함께 사용할 경우 보다 극대화된 효과를 나타낼 수 있게 된다.
이러한 상기 최종 본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분들 이외에 통상의 화장료에 배합되는 성분, 예를 들면 유지류, 탄화수소, 납류, 지방산, 합성 에스테르류 등, 알코올류, 분체, 계면활성제, 증점제, 고분자화합물, 겔화제, 자외선 흡수제, 자외선 산란제, 산화 방지제, 색소, 안료, 방부제, 향료, 약제 또는 물 등을 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위에서 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
유지류로서는 호호바유, 피마자유, 올리브유, 대두유, 야자유, 팜유, 카카오유, 밍크유, 터틀유(turtle oil) 등을 들 수 있다.
탄화수소류로서는 유동 파라핀, 바셀린, 마이크로 크리스탈린 왁스, 스쿠알렌 등을 들 수 있다.
납류로서는 밀랍, 라놀린, 카르나우바 왁스, 칸데릴라 왁스(candelilla wax) 등을 들 수 있다.
지방산으로서는 미리스틴산, 팔미틴산, 스테아린산, 올레인산, 이소스테아린산, 라우린산 등을 들 수 있다.
합성 에스테르류로서는 미리스틴산이소프로필, 팔미틴산이소프로필, 올레인산부틸, 미리스틴산미리스틸, 미리스 틴산옥틸도데실, 모노스테아린산프로필렌글리콜, 락트산미리스틸, 사과산이소스테아릴, 모노스테아린산글리세린, 염화디스테아릴디메틸암모늄 등을 들 수 있다.
유지류, 탄화수소, 납류, 지방산, 합성 에스테르류는 통상 합쳐서 화장료 조성물 당 0~30w/w%의 비율로 배합될 수있다.
알코올류로서는 에탄올, 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 라우릴알코올, 세탄올, 스테아릴알코올, 올레일알코올 등을 들 수 있다. 알코올류는 통상 화장료조성물 당 0~25 w/w%의 비율로 배합될 수 있다.
계면활성제로서는 폴리글리세린지방산에스테르류, 소르비탄지방산에스테르류, 폴리옥시에틸렌지방산에스테르류, 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르류, 폴리옥시에틸렌알킬에테르류, 야자유지방산모노에탄올아미드, 폴리옥 시에틸렌 경화 피마자유, 라우릴황산나트륨, 피로글루타민산이소스테아린산폴리옥시에틸렌글리세릴, 알킬벤젠술 폰산나트륨, 폴리옥시에틸렌스테아릴에테르, 디알킬술포숙신산, 브롬화세틸피리디늄, 염화-n-옥타데실트리메틸 암모늄, 모노알킬인산, N-아실술타민산, N-아실글루타민, 자당 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노스 테아레이트, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르황산나트륨, 폴리옥시에틸렌 환원 라놀린, 슈거에스테르 등을 들 수 있다. 계면활성제는 통상 화장료 조성물 당 0~10 w/w%의 비율로 배합될 수 있다.
증점제로서는 카르복시비닐 폴리머, 메틸폴리실록산, 덱스트란, 카르복시메틸셀룰로오스, 카라긴난, 히드록시프 로필메틸셀룰로오스 등을 들 수 있다. 증점제는 통상 화장료 조성물 당 0~5 w/w%의 비율로 배합될 수 있다.
추가 보습제로서는 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 피로글루타민산, 아세틸글루타민산, 프로시아니딘등을 들 수 있다. 보습제는 통상 화장료 조성물 당 0~25 w/w%의 비율로 배합될 수 있다.
방부제로서는 안식향산, 살리실산, 디히드로아세트산 혹은 그들의 염류, 파라옥시안식향산에스테르류의 페놀류, 트리클로산 할로카본, 1,2-헥산다이올, 에틸헥실글리세린, 카프릴릴글라이콜, 하이드록시아세토페논 등을 1종 이상 혼용하여 사용한다. 방부제는 통상 화장료 조성물 당 0~2.0 w/w%의 비율로 배합될 수 있다.
향료는 통상 화장료에 사용하는 것이면 어떤 향료를 사용해도 된다.
안료로서는 산화철, 이산화티탄, 산화아연, 카올린, 탤크 등을 들 수 있다. 안료는 통상 화장료 조성물 당 0~5 w/w% 의 비율로 배합될 수 있다.
약제로서는 소맥 배아유, 비타민 A, 비타민 B2, 비타민 E, 아스코르빈산-2-인산마그네슘 혹은 나트륨, D-판토테닐알코올, 글리시리진산(glycyrrhizinate)디칼륨, 글루타티온(glutathione), UV 흡수제, 킬레이트제, 식물 추출물, 미생물 대사물/추출물 등을 들 수 있다. 약제는 통상 화장료 조성물 당 0~5 w/w%의 비율로 배합될 수 있다.
물로서는 수돗물, 미네랄 워터, 소금물(salt water), 해수, 해양 심층수, 초순수, 극지(極地) 얼음 유래 물, 미네랄 함유수(mineral-containing water), 정제수 등을 들 수 있다. 물은 임의의 비율로 배합된다.
이렇게 구성된 상기 화장료 조성물은 여러 가지 제형으로 이루어져 실 사용될 수 있는데 이때, 구체적인 예로는 스킨, 로션, 크림, 에센스, 세럼, 썬크림, 메이크업 프라이머, 메이크업 베이스, 파운데이션, 컨실러, 비비크림, 또는 씨씨(Color Correction) 크림, 팩트, 미스트 및 메이크업 픽서 제형 중 어느 하나일 수 있다.
이하에서는 실시예 및 실험예를 들어 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명할 것이나, 이들 실시예 및 실험예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
<실시예 1> 화장료 조성물1 제조
무균상태의 개똥쑥 잎 전편을 확보하고 이를 고체배지(MS salt+2mg/L BA+ 0.1mg/L NAA+agar 16g)에 넣고 25℃, 암조건하에서 배양하였으며 2주마다 계대하여 생장기 활성을 유지시키면서 캘러스 세포주를 확보하였다.
이렇게 확보된 캘러스 세포주를 현탁배양을 통하여 배양액 형태로 제조하였다.
이러한 상기 배양액을 액체배지(MS salt+2mg/L BA+ 0.1mg/L NAA+증류수 1L)에 1:10 비율로 혼합한 후, 이를 25℃, 암실에서 배양하였으며, 이때 2주에 1회 계대를 통하여 확보하고 세포의 증식을 유지하면서 캘러스 배양액을 제조하였다.
그 다음 상기 캘러스 배양액을 3000g, 30분동안 원심분리하여 얻은 상등액은 0.1㎛ pore size 필터를 통과시켜 걸러져 나온 여과물 즉, 개똥쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀을 획득한 후, 엑소좀 1ml에 DMSO 용액 100㎕를 넣고 혼합하여 화장료 조성물1을 제조하였다. 상기 3000g 30분 원심후 배양액 부유물의 정도에 따라 추가로 5000g에서 30분 원심분리를 할 수 있으며, 추가로 진행한 원심분리는 0.1㎛ pore size 필터여과 과정을 순조롭게 하며, 효능시험 결과에는 큰 차이가 나지 않았다.
< 실시예 2> 화장료 조성물2 제조
상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조하되, 상기 개똥쑥 대신 강화약쑥을 적용하여 강화약쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀 1ml에 DMSO 용액 100㎕를 넣고 혼합하여 화장료 조성물2를 제조하였다. 이때, 상기 강화약쑥은 배양배지로 Gamborg B5 vitamin salt + 0.1mg/L IAA + 0.1mg/L NAA + 1.5mg/L 2,4-D + 0.25mg/L Kinetin로 구성된 고체배지 또는 액체배지를 사용하였다.
<실시예 3> 화장료 조성물3 제조
상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조하되, 상기 개똥쑥 대신 인진쑥을 적용하여 인진쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀 1ml에 DMSO 용액 100㎕를 넣고 혼합하여 화장료 조성물3을 제조하였다. 이때, 상기 인진쑥은 배양배지로 MS salt + 1mg/L 2,4-D로 구성된 고체배지 또는 액체배지를 사용하였다.
<실시예 4> 화장료 조성물4 제조
무균상태의 개똥쑥 잎 전편을 확보하고 이를 고체배지(MS salt+2mg/L BA+ 0.1mg/L NAA+agar 16g)에 넣고 25℃, 암조건하에서 배양하였으며 2주마다 계대하여 생장기 활성을 유지시키면서 캘러스 세포주를 확보하였다.
이렇게 확보된 캘러스 세포주를 현탁배양을 통하여 배양액 형태로 제조하였다.
이러한 상기 배양액을 액체배지(MS salt+2mg/L BA+ 0.1mg/L NAA+증류수 1L)에 1:10 비율로 혼합한 후, 이를 25℃, 암실에서 배양하였으며, 이때 2주에 1회 계대를 통하여 확보하고 세포의 증식을 유지하면서 캘러스 배양액을 제조하였다.
그 다음 상기 캘러스 배양액을 3000g, 30분동안 원심분리한 후, 가라앉은 하층물(세포조직)에 80%(v/v)에탄올에 1: 10 중량비로 넣고 혼합한 후, 초음파로 1시간 추출 후 85℃에서 1시간동안 추출한 다음, 이를 감암농축하여 개똥쑥 캘러스 배양액 유래 배양세포 추출물을 제조하였다, 제조된 추출물은 DMSO에 용해하여 50mg/mL 농도로 제조되었으며, 본 실험에서 용해용매는 DMSO를 사용하였으나, 적용되는 제형에 따라 에탄올, 정제수 등을 사용할 수 있다.
그 다음 상기 실시예1의 개똥쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀 1ml와 상기 개똥쑥 캘러스 배양액 유래 배양세포 추출물 50mg/mL 농도의 추출물 50㎕를 혼합한 후, 이를 포함하는 화장료 조성물4를 제조하였다.
<실시예 5> 화장료 조성물5 제조
상기 실시예 4와 같은 방법으로 제조하되, 상기 개똥쑥 대신 강화약쑥을 적용하여 화장료 조성물5를 제조하였다.
<실시예 6> 화장료 조성물6
상기 실시예 4와 같은 방법으로 제조하되, 상기 개똥쑥 대신 인진쑥을 적용하여 화장료 조성물6을 제조하였다.
<실시예 7> 화장료 조성물7
상기 실시예 1,2,3에서 제조된 개똥쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀, 강화약쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀 및 인진쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀을 1 : 10 : 1 중량비로 혼합한 후, 이를 적용하여 화장료 조성물7을 제조하였다.
<실시예 8> 화장료 조성물8
상기 실시예 1,2,3에서 제조된 개똥쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀, 강화약쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀 및 인진쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀을 1 : 10 : 1 중량비로 혼합하여 혼합물 1을 제조하고, 상기 실시예 4,5,6에서 제조된 개똥쑥 캘러스 배양액 유래 배양세포 추출물, 강화약쑥 캘러스 배양액 유래 배양세포 추출물 및 인진쑥 캘러스 배양액 유래 배양세포 추출물을 1 : 10 : 1 중량비로 혼합하여 혼합물 2를 제조한 후, 상기 혼합물 1 1ml와 상기 혼합물 2 50㎕를 혼합한 다음 이를 적용하여 화장료 조성물8을 제조하였다.
<실시예 9> 화장료 조성물9
참마를 80%(v/v)에탄올 용매에 1: 10 중량비로 넣고 1 시간동안 초음파 추출 후 85℃에서 1 시간동안 추출하여 참마추출물을 제조하였다. 제조된 상기 참마 출출물은 DMSO에 용해하여 50mg/mL 농도롤 제조되었으며, 본 실험에서 용해용매는 DMSO를 사용하였으나, 적용되는 제형에 따라 에탄올, 정제수 등을 사용할 수 있다.
상기 실시예 8의 화장료 조성물8에서 제조된 상기 혼합물 1 1ml와 상기 혼합물 2 50㎕및 상기 참마추출물 50㎕를 혼합한 다음 이를 적용하여 화장료 조성물 9를 제조하였다.
<비교예 1> 화장료 조성물 10제조
개똥쑥을 80%(v/v)에탄올 용매에 1: 10 중량비로 넣고 85℃에서 1 시간동안 추출하여 개똥쑥 추출물을 제조하였다.
강화약쑥을 80%(v/v)에탄올 용매에 1: 10 중량비로 넣고 85℃에서 1 시간동안 추출하여 강화약쑥 추출물을 제조하였다.
인진쑥을 80%(v/v)에탄올 용매에 1: 10 중량비로 넣고 85℃에서 1 시간동안 추출하여 인진쑥 추출물을 제조하였다.
상기 개똥쑥 추출물, 강화약쑥 추출물, 인진쑥 추출물을 1 : 10 : 1 중량비로 혼합한 후, 이를 적용하여 화장료 조성물 10을 제조하였다.
<비교예 2> 화장료 조성물 11제조
상기 실시예 9의 화장료 조성물9와 같이 제조하되, 상기 상기 혼합물 1 1ml와 상기 혼합물 2 200㎕및 상기 참마추출물 200㎕를 혼합한 다음 이를 적용하여 화장료 조성물 11을 제조하였다.
(제형 1, 2 제조) 본 발명의 피부미백용 또는 피부주름개선용 에센스 또는 크림 제조
상기 실시예 8,9의 조성물을 적용함과 동시에 하기 표 1의 조성비율대로 부가재료들을 혼합하여 에센스 제형 또는 크림제형의 화장품을 제조하였다. 원활한 혼합을 위해 교반기를 사용하며, 교반속도는 500~1,500 rpm, 20~45℃, 30~1시간정도로 적용하여 본 발명의 화장품들을 제조하였다.
성분원료 기능 함량(wt%)
제형1
(실시예8의 화장료 조성물8 포함)		 정제수 용제 91.90
실시예8의 화장료 조성물8 주성분 6.00
1,2-헥산다이 보존제 2.00
잔탄검 점증제 0.10
제형2
(실시예9의 화장료 조성물9 포함)		 정제수 용제 69.00
부틸렌글라이콜 보습제 5.00
글리세린 보습제 5.00
하이드로제네이티드레시틴 유화제 2.00
폴리솔베이트60 유화제 1.00
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 피부유연화제 10.00
실시예 9의 화장료 조성물 9 주성분 6.00
1,2-헥산다이올 보존제 2.00
<실험예 1> 미백효과 확인
1. 실험방법
미백효과를 확인하기 위해 Tyrosinase 저해활성을 확인한 것으로, 측정은 67 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8) 80 μl에 10 mM L-DOPA (Sigma, USA)를 녹인 기질액 40 μl 및 시료용액 40 μl의 혼합액에 200 U/ml mushroom tyrosinase 40 μl을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 492 nm에서 측정하였다. Tyrosinase 저해활성은 실시예들 및 비교예들로 제조된 시료용액의 흡광도 감소율로 나타내었다.
저해율(%)＝(1－ 시료첨가군의 흡광도 ) × 100
대조구로는 정제수 1ml에 DMS0 용액 100㎕ 넣고 혼합한 것을 사용하였다.
2. 실험결과
대조구 알부틴 실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 실시예5 실시예6 실시예7 실시예8 실시예9 비교예1 비교예2
Tyrosinase
저해율(%)		 0 76 48 40 42 80 74 83 55 88 89 40 89
상기 표 2에 나타나 있듯이, 본 발명의 실시예 1 내지 9의 경우에는 초원심 분리를 이용한 순수정제방법을 적용함에 따라 수득된 엑소좀과 배양세포 추출물에서 높은 미백효과를 나타낸 것으로 판단된다.
특히, 실시예 7,8에 나타나 있듯이 개똥쑥, 강화약쑥, 인진쑥을 혼합 사용할 경우 단독 사용하는 실시예 1 내지 6보다 더 상승된 미백효과를 갖는 화장료 조성물이 생성되었음을 확인하였다.
또한, 실시예 9에 나타나 있듯이 참마추출물에 포함되어 있는 뮤신이라는 성분이 미백효과를 극대화시켜주어 조성물을 안정화시켜줌에 따라, 미백효능이 최대 상승되어 나타난 것으로 판단된다.
이에 반면, 비교예1의 경우에는 단순 에탄올 추출물을 적용한 것으로써, 미백효과가 현저히 낮음을 확인하였으며, 비교예 2의 경우에는 배양세포 배양액과 참마추출물의 함량이 많음에도 불구하고 미백효과가 실시예 9와 비슷하게 나타나는 바, 추가 함량에 따른 보다 더 상승된 미백효과는 나타나지 않음을 확인하였다.
<실험예 2> 항주름효과 확인
1. 실험방법
Elastase는 단백질인 엘라스틴을 분해하는 효소이다. Elastase는 엘라스틴 뿐만아니라 콜라겐을 분해할 수 있는 가수 분해 효소이다.
피부의 진피조직 속에서는 콜라겐과 피부의 탄력성에 관련된 엘라스틴이 그물망 구조로 형성하고 있는데, 엘라스틴이 elastase에 의해 분해되어 피부의 그물망 구조 결합이 끊어짐으로, elastase가 주름생성의 주원인 효소로 알려져 있다.
이에, 항주름효과를 확인하기 위해 Elastase 저해활성을 확인한 것으로, Elastase 저해활성측정은 n-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide을 기질로 사용하여 37도에서 30분간 반응하였다. 반응 후 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 445 nm에서 측정하였다. 실시예들 및 비교예들로 제조된 시료용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 40 μ씩 96 well plate에 분주하여 준비하였다.
준비된 각각의 웰에 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 2.5U/mL porcine pancreas elastase용액을 40 μ씩 각각 첨가한 후, 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 n-succinyl-(L-Ala)3-p1 nitroanilide (0.5 mg/mL)을 첨가하여 기질로 사용하였고 반응시간은 30분으로서 그 생성물을 측정하였다.
Elastase 저해활성은 각 실시예들 및 비교예들 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율을 아래와 같은 식으로 계산하여 그 활성을 확인하였다.
효소활성 저해(%)=(1 - 시료첨가군 흡광도/무첨가군 흡광도)×100
대조구로는 정제수 1ml에 DMS0 용액 100㎕ 넣고 혼합한 것을 사용하였다.
2. 실험결과
대조구 레티놀 실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 실시예5 실시예6 실시예7 실시예8 실시예9 비교예1 비교예2
Elastase
저해율(%)		 0 32 28 22 24 32 33 40 30 50 55 15 55
상기 표 3에 나타나 있듯이, 본 발명의 실시예 1 내지 9의 경우에는 수득된 엑소좀과 배양세포 추출물에서 엘라스테이즈(Elastase)의 함량이 높게 나타남을 확인하였다.
특히, 실시예 7,8에 나타나 있듯이 개똥쑥, 강화약쑥, 인진쑥을 혼합 사용할 경우 단독 사용하는 실시예 1 내지 6보다 더 상승된 항주름효과를 갖는 화장료 조성물이 생성되었음을 확인하였다.
또한, 실시예 9에 나타나 있듯이 참마추출물에 포함되어 있는 뮤신이라는 성분이 항주름효과를 극대화시켜주어 조성물을 안정화시켜줌에 따라, 항주름효능이 최대 상승되어 나타난 것으로 판단된다.
이에 반면, 비교예1의 경우에는 단순 에탄올 추출물을 적용한 것으로써, 항주름효과가 현저히 낮음을 확인하였으며, 비교예 2의 경우에는 배양세포 배양액과 참마추출물의 함량이 많음에도 불구하고 항주름효과가 실시예 9와 비슷하게 나타나는 바, 추가 함량에 따른 보다 더 상승된 항주름효과는 나타나지 않음을 확인하였다.
<실험예 3> 사용감 확인
1. 실험방법
사용감을 평가하기 위해, 20~40세 성인 여성 30명으로 구성된 품평단을 대상으로 사용감에 대한 설문을 실시하였다. 제형 1,2 및 비교제형 1,2의 화장료 조성물을 스킨사용 후 순차적으로, 제형 1,2 또는 비교제형 1,2를 아침에 사용하도록 한 후 설문항목에 5점 척도(점수가 높을수록 우수함)로 답하게 하는 방식으로 평가하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 여기서 비교제형 1,2는 상기 제형 1,2의 성분들 중 실시예 8,9의 조성물 대신 각각 비교예 1,2의 조성물들을 적용한 것이다.
2. 실험결과
상기 실험결과, 하기 표 4와 같이 나타났다.
구분 발림성 지속성 피부 자극도
(수치가 높을수록 자극도가 높음)
제형1 4.0 4.5 1.5
제형2 4.5 4.7 2.0
비교제형1 2.5 1.5 4.7
비교제형2 0.5 2.0 2.0
상기 표 4에 나타나 있듯이, 비교제형1의 경우에는 발림성이 떨어지며 피부자극도가 매우높고 지속성이 떨어지며 전반적인 사용감이 낮게 나타났으며, 비교제형 2의 경우에는 너무 묽어 발림성이 매우 떨어져 전반적인 사용감이 낮게 나타남을 확인하였다.
이에 반면, 제형 1,2의 화장품은 발림성 및 지속성이 우수한 평가를 받았으며, 자극도 역시 적음을 알 수 있는 바, 본 발명의 유효성분들이 화장료 소재로써 적합함을 알 수 있었다.
이와 같이 본 발명에 의해, 쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀과 쑥 캘러스 배양액 유래 배양세포 추출물을 단독 또는 혼합 사용하여 피부 미백능을 높여줌과 동시에 피부주름개선효능도 갖으면서 사용감이 우수한 화장품을 제공할 수 있음을 알 수 있다.
상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 실험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

  1. 쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는,
    피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물.
  2. 쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀과 쑥 캘러스 배양액 유래 배양세포 추출물을 유효성분으로 포함하는,
    피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 쑥은 개똥쑥, 강화약쑥, 인진쑥 중 어느 하나 이상인 것이 특징인,
    피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 쑥 캘러스 배양액 유래 엑소좀과 쑥 캘러스 배양액 유래 배양세포 추출물은 10 : 0.5~1 중량비로 혼합구성되는 것이 특징인,
    피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물에 참마 추출물을 더 포함하는 것이 특징인,
    피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물.
  6. 쑥잎을 20~25℃, 암조건하에 고체배지에 배양하여 캘러스 세포주를 제조하는 제1단계;
    상기 캘러스 세포주를 액상배지에 접종한 후 20~25℃, 암조건하에 배양하여 캘러스 배양액을 제조하는 제2단계;
    상기 제2단계의 캘러스 배양액을 원심분리하여 얻은 상등액을 필터를 통해 여과시켜 걸러져 나온 엑소좀을 획득하는 제3단계;
    상기 제2단계의 캘러스 배양액을 원심분리한 후 얻은 하층물은 에탄올로 추출한 후 농축하여 배양세포 추출물을 제조하는 제4단계 및,
    상기 제3단계의 엑소좀과 상기 제4단계의 배양세포 추출물을 혼합한 혼합물을 포함하는 피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물을 제조하는 제5단계;를 포함하는,
    피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 제5단계의 조성물 제조시, 참마추출물을 더 포함하여 제조하는 것이 특징인,
    피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물의 제조방법.
  8. 제6항 또는 제7항의 제조방법에 의해 제조되어 피부 미백능 및 피부 주름개선능을 갖는 것이 특징인,
    피부미백용 또는 피부주름개선용 화장료 조성물.
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