KR20230086480A - 신규한 아디포넥틴 아날로그 및 결합체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 활성이 증대된, 신규한 아디포넥틴 아날로그에 관한 것이다.

Description

신규한 아디포넥틴 아날로그 및 결합체 {Novel adiponectin analog and conjugate comprising the same}

본 발명은 신규한 아디포넥틴 아날로그, 이의 결합체, 및 용도에 관한 것이다.

지방조직은 에너지원을 지방으로 축적하는 저장 장소인 동시에 여러 종류의 생물학적 활성을 띠는 다양한 물질을 분비해 전신 대사 조절에 관여하는 내분비기관이다. 이러한 물질들을 아디포카인이라고 하는데, 아디포넥틴, 렙틴, 인터류킨-6, 종양괴사 인자 알파(tumor necrosis factor alpha, TNFα) 등이 여기에 속한다. 이러한 아디포카인은 지질 및 당 대사, 인슐린 감수성 등을 조절하기 때문에 비만과 관련된 대사질환 발병과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

이 중 아디포넥틴은 혈중에 매우 높은 농도(2~20 μg/mL)로 존재해 전체 혈장 단백질의 약 0.01%를 차지하는 아디포카인이다. 아디포넥틴은 세포 외 분비를 위한 호르몬을 대상으로 하는 짧은신호배열, 종 사이에서 변화하는 짧은 영역, 콜라겐 단백질과 유사한 65개의 아미노산영역, 및 구형 도메인의 4가지 영역으로 구성된, 244개 아미노산으로 이루어진 펩타이드이며, 혈장에서 복합체(multimer)로 존재한다.

아디포넥틴은 체지방이 증가하면 지방조직에서 발현되고 혈액을 순환하는 단백질로, 지방의 이화 과정에 관여하는데, 근육에서 아디포넥틴이 AMP activated protein kinase (AMPK)를 활성화시켜 지방산의 β-산화를 촉진하고, 지방조직에서는 지방 합성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 지방의 감소는 아디포넥틴 생산을 증가시키며, 비만이 되면 혈액 내 아디포넥틴양이 감소된다.

또한, 아디포넥틴은 인슐린 감수성을 증가시키기 때문에 아디포넥틴을 투여하면 인슐린 저항성이 회복되는 것으로 알려져 있다. 아디포넥틴의 수용체인 AdipoR1, AdipoR2는 비만과 관련된 인슐린 저항성 상태에서 발현이 감소되어 있는데, 상기 AdipoR1, AdipoR2이 아디포넥틴의 항당뇨 대사 활동을 매개하는 것으로 알려져 있다.

이와 같이 아디포넥틴은 다양한 질환에 관여하고 있으므로, 여러 질환의 치료제, 특히, 비만 관련 질병의 치료제로 이용될 수 있을 것으로 기대되고 있다.

또한, 아디포넥틴은 섬유화 정도를 진단하기 위한 지표로 이용되기도 하며, AMP-활성화 단백질 키나아제(AMP activated protein kinase, AMPK)를 활성화시켜 항섬유화 효과를 갖는 것으로 알려져 있다.

이러한 인슐린 감수성 개선, 항섬유화 등의 효과를 갖는 아디포넥틴은 비만 관련 질병을 치료하기 위한 유용한 타깃이 될 것으로 기대되어 다양한 연구가 진행되고 있다. 특히, 아디포넥틴의 활성을 높임으로써 유용한 치료제를 개발하려는 연구가 이루어지고 있다.

본 발명의 하나의 목적은 아디포넥틴 아날로그를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 아날로그를 포함하는 지속형 결합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 아실화된 아디포넥틴 아날로그를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 아디포넥틴 아날로그, 이의 결합체, 또는 아실화된 아디포넥틴 아날로그를 포함하는 간섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 아디포넥틴 아날로그, 이의 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그, 또는 이를 포함하는 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간섬유증의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 아디포넥틴 아날로그, 이의 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그, 또는 이를 포함하는 조성물의 간섬유증의 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 아디포넥틴 아날로그, 이의 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그, 또는 이를 포함하는 조성물의 간섬유증의 예방 또는 치료를 위한 약제를 제공하기 위한 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 하나의 양태는 신규한 아디포넥틴 아날로그(adiponectin analog)이다.

하나의 구체예로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 천연형 아날로그 또는 공지된 아디포넥틴의 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변이된 서열을 포함하는 것일 수 있다.

다른 하나의 구체예로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그인 것을 특징으로 한다:

[일반식 1]

Ra-Rb-I-Rc-L-Rd (서열번호 95)

상기 일반식 1에서,

Ra는 Xa1-Xa2-F-Xa3-Xa4-Y로 나타내어지고, 여기서

Xa1은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 트레오닌(T), 또는 티로신(Y)이고,

Xa2는 티로신(Y), 글루탐산(E), 글리신(G), 또는 페닐알라닌 (F)이고,

Xa3는 글리신(G) 또는 부존재이고,

Xa4는 알라닌(A), 라이신(K), 류신(L), 발린(V), 또는 노르류신(NL)이고;

Rb는 Xb1-Xb2-Xb3-Xb4-Xb5-Xb6로 나타내어지고, 여기서

Xb1은 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 세린(S), 또는 류신(L)이고,

Xb2는 세린(S), 프롤린(P), 글루탐산(E), 글리신(G), 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 또는 하이드록시프롤린(HyP)이고,

Xb3는 글리신(G), 아스파라긴(N), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 라이신(K), 티로신(Y), 또는 부존재이고,

Xb4는 세린(S), 아스파르트산(D), 프롤린(P), 아스파라긴(N), 또는 부존재이고,

Xb5는 글루타민(Q), 하이드록시프롤린(HyP), 또는 부존재이고,

Xb6는 글루탐산(E) 또는 부존재이고,

Rc는 Xc1-Xc2로 나타내어지고, 여기서

Xc1은 프롤린(P) 또는 하이드록시 프롤린(HyP)이고,

Xc2는 페닐알라닌(F), 노르류신(NL), 노르발린(NV), 글리신(G), 또는 류신(L)이고;

Rd는 Xd1-Xd2-Xd3-Xd4-Xd5로 나타내어지고, 여기서

Xd1은 페닐알라닌(F), 아르기닌(R), 또는 티로신(Y)이고,

Xd2는 글루탐산(E), 글리신(G), 또는 티로신(Y)이고,

Xd3는 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y)이고,

Xd4는 알라닌(A), 페닐알라닌(F), 또는 부존재이고,

Xd5는 알라닌(A), 시스테인(C), 글루탐산(E), 세린(S), 티로신(Y), 또는 부존재이다.

일 구체예에서, 상기 아디포넥틴 아날로그는

Ra는 DYFAY, EYFAY, FEFNLY, FGFNLY, FYFNLY, FYFAY, FYFGNLY, FYFKY, FYFLY, FYFVY, HYFAY, TFFAY, YFFNLY, YYFNLY, 및 YYFAY 중 어느 하나이고;

Rb는 ESGSQ, FPE, HHyPE, HDN, HEN, HGN, HP, HPD, HPE, HPK, HPKN, HPQ, HPQSQ, HRNPQ, HRRDHyPE, LDE, 및 SDYSQ 중 어느 하나이고;

Rc는 HyPF, PNL, PNV, PF, PG, 및 PL 중 어느 하나이고;

Rd는 FEFA, FGFA, FGYFA, FYF, FYFA, FYFAC, FYFAE, FYFAS, FYFAY, RYFA, 및 YYF 중 어느 하나; 인 것인, 일반식 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 아디포넥틴 아날로그는

Ra는 FYFNLY, FYFAY, FYFGNLY, 또는 YYFNLY이고;

Rb는 HHyPE, HP, HPE, 또는 HPQ이고;

Rc는 HyPF, PNV, PF, 또는 PG이고;

Rd는 FGYFA, FYFA, FYFAE, 또는 FYFAY; 인 것인, 일반식 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산을 추가로 포할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그는 N-말단에 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열이 추가로 결합될 수 있다.

H, HP, HDG, HHH, HHP, HEDP, HEHH, HEHP, HEHYFTNLIFYDEEDHEHH, HESG, HSHH, HSHP, HYDG, HAibEG, 또는 HyPTSGH;

P, PSEH, PSTEH, PSTEY, PSTEYH, PSDEH, PGSDEH, PFTNLIFYDEEDHEHH, PSGFYPHFYFNLEDHEFY, PAibGFYPHFYYNLEDYEHY, 또는 PGFTNLHFYDNLEDHEHY;

FTNLIEHH, FYDEEDHEHH, FNLYHPEIPFLHEHH, FTNLIFYDEEDHEHH, FTNLIFYHEEDHEDH, FTNLIGFYDEEDHEHH, FTNLHFYDNLEDHEHY, FYFNLYHPEIPFLFYFAEHH, 또는 FYFNLYHPFYFNLYHPFYFNLYHP;

YDG, YAGETH, YYFNLYEHH, YYFNLYHPEIPFLFYFA, YYFNLYHPEIPFLFYFAEHH, 또는 YYFNLYLDEIPFLFYFAEHH;

GGGGSFTNLIFYDEEDHEHH, GGGGSGGGGSGGGGSHEHH, 또는 GIPGHPGHNGAPGEHH;

MPINLFTNLHFYDNLEDHEHY 또는 MPINLFTNLIFYDNLEDHEHH; 또는

KEHH 또는 KIFYDEEDHEHH.

일 구체예에서, 상기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그는 N-말단에 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열이 추가로 결합될 수 있다.

H, HP, 또는 HEHH, HEHYFTNLIFYDEEDHEHH;

P 또는 PSTEY;

FTNLIEHH, FNLYHPEIPFLHEHH, FTNLIFYDEEDHEHH, FTNLIFYHEEDHEDH, FTNLIGFYDEEDHEHH, FTNLHFYDNLEDHEHY, FYFNLYHPEIPFLFYFAEHH, 또는 FYFNLYHPFYFNLYHPFYFNLYHP;

YYFNLYEHH, YYFNLYHPEIPFLFYFA, 또는 YYFNLYHPEIPFLFYFAEHH;

GGGGSFTNLIFYDEEDHEHH, GGGGSGGGGSGGGGSHEHH.

일 구체예에서, 상기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그는 C-말단에 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열이 추가로 결합될 수 있다.

HIT;

HITVYMKDVKVSL; 또는

IPFLFYFAEIPFLFYFA.

일 구체예에서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 C-말단이 아미드화 될 수있다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 아날로그로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 42 내지 63, 및 서열번호 65 내지 93으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 아날로그로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 31, 서열번호 40, 서열번호 42 내지 44, 서열번호 48 내지 50, 서열번호 57 내지 63, 서열번호 66, 서열번호 73 내지 75, 서열번호 81 내지 85, 및 서열번호 91으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 아날로그로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 C-말단이 아미드화된 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 아날로그로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 2 내지 93으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그이다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 31, 서열번호 44, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 66, 서열번호 74, 및 서열번호 75로 이루어진 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그이다.

하나의 구체예로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 3, 서열번호 6 내지 28, 서열번호 30, 서열번호 32 내지 36, 서열번호 38, 및 서열번호 41로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

다른 하나의 구체예로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 2 내지 93으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 아날로그로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 하기 일반식 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

[일반식 2]

X1-Y-F-X2-Y-X3-X4-X5-X6-I-P-X7-L-F-Y-F-X8

상기 일반식 2에서,

X1은 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y)이고,

X2는 알라닌(A), 라이신(K), 류신(L), 발린(V), 또는 노르류신(NL)이고;

X3은 히스티딘(H) 또는 류신(L)이고,

X4는 프롤린(P) 또는 아스파르트산(D)이고,

X5는 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 부존재이고,

X6는 아스파르트산(D) 또는 부존재이고,

X7는 페닐알라닌(F), 노르류신(NL), 노르발린(NV), 글리신(G), 또는 류신(L)이고;

X8는 알라닌(A) 또는 부존재이다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 아날로그로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 하기 일반식 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

[일반식 3]

X9-Y-F-NL-Y-H-P-E-I-P-F-L-F-Y-F-A-X10

상기 일반식 3에서,

X9는 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y)이고,

X10은 글루탐산(E) 또는 부존재이다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 아날로그로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 하기 일반식 4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

[일반식 4]

X11-X12-F-X13-NL-Y-H-X14-X15-X16-X17-X18-I-X19-F-L-F-X20-X21-X22-X23

상기 일반식 4에서,

X11은 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y)이고,

X12는 티로신(Y) 또는 페닐알라닌(F)이고,

X13는 글리신(G) 또는 부존재이고,

X14는 프롤린(P), 아르기닌(R), 또는 하이드록시프롤린(HyP)이고,

X15는 글루탐산(E) 또는 아르기닌(R)이고,

X16는 아스파르트산(D) 또는 부존재이고,

X17는 하이드록시프롤린(HyP) 또는 부존재이고,

X18는 글루탐산(E) 또는 부존재이고,

X19은 프롤린(P) 또는 하이드록시 프롤린(HyP)이고,

X20는 글리신(G) 또는 티로신(Y)이고,

X21는 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y)이고,

X22는 알라닌(A) 또는 페닐알라닌(F)이고,

X23는 알라닌(A) 또는 부존재이다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 하기 화학식 1로 표시되는 아디포넥틴 아날로그를 포함하는 지속형 결합체이다:

[화학식 1]

X - La - F

여기서,

X는, 아디포넥틴 아날로그(adiponectin analog)이고;

L은, 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커이며;

a는, 0 또는 자연수이며, 다만 a가 2 이상일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고;

F는, 이합체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;

-는 X와 L 사이, L과 F 사이의 공유결합 연결을 나타냄.

하나의 구체예로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다:

[일반식 1]

Ra-Rb-I-Rc-L-Rd (서열번호 95)

상기 일반식 1에서,

Ra는 Xa1-Xa2-F-Xa3-Xa4-Y 로 나타내어지고, 여기서

Xa1은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 트레오닌(T), 또는 티로신(Y)이고,

Xa2는 티로신(Y), 글루탐산(E), 글리신(G), 또는 페닐알라닌 (F)이고,

Xa3는 글리신(G) 또는 부존재이고,

Xa4는 알라닌(A), 라이신(K), 류신(L), 발린(V), 또는 노르류신(NL)이고;

Rb는 Xb1-Xb2-Xb3-Xb4-Xb5-Xb6 로 나타내어지고, 여기서

Xb1은 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 세린(S), 또는 류신(L)이고,

Xb2는 세린(S), 프롤린(P), 글루탐산(E), 글리신(G), 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 또는 하이드록시프롤린(HyP)이고,

Xb3는 글리신(G), 아스파라긴(N), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 라이신(K), 티로신(Y), 또는 부존재이고,

Xb4는 세린(S), 아스파르트산(D), 프롤린(P), 아스파라긴(N), 또는 부존재이고,

Xb5는 글루타민(Q), 하이드록시프롤린(HyP), 또는 부존재이고,

Xb6는 글루탐산(E) 또는 부존재이고;

Rc는 Xc1-Xc2 로 나타내어지고, 여기서

Xc1은 프롤린(P) 또는 하이드록시 프롤린(HyP)이고,

Xc2는 페닐알라닌(F), 노르류신(NL), 노르발린(NV), 글리신(G), 또는 류신(L)이고;

Rd는 Xd1-Xd2-Xd3-Xd4-Xd5 로 나타내어지고, 여기서

Xd1은 페닐알라닌(F), 아르기닌(R), 또는 티로신(Y)이고,

Xd2는 글루탐산(E), 글리신(G), 또는 티로신(Y)이고,

Xd3는 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y)이고,

Xd4는 알라닌(A), 페닐알라닌(F), 또는 부존재이고,

Xd5는 알라닌(A), 시스테인(C), 글루탐산(E), 세린(S), 티로신(Y), 또는 부존재이다.

다른 하나의 구체예로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 40, 및 서열번호 42 내지 63, 및 서열번호 65 내지 93으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

다른 하나의 구체예로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 31, 서열번호 40, 서열번호 42 내지 44, 서열번호 48 내지 50, 서열번호 57 내지 63, 서열번호 66, 서열번호 73 내지 75, 서열번호 81 내지 85, 및 서열번호 91으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 31, 서열번호 44, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 66, 서열번호 74, 및 서열번호 75로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

다른 하나의 구체예로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 3, 서열번호 6 내지 28, 서열번호 30, 서열번호 32 내지 36, 서열번호 38, 및 서열번호 41로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

다른 하나의 구체예로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 6 내지 30, 서열번호 32 내지 39, 서열번호 41, 서열번호 45 내지 47, 서열번호 51 내지 56, 서열번호 65, 서열번호 67 내지 72, 서열번호 76 내지 80, 서열번호 86 내지 90, 서열번호 92, 및 서열번호 93으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

다른 하나의 구체예로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 2 내지 93으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 하이브리드(hybrid)인 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체로서, 상기 L은 폴리에틸렌 글리콜 링커인 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체로서, 상기 L은 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하고, 상기 에틸렌글리콜 반복 단위 부위(moiety)의 화학식량은 1 내지 100 kDa 범위에 있는 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체로서, 상기 L은 폴리에틸렌글리콜 링커로서 분자량 2 kDa 내지 30 kDa을 갖는 링커인 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체로서, 상기 지속형 결합체는 상기 이합체 형태 면역글로불린 Fc 영역을 이루는 두 사슬 중 하나의 Fc 사슬에만 한 분자의 X가 상기 폴리에틸렌글리콜 링커를 통하여 공유결합적으로 연결된 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체로서, 상기 L의 한쪽 말단이 F의 아민기 또는 티올기와, L의 다른 말단이 X의 아민기 또는 티올기에 각각 반응하여 형성된 공유결합으로 F 및 X에 각각 연결되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 아실화된 아디포넥틴 아날로그이다.

하나의 구체예로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 1개 또는 2개의 카보실산을 포함한 C₁-C₃₀ 직쇄 또는 분지쇄아실기로 아실화된 것을 특징으로 한다.

다른 하나의 구체예로서, 상기 아실기는 C₄ 내지 C₃₀ 지방산 또는 다이카복실산인 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 아날로그로서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 N-말단에 위치한 아미노산 또는 라이신 잔기에 아실화된 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 아날로그로서, 상기 아실화된 아디포넥틴 아날로그는 링커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 아날로그로서, 상기 링커는 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 아디포넥틴 아날로그; 지속형 결합체; 또는 아실화된 아디포넥틴 아날로그를 포함하는 간섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물이다.

하나의 구체예로서, 상기 약학 조성물은 약학적 유효량의 아디포넥틴 아날로그; 지속형 결합체; 또는 아실화된 아디포넥틴 아날로그 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 약학 조성물로서, 상기 약학 조성물은 하기 특성 중 하나 이상의 특성을 나타내는 것을 특징으로 한다:

(i) 간 섬유화 개선; 및

(ii) TGFβ, Col1a1, 또는 Col3a1의 발현 감소.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 약학 조성물로서, 상기 약학 조성물은 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 또는 직장 내 투여 경로로 투여되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 아디포넥틴 아날로그, 이의 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그, 또는 이를 포함하는 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간섬유증의 예방 또는 치료 방법이다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 아디포넥틴 아날로그, 이의 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그, 또는 이를 포함하는 조성물의 간섬유증의 예방 또는 치료 용도이다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 아디포넥틴 아날로그, 이의 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그, 또는 이를 포함하는 조성물의 간섬유증의 예방 또는 치료를 위한 약제를 제공하기 위한 용도이다.

본 발명에 따른 아디포넥틴 아날로그는 기존의 아디포넥틴에 비해 활성이 높은 한편, 아실화된 아날로그 및 아날로그의 지속형 결합체는 체내 안정성이 우수하여 치료제로서 이점을 가진다.

도 1은 서열번호 49의 아디포넥틴 아날로그 투여에 따른 간 섬유화 개선 효과를 H&E 및 Sirius red 염색으로 확인한 도이다.
도 2는 서열번호 49의 아디포넥틴 아날로그 투여에 따른 간 섬유화 개선 효과를 하이드록시프롤린의 수준 감소을 통해 확인한 도이다.
도 3은 서열번호 49의 아디포넥틴 아날로그 투여에 따른 간 섬유화 개선 효과를 TGFβ, Col1a1, 및 Col3a1 유전자의 발현 수준 감소를 통해 확인한 도이다.

본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다. 한편, 본원에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.

본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib (2-아미노이소부티르산, 2-aminoisobutyric acid), Sar (N-methylglycine), 알파-메틸-글루탐산 (α-methyl-glutamic acid) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.

알라닌 A 아르기닌 R

아스파라긴 N 아스파르트산D

시스테인 C 글루탐산 E

글루타민 Q 글리신 G

히스티딘 H 이소류신 I

류신 L 라이신 K

메티오닌 M 페닐알라닌 F

프롤린 P 세린 S

트레오닌 T 트립토판 W

티로신 Y 발린 V

또한, 본 명세서에서 하기 아미노산은 아래와 같이 표기된다.

하이드록시프롤린 HyP

노르류신 NL

노르발린 NV

본 명세서에서 “Aib”는 “2-아미노이소부티르산(2-aminoisobutyric acid)” 또는 “아미노이소부티르산(aminoisobutyric acid)”으로 혼용될 수 있으며, 2-아미노이소부티르산(2-aminoisobutyric acid)과 아미노이소부티르산(aminoisobutyric acid)은 혼용되어 사용될 수 있다.

본 발명의 하나의 양태는 아디포넥틴 아날로그(adiponectin analog)이다. 구체적으로, 상기 아디포넥틴 아날로그는 천연형 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변이된 것을 의미하며, 본 발명에서는 천연형 아디포넥틴의 서열에서 아미노산 치환, 삽입, 결실, 수식(modification) 및 이들의 조합으로 변형된 서열을 의미할 수 있다. 특히, 아디포넥틴 수용체와의 결합력을 높이기 위해 소수성 상호작용 및 수소 결합을 원활히 할 수 있도록 소수성 아미노산의 삽입 또는 치환, 수소결합을 잘 이루는 것으로 알려진 아미노산으로 서열을 치환하거나, 소수성 성질을 가지는 서열의 연장 및 삽입, 천연형 아디포넥틴의 일부 서열 반복, N-말단 및 C-말단 서열의 연장, 음전하 또는 양전하를 갖는 아미노산의 삽입 또는 치환 등을 통해 제조된 것일 수 있으나, 우수한 아디포넥틴 활성을 나타내는 한 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 아디포넥틴 아날로그는 비자연적인(non-naturally occurring) 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "아디포넥틴(adiponectin)”이란, 지방조직에서 분비하는 물질인 아디포카인의 일종으로서 지질 및 당 대사, 인슐린 감수성 등을 조절해 비만과 관련된 대사질환 발병과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 제2형 당뇨병 및 인슐린 저항성, 비만이 심할수록 혈장 아디포넥틴 농도가 낮고 고혈압이나 동맥경화, 심혈관질환에서도 그 농도가 감소되어, 상기 질환의 표지자이자 치료제가 될 것으로 기대되고 있다. 또한, 항염증 물질로서도 작용할 수 있는 것으로 보고되어 있다. 상기 아디포넥틴은 AdipoR1 및 AdipoR2의 두 종류의 수용체에 작용하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 아디포넥틴은 인간 유래 아디포넥틴이며, 구체적으로, 활성 부위인 149번 내지 166번 아미노산을 포함하는 영역일 수 있으며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "아디포넥틴 아날로그"란 천연형 아디포넥틴의 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변이된 것을 의미하며, 구체적으로 천연형 아디포넥틴의 활성 부위에서 하나 이상의 아미노산이 변이된 것을 의미할 수 있다. 한 실시 형태에서 본 발명의 아디포넥틴 아날로그는 AdipoR1 및/또는 AdipoR2 수용체와의 결합력이 천연형보다 증가한 것으로서, 공지된 아디포넥틴에 비해 높은 활성을 갖기 때문에, 다양한 질환의 치료제로 이용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 아디포넥틴 아날로그는 TGFβ 활성을 억제할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시 형태에서 아디포넥틴 아날로그는 천연형 아디포넥틴 또는 기존의 알려진 아디포넥틴 아날로그인 BHD1028(엔큐라젠)에 비해 활성이 높도록 변형된 아날로그이다. 예컨대 한 구체적인 실시 형태에서 본 발명의 아디포넥틴 아날로그는 천연형 아디포넥틴에 비해 활성이 높은 것으로 알려진, 공지의 아디포넥틴 아날로그인 BHD1028에 비해서도 우수한 활성을 갖는다. 구체적으로, 본 발명에 따른 아디포넥틴 아날로그는 BHD1028에 비해 약 100% 이상, 200% 이상, 300%이상, 400% 이상, 500% 이상, 700% 이상, 1000% 이상, 1500% 이상, 2000% 이상, 2500% 이상, 3000% 이상, 3500% 이상의 활성을 나타내는 것일 수 있다.

이와 같은 아디포넥틴 아날로그의 활성은 당업계에 공지된 방법으로 측정될 수 있으며, 특정한 방법에 제한되지 않는다. 한 예로, 아디포넥틴 아날로그에 의해 억제되는 TGFβ 활성을 측정함으로써 아디포넥틴 아날로그의 활성을 분석할 수 있다.

본 발명에서, “BHD1028”는 엔큐라젠의 아디포넥틴 아날로그로서, 아디포넥틴의 수용체인 AdipoR1에 높은 친화력을 갖도록 설계되어 비만 치료제로 개발되고 있다. 구체적으로, 서열번호 94의 아미노산 서열을 지닌다.

본 발명에서 용어, "약"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 아디포넥틴 아날로그는 천연형 서열, 특히 아디포넥틴의 활성 부위에서 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 또는 20개 이상의 아미노산을 치환 또는 부가한 것일 수 있다. 상기 아미노산의 부가는 N-말단 또는 C-말단에 이루어질 수 있고, 또는 펩타이드 내부에 이루어질 수도 있다.

상기 아미노산의 치환 또는 부가 시에는 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비자연적 발생 아미노산, 아미노산 유도체, 이의 이성질체 등을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep, Genzyme Pharmaceuticals 등이 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩티드와 정형적인 펩티드 서열은 상업화된 펩티드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American Peptide Company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능하다. 아미노산 유도체도 마찬가지 방식으로 입수할 수 있다. 치환 또는 삽입하는 아미노산의 예를 일부만 들자면 데스아미노-히스티딘(desamino-histidine), 베타-히드록시 이미다조프로피온산(beta-hydroxyimidazopropionic acid), 4-이미다조아세트산(4-imidazoacetic acid), 베타-카르복시 이미다조프로피온산(beta-carboxyimidazopropionic acid), 노르류신(Norleucine), 노르발린(Norvaline), 하이드록시프롤린(Hydroxyproline), 2-아미노이소부티르산(2-aminoisobutyric acid, Aib) 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 아디포넥틴 아날로그는 천연형 서열에서 일부 서열이 결실된 것일 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1을 포함하는 아디포넥틴 활성 부위의 N-말단에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 서열번호 1을 포함하는 아디포넥틴 활성 부위의 C-말단에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 아디포넥틴 아날로그는 말단의 서열을 절단하거나, 절단한 위치에 다른 아미노산을 치환 또는 삽입한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또는 절단된 위치인, N-말단 또는 C-말단을 아세틸화 (acetylation) 및/또는 아미드화 (amidation)할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명의 아디포넥틴 아날로그는 N-말단에서 아미노기 대신 수소를 갖도록 변형된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 아디포넥틴 아날로그는 15 내지 40개 아미노산 잔기, 15 내지 35개, 15 내지 30개 아미노산 잔기를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 42 내지 63, 및 서열번호 65 내지 93으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

보다 구체적인 예로, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 31, 서열번호 40, 서열번호 42 내지 44, 서열번호 48 내지 50, 서열번호 57 내지 63, 서열번호 66, 서열번호 73 내지 75, 서열번호 81 내지 85, 및 서열번호 91로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

보다 구체적인 예로, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 31, 44, 및 49로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또는, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 31, 서열번호 44, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 66, 서열번호 74, 및 서열번호 75로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 3, 서열번호 6 내지 28, 서열번호 30, 서열번호 32 내지 36, 서열번호 38, 및 서열번호 41로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또는, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 2 내지 93으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 '특정 서열번호로 구성되는 아디포넥틴 아날로그'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 아디포넥틴 아날로그와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.

본 발명의 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 2 내지 93의 아미노산 서열과 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 아디포넥틴 수용체에 작용하여 아디포넥틴의 활성을 보유하는 한, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 서로 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.

보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.

용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

임의의 두 염기 서열 또는 펩타이드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

염기 서열 또는 펩타이드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.

또한, 본 발명의 아디포넥틴 아날로그 제조에는 L-형 혹은 D-형 아미노산, 및/또는 비-천연형 아미노산을 이용한 변형; 및/또는 천연형 서열을 개질, 예를 들어 측쇄 작용기의 변형, 분자 내 공유결합, 예컨대, 측쇄 간 고리 형성, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 인산화, 아미노헥산화, 바이오틴화 등과 같이 개질함으로써 변형하는 것이 모두 포함된다.

또한, 본 발명의 아디포넥틴 아날로그는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위하여 이의 N-말단 및/또는 C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 유기단으로 보호되거나, 또는 펩타이드 말단 등에 아미노산이 추가되어 변형된 형태일 수 있다.

특히, 화학적으로 합성한 펩타이드의 경우, N- 및 C-말단이 전하를 띠고 있기 때문에, 이러한 전하를 제거하기 위하여 N-말단을 아세틸화 (acetylation) 및/또는 C-말단을 아미드화 (amidation)할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

구체적으로, 본 발명의 아디포넥틴 아날로그의 N-말단 또는 C-말단은 아민기(-NH₂) 또는 카르복실기(-COOH)를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또는, N-말단에 아미드 그룹 대신 수소를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 아디포넥틴 아날로그는 C-말단에 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상의 아미노산 잔기를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 아디포넥틴 아날로그는 그 길이에 따라 이 분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들어 자동 펩타이드 합성기에 의해 합성할 수 있으며, 유전자 조작 기술에 의하여 생산할 수도 있다.

구체적으로, 본 발명의 아디포넥틴 아날로그는 표준 합성 방법, 재조합 발현 시스템, 또는 임의의 다른 당해 분야의 방법에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 아디포넥틴 아날로그는, 예를 들어 하기를 포함하는 방법을 포함하는 다수의 방법으로 합성될 수 있다:

(a) 펩타이드를 고체상 또는 액체상 방법의 수단으로 단계적으로 또는 단편 조립에 의해 합성하고, 최종 펩타이드 생성물을 분리 및 정제하는 방법; 또는

(b) 펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물을 숙주세포 내에서 발현시키고, 발현 생성물을 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 방법; 또는

(c) 펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물의 무세포 시험관 내 발현을 수행하고, 발현 생성물을 회수하는 방법; 또는

(a), (b) 및 (c)의 임의의 조합으로 펩타이드의 단편을 수득하고, 이어서 단편을 연결시켜 펩타이드를 수득하고, 당해 펩타이드를 회수하는 방법.

또한, 본 발명에 따른 아디포넥틴 아날로그는 펩타이드 그 자체, 이의 염 (예컨대, 상기 펩타이드의 약학적으로 허용가능한 염), 또는 이의 용매화물의 형태를 모두 포함한다. 또한, 펩타이드는 약학적으로 허용되는 임의의 형태일 수 있다.

상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 용어, "약학적으로 허용되는"은 의약학적 판단의 범위 내에서，과도한 독성，자극, 또는 알레르기 반응 등을 유발하지 않고 원하는 용도에 효과적으로 사용 가능한 물질을 의미한다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용되는 염" 이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산，말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산，숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산，시트르산, 메탄설폰산，포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산，벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속，마그네슘 등의 알칼리 토금속，및 암모늄 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용된 용어 "용매화물"은 본 발명에 따른 아디포넥틴 아날로그 또는 이의 염이 용매 분자와 복합체를 형성한 것을 말한다.

한편, 본 발명의 아디포넥틴 아날로그는 천연형 아디포넥틴 또는 공지된 기존의 아디포넥틴(예를 들어, BHD1028)에 비해 체내 반감기가 증가된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 반감기 증가를 위한 생체적합성 물질(예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역)이 아디포넥틴 아날로그에 직접 또는 링커를 통해 결합하여, 반감기가 증가된 지속형 결합체 형태를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 지속형 결합체는 아디포넥틴 수용체에 대한 결합력을 높인 아디포넥틴 아날로그를 포함할 뿐만 아니라, 이의 반감기를 증가시키기 위한 대표적인 캐리어로서 면역글로불린 Fc 영역과 결합시켜 아디포넥틴 아날로그의 반감기가 증가되고, 혈중 노출도가 높아져 유용한 치료제로 이용될 수 있다.

본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 아디포넥틴 아날로그의 지속형 결합체를 제공한다.

본 발명에서 상기 아디포넥틴 아날로그 지속형 결합체는, 본 발명에 따른 아디포넥틴 아날로그에 이의 생체 내 반감기를 증가시키기 위한 생체적합성 물질이 결합된 형태일 수 있다. 본 발명에서 상기 생체적합성 물질이란 용어는 캐리어란 용어와 혼용될 수 있다.

본 발명에서 상기 지속형 결합체는 캐리어가 결합되지 않은 아디포넥틴 아날로그에 대비하여 효력의 지속성이 증가된 것으로서, 본 발명에서는 이러한 결합체를 "지속형 결합체" 또는 “결합체”로 지칭한다.

한편, 이러한 결합체는 천연형이 아닐(non-naturally occurring) 수 있다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 상기 지속형 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는, 지속형 결합체이다:

[화학식 1]

X - La - F

여기서,

X는, 아디포넥틴 아날로그(adiponectin analog)이고;

L은, 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커이며;

a는, 0 또는 자연수이며, 다만 a가 2 이상일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고;

F는, 이합체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;

-는 X와 L 사이, L과 F 사이의 공유결합 연결을 나타낸다.

보다 구체적으로, X와 L, 및 L과 F는 공유결합으로 서로 연결되는 것일 수 있으며, 이때 상기 결합체는 화학식 1의 순서로, X, L, 및 F가 공유결합을 통하여 각각 연결된 결합체일 수 있다.

또한, 상기 F는 X와 직접적으로 연결되거나(즉, 상기 화학식 1에서 a가 0이거나), 또는 링커(L)를 통해 연결된 것일 수 있다.

본 발명의 용어, “지속형 결합체” 또는 “결합체”는 상기 아디포넥틴 아날로그와 생체적합성물질이 결합된 구조를 가지며, 상기 생체적합성물질이 결합되지 않은 아디포넥틴 아날로그에 비해 증가된 효력의 지속성을 나타낼 수 있다. 상기 지속형 결합체에서 생체적합성물질은 아디포넥틴 아날로그에 공유결합으로 연결된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 상기 결합체를 구성하는 일 모이어티의 구성에 해당할 수 있다. 구체적으로, 상기 화학식 1에서 X에 해당하고, 아디포넥틴 아날로그에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

상기 아디포넥틴 아날로그는 상술한 아디포넥틴 아날로그, 구체적으로 일반식 1 또는 서열번호 2 내지 93의 아미노산 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 펩타이드 또는 단편일 수 있으며, 생체적합성물질은 상기 아디포넥틴 아날로그의 반감기를 증가시킬 수 있는 물질로서, 본 발명의 상기 결합체를 구성하는 모이어티의 일 구성(F)에 해당한다.

예를 들어, 상기 결합체에 포함되는 아디포넥틴 아날로그는 일반식 1 또는 서열번호 2 내지 93 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, (필수적으로) 구성되는 펩타이드일 수 있다. 다른 예로, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 40, 및 서열번호 42 내지 63, 및 서열번호 65 내지 93로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, (필수적으로) 구성되는 펩타이드일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 31, 서열번호 40, 서열번호 42 내지 44, 서열번호 48 내지 50, 서열번호 57 내지 63, 서열번호 66, 서열번호 73 내지 75, 서열번호 81 내지 85, 및 서열번호 91로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, (필수적으로) 구성되는 펩타이드일 수 있다.

또는, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 31, 서열번호 44, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 66, 서열번호 74, 및 서열번호 75로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, (필수적으로) 구성되는 펩타이드일 수 있다.

또는, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 3, 서열번호 6 내지 28, 서열번호 30, 서열번호 32 내지 36, 서열번호 38, 및 서열번호 41로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, (필수적으로) 구성되는 펩타이드일 수 있다. 또는, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 2 내지 93으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 서열을 포함하거나, (필수적으로) 구성되는 펩타이드일 수 있다.

또한, 생체적합성물질의 결합에 의해 활성을 상실하지 않으면서 반감기가 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "생체적합성물질"은 생리활성물질인 본 발명의 펩타이드에 결합되어 생체적합성 물질부 또는 캐리어와 결합되지 않은 생리활성물질에 비하여 생리활성물질의 효력의 지속성을 증가시켜줄 수 있는 물질을 지칭한다. 상기 생체적합성물질은 생리활성물질(예를 들어, 아디포넥틴 아날로그)에 공유결합으로 연결된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

상기 결합체에서 F는 X, 즉 아디포넥틴 아날로그의 반감기를 증가시킬 수 있는 물질로서, 본 발명의 결합체를 구성하는 모이어티의 일 구성에 해당한다.

상기 F는 X와 공유 화학결합으로 서로 결합되는 것일 수 있으며, 공유 화학결합으로 L을 통하여 F와 X가 서로 결합되는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 F는 면역글로불린 Fc 영역이고, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG Fc 영역, 또는 비당쇄화된 IgG4 Fc 영역일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

상기 생체적합성 물질은 면역글로불린 Fc 영역일 수 있으며, 보다 구체적으로 IgG Fc 영역일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

구체적인 예로, 상기 F(면역글로불린 Fc 영역)는 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이합체이며, L의 한 말단이 상기 두 폴리펩타이드 사슬 중 하나의 폴리펩티드 사슬에만 연결되어 있는 구조를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

하나의 구체적인 실시 형태에서, 본 발명의 지속형 결합체는 아디포넥틴 아날로그와 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 아디포넥틴 아날로그 내의 하나 이상의 아미노산 측쇄는 생체 내에서 가용성 및/또는 반감기를 증가시키고/시키거나 생체이용율을 증가시키기 위해 이러한 생체적합성 물질에 접합될 수 있다. 이러한 변형은 또한 아디포넥틴 아날로그의 소거(clearance)를 감소시킬 수 있다.

상술한 생체적합성 물질은 수용성(양친매성 또는 친수성) 및/또는 무독성 및/또는 약학적으로 허용가능한 것일 수 있다.

상기 F는 X와 직접적으로 연결되거나(즉, 상기 화학식 1에서 a가 0이거나), 또는 폴리에틸렌 글리콜 링커(L)를 통해 연결된 것일 수 있다.

한편, 이러한 결합체는 비자연적인 (non-naturally occurring) 것일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 아디포넥틴 아날로그 결합체는 BHD1028에 비해 활성이 약 0.1% 이상, 1% 이상, 10 % 이상, 50 % 이상, 100% 이상, 200% 이상, 300%이상, 400% 이상, 500% 이상, 700% 이상, 1000% 이상, 1500% 이상, 2000% 이상, 2500% 이상, 3000% 이상, 3500% 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 지속형 결합체의 일 구성 요소인 "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및/또는 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 포함하는 부위를 의미한다. 상기 면역글로불린 Fc 영역은 본 발명의 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있다.

본 명세서에서 Fc 영역이라고 하면 면역글로불린의 파파인 소화에서 얻는 천연형 서열뿐 아니라 그 유도체, 예컨대 천연 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 변환되어 천연형과 상이하게 된 서열까지 망라하여 포함된다.　

상기 F는, 2개의 폴리펩타이드 사슬이 이황화결합으로 연결되어 있는 구조이며, 상기 두 사슬 중 한 사슬의 질소 원자를 통해서만 연결되어 있는 구조일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 질소 원자를 통한 연결은 라이신의 입실론 아미노 원자나 N-말단 아미노기에 환원적 아민화를 통하여 연결될 수 있다.

환원적 아민화 반응이란 반응물의 아민기 또는 아미노기가 다른 반응물의 알데히드 (즉, 환원적 아민화가 가능한 작용기)와 반응하여 아민을 생성한 다음, 환원 반응에 의해 아민 결합을 형성시키는 반응을 의미하여, 당해 기술 분야에 널리 알려져 있는 유기합성 반응이다.

하나의 구체예로, 상기 F는 그 N-말단 프롤린의 질소 원자를 통하여 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 면역글로불린 Fc 영역은 본 발명의 화학식 1의 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성으로, 구체적으로, 상기 화학식 1에서 F에 해당할 수 있다.

이러한 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 면역글로불린 Fc 영역은 N-말단에 특정 힌지 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 용어, "힌지 서열"은 중쇄에 위치하여 이황화결합(inter disulfide bond)를 통하여 면역글로불린 Fc 영역의 이량체를 형성하는 부위를 의미한다.

본 발명에서, 상기 힌지 서열은 하기의 아미노산 서열을 갖는 힌지 서열 중 일부가 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 갖도록 변이된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:

Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 97).

상기 힌지 서열은 서열번호 97의 힌지 서열 중 8번째 또는 11번째 시스테인 잔기가 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 힌지 서열은 하나의 시스테인 잔기만을 포함하는, 3 내지 12개의 아미노산으로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 힌지 서열은 다음과 같은 서열을 가질 수 있다: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 98), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Pro(서열번호 99), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser(서열번호 100), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro(서열번호 101), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser(서열번호 102), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(서열번호 103), Glu-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(서열번호 104), Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 105), Glu-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 106), Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 107), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 108), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 109), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 110), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(서열번호 111), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro(서열번호 112), Glu-Ser-Lys-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 113), Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 114), Glu-Pro-Ser-Cys(서열번호 115), Ser-Cys-Pro(서열번호 116).

더욱 구체적으로는 상기 힌지 서열은 서열번호 107 (Pro-Ser-Cys-Pro)또는 서열번호 116(Ser-Cys-Pro)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 서열의 존재로 면역글로불린 Fc 사슬 두 분자가 이량체를 형성한 형태일 수 있고, 또한, 본 발명의 화학식 1의 결합체는 링커의 일 말단이 이량체의 면역글로불린 Fc 영역의 한 사슬에 연결된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "N-말단"은 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노 말단을 의미하는 것으로, 아미노 말단의 최말단, 또는 최말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 이상의 아미노산까지 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 서열을 N-말단에 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.

예컨대, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6) 중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 지속형 결합체의 하나의 실시 형태로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역 F는 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이합체(이량체 dimer)이며, 이 때 상기 Fc 영역 이량체 F와 X는 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 하나의 링커 L을 통하여 공유결합적으로 연결되어 있다. 이 실시 형태의 한 구체예에서, X는 이러한 Fc 영역 이량체 F의 두 폴리펩타이드 사슬 중 하나의 폴리펩타이드 사슬에만 링커 L을 통하여 공유결합으로 연결되어 있다. 이 실시 형태의 더욱 구체적인 예시에서, 이러한 Fc 영역 이량체 F의 두 폴리펩타이드 사슬 중 X가 연결된 하나의 폴리펩타이드 사슬에는 한 분자의 X만이 L을 통하여 공유결합적으로 연결되어 있다. 이 실시 형태의 가장 구체적인 예시에서 상기 F는 동종이량체(homodimer)이다.

다른 구체예에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역 F는 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이량체며, L의 한 말단이 상기 두 폴리펩타이드 사슬 중 하나의 폴리펩티드 사슬에만 연결되어 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 지속형 결합체의 다른 실시 형태에서는, 이량체 형태의 하나의 Fc 영역에 X 두 분자가 대칭적으로 결합하는 것 역시 가능하다. 이때 상기 면역글로불린 Fc와 X는 비펩타이드성 링커에 의해 서로 연결될 수 있다. 그러나, 상기 기술된 예에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 그 유도체, 치환체, 예컨대 천연 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 변환되어 천연형과 상이하게 된 서열등 변형체까지 망라하여 포함된다. 상기 유도체, 치환체, 변형체는 FcRn에 결합하는 능력을 보유하는 것을 전제로 한다.　

예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.

또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동등한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 것일 수 있다.

또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.

또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포 독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역 반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.

본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 더 구체적인 실시 형태에서는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.

한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 더 구체적인 실시 형태에서는 인간기원이다.

또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며, 보다 더 구체적인 실시 형태에서는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다. 더욱 더 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역이며, 가장 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 하나의 구체적인 실시 형태에서, 면역글로불린 Fc 절편은 인간 IgG4 Fc의 영역으로서, 각 단량체(monomer)의 3번 아미노산인 시스테인 사이의 이황화 결합(inter-chain 형태)을 통해 2개의 단량체가 연결된 동종이량체(homodimer) 형태일 수 있으며, 이 때 동종이량체의 각 단량체는 독립적으로 35번 및 95번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합 및 141번 및 199번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합, 즉 2개의 내부의 이황화 결합(intra-chain 형태)을 가지거나/가질 수 있다. 각 단량체의 아미노산 수는 221개의 아미노산으로 구성될 수 있므며, 동종이량체를 형성하는 아미노산은 전체 442개의 아미노산으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 면역글로불린 Fc 절편은 서열번호 96의 아미노산 서열 (221개의 아미노산으로 구성됨)을 갖는 단량체 2개가 각 단량체의 3번 아미노산인 시스테인 사이에 이황화 결합을 통해 동종이량체를 형성하고, 상기 동종이량체의 단량체는 각각 독립적으로 35번 및 95번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합 및 141번 및 199번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합을 형성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 화학식 1의 F는 서열번호 96의 아미노산 서열인 단량체를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 F는 서열번호 96의 아미노산 서열의 단량체의 동종이량체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

하나의 예로, 면역글로불린 Fc 절편은 서열번호 96의 아미노산 서열 (442개의 아미노산으로 구성됨)을 포함하는 동종이량체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

한편, 본 발명에서 면역글로불린 Fc 영역과 관련된 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 영역으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.

본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 불변영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 영역에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.

한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 구체적으로는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 구체적으로는 보체 의존적 독성(CDC, Complement dependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.

또한, 상술한 지속형 결합체는 효력의 지속성이 천연형 아디포넥틴 또는 기존의 아디포넥틴 아날로그(예를 들어, BHD1028)에 비해, 또는 F가 수식되지 않은 X에 비해 증가된 것일 수 있으며, 이러한 결합체는 상술한 형태뿐만 아니라, 생분해성 나노파티클에 봉입된 형태 등을 모두 포함하나 이에 제한되지 않는다.

한편, 상기 화학식 1에서, 상기 L은 비펩타이드성 링커, 예를 들어 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커일 수 있다.

본 발명에서 "비펩타이드성 링커"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 포함한다. 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 상기 비펩타이드성 링커는 본 발명의 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있으며, 상기 화학식 1에서 L에 해당된다.

본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 링커는 생체 내 단백질 분해 효소에 저항성 있는 중합체이면 제한 없이 사용될 수 있다. 본 발명에서 상기 비펩타이드성 링커는 비펩타이드성 중합체와 혼용되어 사용될 수 있다.

본 발명에서 비펩타이드성 링커는 말단에 반응기를 포함하여, 결합체를 구성하는 다른 구성 요소와 반응을 통해 결합체를 형성할 수 있다. 양 말단에 반응성 작용기를 갖는 비펩타이드성 링커가 각 반응기를 통해 상기 화학식 1의 X 및 F와 결합하여 결합체를 형성할 경우, 상기 비펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 중합체는 비펩타이드성 중합체 연결부(linker moiety) 또는 비펩타이드성 링커 연결부로 명명할 수 있다.

특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 비펩타이드성 링커는 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜일 수 있고, 또한, 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적인 비펩타이드성 링커의 예로서 폴리에틸렌 글리콜 링커일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 비펩타이드성 링커의 반복 단위는 에틸렌글리콜 반복 단위일 수 있고, 구체적으로, 상기 비펩타이드성 링커는 에틸렌글리콜 반복 단위를 포함하면서, 결합체의 제조에 이용되는 작용기를 말단에 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 지속형 결합체는 상기 링커의 작용기를 통해 X와 F가 연결된 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서, 상기 비펩타이드성 링커는 2개, 또는 3개 이상의 작용기를 포함할 수 있고, 각 작용기는 동일하거나, 서로 상이할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

하나의 구체예로, 상기 에틸렌글리콜 반복 단위를 포함는 링커인 L은, 결합체로 구성되기 이전에는 결합체의 제조에 이용되는 작용기를 말단에 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 지속형 결합체는 상기 작용기를 통해 X와 F가 연결된 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 링커는 하기 화학식 2로 표시되는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:

[화학식 2]

여기서, n= 10 내지 2400, n= 10 내지 480, 또는 n = 50 내지 250이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 지속형 결합체에서 PEG 모이어티는, -(CH₂CH₂O)n-구조 뿐만 아니라 연결 요소와 이 -(CH₂CH₂O)n- 사이에 개재하는 산소 원자도 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 결합체는 일반식 1 또는 서열번호 2 내지 93 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그(X)와 면역글로불린 Fc 영역(F)이 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커를 통해 공유 결합으로 연결된 구조 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폴리에틸렌 글리콜은, 에틸렌 글리콜 동종 중합체, PEG 공중합체, 또는 모노메틸-치환된 PEG 중합체(mPEG)의 형태를 모두 포괄하는 용어이나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

하나의 구체예로 상기 에틸렌글리콜 반복단위는 그 예로, [OCH₂CH₂]n로 표시될 수 있으며, n 값은 자연수로 상기 결합체 내의 [OCH₂CH₂]n 부위의 평균 분자량, 예컨대 수평균 분자량이 O 초과 내지 약 100 kDa이 되도록 정해질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또 하나의 예로, 상기 n 값은 자연수로 상기 결합체 내의 [OCH₂CH₂]n 부위의 평균 분자량, 예컨대 수평균 분자량이 약 1 내지 약 100 kDa, 약 1 내지 약 80 kDa, 약 1 내지 약 50 kDa, 약 1 내지 약 30 kDa, 약 1 내지 약 25 kDa, 약 1 내지 약 20 kDa, 약 1 내지 약 15 kDa, 약 1 내지 약 13 kDa, 약 1 내지 약 11 kDa, 약 1 내지 약 10 kDa, 약 1 내지 약 8 kDa, 약 1 내지 약 5 kDa, 약 1 내지 약 3.4 kDa, 약 3 내지 약 30 kDa, 약 3 내지 약 27 kDa, 약 3 내지 약 25 kDa, 약 3 내지 약 22 kDa, 약 3 내지 약 20 kDa, 약 3 내지 약 18 kDa, 약 3 내지 약 16 kDa, 약 3 내지 약 15 kDa, 약 3 내지 약 13 kDa, 약 3 내지 약 11 kDa, 약 3 내지 약 10 kDa, 약 3 내지 약 8 kDa, 약 3 내지 약 5 kDa, 약 3 내지 약 3.4 kDa, 약 8 내지 약 30 kDa, 약 8 내지 약 27 kDa, 약 8 내지 약 25 kDa, 약 8 내지 약 22 kDa, 약 8 내지 약 20 kDa, 약 8 내지 약 18 kDa, 약 8 내지 약 16 kDa, 약 8 내지 약 15 kDa, 약 8 내지 약 13 kDa, 약 8 내지 약 11 kDa, 약 8 내지 약 10 kDa, 약 9 내지 약 15 kDa, 약 9 내지 약 14 kDa, 약 9 내지 약 13 kDa, 약 9 내지 약 12 kDa, 약 9 내지 약 11 kDa, 약 9.5 내지 약 10.5 kDa, 또는 약 10 kDa일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 L은 폴리에틸렌글리콜 링커로서 분자량 2 kDa 내지 30 kDa을 갖는 링커일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

하나의 구체예로, 상기 링커의 양 말단은 면역글로불린 Fc 영역의 티올기, 아미노기, 하이드록실기 및 아디포넥틴 아날로그의 티올기, 아미노기, 아지드기, 하이드록실기에 결합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 링커는 양쪽 말단에 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 아디포넥틴 아날로그와 결합될 수 있는 반응기, 구체적으로는 면역글로불린 Fc 영역의 시스테인의 티올기; N-말단, 라이신, 아르기닌, 글루타민 및/또는 히스티딘에 위치한 아미노기; 및/또는 C-말단에 위치한 하이드록실기와 결합되고, 아디포넥틴 아날로그의 시스테인의 티올기; N-말단, 라이신, 아르기닌, 글루타민 및/또는 히스티딘의 아미노기; 아지도리신의 아지드기; 및/또는 하이드록실기와 결합될 수 있는 반응기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

보다 구체적으로, 상기 링커의 반응기는 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기에서, 알데히드 그룹으로 프로피온 알데히드 그룹 또는 부틸 알데히드 그룹을 예로서 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 비펩타이드성 링커의 양 말단은 각각 F, 예컨대 면역글로불린 Fc 영역의 아민기 또는 티올기 및 X의 아민기 또는 티올기에 결합할 수 있다.

구체적으로, 상기 비펩타이드성 링커는 양쪽 말단에 각각 F (예컨대, 면역글로불린 Fc 영역) 및 X와 결합될 수 있는 반응기, 구체적으로는 X, 혹은 F (예컨대, 면역글로불린 Fc 영역)의 N-말단 또는 라이신에 위치한 아민기, 또는 시스테인의 티올기와 결합될 수 있는 반응기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, F, 예컨대 면역글로불린 Fc 영역 및 X와 결합될 수 있는, 상기 비펩타이드성 링커의 반응기는 알데히드기, 말레이미드기 및 석시니미드 유도체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기에서, 알데히드기로 프로피온 알데히드기 또는 부틸 알데히드기를 예로서 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 발레르에이트, 석시니미딜 메틸부타노에이트, 석시니미딜 메틸프로피온에이트, 석시니미딜 부타노에이트, 석시니미딜 프로피오네이트, N-하이드록시석시니미드, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

비펩타이드성 링커는 이러한 반응기를 통하여 X와 F에 연결되어 비펩타이드성 링커 연결부로 전환될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 알데히드 결합에 의한 환원성 아민화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.

또한, 상기 비펩타이드성 링커의 양쪽 말단의 반응기는 서로 동일하거나 또는 서로 상이할 수 있으며, 예를 들어, 양 말단에 알데히드기를 갖거나, 또는, 한쪽 말단에는 말레이미드기를, 다른 쪽 말단에는 알데히드기, 프로피온 알데히드기, 또는 부틸 알데히드기를 가질 수 있다. 그러나, 비펩타이드성 링커의 각 말단에 F, 구체적으로 면역글로불린 Fc 영역과 X가 결합될 수 있다면, 특별히 이에 제한되지 않는다.

예를 들어, 상기 비펩타이드성 링커의 한쪽 말단에는 반응기로서 말레이미드 기를 포함하고, 다른 쪽 말단에는 알데히드기, 프로피온 알데히드기 또는 부틸 알데히드기 등을 포함할 수 있다.

양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 링커로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 지속형 결합체를 제조할 수 있다.

하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 비펩타이드성 링커는 X의 시스테인 잔기, 보다 구체적으로 시스테인의 -SH 기에 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 시스테인 잔기의 -SH 기에 비펩타이드성 링커의 반응기가 연결될 수 있으며, 반응기에 대해서는 앞서 기술한 내용이 모두 적용된다. 만약, 말레이미드-PEG-알데히드를 사용하는 경우, 말레이미드 기는 X의 -SH 기와 티오에테르(thioether) 결합으로 연결하고, 알데히드기는 F, 구체적으로 면역글로불린 Fc의 -NH₂기와 환원적 아민화 반응을 통해 연결할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 이는 하나의 일례에 해당한다.

이와 같은 환원적 알킬화를 통하여 비펩타이드성 링커인 PEG의 한쪽 말단에 위치한 산소 원자에 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단 아미노기가 -CH₂CH₂CH₂-의 구조를 가지는 링커 작용기를 통해 서로 연결되어, -PEG-O-CH₂CH₂CH₂NH-면역글로불린 Fc와 같은 구조를 형성할 수 있고, 티오에테르 결합을 통하여 PEG의 한쪽 말단이 아디포넥틴 아날로그의 시스테인에 위치한 황 원자에 연결된 구조를 형성할 수 있다. 상술한 티오에테르 결합은

의 구조를 포함할 수 있다.

그러나, 상술한 예에 특별히 제한되는 것은 아니며, 이는 하나의 일례에 해당한다.

다른 구체적인 실시 형태에서 상기 비펩타이드성 중합체는 X의 라이신 잔기, 보다 구체적으로, 라이신의 아민기에 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 결합체에서, 비펩타이드성 링커의 반응기가 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 위치한 -NH₂와 연결된 것일 수 있으나, 이는 하나의 일례에 해당한다.

또한, 상기 결합체에서, 아디포넥틴 아날로그는 반응기를 갖는 링커와 C-말단을 통해 연결될 수 있으나, 이는 하나의 일례에 해당한다.

본 발명에서 "C-말단"은, 아디포넥틴 아날로그의 카르복시 말단을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 링커와 결합할 수 있는 위치를 말한다. 그 예로, 이에 제한되지는 않으나, C-말단의 최말단 아미노산 잔기뿐만 아니라 C-말단 주위의 아미노산 잔기를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 최말단으로부터 첫 번째 내지 20 번째의 아미노산 잔기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 따로 가리키는 바가 없으면, 본 발명에 따른 "아디포넥틴 아날로그" 또는 아디포넥틴 아날로그가 생체적합성 물질에 공유결합으로 연결된 "결합체"에 대한 명세서 상세한 설명이나 청구 범위의 기술은 해당 아디포넥틴 아날로그 또는 결합체는 물론이고, 해당 아디포넥틴 아날로그 또는 결합체의 염(예컨대, 상기 펩타이드의 약학적으로 허용가능한 염), 또는 이의 용매화물의 형태를 모두 포함하는 범주에도 적용된다. 따라서 명세서에 "아디포넥틴 아날로그" 또는 "결합체"라고만 기재되어 있더라도 해당 기재 내용은 그 특정 염, 그 특정 용매화물, 그 특정 염의 특정 용매화물에도 마찬가지로 적용된다. 이러한 염 형태는 예를 들어 약학적으로 허용되는 임의의 염을 사용한 형태일 수 있다. 상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 용어, "약학적으로 허용되는"은 의약학적 판단의 범위 내에서，과도한 독성，자극, 또는 알레르기 반응 등을 유발하지 않고 원하는 용도에 효과적으로 사용 가능한 물질을 의미한다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용되는 염" 이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산，말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산，숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산，시트르산, 메탄설폰산，포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산，벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속，마그네슘 등의 알칼리 토금속，및 암모늄 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용된 용어 "용매화물"은 본 발명에 따른 아디포넥틴 아날로그 또는 이의 염이 용매 분자와 복합체를 형성한 것을 말한다.

또한, 본 발명의 지속형 결합체는 상술한 아디포넥틴 아날로그를 생체적합성 물질에 공유결합으로 연결시킴으로써 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 예시로는, a) 상기 아디포넥틴 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 배양하여 아디포넥틴 아날로그를 발현시키는 단계; b) 발현된 아디포넥틴 아날로그를 생체적합성 물질과 연결시키는 단계; 및 c) 제조된 결합체를 분리 및 정제하는 단계를 통해 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 형질전환체의 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 숙주세포 배양의 요건을 충족해야 한다. 숙주세포의 성장을 위하여 배지 중에 포함될 수 있는 탄소원은 제조된 형질전환체의 종류에 따라 당업자의 판단에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 배양 시기 및 양을 조절하기 위해 적당한 배양 조건을 채택할 수 있다.

사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 사카로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다.

마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양 도중에 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 염기성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예: 공기)를 주입한다.

본 발명에 따른 형질전환체의 배양은 보통 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 또한 배양은 원하는 아디포넥틴 아날로그의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 지속되는데, 이러한 목적으로 배양은 보통 10 내지 160시간 동안 지속될 수 있다.

전술한 바와 같이 숙주세포에 따라 적절한 배양 조건을 조성해주면 본 발명에 따른 형질전환체는 아디포넥틴 아날로그를 생산하게 되며, 벡터의 구성 및 숙주세포의 특징에 따라 생산된 아디포넥틴 아날로그는 숙주세포의 세포질 내, 원형질막 공간(periplasmic space) 또는 세포 외로 분비될 수 있다.

숙주세포 내 또는 외에서 발현된 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 정제 방법의 예로는 염석(예: 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(예: 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 적용할 수 있다.

또는, 펩타이드 합성법에 의해 제조된 아디포넥틴 아날로그를 비펩타이드성 중합체를 통해 생체적합성 물질(예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역)과 연결시킬 수도 있다. 이와 같은 펩타이드 합성은 본 발명의 아디포넥틴 아날로그 서열이 제공되어 있는 바, 공지의 펩타이드 합성법을 이용해 제한없이 제조할 수 있다.

아디포넥틴 아날로그는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 아실화된 아디포넥틴 아날로그를 제공한다.

상기 아디포넥틴 아날로그는 상술한 바와 같다. 구체적으로, 상기 아디포넥틴 아날로그는 일반식 1 또는 서열번호 2 내지 93 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

아실화(acylation)는 펩타이드　약물의 약동학적 및 약력학적 특성을 개선하기 위한 방법으로 알려져 있다. 펩타이드 약물의 경우, 체내 효소 분해로 인해 약효를 발휘하기 어려운 문제점이 있다. 이에, 지방산을 펩타이드에 부착시키는 펩타이드의 아실화를 통해 효소 작용 부위를 차단함으로써 펩타이드 약물의 안정성을 높이고 반감기를 증가시키는 기술이 연구되고 있다(PLoS One 2014 Oct 8;9(10):e109939; Tetrahedron, 49(20), 4141-4146).

본 발명의 아디포넥틴 아날로그는 반감기 증가를 위해 아실화된 형태일 수 있다.

본 발명에서, 아실화에 이용되는 아실기는 임의의 길이를 갖는 탄소쇄일 수 있고, 선형 또는 분지쇄형일 수 있다. 구체적으로, 상기 쇄는 선형 지방족 쇄, 분지형 지방족 쇄, 사이클릭 알킬 모이어티를 함유하는 쇄, 소수성 천연 생성물, 예컨대, 스테로이드, 아르알킬 쇄, 또는 아실 모이어티를 함유하는 알킬 쇄를 포함할 수 있다.

일 구체 예는 아디포넥틴 아날로그에 아실기가 부착된 아실화된 아디포넥틴 아날로그일 수 있다.

하나의 구체예로서, 상기 아실기가 아디포넥틴 아날로그의 아미노산 서열의 N 말단; 또는 아디포넥틴 아날로그 아미노산 서열에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 아민;에 부착되는 것일 수 있다.

한 구체적인 실시예로, 상기 아디포넥틴 아날로그는 1개 이상, 2개 이상, 구체적으로는 1개 또는 2개의 카보실산 또는 카복실산 유도체를 포함하는 C₁-C₄₀ 직쇄 또는 분지쇄 아실기로 아실화된 것일 수 있고, 한 예로, 상기 아실기는 지방산 또는 다이카복실산, 또는 이의 유도체 화합물, 예컨대 지방산 또는 다이카복실산의 에스터 화합물, 구체적으로는 C₄ 내지 C₄₀ 지방산 또는 다이카복실산, 또는 이의 에스터 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적인 예로, C₁₈, C₂₀, C₂₂, C₂₄, C₂₆, C₂₈, C₃₀, C₃₀, C₃₅, 또는 C₄₀의 지방산 또는 다이카복실산, 또는 이의 에스터 화합물일 수 있다. 다른 예의 아실기로는 콜산, 케노데옥시콜산, 데옥시콜산, 리토콜산, 타우로콜산, 글리코콜산, 콜레스테롤산 등의 담즙산, 숙신산 또는 숙신산 유도체, 말레산, 또는 말레산 유도체 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 아실기의 구체예로는 알데히드 그룹, 말레이미드(Maleimide) 그룹 및 석시니미드(Succinimid) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 아실기의 반응기는 카복실산, 숙신산 에스터, 석시니미드(Succinimide), 또는 하이드록시석신이미드일 수 있다.

한 구체적인 실시예로, 아디포넥틴 아날로그 아미노산 서열에 존재하는 1 내지 5, 예컨대 1 내지 3, 또는 한 개의 라이신 잔기의 측쇄 아민;에 아실기가 부착되는 것일 수 있다.

하나의 구체예로서, 상기 아실화된 아디포넥틴 아날로그는 1개 또는 2개의 카보실산을 포함한 C₁-C₄₀ 직쇄 또는 분지쇄 아실기로 아실화된 것일 수 있다.

하나의 구체예로서, 상기 아실기는 C₄ 내지 C₄₀ 지방산 또는 다이카복실산일 수 있다.

본 발명의 아실화된 아디포넥틴 아날로그는 당업계의 공지된 방법으로 아실기가 아디포넥틴 아날로그에 부착된 것일 수 있다. 특별히 이에 제한되지 않으나, 보호기를 이용하고/하거나 링커를 이용하여 목적하는 위치에 아실기를 부착할 수 있으며, 유기 용매 또는 수용액의 존재 하에서 반응을 수행하는 것일 수 있다.

본 발명에서, 아디포넥틴 아날로그는 이의 아미노산 잔기에 직접 아실기가 부착된 형태일 수 있다. 예를 들어, 에스테르, 티오에스테르, 이미드, 또는 아미드 결합을 통해 아실기가 부착된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 아디포넥틴 아날로그는 아민, 히드록실, 또는 티올기를 갖는 아미노산 잔기에 아실화가 이루어진 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 아디포넥틴 아날로그는 N-말단에 위치한 아미노산 또는 라이신 잔기에 아실화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 라이신 잔기의 아실화는 라이신 잔기의 측쇄 아민(라이신의 입실론 아미노 원자)에 아실기가 부착되는 것일 수 있다.

또는, 본 발명의 아실화된 아디포넥틴 아날로그는 링커를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 아실화된 아디포넥틴 아날로그는 링커의 연결 이후 아실화가 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 링커는 아민, 히드록실, 또는 티올기를 갖는 1개 이상의 아미노산이거나, 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커이거나, 또는 1개 이상의 아미노산과 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커가 연결된 형태의 링커일 수 있다.

예를 들어, 상기 링커는 [-OCH₂CH₂-]n의 구조를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. 상기 n은 1 내지 10의 자연수 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 링커는 아민, 히드록실, 티올, 및/또는 카르복실기, 알데히드, 말레이미드, 석시니미드 등을 반응기로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 아실화는 상기 링커의 결합 이후, 링커의 일 반응기와 아실기를 부착시키는 것일 수 있으며, 또는, 2개 이상의 카복실산을 포함하는 경우에는 1개를 제외한 나머지는 에스터와 같은 보호기로 보호된 친유성 모이어티를 부착시키는 것일 수 있으나, 본 발명에 따른 아디포넥틴 아날로그에 아실기를 도입할 수 있다면, 아실기의 도입 방법은 특정한 방법으로 제한되지 않는다.

본 발명의 아실화된 아디포넥틴 아날로그는 N-말단, C-말단, 또는 펩타이드의 내부 잔기에 아실기가 부착된 것일 수 있다. 예를 들어, N-말단, C-말단 또는 펩타이드 내부의 티로신, 페닐알라닌, 또는 라이신 잔기의 측쇄에 아실기가 부착되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 예로, 티로신, 페닐알라닌, 또는 라이신의 아민기, 히드록실기 또는 시스테인의 티올기 등에 아실기가 부착되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

하나의 구체예로서, 상기 아실기는 하기 화학식 3-1로 나타내어질 수 있다.

[화학식 3-1]

본 발명에 따른 아실화된 아디포넥틴 아날로그의 구체적인 실시 양태로, 아디포넥틴 아날로그의 아미노산 서열의 N-말단 아실화 또는 아디포넥틴 아날로그 아미노산 서열에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 아민(라이신 사이드체인)에 아실기가 부착되어 아실화된 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 하기 화학식 3-2 및 3-3의 구조식을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

[화학식 3-2]

상기 화학식 3-2에서 R은 아디포넥틴 아날로그를 나타낸다.

하나의 구체예로서, 상기 아디포넥틴 아날로그의 N 말단에 아실기가 부착될 수 있다.

다른 하나의 구체예로서, 상기 아디포넥틴 아날로그 아미노산 서열에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 아민에 아실기가 부착될 수 있다.

[화학식 3-3]

상기 화학식 3-3은 측쇄 아민에 화학식 3-1의 아실기가 부착된 라이신 잔기를 나타낸다.

상술한 본 발명의 아실화된 아디포넥틴 아날로그는 BHD1028에 비해 활성이 약 0.1% 이상, 1% 이상, 10 % 이상, 50 % 이상, 100% 이상, 200% 이상, 300%이상, 400% 이상, 500% 이상, 700% 이상, 1000% 이상, 1500% 이상, 2000% 이상, 2500% 이상, 3000% 이상, 3500% 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 아실화된 아디포넥틴 아날로그는 아디포넥틴 수용체에 대한 활성을 보유하여 아실화되지 않은 아디포넥틴 또는 아디포넥틴 아날로그와 동일한 기능을 수행할 수 있으면서도 높은 활성 수준과 안정성, 및 증가된 반감기를 갖는 것일 수 있다.

본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 아디포넥틴 아날로그; 이를 포함하는 지속형 결합체; 또는 아실화된 아디포넥틴 아날로그를 포함하는 조성물을 제공한다. 아디포넥틴 아날로그; 이를 포함하는 지속형 결합체; 및 아실화된 아디포넥틴 아날로그는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명에 따른 조성물은 약학 조성물일 수 있고, 구체적인 한 양태로는 간섬유증 예방 또는 치료 용도를 갖는 약학 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 아디포넥틴 아날로그; 이를 포함하는 지속형 결합체; 또는 아실화된 아디포넥틴 아날로그를 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 약리학적 유효량의 아디포넥틴 아날로그; 이를 포함하는 지속형 결합체; 또는 아실화된 아디포넥틴 아날로그를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 구체적인 예로, 일반식 1 또는 서열번호 2 내지 93 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그; 이를 포함하는 지속형 결합체; 또는 아실화된 상기 아디포넥틴 아날로그를 포함할 수 있고, 보다 구체적으로, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 40, 및 서열번호 42 내지 63, 서열번호 65 내지 93으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그; 서열번호 44, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 66, 서열번호 74, 및 서열번호 75로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그; 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 31, 서열번호 40, 서열번호 42 내지 44, 서열번호 48 내지 50, 서열번호 57 내지 63, 서열번호 66, 서열번호 73 내지 75, 서열번호 81 내지 85, 및 서열번호 91로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그; 서열번호 3, 서열번호 6 내지 28, 서열번호 30, 서열번호 32 내지 36, 서열번호 38, 및 서열번호 41로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그; 또는 서열번호 2 내지 93으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그를 포함하는 조성물일 수 있고, 또는 상기 아디포넥틴 아날로그를 포함하는 지속형 결합체, 또는 상기 아디포넥틴 아날로그가 아실화된 형태인 아날로그를 포함하는 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 조성물은 하기 특성 중 하나 이상의 특성을 나타내는 것일 수 있으나, 아디포넥틴 수용체에 대한 활성을 나타내어 항염 활성을 갖고/갖거나 섬유화 개선 효과를 나타내는 이상, 제한되는 것은 아니다:

(i) 간 섬유화 개선; 및

(ii) TGFβ, Col1a1, 또는 Col3a1의 발현 감소.

아디포넥틴은 AdipoR1 및 AdipoR2 수용체에 작용하는 아디포카인으로, 지질 및 당 대사, 인슐린 감수성 등을 조절해 대사질환 발병에 관련되어 있다. 높은 활성을 갖도록 변형된 본 발명의 아디포넥틴 아날로그를 통해 대사질환, 특히간섬유증에 대한 예방 및 치료 효과를 얻을 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 아디포넥틴 아날로그; 이를 포함하는 지속형 결합체; 또는 아실화된 아디포넥틴 아날로그는 천연형 아디포넥틴 또는 기존의 공지된 아디포넥틴 아날로그(예를 들어, BHD1028)에 비해 약 0.01배 이상, 약 0.1배 이상, 약 1배 이상, 약 3배 이상, 약 5배 이상, 약 10배이상, 약 15배 이상, 약 20배이상, 약 25배이상, 또는 약 30배이상의 활성을 갖는 것일 수 있으나, 그 수치는 한정되지 않으며 간섬유증에 대한 예방 및 치료 효과를 갖는 이상 본 발명의 범주에 속한다.

본 발명에서, “간 섬유증 (liver fibrosis)”은 반복적인 간 손상에 대한 상처 회복 과정의 결과로, 재생 (reparative)이나 반응 과정에서 기관이나 조직에 과도한 섬유성 결합조직이 형성되는 것을 의미한다. 간경변증과는 달리 가역적이고, 얇은 원섬유(thin fibril)로 구성되며, 결절(nodule) 형성이 없는 것으로 알려져 있고, 간 손상의 원인이 소실되면 정상회복이 가능할 수 있으나, 이러한 간 섬유증 과정이 반복적으로 지속되면 ECM(extra cellular matrix) 간의 교차결합(crosslinking)이 증가하여 결절(nodule)이 있는 비가역적인 간경변증으로 진행된다. 본 발명에 따른 조성물은 간섬유증에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 투여시 투여받은 개체에서 (i) 간 섬유화 개선; 및/또는 (ii) TGFβ, Col1a1, 또는 Col3a1의 발현 감소를 통해 간섬유증에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 본 발명에 따른 아디포넥틴 아날로그; 이를 포함하는 지속형 결합체; 또는 아실화된 아디포넥틴 아날로그를 포함하는 조성물은 간섬유증에 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에서 용어 "예방"은 상기 아디포넥틴 아날로그; 이를 포함하는 지속형 결합체; 아실화된 아디포넥틴 아날로그; 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 간섬유증을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어 "치료"는 상기 아디포넥틴 아날로그; 이를 포함하는 지속형 결합체; 아실화된 아디포넥틴 아날로그; 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 간섬유증의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 아디포넥틴 아날로그; 이를 포함하는 지속형 결합체; 또는 아실화된 아디포넥틴 아날로그의 사용은 혈중 노출도, 혈중 반감기 및 생체 내 효력 지속 효과의 획기적인 증가로 인해 매일 투여되야 하는 만성환자에게 투여 횟수를 감소시켜 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있는 큰 장점이 있다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 아디포넥틴 아날로그, 이의 지속형 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그를 약학적 유효량으로 포함할 수 있다. 여기서, 약학적 유효량으로 포함하는 것은, 아디포넥틴 아날로그, 이의 지속형 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그로 인한 목적하는 약리 활성(예를 들어, 간섬유증의 예방, 개선 또는 치료)을 얻을 수 있는 정도를 의미하고, 또한 투여되는 개체에서 독성 또는 부작용이 일어나지 않거나 미미한 수준으로서 약학적으로 허용되는 수준을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이와 같은 약학적 유효량은 투여 횟수, 환자, 제형 등을 종합적으로 고려하여 결정될 수 있다.

특별히 이에 제한되지 않으나, 본 발명의 상기 약학 조성물은 상기 성분 (유효성분)을 0.01 내지 99% 중량 대 부피로 함유할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용가능한 담체, 또는 희석제는 비자연적으로 발생된 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용을 일으키지 않는 것을 의미하며, 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 아디포넥틴 아날로그; 이를 포함하는 지속형 결합체; 또는 아실화된 아디포넥틴 아날로그를 포함한 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 상기 부형제는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 경구 투여 시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 인산칼슘, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

또한, 상기 조성물은 약학 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제, 구체적으로는 단백질 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여 방법을 이용하여 경구, 또는 피부, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 수막강 내, 심실 내, 폐, 경피, 피하, 복 내, 비강 내, 소화관 내, 국소, 설하, 질 내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구 투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 결합체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타티온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트제, 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers) 등이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 아디포넥틴 아날로그; 이를 포함하는 지속형 결합체; 또는 아실화된 아디포넥틴 아날로그; 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간섬유증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 아디포넥틴 아날로그, 이의 지속형 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그, 이를 포함하는 조성물, 간섬유증 예방 및 치료에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 상기 개체는, 간섬유증이 발병하였거나 의심되는 개체로서, 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유 동물을 의미하나, 본 발명의 아디포넥틴 아날로그, 이의 지속형 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그, 또는 이를 포함하는 상기 조성물로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다.

본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질(예를 들어, 아디포넥틴 아날로그, 이의 지속형 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그)을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 생체 내 표적에 도달할 수 있는 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 예를 들어 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 또는 직장 내 투여 등이 될 수 있다.

본 발명의 방법은 상기 아디포넥틴 아날로그, 이의 지속형 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그, 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서, 투여시 투여량과 횟수는 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 상기 아디포넥틴 아날로그, 이의 지속형 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그를 약학적 유효량으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 아디포넥틴 아날로그, 이의 지속형 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그를 약학적 유효량으로 포함하는 것은, 아디포넥틴 아날로그, 이의 지속형 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그로 인한 목적하는 약리 활성을 얻을 수 있는 정도를 의미하고, 또한 투여되는 개체에서 독성 또는 부작용이 일어나지 않거나 미미한 수준으로서 약학적으로 허용되는 수준을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이와 같은 약학적 유효량은 투여 횟수, 환자, 제형 등을 종합적으로 고려하여 결정될 수 있다.

특별히 이에 제한되지 않으나, 본 발명의 상기 약학 조성물은 상기 성분 (유효성분)을 0.01 내지 99% 중량 대 부피로 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 아디포넥틴 아날로그, 이의 지속형 결합체, 또는 아실화된 아디포넥틴 아날로그의 바람직한 전체 용량은 하루에 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 mg 내지 500 mg일 수 있다. 그러나 상기 아디포넥틴 아날로그, 이의 지속형 결합체, 또는 아실화된 아디포넥틴 아날로그의 용량은 약학 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 조성물의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 약학 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하여, 본 발명의 약학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다. 상기 약학 조성물은 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 또는 직장 내 투여 경로로 투여되는 것일 수 있으나, 목적하는 약리 효과를 얻을 수 있다면 특정 투여 경로로 제한되지 않는다.

한 예로, 본 발명의 약학 조성물은 1주에 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 또는 1개월에 1회 투여되는 것일 수 있고, 또는 1주 내지 1개월 범위의 시간 간격으로 1회 또는 다회 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 간섬유증의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 상기 아디포넥틴 아날로그, 이의 지속형 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그, 또는 이를 포함하는 조성물의 용도이다.

상기 아디포넥틴 아날로그, 이의 지속형 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그, 또는 이를 포함하는 조성물, 간섬유증의 예방, 치료, 투여 경로 및 투여 횟수에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 아디포넥틴 아날로그, 이의 지속형 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그, 또는 이를 포함하는 조성물의 간섬유증의 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.

상기 아디포넥틴 아날로그, 이의 지속형 결합체, 아실화된 아디포넥틴 아날로그, 또는 이를 포함하는 조성물, 간섬유증의 예방, 치료, 투여 경로 및 투여 횟수에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

한편, 본원 명세서에서 문맥상 달리 요구하지 않는 한, “포함한다”, “포함하는”, “함유하는”, 등의 표현은 명시된 정수(integer) 또는 정수 그룹의 포함을 의미하지만, 다른 정수 또는 정수의 집합을 배제하는 것이 아니라고 이해되어야 한다.　

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 아디포넥틴 아날로그 펩타이드의 설계

천연형 및 기존에 알려진 아디포넥틴 아날로그(BHD1028, 엔큐라젠; 서열번호 94) 대비 치료 효력이 높은 아디포넥틴 아날로그를 제조하고자 하였다. 천연형 아디포넥틴의 활성 서열(서열번호 1; KFHCNIPGLYYFAYHITV)에서 아미노산 치환, 서열의 연장, 삽입, 일부 서열의 반복 등을 수행하여 천연형 및 기존에 알려진 아디포넥틴 아날로그에 비해 높은 활성을 갖는 아디포넥틴 아날로그를 제조하였다.

이와 같은 과정을 통해 제조된 아디포넥틴 아날로그의 서열은 다음과 같다.

[표 1]

상기 표 1에서, Aib는 2-Aminoisobutyric acid, NL은 노르류신(Norleucine), HyP는 하이드록시프롤린(Hydroxyproline), NV는 노르발린(Norvaline), NH ₂ 는 아날로그의 C-말단이 아미드화된 것을 의미한다.

실시예 2: 아디포넥틴 아날로그 및 비교물질의 합성

상기 실시예 1에서 제조된 아디포넥틴 아날로그 및 비교물질(서열번호 94, BHD1028, 엔큐라젠)의 합성은 고체상 합성법을 이용하는 자동 펩타이드 합성기(Symphony X, Gyros Protein Tech.)를 이용하였다. C-말단의 카복실기를 유지하기 위하여 서열번호 3, 4, 5의 아날로그는 A-wang resin을, 그 외의 아날로그는 F-wang resin을 사용하였다. 각 아미노산을 C-말단에서 N-말단 순서로 합성하였다.

상기 합성된 아디포넥틴 아날로그 및 비교물질의 정제는 역상 크로마토그래피를 이용하였다. 합성된 펩타이드의 순도는 분석용 액상 크로마토그램 (RP-HPLC)를 이용하여 순도를 확인하였으며, 90%이상인 경우 실험에 사용 가능한 수준으로 판단하여 진행하였다. 또한, 액상 크로마토그램/질량분석기 (LC/MS)를 사용하여 펩타이드의 분자량 및 정보를 확인하였다.

합성된 펩타이드는 실험에 사용되기 전까지 -20℃에 보관하였다.

실시예 3: 아디포넥틴 아날로그들의 시험관내 상대 효력 확인

상기 실시예 2에서 얻은 신규 아디포넥틴 아날로그들의 BHD1028 비교물질에 대한 시험관 내 활성을 인간 간세포에서 TGFβ의 처리에 의해 유도되는 섬유화 반응을 억제하는 정도를 발광 분석 기법(bioluminescence assay)으로 평가하였다.

SMAD 2/3 반응 인자(response element)하의 루시퍼라아제 리포터 유전자를 안정적으로 발현하는 인간 간세포주인 SMAD/HepG2(미국 Signosis사)에 2배 연속희석법으로 희석된 아디포넥틴 아날로그 시험 물질 또는 비교물질을, 250 mM ~ 0.49 mM의 범위로 처리하였다. 3시간 후, 각 웰에 5 ng/mL 농도의 인간 TGFβ를 추가로 처리하여 16시간 동안 반응 시켰으며, 이후 발현된 루시퍼라아제의 발광 정도를 Dual-Luciferase^® Reporter Assay System(미국 Promega사 E1910)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.

측정된 값을 이용하여 비교물질과 신규 아디포넥틴 아날로그 시험 물질들의 처리 농도에 따른 발광도의 용량-반응 곡선을 그린 후, GraphPad 프로그램으로 반수저해농도(IC₅₀)를 산출하였으며 비교 물질의 IC₅₀을 시험 물질의 IC₅₀으로 나눈 몫을 백분율로 나타내었다.

[표 2] 비교물질에 대한 신규 아디포넥틴 아날로그의 시험관 내 활성

시험 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 신규 아디포넥틴 아날로그들은 대조군으로 사용한 비교물질에 비하여 약 2 ~ 15 배 가량 높은 시험관 내 활성을 나타내었으며 이를 통해 신규 아디포넥틴 아날로그들이 TGFβ 매개성 섬유화 반응을 개선할 수 있는 가능성을 확인하였다.

실시예 4: 아실화된 아디포넥틴 아날로그의 제조

상기 실시예에서 제조된 아디포넥틴 아날로그(서열번호 31, 44, 49)를 다음과 같은 두 가지 형태로 아실화 하였다. 첫째는 N-말단 아실화 형태이고, 둘째는 라이신 사이드체인(라이신 잔기의 측쇄 아민)의 아실화 형태이다.

아실화 되기 전 아디포넥틴 아날로그는 상기 실시예 2의 방법에 따라 합성하였으며, 합성시에는 Fmoc(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐) 보호된(protected) 아미노산, 펩타이드-resin 대비 4 당량), HOBt(1-히드록시벤조트리아졸, 펩타이드-resin 대비 8 당량), DIC (디이소프로필카르보디이미드, 펩타이드-resin 대비 8 당량)를 사용하고, Fmoc은 20% 피페리딘/DMF로 보호를 제거(deprotection)하였다. Fmoc 보호기는 자동 합성기에서 레진이 있는 반응 용기에 8 mL의 20% 피페리딘/DMF를 5분간 가하여 떼어내었으며 이 과정을 한번 더 반복하였다. 남아 있는 불순물을 제거하기 위해 각 과정 후에는 DMF 12 mL로 10초간 6회 세척하였다.

아디포넥틴 아날로그 N-말단에 하기 화학식 3-2와 같은 구조로 아실화하기 위해, Fmoc 보호기를 제거한 후 tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu (펩타이드-resin 대비 4당량), HOBt(펩타이드-resin 대비 8당량), DIC(펩타이드-resin 대비 8당량) 를 DMF 용매 하에 상온에서 30분동안 반응시켰다. 1회 반응 후, 동일한 양의 tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu, HOBt, DIC 및 DMF를 새 것으로 교체한 다음 상기 반응 과정을 1회 반복하였다.

[화학식 3-2]

상기 화학식 3-2에서 R은 아디포넥틴 아날로그를 나타낸다. 구체적으로는 상기 아디포넥틴 아날로그의 N 말단에 아실기가 부착된다.

반응 후 제거되지 않은 보호기는 레진에서 펩타이드가 절단될 때 함께 탈보호하여 N-말단에 아실화된 아디포넥틴 아날로그를 얻었다.

화학식 3-3과 같은 구조로 아디포넥틴 아날로그의 라이신 잔기의 측쇄 아민 아실화를 위해 아디포넥틴 아날로그의 라이신 잔기 합성 시 사용한 Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 대신 Fmoc-L-Lys[Oct-(otBu)-Glu-(otBu)-AEEA-AEEA]-OH(펩타이드-resin 대비 4당량) 를 사용하여 합성하였으며, 이후 과정은 상기 아실화 과정과 같은 방법으로 반응시켰다.

[화학식 3-3]

반응 후 제거되지 않은 보호기는 레진에서 펩타이드가 절단될 때 함께 탈보호하여 라이신 잔기의 측쇄 아민 아실화된 아디포넥틴 아날로그를 얻었다.

실시예 5: 아디포넥틴 아날로그의 지속형 결합체 제조

실시예 5-1: 아디포넥틴 아날로그의 페길화와 정제

상기 실시예 2에서 얻은 아디포넥틴 아날로그(서열번호 31)를 면역글로불린 Fc 영역에 결합한 지속형 결합체를 제조하기 위하여 아디포넥틴을 폴리에틸렌글리콜(PEG) 링커의 한 말단에 연결시킨 연결체를 먼저 제조하였다. PEG 링커로는 양 말단의 히드록시 수소가 프로필알데히드기로 개질된 변형 PEG로서 에틸렌글리콜 반복 단위의 화학식량이 3.4 kDa인 변형 PEG인 3.4K ALD-PEG-ALD(한국 한미정밀화학사) 혹은 양 말단의 히드록시 수소 중 하나를 프로필알데히드기로, 반대쪽을 3-디에톡시프로필로 개질한 변형 PEG로서 에틸렌글리콜 반복 단위의 화학식량이 3.4 kDa인 변형 PEG인 3.4K ALD-PEG-DEP(한국 한미정밀화학사)를 연결체 제조에 사용하였다. 아디포넥틴 아날로그의 아미노산 서열 N-말단에 페길화시키기 위하여, 아날로그와 PEG 링커의 몰비를 1:5~1:30, 아날로그의 농도를 1~5 mg/mL로 하여 상온 혹은 2~10℃에서 1~3시간 동안 반응시켰다. 이때, 반응은 환원제인 10~50 mM 시안화수소화붕소나트륨(sodium cyanoborohydride, 이하 SCB)의 존재 하에서 0~60% 아이소프로판올 혹은 0~60% 에탄올 혹은 10~60% 다이메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, 이하 DMSO))가 포함된 pH 6.0~8.0인 10~100 mM 농도의 인산칼륨(이하 K-P), 비스-트리스-하이드로클로라이드(이하 Bis-Tris-HCl) 혹은 트리스-하이드로클로라이드(이하 Tris-HCl) 완충액 내에서 수행되었다. 반응이 종결된 후, Source 15S (Cytiva), Source 15Q (Cytiva) 혹은 Source 15RPC (Cytiva)를 통하여 반응액을 정제하였고, 이로부터 모노-페길화된(monopegylated) 펩타이드를 수득하였다. 3.4K ALD-PEG-DEP를 사용한 경우 3-디에톡시프로필기의 가수분해를 위해 산성 완충액(pH 2.0) 상에서 밤새 방치하거나 50 mM 염산으로 완충제 교환을 해준다.

실시예 5-2: 아디포넥틴 아날로그-PEG-면역글로불린 Fc 결합체의 제조

상기 실시예 5-1을 통해 수득한 모노-페길화된 아디포넥틴 아날로그를 이합체 형태의 변형 면역글로불린 Fc 단편(대한민국 특허등록 제10-725315호에 따라 제조, 서열번호 96)과 1:2~1:10의 몰비로 혼합하고, 전체 펩타이드 농도를 1~20 mg/mL로 하여 상온 혹은 2~10℃에서 12~16시간 반응시켰다. 이때, 반응은 100 mM K-P pH 6.0~8.0 혹은 50 mM Bis-Tris pH 6.0~8.0에서 이루어졌으며, 0~20% IPA 혹은 0~20% 에탄올 및 환원제인 10~50 mM SCB를 첨가하여 반응시켰다. 반응이 종결된 후, 하기 조건에서 반응액은 Source 15Q 정제 컬럼 (Cytiva), Sephaedex 75 혹은 200 정제 컬럼 (Cytiva), Source 15 Phe 정제 컬럼 (Cytiva), Butyl-FF, Butyl-HP 정제 컬럼 (Cytiva)을 사용하여 정제하였다. 이로부터 아디포넥틴-3.4K PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 수득하였다.

실시예 6: 아디포넥틴 아날로그의 TAA 유도 간 섬유화 모델 마우스에서의 간 섬유화 개선 효력

상기 실시예 2에서 제조한 아디포넥틴 아날로그(서열번호 49)의 생체 내 (in vivo) 효력을 측정하기 위하여, 티오아세트아미드(Thioacetamide, TAA) 유도 간 섬유화 모델 마우스를 이용하였다.

7주령의 정상 수컷 C57BL/6 마우스 (대한바이오링크, 한국)를 이용하여 TAA를 50 ~ 400 mg/kg 용량으로 주 3회씩 총 12 주간 복강투여하여 TAA 유도 간 섬유화 모델을 만들었다. 약물의 투여는 TAA 투여 시작 2주 뒤부터, 군당 7마리씩 대조군인 G1(TAA 없이 비히클만 투여한 정상 마우스), TAA만 투여한 군인 G2(TAA 및 비히클 투여), TAA와 아디포넥틴 아날로그(서열번호 49) 투여군 G3(TAA 투여 및 아날로그 4823 mg/kg 1일 2회 투여)의 3개 군으로 나누었다. 상기 시험 물질은 2 % DMSO 함유 증류수 상태로 피하를 통해 투여하였다. 총 10주 투여 후 채혈 및 부검하였다. 얻어진 간 조직의 좌측 측면엽은 조직 병리학적 분석을 위해 포르말린으로 고정하였다. 나머지 간 조직은 무게를 측정하여 증류수를 넣고 파쇄하여 -80 ℃에서 보관하였다.

채혈된 혈액은 혈청 분리 튜브(BD bioscience, 미국)로 혈청 분리한 후, 분석 시점까지 -80 ℃에서 보관하였다.

다음으로 간 조직의 조직 병리학적 분석을 위하여, 포르말린에 고정한 조직 샘플을 파라핀 절편화하여 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin) 염색(H&E) 및 시리우스 레드(Sirius red)(미국 IHC World사 NovaUltra Sirius Red Stain Kit) 염색을 표준적인 프로토콜에 따라 진행하여 분석하였다. 간 조직내 섬유화 정도를 반영하는 시리우스 레드 염색 결과에서, 아디포넥틴 아날로그를 투여한 실험군은 대조군 대비하여 간 섬유화 지표(시리우스 레드 염색에 양성인 영역)가 현저히 개선되었다(도 1 참조).

다음으로, 간 섬유화 지표인 간 내 하이드록시프롤린(Hydroxyproline)의 양은 간 조직 파쇄물을 염산으로 가수분해하여 Hydroxyproline assay kit (네덜란드 Quickzyme Biosciences사, 카탈로그 번호 QZBHYPRO5)를 사용해 제조사의 프로토콜을 따라 측정하였다. 아디포넥틴 아날로그의 투여군은 대조군 대비하여 현저히 개선된 간 섬유화 지표를 보였다(도 2).

다음으로, 간 섬유화 지표 유전자의 발현을 확인하기 위하여, 정량 실시간 중합효소 연쇄 반응(quantitative Real-time PCR)을 통해 TGFβ 및 Col1a1, Col3a1 유전자의 발현을 측정하였다.

먼저, 간 조직에서 RNeasy mini kit (Qiagen, 74106)를 사용해 mRNA를 추출하고, iScript cDNA synthesis kit (Bio-rad, 1708891)을 사용해 cDNA로 합성하였다. cDNA 반응 조건은 제조사의 시험 프로토콜과 동일하게 사용하였다. 합성된 cDNA를 희석한 후, 2X Power SYBR™ Green PCR Master Mix (Applied biosystems, 4367659)를 사용하여 QuantStudio 6 FLEX (Thermofisher, 미국) 기기로 분석하였다. 반응에 사용한 프라이머의 서열은 다음과 같다.

TGFβ-forward(서열번호 117) : 5'- ACT GCT TCC CGA ATG TCT GAC GTA - 3'

TGFβ-reverse(서열번호 118) : 5'- TAA AGA GGT CAC CCG CGT GCT AAT - 3'

Col1a1-forward(서열번호 119) : 5'- AGA GCA TGA CCG ATG GAT TC - 3'

Col1a1-reverse(서열번호 120) : 5'- CCT TCT TGA GGT TGC CAG TC - 3'

Col3a1-forward(서열번호 121) : 5'- ACT GGG GAA ACA TGC ATA AA - 3'

Col3a1-reverse(서열번호 122) : 5'- GGC CAT AGC TGA ACT GAA AA - 3'

GAPDH-forward(서열번호 123) : 5'- CAA CAG CAA CTC CCA CTC TT - 3'

GAPDH-reverse(서열번호 124) : 5'- TGT TGC TGT AGC CGT ATT CA - 3'

중합효소 연쇄 반응 분석을 통해 얻어진 목적 유전자의 Ct 값을 대조군 유전자인 GAPDH의 Ct 값으로 보정한 뒤 (ΔΔCt법), G1 그룹의 발현 양을 100%로 환산하여 상대 발현 양을 나타내었다.

서열번호 49의 아디포넥틴 아날로그를 투여한 G2 그룹은, 대조군 대비하여 간 섬유화 지표 유전자 발현 양이 현저히 감소한 것을 확인하였다 (도 3).

도 1 내지 3의 실험 결과의 통계학적 유의성은 One-way ANOVA 분석을 통하여, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001로 나타내었다.

아디포넥틴 아날로그의 시험관 내 활성은 표 2와 같이, 본 발명에 따른 신규 아디포넥틴 아날로그는 기존에 이용되는 아디포넥틴인 비교물질에 비해 우수한 활성을 나타내며, 특히 서열번호 49의 아디포넥틴 아날로그는 비교물질에 비하여 약 15배 높은 시험관 내 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.

또한 본 발명에 따른 아디포넥틴 아날로그를 이용한 간 섬유화 동물 모델 시험에서, 도 1 내지 3의 시험 결과에서 명시된 바와 같이, 본 발명에 따른 아디포넥틴 아날로그는 간 섬유화 모델 마우스에서 간 섬유증을 현저히 개선하는 효력이 있음을, 조직 병리학적 분석 및 간 조직내 섬유화 지표 및 유전자 발현 분석을 통해 확인하였다. 이를 통해 아디포넥틴 아날로그는 간 섬유증 개선에 효력이 있음을 시사하는 바이다.

상기와 같은 실험 결과로부터 본 발명에 따른 아디포넥틴 아날로그는 천연형 아디포넥틴 또는 기존에 알려진 아디포넥틴에 비해 높은 활성을 가져, 치료제로서 유리한 이점을 갖는 것을 확인하였으며, 특히 간 섬유증에 대한 우수한 치료제로 이용될 수 있는 가능성을 시사하는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> HANMI PHARM. CO., LTD. <120> Novel adiponectin analog and conjugate comprising the same <130> PN141289 <160> 124 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Active sequence of natural adiponectin <400> 1 Lys Phe His Cys Asn Ile Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe Ala Tyr His Ile 1 5 10 15 Thr Val <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <400> 2 Pro Tyr Tyr Phe Ala Tyr His Pro Gln Ile Pro Gly Leu Phe Tyr Phe 1 5 10 15 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <400> 3 Pro Phe Tyr Phe Lys Tyr His Pro Gln Ile Pro Gly Leu Phe Tyr Phe 1 5 10 15 Ala <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <400> 4 His Phe Tyr Phe Ala Tyr His Pro Gln Ile Pro Lys Leu Phe Tyr Phe 1 5 10 15 Ala <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is Norvaline (NV) <400> 5 Pro Phe Tyr 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Pro Gln Ile Pro Phe Leu Phe Tyr Phe 1 5 10 15 Ala <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is Norvaline (NV) <400> 21 Pro Phe Tyr Phe Val Tyr His Pro Gln Ile Pro Xaa Leu Phe Tyr Phe 1 5 10 15 Ala Cys <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <400> 22 His His His Phe Tyr Phe Ala Tyr His Pro Gln Ile Pro Lys Leu Phe 1 5 10 15 Tyr Phe Ala <210> 23 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <400> 23 His Phe Tyr Phe Ala Tyr His Pro Gln Ile Pro Lys Leu Phe Tyr Phe 1 5 10 15 Ala His Ile Thr 20 <210> 24 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is Norvaline (NV) <400> 24 His His Pro Phe Tyr Phe Ala Tyr His Pro Gln Ile Pro Xaa Leu Phe 1 5 10 15 Tyr Phe Ala <210> 25 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog 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Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 37 Pro Ser Thr Glu His Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe 1 5 10 15 Leu Phe Tyr Phe Ala 20 <210> 38 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 38 Pro Ser Asp Glu His Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe 1 5 10 15 Leu Phe Tyr Phe Ala 20 <210> 39 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 39 Pro Ser Thr Glu Tyr His Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro 1 5 10 15 Phe Leu Phe Tyr Phe Ala 20 <210> 40 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 40 Pro Ser Thr Glu Tyr Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe 1 5 10 15 Leu Phe Tyr Phe Ala 20 <210> 41 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 41 Pro Gly Ser Asp Glu His Phe Tyr Phe Xaa Tyr Phe Pro Glu Ile Pro 1 5 10 15 Phe Leu Phe Tyr Phe Ala 20 <210> 42 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Alanine at the C-terminal of the sequence is amidated Alanine (Alanine-NH2) <400> 42 His Glu His His Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Phe Ala 20 <210> 43 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> Alanine at the C-terminal of the sequence is amidated Alanine (Alanine-NH2) <400> 43 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His 1 5 10 15 Glu His His Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu Phe 20 25 30 Tyr Phe Ala 35 <210> 44 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 44 Phe Thr Xaa Ile Phe Tyr Asp Glu Glu Asp His Glu His His Phe Tyr 1 5 10 15 Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu Phe Tyr Phe Ala 20 25 30 <210> 45 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 45 Pro Gly Phe Thr Xaa His Phe Tyr Asp Xaa Glu Asp His Glu His Tyr 1 5 10 15 Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu Phe Tyr Phe Ala 20 25 30 <210> 46 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is 2-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 46 Pro Xaa Gly Phe Tyr Pro His Phe Tyr Tyr Xaa Glu Asp Tyr Glu His 1 5 10 15 Tyr Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu Phe Tyr Phe 20 25 30 Ala <210> 47 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 47 Pro Ser Gly Phe Tyr Pro His Phe Tyr Phe Xaa Glu Asp His Glu Phe 1 5 10 15 Tyr Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu Phe Tyr Phe 20 25 30 Ala <210> 48 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 48 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Norleucine (NL) <400> 51 Tyr Ala Gly Glu Thr His Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro 1 5 10 15 Phe Leu Phe Tyr Phe Ala 20 <210> 52 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is Hydroxyproline (HyP) <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 52 Xaa Thr Ser Gly His Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe 1 5 10 15 Leu Phe Tyr Phe Ala 20 <210> 53 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 53 Met Pro Ile Xaa Phe Thr Xaa Ile Phe Tyr Asp Xaa Glu Asp His Glu 1 5 10 15 His His Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu Phe Tyr 20 25 30 Phe Ala <210> 54 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misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 56 Phe Tyr Asp Glu Glu Asp His Glu His His Phe Tyr Phe Xaa Tyr His 1 5 10 15 Pro Glu Ile Pro Phe Leu Phe Tyr Phe Ala 20 25 <210> 57 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 57 Phe Thr Xaa Ile Phe Tyr His Glu Glu Asp His Glu Asp His Phe Tyr 1 5 10 15 Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu Phe Tyr Phe Ala 20 25 30 <210> 58 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 58 Phe Thr Xaa Ile Phe Tyr Asp Glu Glu Asp His Glu His His Phe Tyr 1 5 10 15 Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu Phe Tyr Phe Ala Tyr His 20 25 30 Ile Thr <210> 59 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 59 His Glu His Tyr Phe Thr Xaa Ile Phe Tyr Asp Glu Glu Asp His Glu 1 5 10 15 His His Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu Phe Tyr 20 25 30 Phe Ala <210> 60 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 60 His Glu His His Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Phe Ala Tyr His Ile Thr Val Tyr Met Lys Asp Val Lys Val 20 25 30 Ser Leu <210> 61 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 61 Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu His Glu His His Phe Tyr 1 5 10 15 Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile 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<222> (8)..(8) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 73 Phe Thr Xaa His Phe Tyr Asp Xaa Glu Asp His Glu His Tyr Phe Tyr 1 5 10 15 Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu Phe Tyr Phe Ala 20 25 30 <210> 74 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> Xaa is Hydroxyproline (HyP) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa is Hydroxyproline (HyP) <400> 74 Phe Thr Xaa Ile Phe Tyr Asp Glu Glu Asp His Glu His His Phe Tyr 1 5 10 15 Phe Xaa Tyr His Xaa Glu Ile Xaa Phe Leu Phe Tyr Phe Ala 20 25 30 <210> 75 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Xaa is Hydroxyproline (HyP) <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Xaa is Hydroxyproline (HyP) <400> 75 Gly Gly Gly Gly Ser Phe Thr Xaa Ile Phe Tyr Asp Glu Glu Asp His 1 5 10 15 Glu His His Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Xaa Glu Ile Xaa Phe Leu Phe 20 25 30 Tyr Phe Ala 35 <210> 76 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa is Hydroxyproline (HyP) <400> 76 Phe Thr Xaa Ile Phe Tyr Asp Glu Glu Asp His Glu His His Phe Tyr 1 5 10 15 Phe Xaa Tyr His Arg Arg Asp Xaa Glu Ile Pro Phe Leu Phe Tyr Phe 20 25 30 Ala <210> 77 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa is Hydroxyproline (HyP) <400> 77 Phe Thr Xaa Ile Phe Tyr Asp Glu Glu Asp His Glu His His Tyr Phe 1 5 10 15 Phe Xaa Tyr His Arg Arg Asp Xaa Glu Ile Pro Phe Leu Phe Tyr Phe 20 25 30 Ala <210> 78 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa is Hydroxyproline (HyP) <400> 78 Phe Thr Xaa Ile Phe Tyr Asp Glu Glu Asp His Glu His His Tyr Phe 1 5 10 15 Phe Xaa Tyr His Arg Arg Asp Xaa Glu Ile Pro Phe Leu Arg Tyr Phe 20 25 30 Ala <210> 79 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 79 Phe Thr Xaa Ile Phe Tyr Asp Glu Glu Asp His Glu His His Phe Gly 1 5 10 15 Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu Phe Gly Phe Ala 20 25 30 <210> 80 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 80 Phe Thr Xaa Ile Phe Tyr Asp Glu Glu Asp His Glu His His Phe Glu 1 5 10 15 Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu Phe Glu Phe Ala 20 25 30 <210> 81 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> Xaa is Hydroxyproline (HyP) <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Xaa is Hydroxyproline (HyP) <400> 81 Phe Thr Xaa Ile Gly Phe Tyr Asp Glu Glu Asp His Glu His His Phe 1 5 10 15 Tyr Phe Gly Xaa Tyr His Xaa Glu Ile Xaa Phe Leu Phe Gly Tyr Phe 20 25 30 Ala <210> 82 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa is Hydroxyproline (HyP) <400> 82 Phe Thr Xaa Ile Phe Tyr Asp Glu Glu Asp His Glu His His Phe Tyr 1 5 10 15 Phe Gly Xaa Tyr His Xaa Glu Ile Pro Phe Leu Phe Gly Tyr Phe Ala 20 25 30 <210> 83 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 83 His Glu His His Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Phe Ala Tyr 20 <210> 84 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 84 Phe Thr Xaa Ile Glu His His Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile 1 5 10 15 Pro Phe Leu Phe Tyr Phe Ala 20 <210> 85 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 85 Tyr Tyr Phe Xaa Tyr Glu His His Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu 1 5 10 15 Ile Pro Phe Leu Phe Tyr Phe Ala 20 <210> 86 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 86 His Tyr Asp Gly Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Phe Ala 20 <210> 87 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 87 Tyr Asp Gly Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu Phe 1 5 10 15 Tyr Phe Ala <210> 88 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 88 His Asp Gly Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu Phe 1 5 10 15 Tyr Phe Ala <210> 89 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 89 His Glu Ser Gly Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Phe Ala 20 <210> 90 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 90 His Glu Asp Pro Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Phe Ala 20 <210> 91 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 91 His Pro Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu Phe Tyr 1 5 10 15 Phe Ala <210> 92 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is Norleucine (NL) <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 92 Lys Glu His His Phe Tyr Phe Xaa Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Phe Ala 20 <210> 93 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Adiponectin analog <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is Norleucine (NL) <400> 93 Lys Ile Phe Tyr Asp Glu Glu Asp His Glu His His Phe Tyr Phe Xaa 1 5 10 15 Tyr His Pro Glu Ile Pro Phe Leu Phe Tyr Phe Ala 20 25 <210> 94 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> BHD1028 <400> 94 Tyr Tyr Phe Ala Tyr His Pro Asn Ile Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe 1 5 10 15 <210> 95 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> General Formula 1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Ra is represented by Xa1-Xa2-F-Xa3-Xa4-Y, wherein Xa1 is D, E, F, H, T, or Y; Xa2 is Y, E, G, or F; Xa3 is G or absent; and Xa4 is A, K, L, V, or Norleucine. <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Rb is represented by Xb1-Xb2-Xb3-Xb4-Xb5-Xb6,wherein Xb1 is E, F, H, S, or L; Xb2 is S, P, E, G, R, D, or Hydroxyproline(HyP); Xb3 is G, N, E, Q, R, K, Y, or absent; Xb4 is S, D, P, N, or absent; Xb5 is Q, Hydroxyproline(HyP), or absent; and Xb6 is E or absent <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Rc is represented by Xc1-Xc2, wherein Xc1 is P or Hydroxyproline(HyP); and Xc2 is F, Norleucine, Norvaline, G, or L. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Rd is represented by Xd1-Xd2-Xd3-Xd4-Xd5, wherein Xd1 is F, R, or Y; Xd2 is E, G, or Y; Xd3 is F or Y; and Xd4 is A, F, or absent, Xd5 is A, C, E, S, Y, or absent. <400> 95 Xaa Xaa Ile Xaa Leu Xaa 1 5 <210> 96 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Immunoglobulin Fc fragment <400> 96 Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220 <210> 97 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 97 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 98 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 98 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 99 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 99 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Pro 1 5 10 <210> 100 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 100 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser 1 5 10 <210> 101 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 101 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro 1 5 10 <210> 102 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 102 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser 1 5 <210> 103 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 103 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 1 5 <210> 104 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 104 Glu Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 1 5 <210> 105 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 105 Glu Ser Pro Ser Cys Pro 1 5 <210> 106 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 106 Glu Pro Ser Cys Pro 1 5 <210> 107 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 107 Pro Ser Cys Pro 1 <210> 108 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 108 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 109 Lys Tyr Gly Pro Pro Pro Ser Cys Pro 1 5 <210> 110 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 110 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Ser Cys Pro 1 5 <210> 111 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 111 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 1 5 <210> 112 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 112 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 113 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 113 Glu Ser Lys Pro Ser Cys Pro 1 5 <210> 114 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 114 Glu Ser Pro Ser Cys Pro 1 5 <210> 115 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 115 Glu Pro Ser Cys 1 <210> 116 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hinge sequence <400> 116 Ser Cys Pro 1 <210> 117 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TGFβ-forward <400> 117 actgcttccc gaatgtctga cgta 24 <210> 118 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TGFβ-reverse <400> 118 taaagaggtc acccgcgtgc taat 24 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Col1a1-forward <400> 119 agagcatgac cgatggattc 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Col1a1-reverse <400> 120 ccttcttgag gttgccagtc 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Col3a1-forward <400> 121 actggggaaa catgcataaa 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Col3a1-reverse <400> 122 ggccatagct gaactgaaaa 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> GAPDH-forward <400> 123 caacagcaac tcccactctt 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> GAPDH-reverse <400> 124 tgttgctgta gccgtattca 20

Claims (37)

1. 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그(adiponectin analog):
   [일반식 1]
   Ra-Rb-I-Rc-L-Rd (서열번호 95)
   상기 일반식 1에서,
   Ra는 Xa1-Xa2-F-Xa3-Xa4-Y로 나타내어지고, 여기서
   Xa1은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 트레오닌(T), 또는 티로신(Y)이고,
   Xa2는 티로신(Y), 글루탐산(E), 글리신(G), 또는 페닐알라닌 (F)이고,
   Xa3는 글리신(G) 또는 부존재이고,
   Xa4는 알라닌(A), 라이신(K), 류신(L), 발린(V), 또는 노르류신(NL)이고;
   Rb는 Xb1-Xb2-Xb3-Xb4-Xb5-Xb6로 나타내어지고, 여기서
   Xb1은 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 세린(S), 또는 류신(L)이고,
   Xb2는 세린(S), 프롤린(P), 글루탐산(E), 글리신(G), 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 또는 하이드록시프롤린(HyP)이고,
   Xb3는 글리신(G), 아스파라긴(N), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 라이신(K), 티로신(Y), 또는 부존재이고,
   Xb4는 세린(S), 아스파르트산(D), 프롤린(P), 아스파라긴(N), 또는 부존재이고,
   Xb5는 글루타민(Q), 하이드록시프롤린(HyP), 또는 부존재이고,
   Xb6는 글루탐산(E) 또는 부존재이고,
   Rc는 Xc1-Xc2로 나타내어지고, 여기서
   Xc1은 프롤린(P) 또는 하이드록시 프롤린(HyP)이고,
   Xc2는 페닐알라닌(F), 노르류신(NL), 노르발린(NV), 글리신(G), 또는 류신(L)이고;
   Rd는 Xd1-Xd2-Xd3-Xd4-Xd5로 나타내어지고, 여기서
   Xd1은 페닐알라닌(F), 아르기닌(R), 또는 티로신(Y)이고,
   Xd2는 글루탐산(E), 글리신(G), 또는 티로신(Y)이고,
   Xd3는 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y)이고,
   Xd4는 알라닌(A), 페닐알라닌(F), 또는 부존재이고,
   Xd5는 알라닌(A), 시스테인(C), 글루탐산(E), 세린(S), 티로신(Y), 또는 부존재이다.
   
2. 청구항 1에 있어서, 상기 아디포넥틴 아날로그는
   Ra는 DYFAY, EYFAY, FEFNLY, FGFNLY, FYFNLY, FYFAY, FYFGNLY, FYFKY, FYFLY, FYFVY, HYFAY, TFFAY, YFFNLY, YYFNLY, 및 YYFAY 중 어느 하나이고;
   Rb는 ESGSQ, FPE, HHyPE, HDN, HEN, HGN, HP, HPD, HPE, HPK, HPKN, HPQ, HPQSQ, HRNPQ, HRRDHyPE, LDE, 및 SDYSQ 중 어느 하나이고;
   Rc는 HyPF, PNL, PNV, PF, PG, 및 PL 중 어느 하나이고;
   Rd는 FEFA, FGFA, FGYFA, FYF, FYFA, FYFAC, FYFAE, FYFAS, FYFAY, RYFA, 및 YYF 중 어느 하나; 인 것인, 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 아날로그.
   
3. 청구항 1에 있어서, 아디포넥틴 아날로그는
   Ra는 FYFNLY, FYFAY, FYFGNLY, 또는 YYFNLY이고;
   Rb는 HHyPE, HP, HPE, 또는 HPQ이고;
   Rc는 HyPF, PNV, PF, 또는 PG이고;
   Rd는 FGYFA, FYFA, FYFAE, 또는 FYFAY; 인 것인, 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 아날로그.
   
4. 청구항 1에 있어서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 것인, 아날로그.
   
5. 청구항 1에 있어서, 상기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그는 N-말단에 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열이 추가로 결합된 것인, 아날로그:
   H, HP, HDG, HHH, HHP, HEDP, HEHH, HEHP, HEHYFTNLIFYDEEDHEHH, HESG, HSHH, HSHP, HYDG, HAibEG, 또는 HyPTSGH;
   P, PSEH, PSTEH, PSTEY, PSTEYH, PSDEH, PGSDEH, PFTNLIFYDEEDHEHH, PSGFYPHFYFNLEDHEFY, PAibGFYPHFYYNLEDYEHY, 또는 PGFTNLHFYDNLEDHEHY;
   FTNLIEHH, FYDEEDHEHH, FNLYHPEIPFLHEHH, FTNLIFYDEEDHEHH, FTNLIFYHEEDHEDH, FTNLIGFYDEEDHEHH, FTNLHFYDNLEDHEHY, FYFNLYHPEIPFLFYFAEHH, 또는 FYFNLYHPFYFNLYHPFYFNLYHP;
   YDG, YAGETH, YYFNLYEHH, YYFNLYHPEIPFLFYFA, YYFNLYHPEIPFLFYFAEHH, 또는 YYFNLYLDEIPFLFYFAEHH;
   GGGGSFTNLIFYDEEDHEHH, GGGGSGGGGSGGGGSHEHH, 또는 GIPGHPGHNGAPGEHH;
   MPINLFTNLHFYDNLEDHEHY 또는 MPINLFTNLIFYDNLEDHEHH; 또는
   KEHH 또는 KIFYDEEDHEHH.
   
6. 청구항 1에 있어서, 상기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그는 N-말단에 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열이 추가로 결합된 것인, 아디포넥틴 아날로그:
   H, HP, 또는 HEHH, HEHYFTNLIFYDEEDHEHH;
   P 또는 PSTEY;
   FTNLIEHH, FNLYHPEIPFLHEHH, FTNLIFYDEEDHEHH, FTNLIFYHEEDHEDH, FTNLIGFYDEEDHEHH, FTNLHFYDNLEDHEHY, FYFNLYHPEIPFLFYFAEHH, 또는 FYFNLYHPFYFNLYHPFYFNLYHP;
   YYFNLYEHH, YYFNLYHPEIPFLFYFA, 또는 YYFNLYHPEIPFLFYFAEHH;
   GGGGSFTNLIFYDEEDHEHH, GGGGSGGGGSGGGGSHEHH.
   
7. 청구항 1에 있어서, 상기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그는 C-말단에 다음 중 어느 하나의 아미노산 서열이 추가로 결합된 것인, 아날로그:
   HIT;
   HITVYMKDVKVSL; 또는
   IPFLFYFAEIPFLFYFA.
   
8. 청구항 1에 있어서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 C-말단이 아미드화된 것인, 아날로그.
   
9. 청구항 1에 있어서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 42 내지 63, 및 서열번호 65 내지 93으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 아날로그.
   
10. 청구항 1에 있어서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 31, 서열번호 40, 서열번호 42 내지 44, 서열번호 48 내지 50, 서열번호 57 내지 63, 서열번호 66, 서열번호 73 내지 75, 서열번호 81 내지 85, 및 서열번호 91으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 아날로그.
    
11. 청구항 1에 있어서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 31, 서열번호 44, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 66, 서열번호 74, 및 서열번호 75으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 아날로그.
    
12. 청구항 1에 있어서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 3, 서열번호 6 내지 28, 서열번호 30, 서열번호 32 내지 36, 서열번호 38, 및 서열번호 41로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 아날로그.
    
13. 청구항 1에 있어서, 하기 일반식 2의 아미노산 서열을 포함하는, 아디포넥틴 아날로그:
    [일반식 2]
    X1-Y-F-X2-Y-X3-X4-X5-X6-I-P-X7-L-F-Y-F-X8
    상기 일반식 2에서,
    X1은 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y)이고,
    X2는 알라닌(A), 라이신(K), 류신(L), 발린(V), 또는 노르류신(NL)이고;
    X3은 히스티딘(H) 또는 류신(L)이고,
    X4는 프롤린(P) 또는 아스파르트산(D)이고,
    X5는 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 부존재이고,
    X6는 아스파르트산(D) 또는 부존재이고,
    X7는 페닐알라닌(F), 노르류신(NL), 노르발린(NV), 글리신(G), 또는 류신(L)이고;
    X8는 알라닌(A) 또는 부존재이다.
    
14. 청구항 1에 있어서, 하기 일반식 3의 아미노산 서열을 포함하는, 아디포넥틴 아날로그:
    [일반식 3]
    X9-Y-F-NL-Y-H-P-E-I-P-F-L-F-Y-F-A-X10
    상기 일반식 3에서,
    X9는 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y)이고,
    X10은 글루탐산(E) 또는 부존재이다.
    
15. 청구항 1에 있어서, 하기 일반식 4의 아미노산 서열을 포함하는, 아디포넥틴 아날로그:
    [일반식 4]
    X11-X12-F-X13-NL-Y-H-X14-X15-X16-X17-X18-I-X19-F-L-F-X20-X21-X22-X23
    상기 일반식 4에서,
    X11은 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y)이고,
    X12는 티로신(Y) 또는 페닐알라닌(F)이고,
    X13는 글리신(G) 또는 부존재이고,
    X14는 프롤린(P), 아르기닌(R), 또는 하이드록시프롤린(HyP)이고,
    X15는 글루탐산(E) 또는 아르기닌(R)이고,
    X16는 아스파르트산(D) 또는 부존재이고,
    X17는 하이드록시프롤린(HyP) 또는 부존재이고,
    X18는 글루탐산(E) 또는 부존재이고,
    X19은 프롤린(P) 또는 하이드록시 프롤린(HyP)이고,
    X20는 글리신(G) 또는 티로신(Y)이고,
    X21는 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y)이고,
    X22는 알라닌(A) 또는 페닐알라닌(F)이고,
    X23는 알라닌(A) 또는 부존재이다.
    
16. 서열번호 2 내지 93으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 아디포넥틴 아날로그.
    
17. 하기 화학식 1로 표시되는 아디포넥틴 아날로그를 포함하는 지속형 결합체:
    [화학식 1]
    X - La - F
    여기서,
    X는, 아디포넥틴 아날로그 (adiponectin analog)이고;
    L은, 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커이며;
    a는, 0 또는 자연수이며, 다만 a가 2 이상일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고;
    F는, 이합체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
    -는 X와 L 사이, L과 F 사이의 공유결합 연결을 나타냄.
    
18. 청구항 17에 있어서, 상기 아디포넥틴 아날로그는
    하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는
    지속형 결합체:
    [일반식 1]
    Ra-Rb-I-Rc-L-Rd (서열번호 95)
    상기 일반식 1에서,
    Ra는 Xa1-Xa2-F-Xa3-Xa4-Y 로 나타내어지고, 여기서
    Xa1은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 트레오닌(T), 또는 티로신(Y)이고,
    Xa2는 티로신(Y), 글루탐산(E), 글리신(G), 또는 페닐알라닌 (F)이고,
    Xa3는 글리신(G) 또는 부존재이고,
    Xa4는 알라닌(A), 라이신(K), 류신(L), 발린(V), 또는 노르류신(NL)이고;
    Rb는 Xb1-Xb2-Xb3-Xb4-Xb5-Xb6 로 나타내어지고, 여기서
    Xb1은 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 세린(S), 또는 류신(L)이고,
    Xb2는 세린(S), 프롤린(P), 글루탐산(E), 글리신(G), 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 또는 하이드록시프롤린(HyP)이고,
    Xb3는 글리신(G), 아스파라긴(N), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 라이신(K), 티로신(Y), 또는 부존재이고,
    Xb4는 세린(S), 아스파르트산(D), 프롤린(P), 아스파라긴(N), 또는 부존재이고,
    Xb5는 글루타민(Q), 하이드록시프롤린(HyP), 또는 부존재이고,
    Xb6는 글루탐산(E) 또는 부존재이고;
    Rc는 Xc1-Xc2 로 나타내어지고, 여기서
    Xc1은 프롤린(P) 또는 하이드록시 프롤린(HyP)이고,
    Xc2는 페닐알라닌(F), 노르류신(NL), 노르발린(NV), 글리신(G), 또는 류신(L)이고;
    Rd는 Xd1-Xd2-Xd3-Xd4-Xd5 로 나타내어지고, 여기서
    Xd1은 페닐알라닌(F), 아르기닌(R), 또는 티로신(Y)이고,
    Xd2는 글루탐산(E), 글리신(G), 또는 티로신(Y)이고,
    Xd3는 페닐알라닌(F) 또는 티로신(Y)이고,
    Xd4는 알라닌(A), 페닐알라닌(F), 또는 부존재이고,
    Xd5는 알라닌(A), 시스테인(C), 글루탐산(E), 세린(S), 티로신(Y), 또는 부존재이다.
    
19. 청구항 18에 있어서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 31, 서열번호 40, 서열번호 42 내지 44, 서열번호 48 내지 50, 서열번호 57 내지 63, 서열번호 66, 서열번호 73 내지 75, 서열번호 81 내지 85, 및 서열번호 91으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 지속형 결합체.
    
20. 청구항 18에 있어서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 6 내지 30, 서열번호 32 내지 39, 서열번호 41, 서열번호 45 내지 47, 서열번호 51 내지 56, 서열번호 65, 서열번호 67 내지 72, 서열번호 76 내지 80, 서열번호 86 내지 90, 서열번호 92, 및 서열번호 93으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 지속형 결합체.
    
21. 청구항 18에 있어서, 상기 아디포넥틴 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 것인, 지속형 결합체.
    
22. 청구항 17에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 하이브리드(hybrid)인, 지속형 결합체.
    
23. 청구항 17에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역인, 지속형 결합체.
    
24. 청구항 17에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 것인, 지속형 결합체.
    
25. 청구항 17에 있어서, 상기 L은 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하고, 상기 에틸렌글리콜 반복 단위 부위(moiety)의 화학식량은 1 내지 100 kDa 범위에 있는, 지속형 결합체.
    
26. 청구항 25에 있어서, 상기 L은 폴리에틸렌글리콜 링커로서 분자량 2 kDa 내지 30 kDa을 갖는 링커인, 지속형 결합체.
    
27. 청구항 17에 있어서, 상기 지속형 결합체는 상기 이합체 형태 면역글로불린 Fc 영역 중 하나의 Fc 영역에 X 한 분자가 상기 폴리에틸렌글리콜 링커를 통하여 서로 공유결합적으로 연결된, 지속형 결합체.
    
28. 청구항 17에 있어서, 상기 L의 한쪽 말단이 F의 아민기 또는 티올기와, L의 다른 말단이 X의 아민기 또는 티올기에 각각 반응하여 형성된 공유결합으로 F 및 X에 각각 연결되어 있는, 지속형 결합체.
    
29. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 아디포넥틴 아날로그에 아실기가 부착된 아실화된 아디포넥틴 아날로그.
    
30. 청구항 29에 있어서, 상기 아실화된 아디포넥틴 아날로그는 1개 또는 2개의 카보실산을 포함한 C₁-C₄₀ 직쇄 또는 분지쇄 아실기로 아실화된 것인, 아날로그.
    
31. 청구항 30에 있어서, 상기 아실기는 C₄ 내지 C₄₀ 지방산 또는 다이카복실산인, 아날로그.
    
32. 청구항 31에 있어서, 상기 아실기는 하기 화학식 3-1로 나타내어지는 것인, 아날로그:
    [화학식 3-1]
    

    

    .
    
33. 청구항 29에 있어서, 상기 아실화된 아디포넥틴 아날로그는 링커를 추가로 포함하는 것인, 아날로그.
    
34. 청구항 33에 있어서, 상기 링커는 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 것인, 아날로그.
    
35. 청구항 29에 있어서, 상기 아실기가 아디포넥틴 아날로그의 아미노산 서열의 N 말단; 또는 아디포넥틴 아날로그 아미노산 서열에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 아민; 에 부착되는 것인, 아날로그.
    
36. 약학적 유효량의 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 아디포넥틴 아날로그; 청구항 17 내지 28 중 어느 한 항의 지속형 결합체; 또는 청구항 29 내지 34 중 어느 한 항의 아실화된 아디포넥틴 아날로그를 포함하는 간섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    
37. 청구항 34에 있어서, 상기 약학 조성물은 하기 특성 중 하나 이상의 특성을 나타내는 것인, 조성물:
    (i) 간 섬유화 개선; 및
    (ii) TGFβ, Col1a1, 또는 Col3a1의 발현 감소.
    
    

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