CN116322645A - Glp-2的长效缀合物的液体制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及胰高血糖素样肽‑2(GLP‑2)的长效缀合物的液体制剂及制备其的方法。

Description

GLP-2的长效缀合物的液体制剂
[技术领域]
本发明涉及胰高血糖素样肽-2(GLP-2)的长效缀合物的液体制剂以及制备其的方法。
[背景技术]
胰高血糖素样肽-2(GLP-2)是由33个氨基酸组成的肽，它由小肠中的L细胞响应摄入的营养物质而产生，并显示出作为用于肠道疾病、肠道损伤和胃病的治疗剂的高潜力。
然而，GLP-2在被开发成商业药物方面仍具有局限性。肽(诸如GLP-2)可由于稳定性低而容易变性，由于在体内被蛋白酶降解而失去活性，并且由于其尺寸相对较小而容易通过肾脏排出。因此，为了保持含有肽作为药理成分的药物的血液浓度和滴度，需要更频繁地施用肽药物。然而，大多数肽药物主要以注射的形式施用，并且需要频繁注射以维持生理活性肽的血液浓度，这造成患者剧烈疼痛。特别地，GLP-2具有极短的体内半衰期(7分钟或更短)，这是由于二肽基肽酶-IV(DPP IV)使GLP-2的滴度损失，二肽基肽酶-IV(DPP IV)在GLP-2的位置2(Ala)和位置3(Asp)处的氨基酸之间进行切割(Bolette H.et al.,TheJournal of Clinical Endocrinology&Metabolism.85(8):2884–2888,2000)。因此，为了增加GLP-2的生理活性半衰期，本发明人开发了GLP-2的长效缀合物(韩国特许专利公开号10-2010-0104382)。
然而，仍然需要开发可以长时间储存GLP-2的长效缀合物的稳定的液体制剂。具体而言，为了将含有GLP-2的长效缀合物的药物供应给药物产品，有必要保持其在体内的药效，同时在贮存和运输期间抑制物理化学变化，诸如光、热或添加剂中的杂质引起的变性、附聚、吸附或水解。尽管液体制剂的温度、pH和添加剂影响降解产物的产生速率，但稳定所有蛋白质以便其可以应用于临床实践的组合物尚不清楚，并且在许多情况下，在特定蛋白质中表现出稳定化作用的液体组合物可能不能应用于其他蛋白质的稳定。本领域已知的是为了最大化靶蛋白在液相中的稳定性，能够最小化蛋白质的特定降解产物的产生速率的因素和添加剂及其组合的选择需要广泛地预先确定。
特别地，在体内具有增加的耐久性和稳定性的GLP-2的长效缀合物的情况下，因为GLP-2、生理活性肽和免疫球蛋白Fc片段连接，分子量和体积比GLP-2的分子量和体积显著增加，因此，特殊的组合物对蛋白质稳定是必需的。此外，因为GLP-2、生理活性肽和免疫球蛋白Fc片段是具有不同物理化学特性的肽或蛋白质，生理活性肽GLP-2和免疫球蛋白Fc片段必须同时被稳定化。然而，不同的肽或蛋白质由于其物理化学差异，在储存期间可以以不同的速率以及在不同的条件下逐步失活，并且当适用于每种肽或蛋白质的稳定剂组合使用时，由于相互竞争和副作用，可以出现与预期的那些不同的不良反应。进一步，在储存期间，储存的蛋白质的性质或浓度可以改变，这导致不同的作用。因此，在GLP-2的长效缀合物的情况下，很难找到同时稳定化生理活性肽GLP-2和免疫球蛋白Fc片段的稳定剂的组合物。
[公开内容]
[技术问题]
本发明的一个目的是提供胰高血糖素样肽-2(GLP-2)的长效缀合物的液体制剂。
本发明的另一个目的是提供制备液体制剂的方法。
[技术方案]
本发明的一个方面提供了胰高血糖素样肽-2(GLP-2)的长效缀合物的液体制剂。
在一个实施方式中，本发明涉及GLP-2的长效缀合物的液体制剂，其包括：
GLP-2的长效缀合物，其中GLP-2和免疫球蛋白Fc片段以药理学有效量彼此连接，和
稳定剂，其包括糖醇、糖类或其组合；和缓冲剂。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，GLP-2的长效缀合物的特征在于其由下面的化学式1表示：
[化学式1]
X–La–F
其中，
X是天然GLP-2或GLP-2衍生物；
L是含有乙二醇重复单元的连接体；
a是0或自然数，其条件是当a是2或更大时，每个L彼此独立；
F是免疫球蛋白Fc片段；和
–表示共价键。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括：
18nmol/mL至18,630nmol/mL的由上述化学式1表示的GLP-2的长效缀合物，和
稳定剂，其包括1％(w/v)至20％(w/v)的糖醇、糖类或其组合；和以用于将pH维持在4.5至6.5的范围内的量的缓冲材料。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，GLP-2衍生物的特征在于其在天然GLP-2序列中的一个或多个氨基酸中具有选自取代、添加、缺失、修饰及其组合的变异。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，X的特征在于其包括由下面的通式1表示的氨基酸序列：
[通式1]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34(SEQ ID NO:9)
其中，
X1是组氨酸、咪唑乙酰基去组氨酸、去氨基组氨酸、β-羟基咪唑丙酰基去组氨酸、N-二甲基组氨酸或β-羧基咪唑丙酰基去组氨酸；
X2是丙氨酸、甘氨酸或Aib(2-氨基异丁酸)；
X30是赖氨酸或精氨酸；和
X34不存在，或是赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、6-叠氮赖氨酸或半胱氨酸。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，X的特征在于其是：
(1)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，和X34是半胱氨酸，
(2)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，和X34是赖氨酸，
(3)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是精氨酸，和X34是赖氨酸，
(4)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，和X34是6-叠氮赖氨酸，
(5)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是精氨酸，和X34是半胱氨酸，
(6)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是Aib，X30是赖氨酸，和X34是半胱氨酸，或
(7)X1是组氨酸，X2是Aib，X30是赖氨酸，和X34是半胱氨酸。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，X的特征在于其包括由下面的通式2表示的氨基酸序列：
[通式2]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34(SEQ ID NO:10)
其中，
X1是组氨酸、咪唑乙酰基去组氨酸、去氨基组氨酸、β-羟基咪唑丙酰基去组氨酸、N-二甲基组氨酸或β-羧基咪唑丙酰基去组氨酸；
X2是丙氨酸、甘氨酸或Aib(2-氨基异丁酸)；
X30是赖氨酸或精氨酸；和
X34是任何一种或多种氨基酸，或其中发生变异的任何一种或多种氨基酸。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，GLP-2衍生物的特征在于其是选自SEQ ID NO:2至8的氨基酸序列。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，免疫球蛋白Fc片段的特征在于其是IgG4Fc区。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，F的特征在于其是由两条多肽链组成的二聚体，并且L的一端仅与两条多肽链中的一条连接。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，L的特征在于其是聚乙二醇。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，在L中乙二醇重复单元部分的化学式量的特征在于其在1kDa至100kDa的范围内。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，免疫球蛋白Fc片段的特征在于其包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，稳定剂的特征在于其进一步包括选自非离子表面活性剂和氨基酸的一种或多种组分。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，稳定剂的特征在于其包括糖醇、糖类或其组合；缓冲剂；非离子表面活性剂；和氨基酸。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，液体制剂可以包括等渗剂或者可以不包括等渗剂。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，缓冲剂的特征在于其选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐、及其组合。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，液体制剂的pH的特征在于其在4.8至6.0的范围内。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，糖醇的特征在于其是选自甘露糖醇和山梨糖醇的一种或多种。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，糖类的特征在于其是葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或其组合。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，非离子表面活性剂的特征在于其是泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，非离子表面活性剂的特征在于其选自泊洛沙姆188、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其组合。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，非离子表面活性剂的特征在于其在液体制剂中以0.001％(w/v)至0.2％(w/v)的浓度存在。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，氨基酸的特征在于其选自甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸及其组合。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，氨基酸的特征在于其在液体制剂中以0.01mg/mL至1mg/mL的浓度存在。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括：
18nmol/mL至18,630nmol/mL的GLP-2的长效缀合物；
5mM至100mM的缓冲剂，其选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐、及其组合；
1％(w/v)至20％(w/v)的葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇或其组合；
0.001％(w/v)至0.2％(w/v)的非离子表面活性剂，其选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯及其组合；和
0.01mg/mL至1mg/mL的氨基酸，其选自甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸及其组合，并且
其中液体制剂的pH为4.5至6.5。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括：
18nmol/mL至18,630nmol/mL的GLP-2的长效缀合物；
5mM至100mM的缓冲剂；
1％(w/v)至20％(w/v)的糖醇、糖类或其组合；
0.001％(w/v)至0.2％(w/v)的非离子表面活性剂；和
0.01mg/mL至1mg/mL的氨基酸，并且
其中液体制剂的pH为4.5至6.5。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括：
186nmol/mL至2,981nmol/mL的GLP-2的长效缀合物；
10mM至40mM的乙酸及其盐或柠檬酸及其盐的缓冲剂；
2％(w/v)至15％(w/v)的蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇或其组合；
0.002％(w/v)至0.05％(w/v)的聚山梨醇酯；和
0.02mg/mL至0.5mg/mL的甲硫氨酸，并且
其中液体制剂的pH为4.8至6.0。
在根据前述实施方式中任一项的液体制剂中，液体制剂的特征在于其进一步包括多元醇。
本发明的另一方面提供了制备液体制剂的方法。
在一个实施方式中，本发明涉及制备前述实施方式中任一项的液体制剂的方法，其包括：混合(i)GLP-2的长效缀合物，其中GLP-2和免疫球蛋白Fc片段彼此连接；与(ii)稳定剂，其包括糖醇、糖类或其组合；和缓冲剂。
[有利效果]
根据本发明的液体制剂通过简单的制剂向具有大分子量的本发明缀合物提供储存稳定性而具有经济优势。
[附图说明]
图1是根据缓冲剂的类型和pH确认GLP-2衍生物的长效缀合物的稳定性的结果(IEX(％)：表3中IE-HPLC(％)，GLP-2衍生物的长效缀合物的残留率)。
图2是根据稳定剂的类型和pH确认GLP-2衍生物的长效缀合物的稳定性的结果(IEX(％)：表5中IE-HPLC(％)，GLP-2衍生物的长效缀合物的残留率)。
[具体实施方式]
在下文中，将对本发明进行更详细的描述。
同时，本文公开的每个解释和示例性实施方式都可以适用于每个其他解释和示例性实施方式。也就是说，本文公开的各种因素的所有组合都属于本发明的范围。此外，本发明的范围不应受限于下文所提供的具体公开内容。
此外，本领域普通技术人员仅仅使用传统实验，就可以能够认识或确认本文描述的本发明的具体方面的许多等同物。此外，还意欲这些等同物包含在本发明中。
在本发明的整个说明书中，不仅使用了自然发生的氨基酸的传统单字母和三字母编码，还使用了通常允许用于其他氨基酸的三字母编码，诸如α-氨基异丁酸(Aib)、6-叠氮赖氨酸(AZK)等。此外，根据IUPAC-IUB的命名规则，本文提到的氨基酸被缩写如下：
丙氨酸(Ala，A) 精氨酸(Arg，R)
天冬酰胺(Asn，N) 天冬氨酸(Asp，D)
半胱氨酸(Cys，C) 谷氨酸(Glu，E)
谷氨酰胺(Gln，Q) 甘氨酸(Gly，G)
组氨酸(His，H) 异亮氨酸(Ile，I)
亮氨酸(Leu，L) 赖氨酸(Lys，K)
甲硫氨酸(Met，M) 苯丙氨酸(Phe，F)
脯氨酸(Pro，P) 丝氨酸(Ser，S)
苏氨酸(Thr，T) 色氨酸(Trp，W)
酪氨酸(Tyr，Y) 缬氨酸(Val，V)
本发明的一个方面提供了胰高血糖素样肽-2(GLP-2)的长效缀合物的液体制剂。
具体而言，本发明提供了GLP-2的长效缀合物的液体制剂，其包括：
GLP-2的长效缀合物，其中GLP-2和免疫球蛋白Fc片段以药理学有效量彼此连接，和
稳定剂，其包括糖醇、糖类或其组合；和缓冲剂。
如本文中使用的，术语“液体制剂”指的是配制成液体形式的药物，并且意欲包括所有内用的液体制剂和外用的制剂。
本发明的液体制剂包括显示出药理作用的GLP-2的长效缀合物，以及当其被配制成液体形式时能够将显示出药理作用的缀合物稳定地保持和/或储存一定时间段的物质。除了表现出液体制剂的药理作用的GLP-2的长效缀合物之外，还包括的组分可与稳定剂互换使用。
在本发明的GLP-2的长效缀合物的液体制剂中，储存稳定性对于确保准确的剂量是重要的。
本发明的液体制剂包括GLP-2的长效缀合物和稳定剂。
如本文中使用的，术语“稳定剂”指的是在制剂中稳定地保持组分(诸如活性成分)特定时间段的物质。
本发明的稳定剂可以是无白蛋白稳定剂，但不限于此。可用作蛋白质稳定剂的人血清白蛋白是从人血中制备的，并且因此可能受来自人类的致病病毒污染，明胶或牛血清白蛋白可能引起疾病或可能引起一些患者的过敏反应。无白蛋白稳定剂不含异种蛋白，诸如人或动物血清白蛋白或纯化的明胶，并且因此不容易受到病毒性感染。
在本发明中，稳定剂特指允许GLP-2的长效缀合物被稳定地储存的物质。在GLP-2的长效缀合物中，储存稳定性不仅对于确保准确剂量很重要，而且对于抑制来自GLP-2的长效缀合物的抗原物质的潜在产生也很重要。
稳定剂可以包括糖醇、糖类或其组合；和缓冲剂。此类液体制剂可以是能够稳定地储存GLP-2的长效缀合物的溶液的形式。
包含在本发明的液体制剂中的缓冲剂可以保持溶液的pH，以便液体制剂的pH不会迅速改变，以使GLP-2的长效缀合物稳定。
缓冲剂可以是pH缓冲剂，其包括磷酸及其共轭碱(即碱盐诸如磷酸盐：磷酸钠、磷酸钾或者其氢盐或二氢盐)、柠檬酸及其盐(例如柠檬酸钠)、乙酸及其盐(例如乙酸钠)或组氨酸及其盐，也可以使用这些缓冲剂的混合物，但缓冲剂不限于此。
本发明的液体制剂可以包括含有缓冲剂作为液体制剂的溶剂的缓冲溶液，并且具体而言，缓冲溶液可以选自柠檬酸盐缓冲溶液(例如柠檬酸钠缓冲溶液)、乙酸盐缓冲溶液(例如乙酸钠缓冲溶液)、磷酸盐缓冲溶液(例如磷酸钠缓冲溶液)、组氨酸缓冲溶液及其组合。更具体而言，缓冲溶液可以选自柠檬酸盐缓冲溶液(例如，柠檬酸钠缓冲溶液)、乙酸盐缓冲溶液(例如乙酸钠缓冲溶液)、组氨酸缓冲溶液及其组合，并且更加具体而言，缓冲溶液可以选自柠檬酸盐缓冲溶液(例如，柠檬酸钠缓冲溶液)、乙酸盐缓冲溶液(例如乙酸钠缓冲溶液)及其组合，但缓冲溶液不限于此。
此外，液体制剂中的缓冲溶液或缓冲剂(柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐或其组合)可以以足以维持液体制剂的目标pH的浓度被包含。具体而言，缓冲剂的浓度可以是约2mM至约200mM，更具体而言约5mM至约100mM、约5mM至约80mM、约5mM至约40mM、约10mM至约40mM、约10mM至约30mM、约15mM至约25mM，但并不具体限于此。
缓冲溶液或液体制剂的pH可以在约4.0至约7.0的范围内，具体而言约4.0至约6.8、约4.2至约6.6、约4.3至约6.5，并且更具体而言约4.5至约6.5、约4.5至约6.3、约4.5至约6.0、约4.8至约6.5、约4.8至约6.0、约5.1至约6.0，或约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0，但pH不限于此。
如本文中使用的，术语“约”指的是包括±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等的所有值，并且包括与在这些值之后的那些相等或相似的所有值的范围，但范围不限于此。
同时，在液体制剂的制备中，将组分溶解在水(例如WFI)中，并且可以使用HCl和/或NaOH等将缓冲溶液或制剂的pH调节到期望的pH，这是本领域已经常用的方法。因此，即使权利要求中没有额外提到pH调节剂，本领域普通技术人员将理解制剂可以具有通过此类方法调节的pH。
本发明的稳定剂中包括的糖醇指的是含有多个羟基的物质，并且是物质的通用术语，其中糖类的醛基和/或酮基被醇基取代，并且可以增加GLP-2的长效缀合物的稳定性。例如，糖醇可以是选自甘露糖醇和山梨糖醇的一种或多种，但不限于此。
本发明的稳定剂中包含的糖类指的是单糖、二糖、多糖、低聚糖等，并且可以增加GLP-2的长效缀合物的稳定性。具体实例可以包括单糖，诸如甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、岩藻糖和木糖；二糖，诸如乳糖、麦芽糖和蔗糖；以及多糖，诸如棉子糖和葡聚糖，但不限于此。
糖醇、糖类或其组合相对于液体制剂的总溶液可以以约1％(w/v)至约20％(w/v)、约1％(w/v)至约15％(w/v)、约2％(w/v)至约15％(w/v)、约2％(w/v)至约12％(w/v)、约2％(w/v)至约10％(w/v)、约3％(w/v)至约10％(w/v)、约4％(w/v)至约10％(w/v)、约4％(w/v)至约9％(w/v)、约5％(w/v)至约9％(w/v)、约5％(w/v)至约8％(w/v)、约1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)、7％(w/v)、8％(w/v)、9％(w/v)、10％(w/v)、11％(w/v)、12％(w/v)、13％(w/v)、14％(w/v)、15％(w/v)、16％(w/v)、17％(w/v)、18％(w/v)、19％(w/v)、或20％(w/v)、约5％(w/v)、或约8％(w/v)的浓度存在，但并不具体限于此。
此外，本发明的稳定剂可以进一步包括选自非离子表面活性剂和氨基酸的一种或多种组分，但不限于此。因此，稳定剂可基本上由糖醇、糖类或其组合；和缓冲剂组成，并且也可基本上由以下组分组成：(i)糖醇、糖类或其组合；缓冲剂；和非离子表面活性剂，(ii)糖醇、糖类或其组合；缓冲剂；和氨基酸，或(iii)糖醇、糖类或其组合；缓冲剂；非离子表面活性剂；和氨基酸，但不限于此。
这里，显而易见的是上面或下面描述的全部内容都适用于构成稳定剂的每种组分的类型、浓度或pH。
虽然不具体限于此，但非离子表面活性剂使蛋白质溶液的表面张力降低，从而防止蛋白质在疏水表面上的吸附或附聚。
可用于本发明的非离子表面活性剂的具体实例可以包括聚山梨醇酯或泊洛沙姆，并且这些可以逐一使用，或其两个或更多个的组合使用。
具体而言，非离子表面活性剂可以是聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188，并且这些可以组合使用，但不具体限于此。
在本发明中，优选的，非离子表面活性剂不以高浓度包含，并且具体而言，其在制剂中可以以约0.2％(w/v)或更低，例如，约0.001％(w/v)至约0.2％(w/v)、约0.001％(w/v)至约0.1％(w/v)、约0.001％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.005％(w/v)至约0.08％(w/v)、约0.002％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.005％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.01％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.01％(w/v)至约0.04％(w/v)、约0.01％(w/v)至约0.03％(w/v)、或约0.02％(w/v)的浓度被包含，但浓度并不具体限于此。
氨基酸可以是甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸或其组合，并且具体而言是甲硫氨酸。此外，甲硫氨酸可以是L-甲硫氨酸，但不具体限于此。
氨基酸可以抑制由于蛋白质的氧化反应等而可以发生的杂质的产生，但并不具体限于此。
氨基酸在制剂中可以以约0.01mg/mL至约1mg/mL，具体而言约0.01mg/mL至约0.8mg/mL、约0.01mg/mL至约0.5mg/mL、约0.02mg/mL至约0.5mg/mL、或约0.02mg/mL至约0.4mg/mL的浓度存在，但不具体限于此。
同时，液体制剂可以进一步包括多元醇，但不具体限于此。
例如，液体制剂可以包括多元醇以及稳定剂，其包括糖醇、糖类或其组合；和缓冲剂。具体而言，液体制剂可以进一步包括稳定剂中的多元醇，该稳定剂基本上由以下组分组成：(i)糖醇、糖类或其组合；缓冲剂；和非离子表面活性剂，(ii)糖醇、糖类或其组合；缓冲剂；和氨基酸，或(iii)糖醇、糖类或其组合；缓冲剂；非离子表面活性剂；和氨基酸，但不具体限于此。
可以进一步被包括在本发明的液体制剂中的多元醇的优选实例可以包括丙二醇和低分子量聚乙二醇、甘油、低分子量聚丙二醇等，并且这些可以以其一个或两个或更多个组合使用。此外，糖醇可以从本发明的多元醇中排除，但不限于此。
同时，除了上面描述的糖醇、糖类或其组合；缓冲剂；氨基酸；和非离子表面活性剂之外，本发明的液体制剂还可以任选地在不损害本发明的作用的范围内进一步包括本领域已知的其他组分或材料。
同时，在一个实施方式中，本发明的液体制剂可以包括等渗剂，或者可以不包括等渗剂。等渗剂指的是可以控制渗透压的物质。当根据本发明的液体制剂被施用至身体时，等渗剂可以用来适当地维持渗透压。
等渗剂的代表性实例可以包括水溶性无机盐，诸如氯化钠、硫酸钠或柠檬酸钠，具体而言是氯化钠，但不具体限于此。此类无机盐可以是进一步包括在上述稳定剂中的任选组分，并不具体限于此。此外，上述稳定剂可以充当等渗剂。
本发明的制剂中的等渗剂的浓度可以是0mM至200mM、0mM至150mM、0mM至100mM、10mM至200mM、10mM至150mM、10mM至100mM、10mM至50mM、20mM至100mM、20mM至80mM、20mM至50mM、20mM至30mM、或40mM至50mM，但不具体限于此。
如本文中使用的，术语“GLP-2的长效缀合物”是包含在本发明的液体制剂中的活性成分，并且可以以药理学有效量包含在制剂中，例如，GLP-2的长效缀合物的浓度可以是约18nmol/mL至约18,630nmol/mL、约18nmol/mL至约14,904nmol/mL、约18nmol/mL至约9,315nmol/mL、约18nmol/mL至约7,452nmol/mL、约18nmol/mL至约5,589nmol/mL、约18nmol/mL至约4,658nmol/mL、约18nmol/mL至约2,981nmol/mL、约18nmol/mL至约1,863nmol/mL、约18nmol/mL至约1,491nmol/mL、约18nmol/mL至约1,211nmol/mL、约18nmol/mL至约932nmol/mL、约18nmol/mL至约746nmol/mL、约18nmol/mL至约559nmol/mL、约18nmol/mL至约373nmol/mL、约37nmol/mL至约5,589nmol/mL、约93nmol/mL至约2,236nmol/mL、约149nmol/mL至约1,491nmol/mL、约186nmol/mL至约2,981nmol/mL、约186nmol/mL至约1,118nmol/mL、约93nmol/mL至约18,630nmol/mL、约186nmol/mL至约9,315nmol/mL、约279nmol/mL至约5,589nmol/mL、约372nmol/mL至约4,658nmol/mL、约465nmol/mL至约3,726nmol/mL、约558nmol/mL至约2,981nmol/mL、约18nmol/mL至约14,910nmol/mL、约18nmol/mL至约9,320nmol/mL、约18nmol/mL至约7,460nmol/mL、约18nmol/mL至约5,590nmol/mL、约18nmol/mL至约4,660nmol/mL、约18nmol/mL至约1,870nmol/mL、约18nmol/mL至约1,220nmol/mL、约18nmol/mL至约940nmol/mL、约18nmol/mL至约750nmol/mL、约18nmol/mL至约560nmol/mL、或约18nmol/mL至约380nmol/mL、约37nmol/mL至约5,590nmol/mL、约93nmol/mL至约2,240nmol/mL、约149nmol/mL至约1,500nmol/mL、约186nmol/mL至约2,990nmol/mL、约186nmol/mL至约1,120nmol/mL、约186nmol/mL至约9,320nmol/mL、约279nmol/mL至约5,590nmol/mL、约372nmol/mL至约4,660nmol/mL、约465nmol/mL至约3,730nmol/mL、约558nmol/mL至约2,990nmol/mL、约186nmol/mL、约186.3nmol/mL、约187nmol/mL、约1,117nmol/mL、约1,117.8nmol/mL、约1,118nmol/mL、约558nmol/mL、约558.9nmol/mL、约559nmol/mL、约1,490nmol/mL、约1,490.4nmol/mL、约1,491nmol/mL、约2,980nmol/mL、约2,980.8nmol/mL、或约2,981nmol/mL，但不限于此。
具体而言，长效缀合物可以是其中免疫球蛋白Fc片段与GLP-2连接的形式。与免疫球蛋白未缀合于其的GLP-2相比，该缀合物可以表现出增加的效果持续时间，并且在本发明中，此类缀合物被称为“长效缀合物”。在本发明中，长效缀合物可以与缀合物互换使用。
同时，缀合物可以是非天然发生的。
此外，在GLP-2的长效缀合物中，GLP-2与免疫球蛋白Fc片段之间的连接可以通过物理或化学键、非共价或共价键，并且具体而言共价键来实现，但不限于此。
此外，连接GLP-2和免疫球蛋白Fc片段的方法没有具体限制，但是GLP-2和免疫球蛋白Fc片段可以通过连接体彼此连接。
进一步，涉及GLP-2的长效缀合物的韩国特许专利公开号10-2019-0037181通过引用并入本文。
在一个具体的实施方式中，GLP-2的长效缀合物具有下面化学式1的结构：
[化学式1]
X–La–F
其中，
X是GLP-2；
L是含有乙二醇重复单元的连接体；
a是0或自然数，其条件是当a是2或更大时，每个L彼此独立；
F是免疫球蛋白Fc片段；和
“–”可以是任何化学键，诸如非共价键或共价键。
在一个具体的实施方式中，本发明的液体制剂可以包括：
18nmol/mL至18,630nmol/mL的由上面的化学式1表示的GLP-2的长效缀合物，和
稳定剂，其包括1％(w/v)至20％(w/v)的糖醇、糖类或其组合；和以用于将pH维持在4.5至6.5的范围内的量的缓冲剂。
在本说明书中，免疫球蛋白Fc区不仅包括从木瓜蛋白酶消化的免疫球蛋白获得的天然序列，还包括其衍生物，例如不同于天然序列的序列，其中天然序列中的一个或多个氨基酸残基通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合进行修饰。
如本文中使用的，术语“胰高血糖素样肽-2(GLP-2)”是具有预防、治疗和改善肠道损伤、肠道疾病和胃病的功能的肽(化学式1中的X)，其不仅包括天然GLP-2，还包括激动剂及其衍生物等。
天然GLP-2的氨基酸序列如下：
GLP-2(1-33)
HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(SEQ ID NO:1)
如本文中使用的，“GLP-2受体激动剂”指的是在体内与GLP-2受体结合并引起与天然GLP-2相同或相似的生理活性的物质。例如，GLP-2激动剂可以包括天然GLP-2或GLP-2衍生物。
如本文中使用的，“GLP-2衍生物”可以是其中在天然GLP-2序列中的一个或多个氨基酸中发生选自取代、添加、缺失、修饰及其组合的变异的那些，并且可以包括具有预防、治疗和/或改善肠道损伤、肠道疾病和胃病的功能的天然GLP-2的模拟物。添加的氨基酸可以是非天然氨基酸(例如D-氨基酸)，并且也可能取代除了天然氨基酸之外的非天然氨基酸。添加的氨基酸序列可以来源于天然GLP-2，但不限于此。此外，本发明中氨基酸的变异可以指其中氨基酸残基的一些基团被化学取代(例如，α-甲基化、α-羟基化、被叠氮基取代)、去除(例如，脱氨作用)和/或修饰(例如，N-甲基化)，独立地或与在一个或多个氨基酸中取代、添加、缺失或其组合相结合的那些，但不限于此。
在一个具体的实施方式中，本发明的GLP-2衍生物可以与天然GLP-2在氨基酸序列中具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性，或者可以是其中GLP-2的氨基酸残基的一些基团被化学取代(例如，α-甲基化、α-羟基化、被叠氮基取代)、去除(例如，脱氨作用)和/或修饰(例如，N-甲基化)的形式，但不限于此。
具体而言，天然GLP-2的激动剂和衍生物不限于此，但可以具有预防、治疗和改善肠道损伤、肠道疾病和胃病的功能。
在一个具体的实施方式中，本发明的GLP-2中的N端氨基可以被取代、去除或修饰，但不限于此。为了防止与GLP-2的N端结合，GLP-2的N端是GLP-2的体内活性的重要位点，当制备GLP-2的长效缀合物时，本发明的GLP-2可以通过以下方法制备：去除N端组氨酸的α氨基的方法、用羟基或羧基取代N端氨基的方法、去除N端组氨酸的α-碳和与α-碳键合的N端氨基以仅留下咪唑-乙酰基官能团的方法、和用两个甲基修饰N端氨基的方法等。
具体而言，GLP-2可以是咪唑乙酰基-去组氨酰基-GLP-2(CA-GLP-2)，其中组氨酸残基(GLP-2的第一个N端氨基酸)的α-碳和与α-碳键合的N端氨基已被去除；去氨基组氨酰基GLP-2(DA-GLP-2)，其中GLP-2的N端氨基已被去除；β-羟基咪唑丙酰基去组氨酰基GLP-2(HY-GLP-2)，其中GLP-2的N端氨基被羟基取代；N-二甲基组氨酰基GLP-2(DM-GLP-2)，其中GLP-2的N端氨基用两个甲基修饰；或β-羧基咪唑丙酰基-去组氨酰基-GLP-2(CX-GLP-2)，其中GLP-2的N端氨基被羧基取代，但不限于此。在一个非限制性实例中，用于制备GLP-2衍生物的材料结构如下：
Figure BDA0004113742410000111
在本发明中，咪唑乙酰基-去组氨酰基(dine)、去氨基组氨酰基(dine)、β-羟基咪唑丙酰基去组氨酰基(dine)、N-二甲基组氨酰基(dine)和β-羧基咪唑丙酰基-去组氨酰基(dine)可分别以与咪唑乙酰基、去-氨基-组氨酰基、β-羟基-咪唑丙酰基、二甲基-组氨酰基、β-羧基-咪唑丙酰基相同的含义使用。
在一个具体的实施方式中，GLP-2衍生物可包括在SEQ ID NO:1的位置1、2、30和33处的一个或多个氨基酸的变异，但不限于此。具体而言，本发明中氨基酸的变异可以选自一个或多个氨基酸中的取代、添加、缺失、修饰及其组合，其中添加的氨基酸可以是非天然氨基酸(例如D-氨基酸)，并且除了天然氨基酸之外的非天然氨基酸的取代也是可能的。添加的氨基酸序列可以来源于天然GLP-2，但不限于此。此外，本发明中的氨基酸变异可以指其中氨基酸残基的一些基团被化学取代(例如α-甲基化、α-羟基化、被叠氮基取代)、去除(例如脱氨作用)和/或修饰(例如N-甲基化)，独立地或与一个或多个氨基酸中取代、添加、缺失或其组合相结合的那些，但不限于此。
在一个具体的实施方式中，GLP-2可以包括下面的通式1的氨基酸序列，但不限于此：
[通式1]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34(SEQ ID NO:9)
其中，
X1是组氨酸、咪唑乙酰基去组氨酸、去氨基组氨酸、β-羟基咪唑丙酰基去组氨酸、N-二甲基组氨酸或β-羧基咪唑丙酰基去组氨酸；
X2是丙氨酸、甘氨酸或Aib(2-氨基异丁酸)；
X30是赖氨酸或精氨酸；和
X34不存在，或是赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、6-叠氮赖氨酸或半胱氨酸。
在一个具体的实施方式中，GLP-2可以包括下面的通式2的氨基酸序列，但不限于此：
[通式2]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34(SEQ ID NO:10)
其中，
X1是组氨酸、咪唑乙酰基去组氨酸、去氨基组氨酸、β-羟基咪唑丙酰基去组氨酸、N-二甲基组氨酸或β-羧基咪唑丙酰基去组氨酸；
X2是丙氨酸、甘氨酸或Aib(2-氨基异丁酸)；
X30是赖氨酸或精氨酸；和
X34是任何一种或多种氨基酸，或其中发生变异的任何一种或多种氨基酸。
具体而言，氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸，并且氨基酸的变异如上所述。
此外，在通式1或2的氨基酸序列当中，与SEQ ID NO:1相同的序列可以被排除，但不限于此。
具体而言，本发明的GLP-2衍生物可以在天然GLP-2的第2个氨基酸处用甘氨酸或Aib(2-氨基异丁酸)取代丙氨酸，在天然GLP-2的第30个氨基酸处用精氨酸取代赖氨酸，或其组合，但不限于此。此外，GLP-2衍生物可以用硫醇基(例如半胱氨酸)、氨基(例如赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺或组氨酸)或叠氮基(例如6-叠氮赖氨酸)引入C端(例如第33个氨基酸)，但并不限于此。
因为当制备GLP-2衍生物的长效缀合物时，缀合发生在引入的基团中，这些可用于制备GLP-2缀合物，其结合位点可选择性地控制。具体而言，GLP-2衍生物的羟基、硫醇基、氨基或叠氮基可以与连接体的一端缀合，并且能够增加体内半衰期的材料(例如免疫球蛋白Fc片段)可以与连接体的另一端缀合。硫醇基、氨基或叠氮基可通过向GLP-2添加氨基酸来引入，但不限于此。硫醇基可以通过向GLP-2添加半胱氨酸(C)来引入；氨基可以通过向GLP-2添加赖氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)或组氨酸(H)来引入；以及叠氮基可以通过向GLP-2添加6-叠氮赖氨酸(AZK)来引入，但这些并不限于此。
具体而言，在GLP-2衍生物中，残基中的至少一个可以是半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸或6-叠氮-赖氨酸，但不限于此。
具体而言，本发明的GLP-2衍生物可以包括用甘氨酸取代丙氨酸(天然GLP-2的第2个氨基酸)，并且将硫醇基(例如半胱氨酸)引入GLP-2的C端；更具体而言，GLP-2衍生物可以包括咪唑乙酰基去组氨酸，其中组氨酸残基(其是在GLP-2的N端处的第一个氨基酸)的α-碳和与α-碳结合的N端氨基被去除，例如，其可以具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，但不限于此。
具体而言，本发明的GLP-2衍生物可以包括用甘氨酸取代丙氨酸(天然GLP-2的第2个氨基酸)，并且将氨基(例如赖氨酸)引入C端；更具体而言，GLP-2衍生物可以包括咪唑乙酰基去组氨酸，其中组氨酸残基(其是在GLP-2的N端处的第一个氨基酸)的α-碳和与α-碳结合的N端氨基被去除，例如，其可以具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，但不限于此。
具体而言，本发明的GLP-2衍生物可以包括用甘氨酸取代丙氨酸(天然GLP-2的第2个氨基酸)，用精氨酸取代赖氨酸(天然GLP-2的第30个氨基酸)，并且将氨基(例如赖氨酸)引入C端；更具体而言，GLP-2衍生物可以包括咪唑乙酰基去组氨酸，其中组氨酸残基(其是在GLP-2的N端处的第一个氨基酸)的α-碳和与α-碳结合的N端氨基被去除，例如，其可以具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列，但不限于此。
具体而言，本发明的GLP-2衍生物可以包括用甘氨酸取代丙氨酸(天然GLP-2的第2个氨基酸)，并且将叠氮基(例如6-叠氮赖氨酸)引入C端；更具体而言，GLP-2衍生物可以包括咪唑乙酰基去组氨酸，其中组氨酸残基(其是在GLP-2的N端处的第一个氨基酸)的α-碳和与α-碳结合的N端氨基被去除，例如，其可以具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列，但不限于此。
具体而言，本发明的GLP-2衍生物可以包括用甘氨酸取代丙氨酸(天然GLP-2的第2个氨基酸)，用精氨酸取代赖氨酸(天然GLP-2的第30个氨基酸)，并且将硫醇基(例如半胱氨酸)引入C端；更具体而言，GLP-2衍生物可以包括咪唑乙酰基去组氨酸，其中组氨酸残基(其是在GLP-2的N端处的第一个氨基酸)的α-碳和与α-碳结合的N端氨基被去除，例如，其可以具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列，但不限于此。
具体而言，本发明的GLP-2衍生物可以包括用2-氨基异丁酸取代丙氨酸(天然GLP-2的第2个氨基酸)，并且将硫醇基(例如半胱氨酸)引入C端，例如，其可以具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列；更具体而言，GLP-2衍生物可以包括咪唑乙酰基去组氨酸，其中组氨酸残基(其是在GLP-2的N端处的第一个氨基酸)的α-碳和与α-碳结合的N端氨基被去除，例如，其可以具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列，但不限于此。
SEQ ID NO:2至8的GLP-2衍生物显示在下面的表1。
[表1]
名称 序列 序列号
CA GLP-2 KC caHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDC 2
CA GLP-2 KK caHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDK 3
CA GLP-2 RK caHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTRITDK 4
CA GLP-2 KAZK caHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDAZK 5
CA GLP-2RC caHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTRITDC 6
CA GLP-2 Aib caHAibDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDC 7
GLP-2 Aib HAibDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDC 8
在上面的表1中，caH表示取代的咪唑乙酰基去组氨酸而不是组氨酸；Aib表示2-氨基异丁酸；以及AZK表示6-叠氮-L-赖氨酸。
根据本发明的GLP-2衍生物可以是包括上面描述的特定序列的肽，或可以是(基本上)由上面描述的特定序列组成的肽，但GLP-2衍生物不限于此。
同时，尽管在本发明中被描述为“由特定的SEQ ID NO组成”的肽或GLP-2，但此类表达并不排除在相应SEQ ID NO的氨基酸序列的上游或下游无意义的序列添加，或其中天然发生的突变，或其中沉默突变，只要具有此类序列添加或突变的肽或GLP-2具有与由相应SEQ ID NO的氨基酸序列组成的肽或GLP-2相同或相应的活性。显而易见的是具有序列添加或突变的此类肽或GLP-2属于本发明的范围。
具体而言，在通式1或2中，(1)X2可以是甘氨酸或Aib，(2)X30可以是赖氨酸或精氨酸，或者(3)X2可以是甘氨酸或Aib，并且X30可以是赖氨酸或精氨酸，但这些并不限于此。
具体而言，在通式1或2中，GLP-2衍生物可以是：
(1)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，和X34是半胱氨酸，
(2)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，和X34是赖氨酸，
(3)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是精氨酸，和X34是赖氨酸，
(4)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，和X34是6-叠氮赖氨酸，
(5)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是精氨酸，和X34是半胱氨酸，
(6)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是Aib，X30是赖氨酸，和X34是半胱氨酸，或者
(7)X1是组氨酸，X2是Aib，X30是赖氨酸，和X34是半胱氨酸，但这些并不限于此。
在本发明中，GLP-2衍生物可以是修饰的形式，其中其N端和/或C端等被化学修饰或被有机基团保护，或者氨基酸可以被添加到GLP-2的末端，用于保护其在体内免受蛋白酶的影响，同时增加其稳定性。
特别地，在化学合成的肽的情况下，其N端和C端是带电荷的。因此，为了去除此类电荷，肽的N端可以被乙酰化和/或肽的C端可以被酰胺化，但是肽修饰并不具体限于此。具体而言，在本发明中，GLP-2衍生物可在其C端处未被修饰或被酰胺化，但修饰不限于此。
本发明的GLP-2可以通过固相合成法合成，可以通过重组法生产，并且可以通过商业方式生产。
在上面的化学式1中，F和X可以通过L经由共价化学键、非共价化学键或其组合彼此缀合。
更具体而言，X和L，以及L和F可以经由共价键彼此连接，并且在这种情况下，缀合物可以是其中X、L和F各自经由共价键按化学式1的顺序连接的缀合物。
此外，F可以直接与X连接(即化学式1中a为0)，或者可以经由连接体(L)连接。
在一个实施方式中，La(化学式1的长效缀合物的一个组分)可以是含有乙二醇重复单元(例如聚乙二醇)的连接体，并且此外，在本领域中已经知道的那些衍生物和在本领域普通技术人员的技术水平下容易制备的衍生物都包括在本发明的范围内。
L(含有乙二醇重复单元的连接体)可以在末端包括官能团——用于制备缀合物，然后其形成为缀合物。根据本发明的长效缀合物可以是其中X和F通过官能团连接的形式，但不限于此。在本发明中，含有乙二醇重复单元的连接体可以包括两个或三个或更多个官能团，并且每个官能团可以彼此相同或不同，但不限于此。
具体而言，连接体可以是由下面的化学式4表示的聚乙二醇(PEG)，但连接体不限于此：
[化学式4]
Figure BDA0004113742410000151
其中n为10至2,400，n为10至480，或n为50至250，但n的范围不限于此。
在上面的长效缀合物中，PEG部分不仅可以包括–(CH2CH2O)n–结构，还可以包括插在连接元件和–(CH2CH2O)n–结构之间的氧原子，但PEG部分不限于此。
此外，在具体的实施方式中，缀合物可以具有这样的结构，其中免疫球蛋白片段(F)通过含有乙二醇重复单元的连接体以共价键与GLP-2连接，但缀合物的结构不限于此。
聚乙二醇是通用术语，其包括所有形式的乙二醇均聚物、PEG共聚物和单甲基取代的PEG聚合物(mPEG)，但聚乙二醇并不具体限于此。
在一个实施方式中，乙二醇重复单元可以由例如[OCH2CH2]n表示，并且n的值是自然数，肽缀合物中[OCH2CH2]n区域的平均分子量(例如，数均分子量)可以被确定为大于0至约100kDa，但不限于此。在另一个实例中，n的值是自然数，肽缀合物中[OCH2CH2]n区域的平均分子量(例如，数均分子量)可以为约1kDa至约100kDa、约1kDa至约80kDa、约1kDa至约50kDa、约1kDa至约30kDa、约1kDa至约25kDa、约1kDa至约20kDa、约1kDa至约15kDa、约1kDa至约13kDa、约1kDa至约11kDa、约1kDa至约10kDa、约1kDa至约8kDa、约1kDa至约5kDa、约1kDa至约3.4kDa、约3kDa至约30kDa、约3kDa至约27kDa、约3kDa至约25kDa、约3kDa至约22kDa、约3kDa至约20kDa、约3kDa至约18kDa、约3kDa至约16kDa、约3kDa至约15kDa、约3kDa至约13kDa、约3kDa至约11kDa、约3kDa至约10kDa、约3kDa至约8kDa、约3kDa至约5kDa、约3kDa至约3.4kDa、约8kDa至约30kDa、约8kDa至约27kDa、约8kDa至约25kDa、约8kDa至约22kDa、约8kDa至约20kDa、约8kDa至约18kDa、约8kDa至约16kDa、约8kDa至约15kDa、约8kDa至约13kDa、约8kDa至约11kDa、约8kDa至约10kDa、约9kDa至约15kDa、约9kDa至约14kDa、约9kDa至约13kDa、约9kDa至约12kDa、约9kDa至约11kDa、约9.5kDa至约10.5kDa、约3.4kDa或约10kDa，但并不具体限于此。
在一个具体的实施方式中，连接体的两端可以与免疫球蛋白Fc区的硫醇基、氨基或羟基缀合，并且可以与GLP-2的硫醇基、氨基、叠氮基或羟基缀合，但不限于此。
具体而言，连接体可以包括能够在两端与免疫球蛋白Fc和GLP-2中的每一个结合的反应基团。具体而言，连接体可以包括能够与半胱氨酸的硫醇基；位于N端、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和/或组氨酸的氨基；和/或位于免疫球蛋白Fc片段C端的羟基结合的反应基团，以及能够与半胱氨酸的硫醇基；赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和/或组氨酸的氨基；叠氮-赖氨酸的叠氮基；和/或GLP-2中的羟基结合的反应基团，但反应基团不限于此。
更具体而言，反应基团可以是选自醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物的一个或多个，但不限于此。
在上文中，作为醛基的实例，可以使用丙醛基或丁醛基，但醛基不限于此。
在上文中，作为琥珀酰亚胺衍生物，可以使用琥珀酰亚胺基羧甲基、琥珀酰亚胺基戊酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺、羟基琥珀酰亚胺基或琥珀酰亚胺基碳酸酯，但琥珀酰亚胺衍生物不限于此。
连接体可以通过反应基团与F(免疫球蛋白Fc)和X(GLP-2)连接，以转化为连接体部分。
此外，通过由醛键还原胺化产生的最终产物比通过酰胺键连接的最终产物更加稳定。醛反应基团在低pH下选择性地在N端反应，然而其在高pH(例如pH 9.0)下可以与赖氨酸残基形成共价键。
本发明的连接体的末端反应基团可以彼此相同或不同。连接体可以在两端具有醛反应基团。可选地，连接体可以在每一端具有醛基和马来酰亚胺基，或者可以在每一端具有醛基和琥珀酰亚胺反应基团，但不限于此。
例如，连接体可以在一端具有马来酰亚胺基，并且在另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。作为另一个实例，连接体可以在一端具有琥珀酰亚胺基，并且在另一端具有丙醛基或丁醛基。
当在丙醛端具有羟基反应基团的聚乙二醇被用作连接体时，本发明的缀合物可以通过根据已知的化学反应将羟基活化为各种反应基团或者通过使用具有修饰的反应基团的商业上可获得的聚乙二醇来制备。
在具体的实施方式中，连接体的反应基团可以与GLP-2的半胱氨酸残基连接，更具体而言与半胱氨酸的-SH基团连接，但不限于此。
当使用马来酰亚胺-PEG-醛时，马来酰亚胺基可以通过硫醚键与GLP-2的-SH基团连接，并且醛基可以通过还原烷基化与免疫球蛋白Fc的-NH2基团连接，但不限于此，并且这只是一个实施方式。
通过还原烷基化，可以通过具有–CH2CH2CH2–的结构的连接体反应基团使免疫球蛋白Fc片段N端处的氨基与位于PEG的一端的氧原子连接来形成诸如–PEG-O-CH2CH2CH2NH–免疫球蛋白Fc的结构；并且可以形成其中PEG的一端通过硫醚键与位于GLP-2的半胱氨酸处的硫原子连接的结构。上面描述的硫醚键可以包括下列结构：
Figure BDA0004113742410000171
然而，连接体并不具体限于上面的实施方式，并且其仅仅是一个实施方式。
此外，在上面的缀合物中，连接体的反应基团可以与位于免疫球蛋白Fc片段的N端处的–NH2连接，但这仅仅是一个实施方式。
此外，在缀合物中，GLP-2可以通过C端与具有反应基团的连接体连接，但这仅仅是一个实施方式。
如本文中使用的，术语“C端”指的是肽的羧基端，并且指的是能够与用于本发明目的的连接体结合的位置。例如，C端可以包括在C端的最末端处的氨基酸残基以及靠近C端的氨基酸残基，并且具体而言可以包括来自最末端的第1个至第20个氨基酸残基，但C端不限于此。
在一个实施方式中，化学式1的缀合物可以具有下面化学式2或化学式3的结构：
[化学式2]
Figure BDA0004113742410000172
[化学式3]
Figure BDA0004113742410000173
/>
在化学式2或3中，X是上面描述的化学式1的肽；
F是免疫球蛋白Fc片段；和
n可以是自然数。特别地，n的描述与上面描述的相同。
在一个实施方式中，化学式2的长效缀合物具有这样的结构，其中X(其为GLP-2)和F(其为免疫球蛋白Fc片段)通过乙二醇重复单元共价连接，其中每个X可以与化学式2的琥珀酰亚胺环连接，并且F可以与化学式2的氧丙烯基连接。此外，化学式3的长效缀合物具有这样的结构，其中X(其为GLP-2)和F(其为免疫球蛋白Fc片段)通过乙二醇重复单元共价连接，其中每个X可以与化学式3的氧丙烯基连接，并且F可以与化学式3的其他氧丙烯基连接。
在上面的化学式2或3中，可以确定n的值使得肽缀合物中[OCH2CH2]n区域的平均分子量(例如数均分子量)为1kDa至100kDa，或1kDa至20kDa，或10kDa，但不限于此。
在一个实施方式中，化学式2的琥珀酰亚胺环或X与化学式2的琥珀酰亚胺环连接的部分可以是X的C端半胱氨酸的硫原子。此外，化学式3的氧丙烯基或X与化学式3的氧丙烯基连接的部分可以是X的C端半胱氨酸的硫原子。
在F中，与化学式2或3的氧丙烯基连接的部分没有特别地限制。在本发明的一个实施方式中，与氧丙烯基连接的F的部分可以是F的N端氮或内部残基的氮原子(例如赖氨酸的ε氮)。在本发明的一个具体实施方式中，其中F与化学式2或3的氧丙烯基连接的部分可以是F的N端脯氨酸，但不限于此。
如本文中使用的，术语“免疫球蛋白Fc片段”指的是排除免疫球蛋白的重链和轻链可变区的重链恒定区。具体而言，免疫球蛋白Fc片段可以包括重链恒定区2(CH2)和/或重链恒定区3(CH3)部分，并且更具体而言可以进一步包括铰链区(全部或部分铰链区)。在本发明中，免疫球蛋白Fc片段可以与免疫球蛋白Fc区互换使用。
本说明书中的免疫球蛋白Fc区不仅包括从木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白获得的天然序列，还包括其衍生物、取代基，例如变体，其中天然序列中的一个或多个氨基酸残基通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合进行修饰，并且因此序列变得不同于天然序列，等，只要上面的衍生物、取代基和变体保留FcRn结合能力。
免疫球蛋白Fc片段可以是构成本发明的化学式1的缀合物的部分的一种构造。具体而言，其可以对应于上面的化学式1至3中的F。
F可以具有其中两个多肽链通过间二硫键连接的结构，并且F通过两个链中的仅一个的氮原子连接，但不限于此。通过氮原子的连接可以是通过还原胺化与赖氨酸的ε氨基或N-末端氨基连接。
还原胺化反应指的是其中反应物的胺基或氨基与另一种反应物的醛(即能够还原胺化的官能团)反应以产生胺，并且此后通过还原反应形成胺键的反应。还原胺化反应是本领域广泛知道的有机合成的反应。
在一个实施方式中，F可以通过其N端脯氨酸的氮原子连接，但不限于此。
此类免疫球蛋白Fc片段可以包括重链恒定区中的铰链区，但不限于此。
在本发明中，免疫球蛋白Fc片段可以包括N端中的特定铰链序列。
如本文中使用的，术语“铰链序列”指的是位于重链中并通过间二硫键形成免疫球蛋白Fc片段的二聚体的区域。
在本发明中，可以对铰链序列进行修饰，使得具有下列氨基酸序列的铰链序列的一部分被缺失，并且因此该序列中只有一个半胱氨酸残基，但不限于此：
Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:11)。
铰链序列可以是其中缺失SEQ ID NO:11的铰链序列中的第8个或第11个半胱氨酸残基的序列，因此序列中仅包含一个半胱氨酸残基。本发明的铰链序列可以由3-12个氨基酸组成，仅包括一个半胱氨酸残基，但铰链序列不限于此。更具体而言，本发明的铰链序列可以具有下列序列：Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:12)，Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser–Pro(SEQ ID NO:13) ，Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser(SEQ ID NO:14) ，Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Pro(SEQ ID NO:15)，Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser(SEQ ID NO:16)，Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys(SEQ ID NO:17)，Glu–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys(SEQ ID NO:18)，Glu–Ser–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:19)，Glu–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:20)，Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:21)，Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:22) ，Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:23) ，Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:24) ，Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys(SEQ ID NO:25)，Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro(SEQ ID NO:26)，Glu–Ser–Lys–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ IDNO:27)，Glu–Ser–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:28)，Glu–Pro–Ser–Cys(SEQ ID NO:29)，Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:30)。
更具体而言，铰链序列可以包括SEQ ID NO:30(Ser–Cys–Pro)或SEQ ID NO:21(Pro–Ser–Cys–Pro)的氨基酸序列，但不限于此。
在本发明的GLP-2衍生物的长效缀合物的更具体的实施方式中，缀合物中免疫球蛋白Fc区的N端是脯氨酸，并且在该缀合物中，Fc区通过脯氨酸的氮原子与连接体连接。
在一个具体的实施方式中，免疫球蛋白Fc片段可以是其中免疫球蛋白Fc链的两个分子由于其中存在铰链序列而形成同二聚体或异二聚体的二聚体的形式，并且此外，本发明的长效缀合物可以是其中连接体的一端与二聚免疫球蛋白Fc片段的一条链连接的形式，但免疫球蛋白Fc片段和缀合物不限于此。
此外，本发明的免疫球蛋白Fc片段可以包括N端中的铰链序列，但不限于此。
如本文中使用的，术语“N端”指的是蛋白质或多肽的氨基端，并且其可以包括来自最末端或氨基端的最末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸。
此外，本发明的免疫球蛋白Fc片段可以是延伸的Fc片段，其包括全部或部分重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)——不包括免疫球蛋白的重链和轻链可变区，只要其具有与其天然类型相比基本上相同或改进的作用。此外，本发明的免疫球蛋白Fc片段可以是其中对应于CH2和/或CH3的一些相当长的氨基酸序列被去除的区域。
例如，本发明的免疫球蛋白Fc片段可以是1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域；2)CH1结构域和CH2结构域；3)CH1结构域和CH3结构域；4)CH2结构域和CH3结构域；5)(i)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域之中的一个或两个或更多个结构域和(ii)免疫球蛋白铰链区(或部分铰链区)的组合；或6)重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域的二聚体，但免疫球蛋白Fc区不限于此。
此外，在一个实施方式中，免疫球蛋白Fc片段可以具有二聚形式，并且X的一个分子可以以二聚形式与一个Fc片段共价连接，特别地，免疫球蛋白Fc和X可以通过连接体彼此共价连接。同时，也可能的是X的两个分子以二聚形式对称地与一个Fc片段连接。特别地，免疫球蛋白Fc和X可以通过连接体彼此连接，但不限于上面描述的实施方式。
此外，本发明的免疫球蛋白Fc片段包括天然氨基酸序列以及其序列衍生物。氨基酸序列衍生物意味着该序列由于天然氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基中的缺失、插入、非保守或保守取代，或其组合而与天然氨基酸序列不同。
例如，已知对连接很重要的IgG Fc中位置214至238、297至299、318至322或327至331位置处的氨基酸残基可用作适合变异的位点。
此外，各种类型的衍生物是可用的，例如，其中去除能够形成间二硫键的位点的衍生物；其中去除来自天然Fc的几个N端氨基酸的衍生物；其中将甲硫氨酸残基添加到天然Fc的N端的衍生物等。此外，补体结合位点(例如C1q结合位点)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点可以被去除以消除效应子功能。制备这些免疫球蛋白Fc片段的序列衍生物的技术在国际公开号WO 97/34631、WO 96/32478等中公开。
蛋白质或肽中不改变分子的整个活性的氨基酸取代是本领域众所周知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常见的取代发生在Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly的氨基酸残基之间。在一些情况下，氨基酸可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酰化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等进行修饰。
上面描述的Fc衍生物可以是表现出与本发明的Fc片段相同的生物活性并且具有增加的Fc片段对热、pH等的结构稳定性的那些衍生物。
此外，此类Fc片段可以从自人类或动物(例如，牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、豚鼠等)中分离的天然类型中获得，或者可以是从转化的动物细胞或微生物中获得的其重组物或衍生物。特别地，Fc片段可以通过从活体人或动物中分离整个免疫球蛋白并用蛋白酶处理分离的免疫球蛋白来从天然免疫球蛋白中获得。当整个免疫球蛋白用木瓜蛋白酶处理时，其被裂解成Fab和Fc片段，然而当用胃蛋白酶处理时，其被裂解成pF′c和F(ab)2片段。Fc或pF′c可以使用尺寸排除色谱法等进行分离。在更具体的实施方式中，Fc片段可以是重组免疫球蛋白Fc片段，其中人源性Fc片段从微生物中获得。
此外，免疫球蛋白Fc片段可以是天然聚糖的形式，与天然类型相比增加或减少的聚糖，或者以去糖基化的形式。免疫球蛋白Fc聚糖的增加、减少或去除可以通过传统方法(诸如化学法、酶法和使用微生物的基因工程法)实现。特别地，其中从Fc中去除聚糖的免疫球蛋白Fc片段显示出对补体(C1q)的结合亲和力显著降低，以及抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性的降低或去除，因此其不会在体内诱导不必要的免疫应答。在这方面，以去糖基化或无糖基化形式的免疫球蛋白Fc片段可以更适合于满足本发明作为药物载体的原始目的。
如本文中使用的，术语“去糖基化”指的是其中用酶去除聚糖的Fc片段，术语“无糖基化”指的是在原核生物(更具体而言大肠杆菌)中产生的非糖基化Fc片段。
同时，免疫球蛋白Fc片段可以来源于人或动物(例如，牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、豚鼠等)，并且在更具体的实施方式中，其可以来源于人。
此外，免疫球蛋白Fc片段可以来源于IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其组合或杂化物。在更具体的实施方式中，免疫球蛋白Fc片段可以来源于IgG或IgM，IgG或IgM是人血液中最丰富的蛋白质之一，并且在更加具体的实施方式中，其可以来源于IgG，已知IgG增强配体结合蛋白的半衰期。在仍更加具体的实施方式中，免疫球蛋白Fc片段可以是IgG4 Fc片段，并且在最具体的实施方式中，其可以是来源于人IgG4的无糖基化Fc片段，但不限于此。
此外，在一个实施方式中，为人IgG4 Fc片段的免疫球蛋白Fc片段可以是其中两个单体通过半胱氨酸(其为每个单体的第3个氨基酸)之间的间二硫键(链间形式)连接的同二聚体形式。特别地，同二聚体可以具有两个二硫键(链内形式)，即一个单体中位置35和95处的半胱氨酸之间的内二硫键和其他单体中位置141和199处的半胱氨酸之间的内部二硫键；和/或每个单体可以由221个氨基酸组成，并且形成同二聚体的氨基酸可以由总共442个氨基酸组成，但氨基酸的数目不限于此。具体而言，免疫球蛋白Fc片段可以是包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的同二聚体(由442个氨基酸组成)，其中两个具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的单体(由221个氨基酸组成)通过半胱氨酸(其为每个单体的第3个氨基酸)之间的间二硫键形成同二聚体，并且其中同二聚体的单体在位置35和95处的半胱氨酸之间独立地形成内二硫键，以及在位置141和199处的半胱氨酸之间独立地形成内二硫键，但免疫球蛋白Fc片段不限于此。
同时，如本文中使用的，术语“组合”意味着编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc片段的多肽与不同来源的单链多肽连接以形成二聚体或多聚体。也就是说，可能从选自IgGFc片段、IgAFc片段、IgM Fc片段、IgD Fc片段和IgE Fc片段的两个或更多个片段中制备二聚体或多聚体。
如本文中使用的，术语“杂化物”意味着对应于不同来源的两个或更多个免疫球蛋白Fc片段的序列存在于免疫球蛋白恒定区的单链中。在本发明中，各种杂化物形式是可能的。例如，杂化物结构域可以由选自IgG Fc、IgM Fc、IgAFc、IgE Fc和IgD Fc的CH1、CH2、CH3和CH4的一至四个结构域组成，并且可以进一步包括铰链区。
同时，IgG还可以被分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类，并且本发明可以包括其组合或杂化物。优选的是IgG2和IgG4亚类，最优选的是IgG4的Fc片段，其很少具有效应子功能诸如补体依赖性细胞毒性(CDC)。
同时，GLP-2或GLP-2的长效缀合物可以包括所有那些以肽本身、其盐(例如，该肽的药学上可接受的盐)或其溶剂化物的形式。
此外，GLP-2或GLP-2的长效缀合物可以是任何药学上可接受的形式。
盐的种类没有具体限制。然而，盐优选地为对受试者(例如哺乳动物)安全且有效的盐，但不具体限于此。
术语“药学上可接受的”指的是在药物医学决策的范围内可以有效地用于预期用途而不会引起过度毒性、刺激、过敏反应等的材料。
如本文中使用的，术语“药学上可接受的盐”指的是来源于药学上可接受的无机酸、有机酸或碱的盐。合适的盐的实例可以包括盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、甲苯对磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。来源于合适的碱的盐的实例可以包括碱金属诸如钠、钾等；碱土金属，诸如镁；和铵等。
如本文中使用的，术语“溶剂化物”指的是在根据本发明的肽或其盐与溶剂分子之间形成的复合体。
在具体实例中，本发明的液体制剂可以包括：
GLP-2的长效缀合物；
缓冲剂，其选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐，及其组合；
葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇或其组合；
非离子表面活性剂，其选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯及其组合；和
氨基酸，其选自甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸及其组合，以及
其中液体制剂的pH为4.5至6.5，但不限于此。
在具体实例中，本发明的液体制剂可以包括：
药理学有效量的GLP-2的长效缀合物(例如，18nmol/mL至18,630nmol/mL)；
5mM至100mM的缓冲剂；
1％(w/v)至20％(w/v)的糖醇、糖类或其组合；
0.001％(w/v)至0.2％(w/v)的非离子表面活性剂；和
0.01mg/mL至1mg/mL的氨基酸，并且
其中液体制剂的pH为4.5至6.5，但不限于此。
在具体实例中，本发明的液体制剂可以包括：
186至18,630nmol/mL的GLP-2的长效缀合物；
5mM至100mM的乙酸及其盐或柠檬酸及其盐的缓冲剂；
1％(w/v)至20％(w/v)的蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇或其组合；
0.001％(w/v)至0.2％(w/v)的聚山梨醇酯；和
0.01mg/mL至1mg/mL的甲硫氨酸，并且
其中液体制剂的pH为4.5至6.5，但不限于此。
在具体实例中，本发明的液体制剂可以包括：
186nmol/mL至2,981nmol/mL的GLP-2的长效缀合物；
10mM至40mM的乙酸及其盐或柠檬酸及其盐的缓冲剂；
2％(w/v)至15％(w/v)的蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇或其组合；
0.002％(w/v)至0.05％(w/v)的聚山梨醇酯；和
0.02mg/mL至0.5mg/mL的甲硫氨酸，并且
其中液体制剂的pH为4.8至6.0，但不限于此。
实施本发明的另一个方面提供了制备液体制剂的方法。
具体而言，制备液体制剂的方法可以包括：混合(i)GLP-2的长效缀合物，其中GLP-2和免疫球蛋白Fc片段彼此连接；与(ii)稳定剂，其包括糖醇、糖类或其组合；和缓冲剂。
GLP-2的长效缀合物、缓冲剂、糖醇、糖类、稳定剂和液体制剂与上面描述的相同。
本发明的治疗方法可以包括以药学(在治疗上)有效量施用液体制剂。液体制剂的适当日总剂量可以由从业者在正确的医学判断的范围内确定，并且液体制剂可以以分剂量施用一次或几次。然而，为了本发明的目的，优选的是，对于任何特定的患者，液体制剂的具体药学(在治疗上)有效剂量根据要实现的反应的种类和程度、具体的组合物(包括是否偶尔与其他药剂一起使用)、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、组合物的排泄率、治疗持续时间、各种因素(包括与具体组合物组合或同时使用的药物)以及医学领域众所周知的类似因素而不同地应用。
在下文中，将参考下列实施例对本发明进行更详细的描述。然而，这些实施例仅用于说明目的，并且本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1:CA-GLP-2KC–PEG(10K)–免疫球蛋白Fc缀合物或CA-GLP-2RC–PEG(10K)– 免疫球蛋白Fc缀合物的制备
对于10kDa MAL-ALD PEG(马来酰亚胺-PEG-醛，其是分子量为10kDa的聚乙二醇，其中每个末端处的氢分别用3-[(3-N-马来酰亚胺基)丙酰基]氨丙基和3-氧代丙基(丙醛基)修饰；NOF Inc.,Japan)对CA-GLP-2KC或CA-GLP-2RC(CPC,Chinese Peptide Co,China)的第34个半胱氨酸残基的PEG化，反应进行1至3小时，CA-GLP-2KC或CA-GLP-2RC与PEG的摩尔比为1：1至2，并且肽浓度为1mg/mL至3mg/mL。本文中，反应在50mM Tris(pH 7.5)和异丙醇的混合溶剂中进行。从反应溶液中，使用SP Sepharose高效柱(GE,U.S.A.)，利用氯化钾和含有柠檬酸钠(pH 2.0)和乙醇的缓冲液的浓度梯度，纯化单PEG化的CA-GLP-2KC或单PEG化的CA-GLP-2RC。
此后，在2℃至8℃下进行反应12至20小时，纯化的单PEG化的CA-GLP-2KC或单PEG化的CA-GLP-2RC与SEQ ID NO:32的免疫球蛋白Fc片段的摩尔比为1：2至1：6并且总蛋白浓度为30mg/mL至35mg/mL。本文中，反应溶液含有100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)和异丙醇，其中加入20mM氰基硼氢化钠(NaCNBH3)作为还原剂。
反应完成之后，(i)CA-GLP-2KC(10K PEG)衍生物的长效缀合物(CA-GLP-2KC-PEG(10K)-免疫球蛋白Fc)和(ii)CA-GLP-2RC(10K PEG)衍生物的长效缀合物(CA-GLP-2RC-PEG(10K)-免疫球蛋白Fc)，其中CA-GLP-2KC或CA-GLP-2RC通过PEG与免疫球蛋白Fc共价连接，通过应用于Source15Q柱(GE,U.S.A)，使用双-Tris缓冲液(pH 6.5)和氯化钠的浓度梯度，和通过应用于Source 15ISO柱(GE,U.S.A.)，使用硫酸铵和柠檬酸钠(pH 5.0至pH5.2)的浓度梯度，从反应溶液中进行纯化。作为HPLC反相分析的结果，缀合物的纯度分别被确定为92.9％和95.6％。
实施例2:CA-GLP-2 RK–PEG(3.4K或10K)–免疫球蛋白Fc缀合物的制备
对于3.4kDa或10kDa的ALD(2)PEG(醛-PEG-醛，其是分子量为3.4kDa的聚乙二醇，其中每个末端处的氢用3-氧代丙基(丙醛基)修饰；NOF Inc.,Japan)对CA-GLP-2RK(CPC,Chinese Peptide Co.,China)的第34个赖氨酸残基的PEG化，反应在2℃至8℃下进行4至16小时，CA-GLP-2RK与PEG的摩尔比为1：5至1：20，并且肽浓度为5mg/mL至10mg/mL。本文中，反应在20mM HEPES(pH 7.5)和乙醇中进行，并通过加入20mM氰基硼氢化钠作为还原剂进行。从反应溶液中，通过使用Source 15S柱(GE,U.S.A.)，利用氯化钾和含有柠檬酸钠(pH 2.0)和乙醇的缓冲液的浓度梯度，纯化单PEG化的CA-GLP-2RK。
此后，根据与实施例1中相同的反应和纯化条件，对纯化的单PEG化的CA-GLP-2RK和SEQ ID NO:32的免疫球蛋白Fc的缀合物进行制备和纯化。作为HPLC反相分析的结果，(i)CA-GLP-2RK(3.4K PEG)衍生物的长效缀合物(CA-GLP-2RK-PEG(3.4K)-免疫球蛋白Fc)和(ii)CA GLP-2RK(10K PEG)衍生物的长效缀合物(CA-GLP-2RK-PEG(10K)-免疫球蛋白Fc)的纯度分别被确定为94.3％和92.6％，其中CA-GLP-2RK通过PEG与免疫球蛋白Fc共价连接。
实施例3: CA-GLP-2KK–PEG(10K)–免疫球蛋白Fc缀合物和CA-GLP-2KAZK–PEG (10K)–免疫球蛋白Fc缀合物的制备
通过根据实施例2的方法使用CA-GLP-2KK和CA-GLP-2KAZK，对CA GLP-2KK(10KPEG)衍生物的长效缀合物(CA-GLP-2KK-PEG(10K)-免疫球蛋白Fc)和CA GLP-2KAZK(10KPEG)衍生物的长效缀合物(CA-GLP-2KAZK-PEG(10K)-免疫球蛋白Fc)进行制备和纯化，其中CA-GLP-2KK或CA-GLP-2KAZK通过PEG与SEQ ID NO:32的免疫球蛋白Fc共价连接。
实施例4:根据缓冲剂的类型和pH评估GLP-2衍生物肽的长效缀合物的稳定性
基于由缓冲剂、作为表面活性剂的聚山梨醇酯20、糖醇和甲硫氨酸组成的液体制剂，根据缓冲剂的类型和pH比较了GLP-2衍生物肽(以下称为“GLP-2衍生物”)的长效缀合物的稳定性。
使用表2所示的组合物制备GLP-2衍生物的长效缀合物(CA-GLP-2RK(3.4K PEG))的液体制剂(液体制剂中长效缀合物的浓度约为186.3nmol/mL)，并在25℃下储存5周，然后通过离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)和尺寸排除色谱法(SE-HPLC)进行分析。
在表3中，IE-HPLC(％)、RP-HPLC(％)和SE-HPLC(％)表示面积％/起始面积％(％)，表示GLP-2衍生物的长效缀合物相对于初始结果值的残留比率。
[表2]
Figure BDA0004113742410000241
Figure BDA0004113742410000251
[表3]
Figure BDA0004113742410000252
从上面的结果可以看出，确定了在柠檬酸钠和乙酸钠缓冲溶液的存在下，稳定性根据pH发生变化。
实施例5:根据稳定剂的类型和pH评估GLP-2衍生物的长效缀合物的稳定性
基于上面的液体制剂的组合物(乙酸钠、聚山梨醇酯20和甲硫氨酸)，根据稳定剂的类型和pH比较了GLP-2衍生物的长效缀合物的稳定性。
对于稳定剂，除了实施例1中确定的甘露糖醇之外，还添加了山梨糖醇和蔗糖，并通过比较pH为5.1和6.0来比较GLP-2衍生物的长效缀合物的稳定性。
特别地，甘露糖醇、山梨糖醇和蔗糖的浓度是考虑到商业上可获得的制剂的最大允许范围和许可机构建议的范围选择的。
使用表4中所示的组合物制备GLP-2衍生物的长效缀合物(CA-GLP-2RK(3.4KPEG))的液体制剂(液体制剂中长效缀合物的浓度约为1,117.8nmol/mL)，并且在25℃下储存4周，然后通过IE-HPLC、RP-HPLC和SE-HPLC进行分析。
在表5中，IE-HPLC(％)、RP-HPLC(％)和SE-HPLC(％)表示面积％/起始面积％(％)，表示GLP-2衍生物的长效缀合物相对于初始结果值的残留比率。
[表4]
Figure BDA0004113742410000253
/>
Figure BDA0004113742410000261
[表5]
Figure BDA0004113742410000262
从上面的结果可以看出，GLP-2衍生物的长效缀合物在本发明的液体制剂中是稳定的。
实施例6:使用最终制剂组合物对GLP-2衍生物的长效缀合物的高浓度液体制剂进 行长期储存稳定性测试
使用含有pH为6.0的乙酸钠、蔗糖、聚山梨醇酯20和甲硫氨酸的液体制剂，其是通过前述实施例最终选定的，分析三种浓度的GLP-2衍生物的长效缀合物(CA-GLP-2RK(3.4KPEG))的高浓度液体制剂的长期储存稳定性。表6显示了高浓度液体制剂在5℃±3℃储存12个月的长期储存稳定性的结果，并且RP-HPLC(％)和SE-HPLC(％)表示面积％/起始面积％(％)，表示GLP-2衍生物的长效缀合物相对于初始结果值的残留比率。
[表6]
Figure BDA0004113742410000263
/>
Figure BDA0004113742410000271
作为长期储存稳定性测试的结果，确定了在三个高浓度下的GLP-2衍生物的长效缀合物在本发明的液体制剂中稳定了超过9个月。
从前述内容来看，本发明所属领域的普通技术人员将能够理解的是本发明可以在不修改本发明的技术概念或本质特征的情况下以其他具体形式体现。在这方面，本文中公开的示例性实施方式仅用于说明的目的，并且不应被解释为限制本发明的范围。相反，本发明意欲不仅涵盖示例性实施方式，还涵盖各种替代方案、修改、等同物和可以包括在由所附权利要求书限定的本发明的精神和范围内的其他实施方式。
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<212> PRT
<213> 智人
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<220>
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<223> Xaa是赖氨酸或精氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa不存在，是赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、6-叠氮赖氨酸或半胱氨酸
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Xaa Xaa Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
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Asp Xaa
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
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<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa是组氨酸、咪唑乙酰基去组氨酸、去氨基组氨酸、β-羟基咪唑丙酰基去组氨酸、N-二甲基组氨酸或β-羧基咪唑丙酰基去组氨酸
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<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是丙氨酸、甘氨酸或Aib(2-氨基异丁酸)
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<221> MISC_FEATURE
<222> (30)
<223> Xaa是赖氨酸或精氨酸
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<221> MISC_FEATURE
<222> (34)
<223> Xaa是任何一种或多种氨基酸，或任何一种或多种被修饰的氨基酸
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Xaa Xaa Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
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Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Xaa Ile Thr
20 25 30
Asp Xaa
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Pro Ser Cys Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Pro
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<213> 人工序列
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<223> 铰链区的变体
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser
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<210> 15
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<213> 人工序列
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<223> 铰链区的变体
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
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<223> 铰链区的变体
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<223> 铰链区的变体
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Glu Pro Ser Cys Pro
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Pro Ser Cys Pro
1
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Cys Pro
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Lys Tyr Gly Pro Pro Pro Ser Cys Pro
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<211> 9
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<223> 铰链区的变体
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Ser Cys Pro
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<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 26
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 27
Glu Ser Lys Pro Ser Cys Pro
1 5
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 28
Glu Ser Pro Ser Cys Pro
1 5
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 29
Glu Pro Ser Cys
1
<210> 30
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 30
Ser Cys Pro
1
<210> 31
<211> 221
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
1 5 10 15
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
20 25 30
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
35 40 45
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
50 55 60
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
65 70 75 80
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
85 90 95
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
100 105 110
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
115 120 125
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
130 135 140
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
145 150 155 160
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
165 170 175
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
180 185 190
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
195 200 205
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215 220
<210> 32
<211> 442
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(442)
<223> 在位置1至442处的氨基酸形成人免疫球蛋白G4 Fc片段(同二聚体)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(221)
<223> 在位置1至221处的氨基酸形成一个单体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (222)..(442)
<223> 在位置222至442处的氨基酸形成一个单体
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(224)
<223> 在位置3和位置224处的氨基酸形成间二硫键
<220>
<221> DISULFID
<222> (35)..(95)
<223> 在位置35和位置95处的氨基酸形成链内二硫键
<220>
<221> DISULFID
<222> (141)..(199)
<223> 在位置141和位置199处的氨基酸形成链内二硫键
<220>
<221> DISULFID
<222> (256)..(316)
<223> 在位置256和位置316处的氨基酸形成链内二硫键
<220>
<221> DISULFID
<222> (362)..(420)
<223> 在位置362和位置420处的氨基酸形成链内二硫键
<400> 32
Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
1 5 10 15
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
20 25 30
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
35 40 45
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
50 55 60
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
65 70 75 80
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
85 90 95
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
100 105 110
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
115 120 125
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
130 135 140
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
145 150 155 160
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
165 170 175
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
180 185 190
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
195 200 205
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Pro Ser Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440

Claims (27)

1.一种GLP-2的长效缀合物的液体制剂，其包括：
18nmol/mL至18,630nmol/mL的由下面的化学式1表示的GLP-2的长效缀合物，和
稳定剂，其包括1％(w/v)至20％(w/v)的糖醇、糖类或其组合；和以用于将pH维持在4.5至6.5的范围内的量的缓冲剂：
[化学式1]
X–La–F
其中，
X是天然GLP-2或GLP-2衍生物；
L是含有乙二醇重复单元的连接体；
a是0或自然数，其条件是当a是2或更大时，每个L彼此独立；
F是免疫球蛋白Fc片段；和
–表示共价键。
2.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述GLP-2衍生物在所述天然GLP-2序列中的一个或多个氨基酸中具有选自取代、添加、缺失、修饰及其组合的变异。
3.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述X包括由下面的通式1表示的氨基酸序列：
[通式1]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34(SEQ ID NO:9)
其中，
X1是组氨酸、咪唑乙酰基去组氨酸、去氨基组氨酸、β-羟基咪唑丙酰基去组氨酸、N-二甲基组氨酸或β-羧基咪唑丙酰基去组氨酸；
X2是丙氨酸、甘氨酸或Aib(2-氨基异丁酸)；
X30是赖氨酸或精氨酸；和
X34不存在，或是赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、6-叠氮赖氨酸或半胱氨酸。
4.根据权利要求3所述的液体制剂，其中所述X是：
(1)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，和X34是半胱氨酸，
(2)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，和X34是赖氨酸，
(3)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是精氨酸，和X34是赖氨酸，
(4)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，和X34是6-叠氮赖氨酸，
(5)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是精氨酸，和X34是半胱氨酸，
(6)X1是咪唑乙酰基去组氨酸，X2是Aib，X30是赖氨酸，和X34是半胱氨酸，或
(7)X1是组氨酸，X2是Aib，X30是赖氨酸，和X34是半胱氨酸。
5.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述X包括由下面的通式2表示的氨基酸序列：
[通式2]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34(SEQ ID NO:10)
其中，
X1是组氨酸、咪唑乙酰基去组氨酸、去氨基组氨酸、β-羟基咪唑丙酰基去组氨酸、N-二甲基组氨酸或β-羧基咪唑丙酰基去组氨酸；
X2是丙氨酸、甘氨酸或Aib(2-氨基异丁酸)；
X30是赖氨酸或精氨酸；和
X34是任何一种或多种氨基酸，或任何一种或多种其中发生变异的氨基酸。
6.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述GLP-2衍生物包括选自SEQ ID NO:2至8的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc片段是无糖基化的IgG4 Fc区。
8.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述F是由两条多肽链组成的二聚体，并且所述L的一端仅与所述两条多肽链中的一条连接。
9.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述L是聚乙二醇。
10.根据权利要求1所述的液体制剂，其中在所述L中所述乙二醇重复单元部分的化学式量在1kDa至100kDa的范围内。
11.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc片段包括所述SEQ IDNO:32的氨基酸序列。
12.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述液体制剂的pH在4.8至6.0的范围内。
13.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述稳定剂进一步包括选自非离子表面活性剂和氨基酸中的一种或多种组分。
14.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述缓冲剂选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐，以及其组合。
15.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述缓冲剂的浓度为5mM至100mM。
16.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述糖醇是选自甘露糖醇和山梨糖醇中的一种或多种。
17.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述糖类为葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或其组合。
18.根据权利要求13所述的液体制剂，其中所述非离子表面活性剂为泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合。
19.根据权利要求13所述的液体制剂，其中所述非离子表面活性剂选自泊洛沙姆188、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其组合。
20.根据权利要求13所述的液体制剂，其中所述非离子表面活性剂在所述液体制剂中以0.001％(w/v)至0.2％(w/v)的浓度存在。
21.根据权利要求13所述的液体制剂，其中所述氨基酸选自甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸及其组合。
22.根据权利要求13所述的液体制剂，其中所述氨基酸在所述液体制剂中以0.01mg/mL至1mg/mL的浓度存在。
23.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述液体制剂包括：
18nmol/mL至18,630nmol/mL的GLP-2的长效缀合物；
5mM至100mM的缓冲剂；
1％(w/v)至20％(w/v)的糖醇、糖类或其组合；
0.001％(w/v)至0.2％(w/v)的非离子表面活性剂；和
0.01mg/mL至1mg/mL的氨基酸，并且
其中所述液体制剂的pH为4.5至6.5。
24.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述液体制剂包括：
18nmol/mL至18,630nmol/mL的GLP-2的长效缀合物；
5mM至100mM的缓冲剂，其选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐，以及其组合；
1％(w/v)至20％(w/v)的葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇或其组合；
0.001％(w/v)至0.2％(w/v)的非离子表面活性剂，其选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯及其组合；和
0.01mg/mL至1mg/mL的氨基酸，其选自甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸及其组合，并且
其中所述液体制剂的pH为4.5至6.5。
25.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述液体制剂包括：
186nmol/mL至2,981nmol/mL的GLP-2的长效缀合物；
10mM至40mM的乙酸及其盐或柠檬酸及其盐的缓冲剂；
1％(w/v)至20％(w/v)的蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇或其组合；
0.002％(w/v)至0.05％(w/v)的聚山梨醇酯；和
0.02mg/mL至0.5mg/mL的甲硫氨酸，并且
其中所述液体制剂的pH为4.8至6.0。
26.根据权利要求1所述的液体制剂，进一步包括多元醇。
27.一种制备根据权利要求1至26中任一项所述的液体制剂的方法，其包括：混合(i)所述GLP-2的长效缀合物，其中GLP-2和所述免疫球蛋白Fc片段彼此连接；与(ii)稳定剂，其包括糖醇、糖或其组合；和缓冲剂。
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