KR20230080175A - 귀리 품종을 판별하기 위한 분자 마커 및 이의 이용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 귀리 품종, 구체적으로 국내 귀리 21개 품종을 판별하는 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 마커는 국내 육성 귀리 21개 품종을 판별할 수 있는 바, 혼종 방지 등의 품질관리로 국내 육성 품종에 대해 차별화할 수 있고, 수입 맥류 부정 유통 방지 및 국내 육성 맥류의 품질 경쟁력을 확보할 수 있으며, 나아가 국내 육성 귀리 품종의 유전자원 보호에 활용할 수 있다.
본 발명의 마커는 국내 육성 귀리 21개 품종을 판별할 수 있는 바, 혼종 방지 등의 품질관리로 국내 육성 품종에 대해 차별화할 수 있고, 수입 맥류 부정 유통 방지 및 국내 육성 맥류의 품질 경쟁력을 확보할 수 있으며, 나아가 국내 육성 귀리 품종의 유전자원 보호에 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 귀리 품종, 구체적으로 국내 귀리 21개 품종을 판별하는 dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) 마커 및 이의 이용에 관한 것이다.
귀리(Avena sativa L.)는 세계적으로 벼과 작물 중에서 밀, 옥수수, 벼, 귀리 다음으로 생산량이 많은 작물이며 대부분이 가축사료로 쓰이나, 최근 성인병 예방 등 식용으로도 그 가치를 인정받고 있다. 그러나, 국내 귀리 재배는 관련 전문인력 양성, 기술개발, 유통채널 등과 같은 인프라가 취약하고, 품질 및 재배환경 개선을 위한 체계적인 연구개발이 부족한 실정이다.
이에 대해 다양한 국내 귀리 품종을 육성하고 이에 대한 보호와 권리 확보가 필요한 실정이다.
특히 귀리 품종의 혼입은 품질 특성 차이로 인한 귀리 품질 저하를 초래하는 바, 국내 및 국외 귀리 품종의 혼종 방지에 의한 국내 귀리 품질 향상을 통해 국내 귀리의 경쟁력 향상이 요구되며, 이를 위해 국내 귀리 품종을 구별 및 판별하기 위한 기술 개발이 우선적으로 요구되어 왔다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 국내 귀리 품종의 혼종 방지를 위해 예의 연구 노력한 결과, 국내 귀리 21개 품종을 판별할 수 있는 dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) 마커를 선별함으로써 본 발명을 완성하였다.
1. 김경민, 국내 귀리품종의 품질특성 및 품종판별용 분자마커 개발, 2017.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 60의 올리고뉴클레오티드; 또는 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드;를 포함하는, 귀리 품종 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 60의 염기서열에서 선택되는 어느 하나 이상의 연속적인 폴리뉴클레오티드; 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 조합;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 귀리 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하는, 귀리 품종 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 귀리 품종 판별 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 내지 서열번호 60의 올리고뉴클레오티드; 또는 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드;를 포함하는, 귀리 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서 용어, "올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 용어, “프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라, 온도 및 이온 강도와 같은 이용 조건에 의존할 것이다. 구체적 예로, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 구아닌 및 시토신의 함량(GC contents), GC배열, 어닐링(annealing) 온도 및 이온 강도 등 여러 조건을 고려하여 결정해야 한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTPs)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 프라이머로 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 구체적인 예로써 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent) 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 프라이머는 변형시킬 수 있으며, 예를 들어 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는, 구체적으로 서열번호 1 내지 서열번호 60의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트는
i) 서열번호 2n-1의 정방향 프라이머; 및
ii) 서열번호 2n의 역방향 프라이머;로 구성되는 프라이머 세트를 포함하고,
상기 n은 1 내지 30의 자연수로, i) 및 ii)의 n은 동일한 값을 갖는 30쌍의 프라이머 세트로 구성될 수 있다.
일예로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8 로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10 로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 15 및 서열번호 16으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 17 및 서열번호 18로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 19 및 서열번호 20으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 21 및 서열번호 22로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 23 및 서열번호 24로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 25 및 서열번호 26로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 27 및 서열번호 28로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 29 및 서열번호 30으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 31 및 서열번호 32로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 33 및 서열번호 34로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 35 및 서열번호 36으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 37 및 서열번호 38로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 39 및 서열번호 40으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 41 및 서열번호 42로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 43 및 서열번호 44로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 45 및 서열번호 46으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 47 및 서열번호 48로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 49 및 서열번호 50으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 51 및 서열번호 52로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 53 및 서열번호 54로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 55 및 서열번호 56으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 57 및 서열번호 58로 구성되는 프라이머 세트; 또는 서열번호 59 및 서열번호 60으로 구성되는 프라이머 세트;로 구성될 수 있다.
한편, 전술한 프라이머 세트와 동일한 영역을 증폭할 수 있고 동일한 기능을 하는 프라이머라면, 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
또한, 서열번호 1 내지 60으로 구성되는 30쌍의 프라이머 세트 중 1개 이상, 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상, 29개 이상 또는 30개의 프라이머 세트를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 귀리 품종 판별용 프라이머 세트는, 표적 서열의 증폭을 위하여 사용될 수 있으며, 특히, 귀리 품종 판별을 위한 SNP 및/또는 Indel 서열의 증폭을 위하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 프라이머 세트는 귀리 게놈 DNA의 SNP 및/또는 InDel의 마커를 검출 또는 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명에서 용어 "단일염기다형성(single nucleotide polymorphism: SNP) 마커"은 염색체가 갖고 있는 염기서열 중 개체 또는 품종 간의 편차를 나타내는 염기 변이를 의미한다. 구체적으로는 특정 염기서열 중 한 염기쌍의 차이를 의미할 수 있다. 상기 SNP 마커는 표준유전체와 실험에 사용된 품종의 유전체 정보를 비교 분석하는 방법을 통해 표준유전체의 염기서열과 상이한 하나 이상의 염기쌍 영역의 정보를 바탕으로 프라이머를 제작한다.
본 발명에서 용어, "Indel(Insertion/deletion) 마커"는 DNA의 염기배열에서 일부 염기가 중간에 삽입되거나(insertion) 결실된(deletion) 변이를 총칭한다. 상기 Indel 마커는 표준유전체와 실험에 사용된 품종의 유전체 정보를 비교 분석하는 방법을 통해 표준유전체보다 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 영역을 탐색하고 그 정보를 바탕으로 프라이머를 제작한다. 따라서 그 증폭 결과는 표준유전체와 비교하여 밴드 크기가 큰 경우(insertion)와 작은 경우(deletion)의 두 종류 타입을 나타낼 수 있다.
상기 "마커(marker)"는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 의미한다.
상기 용어, "표준유전체"는 본 발명의 품종 판별에 있어 기준이 되는 작물의 품종의 유전체를 의미한다.
상기 용어, "유전자좌"는 분자 마커의 유전자 지도상의 위치를 의미한다.
구체적으로, 본 발명의 프라이머 세트 중 서열번호 37 및 서열번호 38로 구성되는 프라이머 세트 및 서열번호 43 및 서열번호 44로 구성되는 프라이머 세트는 InDel 마커를 검출 또는 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트일 수 있고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8 로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10 로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 15 및 서열번호 16으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 17 및 서열번호 18로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 19 및 서열번호 20으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 21 및 서열번호 22로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 23 및 서열번호 24로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 25 및 서열번호 26로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 27 및 서열번호 28로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 29 및 서열번호 30으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 31 및 서열번호 32로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 33 및 서열번호 34로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 35 및 서열번호 36으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 39 및 서열번호 40으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 41 및 서열번호 42로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 45 및 서열번호 46으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 47 및 서열번호 48로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 49 및 서열번호 50으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 51 및 서열번호 52로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 53 및 서열번호 54로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 55 및 서열번호 56으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 57 및 서열번호 58로 구성되는 프라이머 세트; 또는 서열번호 59 및 서열번호 60으로 구성되는 프라이머 세트;는 SNP의 마커를 검출 또는 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 삼한, 광한, 옥한, Swan, 일한, Gehl, 다경, 다조, 다한, 동한, 선양, 신한, 조풍, 조한, 태한, 풍한, Hi-early, 중모 2005, 중모 2501, 중모 2507 및 중모 2511로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 품종을 판별할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에서, 본 발명에서 선별된 30쌍의 프라이머 세트를 이용하여 국내 귀리 28개 품종에 대해 PCR 수행 후 다형성 분석한 결과, 전술한 국내 귀리 21개 품종을 판별할 수 있음을 확인하였다(도 1 내지 도 5, 도 7).
본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 1 내지 서열번호 60의 염기서열에서 선택되는 어느 하나 이상의 연속적인 올리고뉴클레오티드; 이들의 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고뉴클레오티드; 및 이들의 조합;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 귀리 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하는, 귀리 품종 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는, 귀리 품종 판별용 키트를 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트는, 이에 제한되는 것은 아니나, PCR 키트, DNA 분석용(예, DNA 칩) 키트일 수 있다.
본 발명의 키트는 본 발명의 조성물을 이용하여 귀리 게놈 DNA의 SNP 및/또는 InDel 서열을 증폭하여 확인함으로써, 국내외 귀리 품종을 판별 또는 구별하는데 사용될 수 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.
예를 들어, PCR 키트는, 이전 양태에서 전술한 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브, 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 다양한 효소(Taq-폴리머라아제 등), DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 귀리 품종 판별용 DNA 칩 키트일 수 있다.
본 발명의 용어 "DNA 칩"이란, 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.
상기 DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 귀리 품종 판별 방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 (a) 단계는 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여, 본 발명의 귀리 품종 판별용 조성물 또는 본 발명의 귀리 품종 판별용 키트를 이용하여 PCR을 수행하는 것일 수 있다. 상기 본 발명의 귀리 품종 판별용 조성물 또는 본 발명의 귀리 품종 판별용 키트는 이전 양태에서 전술한 바와 같다.
상기 (a) 단계는 귀리 식물 개체 또는 종자로부터 분리된 시료를 이용하여 게놈 DNA를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시료는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일예로, 종자, 분리된 조직 또는 분리된 세포일 수 있다.
상기 (a) 단계는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의하여 수행될 수 있다. 상기 본 발명의 프라이머 세트는 이전 양태에서 전술한 바와 같다.
또한, 상기 (a) 단계의 PCR 수행 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적으로, 주형으로 사용되는 DNA는 각각의 개별 귀리 식물 또는 종자로부터 분리된 DNA일 수 있고, 2 이상의 귀리 식물 또는 종자를 포함하는 혼합 물질로부터 분리된 DNA일 수도 있다.
상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 것일 수 있다.
상기 증폭된 PCR 산물의 분석은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적으로, (a) 단계에 의하여 증폭된 DNA 마커의 서열을 결정하여, 목적하는 DNA 마커가 검출되었는지의 여부를 확인할 수 있다. 구체적인 방법으로서 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 증폭시킨 PCR 산물을 보다 효과적으로 인식하기 위하여, 상기 프라이머의 5' 또는 3' 말단에 형광물질 등으로 표지할 수 있다. 이때, 사용되는 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, FAM(6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), NEDTM 등을 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명의 특이적 프라이머 세트는 증폭된 PCR 산물의 명확한 크기 차이로 인하여, 별다른 형광물질의 표지 없이도 겔 상에서 밴드 사이즈로 이를 명확히 구분할 수 있다.
본 발명의 마커는 국내 육성 귀리 21개 품종을 판별할 수 있는 바, 혼종 방지 등의 품질관리로 국내 육성 품종에 대해 차별화할 수 있고, 수입 맥류 부정 유통 방지 및 국내 육성 맥류의 품질 경쟁력을 확보할 수 있으며, 나아가 국내 육성 귀리 품종의 유전자원 보호에 활용할 수 있다.
도 1은 dCAPS 마커 30쌍을 이용한 귀리 28품종의 PCR 검정 결과이다.
도 2는 dCAPS 마커 30쌍을 이용한 귀리 28품종의 PCR 검정 결과이다.
도 3은 dCAPS 마커 30쌍을 이용한 귀리 28품종의 PCR 검정 결과이다.
도 4는 dCAPS 마커 30쌍을 이용한 귀리 28품종의 PCR 검정 결과이다.
도 5는 dCAPS 마커 30쌍을 이용한 귀리 28품종의 PCR 검정 결과이다.
도 6은 dCAPS 마커 30쌍을 이용한 귀리 28품종의 계통수 분석 결과이다.
도 7은 dCAPS 30종 마커를 이용하여 확인한 귀리 28개 품종의 유전형 분석 결과이다.
도 2는 dCAPS 마커 30쌍을 이용한 귀리 28품종의 PCR 검정 결과이다.
도 3은 dCAPS 마커 30쌍을 이용한 귀리 28품종의 PCR 검정 결과이다.
도 4는 dCAPS 마커 30쌍을 이용한 귀리 28품종의 PCR 검정 결과이다.
도 5는 dCAPS 마커 30쌍을 이용한 귀리 28품종의 PCR 검정 결과이다.
도 6은 dCAPS 마커 30쌍을 이용한 귀리 28품종의 계통수 분석 결과이다.
도 7은 dCAPS 30종 마커를 이용하여 확인한 귀리 28개 품종의 유전형 분석 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. RNA-Seq를 이용한 각 품종별 염기서열 변이 분석
1-1. RNA 추출
조양 외 10개 귀리 품종의 RNA-Seq를 수행하기 위해, 각 품종의 유묘기 잎에서 RNA를 추출하였다. 추출된 각 품종의 RNA는 RIN(RNA integrity number) 값이 7.0 이상으로 라이브러리 제작 및 염기서열 분석에 적합하였다(표 1).
| Variety | RNA concentration (ng/uL) | Total amount of RNA(ug) | RIN | rRNA ratio |
| 조양(Choyang) | 1416.2 | 58.1 | 8.1 | 1.0 |
| 대양(Daeyang) | 1322.2 | 54.2 | 7.7 | 1.0 |
| 다크호스(Darkhorse) | 1567.0 | 64.2 | 8.2 | 1.0 |
| Gehl | 1709.4 | 70.1 | 8.6 | 1.1 |
| 광한(Gwanghan) | 1478.8 | 60.6 | 8.2 | 1.0 |
| 하이스피드(Hispeed) | 899.3 | 36.9 | 6.8 | 1.0 |
| 일한(Ilhan) | 1489.9 | 61.1 | 7.9 | 1.0 |
| 옥한(Okhan) | 1264.8 | 51.9 | 8.4 | 1.0 |
| 삼한(Samhan) | 1687.1 | 70.9 | 8.6 | 1.2 |
| Swan | 1741.4 | 71.4 | 7.8 | 1.0 |
1-2. 귀리 품종의 RNA-Seq을 위한 라이브러리 제작 및 RNA-Seq 수행
귀리 품종의 RNA-Seq을 위한 라이브러리를 제작하기 위해, 상기에서 추출한 RNA에 섞인 DNA를 제거한 후 단편화하였다. RNA로부터 cDNA를 합성한 후 후 양 말단에 어댑터(adapter)를 부착하고 적합한 크기의 cDNA를 선발하였다. 각 품종별 cDNA 라이브러리 작성 후 RNA-Seq를 수행하고 Illumina HiSeq X platform을 이용하여 염기서열을 결정하였다.
그 결과, 33,197,992~43,776,694개 read를 생성하였으며 평균 36,568,569개 임을 확인하였다(표 2). GC 비율은 평균 55%였고, 염기서열 정확도가 99%를 나타내는 Q20은 평균 98% 로 확인되었다. 이후, Trimmomatic 프로그램을 이용하여 어댑터와 짧은 read를 제거하여 31,187,392~41,304,176 개의 고품질 read를 생성하였다.
| Variety | Raw data | Trimmed data | ||||||
| Total read | Total nucleotide | GC (%) | Q20 (%) | Average length (bp) | Total read | Total nucleotide | Average length (bp) | |
| 조양(Choyang) | 34,091,906 | 5,147,877,806 | 54.82 | 98.27 | 151 | 31,937,598 | 4,679,320,810 | 146.5 |
| 대양(Daeyang) | 35,130,420 | 5,304,693,420 | 53.79 | 98.26 | 151 | 32,872,618 | 4,802,284,508 | 146.1 |
| 다크호스(Darkhorse) | 36,272,032 | 5,477,076,832 | 54.24 | 98.31 | 151 | 34,014,924 | 4,966,621,185 | 146.0 |
| Gehl | 43,776,694 | 6,610,280,794 | 54.40 | 98.46 | 151 | 41,304,176 | 5,998,734,784 | 145.2 |
| 광한(Gwanghan) | 37,093,196 | 5,601,072,596 | 54.85 | 98.33 | 151 | 34,804,440 | 5,077,842,605 | 145.9 |
| 하이스피드(Hispeed) | 33,197,992 | 5,012,896,792 | 54.00 | 98.34 | 151 | 31,187,392 | 4,554,914,836 | 146.0 |
| 일한(Ilhan) | 38,554,606 | 5,821,745,506 | 54.48 | 98.26 | 151 | 36,046,378 | 5,270,758,292 | 146.2 |
| 옥한(Okhan) | 33,311,918 | 5,030,099,618 | 55.15 | 98.28 | 151 | 31,244,814 | 4,557,668,933 | 145.9 |
| 삼한(Samhan) | 35,883,886 | 5,418,466,786 | 55.20 | 98.43 | 151 | 33,811,178 | 4,936,778,375 | 146.0 |
| Swan | 38,373,044 | 5,794,329,644 | 54.15 | 98.31 | 151 | 36,005,730 | 5,268,310,072 | 146.3 |
| Mean | 36,568,569 | 5,521,853,979 | 55.00 | 98.00 | 151 | 34,322,925 | 5,011,323,440 | 146.0 |
1-3. 귀리의 표준유전체(unigene) 조립
상기 실시예 2에서 수득한 Trinity 프로그램을 이용하여 조양 등 10개 귀리 품종의 시퀀싱된 read를 이용하여 709,709 개의 표준유전체를 조립하였다. 709,709 개의 표준유전체에서 cd-hit-est, TGICL 프로그램을 통해 유사서열을 제거하고 최종 128,244개의 표준유전체를 생성하였다.
그 결과, 최종 생성된 표준유전체에서 가장 긴 것은 21,849bp, 가장 짧은 것은 187bp 였으며 평균 길이는 1,072bp였다(표 3). 전체 표준유전체의 길이에서 절반에 해당되는 N50은 1,752bp로 나타났다. 또한, 예측된 ORF는 56,483개였으며, 시작 코돈 및 종결 코돈이 모두 존재하는 ORF(open reading frame)는 32,202개로 나타났다.
조양 외 10개 귀리 품종은 평균 87.7%의 매핑율과 평균 15.78의 depth를 나타내었다(표 4).
| De-novo | Reads | Read Bases | Min length |
Max length | AVG length | N50 (bp) | N90 (bp) |
BUSCO (embryophyta_odb10) |
| Raw data | 365,685,694 | 55,218,539,794 | 151 | 151 | 151 | |||
| Trimmed data | 343,229,248 | 50,113,234,400 | 50 | 151 | 146 | |||
| Trinity (RNA-seq de novo assembly) |
709,709 | 617,608,507 | 177 | 23,317 | 870 | |||
| cd-hit-est (90%)-1st | 440,095 | 312,460,777 | 187 | 23,317 | 710 | 1,106 | 291 | |
| cd-hit-est (90%)-2nd | 422,088 | 298,844,953 | 187 | 23,317 | 708 | 1,097 | 291 | |
| cd-hit-est (90%)-3rd | 371,180 | 272,335,823 | 187 | 23,317 | 734 | 1,157 | 298 | |
| TGICL | 233,449 | 178,029,002 | 187 | 21,849 | 763 | 1,334 | 294 | |
| Coverage Filter (>10) | 128,244 | 137,438,033 | 187 | 21,849 | 1,072 | 1,752 | 441 | C:82.3%[S:42.8%,D:39.5%],F:2.7%,M:15.0% |
| Predicted ORFs | 56,483 | 47,850,738 | 258 | 15,213 | 847 | 1,089 | 396 | C:74.1%[S:52.9%,D:21.2%],F:6.9%,M:19.0% |
| Predicted complete ORFs | 32,202 | 32,497,662 | 258 | 15,213 | 1,009 | 1,287 | 489 | C:64.8%[S:48.4%,D:16.4%],F:6.1%,M:29.1% |
| Variety | Processed read | Mapped reads | Unique hit PE reads | Unmapped reads | Read mapping rate (%) | Average depth (x) |
| 조양(Choyang) | 31,937,598 | 27,965,238 | 10,594,206 | 1,681,828 | 87.6 | 15.11 |
| 대양(Daeyang) | 32,872,618 | 28,806,502 | 11,247,262 | 1,873,278 | 87.6 | 15.07 |
| 다크호스(Darkhorse) | 34,014,924 | 29,804,230 | 9,263,540 | 1,838,306 | 87.6 | 15.40 |
| Gehl | 41,304,176 | 36,786,406 | 10,428,980 | 1,723,984 | 89.1 | 18.81 |
| 광한(Gwanghan) | 34,804,440 | 30,422,824 | 11,468,622 | 1,710,074 | 87.4 | 15.89 |
| 하이스피드(Hispeed) | 31,187,392 | 27,403,746 | 10,556,148 | 1,665,156 | 87.9 | 14.79 |
| 일한(Ilhan) | 36,046,378 | 31,349,728 | 12,241,220 | 2,073,428 | 87.0 | 16.32 |
| 옥한(Okhan) | 31,244,814 | 27,511,954 | 10,208,568 | 1,410,194 | 88.1 | 14.51 |
| 삼한(Samhan) | 33,811,178 | 29,786,056 | 11,267,756 | 1,727,036 | 88.1 | 15.55 |
| Swan | 36,005,730 | 31,295,712 | 10,038,762 | 2,200,208 | 86.9 | 16.31 |
| Mean | 34,322,925 | 30,113,240 | 10,731,506 | 1,790,349 | 87.7 | 15.78 |
1-4. 표준유전체와의 비교를 통해 탐색된 SNP의 특성 분석
염기서열 변이인 SNP의 분석 조건은 min coverage: ≥5, max coverage: ≤250, quality:≥20, SNP ratio: 0.9, progeny: 10 으로 하였다. 각 귀리 품종의 read를 매핑하여 SNP를 탐색한 결과 단일 변이를 나타내는 총 6,634개의 SNP를 탐색하였다.
그 결과, SNP는 20.7kbp 당 1개가 존재하여 비교적 낮은 수치를 나타내었다(표 5). 염기서열 변이중 Transition인 SNP는 3,880개, Transversion은 2,754개로 Transition 비율이 높았으며, 예측된 ORF를 이용하여 탐색된 SNP에 대한 annotation한 결과, 단백질 서열에 변이를 나타낼 수 있는 SNP는 777개 표준유전체에서 총 1,228개로 분석되었다.
예측된 ORF를 이용하여 탐색된 SNP에 대한 annotation한 결과, 단백질 서열에 변이를 나타낼 수 있는 SNP는 777개 표준유전체에서 총 1,228개로 분석되었다(표 6).
| Number of 표준유전체s | 128,244 |
| Total bases | 137,438,033 |
| Number of SNPs | 6,634 |
| SNP frequncy | 1/20.7kbp |
| Transition | 3,880 |
| A→G | 1,941 |
| C→T | 1,939 |
| Transversion | 2,754 |
| A→C | 650 |
| A→T | 440 |
| C→G | 1,018 |
| G→T | 646 |
| Annotation of SNPs | Number of SNPs | Number of associated 표준유전체s |
| Non synonymous | 1228 | 777 |
| Synonymous | 1648 | 951 |
| Othersa | 2372 | 1161 |
| Non-determinedb | 1386 | 648 |
| Total | 6634 | 3537 |
aOthers: Start codon gained or lost, stop codon gained or lost, 3' UTR or 5' UTR region.
bNon-determined*: CDS was not predicted.
실시예 2. 귀리 품종 판별을 위한 분자마커 세트 발굴
SNP ratio : 1.0, depth ≥ 10인 각 귀리 품종의 특이적인 SNP를 총 638개 선발하였다. 각 귀리 품종 특이적인 SNP의 인접한 위치에 mismatch 염기서열을 생성하여 제한효소의 인식서열을 생성할 수 있는 571개 SNP를 dCAPS 마커 발굴에 사용하였다(표 7).
| Variety | High-quality SNP | SNP used for marker development |
| 조양(Choyang) | 11 | 9 |
| 대양(Daeyang) | 7 | 6 |
| 다크호스(Darkhorse) | 0 | 0 |
| Gehl | 147 | 128 |
| 광한(Gwanghan) | 171 | 156 |
| 하이스피드(Hispeed) | 0 | 0 |
| 일한(Ilhan) | 74 | 67 |
| 옥한(Okhan) | 34 | 29 |
| 삼한(Samhan) | 117 | 105 |
| Swan | 77 | 71 |
| Total | 638 | 571 |
dCAPS 마커를 이용하여 귀리 28개 품종에 대한 PCR 검정 후 다형성을 나타내는 마커를 선발하여 귀리 품종 판별용 마커 세트를 구축하고자 하였다. 여기에서 사용된 귀리 28개 품종은 하기 표 8과 같다.
SNP 571개 중 491개 SNP에 대한 총 1,273개 dCAPS 마커를 검정하였다.
| No. | Vareity | Pedigree |
| 1 | 삼한(Samhan) | Early80/Maine PI-590 |
| 2 | 광한(Gwanghan) | Early80/PA202-210-S |
| 3 | 다크호스(Darkhorse) | Sprinter/73625 |
| 4 | 옥한(Okhan) | Early80/Maine PI-590 |
| 5 | 조양(Choyang) | Cuauhtemoc/PA202-210-S |
| 6 | 하이스피드(Highspeed) | Mex 5 mutant |
| 7 | 대양(Daeyang) | FLX446-1-84-Q1/(Selection 3638-2 Purified/LETORIA) |
| 8 | Swan | Kent/Ballidu |
| 9 | 일한(Ilhan) | 517A2-121/B-1-2-57 |
| 10 | Gehl | 06751//AC Baton*2/05588-297 |
| 11 | 다경(Dakyeong) | (Osage////Bonda///Hajira//Joanette/Santa Fe)/SWAN |
| 12 | 다조(Dajo) | (Swan*3/Cuauhtemoc//PA202-210)/Beltsville 61-150 |
| 13 | 다한(Dahan) | Sprinter/73625//PA7507-37 |
| 14 | 동한(Donghan) | Early80/Maine PI-590 |
| 15 | 메귀리(Megwiri) | Introduced variety |
| 16 | 삼절귀리(Samjeolgwiri) | Introduced variety |
| 17 | 선양(Seonyang) | Early80/Cuauhtemoc |
| 18 | 수양(Suyang) | Cuauhtemoc/PA202-210-S |
| 19 | 신한(Shinhan) | 517A2-121/B-1-2-57 |
| 20 | 조풍(Jopung) | Early80/PA202-210-S//Walken |
| 21 | 조한(Johan) | Early80/PA202-210-S |
| 22 | 태한(Taehan) | PA7836-2093/Illinois 60-3244-1 |
| 23 | 풍한(Punghan) | Cuauhtemoc/PA202-210//Beltsville 61-150 |
| 24 | Hi-early | 517A2-121/B-1-2-57 |
| 25 | 중모 2005(Joongmo 2005) | Early80/PENNCOMP31-3//Early80/PA202-210 |
| 26 | 중모 2501(Joongmo 2501) | Early80/Cuauhtemoc//(Selection 3638-2 Purified/LETORIA) |
| 27 | 중모 2507(Joongmo 2507) | Mex 5/Samhan |
| 28 | 중모 2511(Joongmo 2511) | (0-200-10/Southland)/Samhan |
dCAPS 마커의 PCR 검정은 DNA: 2㎕ (50ng/㎕), Taq: 0.1㎕ (5Unit/㎕), primer: 3㎕ (20pmol/㎕), 10Х buffer: 2.4㎕ dNTPs: 0.5㎕, Total: 24㎕ 의 조성물을 이용하여 수행하였으며, 표 9의 조건에 따른 touch down PCR 방법으로 수행하였다. 제한효소는 37℃에서 1시간 동안 처리하였으며, 전기영동은 3% 아가로즈겔에서 1시간 동안 수행하고 그 결과를 도 1 내지 도 5에 도시하였다.
또한, dCAPS 마커 30쌍을 이용한 귀리 28품종의 계통수 분석 결과, 귀리 28 품종은 6개 그룹으로 나누어졌으며, 태한의 유전적 거리가 가장 큰 것을 확인하였다(도 6).
| Temp. | Time | Cycle | Remark | |
| 1 | 94℃ | 5 min | ||
| 2 | 94℃ | 30 sec | 10 cycle | Auto delta -0.6℃/cycle |
| 3 | 66-60℃ | 20 sec | ||
| 4 | 72℃ | 30 sec | ||
| 5 | 94℃ | 30 sec | 25 cycle | |
| 6 | 60℃ | 20 sec | ||
| 7 | 72℃ | 30 sec | ||
| 8 | 72℃ | 5 min | ||
| 9 | 12℃ | - |
최종 선발된 30쌍의 dCAPS 마커는 하기 표 10에 나타내었다.
선발된 dCAPS 마커 30쌍의 평균 MAF (major allele frequency)는 0.857, gene diversity는 0.235, PIC 값은 0.203이었다(표 11).
| Marker name | SNP (Reference/ alternate) |
Forward | Reverse |
| CY-6 | T/C | AGTTATTTGCTCGGAGCGTCTA(서열번호 1) | AGTGCTTATGAACGTTTCAGGT(서열번호 2) |
| GH-16-3 | C/A | GAGGCAACACGCCAACATTCTA(서열번호 3) | CCTTACCAACAACCTCTGCTAC(서열번호 4) |
| GH-23-3 | G/C | CCCCCGTCGTCCCGATGAAGAT(서열번호 5) | TTTACACACCGCTAACTCACAG(서열번호 6) |
| GH-3 | A/G | GAACTCAGCGGCCTCTACGATC(서열번호 7) | TCCTGGCGGTCTAATTTATCTA(서열번호 8) |
| GH-56 | G/T | GTGAACAGCGTGCTAAAAAGC(서열번호 9) | AGATGGCATAAAGCAGGTAAGA(서열번호 10) |
| GH-63 | T/C | CCTCCCCACCACCACTTGTGCG(서열번호 11) | TTCTAGACTTCCATGCCACTTT(서열번호 12) |
| GH-65 | T/C | CTCCTGCTCCATGCTGTTGGAC(서열번호 13) | TTTACACACCGCTAACTCACAG(서열번호 14) |
| GH-99 | T/C | AAAATTTCTATCGATCGGTCGA(서열번호 15) | GAGAAGACGATGCTTCGAGAT(서열번호 16) |
| GHA-11 | A/G | GAGTTGAAGCCGGTGCCCAATT(서열번호 17) | GGTTGAATCCCTCTCTCTTTCT(서열번호 18) |
| GHA-24 | A/C | GTAACAGACACAACTCTGCCGG(서열번호 19) | TATACAAACCACGCACGTAGAG(서열번호 20) |
| GHA-43-1 | G/C | GCAACGCGGATCCGAGGGTCTA(서열번호 21) | CCTACCTAGTCGAATTTCCCTC(서열번호 22) |
| GHA-64 | T/C | TGTGTGTGAGATGATGCTCGGC(서열번호 23) | TCAGGCTCACTGTTTACAAATG(서열번호 24) |
| GHA-72 | A/G | GAGTTGAAGCCGGTGCCCAGCT(서열번호 25) | GGTTGAATCCCTCTCTCTTTCT(서열번호 26) |
| GHA-85 | A/G | CTCCAAAGCTAGAAAACACCCG(서열번호 27) | ATGGAAATGATGGGCTAGAAA(서열번호 28) |
| GHA-101 | T/C | GTTGCTTCCTAAGAATCAGGCC(서열번호 29) | ATCCAACCTCTGTTGTGTCTTC(서열번호 30) |
| GHA-102 | T/C | CGCGCTTGGTGATATCAAGATC(서열번호 31) | AACTACAGAACCTGATGGCAAC(서열번호 32) |
| GHA-115 | T/A | TTCTCGCGAATCTCTCCACTCG(서열번호 33) | CTCTACCTAGAAGCAACGCAAT(서열번호 34) |
| IH-12-2 | C/A | GCACCTCCGTCGTGGTAGTATA(서열번호 35) | TCAACAACAATGGTGTCTATGG(서열번호 36) |
| IH-39 | T/G | ACAATACACGAGGAGATAACCG(서열번호 37) | GGAATGGTGATTACAAGTTCAGA(서열번호 38) |
| OH-6-1 | T/C | GCTGTAGCTAGCGTGCGAGGTC(서열번호 39) | GCATCTCTCAACACCATCTCAT(서열번호 40) |
| SH-4 | T/C | TATGGTCCATGCGTCACAGGTA(서열번호 41) | CTTCTGCAAATAGTGAACGACA(서열번호 42) |
| SH-5-1 | T/C | GGCAAGAGGTGCACCTGGGAAT(서열번호 43) | AGTAGGCTCAGATGACGATGAG(서열번호 44) |
| SH-20-1 | A/T | GGATTAGTCGTGCATTGTCCGC(서열번호 45) | CCAAAGTTGTTCACTCTTTGGTA(서열번호 46) |
| SH-28-2 | C/G | GGATGTCGCTGGGTAGCGGTAC(서열번호 47) | TTCCAACTGAACAATCTTGACA(서열번호 48) |
| SH-34-4 | G/A | CTGCCACGTGAGGCCTCGACTA(서열번호 49) | TACATTGGTGATGATTAGTCGC(서열번호 50) |
| SW-3-2 | G/A | CCAGGCCGTGTCATCTATCATG(서열번호 51) | ACGAGGGAGTACTGTACGTGAT(서열번호 52) |
| SW-21-2 | G/C | TGGTTTACAGATGAGTGGCCGG(서열번호 53) | CCTCAAGAGGAAAGGGTAAAGT(서열번호 54) |
| SW-23-1 | T/A | TGCCCCCAGCATGACCTTCATG(서열번호 55) | CCTGTGTACATACACGTTTGCT(서열번호 56) |
| SW-27 | T/C | TTCAGGCGCACGGGAGATGGTC(서열번호 57) | GTGTTTCACTGAACTGCGAATA(서열번호 58) |
| SW-45 | A/C | CCAGCATATACGGTGATGTCAA(서열번호 59) | CCATCTACCCGAGGTTCGT(서열번호 60) |
| Marker name | SNP (Reference/ alternate) |
Forward | Reverse | Product size (bp) | Restricion enzyme | MAF | Gene diversity | PIC |
| CY-6 | T/C | 서열번호 1 | 서열번호 2 | 323 | AccI | 0.929 | 0.133 | 0.124 |
| GH-16-3 | C/A | 서열번호 3 | 서열번호 4 | 302 | DdeI | 0.857 | 0.245 | 0.215 |
| GH-23-3 | G/C | 서열번호 5 | 서열번호 6 | 383 | BglII | 0.857 | 0.245 | 0.215 |
| GH-3 | A/G | 서열번호 7 | 서열번호 8 | 318 | PvuI | 0.963 | 0.071 | 0.069 |
| GH-56 | G/T | 서열번호 9 | 서열번호 10 | 377 | HindIII | 0.857 | 0.245 | 0.215 |
| GH-63 | T/C | 서열번호 11 | 서열번호 12 | 236 | HinP1I | 0.964 | 0.069 | 0.067 |
| GH-65 | T/C | 서열번호 13 | 서열번호 14 | 294 | AvaII | 0.857 | 0.245 | 0.215 |
| GH-99 | T/C | 서열번호 15 | 서열번호 16 | 340 | AccI | 0.964 | 0.069 | 0.067 |
| GHA-11 | A/G | 서열번호 17 | 서열번호 18 | 395 | MunI | 0.857 | 0.245 | 0.215 |
| GHA-24 | A/C | 서열번호 19 | 서열번호 20 | 308 | NaeI | 0.929 | 0.133 | 0.124 |
| GHA-43-1 | G/C | 서열번호 21 | 서열번호 22 | 244 | AccI | 0.857 | 0.245 | 0.215 |
| GHA-64 | T/C | 서열번호 23 | 서열번호 24 | 269 | EagI | 0.786 | 0.337 | 0.280 |
| GHA-72 | A/G | 서열번호 25 | 서열번호 26 | 395 | MspA1I | 0.857 | 0.245 | 0.215 |
| GHA-85 | A/G | 서열번호 27 | 서열번호 28 | 252 | HpaII | 0.929 | 0.133 | 0.124 |
| GHA-101 | T/C | 서열번호 29 | 서열번호 30 | 355 | StuI | 0.893 | 0.191 | 0.173 |
| GHA-102 | T/C | 서열번호 31 | 서열번호 32 | 281 | BglII | 0.929 | 0.133 | 0.124 |
| GHA-115 | T/A | 서열번호 33 | 서열번호 34 | 323 | AvaI | 0.857 | 0.245 | 0.215 |
| IH-12-2 | C/A | 서열번호 35 | 서열번호 36 | 282 | AccI | 0.778 | 0.346 | 0.286 |
| IH-39 | T/G | 서열번호 37 | 서열번호 38 | 266 | HpaII | 0.893 | 0.191 | 0.173 |
| OH-6-1 | T/C | 서열번호 39 | 서열번호 40 | 306 | AvaII | 0.821 | 0.293 | 0.250 |
| SH-4 | T/C | 서열번호 41 | 서열번호 42 | 255 | RsaI | 0.857 | 0.245 | 0.215 |
| SH-5-1 | T/C | 서열번호 43 | 서열번호 44 | 298 | HinfI | 0.893 | 0.191 | 0.173 |
| SH-20-1 | A/T | 서열번호 45 | 서열번호 46 | 244 | MspA1I | 0.750 | 0.375 | 0.305 |
| SH-28-2 | C/G | 서열번호 47 | 서열번호 48 | 373 | KpnI | 0.714 | 0.408 | 0.325 |
| SH-34-4 | G/A | 서열번호 49 | 서열번호 50 | 283 | DdeI | 0.643 | 0.459 | 0.354 |
| SW-3-2 | G/A | 서열번호 51 | 서열번호 52 | 233 | BspHI | 0.857 | 0.245 | 0.215 |
| SW-21-2 | G/C | 서열번호 53 | 서열번호 54 | 302 | NaeI | 0.786 | 0.337 | 0.280 |
| SW-23-1 | T/A | 서열번호 55 | 서열번호 56 | 341 | BspHI | 0.857 | 0.245 | 0.215 |
| SW-27 | T/C | 서열번호 57 | 서열번호 58 | 209 | AvaII | 0.857 | 0.245 | 0.215 |
| SW-45 | A/C | 서열번호 59 | 서열번호 60 | 224 | HincII | 0.857 | 0.245 | 0.215 |
| Mean | 0.857 | 0.235 | 0.203 |
dCAPS 30종 마커를 이용하여 확인한 귀리 28개 품종의 유전형 정보는 도 7에 도시하였다.
dCAPS 마커 30종으로 각 그룹(1~3)의 품종은 서로 구분이 되지 않았으나(1: 다크호스, 하이스피드, 대양, 2: 조양, 수양, 3: 메귀리, 삼절귀리), 귀리 21개 품종은 서로 판별이 가능함을 확인하였다.
또한, OH-6-1, SH-20-1은 dCAPS 마커로 제작되었으나 제한효소 처리전 전기영동 결과 귀리 품종간에 다형성을 나타내어 InDel 마커로서 사용가능함을 확인하였다.
본 실시예에서 확인된 바와 같이 본 발명의 마커는 국내 육성 귀리 21개 품종을 판별할 수 있는 바, 혼종 방지 등의 품질관리로 국내 육성 품종에 대해 차별화할 수 있고, 수입 맥류 부정 유통 방지 및 국내 육성 맥류의 품질 경쟁력을 확보할 수 있으며, 나아가 국내 육성 귀리 품종의 유전자원 보호에 활용할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Molecular markers for discriminating Avena sativa L. varieties
and uses thereof
<130> KPA211465-KR
<160> 60
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CY-6_F
<400> 1
agttatttgc tcggagcgtc ta 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CY-6_R
<400> 2
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<210> 3
<211> 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 3
gaggcaacac gccaacattc ta 22
<210> 4
<211> 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 4
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<210> 5
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<400> 5
cccccgtcgt cccgatgaag at 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
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tttacacacc gctaactcac ag 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GH-3_F
<400> 7
gaactcagcg gcctctacga tc 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GH-3_R
<400> 8
tcctggcggt ctaatttatc ta 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GH-56_F
<400> 9
gtgaacagcg tgctaaaaag c 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GH-56_R
<400> 10
agatggcata aagcaggtaa ga 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GH-63_F
<400> 11
cctccccacc accacttgtg cg 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GH-63_R
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ttctagactt ccatgccact tt 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GH-65_F
<400> 13
ctcctgctcc atgctgttgg ac 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GH-65_R
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tttacacacc gctaactcac ag 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GH-99_F
<400> 15
aaaatttcta tcgatcggtc ga 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GH-99_R
<400> 16
gagaagacga tgcttcgaga t 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GHA-11_F
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gagttgaagc cggtgcccaa tt 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GHA-11_R
<400> 18
ggttgaatcc ctctctcttt ct 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GHA-24_F
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gtaacagaca caactctgcc gg 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GHA-24_R
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tatacaaacc acgcacgtag ag 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GHA-64_F
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<213> Artificial Sequence
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gagttgaagc cggtgcccag ct 22
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ggttgaatcc ctctctcttt ct 22
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<223> GHA-85_F
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ctccaaagct agaaaacacc cg 22
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atggaaatga tgggctagaa a 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> GHA-101_F
<400> 29
gttgcttcct aagaatcagg cc 22
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<211> 22
<212> DNA
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atccaacctc tgttgtgtct tc 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GHA-102_F
<400> 31
cgcgcttggt gatatcaaga tc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GHA-102_R
<400> 32
aactacagaa cctgatggca ac 22
<210> 33
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GHA-115_F
<400> 33
ttctcgcgaa tctctccact cg 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GHA-115_R
<400> 34
ctctacctag aagcaacgca at 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IH-12-2_F
<400> 35
gcacctccgt cgtggtagta ta 22
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<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> IH-12-2_R
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tcaacaacaa tggtgtctat gg 22
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IH-39_F
<400> 37
acaatacacg aggagataac cg 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IH-39_R
<400> 38
ggaatggtga ttacaagttc aga 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OH-6-1_F
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gctgtagcta gcgtgcgagg tc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OH-6-1_R
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gcatctctca acaccatctc at 22
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH-4_F
<400> 41
tatggtccat gcgtcacagg ta 22
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH-4_R
<400> 42
cttctgcaaa tagtgaacga ca 22
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH-5-1_F
<400> 43
ggcaagaggt gcacctggga at 22
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH-5-1_R
<400> 44
agtaggctca gatgacgatg ag 22
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH-20-1_F
<400> 45
ggattagtcg tgcattgtcc gc 22
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH-20-1_R
<400> 46
ccaaagttgt tcactctttg gta 23
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH-28-2_F
<400> 47
ggatgtcgct gggtagcggt ac 22
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH-28-2_R
<400> 48
ttccaactga acaatcttga ca 22
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH-34-4_F
<400> 49
ctgccacgtg aggcctcgac ta 22
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH-34-4_R
<400> 50
tacattggtg atgattagtc gc 22
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SW-3-2_F
<400> 51
ccaggccgtg tcatctatca tg 22
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SW-3-2_R
<400> 52
acgagggagt actgtacgtg at 22
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SW-21-2_F
<400> 53
tggtttacag atgagtggcc gg 22
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SW-21-2_R
<400> 54
cctcaagagg aaagggtaaa gt 22
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SW-23-1_F
<400> 55
tgcccccagc atgaccttca tg 22
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SW-23-1_R
<400> 56
cctgtgtaca tacacgtttg ct 22
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SW-27_F
<400> 57
ttcaggcgca cgggagatgg tc 22
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SW-27_R
<400> 58
gtgtttcact gaactgcgaa ta 22
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SW-45_F
<400> 59
ccagcatata cggtgatgtc aa 22
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SW-45_R
<400> 60
ccatctaccc gaggttcgt 19
Claims (9)
- 서열번호 1 내지 서열번호 60의 올리고뉴클레오티드; 또는 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드;를 포함하는, 귀리 품종 판별용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 서열번호 60의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는
i) 서열번호 2n-1의 정방향 프라이머; 및
ii) 서열번호 2n의 역방향 프라이머;로 구성되는 프라이머 세트를 포함하고,
상기 n은 1 내지 30의 자연수로, i) 및 ii)의 n은 동일한 값을 갖는 30쌍의 프라이머 세트로 구성되는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8 로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10 로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 15 및 서열번호 16으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 17 및 서열번호 18로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 19 및 서열번호 20으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 21 및 서열번호 22로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 23 및 서열번호 24로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 25 및 서열번호 26로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 27 및 서열번호 28로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 29 및 서열번호 30으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 31 및 서열번호 32로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 33 및 서열번호 34로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 35 및 서열번호 36으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 37 및 서열번호 38로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 39 및 서열번호 40으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 41 및 서열번호 42로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 43 및 서열번호 44로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 45 및 서열번호 46으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 47 및 서열번호 48로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 49 및 서열번호 50으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 51 및 서열번호 52로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 53 및 서열번호 54로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 55 및 서열번호 56으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 57 및 서열번호 58로 구성되는 프라이머 세트; 또는 서열번호 59 및 서열번호 60으로 구성되는 프라이머 세트;로 구성되는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 삼한, 광한, 옥한, Swan, 일한, Gehl, 다경, 다조, 다한, 동한, 선양, 신한, 조풍, 조한, 태한, 풍한, Hi-early, 중모 2005, 중모 2501, 중모 2507 및 중모 2511로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 품종을 판별하는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 귀리 게놈 DNA의 SNP 또는 InDel 서열을 검출 또는 증폭시킬 수 있는 것인, 프라이머 세트.
- 서열번호 1 내지 서열번호 60의 염기서열에서 선택되는 어느 하나 이상의 연속적인 올리고뉴클레오티드; 이들의 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고뉴클레오티드; 및 이들의 조합;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 귀리 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하는, 귀리 품종 판별용 조성물.
- (a) 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 귀리 품종 판별 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 (b) 단계의 증폭 산물의 분석은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210167654A KR20230080175A (ko) | 2021-11-29 | 2021-11-29 | 귀리 품종을 판별하기 위한 분자 마커 및 이의 이용 |
Applications Claiming Priority (1)
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210167654A KR20230080175A (ko) | 2021-11-29 | 2021-11-29 | 귀리 품종을 판별하기 위한 분자 마커 및 이의 이용 |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230080175A (ko) |
-
2021
- 2021-11-29 KR KR1020210167654A patent/KR20230080175A/ko not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. 김경민, 국내 귀리품종의 품질특성 및 품종판별용 분자마커 개발, 2017. |
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