KR20230076254A - 반응표면분석법을 이용한 하이드로페룰산 제조방법 - Google Patents
반응표면분석법을 이용한 하이드로페룰산 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본발명은 반응표면분석법을 이용한 하이드로페룰산 제조방법에 관한 것으로, 페룰산을 미강배지에 첨가하여 일정온도에서 정치배양하면서 HFA를 생성하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 미강배지에 탄소원으로 포도당, 및 마그네슘을 더 첨가하는 것을 특징으로 한다. 또한, 콘브랜 가수분해물을 더 첨가하는 것으로, 본발명은 페롤, 미강, 포도당, 마그네슘, 콘브랜가수분해물을 혼합, u효하여 가격이 저렴하고 품질이 우수한 HFA를 제조하는 현저한 효과가 있다.
Description
본발명은 반응표면분석법을 이용한 하이드로페룰산 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 페롤, 미강, 포도당, 마그네슘, 콘브랜가수분해물을 혼합, 발효하여 가격이 저렴하고 품질이 우수한 HFA를 제조하는 반응표면분석법을 이용한 하이드로페룰산 제조방법에 관한 것이다.
등록특허공보 등록번호 10-1775240호는 (a) 옥수수 피를 알칼리 용액과 반응시켜 페룰린산 (ferulic acid)을 포함하는 조추출물을 수득하는 단계;
(b) 상기 수득한 조추출물과 액화효소(α-amylase), 당화효소(glucoamylase), 또는 액화효소 및 당화효소를 모두 반응시켜 상기 수득한 조추출물로부터 전분을 제거하는 단계; 및
(c) 옥수수 피 추출 잔사를 세척하는 단계를 거쳐 페룰린산 추출액을 수득하는 단계를 포함하는, 페룰린산의 제조 방법이 공개되어 있다.
또한, 등록특허공보 등록번호 10-1798855호는 쌀의 세척 분말을 계량하여 정제수를 첨가한 후 효소를 이용하여 효소분해 시켜고 분쇄한 후 가열하여 살균시키고 냉각하여 쌀추출액을 얻는 단계;
쌀추출액에 유지, 점증제, 천일염, 코코넛밀크, 당류 및 정제수를 첨가하여 혼합하는 단계로, 이 때 상기 점증제는 구아검 또는 카라기난인 단계;
상기의 혼합물을 75℃ 내지 85℃에서 20분 내지 40분 동안 100rpm내지 200rpm의 속도로 교반하여 유화시키는 단계; 및
상기의 쌀추출액을 포함하고 있는 유화된 혼합물을 150 바(bar) 내지 300 바(bar)의 압력으로 미세균질화 하는 단계를 포함하여 안정된 분산도를 갖으며 쌀의 풍미와 관능을 갖춘 것을 특징으로 하는, 쌀을 주성분으로한 곡물 가공 음료의 제조방법이 공개되어 있다.
그러나 상기 종래기술들은 원료 및 공정이 적정하지 않아서 가격이 비싸고 품질이 떨어지는 단점이 있었다.
따라서 본발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 안출된 것으로, 페롤, 미강, 포도당, 마그네슘, 콘브랜가수분해물을 혼합, u효하여 가격이 저렴하고 품질이 우수한 HFA를 제조하는 반응표면분석법을 이용한 하이드로페룰산 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.
본발명은 반응표면분석법을 이용한 하이드로페룰산 제조방법에 관한 것으로, 페룰산을 미강배지에 첨가하여 일정온도에서 정치배양하면서 HFA를 생성하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 미강배지에 탄소원으로 포도당, 및 마그네슘을 더 첨가하는 것을 특징으로 한다.
또한, 콘브랜 가수분해물을 더 첨가하는 것을 특징으로 한다.
따라서 본발명은 페롤, 미강, 포도당, 마그네슘, 콘브랜가수분해물을 혼합, u효하여 가격이 저렴하고 품질이 우수한 HFA를 제조하는 현저한 효과가 있다.
도 1. 일정 비율의 FA 첨가(0.05)와 함께 발효 시간과 발효 온도의 결합 효과에 대한 반응 표면 및 등고선 플롯(Response surface and contour plots of combining effects of fermentation time and fermentation temperature with constant of percent FA addition (0.05%))
도 2. 발효 온도(35°C)를 일정하게 유지한 상태에서 발효 시간 및 FA 첨가 비율의 결합 효과에 대한 반응 표면 및 등고선 플롯(Response surface and contour plots of combining effects of fermentation time and percent FA addition with constant of fermentation temperature (35°C))
도 3. 발효 시간 상수와 함께 발효 온도 및 FA 첨가 비율의 결합 효과에 대한 반응 표면 및 등고선 플롯(Response surface and contour plots of combining effects of fermentation temperature and percent FA addition with constant of fermentation time (36 h))
도 4 소프트웨어 분석 프로그램에 따른 최적화 조건도(Optimization condition based on software analysis program)
도 5. 발효액에서 HFA의 분리 및 부분 정제도(Separation and partial purification of HFA from fermented broth)
도 6. 발효액에서 HFA의 분리 및 부분 정제도(Separation and partial purification of HFA from fermented broth)
도 2. 발효 온도(35°C)를 일정하게 유지한 상태에서 발효 시간 및 FA 첨가 비율의 결합 효과에 대한 반응 표면 및 등고선 플롯(Response surface and contour plots of combining effects of fermentation time and percent FA addition with constant of fermentation temperature (35°C))
도 3. 발효 시간 상수와 함께 발효 온도 및 FA 첨가 비율의 결합 효과에 대한 반응 표면 및 등고선 플롯(Response surface and contour plots of combining effects of fermentation temperature and percent FA addition with constant of fermentation time (36 h))
도 4 소프트웨어 분석 프로그램에 따른 최적화 조건도(Optimization condition based on software analysis program)
도 5. 발효액에서 HFA의 분리 및 부분 정제도(Separation and partial purification of HFA from fermented broth)
도 6. 발효액에서 HFA의 분리 및 부분 정제도(Separation and partial purification of HFA from fermented broth)
본발명은 반응표면분석법을 이용한 하이드로페룰산 제조방법에 관한 것으로, 페룰산을 미강배지에 첨가하여 일정온도에서 정치배양하면서 HFA를 생성하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 미강배지에 탄소원으로 포도당, 및 마그네슘을 더 첨가하는 것을 특징으로 한다.
또한, 발효온도는 34.4℃, 발효시간은 45.84시간인 것을 특징으로 한다.
또한, 콘브랜 가수분해물을 더 첨가하는 것을 특징으로 한다.
본발명을 첨부도면에 의해 상세히 설명하면 다음과 같다.
반응표면분석법을 이용한 하이드로페룰산 생산방법 최적화
발효공정
유효성분의 함량을 최대화하기 위하여 compound X의 전구물질인 ferulic acid를 첨가하여 발효최적 공정을 조사하였다. 최적화를 위하여 선행공정조건 조사를 실시하여 parameter를 결정하였으며, 이에 따라 최적화 실험을 실시 한 결과는 다음과 같다.
초기 최적조건 탐색실험 (one-at-a-time method)
반응표면분석법으로 최적조건을 구하기 위하여 독립변수를 확정하기 위한 실험을 실시하였다. 변수로서 교반조건, 발효시간과 온도, 고형물비, 배지에 첨가되는 포도당과 철분 및 마그네슘 함량을 조사하였다. 모든 실험에서 미강배지를 기본을 하였으며 페룰산을 0.01% 첨가한 배지로 실험하였다.
교반속도
페룰산 0,01%를 미강배지에 첨가하여 35°C에서 36시간 발효시키면서 생성되는 HFA함량을 비교한 결과는 표 1과 같다. 교반속도 0과 100rpm에서 생성한 HFA 함량은 유의적 차이를 보이지 않았고, 200rpm에서는 HFA가 생성되지 않았다. 에너지 수율 측면을 고려하여 적정 교반속도는 0rpm이 적정하다고 판단되었으나, 1시간 간격으로 간헐 교반으로 처리하여 고형물이 하부에 집적되는 것을 방지하기로 하였다.
| Agitation speed (rpm) | mgHFA/L culture broth |
| 0 | 56.32 |
| 100 | 57.90 |
| 200 | ND |
발효시간
페룰산 0,01%를 미강배지에 첨가하여 35°C에서 정치배양하면서 HFA 생성량을 비교하였다 (표 2). 발효시간은 생성량을 증가시키기 위하여 최대 3일로 하였다. HFA는 1.5일차에서 최대 생성량을 보였으나 유의성은 크지 않았다. 다음 단계에서 독립변수로서 실험을 계속하였다.
| Fermentation time (day) | mgHFA/L culture broth |
| 0 | ND |
| 1 | 60.2 |
| 1.5 | 64.7 |
| 2 | 61.1 |
| 3 | 61.4 |
고형물 함량 비
미강배지에서 미강과 정제수의 함량비를 비교하여 HFA 생성량을 평가하였다 (표 3). 고형물비 1:5 이하에서는 정제수 대부분이 미강에 흡수되어 최소비율을 1:5로 결정하였다. 최대 HFA 생성량은 1:10 비율에서 달성되었으므로 계속되는 실험에서는 1:10을 고형물 비로 사용하였다.
| RB:DW ratio | mgHFA/L culture broth |
| 0.5 : 10 | 72.3 |
| 1 : 10 | 77.3 |
| 2 : 10 | 54.9 |
포도당의 첨가 효과
미강배지에 탄소원으로 포도당을 보강하여 첨가효과를 평가하였다(표 4). 포도당의 첨가는 HFA생성 효율을 크게 떨어뜨렸다.
| Glucose addition (%) | mgHFA/L culture broth |
| 0 | 64.73 |
| 10 | 62.28 |
| 20 | 54.55 |
마그네슘 첨가 효과
마그네슘은 유산균의 증식을 촉진하는 것으로 보고되고 있어 이의 첨가효과를 확인하였다(표 5).
0.05% 마그네슘 첨가는 HFA 생성을 증진시켰으나 대조구에 비하여 유의적인 차이는 없었다.
| Magnesium addition (%) | mgHFA/L culture broth |
| 0 | 72.37 |
| 0.05 | 76.17 |
| 0.10 | 69.83 |
페룰산 첨가 효과
HFA 전구체로 확인된 페룰산을 첨가하여 HFA 생성 증진효과를 평가하였다 (표 6). 페룰산의 첨가는 HFA의 생성을 크게 증진시켰으며 0,05% 첨가한 경우 가장 생성량이 높았다.
| Ferulic acid addition (%) | mgHFA/L culture broth |
| 0 | 3.66 |
| 0.01 | 63.48 |
| 0.05 | 142.51 |
| 0.10 | 131.73 |
발효온도
발효온도 실험에서는 35℃가 최적으로 판단되었으며, 45℃에서는 그 생성량이 크게 감소하였다 (표 7).
| Fermentation temperature (°C) | mgHFA/L culture broth |
| 25 | 56.03 |
| 35 | 63.48 |
| 45 | 1.03 |
미강발효조건의 최적화 실험
독립변수의 수준과 범위
전술한 실험에 의하여 반응표면분석법에 이용할 3개의 독립변수의 수준과 범위를 결정하였으며 그 결과를 표 8에 나타내었다. 발효시간과 온도 및 페룰산 첨가량이 HFA 생성량을 결정하는 가장 중요한 factor이며, 각각의 factor는 세가지 수준을 설정하였다.
| Variables | Symbol | Range of levels | ||
| Low (-1) | Center (0) | High (+1) | ||
| Fermentation time (h) | X 1 | 12 | 36 | 60 |
| Fermentation temperature (℃) | X 2 | 30 | 35 | 40 |
| Ferulic acid addition (%) | X 3 | 0.025 | 0.050 | 0.075 |
반응표면분석
3가지 독립변수가 HFA 생산에 미치는 영향을 실험한 FCCCD 결과는 표 9와 같다.
표면분석 데이터는 미니탭으로 분석하였으며 HFA 생산공정에 미치는 독립변수들의 영향을 나타낸 회귀식은 아래와 같다:
Y = 140.45 + 5.83X1-10.24X2+0.52X3-7.89(X1)2-30.27(X2)2-6.49(X3)2
+ 3.19X1X2+5.35X1X3+2.43X2X3
상기 식에서 Y는 세가지 독립변수의 함수로서 HFA의 생성량이다. ANOVA 분석의 결과는 표 10에 나타내었으며, 제안된 모델이 통계학적으로 유의함을 알 수 있었으며, 모델 식이 실제 실험데이터와 일치도가 높음을 알 수 있었다(표 11)
반응표면분석 결과를 그래프로 나타낸 결과는 다음과 같다 (Fig. 8-1 ∼8-5). Fig. 8-1은 페룰산 첨가량이 0.05% 일 때 발효온도와 시간에 따른 HFA 생성량을 3D로 나타낸 것으로 발효최적조건인 34℃, 발효시간 45시간일 때 HFA 생성량이 140mg/L으로 최대치가 됨을 보여준다. Fig. 8-2와 8-3은 각각 페룰산 첨가량과 발효시간의 효과와 발효온도와 페룰산 첨가효과를 나타낸 것이다.
발효공정의 최적화와 검증모델(verification model)
최적화 프로그램 분석의 결과 HFA생산을 위한 최적 조건은 Fig. 8-4와 같았다. 즉, 0.0545% 페룰산을 첨가한 미강배지에서 발효온도 34.4℃, 발효시간 45.84시간으로 발효를 마치면 HFA가 최대치인 142.4mg/L 생산되는 것으로 예측하였다. 동일 조건에서 미강발효를 실시하여 HFA 생산량을 측정한 결과, 148.2mg/L였다 (표 12). 이로서 최적화 모델식이 HFA생산량을 성공적으로 예측하고 있음을 추정할 수 있었다.
최적화 모델식이 실제 발효공정에 적용시킬 경우 결과치가 예측치와 얼마나 차이가 있는지 확인하기 위하여 검증 모델실험을 실시하였으며 그 결과는 Table 8-13과 같다.
발효시간과 온도 및 페룰산 첨가농도 조합을 다르게 한 4가지 조건의 발효에서 실측치는 예측치와 유사하게 나타남으로서 예측모델로 얻은 값이 실험으로 얻은 값에 매우 근접하여 예측모델의 정확성이 검증되었다.
페룰산 대체소재 개발
페룰산을 대체할 천연소재를 개발하기로 하고, 미강과 콘브랜으로부터 페룰산을 분리하기 위하여 알칼리 처리를 하여 수율을 비교하였다(표 15). 콘브랜은 미강에 비하여 5배 정도의 페룰산을 더 얻을 수 있었다
미강과 콘브랜의 가수분해액을 사용하여 Lw로 발효시킨 결과 발효액 중 페룰산과 HFA 함량은 표 16과 같다. 페룰산을 많이 함유한 콘브랜은 가수분해물을 희석함에 따라 증식이 활발하여 졌으나 HFA는 생성하지 않았다. 반면 미강 가수분해액은 2배 희석한 경우 HFA를 생성하였다. 콘브랜의 영양성분과 미강의 영양성분의 차이로 Lw가 페룰산 대사능이 상이한 것으로 추정된다.
위의 결과를 바탕으로 기존의 콘브랜 가수분해물에 미강을 혼합한 후 물을 가하여 개선배지를 제조하였으며, 이를 최적조건에서 발효시켜 그 결과를 미강배지에 페룰산을 0.0545% 첨가하여 발효한 결과와 비교하였다(표 17). 미강배지에 페룰산을 첨가한 배지는 HFA를 148mg/L 생산하였으나 콘브랜 가수분해물을 가한 미강배지는 135.9mg/L의 HFA를 생산하였다. 콘브랜가수분해물의 FA 농도가 페룰산 첨가 미강배지의 페룰산 농도의 50%인 점을 고려한다면 고가의 페룰산을 미강배지에 첨가하는 것보다 콘브랜 가수분해물을 첨가하는 것이 원가측면에서 더 효과적인 것으로 판단된다.
유효성분 분리공정
미강 발효물로부터 유효성분을 분리하는 공정은 일반 식품용과 건강기능성 식품용 소재로 구별하여 설계하였다. 즉, 일반식품용 소재는 HFA 순도가 낮은 것으로, 건강기능성 식품용 소재는 HFA 순도가 높도록 하였다.
고순도 HFA 분리 공정
미강 발효액으로부터 HFA를 고농도 함유한 소재를 제조하는 공정은 Fig. 8-5와 같다. 원심분리 후 상층액을 헥산처리하여 지질 성분을 제거하고, 에틸아세테이트로 유효성분을 추출 농축하였다. 농축액 4.5g 중 HFA 함량은 148mg이었다. 이 소재는 건강기능성 식품용 소재로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
저순도 HFA 분리 공정
일반 식품용으로 일회 서빙사이즈가 큰 경우 저순도 HFA를 사용하는 것이 더 경제적이다. 따라서 도 6 두 종류의 저순도 HFA 함유 소재 생산 공정을 개발하였다
Claims (3)
- 페룰산을 미강배지에 첨가하여 일정온도에서 정치배양하면서 HFA를 생성하는 것을 특징으로 하는 반응표면분석법을 이용한 하이드로페룰산 제조방법
- 제1항에 있어서, 상기 미강배지에 탄소원으로 포도당, 및 마그네슘을 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 반응표면분석법을 이용한 하이드로페룰산 제조방법
- 제2항에 있어서, 상기 미강배지에 콘브랜 가수분해물을 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 반응표면분석법을 이용한 하이드로페룰산 제조방법
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