KR20230075183A - 리프트밸리열 바이러스 신속 검출을 위한 재조합효소 중합효소 증폭 반응용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 리프트밸리열(Rift valley fever) 바이러스 신속 검출을 위한 재조합효소 중합효소 증폭 반응용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 리프트밸리열 바이러스 유전자의 S segment에 특이적인 프라이머쌍 및 프로브를 포함하는 리프트밸리열 바이러스 신속 검출을 위한 재조합효소 중합효소 증폭 반응용 조성물 및 이를 이용한 리프트밸리열 바이러스 검출방법에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 프라이머쌍을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 리프트밸리열 바이러스 검출방법에 따르면 재조합효소 중합효소 증폭법에 따라 검체 내 리프트밸리열 바이러스를 매우 높은 민감도와 특이도로 신속하게 검출할 수 있어, 리프트밸리열 바이러스 감염증 진단 및 바이러스 검출에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명이 제공하는 프라이머쌍을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 리프트밸리열 바이러스 검출방법에 따르면 재조합효소 중합효소 증폭법에 따라 검체 내 리프트밸리열 바이러스를 매우 높은 민감도와 특이도로 신속하게 검출할 수 있어, 리프트밸리열 바이러스 감염증 진단 및 바이러스 검출에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 리프트밸리열(Rift valley fever) 바이러스 신속 검출을 위한 재조합효소 중합효소 증폭 반응용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 리프트밸리열 바이러스 유전자의 S segment에 특이적인 프라이머쌍 및 프로브를 포함하는 리프트밸리열 바이러스 신속 검출을 위한 재조합효소 중합효소 증폭 반응용 조성물 및 이를 이용한 리프트밸리열 바이러스 검출방법에 관한 것이다.
리프트밸리열(Rift Valley Fever; RVF)은 버냐바이러스(Bunyaviridae)와 필보바이러스(Phlebovirus)속에 속하며, 세 개의 분절로 이루어진 단일가닥의 선형(-)RNA 바이러스이다. 1900년대 초반 케냐의 가축에서 처음 발견된 이후 감염된 가축을 통하여 많은 사람과 동물에서 발생이 보고되고 있다. 잠복기는 대개 2-6일이며, 일반적으로 발열, 현기증, 극심한 체중감소 등의 경미한 증상을 나타내지만 심한 경우에는 쇼크, 출혈, 안질환, 뇌염으로 인한 두통, 혼수상태 등의 증상을 보이며 사망에 이를 수 있다. 전체 감염자의 1%가 사망하고 출혈열 증상 환자의 경우 치사율이 50%에 달하나 현재까지 특이적 항바이러스제나 예방 백신이 개발되지 않았으며, 발병시 대중 치료만 가능하다. 감염 경로는 감염된 혈액을 가진 모기나 흡혈곤충에게 물리거나 감염된 동물의 혈액이나 체액, 장기에 접촉하는 경우, 감염된 동물의 우유를 가공하지 않고 마실 경우에 감염이 일어날 수 있다. 대부분의 아프리카 지역과 아라비아 반도에서 주로 발생하며, 특히 매개모기 서식지인 서아프리카 지역에서 많이 발생하나, 현재까지 국내에서 발병된 보고는 없다.
리프트밸리열(Rift Valley Fever; RVF)은 대부분의 아프리카 지역에서 발생하는 감염병으로 국내 유입 가능성이 높아 이에 대한 진단법 개발 필요하다. 리프트밸리 바이러스의 매개체인 Culex tritaeniorhynchus와 Aedes vexans 는 전국에 퍼져 서식하고 있어, 교통의 발달로 물적 인적 자원의 교류가 빈번한 작금의 상황을 고려할 때 국내에 유입되면 국내 유행이 가능한 바이러스임으로 국민 보건의 지대한 영향을 미칠 가능성이 높다. 이에 따라 2019년에 질병관리본부에서 미래 유입가능한 신종감염병으로 선정된 바 있다.
선제적 방제를 위해서는 리프트밸리 바이러스를 높은 정확도로 검출할 수 있는 신속하고 현장에서 바이러스 검출이 용이한 분자진단 키트의 개발이 절실한 실정이다.
리프트밸리열 바이러스의 경우 환자 및 사망자와 접촉에 의한 2차 감염 가능성은 낮으나, 의료인, 장례지도사 등 환자 및 사망자와 접촉가능성이 높은 직업군의 조기 발견을 위한 주기적인 진단에 응용할 간편한 진단방법 개발이 필요하다.
신속하고 정확한 리프트밸리열 바이러스 진단제는 일반의료 현장뿐만 아니라 공항, 항만, 검역 현장 등에 배치하여 의심증상을 보이는 의심환자의 신속한 선별을 하여 국내로 리프트밸리열 바이러스의 유입을 조기에 차단할 필요가 있다.
리프트밸리열 바이러스 감염증의 경우 일반적인 증상을 보이면 1% 정도의 치사율을 보이나 출혈을 동반하기 시작하면 치사율이 50%에 육박하는 고위험의 바이러스이며, 특별한 치료방법도 성립되어 있지 않고, 특히나 백신도 없는 현 상황에서 조기 진단만이 치사율을 낮출 수 있는 유일한 방법이므로 정확하고 간단한 진단법의 개발이 시급한 실정이다.
한편, 종래에는 바이러스 검출을 위해 ITS-RFLP, 종-특이적 프라이머를 이용한 PCR 및 실시간 PCR 방법 등이 연구되었으나 이러한 PCR 기반의 종래 검출 방법은 DNA의 변형이 온도에 민감하기 때문에 프라이머의 개발이 매우 중요하며, 증폭 단계에서 온도를 변화시키기 위해 시간이 소요된다는 단점을 가진다. 또한, 증폭된 반응 산물을 전기영동으로 확인하고 최종적으로 염기서열 분석을 해야 하는 일련의 과정을 통해 추가로 분석 시간이 요구되며, 중합효소연쇄반응기와 같은 전문적인 장비가 요구되어 고비용이라는 단점 또한 강조되고 있다.
이러한 단점을 극복하기 위해 개발된 재조합효소 중합효소 증폭법(Recombinase Polymerase Amplification; RPA)은 기존의 PCR 방법과 유사하나, 일정한 온도에서 온도변화 없이 특정 유전자의 증폭이 가능하기 때문에 반응 시간을 단축할 수 있고, 특수한 장비가 필요치 않아서 검사 단가가 저렴하고, 운반성이 뛰어나 현장검사가 가능할 수 있다는 장점을 가진다. 재조합효소 중합효소 증폭법(Recombinase Polymerase Amplification; RPA)은 박테리오파지 T4 재조합효소를 이용하여 DNA 이중가닥의 해리를 일으키고 동시에 DNA 중합효소와 특정 primer들을 사용하여 특정DNA를 증폭해내는 방법이다. 이는 PCR의 경우와 같이 표적 기질(target template)과 한 쌍의 primer (oligonucleotide)를 사용하여 특정 염기서열의 DNA를 증폭시킬 수 있으나, PCR의 경우와 달리 일정 온도(37℃ - 42℃)의 범위에서 등온조건으로 증폭반응을 일으킬 수 있는 장점이 있다. 현재 RPA는 매우 빠르게 증폭산물을 만들 수 있도록 발전되었으며, 이는 등온조건의 장점과 함께 널리 인식되어 특이유전자증폭을 통한 특정병원체의 검출법에 다양하게 RPA가 응용되고 있다.
이에, 본 발명자는 리프트밸리열 바이러스를 RPA 방법을 통해 매우 빠르고 간편하게 검출할 수 있는 검출법을 개발하고자 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명의 일실시예에서 제작된, 리프트밸리열 바이러스 유전자의 S segment에 특이적인 프라이머쌍 및 프로브를 이용하면 매우 높은 민감도와 특이도로 리프트밸리열 바이러스를 검출할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 리프트밸리열(Rift valley fever) 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 리프트밸리열(Rift valley fever) 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 리프트밸리열(Rift valley fever) 바이러스 감염증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 검체로부터 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 리프트밸리열 바이러스 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 인간을 제외한 포유동물로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 리프트밸리열 바이러스 감염증 진단방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 리프트밸리열(Rift valley fever) 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 리프트밸리열(Rift valley fever) 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 리프트밸리열(Rift valley fever) 바이러스 감염증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 검체로부터 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 리프트밸리열 바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 인간을 제외한 포유동물로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 리프트밸리열 바이러스 감염증 진단방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 리프트밸리열(Rift valley fever) 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 "프라이머(primer)"란 짧은 서열의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로서 목적하는 DNA 또는 RNA의 반대편 가닥의 상보적 위치에 특이적으로 부착되어 유전자의 증폭(amplification)을 개시하는 역할을 하는 올리고뉴클레오티드로서, 바람직하게는 리프트밸리열 바이러스 유전자의 S segment 영역에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열과 각각 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 유사한 서열의 프라이머도 포함될 수 있다.
상기 프라이머쌍는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 프라이머는 리프트밸리열 바이러스 유전자의 S segment를 증폭할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 조성물은 프로브(probe)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 "프로브(probe)"란, 목적하는 유전자에 특이적으로 부착되어 목적 유전자를 확인 및/또는 검출하는 탐침자를 포괄적으로 포함하는 광의의 개념이다. 상기 프로브는 하나 이상 유형의 화학 결합을 통하여, 일반적으로 상보적 염기 쌍형성을 통하여, 보통 수소 결합 형성을 통하여 상보적인 서열의 표적 핵산에 결합하고 따라서 이중나선(duplex) 구조를 형성할 수 있는 핵산이다. 프로브는 “프로브 결합 부위”에 결합 또는 혼성화한다. 특히, 일단 프로브가 프로브의 상보적인 표적에 혼성화하면 프로브의 검출을 용이하게 하도록 프로브는 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 그러나 대안적으로, 프로브는 표지화되지 않을 수 있지만, 표지화된 리간드와의 특이적 결합에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 프로브는 크기가 상당히 다양할 수 있다. 일반적으로 프로브는 길이가 적어도 7 내지 15개 뉴클레오티드이다. 다른 프로브는 길이가 적어도 20, 30 또는 40개 뉴클레오티드이다. 또 다른 프로브는 다소 더 길며, 길이가 적어도 50, 60, 70, 80, 또는 90개 뉴클레오티드이다. 또 다른 프로브는 더욱 더 길며, 길이가 적어도 100, 150, 200개 또는 그 이상의 뉴클레오티드이다. 프로브는 또한 상기 값(예컨대, 길이가 15~20개 뉴클레오티드)의 임의의 값으로 한정된 임의의 범위 내에 있는 임의의 길이의 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 “혼성화”는 상보적 염기서열을 가진 단일가닥 핵산들 간 수소결합에 의해 이중가닥 핵산이 형성되는 것을 의미하며, 어닐링(annealing)과 유사한 의미로 사용된다. 다만 조금 더 넓은 의미에서, 혼성화는 두 개의 단일가닥 간 염기서열이 완전히 상보적인 경우(perfect match)와 더불어 예외적으로 일부의 염기서열이 상보적이지 않은 경우(mismatch)까지 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 프로브는 리프트밸리열 바이러스 유전자의 S segment에 특이적으로 결합하는 화합물, 항체, 단백질, 올리고뉴클레오티드 등 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에서 상기 프로브는 상기 프라이머에 의해 증폭된 증폭산물에 특이적으로 결합하며, 엔도뉴클레아제에 의해 비염기 형태로 치환된 부위를 포함한 3' 부분이 제거되어 증폭산물을 검출하게 할 수 있다.
본 발명에서 상기 프로브는 3' 말단에 스페이서가 포함되어 엔도뉴클레아제에 의해 3' 부위가 제거되지 않은 상태에서의 불필요한 증폭반응이 일어나지 않도록 이루어지는 것이 바람직할 수 있다. 이때 스페이서는 예를 들어, C3 스페이서(C3 spacer)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 프로브는 서열의 중간의 일부 염기가 비염기 형태로 치환될 수 있다. 상기 중간의 비염기 형태는 엔도뉴클레아제의 작용을 위해 구성되는 것으로서 엔도뉴클레아제가 인식하여 절단할 수 있는 통상적인 DNA의 비염기 형태일 수 있으며, 예를 들어 THF(tetrahydrofuran)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 프로브는 증폭산물의 검출을 위해 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 프로브는 리포터와 소광자 간 거리가 가까울 때에는 신호 발생이 억제되다가 리포터와 소광자 간 거리가 멀어지면서 신호 세기가 증가한다. 일반적으로 상기 프로브가 상보적 염기서열과 혼성화하였을 때에 리포터와 소광자 간 거리가 가장 멀어지므로 신호 발생 또는 신호 세기 증가를 통해 특정 염기서열을 검출할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 리포터는 FAM, TET, JOE, YAKYE, HEX, CY3, ATTO550, TAM, ROX, TxRed, CY35, LC610, LC640, ATTO647N, CY5, 및 ATTO680 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 형광 물질인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 소광자는 TAM, BHQ1, BHQ2, BHQ3, BHQ650, DAB, 및 Eclip으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 상기 프로브는 검출을 용이하게 하기 위하여 말단 부위 또는 중간 부위에 하나 이상의 표지를 포함할 수 있으며, 상기 표지는 바람직하게는 형광 모이어티이며, 더욱 바람직하게는 다민, 쿠마린, 시아닌, EvoBlue, 옥사진, 카르보피로닌(carbopyronin), 나프탈렌, 바이페닐, 안트라센(anthracene), 페난트렌, 파이렌, 카르바졸 등을 기본 백본으로 가지는 형광 색소 또는 이의 유도체 같은 형광 모이어티가 선택적으로 연결 또는 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 형광 모이어티, 즉 리포터는 Cy5.5 (694), Cy7 (773), ATTO 390™ (479), ATTO 425™ (484), ATTO 465™ (508), ATTO 488™ (523), ATTO 495™ (527), ATTO 520™ (538), ATTO 532™ (553), ATTO Rho6G™ (570), ATTO 550™ (576), ATTO 565™ (592), ATTO Rho3B™ (565), ATTO Rho11™ (608), ATTO Rho12™ (532), ATTO Thio12™ (579), ATTO 610™ (634), ATTO 611 X™ (681), ATTO 620™ (643), ATTO Rho14™ (625), ATTO 633™ (657), ATTO 647™ (669), ATTO 647 N™ (669), ATTO 655™ (684), ATTO Oxa12™ (663), ATTO 700™ (719), ATTO 725™ (752), ATTO 740™ (764), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), EvoBlue10™, EvoBlue30™, MR121, Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), 로다민(Rhodamine) 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), 피코에리트린 R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), 피로닌 Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-피코시아닌 (642), C-피코시아닌 (648), TOPRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), 티아디카르보시아닌 (671), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar650 (566), Quasar570 (667), Quasar670 (705), Quasar705 (610) 및 이의 유도체 또는 컨쥬게이트와 연결될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다. 또한, 상기 형광 모이어티 유도체는 본 발명의 검출을 방해하지 않는 한 자유 카르복실기, 에스테르(예컨대, N-하이드로숙신이미드(NHS) 에스테르) 또는 말레이미드 유도체를 추가적으로 포함할 수 있다. 또는, 형광 빛을 흡수하여 퀀칭시킬 수 있는 소광체, 즉, 퀀처가 선택적으로 연결 또는 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 퀀처는 답실(Dabsyl), BHQ(Black Hole Quencher)-0,BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, Iowa Black®FQ, Iowa Black®RQ, QXLTM 490, IRDye QC-1, Deep Dark QuencherII, Deep Dark QuencherI, Eclipse® Dark Quencher, ATTO 540Q, ATTO 580Q, ATTO 612Q 및 이의 유도체 또는 컨쥬게이트와 연결될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 퀀처 유도체는 본 발명의 검출을 방해하지 않는 한 자유 카르복실기, 에스테르(예컨대, N-하이드로숙신이미드(NHS) 에스테르) 또는 말레이미드 유도체를 추가적으로 포함할 수 있다. 또는 상기 표지는 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파 등 검출이 가능한 시그널을 제공할 수 있는 표지라면 제한이 없다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 프로브는 GAATGATGACATTAGAAGGGATCAGATTGC [FAM-dT] AC [THF] C [BHQ-dT] AGCATATGAGGAGCT-[3'-block] 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 프라이머 세트는 바람직하게는 등온증폭 용도이며, 더욱 바람직하게는 재조합효소 중합효소 증폭반응(Recombinase polymerase amplification)용일 수 있으나, 현장에서 단시간 내에 유전자를 증폭 및 검출 가능한 방법이라면 특별히 제한되지 않는다.
상기 "재조합효소 중합효소 증폭법(RPA)"은 DNA 및 RNA 증폭을 확인할 수 있는 기술을 의미하며, 기존 PCR 과는 다르게 DNA 결합 단백질과 재조합효소(recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟 서열(target sequence)을 증폭시킬 수 있는 기술이다. RPA 방법은 중온성 중합효소(mesophilic polymerase)를 이용하여 등온 조건에서도 증폭이 가능하므로, 특별한 장비 없이 등온 장치만 있으면 단 시간 안에 바이러스를 검출 및 진단할 수 있는 장점이 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 리프트밸리열(Rift valley fever) 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 양태에서 상기 키트에는 전술한 프로브가 추가로 포함될 수 있다.
상기 키트는 RPA 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있고, 상기 각각의 프라이머쌍 및 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPCwater) 및 멸균수 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 리프트밸리열(Rift valley fever) 바이러스 감염증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 검체로부터 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 리프트밸리열 바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 (b) 단계의 증폭은 재조합효소 중합효소 증폭일 수 있다. 상기 증폭은 30 내지 45℃에서 5 내지 30분간 수행될 수 있으며, 바람직하게는 30 내지 40℃에서 5 내지 25분간 수행될 수 있으며, 더 바람직하게는 35 내지 40℃에서 5 내지 20분간 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 35 내지 40℃에서 10 내지 20분간 수행될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 (c) 단계의 검출은 프로브를 이용하여 측면흐름검출법을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 검체는 임상시료일 수 있다.
상기 임상시료는 생물학적 시료와 동일한 의미로 해석될 수 있으며, 리프트밸리열 바이러스 감염이 의심되는 개체, 즉, 사람 등 포유동물로부터 분리된 시료일 수 있다. 이의 비제한적인 예시로서 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 모피, 소변 등이 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 인간을 제외한 포유동물로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 리프트밸리열 바이러스 감염증 진단방법을 제공한다.
본 발명이 제공하는 프라이머쌍을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 리프트밸리열 바이러스 검출방법에 따르면 재조합효소 중합효소 증폭법에 따라 검체 내 리프트밸리열 바이러스를 매우 높은 민감도와 특이도로 신속하게 검출할 수 있어, 리프트밸리열 바이러스 감염증 진단 및 바이러스 검출에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 리프트밸리가 발생한 나라들에서 분리한 23건의 분리주로부터 얻은 S-segment 서열을 비교하여 프라이머3 프로그램으로 프라이머와 프로브를 선정한 결과이다.
도 2 및 도 3은 본 발명에 따른 프라이머쌍 및 프로브의 검출 민감도를 평가한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 프라이머쌍 및 프로브의 검출 특이도를 평가한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 프라이머쌍 및 프로브의 End point 검출 민감도를 평가한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 프라이머쌍 및 프로브의 End point 검출 특이도를 평가한 결과이다.
도 2 및 도 3은 본 발명에 따른 프라이머쌍 및 프로브의 검출 민감도를 평가한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 프라이머쌍 및 프로브의 검출 특이도를 평가한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 프라이머쌍 및 프로브의 End point 검출 민감도를 평가한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 프라이머쌍 및 프로브의 End point 검출 특이도를 평가한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 리프트밸리열 바이러스 검출용 프라이머의 제작
리프트밸리열 바이러스 특이적인 검출용 프라이머를 제작하기 위하여, 일차적으로 바이러스의 유전 정보를 이용하여 다중 정렬(multiplealignment)을 수행하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다. 리프트밸리열 바이러스의 유전자 중 S segment를 선택하였다. Primer3 프로그램을 이용하여 프라이머와 프로브를 디자인한 결과 한 부위에서만 프라이머가 선별되었다. 검출용 프로브는 올리고뉴클레오티드 골격에 dT-fluorophore(FAM-dT)와 이에 상응하는 dT-quencher(BHQ-dT) 그룹을 abasic 뉴클레오타이드 유사체(tetrahydrofuran residue; THF, 혹은 dSpacer)에 인접하도록 제작하였고, 중합효소에 의한 중합반응(연장)을 방지하기 위하여 3' 말단에는 3'-modification 그룹인 C3-spacer를 배치함으로써, 프로브 결합시 형광의 발생을 통하여 리프트밸리열 바이러스를 검출할 수 있도록 제작하였다. 리프트밸리열 바이러스의 S segment에 특이적인 프라이머쌍 및 프로브의 서열은 하기 표 1과 같다.
실시예 2: 리프트밸리열 바이러스 S segment RPA용 target 유전자 제작
RPA용 진단용 프로브와 프라이머의 성능 테스트를 위해서 리프트밸리열 바이러스의 핵산이 필요하나 현재 국내에는 해당 바이러스에 대한 핵산이 존재하지 않기 때문에, 23개의 리프트밸리 바이러스의 consensus sequence 부위를 (주)바이오니아에 의뢰하여 mRNA transcript 제작하여 실험에 사용하였다.
리프트밸리열 S segment의 mRNA transcript 서열은 다음과 같다:
TCATGCACCATCGTCCTAGTCACGAGGTTCGCTTGCGATTCTCTGATTTCTACAATGTCGGAGAATTCCCATACCGAGTCGGACTTGGAGACTTTGCATCAAACGTTGCACCTCCACCAGCAAAGCCTTTTCAGAGACTTATATGATCTAATAGGCCATATGACTCTTAGTGATTTCACAAGGTTCCCCAACTCTAAAAGAAGCCATATCCTGGCCTCTTGGAGAACCCTCACTGGCTTTCTTTGACCTAAGCTAGCTACTAGAGTGCACAGGAATGATGACATTAGAAGGGATCAGATTGCTACTCTAGCATATGAGGAGCTGCAAGATTACCAATGATTTAGAAGACTCCTTTCCAGTTGGCTTACACAGGATGATAGTGACCGAGGCTATCCTCAGAGGGATTGACCTGTGCCTGTTGCCAGGCTTTGACCTC
실시예 3: 제조된 프라이머 및 프로브의 검출 민감도
상기 실시예 1에서 제조한 RPA용 프라이머와 프로브의 성능 테스트를 위해서 상기 실시예 2에서 제작한 리프트밸리열 바이러스의 target gene 인공합성 핵산을 이용하여 최소검출 한계를 측정하였다.
10 ng에서부터 0.01 pg까지 열단계씩 희석하여 37℃에서 20분 반응을 T8 UV scanner에서 수행한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 0.01 pg까지 20분내에 검출이 가능한 것으로 확인되었다.
또한, mRNA copies에 대한 검출한계를 1x106부터 1x100까지 열단계 희석하여 37℃, 20분간 등온핵산 증폭기로 반응시킨 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 1x103까지 20분내에 검출이 가능한 것으로 확인되어 검출 민감도가 매우 뛰어난 것으로 확인되었다.
실시예 4: 제조된 프라이머 및 프로브의 검출 특이도
전북대 병원에 내원한 환자로부터 얻은 40건의 Adenovirus, Human Rhinovirus, Human Enterovirus, Human Vocavirus에 대한 핵산을 분리 정제하여 상기 실시예 1에서 제조된 프라이머쌍 및 프로브의 검출 특이도를 평가한 결과, 다른 바이러스는 어느 하나도 검출하지 않는 것으로 확인되어 특이도가 매우 높은 것을 확인할 수 있었다(도 4a 내지 4g).
실시예 5: End point RPA 프라이머 및 프로브를 이용한 민감도 및 특이도
End point RPA용 프로브의 성능 테스트를 위해서 리프트밸리열 바이러스의 target gene 인공합성 핵산을 이용하여 최소검출 한계를 측정하고자, mRNA copies에 대한 검출한계를 1x105부터 1x100까지 열단계 희석하여 37
, 10분간 등온핵산 증폭기로 반응시킨 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 1x103까지 10분내에 검출이 가능한 것으로 확인되었다.
또한, 전북대 병원에 내원한 환자로부터 얻은 1건의 Adenovirus, Human Rhinovirus, Human Enterovirus, Human Vocavirus에 대한 핵산을 분리 정제하여 상기 실시예 1에서 제조된 프라이머쌍 및 프로브의 검출 특이도를 평가한 결과, 다른 바이러스는 어느 하나도 검출하지 않는 것으로 확인되어 특이도가 매우 높은 것을 확인할 수 있었다(도 6).
본 발명이 제공하는 프라이머쌍을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 리프트밸리열 바이러스 검출방법에 따르면 재조합효소 중합효소 증폭법에 따라 검체 내 리프트밸리열 바이러스를 매우 높은 민감도와 특이도로 신속하게 검출할 수 있어, 리프트밸리열 바이러스 감염증 진단 및 바이러스 검출에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
<110> UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION, YONSEI UNIVERSITY WONJU CAMPUS
<120> Composition for recombinase polymerase amplification reaction for
rapid detection of Rift valley fever virus
<130> NP21-0077
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 1
gatctaatag gccatatgac tcttagtgat ttc 33
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 2
aaaggagtct tctaaatcat tggtaatctt g 31
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 3
atgatgacat tagaagggat cagattgcta ctcta 35
Claims (18)
- 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 리프트밸리열(Rift valley fever) 바이러스 검출용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 프로브는 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 리포터는 FAM, TET, JOE, YAKYE, HEX, CY3, ATTO550, TAM, ROX, TxRed, CY35, LC610, LC640, ATTO647N, CY5, 및 ATTO680 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 형광 물질인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 소광자는 TAM, BHQ1, BHQ2, BHQ3, BHQ650, DAB, 및 Eclip으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 프로브는 5'-GAATGATGACATTAGAAGGGATCAGATTGC [FAM-dT] AC [THF] C [BHQ-dT] AGCATATGAGGAGCT-[3'-block] 인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 재조합효소 중합효소 증폭반응(Recombinase polymerase amplification)용인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 리프트밸리열(Rift valley fever) 바이러스 검출용 키트.
- 제9항에 있어서, 상기 키트는 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 포함하는, 리프트밸리열(Rift valley fever) 바이러스 감염증 진단용 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 조성물은 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- (a) 검체로부터 핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 리프트밸리열 바이러스 검출방법.
- 제13항에 있어서, 상기 증폭은 재조합효소 중합효소 증폭인 것을 특징으로 하는 검출방법.
- 제13항에 있어서, 상기 검출은 프로브를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 검출방법.
- 제13항에 있어서, 상기 검체는 임상시료인 것을 특징으로 하는 검출방법.
- 제13항에 있어서, 상기 증폭은 30 내지 45℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 검출방법.
- (a) 인간을 제외한 포유동물로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 리프트밸리열 바이러스 감염증 진단방법.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020210161521A KR20230075183A (ko) | 2021-11-22 | 2021-11-22 | 리프트밸리열 바이러스 신속 검출을 위한 재조합효소 중합효소 증폭 반응용 조성물 |
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| KR20230075183A true KR20230075183A (ko) | 2023-05-31 |
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ID=86543785
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020210161521A KR20230075183A (ko) | 2021-11-22 | 2021-11-22 | 리프트밸리열 바이러스 신속 검출을 위한 재조합효소 중합효소 증폭 반응용 조성물 |
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- 2021-11-22 KR KR1020210161521A patent/KR20230075183A/ko unknown
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