KR20230070075A - Pd-l1 키메라 항원 수용체-발현 nk 세포에 의한 pd-l1-양성 악성종양의 제거 - Google Patents

Pd-l1 키메라 항원 수용체-발현 nk 세포에 의한 pd-l1-양성 악성종양의 제거 Download PDF

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로랑 에이치 부아셀
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난트퀘스트, 인크.
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Abstract

PD-L1 CAR, CD16 및 IL2의 조합을 발현하는 NK-92™세포의 조성물, 및 이러한 세포를 사용하여 종양 세포 및 종양 미세환경내 세포(예를 들어, MDSC 또는 TAM)를 감소시키고 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

PD-L1 키메라 항원 수용체-발현 NK 세포에 의한 PD-L1-양성 악성종양의 제거 {ELIMINATION OF PD-L1-POSITIVE MALIGNANCIES BY PD-L1 CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR-EXPRESSING NK CELLS}
본 출원은 2018년 10월 31일에 출원된 일련 번호 제62/753,740호를 갖는 본원의 동시계류 중인 미국 가출원을 우선권으로 주장하며, 상기 출원은 참조로서 본원에 포함된다.
서열 목록
크기가 40 kb인 104077.0006PCT_ST25_REV006이라 명명된 서열 목록의 ASCII 텍스트 파일 내용은 2019년 7월 26일에 생성되었고, 본 출원과 함께 EFS-Web을 통해 전자 제출되었으며, 그 전체가 참조로서 포함된다.
고형 종양에서 암 세포는 이의 주변에 종양 미세환경을 형성하여 암 세포의 성장 및 전이를 지원할 수 있다. 종양 미세환경은, 신생물 형질전환을 촉진하고, 종양 성장 및 침입을 보조하고, 숙주 면역으로부터 종양을 보호하고, 치료 내성을 조성하고, 휴면 전이가 성장하는 기반을 제공할 수 있는, 주변 혈관, 면역 세포, 섬유아세포, 기타 세포, 가용성 인자, 신호전달 분자, 세포외 기질, 및 역학적 신호를 포함하여 종양이 존재하는 세포 환경이다. 종양 및 이의 주위 미세환경은 밀접하게 관련되어 있으며, 지속적으로 상호작용한다. 종양은 세포외 신호를 방출하고, 종양 혈관신생을 촉진하며, 말초 면역 내성을 유도함으로써 이들의 미세환경에 영향을 줄 수 있는 반면, 미세환경내 면역 세포는 암 세포의 성장 및 진화에 영향을 미칠 수 있다. 문헌[Swarts et al. "Tumor Microenvironment Complexity: Emerging Roles in Cancer Therapy," Cancer Res, vol., 72, 2473-2480 쪽, 2012]을 참조하라.
자연 살해(Natural killer: NK) 세포는 선천성 면역계의 주요 성분을 구성하는 세포독성 림프구이다. 일반적으로 순환 림프구 중 약 10% 내지 15%를 나타내는 자연 살해(NK) 세포는, 항원에 대해 비-특이적으로 그리고 선행 면역 감작 없이, 바이러스-감염된 세포 및 많은 악성 세포를 포함하여 표적화된 세포에 결합하고 이를 사멸시킨다. 문헌[Herberman et al., Science 214:24 (1981)]. 표적화된 세포의 사멸은 세포 용해를 유도함으로써 발생한다. 이러한 목적에 사용된 NK 세포는 대상체의 혈액의 말초 혈액 림프구(peripheral blood lymphocyte: "PBL") 분획으로부터 단리되고, 충분한 수의 세포를 얻기 위해 세포 배양으로부터 증대되고, 이어서 대상체 내에 재주입된다. 이러한 자가 NK 세포는 생체외 요법과 생체내 치료 둘 모두에서 다소 효과적인 것으로 보여졌다. 그러나, 이러한 요법은 자가 유래에 국한되고, 모든 NK 세포가 세포용해성은 아니라는 점 때문에 추가적인 복잡성을 띤다.
현재, CAR-T 요법은 종양 미세환경에서 면역 세포를 표적화하는 흔한 요법이 되었다. 그러나, 표적 항원의 다수가 또한 정상 전구 세포에서도 발현되기 때문에 이러한 CAR-T 요법은 흔히 생체내 모델에서 혈구감소증 및 골수 전구체의 감소를 유발하는데, 이는 영구적으로 발현된 종양 항원-특이적 CAR-T 세포가 환자에게 허용 가능하지 않은 독성을 가질 것임을 시사한다. 또한, CAR-T 기법은 자가 T-세포의 엔지니어링에 의존하는데, 이는 상당한 환자별 변이성, 뿐만 아니라 T-세포가 증대될 수 없는 다수 환자의 배제를 초래한다. 따라서, 종양 세포와 종양 미세환경내 세포 둘 모두를 표적화하는 효과적인 암 요법에 대한 필요성이 존재한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 PD-L1 CAR 및 Fc 수용체를 발현하는 변형된 NK-92®세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92®세포는 다중-시스트론성 작제물을 포함하고, 여기서 다중-시스트론성 작제물은 PD-L1 CAR 및 Fc 수용체를 인코딩한다. 일부 구현예에서, Fc 수용체는 CD16이다. 일부 구현예에서, Fc 수용체는 SEQ ID NO: 2를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-시스트론성 전이유전자는 IL-2 또는 이의 변이체를 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, PD-L1 CAR, Fc 수용체, 및/또는 IL2는 코돈-최적화 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, IL-2 변이체는 erIL-2이다.
일부 구현예에서, PD-L1 CAR, Fc 수용체, 또는 erIL-2 중 하나 이상에 대한 코딩 서열은 인간계에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 PD-L1-발현 세포를 사멸시킬 수 있다. 일부 구현예에서, PD-L1-발현 세포는 골수-유래 억제 세포(myeloid-derived suppressor cell: MDSC), 또는 종양 세포이다. 일부 구현예에서, PD-L1 CAR은 scFv 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 자기-절단 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하고, 여기서 서열은 PD-L1 CAR과 CD16 사이에 위치되며, 서열은 PD-L1 CAR과 FcR의 등몰 발현을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 CD16을 인코딩하는 서열과 IL-2 또는 이의 변이체를 인코딩하는 서열 사이에 내부 리보솜 도입 서열(internal ribosomal entry sequence: IRES)을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1-발현 세포에 대한 변형된 NK-92® 세포의 직접 세포독성은 표적에 대한 이펙터 비율이 10일 때 40% 내지 100%이다. 일부 구현예에서, PD-L1 발현 세포에 대한 변형된 NK-92® 세포의 직접 세포독성은 aNK®세포보다 높다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포의 ADCC 활성은 표적에 대한 이펙터 비율이 10일 때 20% 내지 60%이다. 일부 구현예에서, PD-L1 CAR은 SEQ ID NO: 10에 대해(및 특히, SEQ ID NO:10 내 CDR 서열에 대해) 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 상기 개시된 변형된 NK-92® 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 변형된 NK-92® 세포를 생성시키기 위한 방법으로서, 벡터를 제공하는 단계(여기서, 벡터는 PD-L1 CAR 및 CD16을 인코딩함), 및 벡터를 NK-92® 세포에 도입하여 변형된 NK-92® 세포를 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 벡터는 IL-2를 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 자기-절단 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하고, 여기서 서열은 CAR과 CD16 사이에 위치되며, 서열은 CAR과 CD16의 등몰 발현을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 벡터는 CD16 코딩 서열과 IL-2 코딩 서열 사이에 내부 리보솜 도입 서열(IRES)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 PD-L1 발현 세포를 사멸시키기 위한 방법으로서, 골수-유래 억제 세포(MDSC), 종양 관련 대식세포(TAM), 또는 종양 세포를 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 복수의 변형된 NK-92® 세포와 인큐베이션시키고, 이에 의해 MDSC, TAM, 또는 종양 세포를 사멸시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, PD-L1 발현 세포는 종양 세포 또는 종양 미세환경내 세포이다. 일부 구현예에서, 미세환경내 세포는 골수-유래 억제 세포(MDSC) 또는 종양 관련 대식세포(TAM)이다. 일부 구현예에서, MDSC 세포는 CD14 또는 CD15를 발현한다. 일부 구현예에서, TAM은 CD68; 및 CD206, CD204, 또는 CD163 중 하나 이상을 발현한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 골수-유래 억제 세포(MDSC), 종양 관련 대식세포, 또는 종양 세포를 사멸시키기 위한 방법으로서, 치료적 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 조성물은 상술된 복수의 변형된 NK-92® 세포를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 대상체의 체표면적의 m2 당 약 1×108 내지 약 1×1011개의 변형된 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 조성물은 상술된 복수의 임의의 변형된 NK-92® 세포를 포함하는, 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 암은 흑색종, 유방암, 난소암, 위암, 전립선암, 편평 세포 암종, 두경부암, 결장암, 췌장암, 자궁암, 신세포암, 교모세포종, 수모세포종, 육종, 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 종양내로 투여된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 골수-유래 억제 세포(MDSC) 또는 종양 세포를 사멸시키기 위한 방법으로서, 치료적 유효량의 제1 조성물 및 제2 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 제1 조성물은 복수의 NK-92® 세포를 포함하고, 제2 조성물은 항-PD-L1 항체를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, NK-92® 세포는 Fc 수용체를 발현한다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 haNK® 세포이다. 일부 구현예에서, 제2 조성물은 아벨루맙(Avelumab)이다.
상기 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 예시적이고 설명적인 것이고, 개시의 추가 설명을 제공하기 위해 의도된 것이다. 다른 목적, 이점 및 신규한 특징은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
목적, 특징 및 이점은 첨부된 도면과 관련하여 고려될 때 하기 개시 내용을 참조하여 보다 용이하게 이해될 것이다.
도 1은 1세대, 2세대, 및 3세대 CAR의 구조 도메인의 개략도이다.
도 2는 CAR 코딩 서열, P2A 서열, CD16 코딩 서열, 및 erIL-2 코딩 서열을 포함하는 삼중시스트론성 플라스미드의 구성요소를 나타낸 것이다.
도 3은 변형된 NK-92®세포에서 PD-L1-CAR의 발현에 대한 유세포 분석의 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 MDA MB 231 세포에 대항하는 PD-L1 t-haNK 세포의 세포독성 효과를 나타낸 것이다. 모 aNK™세포는 대조 세포로서 사용되었다.
도 5a는 골수-유래 억제 세포(MDSC)에 대한 PD-L1 t-haNK 세포의 세포독성 효과를 나타낸 것이다. 도 5b는 aNK™내성의 PD-L1-양성 MDA-MB-231 세포주에 대한 PD-L1 t-haNK 세포의 세포독성 효과를 나타낸 것이다. XL-48 및 XL-49는 두 개의 상이한 항-PD-L1 항체로부터 유래된 두 개의 상이한 scFv 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 두 개의 PD-L1 t-haNK 집단이다. 도 5c는, 항-CD20 항체 리툭시맙과 조합될 때, 조작된 SUP-B15 세포에 대항하는 PD-L1 t-haNK 세포의 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 활성을 나타낸 것이다. 이들 조작된 SUP-B15 세포는 CD19가 아니라 CD20을 발현한다. 헤르셉틴(Herceptin)은 대조 항체로 사용되었다.
도 6a는 비히클 및 PD-L1 t-haNK 세포로 처리된 마우스에서 MDA-MB-231 유래 종양의 생체내 종양 성장을 나타낸 것이고; 도 6b는 i.v. 투여를 이용한 비히클 및 PD-L1 t-haNK 세포로 처리된 마우스에서 HCC827 유래 종양의 생체내 종양 성장을 나타낸 것이다.
도 7은 i.t. 투여를 이용한 비히클 및 PD-L1 t-haNK 세포로 처리된 마우스에서 HCC827 유래 종양의 생체내 종양 성장을 나타낸 것이다.
도 8은 PD-L1 t-haNK 세포와 haNK® 세포 간의 예시적인 차이를 나타낸 것이다.
도 9는 MDA-MB-231 세포에 대항하는 PD-L1 t-haNK 세포 및 haNK®세포의 세포독성을 비교하는 예시적인 데이터를 나타낸 것이다.
도 10은 다양한 종양 세포에 대항하는 PD-L1 t-haNK 세포의 세포독성을 비교하는 예시적인 데이터를 나타낸 것이다.
도 11은 MDA-MB-231 세포 및 PD-L1 녹-아웃 MDA-MB-231 세포로부터 확립된 종양으로의 PD-L1 t-haNK 세포의 추적을 비교하는 예시적인 데이터를 나타낸 것이다.
도 12는 PD-L1 t-haNK 세포로 처리된 동물에서 MDA-MB-231 세포 및 PD-L1 녹-아웃 MDA-MB-231 세포로부터의 종양 성장을 비교하는 예시적인 데이터를 나타낸 것이다.
도 13은 MDSC에 대항하는 PD-L1 t-haNK 세포의 세포독성을 입증하는 예시적인 데이터를 나타낸 것이다.
개요
본 개시는 PD-L1 CAR, Fc 수용체, 및 IL2의 조합을 발현하는 NK-92™세포를 제공한다. 이들 세포는 종양 세포와 종양 미세환경내 세포 둘 모두를 표적화하여 암을 효과적으로 치료할 수 있다.
용어
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 하기 청구항에서, 하기 의미를 갖는 것으로 정의될 다수의 용어가 언급될 것이다.
본원에 사용된 용어는 특정 구현예를 기재하기 위한 것일 뿐이며, 제한하고자 함은 아니다. 본원에 사용된 단수 형태는 문맥이 명확하게 달리 나타내지 않는 한 복수 형태 또한 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 예를 들어, "자연 살해 세포"에 대한 언급은 복수의 자연 살해 세포를 포함한다.
모든 숫자로 나타낸 명칭, 예를 들어, pH, 온도, 시간, 농도 양, 및 분자량 (범위 포함)은 적절한 경우에 0.1 또는 1.0의 증분에 의해 (+) 또는 (-)로 달라지는 근사치이다. 항상 분명하게 언급되지는 않지만, 숫자로 나타낸 명칭 모두는 그 앞에 용어 "약"이 있을 수 있는 것으로 이해해야 한다.
본원에 사용된 "+"는, 특정 세포 마커의 존재를 나타내기 위해 사용될 때, 세포 마커가 이소형 대조군에 비해 형광 활성화 세포 분류에서 검출 가능하게 존재하거나; 정량적 또는 반-정량적 RT-PCR에서 배경 위에 검출 가능하다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "-"는, 특정 세포 마커의 존재를 나타내기 위해 사용될 때, 세포 마커가 이소형 대조군에 비해 형광 활성화 세포 분류에서 검출 가능하지 않게 존재하거나; 정량적 또는 반-정량적 RT-PCR에서 배경 위에 검출 가능하지 않다는 것을 의미한다.
당업자에 의해 이해될 바와 같이, 임의의 및 모든 목적을 위해, 특히 서면 기재사항을 제공하는 관점에서, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 하위범위 및 이의 하위범위의 조합을 포괄한다. 임의의 열거된 범위는 동일한 범위가 적어도 2등분, 3등분, 4등분, 5등분, 10등분 등으로 분해되는 것을 충분하게 기재하고 가능하게 함으로써 용이하게 인식될 수 있다. 비-제한적 예로서, 본원에 논의된 각각의 범위는 하위 3분의 1, 중간 3분의 1 및 상위 3분의 1 등으로 용이하게 분해될 수 있다. 또한, 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 모든 언어 예컨대 "최대", "적어도", "초과", "미만" 등은 언급된 수를 포함하고, 상기 논의된 바와 같은 하위범위로 후속적으로 분해될 수 있는 범위를 지칭한다. 최종적으로, 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1개 내지 3개의 세포를 갖는 군은 1개, 2개, 또는 3개의 세포를 갖는 군을 지칭한다. 유사하게, 1개 내지 5개의 세포를 갖는 군은 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 세포를 갖는 군 등을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "필적 가능한", 또는 "실질적으로 유사한"과 상호교환 가능하게 사용되는 용어 "실질적으로 동일한"은, NK-92™세포의 특정 정량화 가능한 성질, 예컨대, 세포독성, 생존율 또는 세포 배가 시간 등을 언급하는 경우, 이러한 성질의 두 측정치가 서로 15% 이하, 10% 이하, 8% 이하, 또는 5% 이하 상이하다는 것을 지칭한다.
또한, 항상 명확하게 명시되지는 않지만, 본원에 기재된 시약은 단지 예시적인 것이고, 그의 등가물이 당해 기술 분야에 공지되어 있다는 것을 이해해야 한다.
본 발명의 목적을 위해 그리고 달리 지시되지 않는 한, 용어 "NK-92™은 본래의 NK-92™세포주뿐만 아니라 NK-92™세포주, NK-92™세포의 클론, 및 변형되지 않은 NK-92™세포(예를 들어, 외인성 유전자의 도입에 의해)를 지칭하기 위해 의도된 것이다. NK-92™세포 및 예시적인 및 비-제한적 이의 변형예는 미국 특허 제7,618,817호; 제8,034,332호; 제8,313,943호; 제9,181,322호; 제9,150,636호; 및 미국 공개 출원 제10/008,955호에 기재되어 있고, 이들 모두 그 전체가 참조로서 본원에 포함되며, 야생형 NK-92™NK-92™™γ™ζ™™및 NK-92™를 포함한다. NK-92™세포는 당업자에게 공지되어 있으며, 이러한 세포는 NantKwest, Inc.로부터 용이하게 입수 가능하다.
본원에 사용된 용어 "NK-92™세포"는 Gong 등의 문헌[Leukemia, Apr; 8(4): 652-8 (1994)]에 기재된 매우 강력한 고유 세포주로부터 유래된 자연 살해 세포를 지칭하며, 이의 권리는 NantKwest가 소유한다(이하에서, "NK-92™세포").
본원에 사용된 용어 "aNK™세포"는 Gong 등의 문헌[Leukemia, Apr; 8(4): 652-8 (1994)]에 기재된 매우 강력한 고유 세포주로부터 유래된 자연 살해 세포를 지칭하며, 이의 권리는 NantKwest가 소유한다(이하에서, "aNK™세포").
본원에 사용된 용어 "haNK® 세포"는 세포 표면 상에서 CD16을 발현하도록 변형된, Gong 등의 문헌[Leukemia, Apr; 8(4): 652-8 (1994)]에 기재된 매우 강력한 고유 세포주로부터 유래된 자연 살해 세포를 지칭하며, 이의 권리는 NantKwest가 소유한다(이하에서, "CD16+ NK-92™세포" 또는 "haNK® 세포").
본원에 사용된 용어 "taNK® 세포"는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 변형된, Gong 등의 문헌[Leukemia, Apr; 8(4): 652-8 (1994)]에 기재된 매우 강력한 고유 세포주로부터 유래된 자연 살해 세포를 지칭하며, 이의 권리는 NantKwest가 소유한다(이하에서, "CAR-변형된 NK-92™세포" 또는 "taNK® 세포").
본원에 사용된 용어 "t-haNK™는 세포 표면 상에서 CD16을 발현하고 키메라 항원 수용체를 발현하도록 변형된, Gong 등의 문헌[Leukemia, Apr; 8(4): 652-8 (1994)]에 기재된 매우 강력한 고유 세포주로부터 유래된 자연 살해 세포를 지칭하며, 이의 권리는 NantkWest가 소유한다(이하에서, "CAR-변형된 CD16+ NK-92™세포" 또는 "t-haNK 세포"). 일부 구현예에서, 종양 특이적 항원은 PD-L1이고, 이러한 NK-92™세포들은 PD-L1 t-haNK 세포로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "다중-시스트론성 작제물"은 단일 mRNA 분자로 번역될 재조합 DNA 작제물을 지칭하며, 단일 mRNA 분자는 둘 이상의 전이유전자를 인코딩한다. 다중-시스트론성 작제물은 두 개의 전이유전자를 인코딩하는 경우 이중시스트론성 작제물로, 세 개의 유전자를 인코딩하는 경우 삼중시스트론성 작제물로, 그리고 네 개의 유전자를 인코딩하는 경우 사중시스트론성 작제물 등으로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항원 수용체"(CAR)는 세포내 신호전달 도메인에 융합된 세포외 항원-결합 도메인을 지칭한다. CAR은 T 세포 또는 NK 세포에서 발현되어 세포독성을 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 세포외 항원-결합 도메인은 관심 대상의 세포에서 발견되는 항원에 특이적인 scFv이다. CAR-발현 NK-92™세포는 scFv 도메인의 특이성에 기초하여, 세포 표면 상에 특정 항원을 발현하는 세포에 표적화된다. scFv 도메인은 종양-특이적 항원 및 바이러스-특이적 항원을 포함하는 임의의 항원을 인식하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, PD-L1 CAR은 일부 암에 의해 발현되는 세포 표면 마커인 PD-L1을 인식한다.
본원에 사용된 용어 "종양-특이적 항원"은 암 또는 신생물성 세포에 존재하나 암 세포와 동일한 조직 또는 계열로부터 유래된 정상 세포에서는 검출 가능하지 않은 항원을 지칭한다. 본원에 사용된 종양-특이적 항원은 또한 종양-관련 항원, 즉, 암 세포 상에서 암 세포와 동일한 조직 또는 계열로부터 유래된 정상 세포에 비해 보다 높은 수준으로 발현되는 항원을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "표적"은, 종양의 표적화를 지칭하는 경우, 종양 세포(즉, 표적 세포)를 인식하고 사멸시키는 NK-92™세포의 능력을 지칭한다. 이러한 문맥에서 용어 "표적화된"은, 예를 들어, 종양에 의해 발현된 세포 표면 항원을 인식하고 이에 결합하는 NK-92™세포에 의해 발현된 CAR의 능력을 지칭한다.
용어 "항체"는 표적 항원에 대한 특이적 결합을 위한 온전한 항체와 경쟁할 수 있는 임의의 이소형의 온전한 면역글로불린 또는 이의 단편을 지칭하고, 키메라, 인간화, 완전 인간, 및 이중특이성 항체를 포함한다. 온전한 항체는 일반적으로 적어도 두 개의 전장 중쇄 및 두 개의 전장 경쇄를 포함하지만, 일부 예에서 중쇄만을 포함할 수 있는 낙타과에서 자연 발생한 항체와 같이 더 적은 사슬을 포함할 수 있다. 항체는 오로지 단일 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 항체의 상이한 부분이 두 개의 상이한 항체로부터 유래되는 "키메라"일 수 있다. 항원 결합 단백질, 항체, 또는 결합 단편은 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 온전한 항체의 효소 또는 화학적 절단에 의해 하이브리도마에서 생산될 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 용어 "항체"는 두 개의 전장 중쇄 및 두 개의 전장 경쇄를 포함하는 항체 외에, 이의 유도체, 변이체, 단편, 및 뮤테인을 포함한다. 또한, 달리 분명하게 배제되지 않는 한, 항체는 단클론성 항체, 이중특이성 항체, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 합성 항체(본원에서 종종 "항체 모사체"로 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체(본원에서 종종 "항체 접합체"로 지칭됨), 및 이의 단편을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, 이 용어는 또한 펩티바디(peptibody)를 포함한다.
용어 "대상체"는 고양이, 개, 소, 말, 돼지, 양, 및 염소와 같은 포유동물을 포함한 비-인간 동물, 및 인간을 지칭한다. 용어 대상체는 또한 본원에 기재된 질병에 대한 치료를 필요로 하는 환자를 지칭한다.
"선택적인" 또는 "선택적으로"는 후속적으로 기재되는 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있고, 그 기재가 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 그렇지 않은 경우를 포함한다는 것을 의미한다.
용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 열거된 요소를 포함하나, 다른 요소는 제외하지 않음을 의미하는 것으로 의도된다. "~로 본질적으로 이루어지는"은, 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용되는 경우, 조합에 대해 임의의 본질적인 유의성이 있는 다른 요소를 제외하는 것을 의미할 것이다. 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 이루어지는 조성물은 청구범위의 기본 및 신규 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 요소는 제외하지 않을 것이다. "~로 이루어지는"은 미량보다 많은 다른 성분 및 실질적인 방법 단계를 제외하는 것을 의미한다. 각각의 이러한 과도기적 용어에 의해 정의된 구현예는 개시의 범주 내에 있다.
본원에 사용된 용어 "세포독성" 및 "세포용해"는, 이펙터 세포, 예컨대, NK 세포의 활성을 기재하는 데 사용되는 경우, 동의어인 것으로 의도된다. 일반적으로, 세포독성 활성은 임의의 다양한 생물학적, 생화학적 또는 생물물리학적 메카니즘에 의한 표적 세포의 사멸과 관련된다. 세포용해는 보다 구체적으로 이펙터가 표적 세포의 형질막을 용해시키고, 그에 따라 이의 물리적 온전성을 파괴하는 활성을 지칭한다. 이는 표적 세포의 사멸을 일으킨다. 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, NK 세포의 세포독성 효과는 세포용해로 인한 것으로 여겨진다.
세포/세포 집단에 대한 용어 "사멸시키다"는 그 세포/세포 집단의 죽음에 이르게 할 임의의 유형의 조작을 포함하도록 지시된다.
용어 "시토카인" 또는 "시토카인들"은 면역계의 세포에 영향을 미치는 일반적인 부류의 생물학적 분자를 지칭한다. 예시적인 시토카인은 FLT3 리간드, 인터페론 및 인터류킨(IL), 특히 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
용어 "환자", "대상체", "개체" 등은 본원에서 상호교환 가능하게 사용되고, 본원에 기재된 방법에 적용 가능한 임의의 동물, 또는 시험관내이든지 또는 계내이든지 이의 세포를 지칭한다. 특정 비-제한적 구현예에서, 환자, 대상체, 또는 개체는 인간이다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는 대상체, 예컨대, 인간에서, 본원에 기재된 질병 또는 장애의 치료를 포함하고, (i) 질병 또는 장애를 억제, 즉 이의 진행을 정지시키는 것; (ii) 질병 또는 장애를 경감, 즉 장애의 퇴행을 유발하는 것; (iii) 장애의 진행을 저속화시키는 것; 및/또는 (iv) 질병 또는 장애 중 하나 이상의 증상의 진행을 억제, 경감 또는 저속화시키는 것을 포함한다. 대상체에 대한 단클론성 항체 또는 자연 살해 세포의 "투여하는" 또는 "투여"라는 용어는 의도된 기능을 수행하기 위해 항체 또는 세포를 임의의 경로로 도입 또는 전달하는 것을 포함한다. 투여는 세포 또는 단클론성 항체의 전달에 적합한 임의의 경로에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 전달 경로는 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하 전달을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92™세포는, 예를 들어, 종양 내로의 주사에 의해 종양에 직접 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재되는 변형된 NK-92™세포는 비경구로, 예를 들어, 주사, 주입 또는 이식(피하, 정맥내, 근육내, 수포내 또는 복강내)에 의해 투여된다.
용어 "발현"은 유전자 산물의 생산을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "세포독성"은 이펙터 세포, 예컨대, NK 세포의 활성을 기재하는 데 사용되는 경우, 임의의 다양한 생물학적, 생화학적, 또는 생물물리학적 메카니즘에 의한 표적 세포의 사멸을 지칭한다.
용어 "감소시키다", "저하된", "저하", 및 "감소시키다"는 모두 본원에서, 참조 수준과 비교하여 적어도 10%만큼의 감소, 예를 들어 참조 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%만큼 또는 최대 100% 및 그를 포함하는 감소(즉, 참조 샘플과 비교하여 부재하는 수준), 또는 10% 내지 100% 사이의 임의의 감소를 지칭하기 위해 사용된다.
용어 "암"은 백혈병, 암종 및 육종을 포함한, 포유동물에서 발견되는 모든 유형의 암, 신생물, 또는 악성 종양을 지칭한다. 예시적인 암은 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 두경부암, 간암, 신장암, 폐암, 비소세포 폐암, 흑색종, 중피종, 난소암, 육종, 위암, 자궁암 및 수모세포종을 포함한다. 추가적인 예는 호지킨병, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 난소암, 횡문근육종, 원발성 혈소판증가증, 원발성 마크로글로불린혈증, 원발성 뇌 종양, 암, 악성 췌장 인슐린종, 악성 카르시노이드, 방광암, 전암성 피부 병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경모세포종, 식도암, 비뇨생식관암, 악성 고칼슘혈증, 자궁내막암, 부신 피질암, 내분비 및 외분비 췌장의 신생물, 및 전립선암을 포함한다.
용어 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 치료되지 않은 환자에 비해 질병의 증상을 경감시키는 데 필요한 양을 지칭한다. 질병의 치료적 처치를 위해 본 개시를 실시하는 데 사용되는 활성 화합물(들)의 유효량은 투여 방식, 대상체의 연령, 체중, 및 전반적인 건강에 따라 다르다. 궁극적으로, 주치의 또는 수의사가 적절한 양 및 투여 방식을 결정할 것이다. 이러한 양은 "유효"량으로 지칭된다.
용어 "종양 미세환경"은 주변 혈관, 면역 세포, 섬유아세포, 골수-유래 염증 세포, 신호전달 분자 및 세포외 기질을 포함하여 종양이 존재하는 세포 환경을 지칭한다. 종양 미세환경에서 예시적인 유형의 세포는 골수 유래 억제 세포(MDSC) 및 종양 관련 대식세포(TAM)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
용어 "면역 세포"는 항원의 특이적 인식에 관여하는 조혈 기원의 세포를 지칭한다. 면역 세포는 항원 제시 세포(APC), 예컨대, 수지상 세포 또는 대식세포, B 세포, T 세포, 자연 살해 세포, 골수 유래 억제 세포(MDSC), 골수 세포, 예컨대, 단핵구, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 호염기구, 및 과립구를 포함한다.
표제 또는 부표제는 독자의 편의를 위해 본 명세서에 사용될 수 있으며, 이는 본 개시의 범주에 영향을 미치도록 의도된 것은 아니다. 추가적으로, 본 명세서에 사용된 일부 용어는 하기에 보다 구체적으로 정의되어 있다.
MDSCS
골수 유래 억제 세포(MDSC)는 종양 미세환경에서 주요 억제 세포 중 하나이다. 종양의 미세환경은 NK 세포와 같은 면역 활성 세포가 종양 세포와 상호작용하고, 이들을 공격하고, 사멸시키는 것을 막는다. 이들 부정적인 마비 효과는 종양 미세환경에 존재하는 억제 세포의 대사물 및 분비물에 의해 매개될 수 있다.
MDSC는 암 및 기타 병리학적 상태, 예컨대, 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome: MDS)에서 면역 반응의 조절자이다(예를 들어, 문헌[Bronte et al., Nature Communications, 6 Jul 2016, 7:12150, DOI: 10.1038/ncomms12150; Eksioglu et al., "Novel Therapeutic Approach to Improve Hematopoiesis in low risk MDS by Targeting myeloid-derived suppressor cells with The Fc-engineered CD33 Antibody BI 836858," Leukemia. 2017 October ; 31(10): 2172-2180. doi:10.1038/leu.2017.21] 참조). 골수-유래 억제 세포는 여러 분화 단계에서 초기 골수 전구체, 미성숙 과립구, 대식세포 및 수지상 세포와 같은 골수 계통으로부터의 면역 세포의 이질성 그룹이다. 골수-유래 억제 세포는 조혈 변화의 결과로 병리학적 상황, 예컨대, 만성 감염 및 암에서 강하게 증대된다(예를 들어, 문헌[Eksioglu et al., "Novel Therapeutic Approach to Improve Hematopoiesis in low risk MDS by Targeting myeloid-derived suppressor cells with The Fc-engineered CD33 Antibody BI 836858," Leukemia. 2017 October; 31(10): 2172-2180. doi:10.1038/leu.2017.21] 참조).
골수 유래 억제 세포는 이들이 면역자극 성질보다는 강한 면역억제 활성을 갖는다는 점에서 다른 골수 세포 유형과 구별된다. 다른 골수 세포와 마찬가지로, 골수-유래 억제 세포는 T 세포, 수지상 세포, 대식세포 및 자연 살해 세포를 포함한 다른 면역 세포 유형과 상호 작용하여 이들의 기능을 조절한다. 골수 유래 억제 세포는 자연 살해(NK) 세포와 NKT 세포의 세포독성 활성과 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의해 매개되는 적응성 면역 반응 둘 모두를 억제할 수 있다. 이들의 작용 기전이 잘 이해되지는 않지만, 임상적 및 실험적 증거에 의해 골수-유래 억제 세포의 높은 침윤이 있는 암 조직은 불량한 환자 예후 및 치료 내성과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다.
말초 순환에서 MDSC의 축적은 질병의 정도와 관련되고, 병기와 상관 관계가 있었다. MDSC는 주로 항종양 면역을 억제함으로써 종양 성장을 촉진하는 데 연루되었다. 또한, MDSC가 혈관신생 및 전이 확산에 또한 관여한다는 강력한 증거가 있다.
MDSC의 두 개의 주요 서브세트가 암 환자에서 확인되었다: CD14의 발현으로 특징화되는 단핵구 서브세트, 및 CD15의 발현으로 특징화되는 과립구 서브세트. MDSC의 두 서브세트 모두는 반응성 산소종 및 아르기나제의 생산을 포함하여 다양한 기전을 통해 숙주 면역을 활발히 억제한다. 인간에서와 마찬가지로, 단핵구 및 과립구 MDSC의 축적은 종양 보유 마우스의 골수, 비장, 말초 순환, 및 종양에서 주지되었다. 마우스에서 MDSC의 성공적인 표적화는 면역 반응 개선, 종양 성장 지연, 생존 개선, 및 백신 요법의 효능 증가와 관련된다. 종양에서, 단핵구 유래 MDSC는 종양 관련 대식세포(TAM)로 급속히 분화된다.
종양 관련 대식세포
종양은 흔히 대식세포에 풍부한 반응성 기질의 일부로서 면역 침윤과 관련이 있다. 전형적으로, 대식세포는 종양 성장에 반대 효과를 갖는 M1 및 M2 대식세포로 분류된다: M1 대식세포는 종양 세포 성장을 억제하는 반면, M2 대식세포는 종양 발달을 촉진한다. 종양 세포는 케모카인과 분극화 시토카인을 통해 대식세포를 M2-유사 표현형으로 동조시켜 파괴로부터 이들의 회피를 도움으로써 이들의 발달을 촉진한다. 이들 M2 대식세포는 흔히 종양-관련 대식세포(TAM)로 지칭된다. TAM은 종양 미세환경에 존재하고, 혈관신생 및 기질 분해를 촉진함으로써 종양 성장을 조장하는 데 중요한 역할을 한다. 결과적으로, 많은 수의 TAM을 갖는 다수 종양이 증가된 종양 성장률, 국소 증식 및 원격 전이를 갖는다.
TAM은 CD68뿐만 아니라 다른 마커를 발현하고, 예를 들어, 일부 TAM은 다음 마커 CD206, CD204, 또는 CD163 중 하나 이상을 발현한다.
NK-92™세포
NK-92™은 비호지킨 림프종을 앓고 있는 대상체의 혈액에서 발견된 후 시험관내에서 불멸화된 세포용해성 암 세포주이다. NK-92™세포는 NK 세포로부터 유래되지만, 정상 NK 세포에 의해 나타나는 주요한 억제성 수용체가 결여되는 반면, 대다수의 활성화 수용체를 보유한다. 그러나, NK-92™세포는 정상 세포를 공격하지도 않고, 이들은 인간에서 허용 가능하지 않은 면역 거부 반응을 유발하지도 않는다. NK-92™세포주의 특징화는 제WO 1998/049268호 및 미국 특허 출원 공개 제2002-0068044호에 개시되어 있다. NK-92™세포는 또한 특정 암의 치료에 있어서 잠재적인 치료제로서 평가되었다.
벡터
본원에 기재된 변형된 세포를 생산하기 위해 세포를 형질감염시키기 위한 벡터가 본원에 기재된다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 벡터는 일과성 발현 벡터이다. 이러한 벡터를 사용하여 도입된 외인성 전이유전자는 세포의 핵 게놈에 통합되지 않으므로; 벡터 복제의 부재 하에서, 외래 전이유전자는 시간 경과에 따라 저하되거나 희석될 것이다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 벡터는 세포의 안정한 형질감염을 가능하게 한다. 일 구현예에서, 벡터는 세포의 게놈으로 전이유전자(들)의 혼입을 가능하게 한다. 일 구현예에서, 벡터는 양성 선택 마커를 갖는다. 양성 선택 마커는 유전자를 발현하지 않는 세포를 사멸시킬 조건 하에 세포가 성장되게 하는 임의의 유전자를 포함한다. 비-제한적 예는 항생제 내성, 예를 들어, 제네티신(Tn5로부터의 Neo 유전자)을 포함한다.
일 구현예에서, 벡터는 플라스미드 벡터이다. 일 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 당업자에게 이해될 바와 같이, 임의의 적합한 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 세포는 관심 대상의 단백질을 인코딩하는 mRNA로 형질감염된다(예를 들어, CAR). mRNA의 형질감염은 단백질의 일과성 발현을 야기한다. 일 구현예에서, mRNA의 NK-92™세포로의 형질감염은 세포의 투여 직전에 수행된다. 일 구현예에서, 세포의 투여 "직전"은 투여하기 약 15분 내지 약 48시간 전을 지칭한다. 바람직하게는, mRNA 형질감염은 투여 약 5시간 내지 약 24시간 전에 수행된다.
PD-L1
예정사-리간드(Programmed death-ligand: PD-L1)는 PD-1에 결합하여 T 세포 활성화를 억제하는 억제 리간드이다. PD-L1은 종양 세포에서 구성적으로 발현되고 유도된다. PD-L1은 또한 MDSC에서도 발현된다. PD-L1-발현 MDSC의 수는 종양 비보유 마우스와 비교할 때 종양-보유 마우스에서 유의하게 증가되었고, PD-L1 발현은 림프 기관에 비해 종양-침윤 MDSC에서 유의하게 더 높은 것으로 보고되었다. 문헌[Lu et al., J. Immunol., May 1, 2017, 198 (1 부록) 124.9]을 참조하라. PD-L1은 또한 종양-관련 대식세포(TAM)에서 발현되고, PD-L1의 TAM 발현은 이의 수용체를 결합한 후 T 세포 아폽토시스를 직접적으로 유도할 수 있다. 문헌[Kuang et al., J. Exp. Med. 2009; 206:1327-1337].
CARS
종양 세포를 동일한 조직으로부터 유래된 정상 세포와 구별하는 표현형 변화는, 정상 세포 표면 성분의 상실 또는 다른 것(즉, 상응하는 정상, 비-암성 조직에서는 검출 불가능한 항원)의 수득을 포함하여, 흔히 특정한 유전자 산물의 발현에서의 하나 이상의 변화와 연관된다. 신생물성 또는 종양 세포에서 발현되지만 정상 세포에서는 발현되지 않거나, 정상 세포에서 발견되는 수준보다 실질적으로 높은 수준으로 신생물성 세포에서 발현되는 항원은 "종양-특이적 항원" 또는 "종양-관련 항원"으로 칭해졌다. 종양-특이적 항원은 암 면역요법을 위한 표적으로서 사용되었다. 하나의 이러한 요법은, T 세포 및 NK 세포를 포함하는 면역 세포의 표면 상에 발현된 키메라 항원 수용체(CAR)를 이용하여, 암 세포에 대항하는 세포독성을 개선한다. CAR은 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인에 연결된 단일-쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. scFv는 표적 세포(예를 들어, 암 세포) 상의 항원을 인식하여 결합하고, 이펙터 세포 활성화를 촉발한다. 신호전달 도메인은 수용체에 의한 세포내 신호전달에 중요한 면역수용체 티로신-기반 활성화 도메인(ITAM)을 함유한다.
본 개시는 세포 표면 상에서 적어도 하나의 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 NK-92™세포를 제공한다. CAR은 특이적 항원이 인식되면 세포용해 반응을 촉발할 수 있는 세포외 항원 인식 부분(대개 특이적 항체의 가변 도메인으로부터 유래됨)을 세포내 신호전달 도메인(단일 또는 추가 공동-자극 요소와 함께)에 조합한다. 다중 유형의 CAR이 존재하는데, 이들 모두 적용에 사용될 수 있다. 1세대 CAR은 하나의 세포질 신호전달 도메인을 함유한다. 신호전달 도메인은, 예를 들어, 하나의 ITAM을 함유하는 Fc 엡실론 수용체 감마(Fcεγ또는 3개의 ITAM을 함유하는 CD3ζ로부터 유래될 수 있다. CD3ζCAR은 FcεγCAR보다 종양 박멸에 보다 효율적인 것으로 사료된다. 예를 들어, 문헌[Haynes, et al. 2001, J. Immunology 166:182-187; Cartellieri, et al. 2010, J. Biomed and Biotech, Vol. 2010, 논문 ID 956304]을 참조하라. 2세대 및 3세대 CAR은 다중 신호전달 도메인, 예를 들어, CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인 및 공동자극성 신호전달 도메인, 예컨대, CD28/CD134/CD137/ICOS 및 CD28/CD134을 단일 CAR에 조합하여 NK-92™세포의 활성화 및 증식을 촉진한다. 따라서, 일부 구현예에서, PD-L1 t-haNK 세포에 의해 발현된 PD-L1 CAR은 CD8으로부터의 힌지 영역, 및/또는 CD28의 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, PD-L1 CAR은 Fcεγ의 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, PD-L1 CAR은 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 힌지 영역, CD28의 막관통 도메인 및 Fcεγ또는 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인의 예는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 가출원 제62/674,936호에 개시되어 있다. 선행 간행물, 예컨대, 문헌[Haynes, et al. 2001, J. Immunology 166:182-187 및 Cartellieri, et al. 2010, J. Biomed and Biotech, Vol. 2010, 논문 ID 956304]에는 CD3ζCAR이 FcεγCAR보다 종양 박멸에 보다 효율적일 수 있다고 개시되어 있지만, 이러한 경우에, 본 발명자들은 놀랍게도 그리고 예기치 않게도 본원에 개시된 세포, 조성물, 및 방법에 대한 경우에는 그렇지 않다는 것을 발견하였다. 실제로, 본 발명자들은 단지 하나의 ITAM 도메인을 갖는 Fcεγ로부터의 세포내 도메인을 포함하는 1세대 CAR을 발현하는 NK-92 세포는 세 개의 ITAM 도메인을 갖는 CD3ζ신호전달 도메인으로의 CAR을 발현하는 NK-92 세포보다, 이러한 ITAM 도메인이 다른 신호전달 도메인(즉, 2세대 또는 3세대 CAR; 본원에서 데이터 미도시)과 조합된 경우에도, CAR에 의해 인식되는 항원을 발현하는 암 세포에 대항하여 동등하거나 더 높은 세포독성 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 예시적인 CAR은 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 특히, 이의 네이티브 맥락에서 IgE 수용체(Fcε는 디설파이드 결합을 통해 서로 커플링된 두 개의 감마 사슬을 포함하고, 호산구, 호염기구, 및 표피 랑게르한스 세포에서만 정상적으로 발현된다. 본 발명자들은 또한 Fcεγ로부터 세포내 도메인을 포함하는 CAR이 다른 CAR, 특히, CD3ζ신호전달 도메인을 포함하는 것보다 NK-92 세포의 표면 상에서 더 높은 수준으로 발현되었다는 예기치 못한 발견을 하였다.
선택적으로, CAR은 PD-L1에 대해 특이적이다. 일부 구현예에서, PD-L1은 인간 PD-L1이다. 일부 구현예에서, PD-L1 CAR은 SEQ ID NO: 10로 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PD-L1 CAR은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, PD-L1 CAR 폴리펩티드는 SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:10 내에서 CDR 서열 부분에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-에피토프 태그 펩티드 단클론성 또는 다클론성 항체를 사용함으로써 세포 표면 검출을 돕기 위해 에피토프 태그 펩티드, 예컨대, FLAG, myc, 폴리히스티딘 또는 V5가 폴리펩티드의 아미노 말단 도메인에 첨가될 수 있다.
예에서, 변이체 폴리펩티드는 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대, 올리고뉴클레오티드-매개 (부위-지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이유발을 사용하여 제조된다. 부위 지정 돌연변이유발(Carter, 1986; Zoller and Smith, 1987), 카세트 돌연변이유발, 제한 선택 돌연변이유발(Wells et al., 1985) 또는 다른 공지된 기술이 클로닝된 DNA에 대해 수행되어 CD16 변이체를 생산할 수 있다(Ausubel, 2002; Sambrook and Russell, 2001).
일부 구현예에서, PD-L1 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CAR의 기능을 변경하지 않으면서 CAR에 대하여 인코딩하는 아미노산 서열을 변경하도록 돌연변이된다. 예를 들어, "비-필수" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 유도하는 폴리뉴클레오티드 치환은 PD-L1 CAR의 scFv 부분을 인코딩하는 코돈-최적화 서열인 SEQ ID NO:9에서 이루어질 수 있다.
한 부류의 아미노산이 동일한 부류의 또 다른 아미노산으로 교체되는 SEQ ID NO:9에서의 보존적 치환은 치환이 폴리펩티드의 활성을 실질적으로 변경하지 않는 한 개시된 변이체의 범주 내에 속한다. 보존적 치환은 당업자에게 널리 공지되어 있다. (1) 폴리펩티드 골격의 구조, 예컨대, β시트 또는 α-나선 입체형태, (2) 전하, (3) 소수성, 또는 (4) 표적 부위의 측쇄의 부피에 영향을 미치는 비-보존적 치환은 폴리펩티드 기능 또는 면역학적 동일성을 변형시킬 수 있다. 비-보존적 치환은 이러한 부류들 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반한다. 치환은 보존적 치환 부위내로, 또는 보다 바람직하게는 비-보존 부위 내로 도입될 수 있다.
예에서, 변이체 폴리펩티드는 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대, 올리고뉴클레오티드-매개 (부위-지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이유발을 사용하여 생산된다. 부위 지정 돌연변이유발(Carter, 1986; Zoller and Smith, 1987), 카세트 돌연변이유발, 제한 선택 돌연변이유발(Wells et al., 1985) 또는 다른 공지된 기술이 클로닝된 DNA에 대해 수행되어 CD16 변이체를 생산할 수 있다(Ausubel, 2002; Sambrook and Russell, 2001).
선택적으로, PD-L1 t-haNK 세포는 암, 특히, PD-L1을 발현하는 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 암은 백혈병(급성 백혈병(예를 들어, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병(골수모구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성, 및 적백혈병 포함)) 및 만성 백혈병(예를 들어, 만성 골수구성(과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병) 포함), 진성 다혈구혈증, 림프종(예를 들어, 호지킨병 및 비호지킨병), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로불린혈증, 중쇄 질병, 육종 및 암종, 예컨대, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질성 암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담즙 관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아성 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 고형 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
FC 수용체
일부 구현예에서, NK-92™세포는 적어도 하나의 Fc 수용체를 발현하도록 변형되고, 이로써 적어도 하나의 Fc 수용체가 NK-92™세포의 세포 표면 상에 디스플레이된다. Fc 수용체는 항체의 Fc 부분에 결합한다. 여러 Fc 수용체는 공지되어 있고, 이의 바람직한 리간드, 친화도, 발현, 및 항체에 대한 결합 후 효과에 따라 상이하다.
[표 1]
예시적인 Fc 수용체
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
일부 구현예에서 NK-92™세포는 세포 표면 상에서 Fc 수용체 단백질을 발현하도록 변형된다.
일부 구현예에서, Fc 수용체는 CD16이다. 본 개시의 목적 상, CD16의 특정 아미노산 잔기는 SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:2에 대해 한 위치에서 상이한 SEQ ID NO:1을 참조하여 지정된다. 따라서, CD16 폴리펩티드의 "위치 158"에서 아미노산 잔기는 CD16 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:2가 최대로 정렬되는 경우에 SEQ ID NO:2(또는 SEQ ID NO:1)의 위치 158에 상응하는 아미노산 잔기이다. 일부 구현예에서, NK-92™세포는 성숙 형태의 단백질, 예를 들어, SEQ ID NO:1의 위치 158에 페닐알라닌을 갖는 인간 CD16을 발현하도록 변형된다. 전형적인 구현예에서, NK-92™세포는 성숙 형태의 단백질, 예를 들어, SEQ ID NO:2의 위치 158에 발린을 갖는 고친화도 형태의 인간 CD16을 발현하도록 변형된다. 성숙 단백질의 위치 158은 네이티브 신호 펩티드를 포함하는 CD16 서열의 위치 176에 상응한다. 일부 구현예에서, CD16 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4의 전구체(즉, 네이티브 신호 펩티드를 가짐) 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다. 따라서, 일 구현예에서, Fc 수용체는 Fcγ를 포함한다. 일부 구현예에서, NK-92™세포는 SEQ ID NO:1(위치 158에 페닐알라닌을 갖는 Fcγ또는 CD16(F-158))과 적어도 90% 서열 동일성; 또는 SEQ ID NO:2(위치 158에 발린을 갖는 CD16(F158V), 보다 높은 친화도 형태)에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 Fc 수용체를 발현하도록 유전자 변형된다.
일부 구현예에서, CD16 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전장 CD16의 위치 176(성숙 CD16 단백질의 위치 158에 상응함)에 페닐알라닌을 갖는, 신호 펩티드를 포함하여 전장 자연 발생 CD16을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70% 폴리뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, CD16 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 위치 176(성숙 단백질의 위치 158에 상응함)에 발린을 갖는, 신호 펩티드를 포함하여 전장 자연 발생 CD16을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70% 폴리뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, CD16을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:5에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖고, 신호 펩티드를 포함하여 전장 CD16 폴리펩티드의 위치 176을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 위치에 발린을 인코딩하는 코돈을 포함한다. 일부 구현예에서, CD16을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전장 CD16의 위치 176에 발린을 인코딩하는 코돈과 함께 SEQ ID NO:5를 포함한다.
일부 구현예에서, CD16 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2에 대해 적어도 70% 80%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, SEQ ID NO:2를 참조로 결정되는 위치 158에서 발린을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2를 인코딩한다. 일부 구현예에서, CD16 폴리뉴클레오티드는 신호 서열이 존재하거나 또는 존재하지 않는 CD16의 세포외 도메인, 또는 전장 CD16의 임의의 다른 단편, 또는 또 다른 단백질의 아미노산 서열에 융합된 CD16의 적어도 부분적인 서열을 포괄하는 키메라 수용체를 인코딩한다. 다른 구현예에서, 항-에피토프 태그 펩티드 단클론성 또는 다클론성 항체를 사용함으로써 세포 표면 검출을 돕기 위해 에피토프 태그 펩티드, 예컨대, FLAG, myc, 폴리히스티딘 또는 V5가 성숙 폴리펩티드의 아미노 말단 도메인에 첨가될 수 있다.
일부 구현예에서, 상동 CD16 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 150개 내지 약 700개, 약 750개, 또는 약 800개의 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 700개 내지 800개 초과의 폴리뉴클레오티드를 갖는 CD16 변이체도 본 개시의 범주 내에 포함된다.
상동 폴리뉴클레오티드 서열은 CD16의 변이체를 코딩하는 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 것들을 포함한다. 상동 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 SEQ ID. NO: 1과 관련된 자연 발생 대립유전자 변이를 포함한다. NK-92™세포를 SEQ ID. NO: 1 또는 SEQ ID. NO: 2에 제시된 아미노산 서열, 이의 자연 발생 변이체, 또는 SEQ ID. NO: 1 또는 SEQ ID. NO: 2에 대해 적어도 70% 동일하거나 또는 적어도 80%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키는 것은 본 개시의 범주 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 상동 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에서 보존적 아미노산 치환을 인코딩한다. 일부 구현예에서, NK-92™세포는 네이티브 폴리뉴클레오티드 서열과는 상이하지만 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는 축중성 상동 CD16 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 형질감염된다.
다른 예에서, CD16 아미노산 서열을 변화시키는 다형성을 갖는 cDNA 서열은, 예를 들어 CD16 유전자에서 유전적 다형성을 나타내는 개체 간 대립유전자 변이와 같이 NK-92™세포를 변형시키는 데 사용된다. 다른 예에서, SEQ ID NO:1의 서열과 상이한 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 다른 종으로부터의 CD16 유전자가 NK-92™세포를 변형시키는 데 사용된다.
변이체 폴리펩티드는 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대, 올리고뉴클레오티드-매개 (부위-지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이유발을 사용하여 제조될 수 있다. 부위 지정 돌연변이유발(Carter, 1986; Zoller and Smith, 1987), 카세트 돌연변이유발, 제한 선택 돌연변이유발(Wells et al., 1985) 또는 다른 공지된 기술이 클로닝된 DNA에 대해 수행되어 CD16 변이체를 생산할 수 있다(Ausubel, 2002; Sambrook and Russell, 2001).
일부 구현예에서, CD16을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CD16의 기능을 변경하지 않으면서 CD16에 대하여 인코딩하는 아미노산 서열을 변경하도록 돌연변이된다. 예를 들어, "비-필수" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 유도하는 폴리뉴클레오티드 치환은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에서 이루어질 수 있다.
한 부류의 아미노산이 동일한 부류의 또 다른 아미노산으로 교체되는, SEQ ID. NO:1 또는 SEQ ID NO:2 내의 보존적 치환은 치환이 폴리펩티드의 활성을 실질적으로 변경하지 않는 한, 개시된 CD16 변이체의 범주 내에 속한다. 보존적 치환은 당업자에게 널리 공지되어 있다. (1) 폴리펩티드 골격의 구조, 예컨대, β시트 또는 α-나선 입체형태, (2) 전하, (3) 소수성, 또는 (4) 표적 부위의 측쇄의 부피에 영향을 미치는 비-보존적 치환은 CD16 폴리펩티드 기능 또는 면역학적 동일성을 변형시킬 수 있다. 비-보존적 치환은 이러한 부류들 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반한다. 치환은 보존적 치환 부위내로, 또는 보다 바람직하게는 비-보존 부위 내로 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, CD16 폴리펩티드 변이체는 길이가 적어도 200개의 아미노산이고 SEQ ID. NO:1 또는 SEQ ID. NO:2에 대해 적어도 70% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, CD16 폴리펩티드 변이체는 길이가 적어도 225개의 아미노산이고 SEQ ID. NO:1 또는 SEQ ID. NO:2에 대해 적어도 70% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, CD16 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID. NO:2를 참조하여 결정된 바와 같이 위치 158에 발린을 갖는다.
일부 구현예에서, CD16 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 CD16 융합 단백질을 인코딩할 수 있다. CD16 융합 폴리펩티드는 비-CD16 폴리펩티드와 융합된 CD16의 임의의 부분 또는 전체 CD16을 포함한다. 융합 폴리펩티드는 재조합 방법을 사용하여 편리하게 생성된다. 예를 들어, CD16 폴리펩티드, 예컨대, SEQ ID. NO:1 또는 SEQ ID. NO:2를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 비-CD16 인코딩 폴리뉴클레오티드(예컨대, 이종 단백질의 신호 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열)와 인-프레임으로 융합된다. 일부 구현예에서, 이종 폴리펩티드 서열이 CD16의 C-말단에 융합되거나 또는 CD16의 내부에 위치하는 융합 폴리펩티드가 생성될 수 있다. 전형적으로, CD16 세포질 도메인의 최대 약 30%가 교체될 수 있다. 이러한 변형은 발현을 증진시키거나 또는 세포독성(예를 들어, ADCC 반응성)을 증진시킬 수 있다. 다른 예에서, 키메라 단백질, 예컨대, Ig-a, Ig-B, CD3-e, CD3-d, DAP-12 및 DAP-10을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 다른 림프구 활성화 수용체로부터의 도메인은 CD16 세포질 도메인의 일부로 교체된다.
융합 유전자는 자동 DNA 합성기 및 후속적으로 어닐링되고 재증폭되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있는 2개의 연속적인 유전자 단편 사이의 상보적 오버행을 일으키는 앵커 프라이머를 사용하는 PCR 증폭을 포함하는 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다(Ausubel, 2002). 융합 모이어티에 CD16을 인-프레임으로 서브클로닝하는 것을 용이하게 하는 많은 벡터가 상업적으로 입수 가능하다.
시토카인
NK-92 세포의 세포독성은 시토카인(예를 들어, 인터류킨-2 (IL-2))의 존재에 의존적이다. 상업적 규모의 배양에서 NK-92 세포를 유지하고 증대시키는 데 필요한, 외인성으로 첨가된 IL-2를 사용하는 비용은 상당하다. NK92 세포의 활성화를 계속하기에 충분한 양으로 IL-2를 인간 대상체에게 투여하는 것은 유해 부작용을 일으킬 것이다.
일 구현예에서, NK-92™세포는 적어도 하나의 시토카인을 발현하도록 변형된다. 특히, 적어도 하나의 시토카인은 IL-2(SEQ ID NO:6), IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 또는 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, 시토카인은 IL-2 또는 이의 변이체이다. 특정 구현예에서, IL-2는 내형질 세망에 표적화되는 변이체이다. 일 구현예에서, 시토카인은 IL-15는 또는 이의 변이체이다. 특정 구현예에서, IL-15는 내형질 세망에 표적화되는 변이체이다.
일 구현예에서, IL-2는 클로닝되고, IL-2를 내형질 세망(erIL-2)(SEQ ID NO: 7)으로 지시하는 신호 서열과 함께 발현된다. 이는 IL-2를 세포외로 방출하지는 않으면서 자가분비 활성화에 충분한 수준의 IL-2의 발현을 가능하게 한다. 예를 들어, 문헌[Konstantinidis et al "Targeting IL-2 to the endoplasmic reticulum confines autocrine growth stimulation to NK-92™cells" Exp Hematol. 2005 Feb;33(2):159-64]을 참조하라. FcR-발현 NK-92 세포의 지속적인 활성화는, 예를 들어, 자살 유전자의 존재에 의해 방지될 수 있다.
자살 유전자
용어 "자살 유전자"는 자살 유전자를 발현하는 세포의 음성 선택을 가능하게 하는 유전자를 지칭한다. 자살 유전자는 유전자를 발현하는 세포가 선택적 작용제의 도입에 의해 사멸될 수 있게 하는 안전 시스템으로 사용된다. 이는 재조합 유전자가 비제어된 세포 성장을 유도하는 돌연변이를 일으키거나, 세포 자체가 그러한 성장이 가능한 경우에 바람직하다. 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(thymidine kinase: TK) 유전자, 시토신 데아미나제 유전자, 수두-조스터 바이러스 티미딘 키나제 유전자, 니트로리덕타제 유전자, 에스케리키아 콜라이 gpt 유전자 및 E. 콜라이 Deo 유전자를 포함하는 다수의 자살 유전자 시스템이 확인되었다. 전형적으로, 자살 유전자는 세포에 질병-효과를 주지 않으나, 특정 화합물의 존재에서 세포를 사멸시킬 단백질에 대하여 인코딩한다. 따라서, 자살 유전자는 전형적으로 시스템의 일부이다.
일 구현예에서, 자살 유전자는 NK-92™세포에서 활성이다. 일 구현예에서, 자살 유전자는 티미딘 키나제(TK) 유전자이다. TK 유전자는 야생형 또는 돌연변이체 TK 유전자(예를 들어, tk30, tk75, sr39tk)일 수 있다. TK 단백질을 발현하는 세포는 간시클로비르를 사용하여 사멸될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 자살 유전자는 5-플루오로시토신의 존재에서 세포에 독성인 시토신 데아미나제이다. 문헌[Garcia-Sanchez et al. "Cytosine deaminase adenoviral vector and 5-fluorocytosine selectively reduce breast cancer cells 1 million-fold when they contaminate hematopoietic cells: a potential purging method for autologous transplantation." Blood. 1998 Jul 15;92(2):672-82].
또 다른 구현예에서, 자살 유전자는 이포스파미드, 또는 시클로포스파미드의 존재에서 독성인 시토크롬 P450이다. 예를 들어, 문헌[Touati et al. "A suicide gene therapy combining the improvement of cyclophosphamide tumor cytotoxicity and the development of an anti-tumor immune response." Curr Gene Ther. 2014;14(3):236-46]을 참조하라.
또 다른 구현예에서, 자살 유전자는 iCas9이다. 문헌[Di Stasi, (2011) "Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy." N Engl J Med 365: 1673-1683]. 또한, 문헌[Morgan, "Live and Let Die: A New Suicide Gene Therapy Moves to the Clinic" Molecular Therapy (2012); 20: 11-13]을 참조하라. iCas9는 소분자 AP1903의 존재에서 아폽토시스를 유도한다. AP1903은, 임상 연구에서 내약성 우수한 것으로 밝혀진 생물학적 불활성 소분자로, 입양 세포 요법의 맥락에서 사용되어 왔다.
코돈 최적화
일부 구현예에서, aNK 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 작제물의 서열은 인간계에서 PD-L1 CAR, CD16, 및/또는 erIL-2의 발현 효율을 최대화하도록 코돈-최적화된다. 코돈 최적화는 전형적으로 네이티브 서열에서 적어도 하나, 하나보다 많은, 또는 상당수의 코돈을 발현 시스템의 유전자에서 더욱 빈번히 또는 가장 빈번히 사용되는 코돈으로 교체하여 핵산 서열을 변형시킴으로써 수행된다. 코돈 최적화는 비-최적화된 서열을 사용하여 생산된 전사물과 비교할 때 요망되는 성질, 예컨대, 더 긴 반감기를 갖는 재조합 RNA 전사물을 생산하기 위해 또는 번역률을 위해 사용될 수 있다. 코돈 최적화를 위한 방법, 예를 들어, Thermo Fisher Scientific(월섬, MA)으로부터의 GeneArt™http://genomes.urv.es/OPTIMIZER에서 무료로 접근 가능한 최적화기(Optimizer), 및 DNA 2.0으로부터의 GeneGPS® 발현 최적화 기법(뉴어크, 캘리포니아)이 용이하게 이용 가능하다. 특정 구현예에서, PD-L1 CAR에 대한 코딩 서열은 코돈-최적화되고, SEQ ID NO:10의 단백질 서열을 인코딩하는 SEQ ID NO: 9에 기재된 바와 같은 서열(scFv 부분)을 포함한다. 일부 구현예에서, 코돈-최적화된 PD-L1 CAR 코딩 서열은 SEQ ID NO:15의 단백질 서열을 인코딩하는 SEQ ID NO: 14에 기재된 서열이다.
전이유전자 발현
전이유전자는 당업자에게 공지된 임의의 메카니즘에 의해 발현 벡터 내로 조작될 수 있다. 다중 전이유전자가 세포 내로 삽입될 경우, 전이유전자는 동일한 발현 벡터 또는 상이한 발현 벡터 내로 조작될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 발현될 전이유전자 단백질을 인코딩하는 mRNA로 형질감염된다.
전이유전자 및 mRNA는, 비-제한적 예로서, 감염, 전기천공, 리포펙션, 뉴클레오펙션, 또는 "유전자-총"을 포함하여, 당해 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 형질감염 방법을 이용하여 NK-92™세포로 도입될 수 있다.
PD-L1 CAR을 발현하는 NK-92™세포
본 개시는 PD-L1 CAR 및 FcR을 발현하는 변형된 NK-92™세포를 제공한다. 선택적으로, 변형된 NK-92™세포는 추가로 IL-2를 발현한다.
일부 구현예에서, 변형된 NK-92™세포는 다중-시스트론성 전이유전자를 포함하고, 다중-시스트론성 전이유전자는 키메라 항원 수용체 및 Fc 수용체, 및 선택적으로 IL-2를 인코딩한다.
일부 구현예에서, FcR은 CD16이다. 일부 구현예에서, CD16은 SEQ ID NO:2를 포함하거나 이로 이루어진 고친화성 CD16이다. 일부 구현예에서 IL-2는 SEQ ID NO: 7을 포함하거나 이로 이루어진 erIL-2이다.
일부 구현예에서, CAR-코딩 서열 및 CD16-코딩 서열은 P2A 서열에 의해 분리된다(SEQ ID NO: 8 ggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacct). 이러한 구성은 단일 mRNA로부터 CAR 및 CD16의 등몰 발현을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, CD16 코딩 서열 및 erIL-2-코딩 서열은 내부 번역 개시를 가능하게 하는 내부 리보솜 도입 서열(IRES)에 의해 분리된다.
일부 구현예에서, 변형된 NK-92™세포는 단일 mRNA로부터 CAR, 고친화성 CD16, 및 erIL-2를 발현하는 삼중시스트론성 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 삼중시스트론성 작제물은 SEQ ID NO: 11에 기재된 바와 같은 서열을 포함한다. CAR의 통합은 이펙터 세포가 CAR에 의해 인식되는 표적을 발현하는 표적 세포를 특이적으로 결속하고 사멸시키는 것을 가능하게 하고; CD16의 통합은 치료적 단클론성 항체와 조합될 때 ADCC를 가능하게 하고; erIL2는 외인성 IL-2의 부재에서 세포 증대를 가능하게 하고, 전이유전자 발현을 위한 선택적 압력을 유지한다. 한 가지 예시적인 삼중시스트론성 작제물은 도 2에 나타나 있으며, PD-L1 CAR 및 CD16 융합 단백질에 대한 예시적인 단백질 서열은 SEQ ID NO: 12에 나타나 있다.
CAR 및 CD16(예를 들어, 고친화성 CD16), 및 erIL-2를 발현하는 변형된 NK-92™세포를 생산하기 위해, 다중-시스트론성 플라스미드가, 예를 들어, 전기천공에 의해 aNK™세포에 도입된다. 형질전환된 NK-92™세포는 IL-2가 없는 배지에서 성장되며, 개별 클론이 제한 희석 클로닝에 의해 형질전환된 NK-92™세포로부터 선택되고, 예를 들어, 고수준의 CAR 및 CD16 발현, 세포독성, ADCC, 성장률, 및/또는 IL-2 분비를 포함하는 기준을 기초로 특징화될 수 있다. 적합한 클론은 또한 aNK™세포의 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 표면 마커, 예를 들어, CD3, CD16, CD54, CD56, NKG2D, 및/또는 NKp30을 발현할 수 있다. 선택적으로, 전장 게놈 시퀀싱(whole genome sequencing: WGS)은 전이유전자 통합 부위를 결정하기 위해 수행된다. 이러한 기준들 중 하나 이상을 충족시키는 클론이 추가 개발을 위해 선택되고, 클리닉에서 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
발현
IL-2의 발현은 IL-2 비함유 조건에서 변형된 NK-92™세포의 능력에 의해 확인될 수 있다. CAR 및 CD16의 발현은 유세포 분석에 의해 측정될 수 있다. CAR, CD16, 및 IL-2(예를 들어, erIL-2, SEQ ID NO: 13)의 코딩 서열을 포함하는 삼중시스트론성 작제물로 형질전환된 NK-92™세포의 경우, 전형적으로 IL-2-비함유 조건을 성장시킬 수 있는 형질전환된 세포 중 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%는 또한 높은 발현 수준의 CAR과 CD16 둘 모두를 나타낸다.
선택적으로, 형질전환된 NK-92™세포의 IL-2 분비 수준은 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여, 예를 들어, ELISA에 의해 다양한 시점에 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 배양 상청액에서의 IL-2 수준은 세포 배양 배지에 방출된 IL-2의 수준을 결정하기 위해 측정된다. 일부 구현예에서, 세포 펠렛에서 IL-2 수준은 IL-2의 총 세포내 수준을 평가하기 위해 측정된다. 일부 구현예에서, 상청액에서의 IL-2 양과 세포 펠렛에서의 IL-2 양 둘 모두는 형질전환된 NK-92™세포에 의해 생산된 IL-2의 총량을 결정하기 위해 측정된다.
선택적으로, 형질전환된 NK-92™세포의 다른 표면 마커는 유세포 분석에 의해 측정될 수 있다. 이들 마커는 CD54, CD56, NKG2D, NKp30, 및 CD3를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 적합한 클론은 동일한 성장 조건 하에 aNK™세포에 대해 이러한 마커와 실질적으로 유사한 발현 수준을 보인 것들이다.
세포독성
선택적으로, 삼중시스트론성 플라스미드로 형질전환된 NK-92™세포의 세포독성은 또한 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 시험될 수 있다. NK-92™세포의 세포독성은 이들의 직접 세포독성 또는 ADCC 활성에 의해 반영될 수 있다. 생산된 NK-92™세포의 직접 세포독성, 비정상 세포, 예컨대, 종양 세포를 표적화하고 사멸시키는 능력은 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어, Klingemann 등의 문헌[Cancer Immunol. Immunother. 33:395-397 (1991)]에 기재된 절차를 이용하여 51Cr 방출 검정(Gong 등의 문헌[Leukemia, Apr; 8(4): 652-8 (1994)])에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 t-haNK 세포의 표면 상에 발현된 CAR에 의해 인식될 수 있는 항원을 발현한다. 간략히, 51Cr-표지된 표적 세포는 NK-92™세포와 혼합되고, 용해된다. 특이적 세포독성의 백분율은 방출된 51Cr의 양을 기초로 계산될 수 있다. 특허 공개 제US20020068044호를 참조하라.
선택적으로, 삼중시스트론성 플라스미드로 형질전환된 NK-92®세포의 세포독성은 세포독성 검정에서 유동-기반을 이용하여 평가될 수 있다. 이펙터 세포(NK-92® 세포) 및 형광단-표지된 표적 세포, 예를 들어, 종양 세포는 상이한 이펙터 대 표적 비로 혼합된다. 프로피듐 아이오다이드(PI)가 세포에 첨가될 수 있고, 샘플은 유세포 분석기로 분석될 수 있다. 바람직하게는, 표적 세포를 표지하는 데 사용되는 형광단은 유세포 분석기에서의 PI와 구별될 수 있다. 일부 구현예에서, 형광단은 CFSE이다. 일부 구현예에서, 형광단은 PKHGL67이다. 세포독성은 형광단-양성 표적 집단 내 PI-양성 세포의 %로 결정될 수 있다.
대안적으로, 생산된 NK-92™세포의 직접 세포독성은 또한 칼세인 방출 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, NK-92™세포(검정에서 이펙터로 지칭됨)는 칼세인 담지 표적 세포(검정에서 표적으로 지칭됨)와 특정 비율로 혼합될 수 있다. 소정의 기간 동안 인큐베이션 후, 표적 세포로부터 방출된 칼세인은, 예를 들어, 형광 플레이트 리더에 의해 평가될 수 있다. 검정에서 사용되는 이펙터 및 표적의 비는 다를 수 있고, 선택적으로 이펙터:표적 비는 20:1, 15:1, 10:1, 8:1, 또는 5:1일 수 있고; 바람직하게는 이펙터:표적 비는 10:1이다. 표적 세포는 NK-92™세포(t-haNK 세포) 상에서 CAR에 의해 인식될 수 있는 항원 분자를 발현하는 임의의 세포일 수 있다. 예를 들어, MDA MB 231 세포는 PD-L1 CAR 및 PD-L1 t-haNK 세포에 대한 표적 세포에 의해 인식될 수 있다. NK-92™세포의 세포독성의 값은 사용되는 표적 세포의 유형뿐만 아니라 이펙터:표적 비에 따라 다를 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 방법을 이용하여 생산된 NK-92™세포는 60% 내지 100%, 예를 들어, 70% 내지 100% 또는 80% 내지 100%의 세포독성을 가질 수 있다. 일부 경우에, NK-92™세포는 1:10의 이펙터:표적 비를 이용할 때 칼세인 방출 검정에 의해 80% 내지 100%, 예를 들어, 82% 내지 100%, 85% 내지 100%, 87% 내지 100%, 88% 내지 100%, 또는 89% 내지 100%의 세포독성을 가질 수 있다.
선택적으로, 평가되는 NK-92™세포, 예를 들어, t-haNK 세포의 세포독성은 항체 의존적 세포독성(ADCC)이다. NK-92™세포의 ADCC 활성을 측정하기 위한 방법은 표적 세포를 인식할 수 있는 항체가 또한 첨가된다는 점을 제외하고 상술된 바와 같은 직접 세포독성을 측정하는 방법과 유사하다. NK 세포의 Fc 수용체는 세포-결합 항체를 인식하고, 세포용해 반응을 촉발하여 표적 세포를 사멸시킨다. 한 가지 예시적인 예에서, t-haNK 세포는 헤르셉틴(항-Her2 항체) 및 SKBr3(표적 세포)와 인큐베이션될 수 있고, SKBr3 세포의 사멸은, 상술된 바와 같이, 표적 세포의 내부 성분, 예를 들어, 51Cr 또는 칼세인의 방출에 의해 측정될 수 있다.
배가 시간
NK-92™세포, 예를 들어, t-haNK 세포의 성장률은 세포 배가 시간, 즉, 세포가 초기 세포 수의 두 배에 이르도록 증식하는 데 소요되는 시간을 이용하여 평가될 수 있다. 배가 시간은 NK-92™세포의 성장률과 역관련되는데; 배가 시간이 길수록 성장률이 낮아진다.
WGS
선택적으로, 변형된 NK-92™세포의 전장 게놈 시퀀싱(WGS)은 다중-시스트론성 작제물의 삽입 부위를 확인하기 위해 수행된다.
치료 용도
본 개시는 또한 질병의 임의의 병기에 대상체에서 임의 유형의 암을 치료하는 방법을 제공한다. 적합한 암의 비-제한적 예는 암종, 흑색종, 또는 육종을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 백혈병 또는 림프종과 같은 조혈 기원의 암을 치료하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양이다.
일부 구현예에서, 대상체에서 임의 유형의 암을 치료하는 방법은 치료적 유효량의 상술된 바와 같은 NK-92™세포를 환자에게 투여하고, 이에 의해 암을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, NK-92™세포는 SEQ ID NO:2에 기재된 서열을 갖는 Fc 수용체, 예를 들어, 고친화성 Fc 수용체를 발현한다. 일부 구현예에서, NK-92™세포는 PD-L1 CAR, Fc 수용체 및 IL-2를 발현한다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92™세포는 다중-시스트론성 작제물을 포함하고, 여기서 다중-시스트론성 작제물은 키메라 항원 수용체 및 Fc 수용체를 인코딩한다.
본원에 기재된 바와 같은 변형된 NK-92™세포로 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 대상체 또는 환자는 암 또는 감염성 질병, 예컨대, 바이러스 감염을 앓고 있다.
변형된 NK-92™세포는 개체에 세포의 절대적인 수만큼 투여될 수 있고, 예를 들어, 상기 개체는 약 1000개의 세포/주사 내지 최대 약 100억 개의 세포/주사, 예컨대 주사당 약, 적어도 약, 또는 최대 약 1×108개, 1×107개, 5×107개, 1×106개, 5×106개, 1×105개, 5×105개, 1×104개, 5×104개, 1×103개, 5×103개 (등)의 NK-92™세포, 또는 종점을 포함하여 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다. 따라서, 본 개시는 또한 복수의 NK-92™세포를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 세포수는 1×108개, 1×107개, 5×107개, 1×106개, 5×106개, 1×105개, 5×105개, 1×104개, 5×104개, 1×103개, 또는 5×103개 (등)이다.
다른 구현예에서, 상기 개체는 약 1000개의 세포/주사/m2 내지 최대 약 100억 개의 세포/주사/m2, 예컨대, 주사 당 약, 적어도 약, 또는 최대 약, 1×108개/m2, 1×107개/m2, 5×107개/m2, 1×106개/m2, 5×106개/m2, 1×105개/m2, 5×105개/m2, 1×104개/m2, 5×104개/m2, 1×103개/m2, 5×103개/m2 (등)의 NK-92™세포, 또는 종점을 포함하여 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, NK-92™세포는 이러한 개체에게 세포의 상대적인 수만큼 투여될 수 있으며, 예를 들어, 상기 개체는 개체의 킬로그램당 약 1000개의 세포 내지 최대 약 100억 개의 세포, 예컨대, 개체의 킬로그램당 약, 적어도 약, 또는 최대 약, 1×108개, 1×107개, 5×107개, 1×106개, 5×106개, 1×105개, 5×105개, 1×104개, 5×104개, 1×103개, 또는 5×103개 (등)의 NK-92™또는 종점을 포함하여 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 총 용량은 m2 당 약 1×1011개, 1×1010개, 1×109개, 1×108개, 1×107개, 또는 종점을 포함하여 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위를 포함하여, 체표면적 m2에 의해 계산될 수 있다. 평균 사람은 약 1.6 m2 내지 약 1.8 m2이다. 바람직한 구현예에서, 약 10억 개 내지 약 30억 개의 NK-92™ 세포가 환자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 용량당 주사되는 NK-92™세포의 양은 m2 당 1×1011개, 1×1010개, 1×109개, 1×108개, 1×107개를 포함하여 체표면적 m2에 의해 계산될 수 있다. 사람에 대한 평균 체표면적은 1.6 m2 내지 1.8 m2이다.
다른 구현예에서, NK-92™세포는 이러한 개체에게 세포의 상대적인 수만큼 투여될 수 있으며, 예를 들어, 상기 개체는 개체의 킬로그램당 약 1000개의 세포 내지 최대 약 100억 개의 세포, 예컨대, 개체의 킬로그램당 약, 적어도 약, 또는 최대 약, 1×108개, 1×107개, 5×107개, 1×106개, 5×106개, 1×105개, 5×105개, 1×104개, 5×104개, 1×103개, 또는 5×103개 (등)의 NK-92™또는 종점을 포함하여 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다.
NK-92™세포는 암을 갖는 환자에게 1회 투여될 수 있거나, 이들은 다수회, 예를 들어, 요법 동안 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간 또는 23시간마다 1회, 또는 1일, 2일, 3일, 4 일, 5일, 6일 또는 7일마다 1회, 또는 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주 또는 그 초과의 주마다 1회, 또는 종점을 포함하여 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, NK-92™세포는 NK-92™세포 및 매질, 예컨대, 인간 혈청 또는 이의 등가물을 포함하는 조성물을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 매질은 인간 혈청 알부민을 포함한다. 일부 구현예에서, 매질은 인간 혈장을 포함한다. 일부 구현예에서, 매질은 약 1% 내지 약 15% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 일부 구현예에서, 매질은 약 1% 내지 약 10% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 일부 구현예에서, 매질은 약 1% 내지 약 5% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 매질은 약 2.5% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈청은 인간 AB 혈청이다. 일부 구현예에서, 인간 치료에서 사용하는 데 허용 가능한 혈청 대체물이 인간 혈청 대신에 사용된다. 이러한 혈청 대체물은 당해 기술 분야에 공지되어 있을 수 있거나, 또는 추후 개발될 수 있다. 15% 초과의 인간 혈청의 농도가 사용될 수 있지만, 약 5% 초과의 농도가 비용-제한적일 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, NK-92™세포는 NK-92™세포 및 세포 생존율을 보조하는 등장성 액체 용액을 포함하는 조성물을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, NK-92™세포는 동결보존된 샘플로부터 재구성된 조성물을 통해 투여된다.
NK-92™세포를 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물은 다양한 담체 및 부형제를 포함할 수 있다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 완충 염수 등이 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균성이고 일반적으로 바람직하지 않은 물질을 함유하지 않는다. 적합한 담체 및 부형제 및 이의 제형은 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, David B Troy, ed, Lippicott Williams & Wilkins (2005)]에 기재되어 있다. 약제학적으로 허용되는 담체란 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 물질을 의미하며, 즉, 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않으면서 또는 이를 함유한 약제학적 조성물의 다른 구성성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 대상체에게 투여된다. 대상체에게 투여되는 경우에, 담체는 활성 성분의 분해를 최소화하고 대상체에서 유해 부작용을 최소화하도록 선택적으로 채택된다. 본원에 사용된 용어 약제학적으로 허용되는은 생리학적으로 허용되는 및 약리학적으로 허용되는과 동의어로 사용된다. 약제학적 조성물은 일반적으로 저장 시 완충 및 보존을 위한 작용제를 포함할 것이고, 투여 경로에 따라, 적절한 전달을 위한 완충제 및 담체를 포함할 수 있다.
생체내 또는 시험관내에서 사용하기 위한 이들 조성물은 세포에 대해 사용되는 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 가까워지도록 필요에 따라 허용 가능한 보조 물질, 예컨대, pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등을 함유할 수 있다. 이들 제형 및/또는 다른 작용제 중 세포의 농도는 달라질 수 있고, 선택된 특정한 투여 방식 및 대상체의 요구에 따라, 주로 유체 부피, 점도, 체중 등에 기초하여 선택될 것이다.
일 구현예에서, NK-92™세포는 치료되는 암에 대한 하나 이상의 다른 치료 또는 작용제와 함께 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, 치료되는 암에 대한 하나 이상의 다른 치료는, 예를 들어, 항체, 방사선, 화학요법제, 줄기 세포 이식, 또는 호르몬 요법을 포함한다.
일부 구현예에서, NK-92™세포 및 기타 암 제제/치료는 동시에 또는 거의 동시에(예를 들어, 서로 약 1분, 5분, 10분, 15분, 20분, 또는 30분 이내) 투여된다. 일부 구현예에서, NK-92™세포 및 기타 암 제제/치료는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 다른 암 치료/제제는 NK-92™세포의 투여 1일, 2일, 또는 3일 후에 투여된다.
일 구현예에서, 다른 암 제제는 항체이다. 일 구현예에서, NK-92™세포는 질병이 있는 세포를 표적화하는 항체와 함께 투여된다. 일 구현예에서, NK-92™세포 및 항체는 환자에게 함께, 예를 들어, 동일한 제형에서; 별개로, 예를 들어, 별개의 제형에서, 동시에 투여되거나; 별개로, 예를 들어, 상이한 투약 계획 또는 상이한 날짜 시점에 투여될 수 있다. 별개로 투여될 때, 항체는 임의의 적합한 경로, 예컨대, 정맥내 또는 종양내 주사를 통해 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 NK-92™세포는 치료 항체 및/또는 다른 항암제와 조합하여 사용된다. 치료 항체는 암-관련 또는 종양-관련 마커를 발현하는 세포를 표적화하는 데 사용된다. 암 치료 단클론성 항체의 예는 표 4에 나타나 있다. 일부 구현예에서, NK-92™세포는 SEQ ID NO:2에 기재된 서열을 갖는 Fc 수용체, 예를 들어, 고친화성 Fc 수용체를 발현한다. 일부 구현예에서, NK-92™세포는 haNK® 세포이다. 일 구현예에서, 치료 항체는 아벨루맙이다.
[표 2]
예시적인 치료 단클론성 항체
Figure pat00004
Figure pat00005
이러한 NK-92™세포의 투여는 단클론성 항체의 투여와 동시에, 또는 순차적인 방식으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, NK-92™세포는 대상체가 단클론성 항체로 치료된 후에 대상체에게 투여된다. 대안적으로, NK-92™세포는 단클론성 항체와 동시에, 예를 들어, 이의 24시간 이내에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, NK-92™세포는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, NK-92™세포는 골수 내로 직접 주입될 수 있다.
따라서, 본 개시는 암 또는 바이러스 감염을 치료하는 것을 필요로 하는 환자에서 암 또는 바이러스 감염을 치료하는 방법으로서, 방법은 치료적 유효량의 본원에 개시된 NK-92™세포를 환자에게 투여함으로써 암을 치료하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
키트
또한, 본원에 기재된 바와 같은 복수의 NK-92™세포를 포함하는 조성물을 사용하여 암 또는 감염성 질병의 치료를 위한 키트가 개시된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 키트는 또한 적어도 하나의 단클론성 항체를 포함할 수 있다. 키트에 포함되는 NK-92™세포는 CAR 및 Fc 수용체를 발현한다. 일부 구현예에서, NK-92™세포는 추가로 IL-2, 예를 들어, erIL-2, 또는 IL-15, 예를 들어, erIL-15를 발현한다. 일부 구현예에서, NK-92™세포는 다중-시스트론성 작제물을 포함하고, 여기서 다중-시스트론성 작제물은 키메라 항원 수용체, Fc 수용체, 및 선택적으로 IL-2 또는 IL-15를 인코딩한다.
특정 구현예에서, 키트는 NK-92™세포의 투여 전에, 이와 동시에 또는 그 후에 투여될 추가적인 화합물, 예컨대, 치료 활성 화합물 또는 약물을 함유할 수 있다. 이러한 화합물의 예는 항체, 비타민, 미네랄, 플루드로코르티손, 이부프로펜, 리도카인, 퀴니딘, 화학요법제 등을 포함한다.
다양한 구현예에서, 키트의 사용에 대한 설명서는 암 또는 감염성 질병의 치료에서 키트 구성성분을 사용하는 것에 대한 지시사항을 포함할 것이다. 설명서는 NK-92™세포의 취급 방법(예를 들어, 해동 및/또는 배양)에 관한 정보를 추가로 함유할 수 있다. 설명서는 투여량 및 투여 빈도에 관한 지침을 추가로 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 키트는 추가로 본원에 기재된 하나 이상의 조성물, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 NK-92™세포를 포함하는 조성물로 충전된 하나 이상의 내용물을 포함한다. 선택적으로, 본원에 기재된 것들과 같이 키트가 암 치료용임을 지시하는 라벨이 그러한 내용물과 관련될 수 있다. 선택적으로, 라벨은 또한 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에서 규정한 형식의 고지를 포함하며, 이러한 고지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관에 의한 승인을 반영한다.
개시된 방법 및 조성물을 위해 사용될 수 있거나, 이와 함께 사용될 수 있거나, 이를 위한 제조에서 사용될 수 있거나, 이의 산물인 물질, 조성물, 및 구성성분이 개시된다. 이들 및 다른 물질이 본원에서 개시되고, 이들 물질의 조합, 하위세트, 상호작용, 군 등이 개시되는 경우에 각각의 다양한 개별적 및 포괄적 조합의 구체적 참조 및 이들 화합물의 순열은 명백히 개시되지 않을 수 있으나, 각각 본원에 구체적으로 고려되고 기재되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 방법이 개시되고 논의되고 그러한 방법을 포함하여 다수의 분자에 대해 이루어질 수 있는 다수의 변형이 논의되는 경우에, 방법의 각각 및 모든 조합 및 순열, 및 가능한 변형이 달리 구체적으로 반대로 지시되지 않는 한 구체적으로 고려된다. 마찬가지로, 이들의 임의의 하위세트 또는 조합이 또한 구체적으로 고려되고 개시된다. 이러한 개념은 개시된 조성물을 사용하는 방법에서의 단계를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 본 개시의 모든 측면에 적용된다. 이에 따라, 수행될 수 있는 다양한 추가적인 단계가 존재하는 경우에, 각각의 이들 추가적인 단계가 개시된 방법의 임의의 구체적 방법 단계 또는 방법 단계의 조합으로 수행될 수 있고, 각각의 이러한 조합 또는 조합의 하위세트가 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주되어야 하는 것으로 이해된다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시적인 목적을 위한 것이며 제한으로 해석되어서는 안 된다. 유사하게 하기 실시예를 성공적으로 수행할 수 있게 하는 당업자가 이용 가능할 다양한 대체 기술 및 절차가 존재한다.
실시예 1: PD-L1 CAR 변형된 NK-92™세포의 생산
PD-L1 CAR을 CD16 및 erIL-2 전이유전자를 또한 함유한 이중시스트론성 플라스미드 pNEUKv1 FcR_IL-2 벡터에 클로닝시켰다. 삼중시스트론성 플라스미드를 aNK™세포로 전기천공하였다. PD-L1 CAR-발현 NK-92™세포가 IL-2-고갈 배지에 의해 선택되었는데, 그 이유는 IL-2 의존성인 형질전환되지 않은 aNK™세포가 IL-2 고갈 배지에서 생존할 수 없기 때문이다.
제한 희석 클로닝
분취량의 다클론성 PD-L1 t-haNK 풀 배양물을 IL-2 보충이 없는 성장 배지에 1.5개 세포/ml의 밀도로 희석하였다. 이러한 세포 현탁액을 평균적으로 웰당 0.3개 세포에 상응하는 웰당 200 μl의 부피로 96-웰 플레이트에 분취하였다. 플레이트를 37℃에서 10일 동안 인큐베이션한 후, 세포 성장을 육안으로 확인하였다. 이제 클론이라 명명되는 성장 배지를 고르고, 추가 증대 및 특징화를 위해 더 큰 용기로 옮겼다.
실시예 2: 변형된 NK-92™세포의 표현형
PD-L1 t-haNK 세포에서 PD-L1 CAR의 발현을 유세포 분석에 의해 측정하였고, 결과는 PD-L1 t-haNK 세포주로부터 86.4% 초과의 세포가 안정한 CAR 발현을 가졌다는 것을 보여주었다. 도 3.
실시예 3: 표적 세포주에 대한 PD-L1 t-haNK 세포의 세포독성
t-haNK 세포의 세포독성을 각각의 표적 세포와 인큐베이션시킴으로써 분석하였다. PD-L1을 발현하는 MDA-MB-231 세포를 PD-L1 t-haNK 세포를 위한 표적 세포로서 사용하였다. 결과는 PD-L1 t-haNK 세포가 이들 각각의 표적 세포를 효과적으로 사멸시켰다는 것을 보여준다. 도 4 참조.
MDSC에 대한 PD-L1 t-haNK 세포의 세포독성을 또한 MDSC에 대하여 시험하였다. 실험에 사용된 MDSC는, 혈액으로부터 얻어지고 피콜 구배(Ficoll gradient)에서 분리된 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC)로부터 생성시켰다. MDSC를 CD11b에 대한 양성 자기 선별에 의해 더 풍부하게 만들고, 재조합 GM-CSF 및 IL-6이 보충된 배양 배지에서 수를 증대시켰다(문헌[Goedegebuure et al, 2011, Current Cancer Drug Targets, Vol. 11, issue 6, 2011]). MDSC를 이후 다양한 이펙터 대 표적 비(E:T 비)로 PD-L1 t-haNK 세포에 노출시켰다.
도 5a에 나타나 있는 바와 같이, PD-L1 t-haNK 세포는 (사멸된) MDSC를 효과적으로 용해시켰다. PD-L1-t-haNK 세포의 세포독성은 모 aNK™세포의 세포독성보다 적어도 50% 더 높았고; 유의하게 더 높은 비율(적어도 50% 더 높은)의 표적 세포가 어느 한 t-haNK 세포주에 의해 사멸되었다. MDSC는 종양 미세환경내 주요 억제 세포들 중 하나이기 때문에, 이 결과는 이러한 PD-L1 t-haNK 세포가 고형 종양을 효과적으로 치료하는 데 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 이들 결과는 또한 PD-L1 t-haNK 세포가 먼저 CAR 매개 세포독성을 통해 종양 미세환경으로부터 MDSC를 없애고, 이후 t-haNK 세포 자체에 의해 또는 다른 면역 세포 또는 특이적 종양 표적 요법에 의해 종양 세포를 사멸시킴으로써 기능한다는 것을 시사한다.
도 5b는 PD-L1 t-haNK 세포가 aNK™내성의 PD-L1-양성 MDA-MB-231 세포주의 특이적 사멸을 향상시켰다는 것을 나타낸다. XL-48 및 XL-49는 두 개의 상이한 항-PD-L1 항체로부터 유래된 두 개의 상이한 scFv 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 두 PD-L1 t-haNK 집단이다. 도 5c는 PD-L1 t-haNK 세포가, 항-CD20 항체 리툭시맙과 조합될 때, 조작된 SUP-B15 세포(CD19-, CD20+)에 대항하는 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 활성을 가졌고, ADCC 활성은 CD16(158V) 수용체만을 발현하는 haNK® 세포의 활성에 필적 가능했다는 것을 나타낸다. 항-Her2 항체 헤르셉틴을 대조 항체로서 실험에 사용하였다.
본 발명자들은 추가로 PD-L1 t-haNK 세포의 활성을 여러 생체내 실험으로 연구하였다. 더욱 특히, 9 내지 10주령된 암컷 NSG 마우스(JAX)를 MDA-MB-231 모델(신선한 세포를 사용한 24 마리의 동물) 및 HCC827 모델(신선한 세포를 사용한 24 마리의 동물 및 동결보존된 세포를 사용한 6마리의 동물)에 대하여 사용하였다. MDA-MB-231 모델은 인간 유방 선암종 모델인 반면, HCC827은 인간 폐 선암종 모델이었다. 마우스를 양쪽 옆구리 위에 피하로 접종하였고, 치료 시작 시 평균 종양 부담은 100 mm3(MDA-MB-231) 및 75 mm3 내지 80 mm3(HCC827)였다. 신선하게 제조되고 조사된 항-PDL1 t-haNK는 5E7개 세포/mL의 농도로 제공한 반면, 동결보존되고 조사된 항-PDL1 t-haNK는 2E7개 세포/mL의 농도로 제공하였다. 비히클 대조군은 단독의 성장 배지였다. 투여는 i.v. 및 정맥내였다. IV의 경우 투여량: 신선하게 제조된 세포: 1E7개 세포/200 μL 용량, 및 동결보존된 세포: 4E6개 세포/200 μL 용량. 종양내 투여는 2.5E6개 세포/종양/50 μL 용량이었다. 투여 빈도는 연속 4주 동안 주 2회였다. 투여 첫 날을 1일째(Day 1)로 결정하였다.
주목할 만하게는, 도 6a 및 도 6b에 나타나 있는 바와 같이, 신선하게 제조된 PD-L1 t-haNK 세포(1E7개 세포/용량)는 정맥내로 투여될 때 MDA-MB-231 모델과 HCC827 모델 둘 모두에서 상당하고 오래-지속되는 종양 성장 억제를 야기하였다: 여기서, MDA-MB-231의 경우, 16일째 TGI가 84%(피크)이고 26일째 TGI가 79%(마지막 측정)인 것으로 종양 정체가 관찰되었다. HCC827의 경우, 120%의 16일째 TGI(피크) 및 84%의 29일째 TGI(연구 종료)로 종양 퇴행이 관찰되었다. 동결보존된 PD-L1 t-haNK 세포(4E6개 세포/용량)는 또한 비히클 대조군에 비해 종양 성장을 억제하는 데 통계학적으로 유의한 효능을 나타냈다. 여기서, 26일째 TGI는 60%(피크)이고, 29일째 TGI는 40%(연구 종료)였다.
게다가, 신선하게 제조된 PD-L1 t-haNK 세포(1E7개 세포/용량)는 또한 비히클과 비교할 때 MDA-MB-231 모델에서 전이성 질병 부담의 유의한 감소를 야기하였다. 대조군의 100% 모든 동물들에게서 전이성 질병 부담이 발생했지만, PD-L1 t-haNK 세포로 치료된 동물들의 경우 단지 50%에서만 전이가 발생했다(모든 단일 기관 결과). 하기 표를 참조하라.
[표 3]
MDA-MB-231 종양-보유 마우스의 다중 기관에서 PD-L1 t-haNK 치료에 의한 전이성 질병 부담의 감소
Figure pat00006
종양내로 투여될 때, MDA-MB-231 모델에서가 아니라 HCC827 모델에서 유의한 종양 성장 억제가 또한 관찰되었다. 여기서, 도 7에 나타나 있는 바와 같이, HCC827에 대한 TGI는 20일째에 70%(피크)이고, 29일째에 49%(연구 종료)였다.
따라서, PDL1 t-haNK 세포는 두 가지 피하 종양 모델에서 뛰어난 효능을 보였다는 점을 주지해야 한다. 구체적으로, 1E7개 세포/용량 수준의 4주 동안 주 2회 투여에서 신선하게 제조된 PD-L1 t-haNK 세포의 IV 투여는 시험된 피하 이종이식 모델 둘 모두에서 상당한 항-종양 효능을 나타냈다. 치료는 16일째 84%의 피크 TGI 및 79%의 연구 종료 TGI(2-원 ANOVA 이어서 튜키 시험(Tukey test)에 의한 다중 비교에 의해 둘 모두의 시점에 P < 0.0001)로 MDA-MB-231 종양-보유 마우스에서 종양 정체, 및 16일째 120%의 피크 TGI 및 84%의 연구 종료 TGI(P < 0.0001)로 HCC827 모델에서 종양 퇴행을 야기하였다. 4E6개 세포/용량의 투여 수준에서 4주 동안 주 2회의 동결보존된 PD-L1 t-haNK 세포의 IV 투여는 또한 60%의 피크 TGI(P < 0.0001) 및 40%의 연구 종료 TGI(P < 0.01)에 도달하여 HCC827 종양 모델에서 유의한 치료 효능을 나타냈다.
2.5E6 개 세포/용량/종양의 투여 수준에서 4주 동안 주 2회의 신선하게 제조된 PD-L1 t-haNK 세포의 IT 투여는, 20일째 70%의 피크 TGI 및 49%의 연구 종료 TGI(P< 0.001)를 야기하여, HCC827 종양의 성장을 효과적으로 억제하였다. 그러나, MDA-MB-231 종양은 종양내로 투여된 PD-L1 t-haNK 세포에 민감하지 않았다.
또 다른 추가의 실험에서, 본 발명자들은 PD-L1 t-haNK 세포 대 haNK 세포에서 다양한 마커의 발현을 비교하였고, 선택된 결과는 도 8에 나타나 있다. 용이하게 알 수 있는 바와 같이, PD-L1 t-haNK 세포는 상당량의 CD16를 발현하면서도 매우 높은 양의 PD-L1 CAR을 발현하였다. 더욱 주목할 만하게는, PD-L1 t-haNK 세포는 퍼포린 및 그랜자임 B에서 증가된 발현을 가졌는데, 이는 도 9에 나타나 있는 바와 같이 PD-L1 t-haNK 세포의 향상된 세포독성에 기여했을 가능성이 있다. 여기서, PD-L1고 세포주(MDA-MB-231)에서 PD-L1 t-haNK는 haNK를 능가하였고, PD-L1 t-haNK에 의한 항-PD-L1 CAR-매개된 사멸은 haNK로 항-PD-L1 Ab 매개된 ADCC를 능가하였다. 게다가, 사멸은 퍼포린/그랜자임에 의존적이고(사멸 활성은 콘카나마이신-a(퍼포린/그랜자임 비활성화제)에 의해 유의하게 없어짐), 사멸은 항-CD16에 의해 영향을 받지 않은 것으로 관찰되었다.
본 발명자들은 또한 추가로 PD-L1 t-haNK 세포가 또한 시험관내에서 다양한 종양 세포에 대항하여 세포독성인지를 연구하였다. 도 10은 조사된 PD-L1 t-haNK가 유방(n = 4), 폐(n = 3), 결장(n = 2), 비뇨 생식기(n = 2), 척색종 및 난소 세포주를 포함하여 상이한 종양과 함께 배양된 경우의 예시적인 결과를 나타낸 것이다. 다양한 정도의 사멸이 각 세포주에 대하여 관찰되었는데, E:T 비가 감소함에 따라 사멸 능력이 줄어드는 것으로 관찰되었다. 주목할 만하게는, 13/13 세포주는 PD-L1 t-haNK에 의해 사멸되었다.
추가의 또 다른 실험에서, 본 발명자들은 PD-L1 t-haNK 세포가 생체내에서 종양으로 이동하는지의 여부를 연구하였다. 도 11에서 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, PD-L1 t-haNK 세포는 PD-L1 발현 MDA-MB-231 TNBC 종양으로 추적되었다(PD-L1 null에 비해 유의미함). 게다가, PD-L1 t-haNK 세포의 IP 투여 경로는 IV 투여된 세포보다 유의하게 더 큰 수준의 PD-L1 t-haNK 세포 축적을 매개하였다. 여기서, 마우스에 MDA-MB-231 세포 및 PD-L1 녹-아웃 MDA-MB-231 세포를 접종하였다. 둘 모두의 세포주에 대하여 24시간 및 72시간 후에 PD-L1 t-haNK 세포의 유동을 모니터링하였다. 분명하게, PD-L1 t-haNK 세포는 PD-L1 발현이 있는 종양으로 추적되었다. 1회 이상 PD-L1 t-haNK 세포가 PD-L1 발현이 있는 종양으로 추적된 경우에 대한 생체외에서 21일 후의 추가 결과가 나타나 있다.
동일한 모델을 이용하여 생체내에서 종양 성장 곡선을 측정하였고, 예시적인 결과는 도 12에 나타나 있다. 주목할 만하게는, PD-L1 t-haNK 세포는 단지 1회의 주입 후에 유의한 항종양 활성을 매개하였고, 이는 유지되었다. PD-L1 t-haNK 세포는 또한 MDA-MB-231 PD-L1 KO 세포에 대하여 유의한 항종양 활성을 매개하였다(36일째).
또한, 세포독성 PD-L1 t-haNK 세포에 대한 민감성을 인간 MDSC에서 시험하였다. 이러한 목적을 위해, IL-1b, IL-6, PGE2, TGFb1, TNFa, VEGF, 및 GM-CSF의 존재에서 7일 동안 PBMC를 배양하고, 증대된 세포를 CD33 선별을 이용하여 선별하였다. MDSC 표현형(CD11b+, HLA-DRneg, CD33)의 확인 시, 기능적 세포독성 검정을 수행하였고, 예시적인 결과가 도 13에 나타나 있다. 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, MDSC는 또한 PD-L1 t-haNK 세포에 의해 효과적으로 사멸된다. 이러한 맥락에서, M2 대식세포는 또한 M2 대식세포가 또한 PD-L1을 발현하기 때문에 PD-L1 t-haNK 세포 매개된 세포 사멸에 적합한 표적인 것으로 여겨진다는 점이 주지되어야 한다(예를 들어, 문헌[BMC Cancer (2015) 15:577 DOI 10.1186/s12885-015-1546-9] 참조).
<110> NantKwest <120> ELIMINATION OF PD-L1-POSITIVE MALIGNANCIES BY PD-L1 CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR-EXPRESSING NK CELLS <130> IPC20082-01 <150> 62/753,740 <151> 2018-10-31 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Low Affinity Immunoglobulin Gamma Fc Region Receptor III-A amino acid sequence (mature form) <400> 1 Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp 1 5 10 15 Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala 20 25 30 Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Ser Leu 35 40 45 Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp 50 55 60 Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp 65 70 75 80 Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro 85 90 95 Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His Ser 100 105 110 Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys 115 120 125 Gly Arg Lys Tyr Phe 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gttctcgagc ttttggagta cgtcgtcttt 1320 aggttggggg gaggggtttt atgcgatgga gtttccccac actgagtggg tggagactga 1380 agttaggcca gcttggcact tgatgtaatt ctccttggaa tttgcccttt ttgagtttgg 1440 atcttggttc attctcaagc ctcagacagt ggttcaaagt ttttttcttc catttcaggt 1500 gtcgtgataa tacgactcac tatagggaga cccaagctgg aattcgccac catggactgg 1560 atctggcgga ttctgtttct cgtgggagct gccacaggcg ctcattctgc tcagcctgcc 1620 aacatccaga tgacccagtc tccatcttct gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 1680 atcacttgtc gggcgagtca ggatattagc cgctggttag cctggtatca gcagaaacca 1740 gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatcg 1800 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcgctctca ctatcagcag cctgcagcct 1860 gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctgacagtc gtttctcgat caccttcggc 1920 caagggacac gactggagat taaaggcggc ggaggaagcg gaggcggagg atctgggggc 1980 ggaggctctg gcggaggggg atctgaggtg cagctggtgc agtctggggg aggcttggta 2040 cagcctgggg ggtccctgag actctcctgt gcagcctctg gattcacctt cagtagctat 2100 agcatgaact gggtccgcca ggctccaggg aaggggctgg agtgggtttc atacattagt 2160 agtagtagta gtaccataca gtacgcagac tctgtgaagg gccgattcac catctccaga 2220 gacaatgcca agaactcact gtatctgcaa atgaacagcc tgagagacga ggacacggct 2280 gtgtattact gtgcgagagg ggactactac tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 2340 acggtcaccg tgagctcagc ggccgcgctg agcaacagca tcatgtactt cagccacttc 2400 gtgcctgtgt tcctgcctgc caagcctaca acaacaccag cccctagacc tccaacccct 2460 gcccctacaa ttgcctctca gcctctgtct ctgaggcccg aagcttgtag acctgctgct 2520 ggcggagctg tgcacaccag aggactggat ttcgcctgct tttgggtgct ggtggtcgtg 2580 ggcggagtgc tggcttgtta ttctctgctg gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 2640 cgactgaaga tccaggtccg aaaggccgcc atcaccagct acgagaagtc tgatggcgtg 2700 tacaccggcc tgagcaccag aaaccaggaa acctacgaga cactgaagca cgagaagccc 2760 ccccagggat ctggagctac taacttcagc ctgctgaagc aggctggaga cgtggaggag 2820 aaccctggac ctatgtggca gctgctgctg cctacagctc tcctgctgct ggtgtccgcc 2880 ggcatgagaa ccgaggatct gcctaaggcc gtggtgttcc tggaacccca gtggtacaga 2940 gtgctggaaa aggacagcgt gaccctgaag tgccagggcg cctacagccc cgaggacaat 3000 agcacccagt ggttccacaa cgagagcctg atcagcagcc aggccagcag ctacttcatc 3060 gacgccgcca ccgtggacga cagcggcgag tatagatgcc agaccaacct gagcaccctg 3120 agcgaccccg tgcagctgga agtgcacatc ggatggctgc tgctgcaggc ccccagatgg 3180 gtgttcaaag aagaggaccc catccacctg agatgccact cttggaagaa caccgccctg 3240 cacaaagtga cctacctgca gaacggcaag ggcagaaagt acttccacca caacagcgac 3300 ttctacatcc ccaaggccac cctgaaggac tccggctcct acttctgcag aggcctcgtg 3360 ggcagcaaga acgtgtccag cgagacagtg aacatcacca tcacccaggg cctggccgtg 3420 tctaccatca gcagcttttt cccacccggc taccaggtgt ccttctgcct cgtgatggtg 3480 ctgctgttcg ccgtggacac cggcctgtac ttcagcgtga aaacaaacat cagaagcagc 3540 acccgggact ggaaggacca caagttcaag tggcggaagg acccccagga caagtgaaat 3600 tccgcccctc tccccccccc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 3660 gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 3720 ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 3780 tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 3840 tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 3900 cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 3960 cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 4020 cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 4080 ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 4140 taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgataa ccgccaccat 4200 gtaccggatg cagctgctga gctgtatcgc cctgtctctg gccctcgtga ccaacagcgc 4260 ccctaccagc agcagcacca agaaaaccca gctgcagctg gaacatctgc tgctggacct 4320 gcagatgatc ctgaacggca tcaacaacta caagaacccc aagctgaccc ggatgctgac 4380 cttcaagttc tacatgccca agaaggccac cgaactgaaa catctgcagt gcctggaaga 4440 ggaactgaag cccctggaag aagtgctgaa cctggcccag agcaagaact tccacctgag 4500 gcccagggac ctgatcagca acatcaacgt gatcgtgctg gaactgaaag gcagcgagac 4560 aaccttcatg tgcgagtacg ccgacgagac agctaccatc gtggaatttc tgaaccggtg 4620 gatcaccttc tgccagagca tcatcagcac cctgaccggc tccgagaagg acgagctgtg 4680 agcggccgcc cgctgatcag cctcgaacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa 4740 aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat 4800 ctcatgctgg agttcttcgc ccaccccaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa 4860 taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt 4920 ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgtg cggtgggctc tatggcttct 4980 gaggcggaaa gaaccagctg gggctctagg gggtatcccc ggatcctgag caaaaggcca 5040 gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 5100 ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 5160 ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 5220 gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 5280 ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 5340 cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 5400 cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 5460 gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 5520 aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 5580 tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 5640 gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 5700 tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 5760 gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 5820 tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 5880 ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 5940 ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagaaccac gctcaccggc 6000 tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 6060 aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc 6120 gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc 6180 gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 6240 ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 6300 gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 6360 gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata 6420 gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca 6480 tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 6540 gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 6600 agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc 6660 aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata 6720 ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aa 6772 <210> 12 <211> 681 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence for PD-L1 CAR and CD16 fusion protein <220> <221> CD8 hinge <222> (273)..(336) <220> <221> CD28 transmembrane <222> (337)..(364) <220> <221> FceRIg signaling domain <222> (365)..(405) <220> <221> P2A sequence <222> (406)..(427) <220> <221> CD16 sequence <222> (428)..(681) <400> 12 Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Ala Gln Pro Ala Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 20 25 30 Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 35 40 45 Ser Gln Asp Ile Ser Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 Gln Ala Asp Ser Arg Phe Ser Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 165 170 175 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro 180 185 190 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr 195 200 205 Ile Gln Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 210 215 220 Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu 225 230 235 240 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met 245 250 255 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala 260 265 270 Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu 275 280 285 Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala 290 295 300 Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg 305 310 315 320 Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys 325 330 335 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 340 345 350 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Leu Lys Ile Gln 355 360 365 Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val Tyr 370 375 380 Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His 385 390 395 400 Glu Lys Pro Pro Gln Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys 405 410 415 Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Trp Gln Leu Leu 420 425 430 Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala Gly Met Arg Thr Glu 435 440 445 Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val 450 455 460 Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro 465 470 475 480 Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser 485 490 495 Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly 500 505 510 Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln 515 520 525 Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val 530 535 540 Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn 545 550 555 560 Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys 565 570 575 Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys 580 585 590 Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val 595 600 605 Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser 610 615 620 Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu 625 630 635 640 Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val 645 650 655 Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys Phe 660 665 670 Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 675 680 <210> 13 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence of erIL2 <400> 13 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu 145 150 155 160 <210> 14 <211> 1215 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence encoding PD-L1 CAR <400> 14 atggactgga tctggcggat tctgtttctc gtgggagctg ccacaggcgc tcattctgct 60 cagcctgcca acatccagat gacccagtct ccatcttctg tgtctgcatc tgtaggagac 120 agagtcacca tcacttgtcg ggcgagtcag gatattagcc gctggttagc ctggtatcag 180 cagaaaccag ggaaagcccc taaactcctg atctatgctg catccagttt gcaaagtggg 240 gtcccatcga ggttcagcgg cagtggatct gggacagatt tcgctctcac tatcagcagc 300 ctgcagcctg aagattttgc aacttactat tgtcaacagg ctgacagtcg tttctcgatc 360 accttcggcc aagggacacg actggagatt aaaggcggcg gaggaagcgg aggcggagga 420 tctgggggcg gaggctctgg cggaggggga tctgaggtgc agctggtgca gtctggggga 480 ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttc 540 agtagctata gcatgaactg ggtccgccag gctccaggga aggggctgga gtgggtttca 600 tacattagta gtagtagtag taccatacag tacgcagact ctgtgaaggg ccgattcacc 660 atctccagag acaatgccaa gaactcactg tatctgcaaa tgaacagcct gagagacgag 720 gacacggctg tgtattactg tgcgagaggg gactactact acggtatgga cgtctggggc 780 caagggacca cggtcaccgt gagctcagcg gccgcgctga gcaacagcat catgtacttc 840 agccacttcg tgcctgtgtt cctgcctgcc aagcctacaa caacaccagc ccctagacct 900 ccaacccctg cccctacaat tgcctctcag cctctgtctc tgaggcccga agcttgtaga 960 cctgctgctg gcggagctgt gcacaccaga ggactggatt tcgcctgctt ttgggtgctg 1020 gtggtcgtgg gcggagtgct ggcttgttat tctctgctgg tcaccgtggc cttcatcatc 1080 ttttgggtcc gactgaagat ccaggtccga aaggccgcca tcaccagcta cgagaagtct 1140 gatggcgtgt acaccggcct gagcaccaga aaccaggaaa cctacgagac actgaagcac 1200 gagaagcccc cccag 1215 <210> 15 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequenc for PD-L1 CAR <400> 15 Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Ala Gln Pro Ala Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 20 25 30 Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 35 40 45 Ser Gln Asp Ile Ser Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 Gln Ala Asp Ser Arg Phe Ser Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 165 170 175 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro 180 185 190 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr 195 200 205 Ile Gln Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 210 215 220 Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu 225 230 235 240 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met 245 250 255 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala 260 265 270 Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu 275 280 285 Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala 290 295 300 Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg 305 310 315 320 Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys 325 330 335 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 340 345 350 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Leu Lys Ile Gln 355 360 365 Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val Tyr 370 375 380 Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His 385 390 395 400 Glu Lys Pro Pro Gln 405

Claims (20)

  1. 대상체에서 골수-유래 억제 세포(MDSC) 또는 종양 세포를 사멸시키기 위한 조성물로서,
    치료적 유효량으로 상기 대상체에게 투여되는 제1 조성물 및 제2 조성물을 포함하고,
    상기 제1 조성물은 복수의 NK-92 세포를 포함하고,
    상기 제2 조성물은 항-PD-L1 항체를 포함하는, 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 NK-92 세포는 Fc 수용체를 발현하는, 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 Fc 수용체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는, 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 NK-92 세포는 haNK 세포인, 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 NK-92 세포는 내형질 세막에 표적화되는 IL-2의 변이체 또는 상기 IL-2를 발현하거나, 또는
    내형질 세막에 표적화되는 IL-15의 변이체 또는 상기 IL-15를 발현하는, 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 제2 조성물은 아벨루맙(Avelumab)인, 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 주사 또는 주입용으로 제형화되는, 조성물.
  8. NK 세포를 개체에게 투여하기 위한 조성물로서,
    PD-L1 CAR을 발현하는 NK 세포를 포함하는 제1 조성물, 및
    일차(primary) NK 세포를 포함하는 제2 조성물을 포함하는, 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 PD-L1 CAR을 발현하는 NK 세포는,
    Fc 수용체를 추가적으로 발현하는, 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 Fc 수용체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는, 조성물.
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 PD-L1 CAR을 발현하는 NK 세포는,
    내형질 세막에 표적화되는 IL-2의 변이체 또는 IL-2를 발현하거나, 또는
    내형질 세막에 표적화되는 IL-15의 변이체 또는 IL-15를 추가로 발현하는, 조성물.
  12. 제 8 항에 있어서,
    상기 PD-L1 CAR을 발현하는 NK 세포는 PD-L1-발현 세포를 사멸시킬 수 있는, 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 PD-L1-발현 세포는 골수-유래 억제 세포(myeloid-derived suppressor cell: MDSC), 종양 관련 대식세포(tumor associated macrophage: TAM), 또는 종양 세포인, 조성물.
  14. 제 8 항에 있어서,
    상기 PD-L1 CAR은 scFv 항체 단편을 포함하는, 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 scFv 항체 단편은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖는, 조성물.
  16. 제 8 항에 있어서,
    상기 PD-L1 CAR을 발현하는 NK 세포의 직접 세포독성은 표적에 대한 이펙터 비율이 10일 때 40% 내지 100%인, 조성물.
  17. 제 8 항에 있어서,
    상기 PD-L1 CAR는
    Fc 엡실론 수용체 감마(Fcεγ) 세포질 신호전달 도메인, 또는
    CD3 제타 세포질 신호전달 도메인을 포함하는, 조성물.
  18. 제 8 항에 있어서,
    인간 혈청 또는 인간 혈청 알부민을 포함하는 매질을 더 포함하는, 조성물.
  19. 제 8 항에 있어서,
    화학요법제를 포함하는 제3 조성물을 더 포함하는, 조성물.
  20. 제 8 항에 있어서,
    상기 PD-L1 CAR을 발현하는 NK 세포는 1,000개 내지 100억 개인, 조성물.
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