KR20230066328A

KR20230066328A - 신규 피리미도디아제핀 유도체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230066328A
Application number: KR1020237006457A
Authority: KR
Inventors: 박승범; 신영희
Original assignee: (주)스파크바이오파마
Priority date: 2020-09-09
Filing date: 2021-08-31
Publication date: 2023-05-15
Also published as: WO2022055168A1; US20230322805A1

Abstract

본 발명은 피리미도디아제핀 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 PERK 신호 활성화를 억제하는 DNAJC3 및 PDIA3에 대하여 특이적으로 결합하여 PERK 신호 억제를 방지함으로써, 타우 응집을 효과적으로 억제 또는 저해할 수 있는 효과가 있어, 타우 단백질의 활성화와 관련된 타우 병증을 근본적으로 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 타우 병증의 치료용 제제 개발 및 타우 단백질의 발현 또는 활성 억제에 관한 다양한 연구에 활용될 수 있다.

Description

신규 피리미도디아제핀 유도체 및 이의 용도

본 발명은 신규 피리미도디아제핀 유도체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, PERK 신호전달 경로에 작용하는 피리미도디아제핀 유도체, 및 이를 포함하는 타우병증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

21세기에 들면서 인간 수명이 길어지게 되고, 이에 따른 퇴행성 신경질환의 발병율이 높아졌으며, 이에 대한 사회적 비용이 기하급수적으로 늘어나고 있는 상황이지만, 퇴행성 신경질환 치료제로 검증된 약물은 극히 제한적이며, 그 효과도 미미하다고 볼 수 있다.

한편, 잘못 접힌 단백질이 축적되는 것을 특징으로 하는 질병을 단백증(proteinopathies)이라고 한다. 많은 퇴행성 신경질환의 특징 중 하나는 비효율적인 단백질 품질 관리(protein quality control; PQC) 과정에서 발생하는 이차적인 비정상 단백질 응집체가 축적되는 것이다. 가장 잘 알려진 단백증 중 하나는 알츠하이머병(Alzheimer’s disease; AD)이다. 알츠하이머병의 원인으로는 타우 단백질과 아밀로이드 β(amyloid β; Aβ)를 비롯하여 여러 가지 단백질이 지목되고 있다. 이들 중 타우 단백질과 아밀로이드 β는 모두 뇌신경세포에 있는 단백질로 타우 단백질은 세포 내부에, 아밀로이드 β는 세포의 표면에 나타난다. 타우 단백질과 아밀로이드 β가 잘못 접히면 이들 단백질은 서로 뭉쳐 플라그(plaques)를 형성하고 타우 단백질이 서로 엉키는 신경원 섬유 엉킴(neurofibrillary tangles; NFT)이 발생하여 신경세포를 파괴하는 것으로 알려져 있다.

NFT 증상은 알츠하이머병 뿐만 아니라 이마관자엽 치매(frontotemporal dementia; FTD), 진행성핵상 마비(progressive supranuclear palsy) 및 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury; TBI)을 포함하여 다른 질병에서도 관찰되며, 이를 총칭하여 타우 병증(tauopathies)이라고 한다. 타우 병증에 대한 주요 치료법으로는 타우 면역 요법, 타우 번역 후 변형(tau post-translational modifications)의 조절제, 타우 응집 억제제 및 타우 분해를 촉진시키는 단백질 제거 메커니즘의 증강제 등을 이용하는 것이 있다.

몇몇 타우 표적화 면역 요법 약물이 현재 임상 시험에서 평가되고 있지만, 아직 개발 초기 단계에 있으며, 대부분 타우 병증에서 병리학적으로 타우 단백질과 관련된 메커니즘에 대한 제한된 지식 때문에, 타우 병증에 대한 승인된 치료제 또는 예방제는 아직까지 없다.

소포체(Endoplasmic reticulum; ER) 스트레스는 타우 병증을 비롯한 신경 퇴행성 장애에 관여하는 것으로 알려져 있다. 소포체는 분비 소포(secretory vesicles)를 통해 수송 전에 다양한 샤페론(chaperones)을 이용해 초기에 잘못 접힌 단백질이 정확하게 접히도록 하는 구조체이다. 잘못 접힌 단백질의 축적 및 세포 내 칼슘 수준의 변화에 의해 발생하는 ER에 대한 스트레스 자극은 펼쳐진 단백질 반응(unfolded protein response; UPR)으로 알려진 세포 생존을 위한 적응성 신호 전달 경로를 활성화시킨다. 이 과정은 단백질 합성을 일시적으로 줄이고 단백질 제거 경로를 활성화하여 ER 항상성을 재설정한다. ER 스트레스가 만성화되면 UPR은 돌이킬 수 없는 손상된 세포를 제거하기 위해 세포 자멸사를 유발한다. 타우 병증 환자의 사후 뇌 조직에서 축적된 NFT와 함께 다양한 ER 스트레스 마커 또는 UPR 단백질이 발견되었으며, 단백질 응집의 정도와 질병 상태 사이에 관련성이 있음이 관찰되었다. 타우 병증은 만성 ER 스트레스에 의해 악화되는 것으로 보고되었지만, ER 스트레스를 표적으로 하는 타우 병증 치료제의 개발은 미미한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2019-7012934호

본 발명자들은 PERK 신호 전달에 경로에 작용하여 타우 응집을 저해할 수 있는 화합물을 합성하였고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 타우 응집 저해능을 갖는 신규한 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 신규한 화합물을 유효성분으로 포함하는 타우병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로, 하기 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

X 는 CH₂; CO; COCF₃; NH; NCH₃; O; S; 또는 SO₂;이고,

Y 는 O; S; SO; SO₂; 또는 NRy이고,

m 은 0 또는 1의 정수이고,

n 은 0, 1 또는 2의 정수이고,

Ry 는 수소; C1-20의 선형 또는 분지형 알킬; 할로겐, C1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C6-20의 아릴; -COR′; -SO₂R′; -SOR′; -COOR′; -CONHR′; 또는 -CONR′R″이고,

Ra 는 수소; C1-20의 선형 또는 분지형 알킬; C1-20의 선형 또는 분지형 알케닐(alkenyl); 할로겐, C1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C6-20의 아릴; 어느 하나의 이상의 수소가 C1-5의 선형 또는 분지형 알킬 또는 6원 내지 10원 아릴로 치환된, 1 내지 2개의 N을 포함하는 5원 내지 6원의 헤테로사이클릴; 또는 -NRa₁Ra₂ 이고,

Rb 는 수소; C1-20의 선형 또는 분지형 알킬; 할로겐, C1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C6-20의 아릴; -NR′R″; -SR′; -SO₂R′; 또는 -SOR′이고,

Rc 는 수소; C1-20의 선형 또는 분지형 알킬; 할로겐, C1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C6-20의 아릴; -COR′; -SOR′; -SO₂R′; -COOR′; -CONHR′; 또는 -CONR′R″;이고,

상기 Ra에서 -NRa₁Ra₂ 의 Ra₁ 및 Ra₂는 각각 독립적으로 수소; C1-20의 선형 또는 분지형 알킬; 어느 하나 이상의 수소가 아민으로 치환된 C1-10의 선형 또는 분지형 아미노알킬; 할로겐, C1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C1-10의 선형 또는 분지형 알콕시, 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C6-20의 아릴로 C1-10의 선형 또는 분지형 알킬의 어느 하나의 수소가 치환된 아릴알킬; 1개의 N을 포함하는 6원의 헤테로아릴로 C1-5 알킬의 어느 하나의 수소가 치환된 헤테로아릴알킬; C1-10 선형 또는 분지형 알킬의 어느 하나의 수소가 페녹시기로 치환된 페녹시알킬; C1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C6-20의 아릴; -COR′; -SO₂R′; -SOR′; -COR′R″; 또는 -COOR′이고,

상기 Ry, Rb, Rc, Ra₁, 및 Ra₂에서, R′ 및 R″는 각각 독립적으로 수소; C1-10의 선형 또는 분지형 알킬; C3-10의 사이클로알킬; 할로겐, C1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C1-10의 선형 또는 분지형 알카이닐(alkynyl), C1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 니트로(nitro)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C6-20의 아릴; 벤질(benzyl); N, O 및 S 원자 중에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 5원 내지 20원의 헤테로아릴이다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, PDIA3, DNAJC3, 또는 PDIA3와 DNAJC3 과의 결합을 통해 PERK 신호 전달 억제를 방지함으로써 타우(Tau) 응집을 저해하는, 타우 응집 저해제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 타우 병증(tauopathies)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 대상체에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는, 타우 병증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 대상체의 타우 병증을 예방 또는 치료하기 위한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 PERK 신호 활성화를 억제하는 DNAJC3 및 PDIA3에 대하여 특이적으로 결합하여 PERK 신호 억제를 방지함으로써, 타우 응집을 효과적으로 억제 또는 저해할 수 있는 효과가 있어, 타우 단백질의 활성화와 관련된 타우 병증을 근본적으로 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 타우 병증의 치료용 제제 개발 및 타우 단백질의 발현 또는 활성 억제에 관한 다양한 연구에 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예예 따른 타우 응집을 모니터링하기 위한 BiFC-tau Venus HEK293 세포 시스템을 도시한 것이다.
도 2는 BiFC-tau Venus HEK293 세포 시스템을 이용하여 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1617)의 타우 응집 억제 효과를 관찰한 이미지이다.
도 3은 BiFC-tau Venus HEK293 세포에서 20 시간 동안 다양한 농도의 SB1617 또는 SB1607와 80 nM 탑시가르긴을 공동 처리할 때 비너스 형광 강도 변화에 대한 용량 의존성 데이터를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 BiFC-tau Venus HEK293 세포에서 20 시간 동안 SB1617, SB1607 및 80nM 탑시가르긴을 처리할 때 총 타우(Tau5) 및 포스포 타우 (S199, T231) 레벨을 측정한 면역 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 타우 단백질 분해를 측정하기 위한 IRES 통합 세포 시스템의 예를 도시한 것이다.
도 6은 DsRed-IRES-tau EGFP HEK293 세포에서 20 시간 동안 5μM의 SB1617 또는 SB1607과 함께 100nM TG로 처리하여 측정한 유세포 분석 데이터를 나타낸 것이다.
도 7은 Bonferroni 사후 분석(Bonferroni’s post hoc analysis)을 이용하여 일원 분산 분석(one-way analysis of variance; ANOVA)을 통해 EGFP-to-DsRed 신호 비율을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 TS-FITGE 2D 겔 전기 영동법(2D gel electrophoresis)을 이용한 분석 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체의 DNAJC3 및 PDIA3에 대한 특이적 결합을 확인하는 CETSA 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 DNAJC3 및 PDIA3에 대한 광 반응성 프로브인 SB1624에 의한 풀다운 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 표면 플라즈몬 공명 분광법을 이용하여 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1617)의 (A) PDIA3 및 (B) DNAJC와의 상호 작용을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 PDIA3 또는 DNAJC3의 발현 억제에 따른 BiFC-tau-Venus 형광 강도 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 PDIA3 또는 DNAJC3의 발현 억제에 따른 EGFP-tau/DsRed 비율 변화를 확인하기 위한 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 PDIA3 또는 DNAJC3의 발현 억제에 따른 EGFP-tau/DsRed 비율 변화를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1617)에 의한 PDIA3 환원 효소 활성의 변경을 통해 PDI의 산화 상태를 모니터링하기 위한 PEG-말레이미드 변형 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 HEK293 BiFC-타우 세포에서 DNAJC3 또는 PDIA3에 대한 siRNA를 도입하고, 면역 블롯 분석을 통해 PERK 다운 스트림 경로의 변경(alteration) 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 인간 신경 모세포종 SH-SY5Y 세포에서 탑시가르긴을 첨가한 경우 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716) 처리 시 PERK 활성화의 시간 경과 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 인간 신경 모세포종 SH-SY5Y 세포에서 탑시가르긴을 첨가하지 않은 경우 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716) 처리 시 PERK 활성화의 시간 경과 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716)에 의한 번역 조절능을 확인하기 위한 면역 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 HEK293 BiFC-tau 세포에서 8 시간 동안 200 nM TG 및 20 μg/mL 사이클로헥시미드(CHX)의 부재 및 존재하에 10 μM 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716)로 처리 시 총 타우 수준을 면역 블롯 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 HEK293 BiFC-tau 세포에서 8 시간 동안 200 nM TG 및 20 μg/mL 사이클로헥시미드(CHX)의 부재 및 존재하에 10 μM 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716)로 처리 시 총 타우 수준을 면역 블롯 분석으로 확인한 결과를 정량화한 그래프이다.
도 22는 SH-SY5Y 세포를 1 μM 탑시가르긴의 유무에 관계없이 5 μM 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716)로 8 시간 동안 처리한 다음 ATF4에 의해 조절된 오토파지 관련 유전자를 RT-qPCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 HEK293 BiFC-tau 세포를 500 nM TG의 존재 또는 부재하에 5 μM 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716)로 6 시간 동안 처리 시 LC3-I에서 LC3-II로의 전환 및 p62 레벨을 면역 블롯 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 HEK293 BiFC-tau 세포에서 오토파지 억제제인 3-메틸 아데닌 (3-MA) 및 바필로마이신 A1 (Baf)의 부재 및 존재하에 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716) 및 TG의 처리에 따른 총 타우 수준을 면역 블롯 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 HEK293 BiFC-tau 세포에서 오토파지 억제제인 3-메틸 아데닌 (3-MA) 및 바필로마이신 A1 (Baf)의 부재 및 존재 하에 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716) 및 TG의 처리에 따른 총 타우 수준을 면역 블롯 분석으로 확인한 결과를 정량화한 그래프이다.
도 26은 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716) 처리에 따른 tau P301L, SOD1(G93A) 및 HET(Q74) 돌연변이 수준 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 수컷 ICR 마우스를 사용한 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716)의 생체 내 약동학적 특성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 수컷 ICR 마우스를 사용한 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716)의 생체 내 혈액 뇌 장벽 투과성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 TBI 마우스 모델에서의 실험 디자인을 개략적으로 도시한 것이다.
도 30은 sham 그룹 및 TBI 마우스 모델의 ipsilateral hippocampal CA1 및 피질(cortex) 부분에서 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716) 처리에 따른 PDI 수준 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 31은 sham 그룹 및 TBI 마우스 모델의 ipsilateral hippocampal CA1 및 피질(cortex) 부분에서 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716) 처리에 따른 ERp57(PDIA3) 수준 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 sham 그룹 및 TBI 마우스 모델의 ipsilateral hippocampal CA1 및 피질(cortex) 부분에서 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716) 처리에 따른 Tau5 수준 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 33은 sham 그룹 및 TBI 마우스 모델의 ipsilateral hippocampal CA1 및 피질(cortex) 부분에서 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716) 처리에 따른 AT8 수준 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 34는 sham 그룹 및 TBI 마우스 모델의 ipsilateral hippocampal CA1 및 피질(cortex) 부분에서 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716) 처리에 따른 신경세포 보호 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 35는 sham 그룹 및 TBI 마우스 모델에서 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716) 처리에 따른 NSS(neurologic severity score) 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 36은 sham 그룹 및 TBI 마우스 모델에서 폴 클라이밍 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 37은 sham 수술 및 TBI 유도 후 72 시간 경과후 비히클 또는 SB1617로 처리된 마우스 모델의 ipsilateral hippocampal CA1 및 피질(cortex) 부분에서 Iba-1 수준 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 38은 sham 그룹 및 TBI 마우스 모델의 ipsilateral hemisphere에서 비히클 또는 SB1617로 처리에 따른 미세아교세포 활성화 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 39는 sham 수술 또는 TBI 유도 후 12시간 및 24시간 째에 비히클 또는 SB1617을 처리한 마우스의 ipsilateral perilesional cortex에서 p62, LC3-I에서 LC3-II로의 전환, BDNF 및 CHOP 수준 여부를 웨스턴 블롯팅 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 40은 급성 알츠하이머 마우스 모델에서의 실험 디자인을 개략적으로 도시한 것이다.
도 41은 급성 알츠하이머 마우스 모델에서 학습시험(Acquisition test)을 통해 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716)의 치료 효능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 42는 급성 알츠하이머 마우스 모델에서의 투여경로에 따른 학습능력 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 43은 급성 알츠하이머 마우스 모델에서의 확인평가(Probe test)를 통해 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체(SB1716)의 치료 효능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

본 발명자들은 타우 응집을 저해하는 피리미도디아제핀 유도체 화합물을 발견하였으며, TS-FITGE 기술을 이용하여 표적 단백질을 동정하고 추가적인 기작 연구를 통해, 상기 피리미도디아제핀 유도체 화합물의 타우 응집 저해 효능이 DNAJC3 및 PDIA3에 대한 특이적 결합을 통한 PERK 신호 활성화 억제를 방지하는 것에 기안함을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, X, Y, m, n, Ra, Rb, 및 Rc 의 정의는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2 내지 10 중 어느 하나로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

상기 화학식 2 내지 10 에서,

X 및 Y 는 앞서 화학식 1에서 정의한 바와 같고,

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 수소; C_1-20의 선형 또는 분지형 알킬; 어느 하나 이상의 수소가 아민으로 치환된 C_1-10의 선형 또는 분지형 아미노알킬; 할로겐, C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시, 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C_6-20의 아릴로 C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬의 어느 하나의 수소가 치환된 아릴알킬; 1개의 N을 포함하는 6원의 헤테로아릴로 C_1-5 알킬의 어느 하나의 수소가 치환된 헤테로아릴알킬; C_1-10 선형 또는 분지형 알킬의 어느 하나의 수소가 페녹시기로 치환된 페녹시알킬; C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C_6-20의 아릴; -COR′; -SO₂R′; -SOR′; -COR′R″; 또는 -COOR′이고,

R₃는 수소; C_1-20의 선형 또는 분지형 알킬; 할로겐, C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C_6-20의 아릴; -NR′R″-SR′; -SO₂R′; 또는 -SOR′이고,

R₄는 수소; C_1-20의 선형 또는 분지형 알킬; 할로겐, C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C_6-20의 아릴; -COR′; -SOR′; -SO₂R′; -COOR′; -CONHR′; 또는 -CONR′R″;이고,

상기 R₁내지 R₄에서, R′ 및 R″는 각각 독립적으로 수소; C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬; C_3-10의 사이클로알킬; 할로겐, C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C_1-10의 선형 또는 분지형 알카이닐, C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C_6-20의 아릴; 벤질; N, O 및 S 원자 중에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하는 5원 내지 20원의 헤테로아릴이다.

본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 화학식 2 내지 10에서 X는 O, S, 또는 SO₂ 이고; Y는 NRy 이고, 여기서 Ry는 수소, C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬, 또는 -COR' 이고, 여기서 R'는 화학식 1에서 정의한 바와 같고; R₁은 할로겐, C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시, 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C_6-20의 아릴로 C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬의 어느 하나의 수소가 치환된 아릴알킬이고; R₂는 수소 또는 C_1-20의 선형 또는 분지형 알킬이고; R₃은 수소 또는 C_1-20의 선형 또는 분지형 알킬이고; R₄는 -SOR′또는 -SO₂R′이고, 여기서 R'는 상기 화학식 2 내지 10에서 정의한 바와 같을 수 있다.

본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 화학식 2 내지 10에서 R₁은 하기 화학식 11로 표시되는 기이고, R₄는 하기 화학식 12로 표시되는 기일 수 있다:

[화학식 11]

[화학식 12]

상기 화학식 11 및 12에서,

L 은 단일 결합 또는 C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬이고,

R₅는 수소; 할로겐; C_1-20의 선형 또는 분지형 알킬; C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시; 아자이드; 또는 C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C_6-20의 아릴이고,

R₆는 할로겐, C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C_1-10의 선형 또는 분지형 알카이닐, C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시, 또는 니트로이다.

또한, 본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 2로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 13 으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.

[화학식 13]

상기 화학식 13 에서,

R₅는 수소; 할로겐; C_1-20의 선형 또는 분지형 알킬; C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시; 아자이드; 또는 C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C_6-20의 아릴이다.

본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 화학식 13에서 R₅는 수소; 할로겐; 또는 아자이드일 수 있다.

하나의 구체적인 실시예로, 상기 화합물은 하기 화합물 101 내지 136으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물일 수 있다.

본 발명의 용어 "피리미도디아제핀 유도체"란 이에 제한되는 것은 아니나, 피리미도디아제핀을 모핵으로 하는 유도체를 의미한다.

본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"이란, 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약제학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하는데, 통상적으로 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있다. 염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 될 수 있다. 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 될 수 있다. 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 될 수 있다. 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 될 수 있다. 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 될 수 있다.

본 발명의 목적상 상기 약학적으로 허용되는 염은 타우 병증의 발병이 예상되거나 또는 상기 질환이 발병된 환자의 치료에 적합한 피리미도디아제핀 유도체의 산 부가 염 또는 염기 부가 염인 것으로 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서, "할로겐"은 플루오르, 염소, 브롬 또는 요오드 원자이다.

본 발명에서, "알킬"은 선형 혹은 분지된 탄소 원자를 가지는 포화된 탄화수소기를 의미한다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 1-메틸에틸, 1-메틸프로필, 2-메틸프로필, 1,1-다이메틸프로필 또는 1,1-다이메틸부틸 등일 수 있다.

본 발명에서, "C_1-20의 선형 또는 분지형 알킬"은 선형 혹은 분지형의 1개 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 포화된 탄화수소기를 의미한다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, iso-프로필, sec-부틸, tert-부틸, neo-펜틸, sec-펜틸, iso-펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐 또는 데실 등일 수 있다.

본 발명에서, "C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬"은 선형 혹은 분지된 1개 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 포화된 탄화수소기를 의미한다. 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 또는 아이소프로필 등일 수 있다.

본 발명에서, "어느 하나 이상의 수소가 아민으로 치환된 C_1-10의 선형 또는 분지형 아미노알킬"은 선형 혹은 분지된 1개 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 포화된 탄화수소기에서 하나 이상의 수소가 아민기인 -NH₂, -NHR′, -NR′R″로 치환된 알킬을 의미한다. 여기에서, R′ 및 R″은 각각 독립적으로 알킬기를 의미한다. 예를 들어, 아미노메틸, 2-(디메틸아미노)에틸, 2-(메틸에틸아미노)프로필 또는 3-(프로필아미노)부틸 등일 수 있다.

본 발명에서, "C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시"는 어느 하나 이상의 수소가 하이드록시기로 치환된 선형 혹은 분지된 1개 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 포화된 탄화수소기를 의미한다. 예를 들어, 하이드록시메틸, 2-하이드록시에틸, 1-하이드록시프로필, 3-하이드록시-4-메틸펜틸 또는 3,4-디하이드록시헵틸 등일 수 있다.

본 발명에서, "C_1-20의 선형 또는 분지형 알케닐"는 선형 혹은 분지된 1개 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 불포화된 이중결합을 갖는 탄화수소기를 의미한다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 에틸렌, 프로펜 또는 2-메틸부-2-텐 등일 수 있다.

본 발명에서, "C_1-10의 선형 또는 분지형 알카이닐"은 선형 혹은 분지된 1개 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 불포화된 삼중결합을 갖는 탄화수소기를 의미한다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 아세틸렌, 프로파인, 부타인 또는 3-메틸부-1-틴 등일 수 있다.

본 발명에서, "C_3-10의 사이클로알킬"은 3개 내지 10개의 탄소 원자가 고리를 이루고 있는 포화된 탄화수소기를 의미한다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실 등일 수 있다.

본 발명에서, "치환된 C_6-20의 아릴"은 탄소수가 6개 내지 20개인 방향족 탄화수소의 탄소에서 수소 원자 하나를 제거한 잔기에서, 어느 하나 이상의 수소가 다른 작용기로 치환된 아릴기를 총칭한다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면 플루오로페닐, 클로로페닐, 톨루엔, 메틸페닐, 메톡시페닐, 니트로페닐, 사이아노페닐 또는 아미노나프틸 등일 수 있다.

본 발명에서, "비치환된 C_6-20의 아릴"은 탄소수가 6개 내지 20개인 방향족 탄화수소의 핵에서 수소 원자 하나를 제거한 잔기를 총칭한다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면 페닐 또는 나프틸 등일 수 있다.

본 발명에서, "치환 또는 비치환된 C_6-20의 아릴로 C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬의 어느 하나의 수소가 치환된 아릴알킬"은 6개 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 치환 또는 비치환된 아릴기가 탄소수가 1개 내지 10개인 알킬기에 치환된 잔기를 총칭한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 벤질, 페닐에틸, 메틸벤질(톨루벤질) 또는 나프틸메틸(메나프틸) 등일 수 있다.

본 발명에서, "1개의 N을 포함하는 6원의 헤테로아릴로 C_1-5 알킬의 어느 하나의 수소가 치환된 헤테로아릴알킬"은 5개의 탄소 원자와 1개의 질소 원자를 가지는 비치환된 헤테로아릴기가 탄소수가 1개 내지 5개인 알킬기에 치환된 잔기를 총칭한다. 이에 제한되는 것은 아니나, (피리딘-2-일)메틸, (피리딘-3-일)에틸, (피리딘-4-일)에틸 또는 2-(피리딘-4-일)펜틸 등일 수 있다.

본 발명에서, "C_1-10 선형 또는 분지형 알킬의 어느 하나의 수소가 페녹시기로 치환된 페녹시알킬"은 페녹시기(-OPh)가 탄소수가 1개 내지 10개인 알킬기에 치환된 잔기를 총칭한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 페녹시메틸, 2-페녹시에틸, 2-페녹시프로필 또는 3-메틸-2-페녹시부틸 등일 수 있다.

본 발명에서, "어느 하나의 이상의 수소가 C_1-5의 선형 또는 분지형 알킬 또는 6원 내지 10원 아릴로 치환된, 1 내지 2개의 N을 포함하는 5원 내지 6원의 헤테로사이클릴"은 5개 내지 6개의 탄소 원자로 이루어진 고리화합물에서 1 내지 2개의 탄소 원자가 질소 원자로 치환되고, 상기 탄소 원자 또는 질소 원자와 결합된 어느 하나 이상의 수소가 C_1-5의 선형 또는 분지형 알킬 또는 6원 내지 10원 아릴로 치환된 잔기를 총칭한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 2-페닐피페리딘-1-일, 2-페닐피롤리딘-1-일 또는 4-메틸-2-페닐피페라진-1-일 등일 수 있다.

본 발명에 따른 화합물은 DNAJC3 및 PDIA3에 대한 특이적 결합을 통해 PERK 신호 활성화 억제를 방지하여 타우 응집을 저해함으로써, 타우 응집에 기인하는 다양한 질환을 예방 및/또는 치료할 수 있다.

이에, 본 발명의 다른 양태로서, 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, PDIA3, DNAJC3, 또는 PDIA3와 DNAJC3 과의 결합을 통해 PERK 신호 전달 억제를 방지함으로써 타우(Tau) 응집을 저해하는, 타우 응집 저해제가 제공된다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1 로 표시되는 피리미도디아제핀 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 타우병증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태로서 대상체에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는, 타우 병증의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태로서 대상체의 타우 병증을 예방 또는 치료하기 위한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도가 제공된다.

본 발명에서 "타우병증"이란 변질된 타우(tau) 단백질(세포 내 마이크로튜불-관련 단백질과 밀접하게 관련된 패밀리)이 뇌조직에 축적됨에 의하여 뇌신경이 손상되는 신경퇴행성 질환을 의미한다. 본 발명에서, 타우병증의 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 이마관자엽 치매(frontotemporal dementia), 진행성핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury) 픽씨병(Pick's disease), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy), 은친화성입자병(Argyrophilic grain disease), 피질기저퇴행(corticobasal degeneration), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntingtin's disease), 및 루게릭병(Amyotrophic lateral sclerosis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 용어 "예방"이란, 타우 병증의 발병이 예상되는 개체에게 본 발명에서 제공하는 피리미도디아제핀 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 투여하여 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어 "개선" 및 "치료"란, 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하는데, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 본 발명의 목적상 상기 치료는 타우 병증이 발병된 환자에게 벤조티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 투여하여 상기 타우 병증의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함하는 것으로 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다.

또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여 될 수 있으며, 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다.

또한, 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학적 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

본 발명에서의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 화학요법유발 말초신경병증에서 통증을 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 피리미도디아디아제핀 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 타우 병증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "개체"란, 상기 타우 병증이 발병될 가능성이 있거나, 또는 발병된 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에 투여함으로써, 타우 병증을 완화 또는 치료할 수 있다.

발명의 실시를 위한 형태

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 실험 방법

1-1. 실험 설계

HEK293 BiFC-tau Venus 세포 시스템을 사용하여 ER 스트레스 조건 하에서 타우 단백질 이량체화를 모니터링하여 셀 기반 표현형 스크리닝을 수행하였다. 예비 SAR 연구에서 초기 적중 화합물의 효능을 개선하고, 수득된 리드 화합물(SB1617)의 효능을 타우-과발현 세포에서 면역 블롯 검정에 의해 평가 하였다(병리학적 p-타우 및 타우 레벨을 정량화 함). 또한 bicistronic DsRed-IRES-EGFP-tau 세포에서 타우 클리어런스의 평가를 통해 단백질 항상성(proteostasis) 조절에서 신규 화합물(SB1617)의 잠재적인 역할을 조사하였다. 또한, 신규 화합물(SB1617)의 세포 표적 단백질을 확인하기 위해 TS-FITGE 기반의 라벨이 없는 표적 식별 방법을 사용하였다. 또한, 표현형 실험(타우-과발현 세포주에서 후보 표적, PDIA3 및 DNAJC3의 녹다운), 시험관 내 결합 분석 및 세포-기반 분석을 통해 관련 표적을 검증하였다. 또한, 세포 기반 생물학적 방법을 사용하여 신규 화합물(SB1617)의 잠재적인 행동 메커니즘을 탐구하고, 외상성 뇌 손상의 마우스 모델을 이용하여 생체 조건에서 그 효능을 평가하였다.

1-2. 세포 배양

BiFC-tau 스테이블 HEK293 인간 배아 신장 세포주(BiFC-tau stable HEK293 human embryonic kidney cell line)는 한국 과학 기술 연구원 (KIST)으로부터 제공받았으며, 10% 태아소혈청(fetal bovine serum; FBS, Gibco), 1% 페니실린(penicillin, 100 units/mL)/스트렙토마이신(streptomycin, 100 μg/mL, Gibco), 펑기존(Fungizone, 0.25 μg/mL, Gibco) 및 제네티신(Geneticin, 100 μg/mL, Gibco)이 보충된 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle’s Medium; DMEM, Gibco)에서 배양되었다. SH-SY5Y 인간 신경 모세포종 세포(CRL-226, ATCC)를 10 % FBS, 1 % 페니실린/스트렙토 마이신 및 펑기존이 보충된 DMEM/F12(Gibco)에서 배양하였다. 모든 세포는 37 ℃ 인큐베이터에서 5 % CO₂로 유지한 상태에서 EZ-마이코플라즈마 검출 키트(EZ-Mycoplasma detection kit, DoGenBio)를 사용하여 마이코플라즈마 음성인 것으로 확인되었다.

1-3. 렌티바이러스(Lentiviral) 생산 및 형질 도입을 이용한 세포주 생성

HEK293 세포주에서 DsRed_IRES_Tau-EGFP를 안정적으로 발현시키기 위해 렌티 바이러스 발현 시스템을 사용 하였다.

바이러스 생산을 위해, HEK293 세포를 100-mm 배양 접시에 시딩하고, pLenti-DsRed_IRES_MAPT:EGFP(Addgene, # 92196)를 인코딩하는 렌티바이러스 전이 플라스미드 3μg, pCMV-VSV-G 엔벨로프 플라스미드 3μg(Addgene, # 8454), psPAX2 패키징 리포펙타민(Lipofectamine, ThermoFisher Scientific)을 사용하는 플라스미드 3μg(Addgene, # 12260), pEGFP-Q23 (addgene #40261) 및 pEGFP-Q74 (addgene #40262)로 공동 형질 감염시켰다. HEK293 세포를 밤새 6-웰 세포 배양 접시에 바이러스 스톡을 첨가하여 감염시켰다. 감염 후, 7 ~ 10 일 동안 제네티신(Geneticin)을 첨가하여 세포를 선별하였다. 이어서 FACS Aria Ⅱ(BD Bioscience)를 사용하여 이중-양성(DsRed 및 EGFP) 게이팅에 의해 세포를 추가로 분류하였다. 10 % FBS, 1 % 페니실린/스트렙토마이신, 펑기존(0.25 μg/mL) 및 제네티신(Geneticin, 100 μg/mL)이 보충된 DMEM에서 안정한 세포주를 배양하고 37 ℃ 인큐베이터에서 5 % CO₂로 유지시켰다.

1-4. 플라스미드 및 siRNA 형질 감염

플라스미드 pRK5-EGFP-Tau(# 46904) 및 pRK-EGFP-Tau P301L(# 46908)은 Addgene에서 구입하였다. 플라스미드 pCMV-SOD1-EGFP 및 pCMV-SOD1 G93A-EGFP는 서울대학교 의과 대학에서 제공받았다. 플라스미드는 제조사의 지시에 기초하여 리포펙타민(Lipofectamine) 및 Opti-MEM(Gibco)를 사용하여 HEK293T 세포에서 형질 감염되었다. PDIA3 및 DNAJC3 녹다운 실험에는 PDIA3 및 DNAJC3에 대한 짧은 간섭 RNA 듀플렉스(short interfering RNA duplex; siRNA duplex, BIONEER)를 사용하였다. siRNA 올리고 뉴클레오티드를 제조사의 지시에 기초하여 리포펙타민 RNAiMAX(ThermoFisher Scientific) 및 Opti-MEM(Gibco)를 사용하여 BiFC-tau 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에서 형질 감염시켰다.

PDIA3 및 DNAJC3에 대한 올리고 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다.

siPDIA3 #1 sense 5′-CGUCCUUCACAUCUCACUA-3′

antisense 5′-UAGUGAGAUGUGAAGGACG-3′

siPDIA3 #2 sense 5′-GAAAUACCAGGACCAGUUU-3′

antisense 5′-AAACUGGUCCUGGUAUUUC-3′

siDNAJC3 #1 sense 5′-CUGCUAUAGCCUUCCUUGA-3′

antisense 5′-UCAAGGAAGGCUAUAGCAG-3′

siDNAJC3 #2 sense 5′-GUGAUGGCUUUUACCUACU-3′

antisense 5′-AGUAGGUAAAAGCCAUCAC-3′

1-5. BiFC-tau Venus HEK293 세포주를 사용한 타우 어셈블리 모니터링 및 화합물 스크리닝

타우 어셈블리를 모니터링하기 위한 표현형-기반 스크리닝을 고처리량 방식으로 BiFC-tau Venus HEK293 세포를 사용하여 수행하였다. 세포를 24 시간 동안 40 μL 배지에서 2.8 x 10³ 세포/웰의 밀도로 384-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 10 μL 배지에서 80 nM 탑시가르긴(thapsigarin, Sigma-Aldrich)로 처리한 다음, 본 발명에 따른 화합물을 포함하여 ~ 3,000 개의 pDOS 라이브러리 화합물 (10 μM)을 0.1 μL 고정 도구(pinning tool)를 사용하여 처리하였다. 녹다운 실험을 위해, 세포를 리포펙타민 RNAiMAX를 사용하여 5 또는 10 nM siRNA로 형질 감염시키고 48 시간 동안 인큐베이션한 후, 탑시가르긴 처리하였다. 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후, 핵(nuclei)을 중간-희석된(medium-diluted) Hoechst 33342(2 ㎍ / mL, ThermoFisher)로 20 분 동안 염색하였다. 플레이트를 INCell Analyzer 2000(GE Healthcare)에서 비너스 형광의 경우 λ_ex/λ_em = 490/525 nm(FITC 채널에 대하여) 및 핵의 경우 λ_ex/λ_em = 350/455 nm(DAPI 채널에 대하여)에서 스캔하였다. 세포 형태를 확인하기 위해 Bright-field 이미지를 촬영하였고, 개발자 소프트웨어(GE Healthcare)를 사용하여 세포 당 비너스 강도를 정량화하기 위해 이미지를 분석하였다.

1-6. HEK293 DsRed-IRES-tau-EGFP 세포주를 사용한 유세포 분석

HEK293 DsRed-IRES-tau-EGFP 세포를 지정된 시간 동안 각 화합물로 처리하거나 리포펙타민 RNAiMAX를 사용하여 siRNA로 형질 감염시켰다. 세포를 트립신 처리하고, 인산 완충 식염수(PBS)에 현탁시키고, Aira II를 사용하여 FACS 분석을 수행하였다. flowing software 2.5.1을 사용하여 세포 당 EGFP 대 DsRed의 형광 강도 비를 측정하기 위해 데이터를 분석하였다. 이중 양성 게이팅을 갖는 세포 당 GFP 및 DsRed 형광 강도의 평균값을 분석에 사용하였다.

1-7. 면역 블로팅

세포를 수집하여, 수정된 방사선 면역 침전 분석 (radioimmunoprecipitation assay; RIPA) 완충액(50mMM Tris-HCl, pH 7.8, 150μmM NaCl, 1 % NP-40, 0.5 % 데옥시콜레이트(deoxycholate), 5mM NaF, 2mM Na₃VO₄, 및 1x 단백질 분해 효소 칵테일(Protease Inhibitor Cocktail, Roche)에 용해시켰다, 이어서 전체 세포 분석 및 피어스 BCA 단백질 분석 키트(Pierce BCA Protein Assay Kit, ThermoFisher Scientific)를 사용하여 각 용해물에서의 총 단백질의 농도를 측정하였다. 측정을 위해 4 ℃에서 10 분 동안 200 g로 원심 분리하였다. 동일한 양의 각 용해물을 PAGE로 분별(fractionated)하고, PVDF 막(PVDF membrane, Bio-Rad)로 옮기고, Tween20 (TBS_T), Sigma)이 첨가된 트리스 식염수(Tris Buffered Saline)에 용해된 2 % 소혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA, MP Biomedicals)으로 실온에서 1 시간 동안 차단시켰다.

막을 4℃에서 밤새 단백질-특이적 항체로 프로브하였다. 다음날, TBS_T 에서 막을 3회 세척하고 TBS_T가 첨가된 2% BSA로 항-토끼(anti-rabbit) 또는 항-마우스(anti-mouse) 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase) 2차 항체(Cell Signaling Technology)와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 세척 후, 막을 검출 시약(GE Healthcare)에 노출시키고 화학 발광(chemiluminescence, Bio-Rad)을 통해 정량화하였다.

면역 블롯 연구를 위한 1차 항체로 하기 항체를 사용하였다.

Rabbit anti-ph(T982)-PERK polyclonal antibody (Abcam, ab192591);

rabbit anti-PERK monoclonal antibody (Cell Signaling Technology, 3192);

rabbit anti-EIF2S1 (phospho S51) polyclonal antibody (Abcam, Ab32157);

rabbit anti-ph-eIF2α (Ser51) monoclonal antibody (Cell Signaling Technology, 3597);

mouse anti-eIF2α monoclonal antibody (santa cruz, sc-133132); rabbit anti-ATF4 monoclonal antibody (Cell Signaling Technology, 11815);

mouse anti-CHOP monoclonal antibody (Cell Signaling Technology, 2895); mouse anti-Tau-5 monoclonal antibody (Abcam, ab80579);

mouse anti-Tau-5 monoclonal antibody (Invitrogen, AHB0042);

rabbit anti-Tau (phospho S199) monoclonal antibody (Abcam, ab81268);

rabbit anti-Tau (phospho T231) monoclonal antibody (Abcam, ab151559);

rabbit anti-Tau (phospho S396) monoclonal antibody (Abcam, ab109390);

rabbit anti-DNAJC3 monoclonal antibody (Cell Signaling Technology, 2940);

rabbit anti-ERp57 polyclonal antibody (Abcam, ab10287);

mouse anti-P4HB monoclonal antibody (Abcam, ab2792);

mouse anti-GFP monoclonal antibody (Cell Signaling Technology, 2955);

rabbit anti-SQSTM1/p62 polyclonal antibody (Cell Signaling Technology, 51145);

rabbit anti-LC3B polyclonal antibody (Abcam, ab51520);

rabbit anti-BDNF monoclonal antibody (Abcam, ab108319);

rabbit anti-GAPDH monoclonal antibody (Cell Signaling Technology, 2118).

1-8. TS-FITGE

HEK293 BiFC-tau 세포를 3 시간 동안 탑시가르긴(200 nM)의 존재 하에 디메틸술폭사이드(DMSO, 0.1 %) 및 본 발명에 따른 화합물(10 μM)로 처리하였다. 세포 현탁액을 지정된 온도 범위에서 3분 동안 가열한 다음, 25℃에서 3 분 동안 가열하였다. 가열 된 세포를 PBS로 세척하고, 용해 완충액 A (프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 PBS 중의 0.4% NP-40)에 재현 탁시켰다. 세포 용해를 위해 세포 현탁액을 액체 질소에서 3 회 동결-해동시켰다. 세포 용해물을 20000 g, 4℃에서 20 분 동안 원심 분리하여 세정 하였다. 가용성 분획의 단백질 농도를 Pierce BCA 단백질 분석으로 정량화 하였다. 단백질 50 ㎍을 차가운 아세톤으로 침전시킨 후, 2000 ℃, 4 ℃에서 7 분 동안 원심 분리하였다. 잔류 펠릿을 10 ㎕의 컨쥬게이션 완충액 (pH 8.6, 30 MM 티오우레아, 7 M 우레아 및 4 % w/v CHAPS에서 30 mM Tris-HCl)으로 재현탁시켰다. 0.4 mM Cy2-N-하이드록시숙신이미드(Cy2-NHS) (DMSO- 처리 그룹의 경우), Cy3-NHS (SB1607- 처리 그룹의 경우) 또는 Cy5-NHS (SB1617- 처리 그룹의 경우) 1 μl를 단백질에 혼합하고 4 ℃에서 45 분 동안 배양하였다. 염료-접합된 단백질체(dye-conjugated proteomes)를 차가운 아세톤으로 침전시키고 50 ㎕의 재수화 완충액 (7 M 우레아, 2 M 티오 우레아, 2 % w/v CHAPS, 40 mM DTT 및 1 % IPG 완충액)으로 재현탁시켰다. 동일한 양의 DMSO- 처리, SB1607- 처리 및 SB1617- 처리된 샘플을 혼합한 다음, 총 150 ㎍ (각 Cy2-, Cy3- 및 Cy5- 표지된 경우 50 ㎍)의 프로테옴을 24 cm 이모빌린 드라이 스트립 겔(Immobiline Drystrip gel, GE Healthcare)에 로딩하였다. 등전 포커싱은 Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare) 후 Ettan DALTsix 시스템(GE Healthcare)을 사용한 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(polyacrylamide gel electrophoresis; PAGE)에 의해 수행되었다. 겔을 Typhoon Trio(GE Healthcare)로 스캔하였다. 단백질 스팟 위치 및 형광 신호는 DeCyder 2D 소프트웨어, ver. 7.2(GE Healthcare)로 분석되었다.

1-9. CETSA

HEK293 BiFC-tau 세포는 탑시가르긴(200 nM)의 존재 하에 3 시간 동안 DMSO(0.1 %) 및 본 발명에 따른 화합물(10μM)로 처리되었다. 세포 현탁액을 지정된 온도 범위에서 3 분 동안 가열한 다음, 25 ℃에서 3 분 동안 가열하였다. 가열된 세포를 PBS로 세척하고, 용해 완충액 A에 재현탁시켰다. 세포 용해를 위해 세포 현탁액을 액체 질소에서 3 회 동결-해동시켰다. 세포 용해물을 20000 g, 4 ℃에서 20 분 동안 원심 분리하여 세정하였다. 동일한 부피의 세정된 세포 용해물을 SDS 완충액과 합한 후 면역 블롯팅하였다.

1-10. 풀다운 어세이

SH-SY5Y 세포를 6- 웰 플레이트에 시딩한 다음, 40 μM SB1617의 존재 또는 부재하에 2.5 시간 동안 1 μM 탑시가르긴 및 5 μM SB1624 (프로브 화합물)로 처리하였다. 세포를 얼음상에서 30 분 동안 356 nm UV 조사에 노출시켰다. 차가운 PBS로 세척한 후, 세포를 RIPA 완충액에 용해시키고, 2000 ℃에서 15 분 동안 4 ℃에서 원심 분리하여 제거하였다. 상청액의 단백질 농도는 Pierce BCA Protein Assay Kit에 의해 결정되었고 단백질 농도는 1 mg/mL로 조정되었다. 비오틴-아지드(biotin-azide, 50 μM, Sigma Aldrich), TBTA(100 μM, Sigma Aldrich), CuSO₄(1 mM, Sigma Aldrich), TCEP(1 mM, Sigma Aldrich) 및 tBuOH (5 %)를 사용한 프로테옴(proteome)에 대한 클릭 반응이 1 시간 동안 수행되었다. 단백질 침전을 위해 -20 ℃에서 20 분 동안 차가운 아세톤을 혼합물에 첨가하였다. 10 분 동안 4 ℃에서 15000 g로 원심 분리 한후, 펠렛(pellet)을 초음파 처리에 의해 1.2 % SDS를 함유하는 PBS에 용해시키고, PBS를 첨가하여 0.2 % 나트륨 도데실설페이트(sodium dodecylsulfate; SDS)로 희석시켰다. 샘플을 실온에서 3 시간 동안 회전시키면서 20 μL 스트렙타비딘 아가로스 비드(streptavidin agarose beads, Sigma Aldrich)와 함께 배양하였다. 비드는 0.2 % SDS를 함유하는 PBS로 4 회 세척되었다. 3x SDS 샘플 완충액으로 비등시켜 단백질을 용리시키고, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다.

1-11. 표면 플라즈몬 공명 어세이

표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SPR) 어세이는Biacore T100 기기(GE Healthcare)를 사용하여 수행하였다. 재조합 PDIA3 또는 DNAJC3 단백질은 CM5 센서 칩(GE Healthcare) 상의 카르복시기를 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노 프로필)-카보디이미드(N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)와 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide)의 1:1 혼합물로 활성화시킴으로써 아미드 결합을 통해 CM5 센서 칩에 고정시켰다. 단백질 고정화 반응은 PDIA3 및 DNAJC3에 대해 각각 pH 4.7 및 pH 5.0에서 0.005% Tween 20을 함유하는 PBS에서 수행되었다. 25℃에서 3 % DMSO 및 0.005 % Tween 20을 함유하는 PBS (pH 7.3)에 다양한 농도의 화합물을 주입함으로써 화합물과 단백질 사이의 결합을 모니터링하였다. Biacore T100 평가 소프트웨어(GE Healthcare)를 사용하여 1 : 1 결합 모델로 센서 그램(sensor grams)을 피팅함으로써 운동 파라미터를 계산하기 위해 데이터를 분석하였다.

1-12. PEG 말레이미드 모디피게이션 어세이

PEG 말레이미드(maleimide)를 사용한 시스테인 변형 분석은 논문(P. Kranz, F. Neumann, A. Wolf, F. Classen, M. Pompsch, T. Ocklenburg, J. Baumann, K. Janke, M. Baumann, K. Goepelt, H. Riffkin, E. Metzen, U. Brockmeier, PDI is an essential redox-sensitive activator of PERK during the unfolded protein response (UPR). Cell Death Dis. 8, e2986 (2017))을 따라 수행하였다.

화합물 처리 후, BiFC-tau HEK293 세포를 차가운 PBS로 세척하고, 얼음상에서 20 분 동안 PBS 중의 20mM N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide, NEM, Sigma Aldrich)와 인큐베이션하여 환원된 형태의 시스테인을 알킬화시키고 차가운 PBS로 세척한 후, 세포를 RIPA 완충액에 용해시켰다. 전체 세포 분석을 위해, 용해물을 4 ℃에서 5 분 동안 200 g으로 원심 분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 상청액의 단백질 농도는 Pierce BCA Protein Assay Kit에 의해 분석되었다. 동일한 양의 각 용해물을 12 mM의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine; TCEP, Sigma Aldrich)으로 20 분 동안 실온에서 처리하여 산화된 PDI의 형태를 감소시켰다. 용해물을 15mM의 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 5000 말레이미드 (methoxy polyethylene glycol 5000 maleimide; mPEG-mal5000, Sigma Aldrich)와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 용해물 및 brief vortex에 SDS 샘플 완충제를 첨가한 후, SDS 샘플을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 직접 사용하였다.

1-13. RNA 추출 및 정량 실시간 PCR

오토파지 관련 유전자의 레벨을 분석하기 위해, SH-SY5Y 세포를 5 μM SB1617의 존재 또는 부재하에 8 시간 동안 1 μM 탑시가르긴으로 처리 하였다. 제조사의 지침에 따라 RNeasy 키트(Qiagen)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. RNA를 NanoVue(GE Healthcare)를 사용하여 정량하고 cDNA를 제조사의 지시에 따라 AccuPower CycleScript RT PreMix dT20(Bioneer)]로 준비하였다. 정량적 RT-폴리머라제 연쇄 반응(Quantitative RT-polymerase chain reaction; qRT-PCR) 실험을 KAPA SYBR FAST ABI 프리즘 qPCR 마스터 믹스(KAPA Biosystems)를 사용하여 수행하였다. 데이터를 비교 Ct(comparative Ct) 방법으로 분석하고 하우스 키핑 유전자에 대해 정규화하였다.

1-14. 실험동물

CD-1 (ICR) 수컷 마우스 (2 ~ 3 개월, 체중 25 ~ 35g; DBL, 한국)를 TBI 연구에 사용하였다. 마우스를 조정된 환경 (22 ± 2 ℃, 55 ± 5 % 습도, 오전 8시에 불을 켠 12 시간 명/암 주기)으로 유지하고 한국 푸리나 (Purina)에 의해 표준식이를 받았다. 모든 쥐에게 물과 음식을 자유롭게 급식하였다. 운송과 관련된 스트레스를 피하고 최소화하기 위해, 동물이 환경 조건에 순응하도록 운송 후 1 주일 기간이 지난 뒤에 실험을 시작하였다. 동물 관리 프로토콜 및 실험 절차는 국립보건원 지침에 따라. 한림 대학교 동물 연구 및 연구위원회(프로토콜 # 한림 2018-82)에 의해 승인되었다.

1-15. 약동학 시험

CD-1 (ICR) 수컷 마우스 (7 주령, KOATECH, Korea)에 본 발명에 따른 화합물(SB1617, 5 % DMSO/35 % PEG-400/65 % DW)을 정맥 내 또는 복강 내로 투여(5 mg/kg, 3.3 mL/kg)한 후, 궤도 정맥 정맥망(orbital venous plexus)에서 지정된 시점에 혈액을 수집하였다. 혈장 샘플로부터 LC-MS/MS 분석기기(Agilent 1200, 4000 Qtrap)로 본 발명에 따른 화합물(SB1617)의 농도를 조사하였다. 약동학적 파라미터는 WinNonlin 소프트웨어 (Pharsight, USA)를 사용하여 혈장 농도-시간 플롯으로부터 수득되었다.

1-16. 혈액 뇌관문 침투 시험

CD-1 (ICR) 수컷 마우스 (7 주령, KOATECH, Korea)에 본 발명에 따른 화합물(SB1617, 5 % DMSO/35 % PEG-400/65 % DW)을 복강 내로 투여(5 mg/kg, 3.3 mL/kg)한 후, 궤도 정맥 정맥망(orbital venous plexus)에서 지정된 시점(0.5 시간 및 3 시간)에 헤파린-처리된 튜브를 이용하여 혈액 샘플을 수집하고 마우스를 희생시킨 다음 뇌 조직을 수거하였다. 혈장 및 뇌 균질액 샘플을 LC-MS/MS 분석기기(Agilent 1260, Agilent 6460)로 분석하였다. 뇌와 혈장에서의 본 발명에 따른 화합물(SB1617)의 비율을 계산하였다.

1-17. 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury; TBI)에 대한 실험 제어 피질 충격 모델

TBI에 대한 실험적으로 제어된 피질 충격(controlled cortical impact; CCI) 모델은 다음과 같이 수행되었다. 이소플루란 기화기(isoflurane vaporizer, VetEquip)를 사용하여 아산화질소(nitrous oxide)와 산소를 70:30로 혼합한 혼합물에 3 %로 흡입된 이소플루란으로 마우스를 깊게 마취시키고, 뇌정위고정장치(stereotaxic apparatus)에 위치시킨 다음, 1 ~ 1.5 % 이소플루란으로 유지하였다. 휴대용 드릴(중간선 2 mm, 브레그마 1 mm)을 사용하여 오른쪽 반구에 약 4 mm로 절개술을 시행하였다. 제어 피질 충격 장치(controlled cortical impact device, Leica Impact One, Leica Biosystems)를 사용하여 2 mm 납작한 팁(flat-tip)이 설치된 충격 장치를 5 m/sec 속도로 1.4 mm 깊이까지 가속하였다. 모든 동물 모델은 외래가 있을 때까지 수술 중 및 수술 후에 등온 담요 제어 장치(Harvard Bioscience)를 사용하여 36 ~ 37.5 ℃의 코어 온도로 유지되었다. 온라인 무작위 배정 도구(randomizer.org)에 따라 무작위로 외상성 뇌 손상 동물 모델을 제조하였다. 가짜 수술 그룹(Sham-operated groups)은 두개골 절개술만 수행하였다.

1-18. TBI에 대한 화합물 투여 시험

TBI 후의 뇌 손상에 대한 본 발명에 따른 화합물의 신경 보호 효과를 조사하기 위해, 본 발명에 따른 화합물(SB1617)을 5 mg/kg (5 % DMSO/50 % PEG-400/45 % DW)의 용량으로 하루 2 회 복강 내 투여하였다. 대조군 마우스를 동일한 부피의 비히클(vehicle)로 복강 내 투여하였다.

1-19. 조직 준비

마우스를 체중 당 0.01 mL/g로 식염수(0.9 % NaCl)에 우레탄(urethane, 1.5 g/kg)을 혼합하여 복강 내로 투여하여 깊게 마취시켰다. 발가락 핀치를 사용하여 마취의 효과를 평가하였다. 이어서, 마우스에 식염수를 심장 내로 관류시킨 후, PBS에 4 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 혼합하여 관류시켰다. 뇌를 1 시간 동안 4 % 파라포름알데히드로 고정하고 동결 보호를 위해 30 % 슈크로스에 담갔다. 그 후, 전체 뇌를 동결시키고 30 μm 두께의 극저온 마이크로톰(cryostat microtome, CM1850, Leica)상에서 관상 동맥 절편을 형성하였다.

1-20. 면역조직화학

내인성 퍼옥시다제(endogenous peroxidase) 활성을 억제하기 위해 절편(section)을 실온에서 20 분 동안 1.2 % H₂O₂에 침지시켰다. PBS로 세척한 후, 절편을 4 ℃에서 0.3 % 트리톤 X-100을 함유하는 PBS 중 마우스 모노클로날 항-NeuN 항체(anti-NeuN antibody, 1 : 500 희석, Millipore)와 밤새 인큐베이션하여 TBI 후 뉴런 손실을 평가하였다. PBS로 세척한 후, 절편을 비오티닐화된 항-마우스 IgG(biotinylated anti-mouse IgG, 1 : 250 희석, Vector)에서 배양하여 실온에서 2 시간 동안 TBI 후. NeuN 항체 및 비오티닐화된 항-랫트 IgG(biotinylated anti-rat IgG, 1 : 250 희석, Vector)를 검출하여 내인성 면역 글로불린 G(endogenous immunoglobulin G)의 누출 정도를 조사하였다. 그 후, 절편을 실온에서 2 시간 동안 아비딘-비오틴-퍼 옥시다제 복합체(avidin-biotin-peroxidase complex, Vector)에 침지시켰다. 인큐베이션 사이에서, 절편을 PBS로 세척하였다. 면역 반응을 0.015 % H₂O₂를 함유하는 0.01M PBS 중 3,3'-디아미노벤지딘(3,3’- diaminobenzidine, Sigma-Aldrich)으로 시각화하고, 절편을 젤라틴-코팅된 슬라이드에 장착하였다. 면역 반응은 올림푸스 IX70 도립 현미경 하에서 관찰되었다.

1-21. 면역 형광 분석

면역 형광 표지(Immunofluorescence labeling)는 기존에 알려진 일반적인 면역 염색 절차에 따라 수행되었다. 내인성 퍼옥시다제(endogenous peroxidase) 활성을 억제하기 위해 절편을 실온에서 15 분 동안 1.2 % H₂O₂에 침지시켰다. PBS로 세척한 후, 절편을 4℃에서 밤새 0.3 % 트리톤 X-100(Triton X-100)을 함유하는 PBS와 함께 각각의 특정 유형의 폴리클로날 또는 모노클로날 1 차 항체(of polyclonal or monoclonal primary antibody)를 인큐베이션하였다.

본 시험에 사용된 1 차 항체는 다음과 같다.

mouse monoclonal anti-4-hydroxynonenal (4-HNE; diluted 1:500; Alpha Diagnostic International),

mouse monoclonal anti-Tau (Tau5; diluted 1:500; Abcam),

mouse monoclonal anti-phospho Tau (Ser202, Thr205; AT8; diluted 1:200; Invitrogen),

mouse monoclonal anti-PDI (diluted 1:100; Abcam),

rabbit polyclonal anti-ERp57 (diluted 1:100; Abcam),

and goat polyclonal anti-Iba-1 antibody (diluted 1:500; Abcam).

PBS로 세척한 후, 절편에 형광-공액 2 차 항체(fluorescent-conjugated secondary antibodies, 1 : 250 희석, Invitrogen)를 적용하였다. 절편은 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI, 1 : 1000 희석; Invitrogen)로 대조 염색되었다. 형광-염색된 절편을 젤라틴-코팅된 슬라이드에 장착하고 DPX [Sigma-Aldrich]로 커버슬립(coverslipped)하였다. 공 초점 현미경(LSM 710; Carl Zeiss)을 사용하여 절편을 촬영하였다.

1-22. IHC/IF 데이터 정량

NeuN- 양성 세포를 세기 위해, 6 번째 절편마다 브레그마 후부를 1.2에서 2.1 mm까지 180 μm 간격으로 수집하였다. 20x 대물 렌즈를 갖는 현미경을 사용하여 각각의 마우스로부터 5 개의 관상 절편을 분석하였다. 이어서, 이들 절편을 코딩하여 해마 반구로부터의 해마 CA1 및 피질에서 총 NeuN-양성 세포의 수를 세도록 블라인드 실험자에게 제공하였다. 데이터는 각 영역 당 평균 NeuN- 양성 세포의 수로 표현되었다. PDI-, ERp57-, Tau5-, AT8-, 4HNE- 면역 형광 강도를 정량하기 위해, 5 개의 관상 절편(coronal sections)을 ImageJ(National Institute of Health)를 사용하여 블라인드 실험자가 평가하였다. 이미지를 ImageJ에 로드하고 메뉴 옵션(이미지/컬러/분할 채널)을 통해 8 비트로 변경하였다. 이미지를 이진화하고 메뉴 옵션(분석/측정)을 선택한 다음 각 면역 형광 신호를 평균 회색 값으로 표시하였다. 미세아교세포(microglia) 활성화를 분석하기 위해, 각각의 마우스로부터 5 개의 관상 절편이 스코어링을 위해 평가되었다. 미세아교세포 활성화 기준은 전술한 프로토콜로부터 변형된 방법에 따라 Iba-1 면역 반응성 세포의 수 및 강도와 이들의 형태를 기초로 설정되었다.

200 μm² 당 연속 공정을 갖는 Iba-1 면역 반응성 세포의 수는 하기 기준에 따라 더 높은 배율(30x 대물렌즈)의 이미지를 사용하여 수동으로 계수되었다:

0, 연속 염색된 프로세스가 있는 세포가 없음;

1, 연속 프로세스가 있는 세포가 1 - 9 개;

2. 연속 프로세스가 있는 세포가 10 - 20 개;

3. 연속 프로세스가 있는 세포가 > 20.

Iba-1 면역 반응성 세포의 형태를 하기 기준에 따라 분석하였다:

0, 0 %가 형태를 활성화(소마(soma)가 커지고 두꺼운 프로세스를 가지는 아모보이드(amoeboid) 형태);

1, Iba-1 면역 반응성 세포의 1 - 45 %가 활성화된 형태;

2, Iba-1 면역 반응성 세포의 45 - 90 %가 활성화된 형태;

3, Iba-1 면역 반응성 세포의 > 90 %가 활성화된 형태.

Iba-1 면역 반응성 세포의 강도를 하기 기준에 따라 분석하였다 :

0, 발현 없음;

1, 약한 발현;

2, 평균 발현;

3, 강한 발현.

총점은 상기 세 가지 항목의 점수를 합하여 0에서 9까지이다.

1-23. 신경학적 결손 평가

본 발명에 따른 화합물(SB1617)의 투여에 의하여 TBI로 유도된 신경학적 결손이 약화되었는지 여부를 평가하기 위해, 신경학적 심각도 점수 (neurological severity score; NSS)를 사용하여 신경학적 기능을 평가하였다. 평가는 1, 12, 24, 48, 및 72 시간 마다 수행되었으며, TBI 유도 또는 가짜 수술 후 7 일에 수행되었습니다. NSS는 반사 행동의 여부와 운동 수행 능력(근육 상태, 비정상적인 움직임), 그리고, 빔 보행(beam walking), 빔 밸런스(beam balance) 및 자발적 운동(spontaneous locomotion)과 같은 행동 과제를 바탕으로 마우스의 기능적 신경 상태를 평가한다. 평가는 0에서 10까지 등급을 매겨 수행되었다(0 = 정상 기능 ~ 10 = 최대 손실). 특정 작업을 수행하지 못하거나 테스트 한 반사 행동이 없는 경우 1 포인트가 부여된다. 따라서, 더 높은 점수는 더 심각한 부상이 있음을 의미한다.

1-24. 폴 클라이밍 시험

마우스의 운동 협응(motor coordination)을 분석하기 위해 폴 클라이밍(Pole climbing) 시험을 수행하였다. 마우스를 폴의 수직 끝단(지면에서 60cm 높이) 위에 올렸다. 그 후, 몸을 완전히 아래쪽으로 향하게하는 데 걸리는 시간(돌리는 시간)과 4 개의 발이 모두 바닥에 닿는 시간(마무리하는 시간)을 기록하였다. 최대 시험 시간은 60 초이다. 일정 시점에서 각 마우스를 3 회 시험한 다음 평균을 계산하여 통계 분석에 사용하였다.

1-25. 통계학적 분석

모든 통계학적 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad, San Diego, CA, USA)를 사용하여 수행되었다.

실시예 2: 합성시약

[화합물 1]

화합물 1의 합성 및 특성 분석은 이전에 보고된 것과 동일하다[참조 : Kim, J. et al. Diversity-Oriented Synthetic Strategy for Developing Chemical Modulator of Protein-Protein Interaction. Nat. Commun. 7, 13196 (2016)].

[화합물 2]

밝은 노란색 고체; R_f = 0.15 (DCM/MeOH = 20:1); 62% 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.04 (br d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 6.68 (br s, 1H), 4.16 (dd, J = 9.8, 4.7 Hz, 1H), 3.83 (m, 2H), 3.64 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 3.28 (ddd, J = 12.8, 6.9, 2.2 Hz, 1H), 3.09 (S, 6H), 1.10 (m, 21H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 167.4, 162.2, 157.7, 157.1, 92.4, 65.2, 64.5, 47.4, 42.0, 18.1, 12.0;

HRMS(ESI+): Calcd for C₁₉H₃₆N₅OSi⁺ [M+H]⁺ 378.2684, found 378.2682, Δppm -0.53; mp: 76-78 ℃.

[화합물 3]

노란색 오일; R_f = 0.36 (DCM/MeOH = 20:1); 61% 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.01 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.27 (m, 2H), 7.20 (m, 3H), 6.74 (br s, 1H), 4.18 (dd, J = 9.8, 4.3 Hz, 1H), 3.89 (m, 3H), 3.67 (t, J = 10.2 Hz, 1H), 3.60 (m, 1H), 3.30 (dd, J = 11.0, 7.4 Hz, 1H), 3.09 (s, 3H), 2.96 (m, 2H), 1.13 (m, 21H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 167.1, 162.1, 157.8, 157.0, 139.0, 128.8, 128.6, 126.5, 92.7, 65.2, 64.4, 54.8, 47.5, 40.8, 34.1, 18.1, 12.0;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₆H₄₂N₅OSi⁺ [M+H]⁺ 468.3153, found 468.3151, Δppm -0.43;

[화합물 4]

노란색 오일; R_f = 0.42 (DCM/MeOH = 20:1); 57% 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.24 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.27-7.15 (m, 5H), 6.40 (br s, 1H), 4.85 (d, J = 15.3 Hz, 1H), 4.38 (d, J = 15.3 Hz, 1H), 4.19 (dd, J = 9.6, 4.5 Hz, 1H), 4.04 (m, 1H), 3.78 (m, 2H), 3.65 (t, J = 9.8 Hz, 1H), 3.25 (ddd, J = 12.9, 7.0, 2.3 Hz, 1H), 1.37 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.24 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 1.12 (m, 21H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 168.1, 162.3, 157.2, 157.1, 139.8, 128.3, 127.6, 126.7, 96.4, 65.2, 64.8, 56.7, 47.2, 45.9, 21.2, 20.7, 18.1, 12.0;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₇H₄₄N₅OSi⁺ [M+H]⁺ 482.3310, found 482.3313, Δppm +0.62;

[화합물 5]

화합물 5의 합성 및 특성 분석은 이전에 보고된 것과 동일하다[참조: J. Kim, J. Jung, J. Koo, W. Cho, W. S. Lee, C. Kim, W. Park, S. B. Park, Diversity-oriented synthetic strategy for developing a chemical modulator of protein-protein interaction. Nat. Commun. 7, 13196 (2016)]

[화합물 6]

노란색 오일; R_f = 0.5 (DCM/MeOH = 20:1); 61% 전체 수율;

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 8.52 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.58 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.35 (br d, J = 5.4 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.32 (dd, J = 9.5, 4.6 Hz, 1H), 4.01 (dd, J = 12.7, 6.4 Hz, 1H), 3.95 (br s, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.76 (t, J = 10.3 Hz, 1H), 3.28 (dd, J = 12.7, 7.3 Hz, 1H), 1.17 (m, 21H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 168.9, 161.3, 161.1, 159.0, 158.1, 131.9, 129.7, 113.9, 107.2, 64.94, 64.92, 55.5, 47.9, 18.08, 18.07, 12.0;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₄H₃₇N₄O₂Si⁺ [M+H]⁺ 441.2680, found 441.2679, Δppm -0.22.

[화합물 7]

밝은 노란색 오일; R_f = 0.39 (DCM/MeOH = 20:1); 73% 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.15 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.30 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.86 (br s, 1H), 4.75, 4.68 (ABq, J _AB = 15.6 Hz, 2H), 4.18 (dd, J = 9.8, 4.3 Hz, 1H), 3.87 (m, 2H), 3.66 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 3.33 (dd, J = 11.0, 7.4 Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 1.12 (m, 21H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 167.3, 162.5, 157.2, 157.1, 136.0, 133.3, 129.2, 128.9, 92.8, 65.2, 64.6, 55.8, 47.3, 40.4, 18.1, 12.0;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₅H₃₉ClN₅OSi⁺ [M+H]⁺ 488.2607, found 488.2608, Δppm +0.20.

[화합물 8]

노란색 오일; R_f = 0.35 (DCM/MeOH = 20:1); 76% 전체 수율;

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 8.12 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.23 (m, 2H), 6.99 (m, 2H), 6.86 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 4.73, 4.66 (ABq, J _AB = 12.2 Hz, 2H), 4.16 (dd, J = 9.8, 4.9 Hz, 1H), 3.86 (m, 2H), 3.64 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 3.31 (ddd, J = 13.0, 7.1, 2.9 Hz, 1H), 2.99 (s, 3H), 1.09 (m, 21H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 167.4, 162.5, 162.3 (d, ¹ J _c,f = 244.4 Hz), 157.19, 157.17, 133.1 (d, ⁴ J _c,f = 3.0 Hz), 129.5 (d, ³ J _c,f = 7.6 Hz), 115.6 (d, ² J _c,f = 21.2 Hz), 92.8, 65.2, 64.6, 55.7, 47.3, 40.2, 18.1, 12.0;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₅H₃₉FN₅OSi⁺ [M+H]⁺ 472.2902, found 472.2904, Δppm +0.42.

[화합물 9]

노란색 오일; R_f = 0.35 (DCM/MeOH = 20:1); 67% 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.14 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.27 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.99 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.80 (br s, 1H), 4.76, 4.68 (ABq, J _AB = 15.4 Hz, 2H), 4.18 (dd, J = 9.8, 4.3 Hz, 1H), 3.87 (m, 2H), 3.66 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 3.33 (m, 1H), 3.02 (s, 3H), 1.16 (m, 21H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 167.3, 162.4, 157.2, 157.1, 139.3, 134.2, 129.3, 119.3, 92.8, 65.1, 64.5, 55.9, 47.3, 40.2, 18.1, 12.0; HRMS(ESI+):

Calcd for C₂₅H₃₉N₈OSi⁺ [M+H]⁺ 495.3011, found 495.3011.

[화합물 10]

옅은 노란색; R_f = 0.45 (EtOAc); 73.0 mg, 61 % 전체 수율;

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 8.12 (s, 1H), 7.79 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.07 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.62 (s, 1H), 5.90 (br d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.66, 4.62 (ABq, J _AB = 16.8 Hz, 2H), 4.49 (br s, 1H), 3.81 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 3.56 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 3.43 (dt, J = 13.6, 5.0 Hz, 1H), 3.06 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.97 (s, 3H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 166.3, 163.5, 156.2, 139.2, 138.7, 137.7, 135.0, 129.2, 129.0, 119.4, 103.4, 101.6, 87.7, 66.9, 58.0, 56.4, 48.7, 40.3;

IR (neat) ν_max: 2969, 2107, 1736, 1567, 1351, 1166, 733 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₂H₂₂IN₈O₃S⁺ [M+H]⁺ 605.0575, found 605.0577, Δppm +0.33; mp: 98-100 ℃.

실시예 3: 피리미도디아제핀 유도체 합성

3-1. 화합물 101 (화합물 SB1601) 합성

하기 반응식 1에 따라 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체인 화합물 101 (SB1601)을 합성하였다.

[반응식 1]

테트라히드로푸란(tetrahydrofuran; THF, 4 ml)에 화합물 1(90.0 mg, 0.198 mmol)을 혼합한 용액에 테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드 용액(tetra-n-butylammonium fluoride; TBAF, THF 중 1.0 M 용액, 0.257 ml, 0.257 mmol)을 첨가하고 실온(rt)에서 혼합물을 교반하였다. 반응의 완료 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO₃ (aq)로 켄칭하였다. 수득물을 디클로로메탄(dichloromethane; DCM)으로 2 회 추출 후, 무수 Na₂SO₄(s)로 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축시켰다.

DCM 4ml에 용해된 조 생성물(crude product) 용액에 p-톨루엔설포닐 클로라이드(p-toluenesulfonyl chloride; p-TsCl, 49.1 mg, 0.257 mmol)를 첨가한 다음, 혼합물을 실온에서 교반하였다. TLC로 나타낸 반응의 완료 후, 용매를 감압하에 제거하고 잔류물을 실리카겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(silica-gel flash column chromatography)로 정제하여 목적 생성물인 하기 SB1601(59.9 mg, 67 % 총 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.

화합물 101: SB1601

R_f = 0.39 (EtOAc);

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 8.12 (s, 1H), 7.44-7.32 (m, 7H), 7.18 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 6.62 (s, 1H), 5.71 (br d, J = 4.9 Hz, 1H), 4.73, 4.69 (ABq, J _AB = 16.5 Hz, 2H), 4.49 (br s, 1H), 3.75 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 3.56 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 3.40 (dt, J = 13.2, 4.9 Hz, 1H), 3.00 (s, 3H), 2.95 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.39 (s, 3H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 166.3. 163.5, 156.0, 144.7, 138.2, 134.9, 130.0, 128.8, 127.8, 127.7, 127.3, 103.5, 87.7, 66.8, 58.6, 56.4, 48.8, 40.0, 21.7;

IR (neat) ν_max: 3249, 1737, 1559, 1336, 1166, 678 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₃H₂₆N₅O₃S⁺ [M+H]⁺ 452.1751, found 452.1753, Δppm +0.44; mp: 150-152 ℃.

3-2. 화합물 102 (SB1602)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 4-메톡시벤젠설포닐 클로라이드(4-methoixybenzenesulfonyl cloride)를 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1602를 합성하였다.

화합물 102 : SB1602

흰색 고체; R_f = 0.30 (EtOAc); 65.7 mg, 71 % 전체 수율;

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 8.11 (s, 1H), 7.43-7.37 (m, 6H), 7.32 (m, 1H), 6.83 (m, 2H), 6.61 (s, 1H), 5.93(br d, J = 5.4 Hz, 1H), 4.73, 4.67 (ABq, J _AB = 16.3 Hz, 2H), 4.46 (br t, J = 4.9 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.75 (dd, J = 7.3, 2.0 Hz, 1H), 3.55 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 3.39 (dt, J = 13.3, 5.1 Hz, 1H), 2.99 (s, 3H), 2.96 (t, J = 7.1 Hz, 1H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 166.2, 163.6, 163.5, 155.9, 138.2, 129.9, 129.3, 128.7, 127.6, 127.2, 114.5, 103.3, 87.8, 66.8, 58.6, 56.3, 55.7, 48.7, 40.0;

IR (neat) ν_max: 3388, 2952, 1739, 1572, 1533, 1357, 1159, 673 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₃H₂₆N₅O₄S⁺ [M+H]⁺ 468.1700, found 468.1703, Δppm +0.64; mp: 121-123 ℃

3-3. 화합물 103 (SB1603)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 2-니트로벤젠설포닐 클로라이드(2-nitrobenzenesulfonyl chloride)를 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1603을 합성하였다.

화합물 103 : SB1603

노란색 고체; R_f = 0.30 (EtOAc); 55.4 mg, 58% 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.09 (s, 1H), 7.62 (m, 1H), 7.52 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.45 (m, 1H), 7.37 (m, 2H), 7.31 (m, 3H), 6.74 (s, 1H), 6.06 (br s, 1H), 4.88 (br s, 1H), 4.60 (s, 2H), 3.99 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 3.58-3.45 (m, 3H), 2.91 (s, 3H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 166.4, 163.9, 156.1, 148.2, 137.9, 134.5, 132.0, 131.7, 130.7, 128.7, 127.8, 127.4, 124.2, 102.0, 87.9, 68.3, 58.1, 56.7, 48.1, 40.0;

IR (neat) ν_max: 2912, 1540, 1353, 1169, 738, 699 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₂H₂₃N₆O₅S⁺ [M+H]⁺ 483.1445, found 483.1443, Δppm -0.41; mp: 80-82 ℃.

3-4. 화합물 104 (SB1604)의 합성

SB1604의 합성 및 특성 분석은 이전에 보고된 것과 동일하다[참조 : Kim, J. et al. Diversity-Oriented Synthetic Strategy for Developing Chemical Modulator of Protein-Protein Interaction. Nat. Commun. 7, 13196 (2016)].

화합물 104 : SB1604

3-5. 화합물 105 (SB1605)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 4-니트로벤젠설포닐 클로라이드(4-nitrobenzenesulfonyl chloride)를 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1605를 합성하였다.

화합물 105 : SB1605

옅은 노란색 고체; R_f = 0.3 (EtOAc); 53.5mg, 59% 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.16-8.14 (m, 3H), 7.51-7.40 (m, 7H), 6.54 (s, 1H), 5.65 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.71 (s, 2H), 4.53 (br s, 1H), 3.82 (dd, J = 7.4, 2.0 Hz, 1H), 3.64 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 3.45 (m, 1H), 3.05-3.01 (m, 4H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 166.4, 163.3, 156.2, 150.5, 143.6, 138.2, 129.1, 129.0, 127.5, 127.4, 124.5, 102.5, 87.5, 66.8, 58.9, 56.6, 48.6, 39.5;

IR (neat) ν_max: 2970, 1739, 1558, 1530, 1400, 1351, 1169, 738 cm^-1; HRMS(ESI+):

Calcd for C₂₂H₂₃N₆O₅S⁺ [M+H]⁺ 483.1445, found 483.1439, Δppm -1.24; mp: 97-99 ℃.

3-6. 화합물 106 (SB1606)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 4-플루오로벤젠설포닐 클로라이드(4-fluorobenzenesulfonyl chloride)를 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1606을 합성하였다.

화합물 106 : SB1606

흰색 고체; R_f = 0.4 (EtOAc); 56.8 mg, 63 % 전체 수율;

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 8.12 (s, 1H), 7.45-7.39 (m, 6H), 7.34 (m, 1H), 7.03 (m, 2H), 6.57 (s, 1H), 5.97 (br s, 1H), 4.72, 4.69 (ABq, J _AB = 16.5 Hz, 2H), 4.47 (br s, 1H), 3.77 (dd, J = 7.6, 2.2 Hz, 1H), 3.58 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 3.40 (dt, J = 13.2, 4.9 Hz, 1H), 2.99 (s, 3H), 2.97 (d, J = 7.5 Hz, 1H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 166.3, 165.6 (d, ¹ J _c,f = 255.1 Hz), 163.4, 156.0, 138.2, 133.9 (d, ⁴ J _c,f = 3.0 Hz), 130.5 (d, ³ J _c,f = 9.9 Hz), 128.8, 127.5, 127.3, 116.7 (d, ² J _c,f = 22.0 Hz), 103.0, 87.6, 66.7, 58.7, 56.4, 48.7, 39.7;

IR (neat) ν_max: 3245, 2921, 1571, 1351, 1169, 1155, 679 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₂H₂₃FN₅O₃S⁺ [M+H]⁺ 456.1500, found 456.1501, Δppm +0.22; mp: 105-107 ℃.

3-7. 화합물 107 (SB1607)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 메테인설포닐 클로라이드(methanesulfonyl chloride)를 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1607을 합성하였다.

화합물 107 : SB1607

흰색 고체; R_f = 0.25 (EtOAc); 55.8 mg, 75 % 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.14 (s, 1H), 7.37-7.26 (m, 5H), 6.58 (s, 1H), 5.92 (br d, J = 4.3 Hz, 1H), 4.73 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 4.64 (br s, 1H), 4.55 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 4.10 (dd, J = 7.6, 1.8 Hz, 1H), 3.92 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 3.60-3.47 (m, 2H), 2.96 (s, 3H), 2.73 (s, 3H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 166.6, 163.5, 156.1, 138.0, 128.7, 127.6, 127.3, 102.5, 87.3, 67.1, 58.2, 56.6, 48.7, 40.4, 38.5;

IR (neat) ν_max: 2912, 2109, 1571, 1538, 1350, 1168, 738 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₁₇H₂₂N₅O₃S⁺ [M+H]⁺ 376.1438, found 376.1437, Δppm -0.27; mp: 136-138 ℃.

3-8. 화합물 108 (SB1608)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 벤젠설포닐 클로라이드(benzenesulfonyl chloride)를 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1608을 합성하였다.

화합물 108 : SB1608

흰색 고체; R_f = 0.38 (EtOAc); 67.6 mg, 78% 전체 수율;

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 8.12 (s, 1H), 7.56 (m, 1H), 7.56 (m, 2H), 7.44-7.37 (m, 6H), 7.33 (m, 1H), 6.63 (s, 1H), 5.95 (br d, J = 4.9 Hz, 1H), 4.73, 4.69 (ABq, J _AB = 16.3 Hz, 2H), 4.50 (br t, J = 4.9 Hz, 1H), 3.75 (dd, J = 7.3, 1.5 Hz, 1H), 3.56 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 3.40 (dt, J = 13.2, 5.0 Hz, 1H), 3.00 (s, 3H), 2.93 (t, J = 6.8 Hz, 1H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 166.3, 163.5, 155.9, 138.2, 137.9, 133.6, 129.4, 128.8, 127.7, 127.6, 127.2, 103.2, 87.7, 66.8, 58.6, 56.3, 48.7, 40.0;

IR (neat) ν_max: 3380, 1739, 1536, 1352, 1170, 974, 723, 696 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₂H₂₄N₅O₃S⁺ [M+H]⁺ 438.1594, found 438.1595, Δppm +0.23; mp: 120-122 ℃.

3-9. 화합물 109 (SB1609)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 벤질설포닐 클로라이드(benzylsulfonyl chloride)를 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1609를 합성하였다.

화합물 109 : SB1609

흰색 고체; R_f = 0.32 (EtOAc); 54.5 mg, 61 % 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.11 (s, 1H), 7.39-7.35 (m, 2H), 7.30-7.21 (m, 8H), 6.60 (s, 1H), 5.76 (br s, 1H), 4.66, 4.50 (ABq, J _AB = 15.6 Hz, 2H), 4.32 (br s, 1H), 4.09 (s, 2H), 3.97 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 3.72 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 3.28 (m, 2H), 2.81 (s, 3H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 166.4, 163.6, 156.0, 138.0, 131.0, 129.1, 128.8, 128.7, 127.9, 127.7, 127.3, 102.2, 87.0, 68.0, 59.4, 57.7, 57.2, 48.1, 40.1;

IR (neat) ν_max: 2970, 1741, 1558, 1403, 1349, 1161, 1049, 969, 696 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₃H₂₆N₅O₃S⁺ [M+H]⁺ 452.1751, found 452.1747, Δppm -0.88; mp: 78-80 ℃.

3-10. 화합물 110 (SB1610)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 피리딘-3-설포닐 클로라이드(pyridine-3-sulfonyl chloride)를 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1610을 합성하였다.

화합물 110 : SB1610

흰색 고체; R_f = 0.15 (EtOAc); 53.8 mg, 62 % 전체 수율;

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆, 77 ^oC): 8.93 (s, 1H), 8.86 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.05 (m, 2H), 7.56 (dd, J = 7.3, 5.1 Hz, 1H), 7.38 (m, 2H), 7.30 (m, 3H), 6.97 (br s, 1H), 6.66 (s, 1H), 4.80 (br s, 1H), 4.66 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 4.66 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 3.71 (br d, J = 6.6 Hz, 1H), 3.52 (m ,1H), 3.33 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 3.04 (br s, 1H), 2.90 (s, 3H);

¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆, 77 ℃): 165.5, 162.9, 155.3, 153.8, 147.2, 137.9, 134.9, 134.2, 128.0, 127.1, 126.6, 124.0, 101.7, 86.7, 66.4, 57.0, 55.6, 47.6, 39.8; IR (neat) ν_max: 3313, 1732, 1555, 1353, 1171, 980, 957, 690 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₁H₂₃N₆O₃S⁺ [M+H]⁺ 439.1547, found 439.1553; Δppm +1.37, mp: 185-187 ℃.

흰색 고체; R_f = 0.15 (EtOAc); 53.8 mg, 62 % 전체 수율;

3-11. 화합물 111 (SB1611)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 2-티오펜설포닐 클로라이드(2-thiophenesulfonyl chloride)를 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1611을 합성하였다.

화합물 111 : SB1611

흰색 고체; R_f = 0.33 (EtOAc); 51.8 mg, 59 % 전체 수율;

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆): 8.10 (dd, J = 4.9, 1.5 Hz, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.57 (dd, J = 3.7, 1.2 Hz, 1H), 7.39-7.36 (m, 2H), 7.30-7.28 (m, 3H), 7.25 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 7.22 (dd, J = 4.9, 3.9 Hz, 1H), 6.60 (s, 1H), 4.75 (br s, 1H), 4.66 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 3.63 (dd, J = 7.3, 1.5 Hz, 1H), 3.52 (dt, J = 13.9, 5.0 Hz, 1H), 3.28 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 2.93 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 2.86 (s, 3H);

¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆): 165.6, 163.3, 155.7, 138.1, 136.9, 135.5, 134.1, 128.5, 127.5, 127.0, 102.0, 87.1, 66.6, 57.4, 56.1, 47.9, 40.2;

IR (neat) ν_max: 3241, 1739, 1577, 1542, 1355, 1166, 1026, 970, 674 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₀H₂₂N₅O₃S₂ ⁺ [M+H]⁺ 444.1159, found 444.1159; mp: 112-114 ℃.

3-12. 화합물 112 (SB1612)의 합성

화합물 1 대신 화합물 2를 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1612를 합성하였다.

화합물 112 : SB1612

노란색 고체; R_f = 0.27 (EtOAc); 41.8 mg, 52 % 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.37 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 8.12 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 8.06 (s, 1H), 6.69 (s, 1H), 5.93 (br s, 1H), 4.54 (br s, 1H), 3.85 (dd, J = 7.6, 1.4 Hz, 1H), 3.46 (m, 2H), 3.07 (s, 6H), 3.01 (t, J = 7.0 Hz, 1H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 166.8, 163.4, 156.1, 150.7, 144.2, 129.3, 124.6, 102.1, 88.3, 67.1, 56.5, 48.5, 43.2;

IR (neat) ν_max: 3409, 2924, 1579, 1524, 1351, 1313, 1171, 738, 685 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₁₆H₁₉N₆O₅S⁺ [M+H]⁺ 407.1132, found 407.1130, Δppm -0.49; mp: 118-120 ℃.

3-13. 화합물 113 (SB1613)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 4-니트로벤젠설포닐 클로라이드(4-nitrobenzenesulfonyl chloride)를 사용하고, 화합물 1 대신 화합물 3을 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1613를 합성하였다.

화합물 113 : SB1613

옅은 노란색 고체; R_f = 0.45 (EtOAc); 61.0 mg, 62 % 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.33 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 8.08 (s, 1H), 7.99 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.30-7.21 (m, 5H), 6.55 (s, 1H), 6.08 (br s, 1H), 4.54 (br s, 1H), 3.97 (m, 1H), 3.84 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 3.46 (m, 3H), 3.09 (s, 3H), 3.00 (m, 2H), 2.89 (m, 1H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 166.5, 163.5, 156.0, 150.6, 144.1, 139.6, 129.2, 128.9, 128.5, 126.2, 124.5, 102.6, 88.1, 67.0, 56.5, 54.5, 48.4, 42.5, 33.8;

IR (neat) ν_max: 3411, 1739, 1580, 1524, 1354, 1169, 738 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₃H₂₅N₆O₅S⁺ [M+H]⁺ 497.1602, found 497.1603, Δppm +0.20; mp: 108-110 ℃.

3-14. 화합물 114 (SB1614)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 4-니트로벤젠설포닐 클로라이드(4-nitrobenzenesulfonyl chloride)를 사용하고, 화합물 1 대신 화합물 4를 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1614를 합성하였다.

화합물 114 : SB1614

밝은 노란색 고체; R_f = 0.5 (EtOAc); 51.6 mg, 51% 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.28 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.05 (s, 1H), 7.92 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.28 (m, 2H), 7.18 (m, 1H), 6.85 (s, 1H), 5.82 (br s, 1H), 4.59 (m, 2H), 4.49 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 3.96 (m, 1H), 3.85 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 3.55 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 3.38 (m, 1H), 3.27 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 1.34 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.29 (d, J = 6.3 Hz, 3H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 167.0, 163.4, 155.9, 150.5, 144.2, 140.3, 128.9, 128.3, 127.9, 126.6, 124.6, 106.9, 87.5, 67.2, 56.7, 56.6, 48.3, 46.3, 20.7, 20.0;

IR (neat) ν_max: 2970, 1738, 1568, 1531, 1348, 1169, 1061, 737 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₄H₂₇N₆O₅S⁺ [M+H]⁺ 511.1758, found 511.1761, Δppm +0.59; mp: 85-87 ℃.

3-15. 화합물 115 (SB1615)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 4-니트로벤젠설포닐 클로라이드(4-nitrobenzenesulfonyl chloride)를 사용하고, 화합물 1 대신 화합물 5를 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1615를 합성하였다.

화합물 115 : SB1615

옅은 노란색 고체; R_f = 0.35 (EtOAc); 44.7 mg, 56 % 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.46 (s, 1H), 8.41 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.85 (s, 1H), 5.74 (br d, J = 3.9 Hz, 1H), 5.56 (s, 1H), 5.17 (s, 1H), 4.63 (br s, 1H), 3.91 (dd, J = 7.6, 1.8 Hz, 1H), 3.66 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 3.50 (m, 1H), 3.25 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 2.17 (s, 3H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 167.4, 162.8, 157.0, 150.8, 143.8, 142.1, 129.1, 124.9, 119.5, 114.5, 87.9, 67.0, 56.2, 48.9, 22.9;

IR (neat) ν_max: 3290, 2977, 1740, 1557, 1529, 1346, 1170, 907, 737 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₁₇H₁₈N₅O₅S⁺ [M+H]⁺ 404.1023, found 404.1023; mp: 200-202 ℃.

3-16. 화합물 116 (SB1616)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 4-니트로벤젠설포닐 클로라이드(4-nitrobenzenesulfonyl chloride)를 사용하고, 화합물 1 대신 화합물 6을 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1616을 합성하였다.

화합물 116 : SB1616

흰색 고체; R_f = 0.35 (EtOAc); 41.8 mg, 45 % 전체 수율;

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆): 8.41 (m, 3H), 8.03 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.65 (br d, J = 4.4 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.47 (s, 1H), 4.89 (br s, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.70 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 3.55 (m, 1H), 3.39 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 3.08 (t, J = 7.3 Hz, 1H);

¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆): 163.3, 162.5, 160.2, 156.6, 150.6, 142.5, 131.2, 129.6, 129.1, 125.1, 113.7, 113.5, 87.5, 66.9, 55.7, 55.3, 48.1;

IR (neat) ν_max: 3244, 3109, 3005, 1739, 1570, 1528, 1352, 1168, 740 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₁H₂₀N₅O₆S⁺ [M+H]⁺ 470.1129, found 470.1127, Δppm -0.43; mp: 250-252 ℃.

3-17. 화합물 117 (SB1617)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 4-니트로벤젠설포닐 클로라이드(4-nitrobenzenesulfonyl chloride)를 사용하고, 화합물 1 대신 화합물 7을 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1617을 합성하였다.

화합물 117 : SB1617

밝은 노란색; R_f = 0.40 (EtOAc); 58.3 mg, 57% 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.24 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 8.13 (s, 1H), 7.63 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.42, 7.35 (ABq, J _AB = 8.2 Hz, 4H), 6.56 (s, 1H), 5.73 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.67, 4.62 (ABq, J _AB = 17.0 Hz, 2H), 4.54 (br s, 1H), 3.84 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 3.61 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 3.45 (dt, J = 13.3, 4.7 Hz, 1H), 3.07 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 2.99 (s, 3H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 166.4, 163.4, 156.3, 150.6, 143.7, 136.8, 133.2, 129.1, 129.03, 128.95, 124.6, 102.8, 87.5, 67.0, 58.0, 56.5, 48.6, 40.1;

IR(neat) ν_max: 3248, 3016, 1739, 1565, 1529, 1350, 1169, 738 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₂H₂₂ClN₆O₅S⁺ [M+H]⁺ 517.1055, found 517.1053, Δppm -0.39; mp: 110-112 ℃.

3-18. 화합물 118 (SB1618)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 4-니트로벤젠설포닐 클로라이드(4-nitrobenzenesulfonyl chloride)를 사용하고, 화합물 1 대신 화합물 8을 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1618을 합성하였다.

화합물 118 : SB1618

밝은 노란색; R_f = 0.39 (EtOAc); 54.5 mg, 55 % 전체 수율;

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 8.24 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.12 (s, 1H), 7.69 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.36 (dd, J = 8.1, 5.6 Hz, 2H), 7.12 (t, J = 8.6 Hz, 2H), 6.61 (s, 1H), 5.76 (br d, J = 4.4 Hz, 1H), 4.64 (s, 2H), 4.54 (br s, 1H), 3.84 (dd, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 3.59 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 3.45 (dt, J = 13.7, 4.9 Hz, 1H), 3.07 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 2.98 (s, 3H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 166.4, 163.4, 162.3 (d, ¹ J _c,f = 244.4 Hz), 156.3, 150.6, 143.8, 133.8 (d, ⁴ J _c,f = 3.8 Hz), 129.3 (d, ³ J _c,f = 7.6 Hz), 129.0, 124.5, 115.7 (d, ² J _c,f = 21.3 Hz), 102.8, 87.6, 67.0, 57.9, 56.5, 48.6, 40.0;

IR (neat) ν_max: 3246, 3018, 1739, 1567, 1533, 1498, 1349, 1170, 739 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₂H₂₂FN₆O₅S⁺ [M+H]⁺ 501.1351, found 501.1353, Δppm +0.40; mp: 102-104 ℃.

3-19. 화합물 119 (SB1619)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 4-니트로벤젠설포닐 클로라이드(4-nitrobenzenesulfonyl chloride)를 사용하고, 화합물 1 대신 화합물 9를 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1619를 합성하였다.

화합물 119 : SB1619

옅은 노란색 고체; R_f = 0.40 (EtOAc); 61.2 mg, 59 % 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.24 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 8.11 (s, 1H), 7.72 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.61 (s, 1H), 5.86 (br d, J = 4.3 Hz, 1H), 4.64 (s, 2H), 4.54 (br s, 1H), 3.84 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 3.59 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 3.45 (dt, J = 13.4, 4.8 Hz, 1H), 3.08 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 2.98 (s, 3H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 166.4, 163.5, 156.2, 150.6, 143.8, 139.3, 134.9, 129.2, 129.0, 124.5, 119.4, 102.8, 87.6, 67.0, 58.0, 56.5, 48.6, 40.1;

IR (neat) ν_max: 2900, 2109, 1572, 1530, 1349, 1168, 738 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₂H₂₂N₉O₅S⁺ [M+H]⁺ 524.1459, found 524.1460, Δppm +0.19; mp: 88-90 ℃.

3-20. 화합물 120 (SB1620)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 4-플루오로벤젠설포닐 클로라이드(4-fluorobenzenesulfonyl chloride)를 사용하고, 화합물 1 대신 화합물 7을 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1620를 합성하였다.

화합물 120 : SB1620

흰색 고체; R_f = 0.40 (EtOAc); 57.2 mg, 59 % 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.11 (s, 1H), 7.50 (dd, J = 8.6, 4.7 Hz, 2H), 7.39, 7.33 (ABq, J _AB = 8.4 Hz, 4H), 7.10 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 6.56 (s, 1H), 5.92 (br d, J = 4.7 Hz, 1H), 4.65 (s, 2H), 4.48 (br s, 1H), 3.78 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 3.56 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 3.41 (dt, J = 13.5, 4.8 Hz, 1H), 2.99 (m, 4H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 166.2, 165.7 (d, ¹ J _c,f = 255.8 Hz), 163.5, 156.1, 136.8, 133.9 (d, ⁴ J _c,f = 3.0 Hz), 133.0, 130.5 (d, ³ J _c,f = 9.9 Hz), 129.1, 129.0, 116.8 (d, ² J _c,f = 22.8 Hz), 103.3, 87.6, 66.8, 57.9, 56.3, 48.7, 40.2;

IR (neat) ν_max: 3015, 1739, 1570, 1491, 1351, 1231, 1171, 1157, 678 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₂H₂₂ClFN₅O₃S⁺ [M+H]⁺ 490.1110, found 490.1112, Δppm +0.41; mp: 150-152 ℃.

3-21. 화합물 121 (SB1621)의 합성

p-톨루엔설포닐 클로라이드 대신 4-메톡시벤젠설포닐 클로라이드(4-methoxybenzenesulfonyl chloride)를 사용하고, 화합물 1 대신 화합물 7을 사용하여 상기 실시예 3-1.의 SB1601의 합성 절차에 따라 하기 SB1621을 합성하였다.

화합물 121 : SB1621

흰색 고체; R_f = 0.35 (EtOAc); 61.6 mg, 62 % 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.10 (s, 1H), 7.45 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.37, 7.32 (ABq, J _AB = 8.2 Hz, 4H), 6.88 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.57 (s, 1H), 5.85 (br s, 1H), 4.65 (s, 2H), 4.47 (br s, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.75 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 3.54 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 3.40 (dt, J = 13.2, 4.9 Hz, 1H), 2.99 (m, 4H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 166.1, 163.7, 163.5, 156.0, 136.9, 132.9, 129.9, 129.3, 129.2, 128.9, 114.6, 103.7, 87.7 (C11, d, J = 2.3 Hz), 66.9, 57.9, 56.3, 55.8 (C25, d, J = 2.3 Hz), 48.8, 40.3;

IR (neat) ν_max: 2970, 1739, 1574, 1496, 1349, 1161, 680 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₃H₂₅ClN₅O₄S⁺ [M+H]⁺ 502.1310, found 502.1310; mp: 156-158 ℃.

3-22. 화합물 122 (SB1622)의 합성

하기 반응식 2에 따라 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체인 SB1622를 합성하였다.

[반응식 2]

디클로로메탄(5 ml)에 SB1617(58.3 mg, 0.113 mmol)를 혼합한 용액에 Et₃N(0.032 ml, 0.226 mmol) 및 아세틸 클로라이드(AcCl, 0.010 ml, 0.147 mmol)를 0 ℃에서 순차적으로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 교반하고 실온으로 가온시켰다. 반응이 완료된 후, 결과물을 포화 NaHCO₃ (aq)로 켄칭하고 디클로로메탄으로 2 회 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 Na₂SO₄ (s)로 건조시키고, 여액을 감압하여 농축한 다음, 실리카겔 플래쉬 컬럼 크로마토 그래피를 이용하여 목적 생성물인 하기 SB1622 (51.2 mg, 81 % 수율, 흰색 고체)를 수득하였다.

화합물 122 : SB1622

R_f = 0.2 (Hexane/EtOAc = 1:1);

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.50 (s, 1H), 8.24 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.59 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.45, 7.39 (ABq, J _AB = 8.2 Hz, 4H), 6.47 (s, 1H), 4.81-4.65 (m, 3H), 4.45 (br s, 1H), 3.80 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 3.38 (br s, 1H), 3.14 (s, 3H), 2.96 (dd, J = 7.8, 5.5 Hz, 1H), 2.06 (s, 3H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 171.1, 165.8, 161.0, 156.1, 150.6, 144.0, 135.7, 133.7, 129.3, 128.9, 128.6, 124.8, 86.3, 69.1, 58.2, 57.6, 46.1, 40.2, 23.6;

IR (neat) ν_max: 2970, 1739, 1674, 1559, 1530, 1350, 1229, 1169, 738 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₄H₂₄ClN₆O₆S⁺ [M+H]⁺ 559.1161, found 559.1175, Δppm +2.50, mp: 105-107 ℃.

3-23. 화합물 123 (SB1623)의 합성

아세틸 클로라이드 대신 사이클로프로판카보닐 클로라이드를 사용하여 상기 실시예 3-22.의 SB1622의 합성 절차에 따라 하기 SB1623을 합성하였다.

화합물 123 : SB1623

밝은 노란색; R_f = 0.35 (Hexane/EtOAc = 1:1); 56.2 mg, 85 % 전체 수율;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.53 (s, 1H), 8.23 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.59 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.45, 7.40 (ABq, J _AB = 8.2 Hz, 4H), 6.51 (s, 1H), 4.74 (m, 3H), 4.45 (br s, 1H), 3.75 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 3.40 (br d, J = 8.6 Hz, 1H), 3.14 (s, 3H), 2.94 (m ,1 H), 1.63 (m, 1H), 1.05 (m, 2H), 0.81 (m, 1H), 0.70 (m, 1H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 174.8, 165.9, 161.0, 156.1 (C2, d, J = 3.8 Hz), 150.6, 144.0, 135.7, 133.7, 129.3, 128.9, 128.7, 124.8, 86.4, 69.0, 58.2, 57.6, 46.5, 40.2 (C25, d, J = 3.7 Hz), 14.0;

IR (neat) ν_max: 2970, 1739, 1665, 1558, 1530, 1398, 1350, 1168, 738 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₆H₂₆ClN₆O₆S⁺ [M+H]⁺ 585.1318, Δppm +1.03; found 585.1324; mp: 124-126 ℃.

3-24. 화합물 124 (SB1624)의 합성

하기 반응식 3에 따라 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체인 SB1624를 합성하였다.

[반응식 3]

디메틸포름아미드(dimethylformamide; DMF, 6 mL)에 화합물 10(73.0 mg, 0.121 mmol)을 혼합한 용액에 트리메틸실릴아세틸렌(0.033 mL, 0.242 mmol), Pd(PPh₃)₂Cl₂(8.50 mg, 0.012 mmol, 10 mol %), 구리(I) 아이오다이드(CuI, 11.6 mg, 0.061 mmol) 및 트리메틸아민(trimethylamine; TEA, 0.051 mL, 0.363 mmol)을 첨사하고, 생성된 혼합물을 실온에서 교반하였다. 반응의 완료 후, 반응 혼합물을 포화 NH₄Cl (aq)로 켄칭하고, 수득물을 에틸 아세테이트로 2 회 추출하였다. 유기층을 무수 Na₂SO₄(s)로 건조시키고, 여과하였다. 여과액을 감압하에 농축 한 후, 실리카겔 플래쉬 컬럼 크로마토 그래피를 이용하여 중간체 B(54.0 mg, 81 % 수율)를 수득하였다. THF(2 mL)에 중간체 B(54.0 mg, 0.098 mmol)를 혼합한 용액에 TBAF(THF 중 1.0 M 용액, 0.127 mL, 0.127 mmol)를 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 반응의 완료 후, 용매를 감압하에 제거하고 잔류물을 실리카겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물인 하기 SB1624(25.1 mg, 51 % 수율, 41 % 전체 수율, 노란색 고체)를 수득하였다.

화합물 124 : SB1624

R_f = 0.45 (EtOAc);

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.14 (s, 1H), 7.53 (s, 4H), 7.37 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.08 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.63 (s, 1H), 5.57 (br s, 1H), 4.66 (s, 2H), 4.49 (br s, 1H), 3.81 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.57 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.43 (m, 1H), 3.31 (s, 1H), 3.02 (m, 4H);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 166.3, 163.3, 155.9, 139.2, 137.9, 135.0, 133.0, 129.3, 128.0, 127.7, 119.4, 103.4, 87.7, 81.80, 81.78, 66.9, 58.0, 56.4, 48.8, 40.3;

IR (neat) ν_max: 3373, 3215, 2955, 2102, 1737, 1574, 1353, 1166, 973 cm^-1;

HRMS(ESI+): Calcd for C₂₄H₂₃N₈O₃S⁺ [M+H]⁺ 503.1608, found 503.1607, Δppm -0.20; mp: 139-141 ℃.

3-25. 화합물 125 (SB1625) ~ 화합물 136 (SB1636)의 합성

[화합물 125] SB1625

밝은 노란색 고체;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.29 - 8.22 (m, 2H), 8.15 (s, 1H), 7.66 - 7.60 (m, 2H), 7.44 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.56 (s, 1H), 5.49 (m, 1H), 4.66 (m, 2H), 4.54 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.62 (m, 1H), 3.52 - 3.42 (m, 1H), 3.08 (m, 1H), 3.00 (s, 3H);

LRMS(ESI+): Calcd for C₂₂H₂₂ClN₆O₅S⁺ [M+H]⁺ 517.11, found 517.05

[화합물 126] SB1626

하얀색 고체;

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 8.13 (s, 1H), 7.32 - 7.28 (m, 2H), 7.27 - 7.25 (m, 2H), 6.71 (s, 1H), 5.88 (m, 1H), 5.54 (m, 1H), 5.29 (m, 1H), 5.23 (m, 1H), 4.83 (m, 1H), 4.62 - 4.56 (m, 4H), 4.07 - 4.01 (m, 1H), 3.90 (m, 1H), 3.56 (m, 1H), 3.48 (m, 1H), 2.96 (s, 3H);

LRMS(ESI+): Calcd for C₂₀H₂₃ClN₅O₃ ⁺ [M+H]⁺ 416.15, found 416.05

[화합물 127] SB1627

하얀색 고체;

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃:MeOD = 95:5, MeOD shim): 8.04 - 7.99 (m, 2H), 7.66 (s, 1H), 7.51 - 7.48 (m, 2H), 7.38 (m, 4H), 4.77 (m, 4H), 4.28 (m, 1H), 4.22 (m, 1H), 3.81 - 3.69 (m, 2H), 3.34 (m, 1H), 2.89 (s, 3H);

LRMS(ESI+): Calcd for C₂₂H₂₄ClN₆O₅S⁺ [M+H]⁺ 519.12, found 519.05

[화합물 128] SB1628

하얀색 고체;

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃:MeOD = 2:1, MeOD shim): 8.13 - 8.09 (m, 2H), 7.73 (s, 1H), 7.58 - 7.54 (m, 2H), 7.42 - 7.38 (m, 2H), 7.35 - 7.31 (m, 2H), 6.08 (s, 1H), 4.83 - 4.70 (m, 2H), 3.97 (m, 1H), 3.67 (m, 1H), 3.49 (m, 1H), 3.39 (m, 1H), 3.36 (m, 1H), 3.16 (s, 3H), 1.99 (m, 1H), 1.78 (m, 1H);

LRMS(ESI+): Calcd for C₂₃H₂₄ClN₆O₅S⁺ [M+H]⁺ 531.12, found 531.05

[화합물 129] SB1629

하얀색 고체;

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 8.29 (m, 2H), 8.06 (s, 1H), 7.69 (m, 2H), 7.48 - 7.43 (m, 2H), 7.43 (s, 2H), 7.38 (m, 2H), 6.92 (m, 2H), 6.68 (s, 1H), 5.08 (m, 1H), 4.83 (m, 1H), 4.69 - 4.60 (m, 2H), 3.87 (m, 1H), 3.44 (m, 1H), 3.09 (m, 4H).

LRMS(ESI+): Calcd for C₂₉H₂₅ClFN₆O₆S⁺ [M+H]⁺ 639.12, found 639.10

[화합물 130] SB1630

하얀색 고체;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.32 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.25 (s, 1H), 7.93 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.28 (m, 2H), 6.71 (s, 1H), 4.71 (m, 1H), 4.52 (m, 2H), 3.97 (m, 1H), 3.75 (m, 1H), 3.58 (m, 1H), 3.46 (m, 1H), 3.38 (m, 1H), 3.05 (m, 1H), 2.97 (s, 3H), 1.19 (t, J = 7.0 Hz, 3H);

LRMS(ESI+): Calcd for C₂₄H₂₆ClN₆O₅S⁺ [M+H]⁺ 545.14, found 545.05

[화합물 131] SB1631

하얀색 고체;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.25 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 8.14 (s, 1H), 7.70 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.56 (s, 1H), 5.53 (m, 1H), 4.91 (s, 1H), 4.81 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 4.58 (d, J = 16.2 Hz, 1H), 3.53 (m, 1H), 3.35 (m, 1H), 3.01 (s, 3H), 2.98 (m, 1H), 2.54 (m, 1H);

LRMS(ESI+): Calcd for C₂₂H₂₂ClN₆O₄S₂ ⁺ [M+H]⁺ 533.08, found 533.15

[화합물 132] SB1632

하얀색 고체;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.12 (s, 1H), 7.30 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.75 (s, 1H), 5.52 (m, 1H), 5.14 (m, 1H), 4.69 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 4.44 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 3.58 (m, 1H), 3.25 (m, 1H), 3.19 (m, 1H), 3.06 (m, 1H), 2.95 (s, 3H), 1.43 (s, 9H);

LRMS(ESI+): Calcd for C₂₁H₂₇ClN₅O₂S⁺ [M+H]⁺ 448.16, found 448.25

[화합물 133] SB1633

하얀색 고체;

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 8.28 (s, 1H), 8.17 - 8.13 (m, 2H), 7.38 - 7.33 (m, 2H), 7.30 - 7.27 (m, 2H), 7.25 (m, 2H), 6.96 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 5.43 (m, 1H), 5.25 (m, 1H), 4.42 (d, J = 14.8 Hz, 2H), 3.66 (m, 1H), 3.44 - 3.34 (m, 2H), 3.17 (m, 1H), 2.91 (s, 3H);

LRMS(ESI+): Calcd for C₂₃H₂₃ClN₇O₃S⁺ [M+H]⁺ 512.13, found 512.05

[화합물 134] SB1634

하얀색 고체;

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 8.33 - 8.25 (m, 3H), 7.52 (m, 2H), 7.45 (m, 2H), 7.36 (m, 2H), 5.79 (s, 1H), 5.53 (m, 1H), 4.94 (m, 2H), 4.48 (m, 1H), 3.59 (m, 1H), 3.42 (m, 1H), 3.10 (m, 1H), 3.03 (s, 3H), 2.92 (m, 1H);

LRMS(ESI+): Calcd for C₂₂H₂₂ClN₆O₆S₂ ⁺ [M+H]⁺ 565.07, found 565.00

[화합물 135] SB1635

하얀색 고체;

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 8.18 (m, 2H), 8.14 (s, 1H), 7.56 (m, 2H), 7.33 (m, 2H), 7.01 (m, 2H), 6.56 (s, 1H), 5.62 (m, 1H), 4.63 (m, 2H), 4.55 (m, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.84 (m, 1H), 3.63 (m, 1H), 3.47 (m, 1H), 3.07 (m, 1H), 2.99 (s, 3H);

LRMS(ESI+): Calcd for C₂₃H₂₅N₆O₆S⁺ [M+H]⁺ 513.16, found 513.10

[화합물 136] SB1636

하얀색 고체;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 8.42 (m, 2H), 8.13 (m, 2H), 8.12 (s, 1H), 6.46 (s, 1H), 5.02 (m, 1H), 4.89 (m, 1H), 4.44 (m, 1H), 3.92 (m, 1H), 3.65 (m, 1H), 3.44 (m, 1H), 3.21 (m, 1H), 3.07 (d, J = 4.7 Hz, 3H);

LRMS(ESI+): Calcd for C₁₅H₁₇N₆O₅S⁺ [M+H]⁺ 393.10, found 393.00

시험예 1: 타우 응집 억제 효과 확인

1-1. 상기 실시예 1-15에 기재된 방법에 따라 HEK293 인간 배아 신장 세포를 사용하여 비너스-기반(Venus-based) 이분자 형광 보완-타우((bimolecular fluorescence complemented-tau; BiFC-tau)의 발현을 확인함으로써 표현형 기반 스크리닝을 수행하였다.

도 1은 본 실시예예 따른 타우 응집을 모니터링하기 위한 BiFC-tau Venus HEK293 세포 시스템을 도시한 것이다. N-말단 비너스 (VN173) 및 C-말단 비너스 (VC155) 단편 서열은 전장(full-length) 인간 타우 (hTau441) 서열과 융합되어 BiFC-tau Venus HEK293 세포 시스템을 형성한다. 융합된 두 벡터 hTau441-VN173 및 hTau441-VC155의 공동 발현 여부를 통해 비너스 형광의 턴-온/오프(turn-on/off) 신호를 모니터링함으로써 용해성 타우 이량체를 측정할 수 있다.

타우 응집의 자극제로서, sarco/endoplasmic reticulum Ca₂ ⁺-ATPase의 직접적인 억제제인 탑시가르긴(thapsigargin, TG; ER 스트레스 유도제)를 사용하였다. 이것은 칼슘 항상성을 교란시킨다. 탑시가르긴 처리는 타우 이량체화(타우 응집)을 유도하며 이는 BiFC-tau 비너스 형광 턴온(BiFC-tau Venus fluorescence turn-on)을 통해 확인할 수 있다.

세포를 24 시간 동안 80 nM 탑시가르긴 및 10 μM의 SB1617 화합물로 공동 처리하였다. FITC 채널 이미지는 BiFC-Venus의 형광을 보여주며, DAPI 채널 이미지는 FITC 채널과 동일한 영역의 세포 핵을 보여준다. 도 2에 나타난 바와 같이, FITC 채널 이미지에 표시된 것처럼 SB1617은 탑시가르긴(TG) 처리에 의해 유도된 BiFC-Venus 형광을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 화합물 스크리닝을 통해 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 피리미도디아제핀 유도체는 BiFC-tau 비너스 형광을 효과적으로 억제함을 확인하였으며, 하기 표 1에서 BiFC-tau-Venus 형광 강도는 HEK293-BiFC-tau-Venus 세포에서 24 시간 동안 10 μM SB16xx 계열 화합물과 80 nM 탑시가르긴을 공동 처리할 때 % 값으로 표시되었다.

화합물 번호	BiFC-tau intensity (%), (IC₅₀)
101 (SB1601)	65, (9.1 ± 0.9)
102 (SB1602)	79
103 (SB1603)	102
104 (SB1604)	115
105 (SB1605)	46, (5.2 ± 0.5)
106 (SB1606)	81
107 (SB1607)	94
108 (SB1608)	105
109 (SB1609)	84
110 (SB1610)	130
111 (SB1611)	110
112 (SB1612)	90
113 (SB1613)	71
114 (SB1614)	47, (6.9 ± 0.9)
115 (SB1615)	99
116 (SB1616)	135
117 (SB1617)	36, (1.9 ± 0.5)
118 (SB1618)	55, (7.6 ± 1.2)
119 (SB1619)	56, (4.6 ± 2.1)
120 (SB1620)	81
121 (SB1621)	51, (6.6 ± 0.6)
122 (SB1622)	81
123 (SB1623)	78
124 (SB1624)	50, (8.1 ± 0.6)
125 (SB1625)	98
126 (SB1626)	100
127 (SB1627)	100
128 (SB1628)	95
129 (SB1629)	70
130 (SB1630)	70
131 (SB1631)	98
132 (SB1632)	80
133 (SB1633)	94
134 (SB1634)	100
135 (SB1635)	57
136 (SB1636)	101

특히. SB1617은 BiFC-tau 비너스 형광을 1.9 μM의 절반-최대 억제 농도(IC₅₀)로 효과적으로 억제함을 알 수 있었다.

추가적으로, 용량에 따른 응집 효과를 확인하기 위해, BiFC-tau 비너스 HEK293 세포에서 20 시간 동안 다양한 농도의 SB1617 또는 SB1607와 80 nM TG를 공동 처리하는 경우의 비너스 형광 강도 변화를 확인하였다. 그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, SB1617의 효과는 용량 의존적임을 확인할 수 있었다. 한편, SB1617의 설폰아미드 그룹에서 방향족 고리를 제거하여 SB1617 화학적 구조를 단순화(SB1607)하면 활성이 손실되어 타우 응집 억제 효과가 특정 화합물-표적 상호 작용에 의존한다는 것을 알 수 있었다.

1-2. 상기 실시예 1-7에 기재된 면역블롯팅 방법에 따라 BiFC-tau venus HEK293 세포에서 20 시간 동안 SB1617, SB1607 및 80nM 탑시가르긴을 처리한 후 총 타우(Tau5) 및 포스포 타우 (S199, T231) 레벨을 측정하였다. 그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 탑시가르긴 처리가 p-tau뿐만 아니라 전체 타우 레벨을 증가시키는 반면, SB1617 처리는 모든 타우 레벨을 감소시킴을 확인할 수 있었다.

1-3. 탑시가르긴 처리시 전체 타우 레벨의 증가는 단백질 합성 자극에 기인한 것으로 보인다. 유사하게, 프리온(prion) 및 돌연변이 타우(mutant tau)와 같은 응집되기 쉬운 단백질의 발현은 ER 스트레스에 의해 촉진되었다. 스트레스 자극 시 전사 변화의 영향을 배제하기 위해, 상기 실시예 1-6에 기재된 방법에 따라 DsRed와 tau EGFP 서열 사이에 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site; IRES)를 함유하는 비시스트로닉 세포(bicistronic cell)인 DsRed-IRES-tau EGFP를 사용하한 유세포 분석을 수행하였다. 그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 화합물 처리시 EGFP-to-DsRed 형광 비율의 변화는 전사 변경(transcriptional alteration)에 관계없이 클리어런스(clearance) 경로를 통한 타우 레벨의 변화를 나타냄을 확인할 수 있었다.

또한, 도 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 탑시가르긴 처리 시 EGFP-to-DsRed 신호 비율이 약간 증가한 것으로 나타났지만 탑시가르긴과 SB1617의 공동 처리 시에는 EGFP-to-DsRed 신호 비율이 감소하여 SB1617이 타우 클리어런스를 촉진하여 타우 단백질 항상성(proteostasis)을 조절하였음을 알 수 있었다. 이로써, 본 발명에 따른 SB1617이 단백질 항상성을 조절함으로써 과다 발현되고 응집되기 쉬운 타우 단백질의 응집을 억제함을 알 수 있었다.

시험예 2: 표적 단백질 분석

2-1. 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체의 작용 메커니즘을 규명하기 위해, 상기 실시예 1-8에 기재된 TS-FITGE 방법에 따라 표적 단백질 분석을 수행하였다.

그 결과 도 8에 나타난 바와 같이, 더 높은 온도에서 처리된 샘플의 2D 겔 전기 영동 이미지에 여러 개의 적색 스팟이 나타났으며, 이는 SB1617과의 특이적 상호 작용에 의해 단백질의 열 안정성이 개선되었음을 나타낸다. 그러나, 이들 단백질은 불활성 화합물 또는 비히클에 의해서는 안정화되지 않았다. 상기 적색 스팟들은 열 변성이 완전히 사라지면 또한 사라졌다. 상기 열 안정성 단백질 (적색 스팟)은 질량 분석법을 통해 동정하였고, 그 결과 DNAJC3 및 PDIA3임을 확인하였다.

2-2. 본 발명에 따른 화합물(SB1617)과 DNAJC3 및 PDIA3간의 특이적 결합여부를 확인하기 위해, 상기 실시예 1-9의 CETSA 및 실시예 1-10의 풀-다운 어세이를 수행하였다. 그 결과 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물(SB1617)은 DNAJC3 및 PDIA3에 대하여 특이적으로 결합함을 확인할 수 있었다.

추가적으로, 상기 실시예 1-11의 표면 플라즈몬 공명 분광법(Surface plasmon resonance; SPR)을 통해 SB1617이 PDIA3 및 DNAJC3과 직접 결합하는지 여부를 확인하였다. 그 결과 도 11에 나타낸 바와 같이, SB1617은 농도가 증가함에 따라 PDIA3 (도 11 A) 및 DNAJC3 (도 11 B)와 결합 정도가 증가함을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 화합물(SB1617)은 DNAJC3 및 PDIA3에 대하여 직접적으로 결합하고 있음을 알 수 있었다.

시험예 3: 표적 단백질과의 상호작용 검증

3-1. 상기 실시예 1-4에 기재된 방법에 따라 BiFC-tau 세포 및 DsRed-IRES-EGFP-tau HEK293 세포에 PDIA3 및 DNAJC3의 발현을 억제하는 siRNA를 도입하고, 도입 48시간 후 100 nM TG를 처리하고, tau-Venus 강도, p-tau 수준 및 EGFP-to-DsRed 강도 비율 변화를 측정하였다. 이때, BiFC-tau 세포는 20 시간 동안, DsRed-IRES-EGFP-tau HEK293 세포는 18시간 동안 처리하였다. 그 결과 도 12 내지 도 14에 나타낸 바와 같이, PDIA3 및 DNAJC3의 발현을 억제하는 경우 tau-Venus 강도, p-tau 수준 및 EGFP-to-DsRed 강도 비율이 감소하여 SB1617의 세포 내 활성과 동일한 표현형을 가짐을 확인할 수 있었다.

3-2. PDIA3는 공지된 PDI 환원 효소이기 때문에 PDIA3 녹다운은 PDI 산화를 촉진해야한다. 따라서, PDIA3와 SB1617의 상호 작용이 PDI 산화를 향상시킬 수 있는지 평가하기 위해, 상기 실시예 1-12에 기재된 PEG- 말레이미드 변형 분석(PEG-maleimide modification assay)을 수행하였다. 보다 구체적으로, BiFC-tau HEK293 세포를 3.5 시간 동안 200 nM TG 및 40 μM SB1617로 처리하였다. 환원된 형태 및 산화된 형태의 PDI의 대조군으로서, 10mM 1,4-디티오트레이톨(DTT) 및 5mM 테트라메틸아조디카르복스아미드(DA)를 각각 15 분 동안 세포에 첨가하였다. 시스테인 중의 유리 티올은 저분자량 말레이미드 분자로 사전-알킬화(pre-alkylated)되어 산화되거나, 이황화 결합된 시스테인으로 남았다. 상기 시스테인을 이황화 환원 단계 후, 고 분자량 PEG-말레이미드(5 kDa)로 알킬화시켰다. 2 개의 상이한 분자량을 갖는 말레이미드는 산화되고 환원된 형태의 PDI의 밴드가 전기 영동에 의해 용이하게 분리되도록 한다. 그 결과 도 15에 나타낸 바와 같이, 탑시가르긴 단독으로 처리한 경우와 비교하여 SB1617과 탑시가르긴을 공동 처리한 경우, 환원된 형태에서 산화된 형태로 PDI 형태가 상당히 전화됨을 확인할 수 있었다. 이로부터, SB1617이 PDIA3의 세포 기능을 교란시킨다는 것을 알 수 있었다.

시험예 4: PERK 신호전달 억제에 대한 방지 효과 학인

4-1. PDIA3 및 DNAJC3는 모두 ER 멤브레인 상의 ER 스트레스 센서인 단백질 키나제-유사 소포체 키나제(protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase; PERK) 신호의 활성화를 억제하는 것으로 보고되었다. PERK 신호의 억제에서 DNAJC3 및 PDIA3의 기능적 역할을 확인하기 위해, BiFC-tau HEK293 세포에 siRNA를 도입하고, 도입 48시간 후 200 nM TG를 6시간 동안 처리하고 면역 블롯 분석을 통해 PERK 다운 스트림 경로의 변경(alteration) 여부를 확인하였다.

그 결과 도 16에 나타낸 바와 같이, PDIA3 또는 DNAJC3의 억제는 타우-과발현 세포에서 탑시가르긴 처리시 p-타우의 비정상적인 증가를 억제하고, PERK 신호 전달 경로에서 PDIA3 및 DNAJC3의 기능을 억제하는 eIF2a(eukaryotic translation initiation factor)의 인산화 및 ATF4를 포함한 PERK의 다운 스트림 신호를 상향 조절(upregulated)함을 확인할 수 있었다.

4-2. PDIA3 및 DNAJC3는 PERK 신호 전달 경로를 억제함으로써 타우 응집을 조절하는 역할을 수행한다. 이에, 인간 신경아세포종 SH-SY5Y 세포(human neuroblastoma cells)에 10 μM SB1617을 처리하고 탑시가르긴을 처리 또는 미처리하고 시간에 따른 PERK 활성화 여부를 확인하였다. 그 결과 도 17에 나타난 바와 같이, SB1617은 PERK 활성화를 연장시켰으며, p-PERK 및 p-eIF2a의 레벨을 지속적으로 유지하는 것으로 나타났으며, 탑시가르긴 처리에 의해 유도된 스트레스 조건 하에서 ATF4를 상향 조절함을 확인할 수 있었다.

한편, 도 18에 나타낸 바와 같이, 세포 스트레스가 없는 경우에는, SB1617에 의한 다운 스트림 PERK 신호 전달의 활성화는 유의적이지 않았다. SB1617의 스트레스-반응 효능은 PDIA3 및 DNAJC3 수준의 상향 조절(upregulation) 또는 ER 스트레스 조건에서 파트너 단백질의 산화 환원 상태의 변화에 기인할 수 있다.

시험예 5: 단백질 항상성(proteostasis) 조절능 확인

5-1. eIF2a의 인산화는 대부분의 mRNA의 번역 억제를 초래하여 ER 부하를 크게 감소시킴으로써 세포가 생존할 수 있게 한다. 이를 확인하기 위해, SH-SY5Y 세포를 지시된 시간 동안 10 μM SB1617로 처리한 다음, 새로 합성된 단백질을 10 ㎍/mL 푸로마이신으로 10 분 동안 표지하고 항-푸로마이신 항체 염색에 의해 가시화하였다. 그 결과 도 19에 나타낸 바와 같이, 탑시가르긴 처리시, 단백질 합성은 일시적으로 억제되고, 이후 시점에서 회복되는 것으로 나타났다. 반면, SB1617이 탑시가르긴과 함께 처리될 때, 단백질 합성의 억제가 강화되고 연장되었으며, 이는 p-eIF2a의 수준과 일치하였다.

5-2. HEK293 BiFC-tau 세포에 200 nM TG 및 20 ㎍/mL 사이클로헥시미드(cycloheximide)의 존재 또는 부재하에서 10 μM SB1617를 8시간 동안 처리 시, 총 타우 수준을 면역블롯팅 분석을 통해 확인하였다. 그 결과, 도 20 및 도 21에 나타낸 바와 같이, HEK293 BiFC-tau 세포가 번역 억제제인 사이클로헥시미드로 전처리 된 경우, SB1617 처리는 타우 레벨에 유의적인 변화를 유발하지 않은 것으로 나타났다.

5-3. ATF4는 전사 인자이며, 이는 eIF2a- 인산화시 상승하고, ER 스트레스시 회복 메커니즘으로서 오토파지(autophagy) 및 산화환원 조절과 관련된 유전자를 상향 조절한다. 이를 확인하기 위해, 1 μM 탑시가르긴의 존재 또는 부재하에 SH-SY5Y 세포에 5 μM SB1617을 8 시간 동안 처리한 다음 ATF4에 의해 조절된 오토파지 관련 유전자를 RT-qPCR로 확인하였다.

그 결과 도 22에 나타낸 바와 같이, SB1617 및 탑시가르긴의 처리는 탑시가르긴을 단독으로 처리한 세포와 비교하여 ATF4에 의해 조절되는 오토파지 관련 유전자의 전사 레벨을 상향 조절함을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, SB1617이 오토파지를 촉진함을 알 수 있었다.

5-4. 500 nM TG의 존재 또는 부재하에 HEK293 BiFC-tau 세포에 5 μM SB1617을 6 시간 동안 처리 시 LC3-I에서 LC3-II로의 전환 및 p62 레벨을 면역블롯 분석을 통해 확인하였고, 그 결과 도 23에 나타난 바와 같이, 경쇄 3-I (light chain 3-I; LC3-I)에서 경쇄 3-II(LC3-II)로의 전환을 확인할 수 있었다.

5-5. HEK293 BiFC-tau 세포에서 오토파지 억제제인 3-메틸 아데닌 (3-MA) 및 바필로마이신 A1 (Baf)의 부재 및 존재하에 SB1617 및 TG로 처리에 따른 총 타우 수준을 면역 블롯 분석을 통해 확인하였다. 그 결과 도 24 및 도 25에 나타난 바와 같이, 초기 및 후기 오토파지 단계를 방해하기 위한 3-메틸아데닌(3-methyladenine) 및 바필로마이신 A1(bafilomycin A1)의 처리를 통해 오토파지 과정이 각각 차단될 때, 타우 레벨의 감소에 대한 SB1617의 효능은 감소되었지만 완전히 사라지지는 않았고, 이는 타우 클리어런스에서의 SB1617 효과는 단백질 항상성 조절을 위한 번역 조절 특성 보다 영향이 적음을 의미한다.

5-6. 상기 시험예 5-1 내지 5-5 결과로부터, 본 발명에 따른 피리미도디아제핀 유도체인 SB1617이 단백질 항상성을 조절하는 경우, ER 스트레스 조건 하에서 잘못 접히고 축적되는 경향을 나타내는 다른 단백질의 수준을 효과적으로 제어가능할 것이라는 가설을 세웠다. 이를 확인하기 위해, SB1617 처리에 따른 다른 응집 경향 단백질의 수준 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 26에 나타낸 바와 같이, 파킨슨 병을 가진 FTD 환자에서 발견되고 쥐 뇌에서 tau 응집 및 축적을 가속화시키는 것으로 알려진 tau P301L, 헌팅턴씨 질병을 유발하는 폴리글루타민 확장 돌연변이 Htt-Q74 및 근위축성 측색 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis; ALS) 환자의 임상적 특징인 SOD1(G93A) 돌연변이 수준이 SB1617 처리에 따라 하향조절됨을 확인할 수 있었다.

시험예 6: TBI 마우스 모델에서 효능 검증

6-1. 본 발명에 따른 화합물(SB1617)의 생체 내 사용 적합성을 평가하기 위해, 상기 실시예 1-15 및 1-16의 기재된 방법에 따라 수컷 ICR 마우스를 사용하여 약동학적 특성 및 혈액 뇌 장벽 침투 특성을 확인하였다.

그 결과 도 27 및 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 복강 내 주사된 피SB1617은 약 6.6 시간의 반감기 및 충분한 혈액-뇌 장벽 교차와 함께 적절한 약동학적 거동을 나타내었다.

Parameters	I.V., 5 mg/kg	I.P., 5 mg/kg
Tmax (h)	NA	1.67 ± 2.02
Cmax (μg/mL)	NA	0.857 ± 0.339
T_1/2 (h)	5.51 ± 1.86	6.57 ± 0.0563
AUC_t (μgㆍh/mL)	4.19 ± 0.112	6.07 ± 2.81
AUC_∞ (μgㆍh/mL)	4.49 ± 0.15	5.65 ± 3.32
CL (L/h/kg)	1.12 ± 0.038	NA
V_SS (L/kg)	6.27 ± 0.928	NA

또한, 도 28 및 표 3에 나타난 바와 같이, SB1617은 혈장과 비교하여 뇌에서 적어도 50 %가 검출됨을 확인할 수 있었다.

Time (h)	Concentration (ng/mL)		Brain/Plasma ratio
Time (h)	Plasma	Brain tissue	Brain/Plasma ratio
0.5	885±187	421±58.2	0.50±0.14
3	92.4±29.8	55.9±5.00	0.66±0.21

6-2. 외상성 뇌손상(traumatic brain injury; TBI)는 ER 스트레스와 함께 결합된 tau 및 Aβ 병리의 발달로 이어지고, 신경 기능과 인지 능력을 손상시켜 뇌에 심각한 손상을 초래한다. 타우, p-타우, 산화 스트레스, ER 스트레스, 신경염증, 뉴런 생존력 및 행동 개선 수준을 확인하여 TBI 마우스에 대한 SB1617의 잠재적 치료 효과를 규명하였고, 상기 실험을 위한 디자인은 도 29에 개략적으로 도시하였다.

먼저, ER 스트레스 및 산화 스트레스 개선 여부를 확인하기 위해, ipsilateral hippocampal CA1 및 피질(cortex) 부분의 면역형광 염색을 실시하였고, 도 30 및 도 31에 나타낸 바와 같이, TBI 마우스 모델에서 ER 스트레스 및 산화 스트레스가 현저히 증가되었으나, SB1617을 TBI 마우스에 투여(5 mg/kg 체중, 하루 2 회)하는 경우 이러한 증상이 개선되는 것을 확인할 수 있었다.

6-3. 총 타우 및 p-타우 레벨 변화를 확인하기 위해, ipsilateral hippocampal CA1 및 피질(cortex) 부분의 면역형광 염색을 실시하였고, 도 32 및 도 33에 나타낸 바와 같이, TBI 24 시간 후, 해마(hippocampa) 및 피질(cortex) 부위에서 총 타우 및 p-타우 레벨의 급격한 증가되었으나, SB1617을 TBI 마우스에 투여(5 mg/kg 체중, 하루 2 회)하는 경우 이러한 증상이 개선되는 것을 확인할 수 있었다.

6-4. 신경세포 보호 활성을 확인하기 위해, ipsilateral hippocampal CA1 및 피질(cortex) 부분의 면역형광 염색을 실시하였고, 도 34에 나타낸 바와 같이, TBI 3 일 후, 신경세포의 사망(neuronal death)이 관찰되었으나, SB1617을 TBI 마우스에 투여(5 mg/kg 체중, 하루 2 회)하는 경우 이러한 증상이 개선되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, SB1617 처리에 따른 NSS(neurologic severity score) 평가를 실시하였고, 도 35에 나타낸 바와 같이, SB1617은 TBI 후 1, 4, 24, 48, 72 시간 및 7 일 경과 후에도 신경 보호 활성을 유지함을 확인할 수 있었다.

6-5. 행동 개선 수준을 확인하기 위해, 상기 실시예 1-24의 폴 클라이밍 시험을 실시하였고, 도 36에 나타낸 바와 같이, TBI 유도 후 SB1617을 투여한 마우스의 경우 머리를 아래쪽 방향으로 돌리는 시간(도 36 A)과 폴을 내려오는 시간(도 36 B)이 모두 비히클만을 투여한 마우스와 비교하여 현저히 단축됨을 확인할 수 있었다.

6-6. 신경염증 개선 수준을 확인하기 위해, ipsilateral hippocampal CA1 및 피질(cortex) 부분의 면역형광 염색을 실시하였고, 도 37에 나타낸 바와 같이, TBI 72 시간 후, 해마(hippocampa) 및 피질(cortex) 부위에서 Iba-1 레벨이 증가되었으나, SB1617을 TBI 마우스에 투여(5 mg/kg 체중, 하루 2 회)하는 경우 이러한 증상이 개선되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, ipsilateral hemisphere에서 미세아교세포 활성화 레벨을 확인하였고, 도 38에 나타난 바와 같이, TBI 후 SB1617를 투여한 마우스의 경우 미세아교세포의 활성이 개선됨을 확인할 수 있었다.

6-7. sham 수술 또는 TBI 유도 후 12시간 및 24시간 째에 비히클 또는 SB1617을 처리한 마우스의 ipsilateral perilesional cortex에서 p62, LC3-I에서 LC3-II로의 전환, BDNF 및 CHOP 수준 여부를 웨스턴 블롯팅 분석을 통해 확인하였다. 그 결과 도 39에 나타낸 바와 같이, SB1617에 의한 PERK 자극은 SB1617 처리시 p62 단백질 수준의 증가에 의해 입증되었으며, p62 단백질 수준은 sham 그룹 보다 TBI 그룹에서 더 낮은 것으로 나타났다. 또한, SB1617 투여시 LC3-I에서 LC3-II로의 전환율이 향상됨을 확인하였고, 이는 SB1617이 TBI 마우스의 오토파지를 촉진한다는 것을 의미한다.

시험예 7: 급성 알츠하이머 마우스 모델에서 효능 검증

7-1. 급성 알츠하이머 마우스 모델에서의 SB1617의 잠재적 치료 효과를 규명하였고, 상기 실험을 위한 디자인은 도 40에 개략적으로 도시하였다.

7-2. 학습시험(Acquisition test)을 통해 치료 효능을 확인한 결과, 도 41에 나타낸 바와 같이, 약물투여에 따른 학습 능력은 WT > Donepezil > SB-1617 > Vehicle 순으로 나타남을 확인할 수 있었다. 한편, 투여경로에 따른 학습능력 차이를 확인한 결과, 도 42에 나타낸 바와 같이, 투여경로에 따른 부형제의 영향은 크게 없는 것으로 확인하였다.

7-3. 확인평가(Probe test)를 통해 치료 효능을 확인한 결과, 플랫폼을 제거한 후, 마우스로 하여금 플랫폼이 있던 위치를 몇 번 지나는지 기록하는 방법으로 수행되었다.

먼저, platform에 다다르는 시간을 비교한 결과, 도 43에 나타낸 바와 같이, vehicle과 비교할 때, SB-1617을 투여한 군에서 유의적으로 낮은 값을 나타내어 WT에 가까운 결과를 보임을 확인할 수 있었다.

다음으로, 가상의 platform을 지나가는 횟수를 비교한 결과, 도 43에 나타낸 바와 같이, vehicle과 비교할 때, SB-1617을 투여한 군에서 유의적으로 높은 값을 나타내어 WT에 가까운 결과를 보임을 확인할 수 있었다.

다음으로, platform이 존재하는 사사분면 내에 머무는 시간 비율(%)을 비교한 결과, SB-1617을 투여한 군에서 platform의 위치를 잘 기억한다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, platform이 존재했던 SW 사사분면 공간으로 진입하는 횟수를 확인한 결과, 도 43에 나타낸 바와 같이, vehicle과 비교할 때, SB-1617을 투여한 군에서 유의적으로 높은 값을 나타내어 WT에 가까운 결과를 보임을 확인할 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

하기 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
X 는 CH₂; CO; COCF₃; NH; NCH₃; O; S; 또는 SO₂;이고,
Y 는 O; S; SO; SO₂; 또는 NRy이고,
m 은 0 또는 1의 정수이고,
n 은 0, 1 또는 2의 정수이고,
Ry 는 수소; C1-20의 선형 또는 분지형 알킬; 할로겐, C1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C6-20의 아릴; -COR′; -SO₂R′; -SOR′; -COOR′; -CONHR′; 또는 -CONR′R″이고,
Ra 는 수소; C1-20의 선형 또는 분지형 알킬; C1-20의 선형 또는 분지형 알케닐(alkenyl); 할로겐, C1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C6-20의 아릴; 어느 하나의 이상의 수소가 C1-5의 선형 또는 분지형 알킬 또는 6원 내지 10원 아릴로 치환된, 1 내지 2개의 N을 포함하는 5원 내지 6원의 헤테로사이클릴; 또는 -NRa₁Ra₂ 이고,
Rb 는 수소; C1-20의 선형 또는 분지형 알킬; 할로겐, C1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C6-20의 아릴; -NR′R″; -SR′; -SO₂R′; 또는 -SOR′이고,
Rc 는 수소; C1-20의 선형 또는 분지형 알킬; 할로겐, C1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C6-20의 아릴; -COR′; -SOR′; -SO₂R′; -COOR′; -CONHR′; 또는 -CONR′R″;이고,
상기 Ra에서 -NRa₁Ra₂ 의 Ra₁ 및 Ra₂는 각각 독립적으로 수소; C1-20의 선형 또는 분지형 알킬; 어느 하나 이상의 수소가 아민으로 치환된 C1-10의 선형 또는 분지형 아미노알킬; 할로겐, C1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C1-10의 선형 또는 분지형 알콕시, 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C6-20의 아릴로 C1-10의 선형 또는 분지형 알킬의 어느 하나의 수소가 치환된 아릴알킬; 1개의 N을 포함하는 6원의 헤테로아릴로 C1-5 알킬의 어느 하나의 수소가 치환된 헤테로아릴알킬; C1-10 선형 또는 분지형 알킬의 어느 하나의 수소가 페녹시기로 치환된 페녹시알킬; C1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C6-20의 아릴; -COR′; -SO₂R′; -SOR′; -COR′R″; 또는 -COOR′이고,
상기 Ry, Rb, Rc, Ra₁, 및 Ra₂에서, R′ 및 R″는 각각 독립적으로 수소; C1-10의 선형 또는 분지형 알킬; C3-10의 사이클로알킬; 할로겐, C1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C1-10의 선형 또는 분지형 알카이닐(alkynyl), C1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 니트로(nitro)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C6-20의 아릴; 벤질(benzyl); N, O 및 S 원자 중에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 5원 내지 20원의 헤테로아릴이다.
제 1 항에 있어서, 하기 화학식 2 내지 10 중 어느 하나로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

상기 화학식 2 내지 10 에서,
X 및 Y 는 제1항에서 정의한 바와 같고,
R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 수소; C_1-20의 선형 또는 분지형 알킬; 어느 하나 이상의 수소가 아민으로 치환된 C_1-10의 선형 또는 분지형 아미노알킬; 할로겐, C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시, 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C_6-20의 아릴로 C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬의 어느 하나의 수소가 치환된 아릴알킬; 1개의 N을 포함하는 6원의 헤테로아릴로 C_1-5 알킬의 어느 하나의 수소가 치환된 헤테로아릴알킬; C_1-10 선형 또는 분지형 알킬의 어느 하나의 수소가 페녹시기로 치환된 페녹시알킬; C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C_6-20의 아릴; -COR′; -SO₂R′; -SOR′; -COR′R″; 또는 -COOR′이고,
R₃는 수소; C_1-20의 선형 또는 분지형 알킬; 할로겐, C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C_6-20의 아릴; -NR′R″-SR′; -SO₂R′; 또는 -SOR′이고,
R₄는 수소; C_1-20의 선형 또는 분지형 알킬; 할로겐, C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C_6-20의 아릴; -COR′; -SOR′; -SO₂R′; -COOR′; -CONHR′; 또는 -CONR′R″;이고,
상기 R₁내지 R₄에서, R′ 및 R″는 각각 독립적으로 수소; C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬; C_3-10의 사이클로알킬; 할로겐, C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C_1-10의 선형 또는 분지형 알카이닐, C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C_6-20의 아릴; 벤질; N, O 및 S 원자 중에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하는 5원 내지 20원의 헤테로아릴이다.
제 2 항에 있어서,
X는 O, S, 또는 SO₂ 이고,
Y는 NRy 이고, 여기서 Ry는 수소, C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬, 또는 -COR' 이고, 여기서 R'는 제1항에서 정의한 바와 같고,
R₁은 할로겐, C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시, 및 아자이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C_6-20의 아릴로 C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬의 어느 하나의 수소가 치환된 아릴알킬이고,
R₂는 수소 또는 C_1-20의 선형 또는 분지형 알킬이고,
R₃은 수소 또는 C_1-20의 선형 또는 분지형 알킬이고,
R₄는 -SOR′또는 -SO₂R′이고, 여기서 R'는 제2항에서 정의한 바와 같은 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제 3 항에 있어서, R₁은 하기 화학식 11로 표시되는 기이고, R₄는 하기 화학식 12로 표시되는 기인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 11]

[화학식 12]

상기 화학식 11 및 12에서,
L 은 단일 결합 또는 C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬이고,
R₅는 수소; 할로겐; C_1-20의 선형 또는 분지형 알킬; C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시; 아자이드; 또는 C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C_6-20의 아릴이고,
R₆는 할로겐, C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬, C_1-10의 선형 또는 분지형 알카이닐, C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시, 또는 니트로이다.
제 2 항에 있어서, 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제 1 항에 있어서, 하기 화학식 13 으로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 13]

상기 화학식 13 에서,
R₅는 수소; 할로겐; C_1-20의 선형 또는 분지형 알킬; C_1-10의 선형 또는 분지형 알콕시; 아자이드; 또는 C_1-10의 선형 또는 분지형 알킬 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환 또는 비치환된 C_6-20의 아릴이다.
제 6 항에 있어서, 상기 화학식 13에서 상기 R₅는 수소; 할로겐; 또는 아자이드인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제 1 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물 101 내지 136으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
제 1 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, PDIA3, DNAJC3, 또는 PDIA3와 DNAJC3 과의 결합을 통해 PERK 신호 전달 억제를 방지함으로써 타우(Tau) 응집을 저해하는, 타우 응집 저해제.
제 1 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 타우 병증(tauopathies)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 타우 병증은 알츠하이머병(Alzheimer’s disease), 이마관자엽 치매(frontotemporal dementia), 진행성핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury) 픽씨병(Pick’s disease), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy), 은친화성입자병(Argyrophilic grain disease), 피질기저퇴행(corticobasal degeneration), 파킨슨병(Parkinson’s disease), 헌팅턴병(Huntingtin’s disease), 및 루게릭병(Amyotrophic lateral sclerosis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 타우 병증(tauopathies)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
대상체에 제 1 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는, 타우 병증의 예방 또는 치료 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 타우 병증은 알츠하이머병(Alzheimer’s disease), 이마관자엽 치매(frontotemporal dementia), 진행성핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury) 픽씨병(Pick’s disease), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy), 은친화성입자병(Argyrophilic grain disease), 피질기저퇴행(corticobasal degeneration), 파킨슨병(Parkinson’s disease), 헌팅턴병(Huntingtin’s disease), 및 루게릭병(Amyotrophic lateral sclerosis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 타우 병증의 예방 또는 치료 방법.
대상체의 타우 병증을 예방 또는 치료하기 위한, 제1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도.
제 14 항에 있어서, 상기 타우 병증은 알츠하이머병(Alzheimer’s disease), 이마관자엽 치매(frontotemporal dementia), 진행성핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury), 픽씨병(Pick’s disease), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy), 은친화성입자병(Argyrophilic grain disease), 피질기저퇴행(corticobasal degeneration), 파킨슨병(Parkinson’s disease), 헌팅턴병(Huntingtin’s disease), 및 루게릭병(Amyotrophic lateral sclerosis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 용도.