KR20230064797A - 체세포로부터 연골세포로의 직접교차분화 유도용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
체세포로부터 연골세포로의 직접교차분화 유도용 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 체세포로부터 연골세포로의 직접교차분화 유도용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 SOX9, GSTA4 또는 이의 조합 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 체세포로부터 연골세포로의 직접교차분화 유도용 조성물 및 이의 연골 손상 질환 치료 용도에 관한 것이다.
SOX9 및/또는 GSTA4를 포함하는 체세포로부터 연골세포로의 직접교차분화 유도용 조성물을 이용하면 유도 만능 줄기세포의 전분화능(Pluripotency) 단계를 거치지 않고 효율적으로 체세포로부터 연골세포로의 분화를 유도할 수 있어, 연골 손상 관련 질환 치료제 개발 등에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
SOX9 및/또는 GSTA4를 포함하는 체세포로부터 연골세포로의 직접교차분화 유도용 조성물을 이용하면 유도 만능 줄기세포의 전분화능(Pluripotency) 단계를 거치지 않고 효율적으로 체세포로부터 연골세포로의 분화를 유도할 수 있어, 연골 손상 관련 질환 치료제 개발 등에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 체세포로부터 연골세포로의 직접교차분화 유도용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 SOX9, GSTA4 또는 이의 조합 단백질; 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 체세포로부터 연골세포로의 직접교차분화 유도용 조성물 및 이의 연골 손상 질환 치료 용도에 관한 것이다.
인구의 고령화 및 이에 따른 난치성 및 퇴행성 질환의 증가에 따라 재생 의학적 조직 재생 및 세포 치료의 수요가 급증하는 추세에 맞추어 줄기세포치료제 개발의 필요성이 크게 대두되고 있다. 특히, 관절염, 류마티스, 기타 연골손상으로 인한 통증 등과 같은 퇴행성 질환 치료에 있어서, 연골세포의 재생을 촉진시키고자, 성체 줄기세포, 배아줄기세포, 및 유도만능 줄기세포 등을 이용한 다양한 치료법이 개발되고 있는 실정이다. 다만, 성체줄기세포의 경우, 제한된 분화능과 낮은 치료 효능을 가지고 있고, 배아줄기세포의 경우에는 윤리적 문제, 안전성 이슈 및 낮은 분화 효율성 문제로 인해 이들 줄기세포는 자가 세포치료제로서의 개발이 어려운 단점이 있다. 또한, 환자 맞춤형 세포치료제 생산을 위해 리프로그래밍 (reprogramming) 기법으로 체세포로부터 유도만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cell)를 제작하고 이를 다시 조직 특이적 세포로 분화시키는 연구가 최근 각광받고 있으나, 낮은 리프로그래밍 효율 및 기형종 형성 가능성 등의 해결해야 하는 문제점이 존재한다.
한편, 특정 체세포로부터 다른 조직 특이적인 세포로의 전환을 유도하는 직접교차분화 기술은 면역거부반응, 기형종 형성, 윤리적 문제 등을 피할 수 있어 최근 환자 맞춤형 세포치료제 생산 기술로 각광받고 있다.
이러한 배경 하에서, 직접교차분화의 효율을 향상시키기 위한 다양한 시도가 이루어지고 있으나 (한국 특허공개번호 10-2015-0015294), 연골세포로의 직접교차분화 기술에 대한 개발 및 이를 이용한 세포 치료제에 대한 적용은 아직 미비한 실정이다.
이에, 본 발명자는 안전하고 간편하게 성체세포를 연골세포로 직접교차분화할 수 있는 방법을 개발하기 위해 연구를 거듭한 결과, 특정 전사인자가 도입된 성체세포를 배양을 하거나 전사인자를 연골손상 동물모델에 주입함으로써 정상적인 연골세포가 유도됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 (1) SOX9 (SRY-Box Transcription Factor 9) 단백질 및 GSTA4 (Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 체세포로부터 연골세포로의 직접교차분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (1) SOX9 (SRY-Box Transcription Factor 9) 단백질 및 GSTA4 (Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 체세포에 접촉 또는 도입시켜 체세포를 연골세포로 직접교차분화 시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (1) SOX9 (SRY-Box Transcription Factor 9) 단백질 및 GSTA4 (Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 체세포에 접촉 또는 도입시켜 직접교차분화 유도된 연골세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 체세포로부터 연골세포로의 직접교차분화 유도용 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골 손상 질환 예방 또는 치료용 약학적 또는 수의학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 체세포로부터 직접교차분화된 연골세포를 유효성분으로 포함하는 연골 손상 질환 예방 또는 치료용 약학적 또는 수의학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다른 목적은 상기 방법에 따라 체세포로부터 직접교차분화된 연골세포를 유효성분으로 포함하는 연골 손상 질환 치료용 세포 치료제를 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) SOX9 (SRY-Box Transcription Factor 9) 단백질 및 GSTA4 (Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 체세포로부터 연골세포로의 직접교차분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) SOX9 (SRY-Box Transcription Factor 9) 단백질 및 GSTA4 (Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 체세포에 접촉 또는 도입시켜 체세포를 연골세포로 직접교차분화 시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) SOX9 (SRY-Box Transcription Factor 9) 단백질 및 GSTA4 (Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 체세포에 접촉 또는 도입시켜 직접교차분화 유도된 연골세포를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 체세포로부터 연골세포로의 직접교차분화 유도용 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골 손상 질환 예방 또는 치료용 약학적 또는 수의학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 따라 체세포로부터 직접교차분화된 연골세포를 유효성분으로 포함하는 연골 손상 질환 예방 또는 치료용 약학적 또는 수의학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 따라 체세포로부터 직접교차분화된 연골세포를 유효성분으로 포함하는 연골 손상 질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 (1) SOX9 (SRY-Box Transcription Factor 9) 단백질 및 GSTA4 (Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 체세포로부터 연골세포로의 직접교차분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 SOX9는 HMG-box 클래스 DNA 결합 단백질의 다른 구성원과 함께 CCTTGAG 서열을 인식한다. 이는 전구 세포를 연골 세포로 분화시키는데 필수적인 비대연골세포(hypertrophic chondrocytes)가 아닌 증식하고 있는 연골세포에 의해 발현되며, 스테로이드 생성 인자 1과 함께 항-뮬러 호르몬(AMH) 유전자의 전사를 조절한다. SOX9는 또한 남성의 성 발달에 중추적인 역할을 한다. Sf1과 함께 작용함으로써 SOX9는 Sertoli 세포에서 AMH를 생성하여 여성 생식 기관의 생성을 억제할 수 있다. 또한 남성 성기의 발달을 촉진하기 위해 몇 가지 다른 유전자와 상호 작용한다. 본 발명에서 상기 SOX9 단백질은 인간, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유 동물 유래의 모든 단백질이 포함될 수 있으며, 사용가능한 야생형의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라, 단백질의 기능성에는 영향을 주지 않는 1종 이상의 변이를 포함하는 단백질 변이체, 예컨대 단백질의 아형(subtype)을 포함할 수 있다. 상기 SOX9 단백질의 아미노산 서열은 공지된 데이터베이스를 통해 확인할 수 있으나, 바람직하게는 NP_000337 또는 NP_035578의 accession number로 표현되는 단백질일 수 있으며, 이는 NM_000346 또는 NM_011448의 accession number로 표현되는 유전자에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명에서 상기 GSTA4는 인간, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유 동물 유래의 모든 단백질이 포함될 수 있으며, 사용가능한 야생형의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라, 단백질의 기능성에는 영향을 주지 않는 1종 이상의 변이를 포함하는 단백질 변이체, 예컨대 단백질의 아형(subtype)을 포함할 수 있다. 상기 GSTA4 단백질의 아미노산 서열은 공지된 데이터베이스를 통해 확인할 수 있으나, 바람직하게는 NP_001503의 accession number로 표현되는 단백질일 수 있으며, 이는 NM_001512의 accession number로 표현되는 유전자에 의해 코딩될 수 있다.
상기 단백질의 변이체란 야생형 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 천연 아미노산 서열과 상이한 서열을 가지면서 야생형 단백질의 고유의 생물학적 기능을 유지하는 단백질을 의미한다. 상기 변이체는 야생형 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이거나 필요에 의해서 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체일 수 있고, 물리, 화학적 환경에 대한 구조적 안정성이 증대되거나 생리학적 활성이 증대된 변이체일 수 있다.
SOX9, GSTA4 또는 이의 변이체는 천연에서 분리되거나, 재조합적 또는 합성적으로 제조된(non-naturally occurring) 것 일 수 있다.
상기 SOX9 또는 GSTA4 단백질을 코딩하는 핵산은 야생형 또는 상기한 바와 같은 변이체 형태의 단백질을 코딩하는 염기서열로서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 SOX9 또는 GSTA4 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 핵산은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA) 또는 RNA(mRNA) 분자일 수 있다.
본 발명에서 상기 "체세포"는 생식세포를 제외한 모든 세포를 의미하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유 동물 유래의 것 또는 분리된 것일 수 있다.
상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 상피세포, 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, B세포, 주피세포, 별아교세포(astrocyte), 혈액세포, 신경 줄기세포, 희소돌기아교 전구세포, 조혈모 줄기세포, 제대혈 줄기세포 및 중간엽 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "연골세포"는 섬유연골 (fibrous cartilage), 탄력연골 (Elastic cartilage), 유리연골 (Hyaline cartilage) 및 모든 종류의 연골세포를 의미하며, 이러한 연골세포들은 인간 및 동물의 몸의 관절을 구성한다. 이러한 연골세포는 생체 내에서 거동 등 모든 신체의 움직임 기능을 원활하게 하는 역할을 하는 바, 퇴행성 관절질환을 포함한 다양한 질환 치료에 중요한 역할을 한다.
본 발명에서 상기 "직접교차분화(Direct Conversion)"는 고등생물에서 전혀 다른 세포 타입을 가지는 성숙한(분화가 끝난) 세포간의 전환을 유도하는 과정을 말한다. 이는 체세포를 유도 만능 줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)로 리프로그래밍 하고 이를 재분화하여 목적하는 세포로 만들어야 하는 종래 기술과 달리, 배아 줄기세포(embryonic stem cells) 및 유도 만능 줄기세포와 같은 만능 줄기세포 단계를 거치지 않고 바로 목적하는 세포로의 전환을 유도한다는 점에서 차이를 가지며, 현재 직접교차분화는 질병 모델링과 신약 개발 등에 이용될 가능성을 인정받고 있어 유전자 치료 및 재생 의학 등에도 응용될 수 있는 기술로 알려져 있다.
본 발명에서 상기 "벡터"는 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 전달체를 의미할 수 있다.
상기 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.
또한, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터, HIV(Human immunodeficiency virus) 벡터, MLV(Murineleukemia virus)벡터, ASLV(Avian sarcoma/leukosis) 벡터, SNV(Spleen necrosis virus)벡터, RSV(Rous sarcoma virus)벡터, MMTV(Mouse mammary tumor virus) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus) 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 벡터 및 에피조말(episomal) 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 1종 이상의 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 (1) SOX9 (SRY-Box Transcription Factor 9) 단백질 및 GSTA4 (Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 체세포에 접촉 또는 도입시켜 체세포를 연골세포로 직접교차분화 시키는 방법을 제공한다.
상기 직접 교차분화 방법은 체세포를 배지에서 배양하는 단계, 상기 배양한 체세포에 직접 교차분화 유도용 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 삽입한 벡터를 형질전환(transformation)시키는 단계, 및 상기 감염된 체세포를 직접 교차분화를 유도할 수 있는 배양조건에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 체세포의 배양에 사용되는 배지는 당해 분야에서 체세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함한다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.
또한, 상기 체세포를 연골세포로 직접교차분화 유도할 수 있는 배양조건은 당해 분야에서 체세포에 대하여 직접교차분화를 유도하는 데 통상적으로 사용되는 배지 및/또는 통상적인 배양 조건을 포함할 수 있다.
상기 직접교차분화 유도용 조성물을 체세포에 도입하는 단계를 통하여, 직접 교차분화 인자들의 이소성 발현(Ectopic expression)을 유도할 수 있다. 이소성 발현이란, 어떤 유전자가 원래 발현하는 조직이나 세포 외에서 발현하는 것, 또는 원래 발현하는 시기와 다른 시기에 발현하는 것을 의미한다.
SOX9 및/또는 GSTA4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 체세포에 전달 또는 도입하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 세포에 핵산분자 또는 단백질을 제공하는 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 조성물에 포함되는 유효 성분들을 체세포의 배양액에 투여하는 방법 또는 체세포에 직접 주입하는 방법을 사용할 수 있다.
상기 SOX9 및/또는 GSTA4를 분화된 세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), 입자 분사법(particle bombardment), 직접근육주입법, 인슐레이터(insulator) 및 트랜스포존을 이용한 방법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다.
상기 SOX9 및/또는 GSTA4 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 벡터 형태의 네이키드 DNA로 세포내로 도입하거나(Wolff et al. Science,1990: Wolffet al. J Cell Sci. 103:1249-59, 1992), 리포좀(Liposome), 양이온성 고분자(Cationic polymer)등을 이용하여 세포내로 도입될 수 있다. 리포좀은 유전자 도입을 위하여 DOTMA나 DOTAP 등의 양이온성 인지질을 혼합하여 제조한 인지질 막으로, 양이온성의 리포좀과 음이온성의 핵산이 일정 비율로 혼합하면 핵산-리포좀 복합체가 형성된다. 바람직하게 상기 핵산 분자는 벡터 형태로 제공되는 것일 수 있다. 또한 상기 핵산 분자는 해당 핵산 분자를 각각 삽입한 바이러스 벡터로 형질전환시킨 패키징 세포로부터 수득한 바이러스, 시험관 내 전사(in vitro transcription)에 의해 생산한 메신저 RNA, 또는 다양한 세포주 내에서 생산된 단백질 등의 형태로 사용할 수 있다. 또한, 상기 패키징 세포는 사용된 바이러스 벡터에 따라 당업계에 공지된 다양한 세포를 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일양태에서, 상기 연골세포로의 직접교차분화 방법은 체외(ex vivo)에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한 (1) SOX9 (SRY-Box Transcription Factor 9) 단백질 및 GSTA4 (Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 체세포에 접촉 또는 도입시켜 직접교차분화 유도된 연골세포를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 체세포로부터 연골세포로의 직접교차분화 유도용 조성물 또는 상기 방법에 따라 체세포로부터 직접교차분화 유도된 연골세포를 유효성분으로 포함하는 연골 손상 질환 예방 또는 치료용 약학적 또는 수의학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 연골 손상 질환은 관절염, 연골염, 쓸개골 염증, 연골 손상, 연골 결손, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 족저근막염, 상완골외과염, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 연골이형성이상증, 변형성 관절증 및 골연화증으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적 또는 수의학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1~90 중량부로 포함되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 MTU에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올 레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 치료용 조성물은 임의의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, l9th Edition, Alfonso, R., ed, Mack Publishing Co.(Easton, PA: 1995))를 추가로 포함할 수 있다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충용액, 예를 들어 인산, 시트르산 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함된다.
본 발명의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 0.01 - 100 mg/kg/day이며, 바람직하게는 0.1 - 20 mg/kg/day이며, 더욱 바람직하게는 5 - 10 mg/kg/day일 수 있다. 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 간격으로 분할 투여할 수도 있다.
본 발명의 조성물의 투여 경로는 공지된 방법, 예를 들어 정맥내, 복강내, 뇌내, 피하, 근육내, 안내, 동맥내, 뇌척수내, 또는 병변내 경로에 의한 주사 또는 주입, 또는 하기 기재된 서방성(sustained release) 시스템에 의한 주사 또는 주입이다. 또한, 본 발명의 약학적 또는 수의학적 조성물은 감염성 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 (1) SOX9 (SRY-Box Transcription Factor 9) 단백질 및 GSTA4 (Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 체세포에 접촉 또는 도입시켜 직접교차분화 유도된 연골세포를 유효성분으로 포함하는 연골 손상 질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.
상기 "세포치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다.
상기 세포 치료제는 약학적 또는 수의학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 예컨대 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, HSA(Human serum albumin) 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 세포 치료제는 예컨대 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가할 수 있으며, 예컨대 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다.
SOX9 및/또는 GSTA4를 포함하는 체세포로부터 연골세포로의 직접교차분화 유도용 조성물을 이용하면 유도 만능 줄기세포의 전분화능(Pluripotency) 단계를 거치지 않고 효율적으로 체세포로부터 연골세포로의 분화를 유도할 수 있어, 연골 손상 관련 질환 치료제 개발 등에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 섬유아세포에 전사인자 (SOX9 단독 또는 GSTA4와 함께)를 다양한 방법으로 도입하여 연골세포로 직접교차분화를 유도하는 과정을 나타낸 모식도도이다.
도 2는 섬유아세포에 전사인자 (SOX9 단독 또는 GSTA4와 함께)를 처리한 후 연골세포의 마커인 Col2a1 과 ChM-I의 발현변화를 q-RTPCR을 통하여 분석함으로써, 연골세포로의 직접교차분화가 원활히 이루어 졌음을 확인한 결과이다.
도 3는 섬유아세포에 전사인자 (SOX9 단독 또는 GSTA4와 함께)를 처리한 후 연골세포의 마커인 Col2a1 과 ChM-I의 발현변화를 면역염색법을 통하여 분석하고 단백질 발현양을 확인한 데이터로써, 연골세포로의 직접교차분화가 원활히 이루어졌음을 확인하는 결과이다.
도 4는 직접교차분화가 되는 과정을 광학 현미경 사진을 통하여 분석하고 날짜별로 정량화 분석을 수행한 결과이다.
도 5는 관절염 모델 마우스에 SOX9을 단독으로 처리했을 때와 SOX9과 GSTA4를 함께 처리하였을 때의 직접교차분화 효율을 qRT-PCR을 통하여 비교 분석한 결과이다.
도 6은 관절염 모델 마우스에 SOX9을 처리했을 연골세포로의 직접교차분화 효율을 마우스 행동실험을 통해서 분석한 결과이다.
도 2는 섬유아세포에 전사인자 (SOX9 단독 또는 GSTA4와 함께)를 처리한 후 연골세포의 마커인 Col2a1 과 ChM-I의 발현변화를 q-RTPCR을 통하여 분석함으로써, 연골세포로의 직접교차분화가 원활히 이루어 졌음을 확인한 결과이다.
도 3는 섬유아세포에 전사인자 (SOX9 단독 또는 GSTA4와 함께)를 처리한 후 연골세포의 마커인 Col2a1 과 ChM-I의 발현변화를 면역염색법을 통하여 분석하고 단백질 발현양을 확인한 데이터로써, 연골세포로의 직접교차분화가 원활히 이루어졌음을 확인하는 결과이다.
도 4는 직접교차분화가 되는 과정을 광학 현미경 사진을 통하여 분석하고 날짜별로 정량화 분석을 수행한 결과이다.
도 5는 관절염 모델 마우스에 SOX9을 단독으로 처리했을 때와 SOX9과 GSTA4를 함께 처리하였을 때의 직접교차분화 효율을 qRT-PCR을 통하여 비교 분석한 결과이다.
도 6은 관절염 모델 마우스에 SOX9을 처리했을 연골세포로의 직접교차분화 효율을 마우스 행동실험을 통해서 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. SOX9 을이용한 연골세포로의 직접교차분화 확인.
본 발명은 특정 전사인자를 이용하여 성체세포에서 연골세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 (Direct lineage reprogramming)을 유도하는 기술로서, 그 일례로, 도 1에 나타낸 바와 같이, 특정 전사인자를 처리하여 섬유아세포 (Fibroblast)를 연골세포로 직접교차분화 시켰다. 보다 구체적으로, 본 실시예에서는, 특정 전사인자의 유무에 따른 연골세포로의 직접교차분화 활성 변화를 확인하고자 하였다.
본 발명을 위하여 Fuw-Sox9 과 Fuw-Gsta4 vector를 사용하였고, Lentivirus를 제작하는 데에 293T cell line을 사용하였다. 293T cell에 Fuw-Sox9 과 Fuw-Gsta4 를 단독 또는 동시에 transfection 하고 48시간 배양 후, Lentiviral extraction step을 거쳐 Sox9 과 Gsta4 바이러스를 추출했다. Fibroblast를 2번 계대배양 후 만들어진 Sox9 과 Gsta4 바이러스를 단독 또는 동시에 transduction 후 14일간 DMEM/F12 10%FBS 배지에서 배양했다.
1-1. SOX9 과 GSTA4의 발현에 따른 직접교차분화 효율 변화
본 연구자는 섬유아세포에 전사인자 (SOX9 단독 또는 GSTA4와 함께) 를 처리한 후 연골세포의 마커인 Col2a1 과 ChM-I의 발현변화를 q-RTPCR을 통하여 분석하였고, 섬유아세포가 연골세포로 직접교차 리프로그래밍 됨을 확인하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 Control (전사인자 미처리 군)에 비해서 SOX9 단독으로 처리하였을 때도 통계적으로 유의미한 유전자 발현량 증가가 분석되었으며 GSTA4 유전자를 추가로 SOX9 과 함께 처리하였을 때에는 더 높은 직접교차분화 효율이 나타나는 것으로 확인되었다.
1-2. 단백질 분석을 통한 직접교차분화율 분석
섬유아세포에 전사인자 (SOX9 단독 또는 GSTA4와 함께)를 처리한 후 연골세포의 마커인 Col2a1 과 ChM-I의 발현변화를 면역염색법을 통하여 분석하고 단백질 발현양을 확인한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 Control (전사인자 미처리 군)에 비해서 SOX9 단독으로 처리하였을 때도 통계적으로 유의미한 단백질 발현량 증가가 분석되었으며 GSTA4 유전자를 추가로 SOX9 과 함께 처리하였을 때 에는 더 높은 직접교차분화 효율이 분석되었다.
면역염색에 대한 분석은, 면역 양성 세포만 카운팅하는 방식과 면역염색이 이루어진 형광발색 정도 (immunofluorescence intensity) 분석을 통하여 이루어 졌다.
추가적으로, 광학 현미경 이미지 분석을 통하여, 연골세포가 직접교차되는 과정을 분석하였으며 GSTA4 유전자를 추가로 SOX9 과 함께 처리하였을 때에 더 빠른 시기에 연골세포가 형성됨을 확인하였다(도 4).
실시예 2. 질병 동물 모델에서의 연골세포로의 직접교차분화 유도 효과 확인
본 실시예에서는, 무릎연골 손상 동물모델을 이용하여 본 발명의 효과를 in vivo 상에서 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 도 5에 나타낸 바와 같이, 전사인자 (SOX9, GSTA4, 또는 이의 조합)를 마우스의 연골손상 부위에 주입하고, 이때, 연골 지표 유전자인 Col2a1 과 ChM-I 변화를 mRNA 정량분석법인 qRT-PCR 을 통해서 분석함과 동시에 마우스 행동성을 평가하였다.
구체적으로, Fuw-Sox9 과 Fux-Gsta4 를 각각 또는 함께, PBS 완충액에 1x10^11 GC 농도로 희석시키고 각 손상 부위에 3ul 씩 투여하고, 3부위 총 9ul를 투여하였다.
구체적으로, 물리적인 연골손상을 통한 질환 마우스 모델이 생성이 된다. 연골 손상 마우스가 생성이 되면 마우스의 back limb 사용에 제한이 되어 마우스 행동성에 문제가 생기는데 이를 BBB scoring을 통하여 분석하여 치료가 완료된 마우스는 더 높은 BBB score 를 얻게 된다. 반복 5회 실험(T1~T5)을 통하여 진행하였고 수술 후 상태가 좋지 않은 군은 분석 군에서 제외되었다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 마우스 연골에서 Fuw-SOX9, Fux-Gsta4 및 이의 조합을 투여한 마우스 모두에서 대조군 대비 Col2a1 과 ChM-I의 발현이 증가하였으며, 도 6에 나타낸 바와 같이 Fuw-SOX9룰 투여한 마우스에서 시간의 경과에 따라 마우스의 행동이 활발해여 무릎연골의 손상으로부터 회복되고 있음을 확인하였다.
SOX9 및/또는 GSTA4를 포함하는 체세포로부터 연골세포로의 직접교차분화 유도용 조성물을 이용하면 유도 만능 줄기세포의 전분화능(Pluripotency) 단계를 거치지 않고 효율적으로 체세포로부터 연골세포로의 분화를 유도할 수 있어, 연골 손상 관련 질환 치료제 개발 등에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
Claims (13)
- (1) SOX9 (SRY-Box Transcription Factor 9) 단백질 및 GSTA4 (Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질;
(2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및
(3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 체세포로부터 연골세포로의 직접교차분화 유도용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 상피세포, 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, B세포, 주피세포, 별아교세포(astrocyte), 혈액세포, 신경 줄기세포, 희소돌기아교 전구세포, 조혈모 줄기세포, 제대혈 줄기세포 및 중간엽 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터, HIV(Human immunodeficiency virus) 벡터, MLV(Murineleukemia virus)벡터, ASLV(Avian sarcoma/leukosis) 벡터, SNV(Spleen necrosis virus)벡터, RSV(Rous sarcoma virus)벡터, MMTV(Mouse mammary tumor virus) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus) 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 벡터 및 에피조말(episomal) 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
- (1) SOX9 (SRY-Box Transcription Factor 9) 단백질 및 GSTA4 (Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질;
(2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및
(3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 체세포에 접촉 또는 도입시켜 체세포를 연골세포로 직접교차분화 시키는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 방법은 체외에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- (1) SOX9 (SRY-Box Transcription Factor 9) 단백질 및 GSTA4 (Glutathione S-Transferase Alpha 4) 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질;
(2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및
(3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 체세포에 접촉 또는 도입시켜 직접교차분화 유도된 연골세포.
- 제1항에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골 손상 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골 손상 질환 예방 또는 치료용 수의학적 조성물.
- 제6항에 따른 연골세포를 유효성분으로 포함하는 연골 손상 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제6항에 따른 연골세포를 유효성분으로 포함하는 연골 손상 질환 예방 또는 치료용 수의학적 조성물.
- 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연골 손상 질환은 관절염, 연골염, 쓸개골 염증, 연골 손상, 연골 결손, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 족저근막염, 상완골외과염, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 연골이형성이상증, 변형성 관절증 및 골연화증으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제6항에 따른 연골세포를 유효성분으로 포함하는 연골 손상 질환 치료용 세포 치료제.
- 제12항에 있어서, 상기 연골 손상 질환은 관절염, 연골염, 쓸개골 염증, 연골 손상, 연골 결손, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 족저근막염, 상완골외과염, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 연골이형성이상증, 변형성 관절증 및 골연화증으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 치료제.
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