KR20230053055A - 쌍별귀뚜라미 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
쌍별귀뚜라미 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 쌍별귀뚜라미 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물, 식품 조성물, 약학적 조성물에 관한 것으로서 세포독성이 없으면서도 간 세포 내 지질 감소, 염증 감소 및/또는 소포체 산화 스트레스 감소 효과가 탁월하여 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 쌍별귀뚜라미 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 쌍별귀뚜라미 가수분해물을 유효성분으로 함유하여, 간 세포 내 지질 감소, 염증 감소 및 소포체 산화 스트레스 감소 효과가 우수한 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
2019년 국내 간 질환 사망률은 인구 10만 명당 12.7명으로 매우 높으며, 30대 사망원인 5위(3.1명/10만 명), 40대 사망원인 3위(10.7명/10만 명), 50대 사망원인 4위(23.4명/10만 명), 60대 사망원인 5위(23.5명/10만 명)를 차지하는 등 간 질환은 한국 중년층 인구의 주요 사망원인이다.
간 질환은 원인에 따라 바이러스로 인한 간 질환, 과음으로 인한 알코올성 간 질환, 약물로 인한 독성 간 질환, 간에 지방이 축적되는 지방간, 인체 면역계통의 이상으로 인한 자가면역성 간 질환, 독성 물질이 과다하게 쌓여서 생기는 대사성 간 질환 및 기타 원인이 불분명한 간 질환으로 구분된다.
상기 간 질환 중에서 지방간은 지방이 간에 침착된 정도가 간 무게의 5% 이상인 경우를 의미한다. 간 내 지방축적을 유도하는 인자로는 비만, 당뇨, 알코올, 고지혈증 등이 있으며, 지방 중에서 주로 중성지방이 간세포에 축적되어 발생한다. 지방간은 발병원인에 따라서 알코올성 지방간 질환(alcoholic fatty liver disease)과 비알코올성 지방간 질환(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)으로 나눌 수 있다.
비알코올성 지방간 질환은 비음주자에서 조직학적으로 간 내 지방축적을 특징으로 하는 질환으로 간세포의 손상 정도에 따라 단순 지방간(steatosis), 비알코올성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis, NASH), 간경변증 (cirrhosis)으로 분류하고 있다.
비알코올성 지방간 질환의 발생과 진행에 대한 이론으로 'two hit'가설이 있다. 이 가설은 인슐린 저항성에 의한 첫 번째 타격(first hit)으로 간세포에 지방이 침착하여 단순 지방간이 되고, 여기에 다양한 산화스트레스가 발생하여 지방 과산화와 염증성 사이토카인의 과생성으로 인한 두 번째 타격(second hit)으로 간세포 손상 및 염증반응이 유발되어 지방간염으로 진행된다는 이론이다. 최근에는 동시다발적으로 다양한 자극 및 병태생리에 의해 비알코올성 지방간 질환이 발생한다는 'multiple hits' 가설이 재정립되고 있다. Multiple hits 가설의 인자로는 인슐린 저항성, 지질 축적, 소포체 스트레스, 염증(IL-1 beta, TNF alpha) 등이 있다.
비알코올성 지방간 질환의 합병증으로 당뇨병, 심혈관계 질환 발생위험이 증가하므로 비알코올성 지방간 질환 치료의 중요성이 강조되고 있다. 비알코올성 지방간 질환을 치료하기 위하여 식이요법과 운동요법을 통한 체중감량이 권고되고 있으며, 약물로는 인슐린 저항성을 개선하는 피오글리타존과 항산화 효과를 가지는 비타민 E 등이 단기간 치료에 사용되고 있다. 그러나 이들 치료제의 장기 투약에 대한 효과는 아직 입증된 바가 없으며 안전성에 대하여 아직 논란이 있어 선별된 환자에게서만 제한적으로 사용되고 있다.
한편, 식용곤충은 영양학적, 환경친화적, 경제적 가치들에 의하여 동물성 단백질 공급원의 고갈에 대한 미래 대안으로 주목받고 있다. 유엔식량농업기구(Food and agriculture organization, FAO)는 2050년에 인구가 90억명에 달할 것으로 예상하였으며, 육류의 대체식품으로 식용곤충을 대안으로 설명하고 있다.
현재 우리나라 식품의약품안전처에서 식용으로 인정하고 있는 곤충은 총 9종으로 백강잠, 식용누에(유충, 번데기), 메뚜기, 갈색거저리(유충), 흰점박이꽃무지(유충), 장수풍뎅이(유충), 쌍별귀뚜라미(성충), 아메리카왕거저리(유충), 수벌(번데기)가 있다. 쌍별귀뚜라미는 절지동물문 곤충강 메뚜기목 귀뚜라미과 왕귀뚜라미속에 속하는 불완전변태 곤충으로 2016년에 식품의약품안전처로부터 새로운 식품원료로 인정받아 누구든지 자유롭게 식품원료로 사용할 수 있게 되었고, 용도 확대를 위하여 다양한 연구가 진행되어 오고 있다.
귀뚜라미는 예로부터 민간요법으로 이뇨작용에 효능이 있다고 전해지고 있으며, 항당뇨, 항산화, 피부 광 노화에 대한 보호 효과 등이 알려져 있으나, 쌍별귀뚜라미의 비알코올성 지방간 질환 개선 효과에 관한 연구는 보고된 바 없으며, 쌍별귀뚜라미를 활용한 연구는 아직 초기 연구단계에 머물러있어 다양한 생리활성 탐색과 활성 성분, 작용기전 규명 등의 노력이 필요하다.
본 발명자들은 식품 원료로 안전성이 확인된 식용 곤충인 쌍별귀뚜라미의 효능을 연구하던 중, 쌍별귀뚜라미의 가수분해물이 간 세포 내 지질 감소, 염증 감소 및 소포체 산화 스트레스 감소 효능을 나타내어 우수한 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물로 활용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 쌍별귀뚜라미 가수분해물의 경우 다양한 농도에서 세포 독성이 없으면서도 높은 간 세포 내 지질 감소, 염증 감소 및 소포체 산화 스트레스 감소 효능을 나타냄을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 쌍별귀뚜라미 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 쌍별귀뚜라미 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 (a) 쌍별귀뚜라미를 건조 및 분쇄시키는 단계; (b) 상기 (a) 결과물에 증류수 및 가수분해효소를 혼합하는 단계; (c) 상기 (b) 결과물을 80 내지 100 ℃에서 10 내지 60 분 동안 정치시켜 효소를 불활성화 시키는 단계; 및 (d) 건조시키는 단계를 포함하여 제조되는, 쌍별귀뚜라미 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급된 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 유효성분으로 쌍별귀뚜라미 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 가수분해물은 단백질 가수분해 효소로 처리된 것이다. 상기 단백질 가수분해 효소는 뉴트라제(Neutrase), 플라보자임(Flavourzyme), 프로타멕스(Protamex), 알카라제(Alcalase), 키모트립신(α-Chymotrypsin), 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin), 브로멜린(Bromelin) 및 파파인(Papain)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이다. 예시적으로, 본 발명의 실시예에 따르면, 뉴트라제, 플라보자임을 사용하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 쌍별귀뚜라미는 착유가 행해지고 남은 탈지박으로, 착유는 400 ~ 800 kgf/cm2의 압력에서 10 분 ~ 1 시간 동안 행해진 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 가수분해물은 고압처리된 쌍별귀뚜라미를 가수분해한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 고압은 500 ~ 5000 Bar의 압력에서 1 ~ 60 분 동안 처리된 것이다. 예시적으로, 본 발명의 실시예에 따르면 1500 Bar의 압력에서 5분 동안 처리하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 간 세포 내 지질 감소, 염증 감소 및/또는 소포체 산화 스트레스 감소를 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 FAS(Fatty acid synthase) 또는 PPAR gamma(peroxisome proliferator activated receptor gamma)의 발현을 억제하여, 지질 축적 감소 활성을 갖는다. FAS는 지방산 합성을 촉매하는 다중 효소 단백질이며, PPAR gamma는 FAS의 합성을 유도하는 전사이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 TNF alpha(tumor necrosis factor alpha) 또는 IL-1 beta(interleukin 1 beta)의 발현을 억제하여, 염증 완화 활성을 갖는다. TNF alpha(tumor necrosis factor alpha)와 IL-1beta(interleukin 1 beta)은 지방간에서 간의 염증뿐만 아니라 만성의 염증 상태를 초래한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 Bip(charperone binding protein), XBP-1(X-box binding protein 1) 또는 CHOP(CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein)의 발현을 억제하여, 소포체 스트레스 완화 효과를 갖는다. 비알코올성 지방간 질환에서 소포체 스트레스에 의하여 비접힘 단백질 반응이 활성화되면, 소포체 내의 단백질의 접힘을 도와주는 샤페론 단백질(Bip, XBP-1)의 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다. 소포체 스트레스에 의해 세포자멸사를 유도하는 전사인자(CHOP)의 발현이 증가한다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, (a) 쌍별귀뚜라미를 건조 및 분쇄시키는 단계; (b) 상기 (a) 결과물에 증류수 및 가수분해효소를 혼합하는 단계; (c) 상기 (b) 결과물을 80 내지 100 ℃에서 10 내지 60 분 동안 정치시켜 효소를 불활성화 시키는 단계; 및 (e) 건조시키는 단계를 포함하여 제조되는, 쌍별귀뚜라미 고압 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 가수분해효소는 뉴트라제(Neutrase), 플라보자임(Flavourzyme), 프로타멕스(Protamex), 알카라제(Alcalase), 키모트립신(α-Chymotrypsin), 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin), 브로멜린(Bromelin) 및 파파인(Papain)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 (a) 결과물은 건조 및 분쇄된 쌍별귀뚜라미에 착유가 행해지고 남은 탈지박이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 착유는 400 ~ 800 kgf/cm2의 압력에서 10 분 ~ 1 시간 동안 행해지는 것이다. 예시적으로, 본 발명의 실시예에 따르면 600 kgf/cm2의 압력에서 3 분 동안 처리하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 (b)는 (a) 결과물에 고압처리한 후 증류수 및 가수분해효소를 혼합하는 단계이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 고압은 500 ~ 5000 Bar의 압력에서 1 ~ 60 분 동안 처리된 것이다. 예시적으로, 본 발명의 실시예에 따르면 1500 bar의 압력에서 5 분 동안 처리하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 (b) 증류수 및 가수분해효소의 혼합은 30 내지 70 ℃에서 5 내지 72 시간 동안 반응시키는 것이다.
본 발명에 따른 식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 식품은 유효성분인 본 발명에 따른 쌍별귀뚜라미 가수분해물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합 양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 초코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 쌍별귀뚜라미 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 치료용 약학적 조성물은 쌍별귀뚜라미 가수분해물을 유효성분으로 포함하는, 간 세포 내 지질 감소, 염증 감소 또는 소포체 산화 스트레스 감소 효과를 갖는, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다.
상기에 언급한 바와 같이 본 발명을 의약으로 사용하는 경우 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바납, 합성규산 알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다.
상기 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 또한, 상기 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 상기 비경구투여는 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 사용하여 이루어질 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
상술한 본 발명의 조성물에 대한 설명은 중복된 내용의 기재에 의한 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
본 발명에 의한 쌍별귀뚜라미 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 조성물은 세포독성이 없으면서도 간 세포 내 지질 감소, 염증 감소 및/또는 소포체 산화 스트레스 감소 효과가 탁월하여 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 쌍별귀뚜라미 탈지 분말을 0 또는 1,500 bar로 압력을 가한 후, 뉴트라제 또는 플라보자임으로 가수분해하여 얻은 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물의 가수분해도를 나타낸 도이다.
도 2는 쌍별귀뚜라미 탈지 분말을 0 또는 1,500 bar로 압력을 가한 후, 뉴트라제 또는 플라보자임으로 가수분해하여 얻은 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물의 항산화 활성을 나타낸 도이다. (A)는 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하여 시료의 가용성 고형분에 대한 비율로 나타낸 결과이고, (B)는 FRAP을 측정한 후 시료의 가용성 고형분에 대한 비율로 나타낸 결과이다.
도 3은 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물의 세포독성을 확인하기 위하여 간암 세포주(HepG2)에 동결건조된 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물을 농도별(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 5 mg/mL)로 처리한 후, 세포 생존율을 나타낸 도이다. (A)는 뉴트라제를 이용하여 제조한 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물(N-GB)에 대한 결과이고, (B)는 플라보자임을 이용하여 제조한 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물(F-GB)에 대한 결과이다.
도 4는 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물이 팔미트산(palmitic acid)에 의한 세포독성을 개선하는지 확인하기 위하여 간암 세포주(HepG2)에 0.2 mM의 팔미트산과 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물을 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 1 mg/mL)로 처리하여 세포 생존율을 나타낸 도이다.
도 5는 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물이 팔미트산에 의한 세포 내 지질 축적을 억제하는지 확인하기 위하여 간암 세포주(HepG2)에 0.2 mM의 팔미트산과 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물을 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 1 mg/mL)로 처리한 후, Oil Red O 염색을 하여 얻은 결과를 나타낸 도이다. (A)는 Oil Red O로 염색한 간암 세포주(HepG2)의 이미지이고, (B)는 Oil Red O의 흡광도를 측정하여 세포 내 지질 함량을 측정한 결과이다.
도 6은 간암 세포주(HepG2)에 0.2 mM의 팔미트산과 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물을 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 1 mg/mL)로 처리한 후, 배양액의 ALT 농도를 나타낸 도이다.
도 7은 간암 세포주(HepG2)에 0.2 mM의 팔미트산과 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물을 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 1 mg/mL)로 처리한 후, 총 RNA를 추출하여 지방합성 관련 유전자의 mRNA 발현을 나타낸 도이다. (A)는 FAS mRNA 수준을 측정한 결과이고, (B)는 PPAR gamma mRNA 수준을 측정한 결과이다.
도 8은 간암 세포주(HepG2)에 0.2 mM의 팔미트산과 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물을 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 1 mg/mL)로 처리한 후, 총 RNA를 추출하여 염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 나타낸 도이다. (A)는 TNF alpha mRNA 수준을 측정한 결과이고, (B)는 IL-1beta mRNA 수준을 측정한 결과이다.
도 9는 간암 세포주(HepG2)에 0.2 mM의 팔미트산과 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물을 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 1 mg/mL)로 처리한 후, 총 RNA를 추출하여 소포체 스트레스 관련 유전자의 mRNA 발현을 나타낸 도이다. (A)는 BIP mRNA 수준을 측정한 결과이고, (B)는 XBP1 mRNA 수준을 측정한 결과이다.
도 10은 간암 세포주(HepG2)에 0.2 mM의 팔미트산과 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물을 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 1 mg/mL)로 처리한 후, 총 단백질을 추출하여 CHOP의 발현을 나타낸 도이다.
도 2는 쌍별귀뚜라미 탈지 분말을 0 또는 1,500 bar로 압력을 가한 후, 뉴트라제 또는 플라보자임으로 가수분해하여 얻은 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물의 항산화 활성을 나타낸 도이다. (A)는 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하여 시료의 가용성 고형분에 대한 비율로 나타낸 결과이고, (B)는 FRAP을 측정한 후 시료의 가용성 고형분에 대한 비율로 나타낸 결과이다.
도 3은 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물의 세포독성을 확인하기 위하여 간암 세포주(HepG2)에 동결건조된 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물을 농도별(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 5 mg/mL)로 처리한 후, 세포 생존율을 나타낸 도이다. (A)는 뉴트라제를 이용하여 제조한 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물(N-GB)에 대한 결과이고, (B)는 플라보자임을 이용하여 제조한 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물(F-GB)에 대한 결과이다.
도 4는 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물이 팔미트산(palmitic acid)에 의한 세포독성을 개선하는지 확인하기 위하여 간암 세포주(HepG2)에 0.2 mM의 팔미트산과 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물을 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 1 mg/mL)로 처리하여 세포 생존율을 나타낸 도이다.
도 5는 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물이 팔미트산에 의한 세포 내 지질 축적을 억제하는지 확인하기 위하여 간암 세포주(HepG2)에 0.2 mM의 팔미트산과 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물을 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 1 mg/mL)로 처리한 후, Oil Red O 염색을 하여 얻은 결과를 나타낸 도이다. (A)는 Oil Red O로 염색한 간암 세포주(HepG2)의 이미지이고, (B)는 Oil Red O의 흡광도를 측정하여 세포 내 지질 함량을 측정한 결과이다.
도 6은 간암 세포주(HepG2)에 0.2 mM의 팔미트산과 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물을 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 1 mg/mL)로 처리한 후, 배양액의 ALT 농도를 나타낸 도이다.
도 7은 간암 세포주(HepG2)에 0.2 mM의 팔미트산과 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물을 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 1 mg/mL)로 처리한 후, 총 RNA를 추출하여 지방합성 관련 유전자의 mRNA 발현을 나타낸 도이다. (A)는 FAS mRNA 수준을 측정한 결과이고, (B)는 PPAR gamma mRNA 수준을 측정한 결과이다.
도 8은 간암 세포주(HepG2)에 0.2 mM의 팔미트산과 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물을 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 1 mg/mL)로 처리한 후, 총 RNA를 추출하여 염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 나타낸 도이다. (A)는 TNF alpha mRNA 수준을 측정한 결과이고, (B)는 IL-1beta mRNA 수준을 측정한 결과이다.
도 9는 간암 세포주(HepG2)에 0.2 mM의 팔미트산과 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물을 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 1 mg/mL)로 처리한 후, 총 RNA를 추출하여 소포체 스트레스 관련 유전자의 mRNA 발현을 나타낸 도이다. (A)는 BIP mRNA 수준을 측정한 결과이고, (B)는 XBP1 mRNA 수준을 측정한 결과이다.
도 10은 간암 세포주(HepG2)에 0.2 mM의 팔미트산과 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물을 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 1 mg/mL)로 처리한 후, 총 단백질을 추출하여 CHOP의 발현을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 제조예, 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 제조예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 제조예, 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 쌍별 귀뚜라미 가수분해물의 제조
쌍별귀뚜라미는 충남 홍성군 소재 '내포 곤충'에서 열풍 건조한 것을 구입하여 사용하였다. 건조 쌍별귀뚜라미 5.5 kg을 롤밀 분쇄기를 이용하여 1회 분쇄하여, 착유기(DB-600, 동방기계, 한국)를 사용하여 45 ℃에서 600 kgf/cm2압력으로 30 분간 착유하였다. 착유하고서 남겨지는 과립 상태의 탈지박을 롤밀 분쇄기로 5 mm 크기로 분쇄하여 쌍별귀뚜라미 탈지 분말을 제조하였다. 탈지한 쌍별귀뚜라미 분말을 200 g씩 비닐백에 담아 진공 포장하였다. High pressure processing 기기(055-60, Uhde, 독일)를 이용하여 1,500 Bar에서 5 분간 처리한 후, 사용 시까지 -20 ℃에 보관하였다. 고압처리한 쌍별귀뚜라미 분말 시료에 증류수를 첨가하여 10%(w/v) 현탁액을 제조하였다. 현탁액의 pH를 효소별 최적 pH(뉴트라제, pH 6.5; 플라보자임, pH 7.0)로 맞춘 후, 1 %(v/v 또는 w/v)의 뉴트라제 또는 플라보자임을 첨가하여 50 ℃에서 15 시간 동안 반응시켰다. 반응 시간이 끝난 후, 효소처리물을 90 ℃에서 30 분간 이상 정치시켜 효소를 불활성화한 후, 100 mesh의 체에 걸러 여액분을 얻어 분무 건조(spray drying)하여 쌍별귀뚜라미 가수분해물을 제조하였다.
실시예 2 : 쌍별 귀뚜라미 가수분해물의 가수분해도 측정
시료에 동일한 부피의 20 %(w/v) trichloroacetic acid (TCA)을 가하여 4 ℃에서 30 분간 반응시킨 후, 원심분리(2560 xg, 4 ℃, 15 분)하여 상등액을 취하였다. 가수분해도는 시료의 총 단백질 함량에 대한 20% TCA 가용성 단백질의 상대비율로 아래와 같이 산출하였다. 단백질 농도는 Bradford 방법을 이용한 protein assay kit (BIORAD, California, USA)를 이용하여 측정하였다.
가수분해도(%) = TCA 가용성 단백질(mg/mL)/시료의 총 단백질(mg/mL) Х 100
그 결과, 뉴트라제를 이용하여 제조한 쌍별귀뚜라미 효소처리물의 가수분해도는 1,500 bar를 처리한 군에서 대조군(0 bar)에서보다 높았으며, 플라보자임을 이용하여 제조한 쌍별귀뚜라미 효소처리물의 가수분해도는 1,500 bar를 처리한 군에서 대조군(0 bar)에서보다 높았다(도 1).
실시예 3 : 쌍별 귀뚜라미 가수분해물의 항산화 활성 측정
3-1) DPPH 라디칼 소거 활성
시료액 40 μL에 4.5 × 10-4 M DPPH reagent (Sigma-Aldrich, MO, USA) 160 μL를 가하여 암실에서 30 분간 반응킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 증류수를 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 시료액의 소거능을 산출하였으며, 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물의 소거능은 시료액의 소거능을 시료액의 가용성 고형분 함량(°Brix)으로 나눈 값으로 나타내었다.
그 결과, 뉴트라제를 이용하여 제조한 각 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물(GB-N)의 DPPH 라디칼 소거능의 경우 1,500 bar를 처리한 군에서 대조군(0 bar)에서보다 유의하게 높았다. 플라보자임을 이용하여 제조한 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물(GB-F)의 DPPH 라디칼 소거능은 1,500 bar를 처리한 군에서 대조군(0 bar)에서보다 높았다(도 2A).
3-2) FRAP(Ferric reducing antioxidant power) 측정
시료액 5 μL와 칵테일 용액(300 mM sodium acetate : 10 mM TPTZ : 20 mM FeCl3·6H2O=10:1:1) 145 μL를 섞어 암실에서 15 분간 반응시킨 후, 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. FeSO4(Sigma-Aldrich)를 표준물질로 사용하여 표준 곡선을 작성하고, 시료액의 FRAP을 mM FeSO4/μL로 나타내었다. 쌍별귀뚜라미 효소처리물의 FRAP은 시료액의 FRAP을 시료액의 가용성 고형분 함량(°Brix)으로 나눈 값으로 하여 나타내었다.
그 결과, 뉴트라제를 이용하여 제조한 쌍별귀뚜라미 효소처리물의 FRAP의 경우 1,500 bar를 처리한 군에서 대조군(0 bar)에서보다 유의하게 높았다. 플라보자임을 이용하여 제조한 쌍별귀뚜라미 효소처리물의 경우 1,500 bar를 처리한 군과 대조군(0 bar)에서의 FRAP은 서로 다르지 않았다(도 2B).
실시예 4 : 간암 세포의 세포 생존율 측정
4-1) 간암 세포주(HepG2)의 배양
HepG2 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였으며, 10 % 우태아혈청(FBS, Welgene, Daegu, Korea)과 1 % 항생/항진균제(antimycotic/antibiotics, Gibco, NY, USA)가 첨가된 둘베코 변성 배지(DMEM, Welgene, Daegu, Korea)에서, 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 배양하였다.
4-2) 세포 생존율 측정 (1)
쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물이 HepG2 세포에서 세포독성을 나타내는지 확인하기 위하여, HepG2 세포를 1 × 105 cells/cm2의 농도로 96 웰 플레이트에 분주하여 24 시간 동안 배양하고 24 시간 동안 1 % FBS가 첨가된 DMEM에서 추가로 배양한 후, 다양한 농도(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 5 mg/mL)의 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물과 함께 24 시간 동안 배양하였다.
그 결과, 뉴트라제를 이용하여 제조한 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물(GB-N)을 0.25, 0.5와 5 mg/mL의 농도로 처리한 경우 대조군(0 mg/mL)과 비교하여 세포 생존율이 유의하게 증가하였다(도 3A). 플라보자임을 이용하여 제조한 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물(GB-F)을 0.5 mg/mL 이상의 농도로 처리한 경우 대조군(0 mg/mL)과 비하여 세포 생존율이 증가하는 경향이 있었다(도 3B).
따라서 GB-N과 GB-F은 모든 농도에서 세포독성을 나타내지 않으며, 오히려 0.25, 0.5와 5 mg/mL의 GB-N과 0.5 mg/mL 이상의 GB-F는 세포 증식을 촉진하는 효과를 확인하였다.
4-3) 세포 생존율 측정 (2)
쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물이 팔미트산(palmitic acid, PA)으로 인한 세포독성을 완화하는지 확인하기 위하여 HepG2 세포를 1 × 105 cells/cm2의 농도로 96 웰 플레이트에 분주하여 24 시간 동안 배양한 후 24 시간 동안 1 % FBS가 첨가된 DMEM에서 추가로 배양하였다. 다양한 농도(0.25, 0.5 또는 1 mg/mL)의 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물과 함께 24 시간 동안 배양한 후, 0.2 mM BSA 결합된 팔미트산(BSA conjugated-palmitic acid)을 첨가하여 24 시간 동안 추가로 배양하였다. 세포 생존율은 EZ-Cytox(Dogenbio, Seoul, Korea)를 15 μL씩 첨가한 후, 37 ℃를 유지하는 세포 배양기에서 3 시간 동안 배양한 후 ELISA 리더(Molecular Device, San Jose, USA)로 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 백분율(%)로 나타내었다. 대조군은 유리지방산이 포함되지 않은 0.2%(w/v)의 BSA 용액을 처리한 것이다.
그 결과, 팔미트산(PA)을 처리한 세포는 BSA 대조군과 비교하여 세포 생존율이 유의하게 감소한 반면, GB-N 또는 GB-F를 0.25, 0.5와 1 mg/mL의 농도로 처리한 군에서는 세포 생존율이 BSA 대조군과 다르지 않았다(도 4).
따라서, GB-N과 GB-F는 PA로 인한 세포독성을 완화하는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 5 : 간암 세포 내 지질 함량 측정
HepG2 세포를 1 × 105 cells/cm2의 농도로 6 웰 플레이트에 분주하여 24 시간 동안 배양한 후 24 시간 동안 1 % FBS가 첨가된 DMEM에서 추가로 배양하였다. 0.25, 0.5 또는 1 mg/mL 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물과 함께 24 시간 동안 배양한 후, 0.2 mM의 BSA 결합된 팔미트산을 첨가하여 24 시간 동안 추가로 배양하였다. 둘베코 인산 완충용액(DPBS, Welgene, Daegu, Korea)을 이용하여 세척하고 10 % 포르말린 용액을 이용하여 실온에서 세포를 고정하였다. 고정한 세포를 60 % 이소프로판올로 세척하고 Oil Red O 워킹 용액을 넣어 실온에서 30 분 동안 염색하였다. 염색한 세포를 증류수로 세척한 다음 흡광도 측정을 위해 1 mL 이소프로판올로 염색된 세포를 용출시켜 마이크로플레이트 리더를 이용하여 492 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 사진은 현미경(NEO science, Selangor, Malaysia)을 이용하여 400 배 확대하여 촬영(Infinity 3, Lumenera's, Ottawa, Canada)하였다.
그 결과, 팔미트산(PA)를 처리한 세포는 BSA 대조군과 비교하여 세포 내 지질 함량이 유의하게 증가하였다. 반면 GB-N 또는 GB-F를 0.25, 0.5 및 1 mg/mL의 농도로 처리한 군에서는 세포 내 지질 함량이 BSA 대조군과 다르지 않거나 감소하였다(도 5).
따라서, GB-N과 GB-F는 PA로 인한 세포 내 지질 축적을 완화하는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 6 : ALT 농도 측정
HepG2 세포를 1 × 105 cells/cm2의 농도로 6 웰 플레이트에 분주하여 24 시간 동안 배양한 후 24 시간 동안 1 % FBS가 첨가된 DMEM에서 추가로 배양하였다. 0.25, 0.5 또는 1 mg/mL의 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물과 함께 24 시간 동안 배양한 후, 0.2 mM의 BSA 결합된 팔미트산을 첨가하여 24 시간 동안 추가로 배양하였다. 배양액의 ALT 농도는 ALT 테스트 키트(EMBIEL, Gunpo, Korea)를 사용하여 측정하였다. 증류수를 맹검으로 하여 표준액, 검액 및 대조군의 흡광도를 측정하여 표준액의 검량 곡선으로부터 효소의 활성단위를 환산하여 비교 관찰하였다.
그 결과, ALT 농도는 팔미트산(PA)를 처리한 세포에서 BSA 대조군과 비교하여 유의하게 증가하였으나, GB-N을 0.25, 0.5와 1 mg/mL의 농도로 처리하는 경우 팔미트산(PA)만 처리한 세포에 비하여 감소하였다(도 6).
따라서, GB-N은 ALT 농도를 감소시키는데 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 7. 쌍별 귀뚜라미 가수분해물의 지질 축적 감소, 염증 완화, 소포체스트레스 완화 활성 측정
7-1) Total RNA 분리 및 cDNA 합성
HepG2 세포를 1 × 105 cells/cm2의 농도로 6 웰 플레이트에 분주하여 24 시간 동안 배양한 후 24 시간 동안 1 % FBS가 첨가된 DMEM에서 추가로 배양하였다. 0.25, 0.5 또는 1 mg/mL의 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물과 함께 24 시간 동안 배양한 후, 0.2 mM BSA 결합된 팔미트산을 첨가하여 24 시간 동안 추가로 배양하였다. 세포로부터 총 RNA의 추출은 뉴클레오졸 시약(MACHEREY-NAGEL, Hoerdt, France)을 이용하여 제조사가 제공하는 방법에 따라 수행하였다. 추출한 RNA는 건조시킨 후 30 μL의 DEPC 처리수(DEPC water)에 녹이고 분광광도계에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. cDNA 합성은 추출한 Total RNA 2 μg을 주형으로 사용하여 M-MLV-RTASE(moloney murine leukemia virus reverse transcriptase; BIONEER, Korea)를 사용하여 합성하였다.
7-2) 실시간 중합 효소 연쇄반응(qRT-PCR)
실시간 중합 효소 연쇄반응은 10 배 희석한 cDNA를 이용하여 AccuPower® 2XGreenStar™ qPCR MasterMix (BIONEER, Daejeon, Korea)와 CFX Connect Real-Time PCR Detection System (BIORAD, Switzerland)을 사용하여 수행하였다. 발현된 각각 유전자의 mRNA 양은 delta-delta Ct방법에 따라 RPLP0에 대한 상대적인 양으로 계산하였다. 사용된 프라이머의 염기서열은 표 1에 나타내었다.
| 유전자 | 프라이머 서열 (5’ → 3’) |
| RPLP0(ribosomal protein, large, P0) | Forward: TGGTCATCCAGCAGGTGTTCGA Reverse: ACAGACACTGGCAACATTGCGG |
| FAS(fatty acid synthase) | Forward: GGATCACAGGGACAACCTGG Reverse: GGGAGATGAGGGGAGTTCCT |
| PPARgamma(peroxisome proliferator activated receptor gamma) | Forward: AGAGCCTTCCAACTCCCTCA Reverse: TCTCCGGAAGAAACCCTTGC |
| TNFalpha(Tumor necrosis factor alpha) | Forward: GGCAGTCAGATCATCTTCTCG Reverse: GGTTTGCTACAACATGGGCTA |
| IL-1beta(Interleukin 1 beta) | Forward: CTCGCCAGTGAAATGATGGCT Reverse: GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT |
| BiP(binding immunoglobulin protein) | orward: CACAGTGGTGCCTACCAAG Reverse: AGCAGGAATTCCAGTCAGA |
| XBP1(X-box binding protein 1) | Forward: CCTGGTTGCTGAAGAGGAGG Reverse: TGCACGTAGTCTGAGTGCTG |
7-3) 실험 결과
지방산 합성을 촉매하는 다중 효소 단백질인 FAS(Fatty acid synthase) mRNA 발현은 팔미트산(PA)를 처리한 세포에서 BSA 대조군과 비교하여 증가하는 경향이 있는 반면, 1 mg/mL의 GB-N를 처리한 군과 0.25, 0.5와 1 mg/mL의 GB-F를 처리한 군에서는 팔미트산(PA)만 처리한 세포보다 유의적으로 낮았다(도 7A). 또한, FAS 합성을 유도하는 전사인자인 PPAR gamma mRNA 발현은 팔미트산(PA)를 처리한 세포에서 BSA 대조군과 비교하여 유의적으로 증가한 반면, GB-N 또는 GB-F를 0.25, 0.5와 1 mg/mL의 농도로 처리한 군에서는 팔미트산(PA)만 처리한 세포보다 유의적으로 낮았다(도 7B).
따라서, GB-N과 GB-F는 팔미트산(PA)로 인한 지방합성 관련 유전자의 mRNA 발현 증가를 억제하여 세포 내 지질 축적을 완화하는 효과가 있음을 확인하였다.
또한, 지방간에서 간의 염증뿐만 아니라 만성의 염증 상태를 초래하는 것으로 알려진 TNF alpha 및 TNF IL-1beta의 발현을 측정한 결과, TNF alpha mRNA 발현은 팔미트산(PA)을 처리한 세포에서 BSA 대조군과 비교하여 유의적으로 증가한 반면, 0.5 와 1 mg/mL의 GB-F를 처리한 군에서는 팔미트산(PA)만 처리한 세포보다 유의적으로 낮았다(도 8A). IL-1 beta mRNA 발현은 팔미트산(PA)를 처리한 세포에서 BSA 대조군과 비교하여 유의적으로 증가한 반면, 0.25와 1 mg/mL의 GB-N 또는 0.25, 0.5와 1 mg/mL의 GB-F를 처리한 군에서는 팔미트산(PA)만 처리한 세포와 비교하여 유의적으로 낮았다(도 8B).
따라서, GB-N과 GB-F는 팔미트산(PA)로 인한 염증성 사이토카인의 mRNA 발현 증가를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
소포체 스트레스에 의하여 소포체 내 단백질 접힘을 도와주는 샤페론 단백질(BiP, XBP-1)의 발현이 증가한다. 실험 결과, BiP mRNA 발현은 팔미트산(PA)을 처리한 세포에서 BSA 대조군과 비교하여 유의적으로 증가한 반면, 0.25와 0.25 mg/mL의 GB-N 또는 0.5와 1 mg/mL의 GB-F를 처리한 군에서는 팔미트산(PA)만 처리한 세포보다 유의적으로 낮았다(도 9A). XBP-1 mRNA 발현은 팔미트산(PA)를 처리한 세포에서 BSA 대조군과 비교하여 증가하는 경향이 있는 반면, 1 mg/mL의 GB-N 또는 0.5와 1 mg/mL의 GB-F를 처리한 군에서는 팔미트산(PA)만 처리한 세포와 비교하여 유의적으로 낮았다(도 9B).
따라서, GB-N과 GB-F는 팔미트산(PA)로 인한 소포체 스트레스 관련 유전자의 mRNA 발현 증가를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 10. Western Blot
HepG2 세포를 1 × 105 cells/cm2의 농도로 6 웰 플레이트에 분주하여 24 시간 동안 배양한 후 24 시간 동안 1% FBS가 첨가된 DMEM에서 추가로 배양하였다. 0.25, 0.5 또는 1 mg/mL의 쌍별귀뚜라미 고압 효소처리물과 함께 24 시간 동안 배양한 후, 0.2 mM BSA 결합된 팔미트산을 첨가하여 24 시간 동안 추가로 배양하였다. 단백질은 세포에 프로테아제 저해제(ATTO, Tokyo, Japan)와 포스파타제 저해제(ATTO, Tokyo, Japan)가 첨가된 RIPA (radioimmunoprecipitation) 용해 완충액(ATTO, Tokyo, Japan)을 가하여 4 ℃에서 30 분간 정치시킨 후 14,000 xg, 4 ℃, 10 분 동안 원심분리하였다. 단백질 농도는 Bradford 방법으로 정량하였으며, 표준물질로는 BSA(bovine serum albumin, Thermo-fisher, USA)를 사용하였다. 추출한 단백질에 5X 샘플 완충액(DYNEBIO, Korea)를 넣고 95 ℃에서 10 분간 끓였다. 30 μg의 단백질을 8 % SDS-PAGE로 분리한 뒤 PVDF 멤브레인(Millipore, MA, USA)에 1 시간 30 분 동안 트랜스퍼하였다. 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 멤브레인은 5 % 스킴 밀크(BD, New Jersey, USA)를 사용하여 1 시간 동안 블로킹하였다. 1차 항체는 4 ℃에서 12 시간 이상 반응시켰다. 1 % TBST(Tris buffered saline Tween-20) (BIORAD, California, USA)로 3 회 세척 후, HRP(horseradish peroxidase )가 결합된 2차 항체를 1 : 1000 혹은 1 : 2000의 비율로 희석하여 상온에서 1 시간 반응시킨 후 TBST로 5 분씩 3 회 세척하였다. Super signal west pico plus (Thermo-fisher, Massachusetts, USA)와 Davinch western system(Davinch K, Seoul, Korea)을 사용하여 단백질 밴드를 확인하였고, 단백질 밴드는 Image J software(ver 1.8, National Institutes of Health, Maryland, USA)를 사용하여 정량화하였다. 단백질 발현 정도는 하우스 키핑 단백질인 베타-액틴(beta-actin)을 내부 대조군으로 사용하여 각 단백질 발현의 정량 값을 대조군에서의 정량 값에 대한 fold 값으로 나타내었다. 사용된 항체는 표 2에 나타내었다.
| Antibody | Catalog number | Dilution Factor | Corporation |
| CHOP | 2895 | 1 : 1000 | Cell Signaling |
| Annexin V | ab14196 | 1 : 1000 | Abcam |
| Beta-actin | sc-8035 | 1 : 1000 | Santa cruz |
| Anti-rabbit IgG | 7074 | 1 : 2000 | Cell Signaling |
| Anti-mouse IgG | 7076 | 1 : 1000 | Cell Signaling |
그 결과, 팔미트산(PA)를 처리한 세포에서 소포체 스트레스에 의한 세포자멸사를 유도하는 전사인자인 CHOP(CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein) 단백질 발현은 BSA 대조군과 비교하여 증가하는 경향이 있는 반면, GB-N 또는 GB-F를 처리한 세포는 CHOP 단백질 발현이 팔미트산(PA)만 처리한 세포와 비교하여 유의적으로 낮았다(도 10).
따라서, GB-N과 GB-F는 팔미트산(PA)으로 인한 소포체 스트레스를 억제하였음을 확인하였다.
실시예 11. 통계처리
실험 결과의 통계처리는 SPSS 프로그램(statistical package for social sciences; ver. 25, IBM Corporation, New York, NY, USA)을 이용하여 분석하였다. 모든 실험은 3 회 반복수행하여 평균과 표준편차로 나타내었다. 각 군의 평균값에 대한 차이는 one-way ANOVA와 Tukey's multiple range test를 사용하여 검증하였다(p < 0.05).
Claims (15)
- 쌍별귀뚜라미(Gryllus bimaculatus) 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 가수분해물은 단백질 가수분해 효소로 처리된 것인 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 단백질 가수분해 효소는 뉴트라제(Neutrase), 플라보자임(Flavourzyme), 프로타멕스(Protamex), 알카라제(Alcalase), 키모트립신(α-Chymotrypsin), 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin), 브로멜린(Bromelin) 및 파파인(Papain)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 가수분해물은 고압처리된 쌍별귀뚜라미를 가수분해한 것인 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 고압은 500 ~ 5000 Bar의 압력에서 처리된 것인, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 간 세포 내 지질 감소, 염증 감소 또는 소포체 산화 스트레스 감소를 특징으로 하는 것인, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 FAS(Fatty acid synthase) 또는 PPAR gamma(peroxisome proliferator activated receptor gamma)의 발현을 억제하는 것인, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 TNF alpha(tumor necrosis factor alpha) 또는 IL-1 beta(interleukin 1 beta)의 발현을 억제하는 것인, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 Bip(charperone binding protein), XBP-1(X-box binding protein 1) 또는 CHOP(CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein)의 발현을 억제하는 것인, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 쌍별귀뚜라미 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- (a) 쌍별귀뚜라미를 건조 및 분쇄시키는 단계;
(b) 상기 (a) 결과물에 증류수 및 가수분해효소를 혼합하는 단계;
(c) 상기 (b) 결과물을 80 내지 100 ℃에서 10 내지 60 분 동안 정치시켜 효소를 불활성화 시키는 단계; 및
(d) 건조시키는 단계를 포함하여 제조되는, 쌍별귀뚜라미 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 제조방법. - 제11항에 있어서, 상기 가수분해효소는 뉴트라제(Neutrase), 플라보자임(Flavourzyme), 프로타멕스(Protamex), 알카라제(Alcalase), 키모트립신(α-chymotrypsin), 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin), 브로멜린(Bromelin) 및 파파인(Papain)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 제조방법.
- 제11항에 있어서, 상기 (b)는 (a) 결과물에 고압처리한 후 증류수 및 가수분해효소를 혼합하는 단계인 것인 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 제조방법.
- 제13항에 있어서, 상기 고압은 500 ~ 5000 Bar의 압력인 것인, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 제조방법.
- 제11항에 있어서, 상기 (b) 증류수 및 가수분해효소의 혼합은 상기 혼합물을 30 내지 70 ℃에서 5 내지 72 시간 동안 반응시키는 것인 방법.
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